+

WO2002013865A1 - Agents destines a soulager les symptomes provoques par des maladies articulaires - Google Patents

Agents destines a soulager les symptomes provoques par des maladies articulaires Download PDF

Info

Publication number
WO2002013865A1
WO2002013865A1 PCT/JP2001/007044 JP0107044W WO0213865A1 WO 2002013865 A1 WO2002013865 A1 WO 2002013865A1 JP 0107044 W JP0107044 W JP 0107044W WO 0213865 A1 WO0213865 A1 WO 0213865A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
chain
plasmid
pthrp
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/007044
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideki Yoshikawa
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to EP01956906A priority Critical patent/EP1312378A4/en
Priority to US10/344,733 priority patent/US20040067231A1/en
Priority to AU2001278742A priority patent/AU2001278742A1/en
Publication of WO2002013865A1 publication Critical patent/WO2002013865A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to an agent for ameliorating symptoms caused by joint diseases, comprising as an active ingredient a substance that inhibits the binding of parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) to its receptor.
  • PTHrP parathyroid hormone-related peptide
  • Parathyroid hormone-related protein was identified in 1987 from a study of humoral factors responsible for hypercalcemia associated with malignant tumors. It is known that its N-terminal side exerts its action by binding to parathyroid hormone (parathyroid horm one, PTH) and a common receptor (PTH / PTHrP receptor).
  • PTHrP has been reported to be produced by various tumor tissues, it is also found in a wide range of normal tissues such as skin, mammary gland, uterus, placenta, bone, smooth muscle, heart, lung, kidney, liver, brain, etc. It is produced and exerts various effects locally via the autocrine / paracrine secretion mechanism.
  • the PTH / PTHrP receptor is strongly expressed in the renal cartilage, which is the target organ for PTH and PTHrP, but also in the aorta, adrenal gland, brain, mammary gland, heart, digestive tract, liver, lung, skeletal muscle, ovary, and fetus It was also expressed in the disc, skin, stomach, uterus, etc., and showed a distribution very similar to that of PTHrP.
  • the actions of PTHrP include, in addition to the action of promoting bone resorption and activation of cartilage by activating osteoclasts in bone, and the action of promoting calcium reabsorption by acting on the distal tubule of the kidney,
  • TNF- ⁇ and IL-1 / 3 also promote the expression of PTHrP (Biotech Biophys ResCommun 249: 339-343, 1998).
  • PTHrP-induced cytokine induction or cytokine-induced PTHrP induction has been reported.
  • PTHrP exerts its own effects on cytokins, especially inflammatory sites such as IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF-H.
  • IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF-H inflammatory sites
  • an object of the present invention is to provide an agent for ameliorating symptoms caused by joint diseases caused by PTH or PTHrP.
  • the present invention is an agent for ameliorating a symptom caused by a joint disease, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between a parathyroid hormone-related peptide and its receptor.
  • the joint diseases include rheumatoid arthritis and / or osteoarthritis, and the symptoms caused by the joint diseases include bone loss near joints.
  • the ameliorating agent of the present invention suppresses bone loss, and is therefore also effective in suppressing bone loss near joints associated with rheumatoid arthritis and Z or osteoarthritis.
  • the above-mentioned substances include an antagonist of parathyroid hormone-related peptide receptor, an anti-parathyroid hormone-related peptide antibody (for example, a humanized or chimerized monoclonal antibody), a fragment of the antibody and / or a modified product thereof.
  • examples of the humanized antibody include a humanized # 23-57-137-1 antibody.
  • joint diseases include rheumatoid arthritis and Z or osteoarthritis.
  • the present invention is a therapeutic agent for joint diseases, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between a parathyroid hormone-related peptide and its receptor.
  • Joint diseases include rheumatoid arthritis and Z or osteoarthritis.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for joint disease, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and its receptor (PTHrP receptor).
  • a therapeutic agent for joint disease which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and its receptor (PTHrP receptor).
  • PTHrP receptor parathyroid hormone-related peptide
  • the present invention is an agent for ameliorating a symptom caused by a joint disease, comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between PTHrP and a PTHrP receptor.
  • PTHrP receptor refers to a receptor that binds to PTHrP described in, for example, Japanese Patent Publication No. 6-506598, and is present on a target organ (eg, bone or kidney). Irrespective of whether it is a PTHrP receptor or not.
  • a substance that inhibits the binding of PTHrP to the PTHrP receptor refers to a substance that binds to PTHrP, thereby inhibiting the binding of PTHrP to the PTHrP receptor (for example, an anti-PTHrP antibody), and PTHrP It refers to any one or both of substances that inhibit binding of PTHrP to PTHrP receptor by binding to the receptor (for example, an agonist for PTHrP receptor (also referred to as PTHrP antagonist)).
  • PTHrP antagonist include those in which at least one amino acid of the PTHrP peptide has been substituted or deleted, a partial sequence of the PTHrP peptide, and the like.
  • Anti-PTHrP antibodies include, for example, antibodies such as humanized antibodies, human antibodies (W096 / 33735) and chimeric antibodies (JP-A-4-228089), as well as hybridoma # 23-57-137-1 Antibody (# 23-57-137-1 antibody).
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • Examples of the PTHrP antagonist include, but are not limited to, polypeptides and small molecules.
  • polypeptides in which at least one amino acid has been deleted, substituted, added, or inserted and which have the same PTHrP angiotensin activity are also those of the present invention. Included in evening gonist.
  • an anti-PTHrP antibody will be described as an example of "a substance that inhibits the binding between PTHrP and a PTHrP receptor".
  • the origin, type (monoclonal, polyclonal) and shape of the anti-PTHrP antibody used in the present invention are not limited as long as they have an effect of improving symptoms caused by joint disease.
  • the anti-PTHrP antibody used in the present invention can be polyclonal or polyclonal using known means. Can be obtained as a monoclonal antibody.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing the antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody is an antibody that binds to PTHrP, thereby inhibiting PTHrP from binding to the PTHZPTHrP receptor, blocking PTHrP signal transduction, and inhibiting the biological activity of PTHrP.
  • Such antibodies include the # 23-57-137-1 antibody produced by hybridoma clone # 23-57-137-1.
  • noisy-Dr. Cell # 23-57-137-1 is designated as mouse-mouse hybridoma # 23-57-137-1, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5631, dated August 15, 1996, at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared as follows.
  • PTHrP is used as a sensitizing antigen, and immunized according to a usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and a conventional screening method is used. Thus, it can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • human PTHrP used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is obtained by expressing the amino acid sequence of the PTHrP gene disclosed in Suva, LJ et al., Science (1987) 237, 893. That is, after inserting a gene sequence encoding PTHrP into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target PTHrP protein is obtained from the host cell or culture supernatant by a known method. Purify.
  • this purified PTHrP protein is used as a sensitizing antigen.
  • the N-terminal 34 peptides of PTHrP can be prepared by chemical synthesis and used as a sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited.
  • the selection is preferably made in consideration of compatibility with the parent cell used for vesicle fusion.
  • rodent animals for example, mice, rats, hamsters, or egrets, sal, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or saline, and the suspension is mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified.
  • an appropriate carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • immunocytes are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immunocytes are splenocytes, in particular. No.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell can be selected from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81 , 1-7), NS-1 (Kohler.G. And Milstein, C. Eur.J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies.DH et a, Cell (1976) ) 8, 405-415), SP2 / 0 (S ulman, M.
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, Methods Enzymo 1. (1981) 73, 3-46). And so on.
  • the cell fusion is carried out in a normal nutrient medium, for example, in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), etc. are used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be added and used.
  • the ratio of the immune cells to the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 10 times larger than that of myeoma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture solution, MEM culture solution, and other ordinary culture solutions used for this type of cell culture suitable for the growth of the myeloma cell line can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000), which has been heated to about 37 ° C in advance, is usually 30 to 60%. (w / v) and mix to form the desired fused cells (hybridomas). Subsequently, an appropriate culture solution is sequentially added, and the operation of centrifuging and removing the supernatant is repeated to remove cell fusion agents and the like that are unfavorable for the growth of hybridomas.
  • a PEG solution for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing it in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the human lymphocytes are sensitized in vitro to PTHrP, and the sensitized lymphocytes are derived from a human-derived myeloid cell with permanent division ability.
  • the desired human antibody having the activity of binding to PTHrP can be obtained by fusing with a single cell (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • transgenic animals having the entire repertoire of human antibody genes are administered with PTHrP as an antigen to obtain anti-PTHrP antibody-producing cells, and human antibodies to PTHrP are obtained from immortalized cells. Good (see International Publication Nos. WO94 / 25585, WO93 / 12227, WO92 / 03918, and WO94 / 02602).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced is It can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the monoclonal antibody can be obtained from the hybridoma by culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining the culture supernatant, or by administering the hybridoma to a mammal compatible with the hybridoma. Then, a method of obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique is used.
  • a gene recombination technique See, for example, Vand amnie, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990.
  • V variable region of the anti-PTHrP antibody
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 52 94-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et a]., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) is used to prepare total RNA, and the desired mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). From the obtained mRNA, cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • Synthesis of cDNA is carried out using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Iidaigaku Kogyo).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Iidaigaku Kogyo
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using PCR Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) and the like.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product, and ligated to the vector-1) NA. Furthermore, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected. To prepare the desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain-initiation method.
  • the DNA encoding the V region of the desired anti-PTHrP antibody After obtaining the DNA encoding the V region of the desired anti-PTHrP antibody, it is incorporated into an expression vector containing DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • a host cell is transformed with this expression vector to express an antibody.
  • Expression of the antibody gene may be performed by separately transforming the DNA encoding the antibody heavy chain ( ⁇ chain) or the light chain (L chain) into an expression vector and co-transforming the host cells, or The host cell may be transformed by incorporating the DNA encoding the L chain into a single expression vector (see WO94 / 11523).
  • transgenic animals For the production of recombinant antibodies, not only the above host cells but also transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein (eg, goat casein) that is specifically produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny.
  • Hormones may also be used in transgeneic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibodies produced from transgenic engi (Ebert, KM et al., Bio / Technology). (1994) 12, 699-702).
  • genetically modified antibodies artificially modified for the purpose of reducing the xenoantigenicity to humans such as chimeric antibodies and humanized antibodies, can be used.
  • modified antibodies can be produced using the following method.
  • the chimeric antibody useful in the present invention is a D encoding the antibody V region obtained as described above. It can be obtained by ligating NA to DNA encoding the C region of a human antibody, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which are used to replace the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies, with human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the gene has been transplanted into the complementarity-determining region of E. coli, and a general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576).
  • a DNA sequence designed to link the mouse antibody CDR and the human antibody framework region (FR) has a portion overlapping both the CDR and FR terminal regions. Amplified by PCR using several oligonucleotides prepared as above as primers. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the human antibody C region, and then inserted into an expression vector, which is then introduced into a host to produce a humanized antibody (EP 239400,
  • the framework region of the human antibody linked via the CDR is selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, the amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, et al., Cance r Res. (1993) 53, 851-856).
  • the C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • C a 1, C a 2, C a 3, and C a 4 are used, and for the L chain, CK, C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody comprises a variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than human, a framework region and a C region derived from a human antibody. Since the humanized antibody has reduced antigenicity in the human body, it is useful as an active ingredient of the improving agent of the present invention.
  • Examples of the humanized antibody that can be used in the present invention include a humanized # 23-57-137-1 antibody.
  • the humanized # 23-57-137-1 antibody has the complementarity determining region of the mouse-derived # 23-57-137-1 antibody, and the human antibody HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M et al., Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) linked to three FR fragments (FR1, FR2 and FR3) and a fragment (FR4) derived from human antibody S25755 (NBRF-PDB),
  • the H chain is linked to the framework region of the human antibody S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier AM et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993), and is designed to have antigen-binding activity. It is a partial substitution of an amino acid residue in one network region.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the L chain or H chain of the humanized # 23-57-137-1 antibody was purchased from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (Japan).
  • FERM for Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA / pUC19), an Escherichia coli harboring a plasmid containing DNA encoding the H chain, dated August 15, 1996, 1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture Escherichia coli JM109 (hMBClLq ⁇ / pUC19), which is E. coli having a plasmid containing DNA encoding an L chain as BP-5629, has been deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5630. I have.
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof, as long as it binds to PTHrP and inhibits the activity of PTHrP.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab,) 2, Fv, and a single chain Fv (scFv) in which an Fv of an H chain or an L chain is linked with an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and a DNA encoding the L chain or L chain V region, all or a desired amino acid sequence thereof.
  • the A portion encoding A is shaped into ⁇ ⁇ and amplified by PCR using a pair of primers that define both ends.Then, the DNA encoding the peptide linker portion, and both ends of which are H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying a pair of primers that are defined to be linked.
  • the expression vector containing them and the host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • scFv can be obtained according to a conventional method.
  • the fragments of these antibodies can be obtained and expressed in the same manner as described above, and produced by a host.
  • the “antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an anti-PTHrP antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” in the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal can be operably linked to the 3 ′ downstream thereof for expression.
  • the promoter / enhancer may include the human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • virus promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and humanelonge.
  • SV40 simian virus 40
  • HEFlo one-factor-one
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked to express the gene.
  • promoters include lacz promoter and araB promoter. When using the lacz promoter, use the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), or when using the a raB promoter It can be expressed by the method of Better et al. (Science (1988) 240, 104 1-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, SP, et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in E. coli periplasm. Then, after separating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • the expression vectors are selected as aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TI0 gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrogenase). It can contain the folate reductase (dhir) gene and the like.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as eukaryotic fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as Escherichia coli cells.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as eukaryotic fungal cells and yeast cells
  • prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as Escherichia coli cells.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • Antibodies expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out using an affinity column. For example, as a column using a protein A column, Hyper D, P0R0S> Separose FF (Pharmacia) and the like can be mentioned. In addition, separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatographic columns other than the above affinity columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (AntibodiesA Laboratory) Manual. Ed Harlow, Davi d Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 0 8. Confirmation of antibody activity
  • Antigen binding activity of the antibody used in the present invention (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), ligand binding activity (Harada, A. et al. , Int ernat ional Immunology (1 993) 5, 681-690) can be measured by a known method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • a fluorescent antibody method is used.
  • the enzyme immunoassay a sample containing an anti-PTHrP antibody, for example, a culture supernatant of an anti-PTHrP antibody-producing cell or a purified antibody is added to a plate coated with PTHrP (1 to 34). After adding a secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, incubating and washing the plate, adding an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate and measuring the absorbance to determine the antigen binding activity. Can be evaluated.
  • the neutralizing activity of the anti-PTHrP antibody is measured.
  • the ameliorating agent of the present invention is used for the purpose of treating or ameliorating joint conditions or symptoms such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
  • the ameliorating agent of the present invention can be administered for the purpose of ameliorating symptoms caused by joint diseases.
  • the symptoms caused by the joint disease include, but are not limited to, bone loss near the joint.
  • the ameliorating agent of the present invention can be administered to the above-mentioned symptoms or to a symptom in which a plurality of other symptoms are combined.
  • the ameliorating agent containing the anti-PTHrP antibody of the present invention as an active ingredient can be administered orally or parenterally, but is preferably parenterally administered, and specifically, a pulmonary drug form (for example, nephrizer-1 etc.) Pulmonary administration using the same device), nasal administration, transdermal administration (eg, ointment, cream), injection, and the like.
  • a pulmonary drug form for example, nephrizer-1 etc.
  • Pulmonary administration using the same device nasal administration
  • transdermal administration eg, ointment, cream
  • injection form include systemic or local administration by intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the effective dose is selected in the range of 0.0 Olnig to l OOOmg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1 to 100 fflg / body can be selected.
  • the dose of the improving agent containing the anti-PTHrP antibody of the present invention is not limited to these doses.
  • the administration may be performed before or after the onset of joint disease, or may be performed when bone loss is predicted.
  • Improving agent comprising the anti-PTHrP antibodies of the present invention as an active ingredient in a conventional manner SeiHitoshi 1 J I spoon can force s to (Remington 's Pharmaceut ical Sc ience , l at es t ed it io n, Mark Publishing Company, Easton, USA), which may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and pharmaceutical additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, lipoxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearin Acids, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like.
  • water pharmaceutically acceptable organic solvents
  • collagen collagen
  • polyvinyl alcohol polyvinylpyrrolidone
  • lipoxyvinyl polymer sodium carboxymethylcellulose
  • sodium polyacrylate Sodium alginate
  • water-soluble dextran sodium carboxymethyl starch
  • the actual additive is selected from the above alone or in appropriate combination according to the dosage form of the improving agent of the present invention, but is not limited thereto.
  • a purified anti-PTHrP antibody is dissolved in a solvent, for example, a physiological saline solution, a buffer solution, a glucose solution, etc., and an anti-adsorption agent, for example, Tween80, Tween 20, or gelatin is added. What added human serum albumin etc. can be used. Alternatively, it may be freeze-dried to give a dosage form that is dissolved and reconstituted before use. Examples of excipients for freeze-drying include sugar alcohols such as mannitol and pudose. Sugars can be used. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Lewis rats using 6-week-old Lewis rats (purchased from Clea Japan, Inc.) as model animals develop arthritis when sensitized with Pepsi type 2 collagen and incomplete Freund's adjuvant.
  • changes in body weight and bone loss were measured in this arthritis model animal (confirmed by the thickness of Paw), compared with the measured values in normal rats, and further compared to Reference Example 4 (4) described later.
  • the effect of the described humanized antibody L chain version "d" on weight gain and bone loss was evaluated.
  • Preparation and grouping of arthritis model animals were performed as follows. First, a 5-week-old male Lewis rat was purchased as a rat (CLEA Japan), and a normal diet was fed for 1 week, and after acclimation, 12 6-week-old rats were prepared. 1 Divide the 2 rats into 3 groups of 4 rats and place them in several places around the ridges of the rats in the 1st and 2nd groups. A 1: 1 mixture (hereinafter referred to as “CI I / FA”) with a band (manufactured by DIFC0) was injected intradermally to a total volume of 1 ml. The rats in Group 3 were not treated as described above.
  • the first group received 10 mg / kg of a PTHrP neutralizing antibody diluted 2-fold with PBS on the first day of sensitization.
  • Group 2 received 2 ml PBS / kg body weight on the first day of sensitization.
  • the rats in Group 3 received neither CI I / FA nor PTHrP neutralizing antibodies.
  • the thickness of Paw was measured to evaluate the onset of arthritis. That is, the onset of arthritis and the degree of arthritis can be evaluated by measuring the thickness of Paw.
  • the thickness of the paw was measured using a Dial Thickness Gauge (manufactured by OZAKI MFG. Co., Ltd.), with the local portion interposed between gauges like a caliper.
  • the thickness measurement of Paw was performed once each over time (first day of sensitization, day 7, day 14, day 21).
  • the body weight of the rats in each group was measured over time (first day, day 7, day 14, day 21), and the bone mass of the rats in each group was measured over time (day one, day 7 of sensitization). , 14 and 21).
  • the bone mass was analyzed using a microforce X-ray imaging system and a BASE system (manufactured by FUJIFILM Corporation) on the rat's knee joint. After drawing a standard straight line, the vicinity of the metaphysis of the proximal tibia was quantitatively evaluated.
  • the expression of the PTH / PTHrP receptor gene could be confirmed in hypertrophic chondrocytes of the knee joint and osteoblasts along the trabecular bone and some cells of the bone marrow.
  • the number of positive cells in the bone marrow was clearly increased in the rats of Group 1 compared to Groups 2 and 3 from 1 week after sensitization.
  • the PTHrP neutralizing antibody is effective as an effective therapeutic agent for bone atrophy as well as preventing bone atrophy due to arthritis.
  • Hybridomas producing monoclonal antibodies against human PTHrP # 23-57-154 and # 23-57-137-1 were prepared as follows (Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993).
  • the amino acid sequence of human PTHrP (group 34) is No. 75.
  • PTHrP (l-34) (Peninsula) and thyroglobulin, a carrier protein, were conjugated using carbodiimid (Doj inn). Thyroglobulin-bound PTHrP (1-34) is dialyzed, adjusted to a protein concentration of 2 mg / ml, mixed 1: 1 with Freund's adjuvant (Difco), and made into 16 emulsions.
  • the female BALB / C mice were immunized 11 times with 100 g of the animal at the back subcutaneously or intraperitoneally. For the first immunization, Freund's complete adjuvant was used, and for the second and subsequent boosters, Freund's incomplete adjuvant was used.
  • the antibody titer in the serum of the immunized mice was measured by the following method. That is, blood was collected from the tail vein of a mouse, and after serum separation, antiserum diluted with RIA buffer and 1251 labeled PTHrP (1-34) were mixed, and the binding activity was measured. Mice with an increased antibody titer were finally immunized with 50 g / animal of PTHrP (1-34) not binding to carrier protein into the peritoneal cavity of the mice.
  • mice were sacrificed 3 days from the final immunization day, after removal of the spleen, splenocytes and Mausumiero Ma cell line P3x63A g 8U. 1 a Therefore the conventional method using 50% polyethylene glycol 4000 and cell fusion.
  • the fused cells were seeded at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / well in 85 96-well plates. Selection of hybridomas was performed using HAT medium. Hybridoma screening was carried out by measuring the presence or absence of a PTHrP-recognizing antibody by the solid-phased RIA method and selecting the culture supernatant in the wells in which growth was observed in the HAT medium.
  • the hybridomas were collected from the wells in which the antibody binding ability was confirmed, suspended in RPMI-1640 medium containing 15% FCS, and supplemented with 0PI-supplement (Sigma), and hybridized by limiting dilution. The doma was unified. Clones # 23-57-154 and # 23-57-137-1 having strong binding ability to PTHrP (l-34) were obtained.
  • the hybridoma clone # 23-57-137-1 was designated as mouse-mouse hybri doma # 23 -57-137-1 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Higashi 1 Tsukuba, Ibaraki, Japan) It has been deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5631, at 1-chome, 1-chome, 6th, August 15, 1996.
  • MRNA from hybridoma # 23-57-137-1 was prepared using Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech). The cells of the hybridoma # 23-57-137-1 were completely homogenized with an extraction buffer, and the mRNA was purified using an oligo (dT) -Cellulose Spun Column according to the instructions provided with the kit, followed by ethanol precipitation. The mRNA precipitate was dissolved in the elution buffer.
  • Cloning of the gene encoding the ⁇ chain V region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP was performed by the 5'-RACE method (Frohman, M.A. et al., Proc. Nail. Acad.
  • Reverse transcription to cDNA was performed by adding about 2 g of NA to type I, adding MHC2 primer-lOpinole, and reacting with reverse transcriptase at 52 ° (:, 30 minutes).
  • Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) was ligated to the 5 'end of the synthesized cDNA by reacting with T4 DNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours.
  • Anchor primer SEQ ID NO: 2
  • C-G1 primer SEQ ID NO: 3
  • PCR solution contains lOmM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KC1, 0.25mM dNTPs
  • oligo_dT primer was used as a primer for cDNA synthesis.
  • About 2 g of the nRNA prepared as described above was used as a ⁇ -form, an oligo-dT primer was added, and the mixture was reacted with a reverse transcriptase at 52 ° C. for 30 minutes to perform reverse transcription to cDNA.
  • the cDNA was purified by ethanol precipitation.
  • the amplified FINDER Anchor was ligated to the 5 'end of the synthesized cDNA with T4 DNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours.
  • a PCR primer MIX (SEQ ID NO: 4) was designed from the conserved sequence of the mouse L chain ⁇ chain constant region, and synthesized using a 394 DNA / RNA Synthesizer (ABI).
  • the PCR solution contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCK 0.25 mM dNTPs (dATP, dGT P, dCTP, dTTP), 1.5 Mm MgCl 2 , and 2.5 units of AmpliTad (PERKIN ELMER) in 100 n1 of the PCR solution.
  • PCR was performed 35 times using a Thermal Cycler Model480J (Perkin Elmer) with a temperature cycle of 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method as described above was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products). A piece of agarose containing a DNA fragment of about 550 bp as the H chain V region and about 550 bp as the L chain V region was cut out, and the A fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. did. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 20 mM 1 mM EDTA solution.
  • a DNA fragment containing a gene encoding a mouse H chain V region and an L chain V region having an EcoRI recognition sequence at the 5′-end and an Xmal recognition sequence at the 3′-end was obtained.
  • a DNA ligation kit ver. was prepared by digesting the EcoRI-Xmal DNA fragment containing the genes encoding the mouse H chain V region and L chain V region prepared as described above with EcoRI and Xmal. Using 2 (Takara Shuzo), the reaction was carried out at 16 ° C for 1 hour according to the attached procedure, and the ligation was performed.
  • This transformant was cultured overnight at 37 ° C in 2 ml of LB medium or 2XYT medium containing 100/2 g / ml or 50 / ig / ml of ampicillin, and a plasmid extractor P ⁇ -100 ⁇ ( Plasmid DNA was prepared using Kurabo Industries or QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN), and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above plasmid was determined using the Dye Terminator Cycle Se It was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer, ABI) using quenching kit (Perkin-Elmer). M13 Primer M4 (Takara Shuzo) as a primer for sequencing
  • nucleotide sequences (including the corresponding amino acid sequences) of the genes encoding the H chain V region and L chain V region of mouse # 23-57-137-1 antibody contained in plasmids MBC1H04 and MBC1L24 are shown in SEQ ID NOs: 57 and 65, respectively. Show. These amino acid sequences are shown in SEQ ID NO: 46 for the fragment of the H chain V region and SEQ ID NO: 45 for the fragment of the L chain V region.
  • the Escherichia coli having the plasmids MBC1H04 and MBC1L24 was designated as Escherichia col i JM109 (MBC1H04) and Escherichia col i JMl 09 (MBC1L24) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba, Ibaraki, Japan) 1-chome No. 1 1 Chuo No. 6), on August 15, 1996, FERM BP-5628 for Escherichia col i JMl 09 (MBC1H04) and FERM BP for Escheri chia col i JM109 (MBC1L 24) -5627, internationally deposited under the Budapest Treaty.
  • CDR complementarity determining regions
  • amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP was applied to the database of the amino acid sequence of the antibody prepared by Kabat et al. The decision was made as shown below.
  • the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the L chain V region are shown in SEQ ID NOs: 59-61, respectively, and the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the H chain V region are shown in SEQ ID NOs: 62-64, respectively.
  • the cloned mouse H chain V region was modified by PCR to ligate it to an expression vector containing the genomic DNA of the human H chain C region C ⁇ 1.
  • the rear primer MBC1-S1 (SEQ ID NO: 7) hybridizes to DNA encoding the 5'-side of the V region leader sequence and has a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. MoI. Biol., 196, 947-950, 1987) and the restriction enzyme Hind III.
  • the forward primer MBC1-a (SEQ ID NO: 8) was designed to hybridize to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region and to have a splice donor sequence and a recognition sequence for the restriction enzyme BamHI.
  • PCR was carried out using TaKaRa Ex Taa (Takara Shuzo), in a reaction mixture of 501, 0.07 g of plasmid MBC 1H04 as type I DNA, and 50 pmok of MBCta and MBC SI as primers, respectively.
  • 5U TaKaRa Ex Taa, 0.25mM dNTP, using the attached buffer, overlying 501 mineral oil, '94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C was performed 30 times with a 2-minute temperature cycle.
  • DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 3% NuSite GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agar mouth containing the 437b long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. Ethano purified thigh A After recovering the solution by precipitation with toluene, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 201 mM EDTA. The obtained DNA solution 11 was digested with restriction enzymes BamHI and Hind III (Takara Shuzo) for 3 I for 1 hour. The digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the HindIII-BamHI DNA fragment containing the gene encoding the mouse H chain V region prepared as described above was subcloned into the pUC19 vector prepared by digesting with HindIII and BamHI.
  • To confirm the nucleotide sequence of this plasmid use the Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-E liner) with primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV as primers, and use DNA Seauencer 373A (Perkin-Elmer) Were determined.
  • the plasmid having the BamHI recognition sequence was named MBC1H / PUC19.
  • H chain V region for production of cDNA type mouse-human chimera H chain Mouse H constructed as described above to be ligated to cDNA of human H chain C region C ⁇ 1
  • the chain V region was modified by PCR.
  • the rear primer MBC 1HVS2 (SEQ ID NO: 9) for the heavy chain V region converts the second asparagine of the sequence encoding the beginning of the V region leader sequence to glycine, and: Kozak consensus sequence (Kozak, M. et. al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), and Hind I and EcoRI recognition sequences.
  • the forward primer MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) for the V region of the H chain hybridizes to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region, and encodes the sequence 5'-side of the C region and Apa I And designed to have a Smal recognition sequence.
  • TaKaRa Ex Taa (Takara Shuzo) was used.
  • a reaction mixture of 501 0.6 g of plasmid MBC1H / PUC19 as type A, 50 pmole of MBC1HVS2 and MBC1H VR2 as primers, and 2.5 U of TaKaRa Ex Taq were used.
  • 501 mineral oil was used as the upper layer and subjected to 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute 30 times. .
  • 1% Sea Ke Separation was performed by agarose gel electrophoresis using GTG agarose (FMC Bio.
  • a piece of agarose containing a 456 bp DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. Purified]) NA was precipitated with ethanol and then dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20 mM 1 mM EDTA solution.
  • the obtained DNA solution 11 was digested with restriction enzymes EcoRI and Smal (Takara Shuzo) at 37 ° C for 1 hour. The digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. The EcoRI-Smal DNA fragment containing the gene encoding the mouse H chain region prepared as described above was subcloned into the pUC19 vector prepared by digesting with EcoRI and Smal. To confirm the nucleotide sequence of this plasmid, use Primer M13 Primer M4 and M13 Primer V as primers, Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer), and DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer). It was determined.
  • a plasmid having an Apal and Smal recognition sequence on the '-side was designated as MBClHv / pUC19.
  • CDNA containing the human antibody H chain C region C ⁇ 1 was prepared as follows. That is, the expression vector DHF encoding the humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody H chain C region IgGl genomic DNA (N. Taka ashi, et al., Cell 29, 671-679 1982). R-AE-RV-PM-lf (see W092 / 19759) and an expression vector that encodes the genomic DNA of humanized PM1 antibody L chain V region and human antibody L chain / c chain C region (See 092/19759) mRNA was prepared from the transfected CH0 cells, and the cDNA containing the humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody C region Cr1 was cloned by RT-PCR. And subcloned into Hind I and BamHI sites of pUC19. After confirming the nucleotide sequence, the plasmid having the correct sequence was named pRVli-PMli-cDNA.
  • Hind I between SV40 promoter on DHFR-AE-HVli-PM-HV and DHFR gene An expression vector was prepared in which the EcoRI site between the II site and the EF-la promoter and the humanized PM1 antibody H chain V region was deleted, and the humanized PM1 antibody H chain V region and the human antibody were deleted. It was used to construct an expression vector for cDNA containing the C region Crl.
  • the pRVh-PMli-cDNA was digested with BamHI, blunted with Klenow fragment, and further digested with HindIII to prepare a blunt HindIII-BamHI fragment.
  • This Hind III-BamHI blunted fragment was ligated to an expression vector prepared by digesting the above DHFR- ⁇ -RVh-PMl-f lacking the Hind III site and EcoRI site with Hind III and Smal. Then, an expression vector RVh-II-cDNA containing cDNA encoding the humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody C region Cr1 was constructed.
  • Expression vector RVh- ⁇ - containing cDNA encoding human H chain V region and human antibody C region Cr1 encoding the human chain PM1 antibody RVh- ⁇ — cDNA is digested with Apal and BamHI, and then contains the H chain C region
  • the MA fragment was recovered and introduced into MBC1 Hv / pUC19 prepared by digestion with Apal and BamHI.
  • the plasmid thus prepared was named MBClHcDNA / pUC19.
  • This plasmid contains cDNA encoding the H chain V region of the mouse antibody and the C region of the human antibody C region, and has EcoRI and HindIII recognition sequences at the 5'-end and BamHI recognition sequences at the 3'-end.
  • Plasmid MBClHcDNA / pUC19 was digested with EcoRI and BamHI, and the obtained DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the H chain of the chimeric antibody was introduced into an expression vector pCOSl prepared by digesting with EcoRI and BamHI.
  • the expression plasmid for the chimeric antibody thus obtained was named MBClHcDNA / pCOSl.
  • For expression vector pCO SI delete the antibody gene from HEF-PM-gr1 (see W092 / 19759) by digestion with EcoRI and Smal, and ligate with EcoRI-Notl-BamHI Adapter 1 (Takara Shuzo). It was constructed by
  • the plasmid MBClHcDNA / pUC19 is digested with EcoRI and BamHI, and the resulting DNA fragment containing the chimeric antibody H chain sequence is digested with EcoRI and BamHI.
  • the expression plasmid of the chimeric antibody thus obtained was named MBClHcDNA / pCHOl.
  • the expression vector pCHOl is DHFR-AE-rvH-PMl- f (see W092 / 19759), the antibody gene was deleted by EcoRI and Smal digestion, and Eco I-Notl-BamHI Adapter (Takara Shuzo) was ligated.
  • a PUC19 vector lacking the Hind III site was constructed. Digest 2 g of PUC19 vector in a reaction mixture containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), lOmM MgCl 2 , lmM DTT, Hind III (Takara Shuzo) with 100 mM KCK 8U for 1 hour at 37 ° C for 1 hour did. The digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA was mixed at room temperature in a 50 1 reaction mixture containing 50 Tris-HCl (pH 7.5) 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 mM NaCL 0.5 mM dNTP, 6 U Klenow fragment (GIBCO BRL). Reaction was carried out for 20 minutes to blunt the ends. The reaction mixture was extracted with phenol and chloroform, and the vector DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • 2XYT agar medium containing 50 g / ml ampicillin coated with X-gal and IPTG (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, The cells were spread on Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and cultured overnight at 37 ° C to obtain transformants.
  • the transformant was cultured overnight at 37 ° C in 20 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and plasmid DNA was purified from the cell fraction using Plasmid Mini Kit (QIAGEN) according to the attached protocol .
  • the purified plasmid was digested with Hind III, Hind III site was designated plasmid PUC19 AHind III confirming that lacking c (ii) Construction of gene encoding human L chain ⁇ chain constant region
  • At least four isotypes of the human antibody light chain C chain C region are known: Mcg + Ke + Oz-, Meg- Ke- Oz-, Meg- Ke- Oz-ten, and Meg- Ke + Oz- (P. Dari avach , et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987).
  • # 23-57— 13 7-1 A human antibody L-chain ⁇ -chain C region with homology to the mouse L-chain ⁇ -chain C region was searched on EMBL data, and the isotype was Mcg + Ke + Oz- (acces sion No. X5781 9) (P. Dari avach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987).
  • HLAMB 1 SEQ ID NO: 11
  • HLAMB3 SEQ ID NO: 13
  • HLAMB2 SEQ ID NO: 12
  • HLAMB4 SEQ ID NO: 14
  • the respective primers Have complementary sequences of 20 to 23 bp at both ends.
  • the external primers HLAMBS (SEQ ID NO: 15) and HLAMBR (SEQ ID NO: 16) have sequences homologous to HLAMB 1 and HLAM B4, respectively.
  • HLAMBS has EcoRI, HindIII, Blnl recognition sequences
  • HLAMBR has EcoRI. Each contains a recognition sequence.
  • HLAMB 1-HLAMB2 and HLAMB3-HLAMB4 were reacted in the first PCR. After the reaction, they were mixed in equal amounts, and assembly was performed by the second PCR. Further, external primers HLAMBS and HUMBR were added, and the full-length DNA was amplified by the third PCR.
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taa (Takara Shuzo) according to the attached prescription.
  • a reaction mixture of 100 1 containing pmole of HLAMB4 and 5 U of TaKaRa Ex Taq overlaying 50 1 mineral oil on the upper layer at 94 ° C for 1 minute and at 60 ° C for 1 minute 5 times with a 1 minute temperature cycle at 72 ° C.
  • the reaction solutions were mixed at a ratio of 50 1 each, and the mixture was subjected to a temperature cycle of 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute three times in the upper layer of mineral oil 3 times.
  • Third PC R was performed by adding 50 pmole of each of the external primers HLAMBS and HLAMBR to the reaction mixture, and performing the cycle 30 times at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. .
  • the DNA fragment of the third PCR product was electrophoresed on a 3% low-melting point agarose gel (NuSieve GTG Agarose, FMC), and then recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101) according to the attached instructions.
  • the obtained DNA fragment was placed at 37 ° C in a reaction mixture of 20 1 containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 mM NaCl, and 8 U EcoRI (Takara Shuzo). Digested for 1 hour. The digestion mixture was extracted with phenol and black form, DNA was recovered by ethanol precipitation, and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 8 mM 1 mM EDTA solution.
  • plasmid pUC19AHindIII was similarly digested with EcoRI, extracted with phenol and black form, and recovered by ethanol precipitation.
  • the digested plasmid PUC19 ⁇ III was added to a reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM MgCl 2 , and alkaline phosphatase (E.coli C75, Takara Shuzo) at 37 ° C at 50 ° C.
  • the mixture was reacted for 30 minutes and subjected to dephosphorylation treatment (BAP treatment).
  • BAP treatment dephosphorylation treatment
  • the reaction solution was extracted with phenol and chloroform, the DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in lOmM Tris-HCl (pH 7.4), 10 x 1 of ImM EDTA solution.
  • the BAP-treated plasmid PUC19 AHind III 11 and the PCR product 41 described above were ligated using DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli JM109 recombinant cells.
  • the resulting transformant was cultured overnight in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAG EN).
  • the plasmid CA A / pUC19 containing the deleted DNA was converted into type III, and reacted with primers H LAMBS and HCLMR, and HCLMS and HLAMB4.
  • Each PCR product was purified and assembled in a second PCR. Further, external primers HLAMBS and HLAMB4 were added, and the full-length DNA was amplified by the third PCR. .
  • the first PCR 100 ⁇ l of a reaction mixture containing 0.1 ⁇ g of A / pUC19, 50 pmole of each of primers HLAMBS and H CLMR, or 50 pmole of each of HCLMS and HLAMB4, and 5 U of TaKaRa Ex Tad (Takara Shuzo) was used for the first PCR.
  • the upper layer of 50 ⁇ 1 mineral oil was cycled 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute.
  • PCR products HLAMBS-HCLMR (236 bp) and HCLMS-HL cliff B4 (147 bp) were each electrophoresed on a 3% low melting point agarose gel, and then recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101).
  • a 20 ⁇ 1 reaction mixture containing 40 ng of each purified DNA fragment and 1 U of TaKaRa Ex Taa was used. Temperature cycling was performed 5 times at 1 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 1 minute.
  • PCR In the third PCR, 2 l of the second PCR reaction solution, 50 pmole of each of the external primers HLAMBS and HLAMB4, and 100 n1 of the reaction mixture containing 5 U of TaKaRa Ex Taa (Takara Shuzo) were used, and 501 mineral oil was overlaid. . PCR was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. The third PCR product, a 357 bp DNA fragment, was electrophoresed on a 3% low-melting-point agarose gel, and recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101).
  • the nucleotide sequence of the purified plasmid was determined using M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) using a 373A DNAsequencer (ABI). Correct without deletion The plasmid confirmed to have the nucleotide sequence was designated as C ⁇ / ⁇ 9.
  • the obtained DNA fragment was digested with EcoRI and cloned into BAP-treated plasmid pUC19 ⁇ HindIII.
  • E. coli JM109 competent cells were transformed, cultured overnight in 2 ml of 2 XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) .
  • the nucleotide sequence of the purified plasmid was determined using M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) using a 373A DNA seduencer (ABI).
  • the plasmid confirmed to have the correct nucleotide sequence was designated as C / ZpUC19.
  • a chimeric # 23-57-137-1 antibody light chain expression vector was constructed.
  • the genes encoding the # 23-57-137-1 light chain V region were ligated to the HindIII and Blnl sites immediately before the human antibody constant region of plasmids CAZpUCl9 and C / c / pUC19, respectively.
  • a PUC19 vector encoding the antibody # 23-57-137-1 L chain V region and L chain ⁇ chain or L chain / 1 chain constant region was prepared.
  • the chimeric antibody L chain gene was excised by EcoRI digestion and subcloned into a HEF expression vector.
  • the # 23-57-137-1 antibody L chain V region from plasmid MBC1L24 was And closed.
  • the synthesis of each primer was performed using 394 DNA / RNA synthesizer (ABI).
  • the rear primer MBCCHL1 (SEQ ID NO: 21) used Hind III recognition sequence and Kozak sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), and the front primer MBCCHL3 (SEQ ID NO: 22) used Bglll was designed to have an EcoRI recognition sequence.
  • PCR contains Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCK 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.1 tg MBC1L24, 50 pmole of MBCCHL1 and MBCCHL3 as primers, and 11 AmpliTa PERKIN ELMER) 100 Using the reaction mixture of 1 above, 501 mineral oil was layered on the upper layer, and the cycle was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 30 times.
  • the 444 bp PCR product is electrophoresed on a 3% low melting point agarose gel, recovered from the gel using the GENECLEAN II kit (BI0101), purified, and dissolved in lOmM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution 201 did.
  • Reaction mixture containing 1 n1 of PCR product each containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U Hind III (Takara Shuzo) and 8 U EcoRI (Takara Shuzo) Digested for 1 hour at 37C in 201.
  • the digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 8 mM 1 mM EDTA solution.
  • the BAP-treated plasmid pUC1911I and the above PCR product 41 were ligated using DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo), and transformed into E. coli JM109 competent cells (Futtsubon Gene) in the same manner as described above. This was spread on a 2XYT agar medium containing 50 g / nil ampicillin and cultured overnight at 37 ° C. The obtained transformant was cultured at 37 ° C. overnight in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin. The plasmid was purified from the cell fraction using a QIA prep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Determine base sequence After the determination, the plasmid having the correct nucleotide sequence was designated as CHL / pUC19.
  • Plasmids CA / pUC19 and CK / PUC19 (1 g each) were combined with 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), lOmM MgCl 2 , 1 mM DTT, lOOmM KC1, 8U Hind III (Takara Shuzo) and 2U Blnl (Takara Shuzo).
  • the c- digestion mixture which was digested at 37 ° C for 1 hour in the reaction mixture 1 containing, was extracted with phenol and chloroform, DNA was recovered by ethanol precipitation, and BAP treatment was performed at 37 ° C for 30 minutes. went.
  • the reaction solution was extracted with phenol and chloroform, DNA was recovered by ethanol precipitation, and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 1 mM EDTA solution 101.
  • This L chain V region DNA41 was subcloned into BAP-treated plasmids CA / pUC19 or C // UC19, respectively, and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were cultured overnight in medium 31111 containing ampicillin and the plasmid was purified from the bacterial cell fraction using QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). These were designated as plasmids MBClL (A) / pUC19 and MBC1L (/ c) / pUC19, respectively.
  • Plasmids MBC1L U) / pUC19 and MBC1L ( ⁇ ) / pUC19 were each digested with EcoRI, electrophoresed on a 3% low-melting-point agarose gel, and the 7431DP DNA fragment was recovered from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101) and purified. Then, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and ImM EDTA solution 101.
  • the plasmid HEF-PMlk-gk 2.7 was digested with EcoRI, extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. After BAP treatment, the recovered DNA fragment was electrophoresed on a 1% low-melting-point agarose gel, and the 6561 bp DNA fragment was recovered from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101), purified, and lOmM Tris-HCl (pH 7.4). ) Was dissolved in ImM EDTA solution 101.
  • BAP-treated HEF vector 21 is transferred to the above plasmid MBCIL (A) or MBClL (/)
  • Each of the EcoRI fragments was ligated with 3 ⁇ 1, each was cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin transformed into E. coli JM109 competent cells, and the plasmid was isolated from the cell fraction using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Purified.
  • the purified plasmid was placed in a reaction mixture 1 containing 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ⁇ 1 mM DTT, 1 OOmM KC1, 8 U Hindlll (Takara Shuzo) and 2 U Pvul (Takara Shuzo). Digested for 1 hour at 37 ° C.
  • plasmids inserted in the correct direction would be MBClL (A) / ne 0 and MBClL (/ c) / neo.
  • the expression plasmid was transiently expressed in COS-7 cells in order to evaluate the antigen binding activity and neutralizing activity of the chimeric antibody.
  • the transient expression of the chimeric antibody is determined by using a Gene Pulser apparatus (Bio Rad) with a Gene Pulser device (Bio Rad) using a combination of plasmids MBClHcDNA / pCOSl and MBCIL (A) / neo or MBClHcDNA / pCOSl and MBClL (c) / neo.
  • COS-7 cells were co-transduced.
  • PBS (-) at a cell concentration of lxlO 7 cells / ml, add 10 zg of each plasmid DNA and pulse at 1,500 V, 25 F capacitance. Gave.
  • the electroporated cells were suspended in DMEM medium (GIBC0) containing 2% "Ultra Low IgG ⁇ fetal serum (GIBC0), after C0 2 incubator one by cultured. 72 hours of culture was used to collect the culture supernatant, to remove cell debris by centrifugation, and subjected to ELISA sample.
  • DMEM medium GIBC0
  • GIBC0 DMEM medium
  • GIBC0 "Ultra Low IgG ⁇ fetal serum
  • An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows.
  • TAG0 concentration of (TAG0) Immobilizes with 100 1 and 200
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ dilution buffer 50 mM Tris-HC ImM MgCl 2 , 0.1 M NaCK 0.05% Tween 20, 0.023 ⁇ 4 NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA), pH 7.2
  • the culture supernatant of COS cells expressing the antibody or the purified chimeric antibody was serially diluted and added to each well.
  • An E1 ISA plate for measuring antigen binding was prepared as follows. Each well of the 96-well plate for ELI SA was immobilized with human PTHrP (1-34) (Peptide Research Laboratories) 1001, which was adjusted to a concentration of 1 g / ml with an immobilization buffer. After blocking with a dilution buffer of 2001, the culture supernatant of the COS cells expressing the chimeric antibody or the purified chimeric antibody was serially diluted and added to each well. After incubating at room temperature and washing with PBS-Tween20, 100 liters of goat anti-human IgG antibody (TAGO) conjugated with alkaline phosphatase was added.
  • TAGO goat anti-human IgG antibody
  • the chimeric antibody had the ability to bind to human PTHrP (1-34) and had the correct structure of the cloned mouse antibody V region.
  • the binding ability of the chimeric antibody to ⁇ HrP (l-34) does not change regardless of whether the L chain C region is a ⁇ chain or a ⁇ chain, the L chain C region of the humanized antibody is It was constructed using a humanized antibody L chain and ⁇ chain.
  • the expression plasmid was introduced into CH0 cells (DXB11).
  • the establishment of a cell line for stable production of chimeric antibodies is based on the expression plasmid MBC 1H for CH0 cells.
  • MBC 1H expression plasmid MBC 1H for CH0 cells.
  • CHO cells were co-transduced by electoporation using a Gene Pulser apparatus (Bio Rad).
  • Each expression vector was digested with the restriction enzyme Pvul to obtain linear DNA, and after extraction with phenol and chloroform, the DNA was recovered by ethanol precipitation and used for elect-mouth poration.
  • Each plasmid DNA was added to 0.8 ml of CH0 cells suspended at a cell concentration of lxlO 7 cells / ml in PBS (-), and pulsed at a capacitance of 1,500 V, 25. After a 10-minute recovery period at room temperature, the cells treated with Erect Oral Portion were suspended in MEM-medium (GIBC0) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBC0), and the cells were placed in three 96-well plates (GIBC0). They were cultured in a C0 2 incubator one by using the Falcon).
  • MEM-medium GIBC0
  • GIBC0 MEM-medium
  • GIBC0 fetal calf serum
  • GIBC0 fetal calf serum
  • GENETICIN G418 Sulfate, GIBC0
  • GIBC0 MEM-spun medium
  • Humanized # 23-57-137-1 antibody H chain was prepared by CDR-grafting using PCR method. Made. Humanized # 23-57-137-1 antibody H chain with FR derived from human antibody S31679 (NBRF-PDB, Cuis inier AM et al., Eur. J. I., 1, 23, 110-118, 1993) Six PCR primers were used to generate (version "a").
  • CDR-grafting primers MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) and MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) have a sense DNA sequence
  • CDR-grafting primers MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 25) and MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) [Antisense]) has an NA sequence, and each has a complementary sequence of 15 to 21 bp at both ends of the primer.
  • the external primers MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) and MBC1HVR1 (SEQ ID NO: 28) have homology with CM grafting primers MBC1HGP1 and MBC1HGP4.
  • CDR-grafting primers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 were separated using a urea denaturing polyacrylamide gel (Molecular Cloningr Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Crush and soak method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • each nmole of the CDR-grafting primer was separated on a 6% denaturing polyacrylamide gel, and the DNA fragment of the desired size was identified by irradiating it with ultraviolet light on a silica gel thin plate, and the crush and soak method was performed.
  • the gel was recovered from the gel and dissolved in 201 OmM Tris-HCl (pH 7.4) and ImM EDTA solution.
  • the PCR was performed using TaKaRa Ex Ta (Takara Shuzo) and the CDR-grafting primers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 prepared as above in 100 1 reaction mixture at 11, 0.25 mM, respectively.
  • a piece of agarose containing a 421 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEANII Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and ImM EDTA solution 201. Profit The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by digesting with BamHI and Hindlll, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hMBCHv / pUC19.
  • the humanized H chain V region constructed as described above was modified by PCR.
  • the rear primer MBC1HVS2 hybridizes with the sequence encoding the 5'-side of the V region leader sequence, and has a Kozak consensus sequence (Kozak, M, et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), Hindlll And EcoRI recognition sequence.
  • the forward primer for the V region of the H chain, MBC 1HVR2 hybridizes to the DNA sequence encoding the 3 'side of the J region, and encodes the sequence 5'-side of the C region, and has Apal and Smal recognition sequences. Designed to.
  • PCR For PCR, use TaKaRa Ex TaQ (Takara Shuzo), use 0.4 g of hMBCHv / pUC19 as type I DNA, and attach MBC1HVS2 and MBC1HVR2 as primers, each containing 50 pmole, 2.5 U TaKaRa Ex TaQ, and 0.25 mM dNTP.
  • the cycle was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agar mouth containing a 456 bp DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEANII Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20 mM lmM EDTA solution. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by digesting with EcoM and Smal, and the nucleotide sequence was determined.
  • the plasmid having Apal and Smal recognition sequences was designated as hMBClHv / pUC19.
  • the plasmid RVli-PMli-cDNA containing the sequence of the hPMl antibody H chain cDNA is digested with Apal and BamHI, the DNA fragment containing the H chain C region is recovered, and digested with Apal and BamHI. And introduced into hMBCmv / pUC19 prepared by The plasmid thus prepared was named ⁇ ClHcDNA / pUC19.
  • This plasmid contains the H chain V region of the humanized # 23-57-137-1 antibody and the human H chain C region C ⁇ 1, EcoRI and Hindlll recognition sequences at the 5'-end, and 3'-end Has a BamHI recognition sequence.
  • SEQ ID NO: 58 shows the nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of humanized H-chain purgeon "a" contained in plasmid hMBClHcDNA / pUC19.
  • the amino acid sequence of version a is shown in SEQ ID NO: 56.
  • hMBC1HCDNA / PUC19 was digested with EcoRI and BamHI, and the ⁇ A fragment containing the obtained H chain sequence was introduced into an expression plasmid pCOSl prepared by digesting with EcoRI and BamHI.
  • the expression plasmid for the humanized antibody thus obtained was named hMBClHcDNA / pCOSl.
  • An L chain gene was constructed in which the FR regions of the humanized antibody and the mouse (chimeric) antibody were recombined, and each region for humanization was evaluated.
  • an octibride antibody was prepared in which FR1 and FR2 were derived from a human antibody, and FR3 and FR4 were derived from a mouse antibody.
  • Plasmids MBClL (t) / neo and JiMBClL (A) / neo were converted to IOBIM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , ImM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) BSA, Aflll (Takara Shuzo) 10 U was digested at 37 ° C.
  • reaction mixture 1 containing The reaction mixture was electrophoresed on a 2% low melting point agarose gel, and a 6282 bp fragment (referred to as cl) and a 1022 bp fragment (referred to as c2) from plasmid MBClL (A) / neo, and a 6282 bp fragment from plasmid hMBCIL ( ⁇ ) / neo (Referred to as hi) and a fragment of 102213P (referred to as h2) were recovered from the gel using the GENECLEA II Kit (BI0101) and purified.
  • cl a 6282 bp fragment
  • c2 1022 bp fragment from plasmid MBClL
  • ⁇ plasmid hMBCIL
  • h2 fragment of 102213P
  • the BAP-treated c1 and h1 fragment 11 were ligated to h2 and c'2 fragment 41, respectively (4 ° C., overnight) and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using QIAprep Spin Plasmid KU (QIAGEN).
  • Digestion was performed at 37 ° C for 1 hour in 20 ⁇ 1 of a reaction mixture containing 2 U of I (Takara Shuzo) or 8U of BamHI (Takara Shuzo) and 8U of Hindlll (Takara Shuzo). If c1-h2 was correctly ligated, the plasmid was confirmed by generating digested fragments of 5560/1246/498 bp with ApaLI and 7134/269 bp with BamHI / Hindlll.
  • Plasmid hMBClLdA / pUC19 containing the humanized antibody L chain V region in which the tyrosine at position 91 (amino acid position 87 according to Kabat's definition) in R3 was substituted with isoleucine was used as type I.
  • Plasmid MBClL (A) / pUC19, hMBClLa ⁇ / pUC19 and hMBClL (each 10 g of U / pUC19 was lOmM Tris-HCl (pH 7.5), lOmM MgCl 2 , ImM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v)
  • the reaction mixture containing BSA, Hindlll 16U and Aflll 4U was digested for 1 hour at 37 ° C in 30 z 1.
  • the reaction solution was electrophoresed on a 2% low melting point agarose gel, and 215 bp from plasmid MBClL (A) / pUC19 ( c2 '), plasmid 11! ⁇ 3 ⁇ 4 (11 ⁇ / 1) (; 19 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 [; 11 ⁇ / 1] (; 19) and 3218bp (hal', hdl ') DNA fragments from GENECLEANII
  • the gel was collected and purified using Kit (BI0101).
  • the al ⁇ hdl 'fragment was ligated to each c2' fragment and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). This These were designated as plasmids m / hMBClLaA / pUC19 and m / hMBClLc / pUC19, respectively.
  • the obtained plasmid Hm / MBClLaA / pUC19 and m / MBClLd ⁇ / pUC19 were digested with EcoRI. Each 743 bp DNA fragment was electrophoresed on a 2% low melting point agarose gel, recovered from the gel using GE NECLEANII Kit (BI0101), purified, and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), ImM EDTA solution 201 did.
  • Each DNA fragment 41 was ligated to the aforementioned BAP-treated HEF vector 1a1, and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 ig / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • Each purified plasmid was mixed with 20 ⁇ 1 of 20 ⁇ 1 containing 20 ⁇ Tris-HCl ( ⁇ 8.5), 10 mM MgCl 2 , ImM DTT, 10 OmM KC1, Hindlll (Takara Shuzo) 8U and Pvul (Takara Shuzo) 2U. Digested at ° C for 1 hour. Plasmid was confirmed by the fact that a digested fragment of 5104/2195 bp was generated if the fragment was inserted in the correct direction, and a digested fragment of 4378/2926 bp if inserted in the reverse direction.
  • the expression vectors encoding the mouse FR1, 2Z human FR3, 4 hybrid antibody L chains were m / hMBClLaA / neo and ni / hMBClLdA / neo, respectively.
  • lml and hml fragment 11 were linked to hm2 and m2 fragment 41, respectively.
  • Cells were transformed. The cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 ig / nil ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • Each purified plasmid was placed in a reaction mixture 1 containing 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , liM DTT, Apal (Takara Shuzo) 8 U, or ApaLI (Takara Shuzo) 2 U at 37 ° C. Digested for 1 hour.
  • Humanized # 23-57-137-1 antibody L chain was produced by CDR-grafting by PCR.
  • Six PCR primers were used to generate the humanized # 23-57-137-1 antibody light chain (version "a").
  • CDR-grafting primers MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) and MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) have a sense DNA sequence
  • CDR-grafting primers MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) and MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) have an antisense DNA sequence.
  • a complementary sequence of 15 to 21 bp at each end of the primer External primers MBC1LV S1 (SEQ ID NO: 33) and MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34) have homology with CDR grafting primers MBC1L GP1 and MBC1LGP4.
  • CDR-grafting primers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4 were separated using a urea denaturing polyacrylamide gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook3 ⁇ 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). crush and soak method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sa mbrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • each separating CDR- grafting primers one lnmole 6% denaturing Poria acrylic amide gel, performed by irradiating ultraviolet rays to the identification of DNA fragments of a desired size by a silica gel thin layer plate on, crus h and soak
  • the gel was recovered from the gel by the method and dissolved in 201 mM Tris-HCl (pH 7.4) and ImMEDTA solution.
  • PCR was performed by using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and adding the CDR-grafting primers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4 prepared as described above to 100 1 reaction mixture, respectively, ll, 0.25 mM dNTP, 2.5 U
  • the reaction mixture was performed 5 times at a temperature cycle of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute using the attached buffer under conditions including TaKaRa Ex Taq.
  • 50 pmole of the external primers MBC1LVS1 and MBC1L VR1 were added thereto, and the mixture was further reacted 30 times in the same temperature cycle.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • TaKaRa Tad (Takara Shuzo) was used in a 100 il reaction mixture. Plasmid hMBCL / pUC19 as type I DNA, MBC1LVS1 and MBC1LGP10R as primers were each 50 pmole, and 2.5 U TaKaRa Ex TaQ (Takara Shuzo) 0.25 mM. Temperature cycle at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, at 72 ° C for 1 minute using 50% mineral oil as the upper layer using the attached buffer under conditions containing dNTPs Went 30 times. DM fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agar mouth containing a 421 bp DNA fragment was cut out, and the GENECLEANII Kit (BI0101) was used to purify the NA fragment according to the instructions attached to the kit.
  • the resulting PCR reaction mixture was subcloned into PUC19 prepared by digestion with BamHI and Hindlll.
  • the nucleotide sequence was determined using M13 Primer M4 primer and M13 Primer RV primer.As a result, the correct sequence was obtained.
  • This plasmid was digested with Hindlll and Blnl, and the 416 bp fragment was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. And separated. The ⁇ A fragment was purified using GENECLEANII Kit (BIOIOI) according to the instructions attached to the kit.
  • the obtained PCR reaction mixture was introduced into a plasmid CAZpUC19 prepared by digesting with Hindlll and Blnl, and named plasmid hMBClLaA / pUC19.
  • This plasmid was digested with EcoRI, and a sequence containing a sequence encoding the humanized L chain was introduced into the plasmid pCOSn, so that the start codon of the humanized L chain was located downstream of the EFla promoter.
  • the plasmid thus obtained was named hMBClLaA / pCOSl.
  • SEQ ID NO: 66 shows the nucleotide sequence (including the corresponding amino acid) of humanized L chain version "a”. The amino acid sequence of version a is shown in SEQ ID NO: 47.
  • Version "b” was created using mutagenesis by PCR. Version “b” is designed to change glycine at position 43 (amino acid number 43 according to Kabat) to proline, and lysine at position 49 (amino acid number 49 according to abat) to aspartic acid. did.
  • the plasmid was subjected to PCR using the plasmid hMBClLaA / pUC19 as type III, and the resulting DNA fragment was digested with BamHI and Hindlll and subcloned into the BamHI and Hindlll sites of pUC19. .
  • nucleotide sequence was determined, it was digested with the restriction enzymes Hindlll and ⁇ , and ligated to 113 ⁇ 43 ⁇ 4 (11 ⁇ ⁇ / 1) (; 19) digested with Hindlll and ⁇ 11.
  • the plasmid thus obtained was designated as hMBClLbA / pI! C19, and this plasmid was digested with EcoRI to encode a humanized L chain.) A fragment containing NA was introduced into plasmid pCOSl, and a humanized fragment was placed downstream of the EF1 ⁇ promoter. The start codon of the modified L chain was located. The plasmid thus obtained was named BClLiU / pCOSl.
  • Version "c” was prepared using mutagenesis by PCR. Version “c” was designed to replace serine at position 84 (amino acid number 80 according to Kabat's rules) with proline. Mutagenic primer MBC1LGP6S (SEQ ID NO: 37) and primer M13 Prim PCR was carried out using the plasmid MBClLaA / pUC19 as a type III by er. The obtained DNA fragment was digested with BamHI and Hindlll, and subcloned into PUC19 prepared by digesting with BamHI and Hindlll.
  • hMBClLc A / pUC19 This plasmid was digested with EcoRI restriction enzyme, and a sequence containing a sequence encoding a humanized L chain was introduced into the EcoRI site of plasmid pCOSl. The start codon of the humanized L chain was located at The plasmid thus obtained was named hMBClLcA / pCOSl.
  • Versions "d”, “e” and “f” were created using mutagenesis by PCR. Each version was designed so that the tyrosine at position 91 (amino acid number 87 according to Kabat's definition) of the "a", “b”, and “c” versions was changed to isoleucine in order.
  • PCR was performed using the mutagen primer MBC1LGP11R (SEQ ID NO: 38) and the primer M-S1 (SEQ ID NO: 44) as a type I hMBClLaA / pCOSl, hMBClLA / pCOSl, and hMB LcA / pCOSl, respectively, and obtained DNA fragments.
  • the plasmids thus obtained were designated as hMBClLdA / pUC19, hMBClLeA / pUC19 and MBC1LfA / pUC19 in this order. These plasmids were digested with EcoRI, and the sequence containing the sequence encoding the humanized L chain was introduced into the EcoRI site of plasmid pCOSl so that the initiation codon of the humanized L chain was located downstream of EFla promoter. did.
  • the plasmids thus obtained were named liMBClLdA / pCOSl and hMBClLe ⁇ / pCOSK hMBClLf ⁇ / pCOS1, respectively.
  • the obtained PCR fragment was digested with Apal and Hindll and introduced into plasmids BClLaA / pUC19 and hMBClLc / pUC19 digested with Apal and HindII.
  • the plasmids containing the correct sequence are designated as hMBClLgA / pUC19 and hMBClLlU / pUC19, respectively.
  • These plasmids are digested with EcoRI, and the sequence containing the sequence encoding the humanized L chain is replaced with the EcoRI of plasmid pCOSl.
  • the start codon of the humanized light chain was located downstream of the EFla promoter.
  • the plasmids thus obtained were named liMBClLgA / pCOSl and hMBClLi / pCOSl, respectively.
  • PCR was performed using the mutagenic primer MBC1LGP14S (SEQ ID NO: 41) and the primer- V1RV) (SEQ ID NO: 43) with the plasmid IiMBClLaA / pUC19 as type I, and the resulting DNA fragment was digested with Apal and Blnl, and digested with Apal and Blnl.
  • the plasmid prepared by digestion was subcloned into 111 ⁇ [; 11 ⁇ person / 1] (19.
  • the nucleotide sequence was determined, and the clone into which the mutation corresponding to each version was introduced was selected.
  • This plasmid is digested with EcoRI, and the sequence containing the sequence encoding the humanized L chain is converted into plasmid pCOSl
  • Tyrosine at position 91 amino acid number 87 according to Kabat's rule
  • the nucleotide sequences (including the corresponding amino acids) of versions "Q", “r", “s” and “t” are shown in SEQ ID NOs: 71, 72, 73 and 74, respectively.
  • the amino acid sequences of these versions are shown in SEQ ID NOs: 52, 53, 54, and 55, respectively.
  • Plasmid thigh BCILQA / PCOSI was digested with Hindlll and EcoRI, subcloned into plasmid PUC19 digested with Hindlll and EcoRI, and named plasmid hMBClLQA / pUC19.
  • Table 5 shows the position of the substituted amino acid in each version of the humanized L chain.
  • Y indicates tyrosine
  • ⁇ indicates proline
  • ⁇ indicates lysine
  • V indicates valine
  • D indicates aspartic acid
  • I indicates isoleucine
  • the plasmids having the plasmids hMBClHcDNA / pUC19 and hMBClLq; i / pUC19 are Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA / pUC19) and Escherichia coli JM109 (hMBClLq; i / pUC19), respectively.
  • the expression plasmid was transiently expressed in COS-7 cells in order to evaluate the antigen-binding activity and neutralizing activity of the hybrid antibody and the humanized # 23-57-137-1 antibody. That is, for transient expression of L-chain hybrid antibody, plasmid hMBClHcDNA / pC 0S1 and h / mMBClL (A) / neo, hMBClHcDNA / pCOSl and m / liMBClLaA / neo, hMBClHcDNA / CO S m / hMBClL (/ neo, hMBClHcDNA / pCOSl and hMBC1L ( ⁇ ) / neo, or hMBClHcDN A / pCOS And mhiiiMBClL (A) / neo were co-transduced into COS-7 cells by electroporation using
  • An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows.
  • BSA bovine serum albumin
  • ELISA plates for antigen binding measurement were prepared as follows. Each well of a 96-well ELISA plate was immobilized with human PTHrP (tri-34) 100 / ⁇ 1 prepared at a concentration of 1 g / ml using a solid phase buffer. After blocking with the dilution buffer of 20021, the culture supernatant of COS-7 cells expressing the hybrid antibody or the humanized antibody or the purified hybrid antibody or the humanized antibody was serially diluted and added to each well. After incubating at room temperature and washing with PBS-Tween 20, 100 il of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (TAG0) was added.
  • TAG0 alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody
  • the antibody combining the humanized H chain version "a” and the chimeric L chain had the same PTHrP binding ability as the chimeric antibody. This result indicates that version "a” is sufficient for humanization of the H chain V region.
  • the humanized H chain version "a” was used as the H chain of the humanized antibody.
  • the antigen-binding activity of a humanized antibody using one of each of the versions "a” to “t” as the L chain was measured.
  • the humanized antibody having the L-chain versions "j", “1”, “m”, “o”, “q”, “r”, “s”, and “t” can be combined with the chimeric antibody. It showed the same PTHrP binding ability.
  • the expression plasmid was introduced into CH0 cells (MB11) in order to establish a stable humanized antibody cell line.
  • Each plasmid DNA was added to 0.8 ml of CHO cells suspended in PBS (-) at a cell concentration of lxlO 7 cells Zinl, and pulsed at a capacitance of 1,500 V, 25 F. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the electroporated cells were suspended in MEM- medium (GIBC0) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBC0) and used in a 96-well plate (Falcon). They were cultured in a C0 2 incubator one Te.
  • GIBC0 fetal serum
  • GENETICIN G418 Sulfate, GIBC0
  • GIBC0 liponucleoside- and deoxyliponucleoside-free MEM- ⁇ medium
  • the neutralizing activity of the mouse antibody, chimeric antibody and humanized antibody was measured using rat osteosarcoma cell line R0S17 / 2.8-5 cells. That, R0S17 / 2.8- to 5 cells, with 10% fetal bovine Ham containing serum (GIBC0)'S F-12 medium (GIBC0) in, were cultured in C0 2 incubator scratch. R0S17 / 2.8-5 cells were seeded on a 96-well plate at 10 4 cells Z100 ⁇ 1 / well, cultured for 1 day, and placed in Ham'SF-12 medium (GIBC0) containing 4 mM Hydrocortisone and 10% fetal bovine serum. Exchange.
  • GIBC0 Ham'SF-12 medium
  • a mouse antibody, chimeric antibody, or humanized antibody whose neutralization activity is to be measured was previously prepared in groups of 10 / xg / ml, 3.3 g / mK, 1.1 g / ml and 0.37 g / ml, 10 g / ml, 2 x / mK 0.5 g / inl and 0.0lg / ml or 10 g / ml, 5 g / mK 1.25 ⁇ g / mK 0.63 g / ml and 0.31 zg / ml An equal amount of the mixture was mixed with the obtained PTHrP (l-34), and 80 l of a mixed solution of each antibody and PTHrP (l_34) was added to each well.
  • the final concentration of each antibody is one quarter of the above antibody concentration, and the concentration of PTHrP (l-34) is lng / ml.
  • PTHrP concentration of PTHrP
  • SEQ ID NO: 16 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 17 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 18 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 20 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 21 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 22 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 23 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 40 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 42 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 43 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 44 synthetic DNA
  • the present invention inhibits the binding of parathyroid hormone-related peptide to its receptor
  • the present invention provides a therapeutic agent for joint disease containing a substance as an active ingredient. Further, according to the present invention, there is provided an agent for ameliorating a symptom caused by a joint disease, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits binding between a parathyroid hormone-related peptide and its receptor.
  • the administration of the above substance was found to improve bone loss in a therapeutic agent model for joint diseases, and thus the substance is useful as a bone loss inhibitor.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明 細 書 関節疾患に起因する症状の改善剤 技術分野
本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチド （Parathyroid hormone related Pep tide (PTHrP) ) とその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有す る関節疾患に起因する症状の改善剤に関する。 背景技術
副甲状腺ホルモン関連蛋白 （parathyroid hormone-related protein, PTHr P) は 1987年、 悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の原因である液性因子の研究か ら同定された蛋白である。 その N末端側は副甲状腺ホルモン （parathyroid horm one, PTH) と共通の受容体 （PTH/PTHrP受容体） に結合することによってその作 用を発現することが知られている。
PTHrPは様々な腫瘍組織から産生されていることが報告されているが、 広範な 正常組織、 例えば皮膚、 乳腺、 子宮、 胎盤、 骨、 平滑筋、 心臓、 肺、 腎、 肝臓、 脳などにおいても産生され、 局所で autocrine/paracrine分泌機構を介して様々 な作用を示す。
PTH/PTHrP受容体は PTHと PTHrPの標的臓器である腎ゃ骨に強く発現しているが、 その他に大動脈、 副腎、 脳、 乳腺、 心臓、 消化管、 肝臓、 肺、 骨格筋、 卵巣、 胎 盤、 皮膚、 胃、 子宮などにも発現し、 PTHrPと極めて類似した分布を示すことが 明らかとなった。
PTHrPの作用としては、 骨における破骨細胞の活性化による骨吸収促進作用及 び軟骨分化作用、 腎の遠位尿細管に作用してカルシウムの再吸収を促進する作用 以外に、
1)上皮細胞におけるカルシウム輸送系 （乳腺上皮、 胎盤など） への関与
2)強力な平滑筋弛緩作用 （子宮、 尿管、 血管、 消化管など） 3)増殖、 分化、 発生への関与
が知られているが、 上記以外の多くの組織における PTHrPの生理的役割は不明で ある。 また、 近年、 PTHrPに関しては、 慢性関節リウマチ （RA) 患者の病巣滑膜 において発現することや、 関節液中で高い濃度で存在することが報告されている 一方、 最近 PTHrPによる各種サイト力インの誘導またはサイト力インによる ΡΤΗ rPの誘導などが報告され、 PTHrPはそれ自身の作用に加え、 サイト力インに起因 する各種疾患との関わりについてもその関与の可能性が明らかとなつた。 ΡΤΗま たは PTHrPとサイトカインの crosstalkの可能性を示唆する以下の報告などが知ら れている。
1)原発性副甲状腺機能亢進症 （Primary hyperpara thyroid ism, PTH高値が原 因で起こる） の患者で IL - 6および TNF -ひ高値である （Grey A. et al, J Clin Endocrinol Me tab 81:3450-5, 1996) 。
2) In vitro系にて骨芽細胞（osteoblast)を PTHまたは PTHrPで刺激すると IL- 6 および LIFの発現が促進される （Pollock JH. et al, J Bone Miner Res 11:75 4-9, 1996) 。
3)滑膜細胞を用いた一連の実験において、 PTHrP刺激で IL- 6産生が亢進、 また T NF - aと IL- lj3は PTHrPの発現を促進するなど PTHrPは pro- infla匪 atory cytokin ecascadeのメンバーである （Funk JL et al, Endocrinology 138:2665-73, 199 7、 Funk JL. et al, J Clin Invest 101:1362-71, 1998) 。
4)ヒ卜培養血管内皮細胞においても TNF- αと IL- 1/3は PTHrPの発現を促進する (Bioc em Biop ys ResCommun 249:339-343, 1998) 。
このように PTHrPによるサイトカインの誘導またはサイトカインによる PTHrPの 誘導などが報告され、 PTHrPはそれ自身の作用に加え、 サイト力イン、 特に IL - 1 β、 IL- 6、 TNF-ひなどの炎症性サイト力インに起因する各種疾患との関わりにつ いてもその関与の可能性が明らかとなつた。
これらの報告は、 PTHrPが RA患者における関節破壊や関節近傍での骨萎縮に関 与している可能性を示唆しているが、 その詳細に関しては不明である。 発明の開示
そこで、 本発明は、 PTH又は PTHrPに起因する関節疾患に起因する症状の改善剤 を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 副甲状腺ホル モン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質により、 関節疾患に起因 する症状及び関節疾患が改善し得ることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を 阻害する物質を有効成分として含む、 関節疾患に起因する症状の改善剤である。 関節疾患としては、 慢性関節リウマチ及び/又は変形性関節症が挙げられ、 関節 疾患に起因する症状としては、 関節近傍の骨量減少が挙げられる。 さらに、 本発 明の改善剤は、 骨量減少を抑制することから、 慢性関節リウマチ及び Z又は変形 性関節症などによって併発される関節近傍の骨量減少の抑制にも有効である。 上 記物質としては、 副甲状腺ホルモン関連ペプチド受容体に対するアン夕ゴニスト、 抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体 （例えばヒト型化又はキメラ化されたモノ クローナル抗体) 、 該抗体の断片及び/又はその修飾物が挙げられる。 ここで、 ヒト型化抗体としては、 ヒト型化 #23- 57-137 - 1抗体が挙げられる。 さらに、 関節 疾患としては、 慢性関節リウマチ及び Z又は変形性関節症が挙げられる。
さらに、 本発明は、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻 害する物質を有効成分として含む関節疾患治療剤である。 関節疾患としては、 慢 性関節リゥマチ及び Z又は変形性関節症が挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 副甲状腺ホルモン関連ペプチド （Parathyro id hormone re lat ed P ept ide： PTHrP) とその受容体 （PTHrP受容体） との結合を阻害する物質を有効成 分として含む関節疾患治療剤である。 また、 本発明は、 PTHrPと PTHrP受容体との 結合を阻害する物質を有効成分として含む、 関節疾患に起因する症状の改善剤で ある。
本明細書中で 「PTHrP受容体」 とは、 例えば特表平 6- 506598号公報に記載され ている PTHrPと結合する受容体を指し、 標的器官上 （例えば骨や腎臓） に存在す る PTHrP受容体か否かを問わない。
また、 「PTHrPと PTHrP受容体との結合を阻害する物質」 とは、 PTHrPに結合す ることにより、 PTHrPが PTHrP受容体と結合することを阻害する物質 （例えば抗 PT HrP抗体） 、 および PTHrP受容体に結合することにより、 PTHrPが PTHrP受容体と結 合することを阻害する物質 （例えば PTHrP受容体に対するアン夕ゴニスト （PTHrP アンタゴニストともいう） ） のいずれか一方又は両方を指す。 具体的に、 PTHrP アンタゴニストとしては、 PTHrPペプチドの少なくとも一つのアミノ酸を置換、 欠失したものや PTHrPペプチドの部分配列などが挙げられる。
抗 PTHrP抗体としては、 例えばヒト型化抗体、 ヒト抗体 （W096/33735号公報） 又はキメラ抗体 （特開平 4- 228089号公報） などの抗体のほか、 ハイプリ ドーマ #2 3 - 57- 137- 1によって産生される抗体 （#23- 57-137- 1抗体） などが挙げられる。 な お、 抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であること好まし レ また、 PTHrPアン夕ゴニストとしては、 ポリペプチド又は低分子などが挙げ られるが、 これらに限定されるものではない。 例えば PTHrPに対して拮抗的に PTH rP受容体に結合する物質として、 特開平 7-165790号公報、 特表平 5-509098号公報 又は Pept ides (UNITED STATES) 1995, 16 (6) 1031-1037、 B iochemis t ry (UNIT ED STATES) Apr. 281992, 31 ( 16) 4026-4033に記載の PTHrPアンタゴニスト活性 を有するポリペプチドが挙げられる。 また、 上記例示のポリペプチドのうち、 少 なくとも 1個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加、 挿入されたポリペプチドであつ て、 同等の PTHrPアン夕ゴニスト活性を有するものも本発明の PTHrPアン夕ゴニス トに含まれる。
本発明では、 「PTHrPと PTHrP受容体との結合を阻害する物質」 として抗 PTHrP 抗体を例に説明する。
1 . 抗 PTHrP抗体
本発明で使用される抗 PTHrP抗体は、 関節疾患に起因する症状の改善効果を有 するものであれば、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナル） および 形状を問うものではない。
本発明で使用される抗 PTHrP抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナルまた はモノクローナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗 PTHrP抗 体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来の モノクローナル抗体は、 ハイブリド一マに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法によリ抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生されるもの を含む。 この抗体は PTHrPと結合することにより、 PTHrPが PTHZPTHrP受容体に結 合するのを阻害して PTHrPのシグナル伝達を遮断し、 PTHrPの生物学的活性を阻害 する抗体である。
このような抗体としては、 ハイプリドーマクローン #23-57-137- 1によリ産生さ れる #23-57- 137- 1抗体が挙げられる。
なお、 ノヽイブリ ド一マクロ一ン # 23 - 57-137—1 は、 mouse-mouse hybr i doma # 23-57-137-1 として、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に、 平成 8年 8月 1 5日付 で、 FERM BP- 5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
2 . 抗体産生ハイプリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 以下のようにして作製できる。 す なわち、 PTHrPを感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクロ一ナルな抗体産生細胞をスクリ一ニン グすることによつて作製できる。
まず、 抗体取得の感作抗原として使用されるヒト PTHrPを、 Suva, L. J. et a l .， Sc i ence ( 1987) 237, 893に開示された PTHrP遺伝子 アミノ酸配列を発現 することによって得る。 すなわち、 PTHrPをコードする遺伝子配列を公知の発現 ベクタ一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中また は培養上清中から目的の PTHrPタンパク質を公知の方法で精製する。
次に、 この精製 PTHrPタンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、 PTHrPの N末端の 34個のペプチドについて、 化学合成により作製することもでき、 これを 感作抗原として使用することもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate- Buffered Saline) や生 理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものを所望により通常のアジュバント、 例 えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎に 数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免疫細胞とし ては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 哺乳動物のミエ口 マ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 (P3x63Ag8.6 53) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550) 、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Mi lstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519) 、 MPC-11 (Margulies. D. H. et aし, Cell (1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (S ulman, M. et al. ' Nature (1978) 276, 269-270) 、 F0 (de St. Grot , S. F. et al. , J. I腿 unol. Me thods (1980) 35, 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 1 48, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133) 等 が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Mi lstein, 、 Methods Enzymo 1. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例え ば、 ミエ口一マ細胞に対して免疫細胞を卜 10倍とするのが好ましい。 前記細胞融 合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培養液 が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することも できる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000- 6000程度） を 通常 30- 60% (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 (ハイプリドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して 上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリ ドーマの生育に好ましくない 細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリ ド一マは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイ プリドーマのスクリーニングおよび単一クロ一ニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記八イブリドーマを得る他に、 ヒト リンパ球を in vi t roで PTHrPに感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を 有するミエ口一マ細胞と融合させ、 PTHrPへの結合活性を有する所望のヒト抗体 を得ることもできる （特公平 1-59878号公報参照） 。 さらに、 ヒト抗体遺伝子の 全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となる PTHrPを投与 して抗 PTHrP抗体産生細胞を取得し、 これを不死化させた細胞から PTHrPに対する ヒト抗体を取得してもよい （国際公開番号 W0 94/25585 号公報、 W0 93/12227 号公報、 W0 92/03918 号公報、 0 94/02602 号公報参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリド —マを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハ イブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水とし て得る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適してお り、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
3. 組換え型抗体
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、 Vand amnie, A. M. et al. , Eur. J. Bioc em. (1990) 192, 767-775, 1990参照） 。 具体的には、 抗 PTHrP抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 PTHrP抗体の可変 (V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry (1979) 18, 52 94-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et a】. , Anal. Biochem. (1987) 162, 15 6-159) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purificatio n Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製することができる。 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合 成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕 学工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Amp li FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCRを用いた 5' -RACE法 (Frohman, M. A. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用すること ができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクタ一]) NAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公 知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネーシヨン法により 確認する。
目的とする抗 PTHrP抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、 これを、 所望の 抗体定常領域 （C領域） をコ一ドする DNAを含有する発現べクタ一へ組み込む。 本発明で使用される抗 PTHrP抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクター に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿主細胞を形質転換し、 抗体を発 現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （Η鎖） または軽鎖 （L鎖） をコードする DNAを 別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、 ある いは Η鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞 を形質転換させてもよい （W0 94/11523 号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れる蛋白質 （ャギ カゼインなど） をコードする遺伝子に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ 注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれるトランス ジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 また、 卜 ランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるため に、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. e t al. , Bio/Technology (1994) 12, 699-702) 。
4 . 改変抗体
本発明では、 上記抗体のほかに、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等 を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ抗体、 ヒ卜 型化 （Humanized) 抗体を使用できる。 これらの改変抗体は、 以下の方法を用い て製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコードする D NAをヒト抗体 C 領域をコードする DNAと連結し、 これを発現べクタ一に組み込ん で宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外 の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; compl ementar i ty de t e rain ing region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一 般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号公 報、 W0 96/02576 号公報参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （f ramework region； FR) とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域 にオーバ一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドを プライマーとして用いて PCR法により増幅する。 得られた DNAをヒト抗体 C領域を コードする DNAと連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入 し産生させることによりヒト型化抗体を得ることができる （EP 239400号公報、
W0 96/02576 号公報参照） 。
CDRを介して連結されるヒ卜抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域にお けるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, e t al. , Cance r Res. ( 1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例え ば H鎖では、 Cァ 1、 Cァ 2、 Cァ 3、 Cァ 4を、 L鎖では C K、 C λを使用す ることができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗 体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常 領域とからなる。 一方、 ヒト型化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、 ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト 型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本発明の改善剤の有 効成分として有用である。 本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体が挙げら れる。 ヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体は、 マウス由来の #23-57- 137- 1抗体の相補性決 定領域を、 L鎖についてはヒト抗体 HSU03868 (GEN-BANK, Deftos Mら， Scand. J. Immunol., 39， 95-103， 1994) 由来の 3つの FR断片 （FR1、 FR2および FR3) 並びにヒト抗体 S25755 (NBRF-PDB) 由来の 断片 （FR4) に連結したものであり、 H鎖についてはヒト抗体 S31679 (NBRF- PDB、 Cuisinier AMら， Eur. J. Immuno l.， 23， 110-118， 1993) のフレームワーク領域と連結し、 抗原結合活性を有す るようにフレ一ムワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
なお、 ヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体の L鎖または H鎖をコードする DNAを含むプ ラスミ ドを有する大腸菌は、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に、 平成 8年 8月 15日 付で、 H鎖をコードする DNAを含むプラスミドを有する大腸菌である Escherichia coli JM109 ( hMBClHcDNA/pUC19 ) については FERM BP- 5629として、 L鎖をコ —ドする DNAを含むプラスミ ドを有する大腸菌である Escherichia coli JM109 ( hMBClLq^ /pUC19) については FERM BP- 5630として、 ブダペスト条約に基づ きそれぞれ国際寄託されている。
5. 抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、 PTHrPに結合し、 PTHrPの活性を阻害するかぎリ、 抗体の断片又はその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab，）2、 Fv、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシング ルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗体断片をコードす る遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現さ せる （例えば、 Co， M.S. et al.， J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976、 Bett er， M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178， 476 - 496, Aca demic Press, Inc. , Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178， 476-496, Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E.， Methods in Enz ymology (1989) 121， 652 - 663、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymo 1 o gy ( 1989) 121, 663-669、 Bi rd, R. E. e t al. , TIBTECH ( 1991) 9, 132- 137参 照） c
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この sc Fvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリンカ一を 介して連結される （Hus ton, J. S. e t al.、 Proc. Nat l. Acad. Sc i. U. S. A. ( 1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書 に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結する ぺプチドリンカ一としては、 例えばアミノ酸 12-19残基からなる任意の一本鎖ぺ プチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 お よび L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、 それらの配列のうちの全部又は 所望のアミノ酸配列をコードする丽 A部分を鐯型とし、 その両端を規定するブラ イマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一部分を コードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプ ライマ一対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べク 夕一、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ること ができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることがで さる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主に より産生させることができる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体の断片 も包含される。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合し た抗 PTHrP抗体を使用することもできる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの 抗体修飾物も包含される。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修 飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野にお いてすでに確立されている。
6 . 組換え型抗体または改変抗体の発現および産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモータ一、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させること ができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一としては、 ヒトサイトメガロウイ リレス前期プロモーター /ェンノヽンサ一 ( human cytomegalovirus immediate ea rly promoter/enhancer) を挙げることが、できる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェン ハンサ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミ アンウィルス 40 (SV 40) 等のウィルスプロモーター/ェンハンサー、 あるいは ヒトェロンゲ一シヨンファクタ一 1ひ （HEFlo!) などの哺乳類細胞由来のプロモ 一夕一ノエンハンサ一等が挙げられる。
SV 40プロモーター ェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法 （Natu re (1979) 277, 108) により、 また、 HEF1 プロモータ一 Zェンハンサーを使 用する場合は Mizushimaらの方法 (Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322) によ り、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモ一夕一としては、 例えば laczプロモーター、 araBプロモーター を挙げることができる。 laczプロモータ一を使用する場合は Wardらの方法 （Natu re (1098) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) により、 あるいは a raBプロモ一夕一を使用する場合は Betterらの方法 （Science (1988) 240, 104 1-1043) により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 437 9 ) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。
複製起源としては、 SV 40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ ローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞 系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは、 選択マ一力一としてアミノグ リコシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TI0 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhir) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺乳 類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げら れ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエ ローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vi t roまたは in vivoで培養して目的とす る抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液 として、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
7 . 抗体の分離、 精製
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主動物から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用される抗体の分離、 精製はァフィ二ティー カラムを用いて行うことができる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いたカラム として、 Hyper D、 P0R0S> Sep arose F. F. (Pharmac ia製） 等が挙げられる。 そ の他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何 ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティ一カラム以外のクロマト グラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わ せることにより、 抗体を分離、 精製することができる （Ant ibod iesA Laborator y Manual. Ed Harlow, Davi d Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 0 8 . 抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性 （Ant ibod ies A Laboratory Manual. Ed Har low, David Lane, Col d Spr ing Harbor Laboratory, 1988) 、 リガン ドレセプタ一結合阻害活性 （Harada, A. e t al. , Int ernat ional Immuno logy ( 1 993) 5, 681-690) の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗 PTHrP抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELI SA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 例えば、 酵素免疫測定法を用いる場 合、 PTHrP ( 1-34) をコ一ティングしたプレートに、 抗 PTHrP抗体を含む試料、 例 えば、 抗 PTHrP抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。 アルカリフォスフ ァターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、 プレートをィンキュベ一トし、 洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、 抗 PTHrP抗体の中和活性を測 定する。
9 . 投与方法および製剤
本発明の改善剤は、 慢性関節リゥマチや変形性関節症等の関節疾患の状態又は 症状に対する治療又は改善を目的として使用される。
さらに、 本発明の改善剤は、 関節疾患に起因する症状の改善を目的として投与 することができる。 また、 関節疾患に起因する症状としては、 例えば、 関節近傍 の骨量減少が挙げられるがこれらに限定されるものではない。 本発明の改善剤は、 上記症状に対して、 あるいはその他の複数の症状が合併した症状に対して投与す ることができる。
本発明の抗 PTHrP抗体を有効成分として含有する改善剤は、 経口、 非経口投与 のいずれでも可能であるが、 好ましくは非経口投与であり、 具体的には経肺剤型 (例えばネフライザ一などの器具を用いた経肺投与剤） 、 経鼻投与剤型、 経皮投 与剤型 （例えば軟膏、 クリーム剤） 、 注射剤型等が挙げられる。 注射剤型の例と しては、 例えば点滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等によ り全身又は局部的に投与することができる。 また、 患者の年齢、 症状により適宜 投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり 0. 0 Olnig から l OOOmgの範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 0. 01〜100000nig/bod y、 好ましくは 0. l〜10000mg/body、 さらに好ましくは 0. 5〜1000mg/t)ody、 さらに 好ましくは l〜100fflg/bodyの投与量を選ぶことができる。 しかしながら、 本発明 の抗 PTHrP抗体を含有する改善剤はこれらの投与量に制限されるものではない。 また、 投与時期としては、 関節疾患が生ずる前後を問わず投与してもよく、 あ るいは骨量減少が予測される時に投与してもよい。
本発明の抗 PTHrP抗体を有効成分として含有する改善剤は、 常法にしたがって 製斉1 Jィ匕すること力 sでき (Remington' s Pharmaceut ical Sc ience, l at es t ed i t io n, Mark Publ i shing Company, Eas ton，米国） 、 医薬的に許容される担体や添加 物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有機溶 剤、 コラーゲン、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 力ルポキシビ 二ルポリマー、 カルボキシメチルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリ. ゥム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキシメチルスターチ ナトリウム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレングリコール、 ジグリセリン、 グリ セリン、 プロピレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清アルブミン （HSA) 、 マンニトール、 ソルビトール、 ラ クトース、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、 本発明改善剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれるが、 これらに限定するものではない。 例えば、 注射用製剤と して使用する場合、 精製された抗 PTHrP抗体を溶剤、 例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等に溶解し、 これに吸着防止剤、 例えば Tween80、 Tween 20、 ゼラ チン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。 あるいは、 使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、 凍 結乾燥のための賦形剤としては、 例えば、 マンニトール、 プドウ糖等の糖アルコ —ルゃ糖類を使用することができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本 発明は、 これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例 1〕 関節炎モデル動物での薬効試験
(1) 目的
実験的関節炎モデルであるコラーゲン誘発関節炎ラット （col l agen induced arthri t is rat : CIAラット） を用いて、 PTHrPに対するヒト型化モノクローナル 抗体の関節炎に起因する骨量減少に対する効果を検討した。
(2)方法
モデル動物として 6週齢ルイスラット （ （株） 日本クレアより購入） を用いた ルイスラットは、 ゥシ 2型コラーゲンとフロインド不完全アジュバンドとで感作 させると関節炎を発症する。 本実施例においては、 この関節炎モデル動物 （Paw の厚みで確認） において体重の増減及び骨量減少の測定を行い、 正常ラットの測 定値と比較し、 さらに、 後述する参考例 4 ( 4 ) に記載したヒト型化抗体 L鎖バ —ジョン" d "が体重増減及び骨量減少に与える影響を評価した。
関節炎モデル動物の作製及び群分けは、 以下のようにして行った。 先ず、 ラッ トとして 5週齢雄性ルイスラットを購入し （日本クレア） 、 1週間通常食を与え て馴化後 6週齢のラット 1 2匹を準備した。 1 2匹のラットを 4匹ずつ 3群に分 け、 第 1群及び第 2群のラットの尾根周囲数力所に、 ゥシ 2型コラーゲン （コラ —ゲン技術研修会） 及びフロインド不完全アジュバンド （DIFC0社製） との 1 ： 1混合液 （以下、 「CI I/FA」 と呼ぶ） を合計 l mlとなるように皮内注した。 なお、 第 3群のラットは、 上述した処置を施さないものとした。
次に、 二次免疫応答 （ブースタ一） をかけるために、 上記処理を 0日目とした 第 7日目に、 第 1群及び第 2群のラットの尾根周囲数力所に対して、 CI I/FAを合 計 0 . 5 mlとなるように皮内注した。
また、 このとき、 第 1群には、 感作初日に PBSで 2倍希釈した PTHrP中和抗体を 10mg/kgで投与した。 第 2群には、 感作初日に、 体重 l kgあたり 2mlの PBSを投与 した。 なお、 第 3群のラットには、 CI I/FA及び PTHrP中和抗体いずれも投与して いない。
そして、 これら第 1群乃至第 3群のラットに対して、 ① in s i tu hybrid izat ion による PTH/PTHrPレセプター遺伝子の発現の確認、 ② Pawの厚み測定及び③体重 測定及び骨量測定を行った。
① in situ hybridization による PTH/PTHrPレセプ夕一遺伝子の発現の確認 各群のラットを経時的に屠殺、 灌流固定した。 そして、 膝関節をパラホルムァ ルデヒドにて固定後、 マイクロウエーブを併用した EDTAによる脱灰を行い、 パラ フィン包埋の後、 薄切切片を作製した。 これを用いて、 DIGラベルした cRNAプロ —ブを使用した in situ hybridizationを行い、 膝関節における PTH/PTHrPレセ プター遺伝子の発現の確認した。
② Pawの厚み測定
関節炎発症を評価するため、 Pawの厚みを計測した。 すなわち、 Pawの厚みを計 測することによって、 関節炎の発症及び関節炎の程度を評価することができる。 Pawの厚みは、 Dial Thickness Gauge (OZAKI MFG. Co. , Ltd製）を用いて、 ノギ スのようにゲージで局所を挟んで測定した。 Pawの厚み測定は、 経時的に （感作 初日、 7日目、 14日目及び 2 1日目） それぞれ 1回ずつ行った。
③体重測定及び骨量測定
各群のラットの体重を経時的 （感作初日、 7日目、 14日目及び 2 1日目） に 測定するとともに、 各群のラットの骨量を経時的 （感作初日、 7日目、 14曰目 及び 2 1日目） に測定した。 骨量としては、 ラットの膝関節をマイクロフォー力 ス X線撮像システムと B ASシステム （富士フィルム社製） を用いて解析し、 そ の結果から骨塩定量ファントム （京都科学社製） を用いて標準直線を描いた上で、 脛骨近位骨幹端付近を定量評価した。
(3)結果
① in situ hybridization による PTH/PTHrPレセプター遺伝子の発現
第 1群のラットでは、 膝関節の肥大軟骨細胞及び骨梁に沿う骨芽細胞及び骨髄 の一部の細胞において、 PTH/PTHrPレセプター遺伝子の発現を確認することがで きた。 また、 第 2群及び第 3群と比較して第 1群のラットでは、 感作後 1週目よ り骨髄中の陽性細胞数が明らかに増加していた。
② Pawの厚み測定 各群の Pawの厚みを測定したところ、 第 1群及び第 2群では、 第 3群と比較し て、 2週目以降で有意に高値を示していた。 このことから、 第 1群及び第 2群に おいて関節炎は、 感作 2週目に発症したものといえる。 上記①の結果を参照する と、 関節炎の発症に先立って PTH/PTHrPレセプター遺伝子の発現が増強すること がわかった。 また、 第 1群と第 2群とでは、 ほぼ同時期に関節炎が発症している (表 1 ) 。
感作初日 第 1週 第 2週 第 3週
第 1群 413. 5 430 521 611. 25
第 2群 423 435 531 600. 8
第 3群 415. 8 423. 3 412. 5 426. 3
9. 73 14. 14 78. 14 97. 86
SD 8. 56 10. 54 1 1 1. 47 100. 54
9. 73 7. 53 15. 55 10. 31 ③体重測定及び骨量測定
体重測定の結果を表 2、 骨量測定の結果を表 3に示す c
表 2
感作初日 第 1週 第 2週 第 3週
第 1群 119 133. 25 147 145. 75
第 2群 119 137 131. 5 152. 5
第 3群 124. 33 134. 33 146. 33 161. 33
1. 58 3. 56 6. 04 9. 28
SD 4. 74 4. 3 4. 39 10. 81
2. 49 2. 36 4. 02 4. 99 表 3
感作初日 第 1週 第 2週 第 3週
第 1群 51. 73 55. 37 «73. 62 67. 62
第 2群 54. 86 64. 06 *47. 61 56. 78
第 3群 60. 31 62. 76 69. 46 71. 5
11. 87 15. 57 16. 29 20. 45
SD 18. 86 17. 22 20. 58 18. 4
22. 65 10. 11 17. 3 25. 44
pく 0. 05, «v. s. * ,
体重測定結果に関して、 第 1群乃至第 3群の間で体重の経時的変化に有意差は 認められなかった （表 2 ) 。 また、 骨量測定結果に関して、 第 2群では、 関節炎 の発症後において骨量が有意に減少しており （表 3 ) 、 骨萎縮が生じている。 こ れに対して、 第 1群では、 関節炎の発症後に骨量が上昇しており、 第 2群の値と 比較して有意差が認められる。 このことから、 PTHrP中和抗体の投与により、 骨 萎縮を抑制できることがわかる。
また、 感作後 3週目においては、 第 1群及び第 2群間の骨量に有意差が認めら れないことから、 PTHrP中和抗体の投与により、 関節炎発症初期における骨萎縮 を抑制できることがわかる。 これは、 PTHrP中和抗体の半減期によるものと考え られ、 PTHrP中和抗体の追加投与によって骨萎縮の抑制を持続できることが示唆 された。
以上の結果より、 PTHrP中和抗体は、 関節炎に起因する骨萎縮を予防するとと もに、 骨萎縮の効果的な治療薬として有効であることがわかった。
〔参考例 1〕
抗 PTHrP (1-34)マウスモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの作製
ヒト PTHrP (卜 34)に対するモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ # 23 - 57 - 154 および #23- 57- 137- 1は、 以下の通り作製した （Sato, K. et al. , J. Bone Min er. Res. 8, 849-860, 1993)。 なお、 ヒト PTHrP (卜 34)のアミノ酸配列を配列番 号 75に示す。
免疫原として使用するために、 PTHrP ( l- 34) (Peninsula 製） とキャリアータ ンパクであるサイログロブリンをカルボジイミ ド （Doj inn) を用いて結合した。 サイログロブリンと結合した PTHrP (1-34)を透析し、 タンパク濃度として 2 mg/ml となるように調製した後、 フロイントアジュバント （D i fco)と 1： 1で混合し、 ェマルジョン作製後、 16匹の雌性 BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あた リ 100 gを 11回免疫した。 初回免疫は、 フロイント完全アジュバントを用い、 二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、 以下の方法で行った。 すなわち、 マウス尾静脈より採血し、 血清分離後 R I Aバッファーで希釈した抗血清と 1251 標識 PTHrP (l- 34)を混合し、 結合活性を測定した。 抗体価の上昇したマウスの腹 腔に、 キヤリァ一タンパクを結合していない PTHrP( l- 34)を動物あたり 50 gを 最終免疫した。
最終免疫 3日目にマウスを屠殺し、 脾臓を摘出後、 脾臓細胞とマウスミエロー マ細胞株 P3x63Ag8U. 1 を 50%ポリエチレングリコール 4000を用いる常法にした がって細胞融合した。 細胞融合した細胞を 2 X 104/ゥエルの細胞数で 85枚の 96 穴プレートに蒔き込んだ。 ハイプリ ドーマの選別は HAT培地を用いて行った。 ハイブリ ドーマのスクリーニングは、 H A T培地中で生育の認められ 穴の培 養上清を固相化 RI A法にて PTHrP認識抗体の有無を測定し選択することによリ行つ た。 抗体との結合能の認められた穴からハイプリ ドーマを回収し、 15% FCSを含 む RPMI- 1640 培地に 0PI- suppl ement (Sigma) を添加した培地に懸濁し、 限界希 釈法にてハイプリ ドーマの単一化を実施した。 PTHrP( l- 34)との結合能の強いク ローン # 23-57-154 および #23- 57-137- 1を得た。
なお、 ハイブリ ドーマクローン #23- 57- 137-1は、 mouse- mouse hybri doma #23 -57-137-1として、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に、 平成 8年 8月 1 5曰に、 FERM BP- 5631としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている。
〔参考例 2〕 ヒト PTHrP( l- 34)に対するマウスモノクローナル抗体の V領域 をコードする DNAのクロ一ニング
ヒト PTHrP (1-34)に対するマウスモノクローナル抗体 #23- 57- 137-1の可変領域 をコードする DNAを次の様にしてクロ一ニングした。
(1) mRNAの調製
ハイブリ ドーマ #23- 57- 137- 1からの mRNAを Quick Prep mRNA Purification Ki t (Pharmacia Biotech社） を用いて調製した。 ハイプリドーマ #23- 57- 137-1の細 胞を抽出バッファ一で完全にホモジナイズし、 キット添付の処方に従い、 oligo (dT) -Cellulose Spun Column にて mRNAを精製し、 エタノール沈殿をおこなった。 m R N A沈殿物を溶出バッファ一に溶解した。
(2) マウス H鎖 V領域をコードする遺伝子の cDNAの作製および増幅
(i) #23- 57- 137- 1抗体 H鎖 V領域 cDNAのクローニング
ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の Η鎖 V領域をコードする遺伝 子のクローニングは、 5'- RACE法 （Frohman, M. A. et al. , Proc. Nail. Acad.
Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids R es. 17, 2919-2932, 1989) により行った。 5' -RACE法には 5' - Ampl i FINDER RA
CE kit (CLONETECH社） を用い、 操作はキット添付の処方にしたがって行った。 cDNA合成に使用するプライマーは、 マウス H鎖定常領域 （C領域） とハイブリダ ィズする MHC2プライマ一 （配列番号 1) を用いた。 前記のようにして調製した mR
NA約 2 gを錶型として MHC2プライマ一 lOpinole を加え、 逆転写酵素と 52° (：、 3 0分間反応させることにより cDNAへの逆転写を行った。
6 N NaOH で RNAを加水分解 （65°C、 30分間） した後、 エタノール沈殿により cDNAを精製した。 T4DNAリガーゼで 37°Cで 6時間、 室温で 16時間反応することに より、 合成した cDNAの 5'末端に Ampli FINDER Anchor (配列番号 42) を連結した。 これを踌型として PCRにより増幅するためのプライマ一として Anchorプライマー (配列番号 2) およぴ丽 C- G1プライマー （配列番号 3) (S.T. Jones, et al. ,
Biotechnology, 9, 88, 1991) を使用した。
PCR溶液は、 その 50μ 1中に lOmM Tris- HCl (pH8.3)、 50mM KC1、 0.25mM dNTPs
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、 1.5 mM MgCl2、 2.5 ユニットの TaKaRa Ta (宝酒 造） 、 lOpmole の Anchorプライマー、 並びに MHC- Glプライマ一及び Ampli FINDE Anchor を連結した cDNAの反応混合物 1 a 1を含有する。 この溶液に 50 1の 鉱油を上層した。 PCRは Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) を用い、 9 4 °Cにて 45秒間、 60でにて 45秒間、 72 °Cにて 2分間の温度サイクルで 30回行った。
(ii) #23-57-137-1 抗体 L鎖 V領域の c DNAのクローニング
ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の L鎖 V領域をコードする遺伝 子のクロ一ニングは、 5' -RACE法 （Frohman, M. A. et al.， Pro Natl. Acad.
Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ； Belyavsky, A. et aに Nucleic Acids R es. 17, 2919-2932, 1989)により行った。 5' - RACE法には 5' - Ampli Finder RACE KiUClonetech)を用い、 操作は添付の処方に従った。 cDNA合成に使用するブラ イマ一は、 oligo_dTプライマーを用いた。 前記のように調製した] nRNA約 2 gを 錶型として oligo- dTプライマーを加え、 逆転写酵素と 52°C、 30分間反応させるこ とにより cDNAへの逆転写を行った。 6N NaOHで RNAを加水分解 （65°C、 30分間） した後、 エタノール沈殿により cDNAを精製した。 合成した cDNAの 5'末端に前記 Am pli FINDER Anchor を T4DNAリガーゼで 37°Cで 6時間、 室温で 16時間反応させる ことにより連結した。
マウス L鎖 λ鎖定常領域の保存配列から PCRプライマー MIX (配列番号 4) を設 計し、 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI社） を用いて合成した。 PCR溶液は、 その 100 n 1中に 10 mM Tris-HCl (pH8.3) 、 50mM KCK 0.25mM dNTPs (dATP, dGT P, dCTP, dTTP) 、 1.5Mm MgCl2 、 2.5 ユニットの AmpliTad (PERKIN ELMER) 、 50pmole の Anchorプライマー （配列番号 2) 、 並びに MLC (配列番号 4) および A即 li FINDER Anchorを連結した cDNAの反応混合物 1 n 1を含有する。 この溶液 に 50 1の鉱油を上層した。 PCRは Thermal Cycler Model480J (Perkin Elmer) を用い、 94°Cにて 45秒間、 60°Cにて 45秒間、 72°Cにて 2分間の温度サイクルで 3 5回行った。
(3) PCR生成物の精製および断片化
前記のようにして PCR法により増幅した DNA断片を、 3 %Nu Sieve GTGァガロ ース （FMC Bio. Products)を用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。 H鎖 V領域として約 550bp 長、 L鎖 V領域として約 550bp 長の DNA断片を含有す るァガロース片を切取り、 GENECLEAN II Ki t (BI0101)を用い、 キット添付の処 方に従い丽 A断片を精製した。 精製した DNAをエタノールで沈殿させた後、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20^ 1に溶解した。 得られた丽 A溶液 1 n 1 を制限酵素 Xmal (New England Biolabs)により 37°Cで 1時間消化し、 次いで 制限酵素 EcoRI (宝酒造） により 37°Cで 1時間消化した。 この消化混合物をフ ェノ一ル及びクロロホルムで抽出し、 エタノール沈殿により DNAを回収した。
こうして、 5'-末端に EcoRI 認識配列を有し、 3'-末端に Xmal認識配列を有す るマウス H鎖 V領域および L鎖 V領域をコードする遺伝子を含む DNA断片を得た。 上記のようにして調製したマウス H鎖 V領域および L鎖 V領域をコードする遺 伝子を含む EcoRI- XmalDNA断片と EcoRI 及び Xmalで消化することにより調製した PUC19 ベクターを DNAライゲーシヨンキット ver.2 (宝酒造） を用い、 添付の処 方に従い 16°Cで 1時間反応させ連結した。 次に 10 1の上記連結混合物を大腸菌 JM109コンビテント細胞 （二ツボンジーン） 100 1に加え、 この細胞を氷上で 15分間、 42°Cにて 1分間、 さらに氷上で 1分間静置した。 次いで 300 1の S0C 培地 (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al. , Cold S pring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え 37°Cにて 30分間インキュベート した後、 100 ig/ml又は 50 zg/mlのアンピシリン、 0.1慮 の IPTG、 20 g/mlの X-galを含む LB寒天培地または 2xYT寒天培地 （Molecular Cloning: A Labgorato ry Manual, Sambrook, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 上にこの大腸菌をまき、 37 にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得 た。
この形質転換体を 100 /2g/ml又は 50/ig/mlのアンピシリンを含有する LB培地 または 2XYT培地 2m 1で 37°Cにて一夜培養し、 菌体画分からプラスミド抽出機 P Ι-100Σ (クラボウ） 又は QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてプラスミ ド DNAを調製し、 塩基配列の決定を行った。
(4) マウス抗体 V領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中の cDNAコード領域の塩基配列を Dye Terminator Cycle Se quenc ing ki t (Perkin-Elmer) を用い、 DNA Sequencer 373A (ABI社 Perkin- Elme r) により決定した。 配列決定用プライマ一として M13 Primer M4 (宝酒造）
(配列番号 5 ) 及び M13 Primer RV (宝酒造） （配列番号 6 ) を用い、 両方向 の塩基配列を確認することによリ配列を決定した。 こうして得られたハイプリ ドーマ #23- 57-137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含有する プラスミ ドを MBC1H04 、 L鎖 V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミ ド を MBC1L24 と命名した。 プラスミド MBC1H04 および MBC1L24 に含まれるマウス # 23 - 57- 137- 1抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域をコードする遺伝子の塩基配列 (対応するアミノ酸配列を含む） をそれぞれ配列番号 57、 65に示す。 これらのァ ミノ酸配列を、 H鎖 V領域の断片については配列番号 46、 L鎖 V領域の断片につ いては配列番号 45に示す。
なお、 前記プラスミド MBC1H04 および MBC1L24 を有する大腸菌は Escheri chi a col i JM109 (MBC1H04 ) および Escherichia col i JMl 09 (MBC1L24 ) として、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に、 平成 8年 8月 1 5日に、 Escherichia col i JMl 09 (MBC1H04)については FERM BP- 5628として、 Escheri chia col i JM109 (MBC1L 24)については FERM BP-5627としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている。
(5) ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体 #23-57-137- 1の CDRの決定 H鎖 V領域および L鎖 V領域の全般の構造は、 互いに類似性を有しており、 そ れぞれ 4つのフレームワーク部分が 3つの超可変領域、 すなわち相補性決定領域 (CDR)により連結されている。 フレームワークのアミノ酸配列は、 比較的よく保 存されているが、 一方、 CDR領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い （Kabat, E. A. et al .， 「Sequence of Prote ins of Immunological InterestJ US Dep t. Heal th and Human Services, 1983)。
このような事実に基づき、 ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の可 変領域のアミノ酸配列を Kabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列のデ一 タベースにあてはめて、 相同性を調べることにより C 領域を表 4に示すごとく 決定した。 なお、 L鎖 V領域の CDR 1〜 3のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号 59 〜61に示し、 H鎖 V領域の CDR 1〜 3のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番 号 62〜64に示した。 表 4
V領域 配列番号 CDR1 CD 2 CDR3
H鎖 V領域 5 7 31-35 50 - 66 99-107
L鎖 V領域 6 5 23-34 50-60 93-105
〔参考例 3〕 キメラ抗体の構築
(1) キメラ抗体 H鎖の構築
(i) H鎖 V領域の構築
ヒ卜 H鎖 C領域 Cァ 1のゲノム DNAを含む発現ベクターに連結するために、 ク ローニングしたマウス H鎖 V領域を PCR法により修飾した。 後方プライマー MBC1- S 1 (配列番号 7 ) は V領域のリーダー配列の 5' -側をコードする DNAにハイブリダ ィズし、 且つ Kozak コンセンサス配列 （Kozak, M. e t al. , J. Mo l. B iol. , 1 96, 947 - 950, 1987)及び制限酵素 Hind I I Iの認識配列を有するように設計した。 前方プライマ一 MBC 1- a (配列番号 8 ) は J領域の 3' -側をコードする DNA配列にハ イブリダィズし、 且つ、 スプライスドナー配列及び制限酵素 BamHIの認識配列を 有するように設計した。 PCRは、 TaKaRa Ex Taa (宝酒造） を用い、 50 1の反 応混合液に鎳型 DNAとして 0. 07 gのプラスミド MBC 1H04 、 プライマ一として MB C卜 aおよび MBC卜 S I をそれぞれ 50pmok 、 2. 5Uの TaKaRa Ex Taa 、 0. 25mMの d N T P含む条件で添付緩衝液を使用して 50 1の鉱油を上層し、' 94°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 2分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法により増 幅した DNA断片を 3 %Nu S ieve GTGァガロース （FMC B i o. Produc ts)を用いたァ ガロースゲル電気泳動により分離した。
437b 長の DNA断片を含有するァガ口一ス片を切取り、 GENECLEAN I I Ki t (BI0 101)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した腿 Aをェタノ —ル沈殿で回収した後、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20 1に溶 解した。 得られた DNA溶液 1 1を制限酵素 BamHI、 Hind III (宝酒造） により 3 I 1時間消化した。 この消化混合物をフエノール及ぴクロ口ホルムで抽出し、 エタノール沈殿により DNAを回収した。
上記のようにして調製したマウス H鎖 V領域をコ一ドする遺伝子を含む Hind III-BamHI DNA断片を Hind IIIおよび BamHIで消化することにより調製した pUC19 ベクターにサブクロ一ニングした。 このプラスミドの塩基配列を確認するためプ ライマー M13 Primer M4 および M13 Primer RV をプライマ一として、 Dye Term inator Cycle Sequencing kit (Perkin-E liner) を用い、 DNA Seauencer 373A (Perkin- Elmer)により塩基配列を決定した。 正しい塩基配列を有するハイプリ ド 一マ #23- 57- 137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含有し、 5 '-側に Hind III認識配列及び Kozak 配列、 3' -側に BamHI認識配列を持つプラス ミドを MBC1H/PUC19 と命名した。
(ii) c DNAタイプのマウス—ヒトキメラ H鎖の作製のための H鎖 V領域の構築 ヒ卜 H鎖 C領域 Cァ 1の cDNAと連結するために、 上記のようにして構築したマ ウス H鎖 V領域を PCR法により修飾した。 H鎖 V領域のための後方プライマー MBC 1HVS2 (配列番号 9) は V領域のリーダー配列の最初をコードする配列の 2番の ァスパラギンをグリシンに変換し、 且つ: Kozak コンセンサス配列 （Kozak, M. e t al.， J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)並びに Hind ΠΙおよび EcoRI 認識 配列を有するように設計した。 H鎖 V領域のための前方プライマ一 MBC1HVR2 (配 列番号 10) は J領域の 3'-側をコードする DNA配列にハイブリダィズし、 且つ、 C 領域の 5'-側の配列をコードし Apa Iおよび Smal認識配列を有するように設計し た。
PCRは TaKaRa Ex Taa (宝酒造） を用い、 50 1 の反応混合液に鐯型丽 Aとし て 0.6 gのプラスミド MBC1H/PUC19 、 プライマ一として MBC1HVS2および MBC1H VR2をそれぞれ 50pmole 、 TaKaRa Ex Taq を 2.5U、 0.25mMの dNTPを含む条件で添 付の緩衝液を使用して 50 1の鉱油を上層して 94°C 1分間、 55°C 1分間、 72°C 1 分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法により増幅した DNA断片を 1 %Sea Ke GTG ァガロース （FMC Bio. Products) を用いたァガロースゲル電気泳動により 分離した。 456bp 長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEAN II Kit (BI0101)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した]) N Aをエタノール沈殿させた後、 10mM Tris-HCl (pH7.4), 1 mM EDTA 溶液 20 i 1に 溶解した。
得られた DNA溶液 1 1を制限酵素 EcoRI および Smal (宝酒造） により 37°Cで 1時間消化した。 この消化混合物をフエノール及びクロ口ホルムで抽出し、 エタ ノール沈殿により DNAを回収した。 上記のようにして調製したマウス H鎖領域を コードする遺伝子を含む EcoRI-Smal DNA断片を EcoRI および Smalで消化するこ とにより調製した pUC19 ベクタ一にサブクローニングした。 このプラスミ ドの 塩基配列を確認するため、 プライマ一 M13 Primer M4 及び M13 Primer V をプ ライマーとして、 Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) を用 レ 、 DNA Sequencer 373A (Perkin- Elmer)により塩基配列を決定した。 正しい塩 基配列を有するハイプリドーマ #23- 57- 137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコー ドする遺伝子を含有し、 5'-側に EcoRI および Hind III認識配列並びに Kozak 配 列、 3'-側に Apalおよび Smal認識配列を持つプラスミドを MBClHv/pUC19と命名し た。
(iii) キメラ抗体 H鎖の発現べクタ一の構築
ヒト抗体 H鎖 C領域 Cァ 1を含む cDNAは、 以下のようにして調製した。 すなわ ち、 ヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 H鎖 C領域 IgGlのゲノム DNA (N. Taka ashi, et al., Cell 29, 671-679 1982) をコードする発現べクタ一 DHF R-AE-RV -PM-l-f (W092/19759参照） と、 ヒト型化 PM1抗体 L鎖 V領域およびヒ ト抗体 L鎖/ c鎖 C領域のゲノム DNAをコードする発現べクタ一 RV卜 PMla ( 092/19 759参照） とを導入した CH0細胞より mRNAを調製し、 RT- PCR法でヒト型化 P M 1抗 体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C r 1を含む c DNAをクローニングし、 pUC19 の Hind ΠΙと BamHI部位にサブクローニングした。 塩基配列を確認した後、 正 しい配列を持つプラスミドを pRVli- PMli- cDNAと命名した。
DHFR-AE-HVli-PM-卜 ί上の SV40プロモーターと DHFR遺伝子との間にある Hind I II部位、 および EF - laプロモーターとヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域との間にある E coRI 部位を欠失した発現ベクターを作製し、 ヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域およ びヒト抗体 C領域 C r 1を含む cDNAの発現べクタ一の構築のために使用した。
pRVh- PMli- cDNAを BamHIで消化した後、 Klenowフラグメントで平滑化し、 さら に Hind IIIで消化し、 Hind III- BamHI平滑化断片を調製した。 この Hind III-Ba mHI平滑化断片を、 上記の Hind III部位および EcoRI 部位が欠失した DHFR- ΔΕ- R Vh-PMl-f を Hind IIIおよび Smalで消化することにより調製した発現ベクターに 連結し、 ヒト型化 PM 1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C r 1をコードす る cDNAを含む発現べクタ一 RVh- ΡΜΙί— cDNAを構築した。
ヒト型ィ匕 PM 1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C r 1をコードする c應 Aを含む発現ベクター RVh-ΡΜΙί— cDNAを Apalおよび BamHIで消化した後、 H鎖 C領 域を含む MA断片を回収し、 Apalおよび BamHIで消化することにより調製した MBC1 Hv/pUC19に導入した。 こうして作製したプラスミドを MBClHcDNA /pUC19 と命 名した。 このプラスミドはマウス抗体の H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 Cァ 1 をコードする cDNAを含み、 5'-末端に EcoRI および Hind III認識配列、 3'-末端 に BamHI認識配列を持つ。
プラスミド MBClHcDNA/pUC19 を EcoRI および BamHIで消化し、 得られたキメラ 抗体の H鎖をコードする塩基配列を含む DNA断片を、 EcoRI および BamHIで消化 することにより調製した発現ベクター pCOSlに導入した。 こうして得られたキメ ラ抗体の発現プラスミドを MBClHcDNA/pCOSlと命名した。 なお、 発現べクタ一 pCO SIは、 HEF-PM -gr 1 (W092/19759参照） から、 EcoRI および Smal消化により抗 体遺伝子を削除し、 EcoRI- Notl- BamHIアダプタ一 （宝酒造） を連結することによ り構築した。
さらに CHO細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、 プラス ミド MBClHcDNA/pUC19 を EcoRI および BamHIで消化し、 得られたキメラ抗体 H鎖 配列を含む DNA断片を、 EcoRI および BamHIで消化することにより調製した発現 プラスミド pCHOlに導入した。 こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドを M BClHcDNA/pCHOl と命名した。 なお、 発現べクタ一 pCHOlは、 DHFR-AE-rvH-PMl- f (W092/19759参照） から、 EcoRI および Smal消化により抗体遺伝子を削除し, Eco I-Notl-BamHI Adaptor (宝酒造） を連結することにより構築した。
(2) ヒト L鎖定常領域の構築
(i) クローニングベクタ一の作製
ヒト L鎖定常領域を含む pUC19 ベクターを構築するために、 Hind III部位欠 失 PUC19 ベクタ一を作製した。 PUC19 ベクター 2 gを 20mM Tris-HCl (pH8.5 ) 、 lOmM MgCl2、 lmM DTT、 100 mM KCK 8Uの Hind III (宝酒造） を含有 する反応混合液 20 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 消化混合液をフエノールお よびクロ口ホルムで抽出し、 DNAをエタノール沈殿により回収した。
回収した DNAを 50 Tris-HCl (pH7.5) 10mM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM NaCL 0.5mM dNTP、 6 Uの Klenowフラグメント （GIBCO BRL)を含有する 50 1の反応 混合液中で室温にて 20分間反応させ、 末端を平滑化させた。 反応混合液をフエノ —ルおよびクロ口ホルムで抽出し、 ベクター DNAをエタノール沈殿により回収し た。
回収したベクタ一 DNAを 50mM Tris-HCl (pH7.6)、 lOmM MgCl2 、 1 mM ATP, lmM DTT、 5 % (v/v) ポリエチレングリコール- 8000 、 0.5 Uの T4 DNAリガ一 ゼ （GIBCO BRL)を含有する反応混合液 10 1中で 16°Cで 2時間反応させ、 自己 連結させた。 反応混合液 5 1を大腸菌 JM109 コンビテント細胞 （二ツボンジ ーン） 100 ^ 1に加え、 氷上で 30分間静置した後、 42 にて 1分間、 さらに氷 上で 1分間静置した。 S0C培地 500 1を加えて、 37°Cで 1時間インキュベーシ ヨンした後、 X- gal と IPTGを表面に塗布した 2XYT寒天培地 （50 g/mlアンピシ リン含有) (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にまき、 37°Cで一夜培養して形 質転換体を得た。
形質転換体を、 50 g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 20mlで 37°C—夜培 養し、 菌体画分から Plasmid Mini Ki t (QIAGEN)を用いて、 添付の処方に従って プラスミド DNAを精製した。 精製したプラスミドを Hind IIIで消化し、 Hind III 部位が欠失していることを確認したプラスミドを PUC19 AHind IIIと命名した c (i i)ヒト L鎖 λ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体 L鎖え鎖 C領域は、 Mcg+ Ke+ Oz -、 Meg- Ke- Oz -、 Meg- Ke- Oz十、 Meg- Ke+ Oz-の少なくとも 4種類のアイソタイプが知られている （P. Dari avach, e t al. , Pro Nat l. Acad. Sc i. USA, 84, 9074-9078, 1987) 。 #23 - 57— 13 7-1マウス L鎖 λ鎖 C領域と相同性を有するヒト抗体 L鎖 λ鎖 C領域を EMBLデー 夕べ一スで検索した結果、 アイソタイプが Mcg+ Ke+ Oz- (acces s ion No. X5781 9) (P. Dari avach, et al. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 84, 9074-9078, 1 987)のヒト抗体 L鎖 λ鎖が最も高い相同性を示し、 #23- 57- 137- 1マウス L鎖 λ鎖 C領:^との相同性はアミノ酸配列で 64. 4%、 塩基配列で 73. 4%であった。
そこで、 このヒト抗体 L鎖 λ鎖 C領域をコードする遺伝子の構築を PCR法を用 いて行った。 各プライマ一の合成は、 394 DNA/RNA synthes i zer (ABI 社） を用 いて行った。 HLAMB 1 (配列番号 1 1) および HLAMB3 (配列番号 13) はセンス DNA配 列を有し、 HLAMB2 (配列番号 12) および HLAMB4 (配列番号 14) はアンチセンス DN A配列を有し、 それぞれのプライマーの両端に 20から 23bpの相補的配列を有する。 外部プライマ一 HLAMBS (配列番号 15) 、 HLAMBR (配列番号 16) は HLAMB 1、 HLAM B4とそれぞれ相同な配列を有しており、 また HLAMBSは EcoRI 、 Hind I I I、 B lnl 認識配列を、 HLAMBRは EcoRI 認識配列をそれぞれ含んでいる。 第一 PCRで HLAMB 1-HLAMB2 と HLAMB3-HLAMB4 の反応を行った。 反応後、 それらを等量混合し、 第 二 PCRでアセンブリを行った。 さらに外部プライマ一 HLAMBSおよび HUMBRを添加 し、 第三 PCRにより全長 DNAを増幅させた。
PCRは TaKaRa Ex Taa (宝酒造） を使い、 添付の処方に従って行った。 第一 PC Rでは、 5 pmo l e の HLAMB 1および 0. 5pmol e の HLAMB2と 5 Uの TaKaRa Ex Taa (宝酒造） とを含有する 100 1の反応混合液、 あるいは 0. 5pmo l eの HLAMB3お よび 5 pmol e の HLAMB4と 5 Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） とを含有する 100 1の反応混合液を用い、 50 1の鉱油を上層して 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分 間、 72 にて 1分間の温度サイクルで 5回行つた。
第二 PCR は、 反応液を 50 1ずつ混合し、 50 1の鉱油を上層して 94°Cにて 1分間、 60 にて 1分間、 72 にて 1分間の温度サイクルで 3回行った。 第三 PC Rは、 反応液に外部プライマー HLAMBSおよび HLAMBRを各 50pmole ずつ添加し、 9 4°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行った。 第三 PCR産物の DNA断片を 3 %低融点ァガロースゲル （NuSieve GTG Agarose, FMC) で電気泳動した後、 GENECLEANII Kit (BI0101) を用い、 添付の処方に従つ てゲルから回収、 精製した。
得られた DNA断片を 50mM Tris-HCl (pH7.5) , 10mM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM N aCl 、 8Uの EcoRI (宝酒造） を含有する 20 1の反応混合液中で 37°Cにて 1 時間消化した。 消化混合液をフエノールおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタ ノール沈殿で回収した後、 10mM Tris-HCl (pH7.4), 1 mM EDTA 溶液 8 x 1に溶 解した。
プラスミド pUC 19 AHind III 0.8 gを同様に EcoRI で消化し、 フエノール およびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿により回収した。 消化したプラスミ ド PUC19 ΔΗίηά IIIを 50 mM Tris-HCl (pH9.0)、 1 mM MgCl2、 アルカリホスフ ァターゼ（E.coli C75, 宝酒造） を含有する反応混合液 50^ 1中で 37°C、 30分間 反応させ脱リン酸処理 （BAP処理） した。 反応液をフエノールおよびクロロホ ルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿により回収した後、 lOmM Tris-HCl (pH7.4) , ImM EDTA 溶液 10 x 1に溶解した。
上記の BAP処理したプラスミド PUC19 AHind III 1 1 と先の PCR産物 4 1 を DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造） を用いて連結し、 大腸菌 JM109 コンビテ ント細胞に形質転換した。 得られた形質転換体を 50 g/mlアンピシリンを含有す る 2XYT培地 2 mlで一夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAG EN) を用いてプラスミドを精製した。
上記プラスミドについて、 クロ一ニングされた DNAの塩基配列の確認を行った。 塩基配列の決定には 373A DNA sequencer (ABI 社） を用い、 プライマーには M13 Primer M4 および M13 Pricer V (宝酒造） を用いた。 その結果、 クロー二 ングされた DNAの内部に 12bpの欠失があることが判明した。 この DNAを含むプラス ミドを C λ A/pUC19 と命名した。 そこで、 その部分を補うためのプライマー H CLMS (配列番号 17) 、 HCLMR (配列番号 18) を新たに合成し、 PCRで再度正し い DNAの構築を行った。
第一 PCRで欠失 DNAを含むプラスミド CA A/pUC19 を錶型とし、 プライマー H LAMBSと HCLMR 、 HCLMS と HLAMB4で反応を行った。 PCR産物をそれぞれ精製し、 第二 PCRでアセンブリを行った。 さらに外部プライマー HLAMBSおよび HLAMB4を添 加し、 第三 PCRにより全長 DNAを増幅させた。 .
第一 PCRでは、 錶型として A/pUC19 0.1 μ g、 プライマー HLAMBSおよび H CLMR 各 50pmole 、 あるいは HCLMS および HLAMB4各 50pmole 、 5Uの TaKaRa Ex Tad (宝酒造） を含有する 100 i lの反応混合液を用い、 50^ 1の鉱油を上層 して 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行 つた。
PCR産物 HLAMBS- HCLMR (236bp) 、 HCLMS- HL崖 B4 (147bp) をそれぞれ 3 %低融点 ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit (BI0101) を用いてゲルか ら回収、 精製した。 第二 PCRでは精製 DNA断片各 40ng、 1 Uの TaKaRa Ex Taa (宝酒造） を含有する 20^ 1の反応混合液を用い、 25^ 1の鉱油を上層して 94°C にて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルを 5回行った。 第三 PCRでは、 第二 PCR反応液 2 l、 外部プライマー HLAMBS、 HLAMB4各 50pmol e 、 5Uの TaKaRa Ex Taa (宝酒造） を含有する 100 n 1の反応混合液を用い、 50 1の鉱油を上層した。 PCRは、 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行った。 第三 PCR産物である 357bp の DNA断片を 3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit (BI0101) を用 いてゲルから回収、 精製した。
得られた]) NA断片 0.1/2 gを EcoRI で消化した後、 BAP処理したプラスミド pUC19AHind IIIにサブクローニングした。 大腸菌 J M 1 0 9コンビテント細胞 に形質転換し、 50 g/mlアンピシリンを含有する 2 XYT培地 2 mlで一夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Ki t (QIAGEN)を用いてプラスミドを精製し た。
精製したプラスミドについて塩基配列を M13 Primer M4、 M13 Primer RV (宝 酒造） を用い、 373A DNAsequencer (ABI 社） にて決定した。 欠失のない正しい 塩基配列を有していることが確認されたプラスミドを C λ/ρυΠ9 とした。
(iii) ヒト L鎖/ c鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミド HEF- PMlk-gk (W092/19759) から L鎖 κ鎖 C領域をコードする DNA 断片を PCR法を用いてクローニングした。 394 DNA/RNA synthesizer (ABI 社） を 用いて合成した前方プライマー HKAPS (配列番号 19) は EcoRI 、 Hind III、 Bin I認識配列を、 後方プライマー HKAPA (配列番号 20) は EcoRI 認識配列を有する ように設計した。
錶型となるプラスミド HEF_PMlk-gk 0.1 g、 プライマ一 HKAPS 、 HKAPA 各 5 Opmole 、 5Uの TaKaRaEx Taa (宝酒造） を含有する 100 1の反応混合液を 用い、 50 z 1の鉱油を上層した。 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1 分間の反応を 30サイクル行った。 360bp の PCR産物を 3 %低融点ァガロースゲル で電気泳動した後、 GENECLEANII Kit (BI0101) を用いてゲルから回収、 精製し た。
得られた DNA断片を EcoRI で消化した後、 BAP処理したプラスミド pUC19 Δ Hind IIIにクローニングした。 大腸菌 J M 1 0 9コンビテント細胞に形質転換 し、 50 g/mlアンピシリンを含有する 2 XYT培地 2 mlで一夜培養し、 菌体画分 から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドの塩基配列を M13 Primer M4 、 M13 Primer RV (宝酒 造） を用い、 373A DNA seduencer (ABI社） にて決定した。 正しい塩基配列を有 していることが確認されたプラスミドを C / ZpUC19 とした。
(3) キメラ抗体 L鎖発現ベクターの構築
キメラ #23-57-137- 1抗体 L鎖発現ベクターを構築した。 プラスミド C AZpUCl 9 、 C /c/pUC19 のヒト抗体定常領域の直前にある Hind III、 Blnl部位に、 #2 3 - 57 - 137- 1L鎖 V領域をコードする遺伝子を連結することによって、 それぞれキ メラ #23- 57- 137-1抗体 L鎖 V領域および L鎖 λ鎖または L鎖/ 1鎖定常領域をコ一 ドする PUC19 ベクターを作製した。 EcoRI 消化によってキメラ抗体 L鎖遺伝子 を切り出し、 HE F発現ベクターへサブクローニングを行った。
すなわち、 プラスミド MBC1L24 から #23- 57- 137- 1抗体 L鎖 V領域を PCR法を用 いてクロ一ニングした。 各プライマーの合成は、 394 DNA/RNA synthesizer (ABI 社） を用いて行った。 後方プライマー MBCCHL1 (配列番号 21) は Hind III認識 配列と Kozak 配列 (Kozak, M. et al. , J.Mol. Biol.196, 947-950, 1987) を、 前方 プライマー MBCCHL3 (配列番号 22) は Bglll 、 EcoRI 認識配列を有するように 設計した。
PCRは、 議 Tris-HCl (pH8.3), 50mM KCK 1.5mM MgCl2 、 0.2mM dNTP、 0.1 t gの MBC1L24 、 プライマ一として MBCCHL1 および MBCCHL3 を各 50pmole 、 1 1の AmpliTa PERKIN ELMER) を含有する 100 1の反応混合液を用い、 50 1の鉱油を上層して 94°Cにて 45秒間、 60°Cにて 45秒間、 72°Cにて 2分間の温度 サイクルで 30回行った。
444bpの PCR産物を 3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEAN I I kit (BI0101)を用いてゲルから回収、 精製し、 lOmM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20 1に溶解した。 PCR産物 1 n 1をそれぞれ 10mM Tris-HCl (pH7. 5)、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 50mM NaCl 、 8 Uの Hind III (宝酒造） および 8 Uの EcoRI (宝酒造） を含有する反応混合液 20 1中で 37Cにて 1時間消化し た。 消化混合液をフエノールおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿 で回収し、 10mM Tris-HCl (pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 8 n 1に溶解した。
プラスミド PUC19 l gを同様に Hind IIIおよび EcoRI で消化し、 フエノー ルおよびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿により回収し、 アルカリホスファ ターゼ（E. col i C75 ， 宝酒造） で BAP処理した。 反応液をフエノールおよびクロ 口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿で回収した後、 lOmM Tris - HC1 (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
BAP処理したプラスミド pUC19 1 I と先の PCR産物 4 1を DNA Ligation Ki t Ver.2 (宝酒造） を用いて連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞 （二ツボン ジーン） に前述と同様に形質転換した。 これを 50 g/nilアンピシリンを含有する 2XYT寒天培地にまき、 37°Cで一夜培養した。.得られた形質転換体を、 50 g/ml アンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで 37°Cで一夜培養した。 菌体画分から QIA prep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。 塩基配列を決 定後、 正しい塩基配列を有するプラスミドを CHL/pUC19 とした。
プラスミド C A/pUC19 、 C K/PUC19 各 1 gをそれぞれ 20mM Tris-HCl (p H8.5)、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM KC1、 8Uの Hind III (宝酒造） および 2Uの Blnl (宝酒造） を含有する反応混合液 1中で 37°Cにて 1時間消化した c 消化混合液をフエノールおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿で回 収した後、 37°Cで 30分間 B AP処理を行った。 反応液をフエノールおよびクロ口 ホルムで抽出し、 DNAをエタノール沈殿で回収し、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 1 mM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
#23 - 57-137 - 1L鎖 V領域を含むプラスミド CHL/pUC19 から 8 /x gを同様に Hin d IIIおよび Blnlで消化した。 得られた 409bp の DNA断片を 3 %低融点ァガロー スゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit (BI0101) を用いてゲルから回収、 精製し、 lOmM Tris-HCl (pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
この L鎖 V領域 DNA 4 1を B AP処理したプラスミド C A/pUC19 または C / / UC19 各 1 1 にサプクローニングし、 大腸菌 JM109コンピテント細胞に 形質転換した。
Figure imgf000037_0001
ァンピシリンを含有する2ズ¥1：培地31111でー夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミ ドを精製 した。 これらをそれぞれプラスミド MBClL(A)/pUC19 、 MBC1L ( /c ) /pUC19 とし た。
プラスミド MBC1L U)/pUC19 および MBC1L ( κ ) /pUC19 をそれぞれ EcoRI で消 化し、 3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 7431DP の DNA断片を GENECL EANII Kit (BI0101) を用いてゲルから回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
発現べクタ一としてプラスミド HEF-PMlk-gk 2.7 を EcoRI で消化し、 フ エノ一ルおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿で回収した。 回収し た DNA断片を BAP処理した後、 1 %低融点ァガロースゲルで電気泳動し、 6561bpの DNA断片を GENECLEANII Kit (BI0101) を用いてゲルから回収、 精製し、 lOmM Tri s-HCl (pH7.4)、 ImM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
BAP処理した HEFベクター 2 1を上記プラスミド MBCIL(A) または MBClL(/ ) EcoRI 断片各 3 ^ 1 と連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に形質転換した 50 g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、 20mM Tris- HC1 (pH8.5) 、 lOmM MgCl^ 1 mM DTT、 1 OOmM KC1 、 8 Uの Hindlll (宝酒造） および 2 Uの Pvul (宝酒造） を含有する 反応混合液 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 断片が正しい方向に挿入されて いれば 5104/2195bp 、 逆方向に挿入されていれば 4378/2926bp の消化断片が生 じることより、 正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれ MBClL(A)/ne 0 、 MBClL(/c)/neo とした。
(4) COS- 7細胞のトランスフエクシヨン
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、 前記発現プラスミ ドを COS- 7細胞で一過性に発現させた。
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、 プラスミド MBClHcDNA/pCOSlと MBCIL(A) /neoまたは MBClHcDNA/pCOSlと MBClL( c)/neoの組み合わせで、 Gene Pulser装置 (Bio Rad)を用いてエレクト口ポレーシヨンにより COS- 7細胞に同時形質導入し た。 PBS (-)中に lxlO7 細胞/ mlの細胞濃度で懸濁されている COS- 7細胞 0.8mlに、 各プラスミド DNA 10 z gを加え、 1， 500V, 25 Fの静電容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、 エレクトロポレーシヨン処理された細胞を 2 % の "Ultra Low IgGゥシ胎児血清（GIBC0)を含有する DMEM培地（GIBC0)に懸濁し、 10 cm培養皿を用いて C02 インキュベータ一にて培養した。 72時間の培養の後、 培養 上清を集め、 遠心分離により細胞破片を除去し、 ELISAの試料に供した。
また、 C0S-7細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、 AifiGel Protein A MAPSIIキット（BioRad)を用いてキット添付の処方に従って行った。
(5) ELISA
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のための ELISAプレートを次のようにして調製した。 ELISA用 96穴 プレート（Maxisorp, NUNC )の各穴を固相化バッファ一（0.1M NaHC03、 0.02¾ Na N3)で l g/mlの濃度に調製したャギ抗ヒ卜 IgG抗体（TAG0) 100 1で固相化し、 200 Γの希釈バッファー（50mM Tri s-HC ImM MgCl 2 、 0. 1M NaCK 0. 05% Tween20、 0. 02¾ NaN3、 1 % 牛血清アルブミン（BSA)、 pH7. 2) でブロッキングの後、 キメ ラ抗体を発現させた COS細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して 各穴に加えた。 1時間室温にてインキュベートし PBS- Tween20で洗浄後、 アル力 リフォスファターゼ結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAGO) 100 i 1を加えた。 1時間室温 にてィンキュベ一トし PBS- Tween20で洗浄の後、 lmg/mlの基質溶液（Sigmal04、 p 一二トロフエニルリン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405ηηιでの吸光度をマイクロプレ 一トリ一ダ一（B i o Rad)で測定した。 濃度測定のスタンダードとして、 Hu IgGl λ Puri f ied (The B ind ing Si te)を用いた。
(i i)抗原結合能の測定
抗原結合測定のための E1 ISAプレートでは、 次のようにして調製した。 ELI SA用 96穴プレートの各穴を固相化バッファ一で 1 g/mlの濃度に調製したヒト PTHrP (1-34) (ペプチド研究所） 100 1で固相化した。 200 1の希釈バッファーでブ ロッキングの後、 キメラ抗体を発現させた COS細胞の培養上清あるいは精製キメ ラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。 室温にてインキュベートし PBS-Tween20で 洗浄後、 アル力リフォスファターゼ結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAGO) 100 i lを加え た。 室温にてインキュベートし PBS- Tween20で洗浄の後、 1 mg/mlの基質溶液（Sig ma 104, p—二トロフエニルリン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405ηπιでの吸光度をマ イク口プレートリーダー（B i 0 Rad)で測定した。
その結果、 キメラ抗体は、 ヒト PTHrP (1-34)に対する結合能を有しており、 ク ローニングしたマウス抗体 V領域の正しい構造を有することが示された。 また、 キメラ抗体において L鎖 C領域が λ鎖あるいは κ鎖のいずれであっても抗体の ΡΤ HrP (l - 34)に対する結合能は変化しないことから、 ヒト型化抗体の L鎖 C領域は、 ヒト型化抗体 L鎖 λ鎖を用いて構築した。
(6) CH0安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、 前記発現プラスミドを CH0細胞 (DXB 11)に導入した。
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、 CH0細胞用発現プラスミド MBC 1H cDNA/pCHOlと MBCIL (λ ) Zneoまたは MBClHcDNAノ pCHOlと MBCIL ( / ) /neoの組み 合わせで、 Gene Pulser装置（Bio Rad)を用いてエレクト口ポレーシヨンにより C HO細胞に同時形質導入した。 それぞれの発現ベクターを制限酵素 Pvulで切断して 直鎖 DNAにし、 フエノールおよびクロ口ホルム抽出後、 エタノール沈殿で DNAを回 収してエレクト口ポレーシヨンに用いた。 PBS (-)中に lxlO7 細胞/ mlの細胞濃度 で懸濁されている CH0細胞 0.8mlに、 各プラスミド DNA を加え、 1, 500V, 25 の静電容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、 エレクト 口ポレーシヨン処理された細胞を 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)を添加した MEM-ひ培 地（GIBC0)に懸濁し、 3枚の 96穴プレート（Falcon)を用いて C02 インキュベータ 一にて培養した。 培養開始翌日に、 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)および 500mg/mlの G ENETICIN(G418Sulfate, GIBC0) 添加、 リポヌクレオシドおよびデォキリポヌク レオシド不含 MEM-ひ培地（GIBC0)の選択培地を交換し、 抗体遺伝子の導入された 細胞を選択した。 選択培地交換後、 2週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、 順調 な細胞増殖が認められた後に、 上記抗体濃度測定 ELISAにて抗体産生量を測定し、 抗体産生量の多い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、 ローラ一ポトルにて 2 %の ϋΐ tra Low IgGゥシ胎児血清添加、 リポヌクレオシドおよびデォキリポヌクレオシ ド不含 MEM培地を用いて、 大量培養を行った。 培養 3ないし 4日目に培養上清 を回収し、 0.2 ΠΙのフィルター （Millipore) により細胞破片を除去した。
CH0細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、 P0R0Sプロテイン Aカラム（PerS eptive Biosystems)を用いて、 ConSep LC100 (Millipore) にて添付の処方に従 つて行い、 中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供 した。 得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、 上記 ELISA系にて 測定した。
〔参考例 4〕 ヒト型化抗体の構築
(1) ヒ卜型化抗体 H鎖の構築
(i) ヒト型化 H鎖 V領域の構築
ヒト型化 #23-57- 137- 1抗体 H鎖を、 PCR法による CDR-グラフティングにより作 製した。 ヒト抗体 S31679 (NBRF-PDB、 Cuis inier A. M. ら、 Eur. J. I雇画 1.， 23, 110-118, 1993)由来の FRを有するヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体 H鎖 （バ一ジョン " a ") の作製のために 6個の PCRプライマーを使用した。 CDR-グラフティングプ ライマ一 MBC1HGP 1 (配列番号 23) 及び MBC1HGP3 (配列番号 24) はセンス DNA配列を 有し、 そして CDRグラフティングプライマ一 MBC 1HGP2 (配列番号 25)及び MBC1HGP4 (配列番号 26)はアンチセンス]) NA配列を有し、 そしてそれぞれプライマーの両端 に 15から 21bpの相補的配列を有する。 外部プライマ一 MBC 1HVS1 (配列番号 27)及び MBC1HVR1 (配列番号 28)は CMグラフティングプライマ一 MBC1HGP1及び MBC 1HGP4と ホモロジ一を有する。
CDR-グラフティングプライマー MBC1HGP1、 MBC1HGP2、 MBC1HGP3および MBC1HGP4 は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し （Molecular CloningrA Lab oratory Manual, Sambrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 、 ゲレ力 らの由出【ま crush and soak法（Molecul ar Cloning:A Laboratory Manual, Sambrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
すなわち、 それぞれ l nmoleの CDR-グラフティングプライマーを 6 %変性ポリ アクリルアミドゲルで分離し、 目的の大きさの DNA断片の同定をシリカゲル薄層 板上で紫外線を照射して行い、 crush and soak法にてゲルから回収し 20 1の 1 OmM Tris-HCl (pH7. 4) , ImM EDTA溶液に溶解した。 PCRは、 TaKaRa Ex Ta (宝酒 造） を用い、 100 1の反応混合液に上記の様に調製した CDR-グラフティングプ ライマ一 MBC1HGP1、 MBC1HGP2, MBC1HGP3および MBC1HGP4をそれぞれ 1 1、 0. 25 mMの dNTP、 2. 5ϋの TaKaRaEx TaQを含む条件で添付緩衝液を使用して 94°Cにて 1 分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回行い、 さらに 50pm oleの外部プライマー MBC1HVS1及び MBC 1HVR1を加え、 同じ温度サイクルを 30回行 つた。 PCR法により増幅した DNA断片を 4 %Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Pr oducts)を用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEANII Ki t (BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをエタノー ルで沈殿させた後、 10mM Tr i s-HCl (pH7. 4) , ImM EDTA溶液 20 1に溶解した。 得 られた PCR反応混合物を BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した pUC19 にサブクローニングし、 塩基配列を決定した。 正しい配列を有するプラスミ ドを hMBCHv/pUC19と命名した。
(ii) ヒト型化 H鎖 c應 Aのための H鎖 V領域の構築
ヒト H鎖 C領域 Cァ 1の cDNAと連結するために、 上記のようにして構築したヒ ト型化 H鎖 V領域を PCR法により修飾した。 後方プライマー MBC1HVS2は V領域の リーダー配列の 5'-側をコードする配列とハイブリダィズし、 且つ Kozakコンセン サス配列（Kozak, M,ら、 J.Mol.Biol.196, 947-950, 1987)、 Hindlllおよび EcoRI認 識配列を有するように設計した。 H鎖 V領域のための前方プライマ一 MBC 1HVR2は J領域の 3'-側をコードする DNA配列にハイブリダィズし、 且つ C領域の 5'-側の 配列をコードし Apalおよび Smal認識配列を有するように設計した。
PCRは TaKaRa Ex TaQ (宝酒造） を用い、 錶型 DNAとして 0.4 gの hMBCHv/pUC19 を用い、 プライマ一として MBC1HVS2および MBC1HVR2をそれぞれ 50pmole、 2.5Uの TaKaRa Ex TaQ、 0.25mMの dNTPを含む条件で添付緩衝液を使用し、 94°Cにて 1分 間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法によ り増幅した DNA断片を 3 % Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用い たァガロースゲル電気泳動により分離した。
456bp長の DNA断片を含有するァガ口一ス片を切取り、 GENECLEANII Kit (BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをエタノー ルで沈殿させた後、 10mM Tris-HCl (pH7.4) , lmM EDTA溶液 20 ζ 1に溶解した。 得 られた PCR反応混合物を EcoMおよび Smalで消化することで調製した pUC19にサブ クロ一ニングし、 塩基配列を決定した。 こうして得られたハイプリドーマ #23 - 5 7 - 137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含有し、 5'-側に EcoR Iおよび Hindlll認識配列及び Kozak配列、 3' -側に Apalおよび Smal認識配列を持つ プラスミドを hMBClHv/pUC19と命名した。
(2)ヒト型化抗体 H鎖の発現べクタ一の構築
hPMl抗体 H鎖 cDNAの配列を含むプラスミド RVli- PMli- cDNAを Apalおよび BamHI にて消化し、 H鎖 C領域を含む DNA断片を回収し、 Apalおよび BamHIで消化するこ とにより調製した hMBCmv/pUC19に導入した。 こうして作製したプラスミドを ΙιΜΒ ClHcDNA/pUC19と命名した。 このプラスミドはヒ卜型化 #23- 57-137- 1抗体の H鎖 V領域及びヒト H鎖 C領域 Cァ 1を含み、 5'-末端に EcoRIおよび Hindlll認識配 列、 3'-末端に BamHI認識配列を持つ。 プラスミド hMBClHcDNA/pUC19に含まれるヒ ト型化 H鎖パージヨン" a"の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号 58 に示す。 また、 バージョン aのアミノ酸配列を配列番号 56に示す。
hMB C 1HCDNA/PU C 19を Ec oR Iおよび B amH Iで消化し、 得られた H鎖配列を含む丽 A 断片を EcoRIおよび BamHIで消化することにより調製した発現プラスミド pCOSlに 導入した。 こうして得られたヒ卜型化抗体の発現プラスミドを hMBClHcDNA/pCOSl と命名した。
さらに CH0細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため hMBC lHcDNA/ PUC19を EcoRIおよび BamHIで消化し、 得られた H鎖配列を含む DNA断片を EcoRIお よび BamHIで消化することにより調製した発現プラスミド pCHOlに導入した。 こう して得られたヒト型化抗体の発現プラスミドを hMBClHcDNA/pCHOlと命名した。 (3) L鎖ハイプリッド可変領域の構築
(i) FR1, 2/FR3, 4ハイプリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス （キメラ） 抗体の FR領域を組み換えた L鎖遺伝子を構築 し、 ヒト型化のための各領域の評価を行った。 CDR2内にある制限酵素 ΑΠΙΙ切断 部位を利用することによって、 FR1及び 2はヒト抗体由来、 FR3及び 4はマウス 抗体由来とする八イブリツド抗体を作製した。
プラスミド MBClL( t)/neo及び JiMBClL(A)/neo各 を IOBIM Tris-HCl (pH7. 5), 10mM MgCl2, ImM DTT, 50mM NaCl, 0.01% (w/v)BSA, Aflll (宝酒造) 10U を含有する反応混合液 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 反応液を 2 %低融点 ァガロースゲルで電気泳動し、 プラスミド MBClL(A)/neoから 6282bpの断片（clと する）および 1022bpの断片（c2とする）、 プラスミド hMBCIL (λ ) /neoから 6282bpの 断片（hiとする）および 102213Pの断片（h2とする) を、 GENECLEA II Kit (BI0101) を用いてゲルから回収、 精製した。
回収した c 1、 h 1断片各 1 gについて B AP処理を行った。 膽 Aをフエノ —ルおよびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿で回収した後、 10mM Tris-HCl
(pH7.4) , ImM EDTA溶液 10 1に溶解した。
BAP処理した c 1及び h 1断片 1 1をそれぞれ h 2、 c'2断片 4 1に連結 し （4°C、 一夜） 、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に形質転換した。 50 g/mlァ ンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Pla smid KU (QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、 ΙΟπιΜ Tris- HC1 (pH7.5), lOmM MgCl2, ImM DTT, ApaL
I (宝酒造） 2 U、 または BamHI (宝酒造） 8U， Hindlll (宝酒造） 8Uを含有する反 応混合液 20^1中で 37°C、 1時間消化した。 c 1-h 2が正しく連結されていれば、 ApaLIで 5560/1246/498bp、 BamHI/Hindlllで 7134/269bpの消化断片が生じること により、 プラスミドの確認を行った。
これをヒト FR1, 2ノマウス FR3, 4ハイプリッド抗体 L鎖をコードする発現べクタ
—を h/mMBClL(A)/neoとした。 一方、 M-c2のクローンが得られなかったので、 p
UCベクタ一上で組換えてから HEFベクターにクローニングした。 その際、 ァミノ 酸置換のないヒト型化抗体 L鎖 V領域を含むプラスミド JiMBCiLa i/i)UC19、 及び F
R3内の 91位（Kaba tの規定によるアミノ酸番号 87位） のチロシンをイソロイシンに 置換したヒト型化抗体 L鎖 V領域を含むプラスミド hMBClLdA/pUC19を錶型とし て用いた。
プラスミ MBClL(A)/pUC19, hMBClLa^/pUC19及び hMBClL(U/pUC19の各 10 g を lOmM Tris-HCl (pH7.5)， lOmM MgCl2, ImM DTT, 50mM NaCl, 0.01%(w/v)BSA, Hindlll 16U, Aflll 4Uを含有する反応混合液 30 z 1中で 37°C、 1時間消化した。 反応液を 2%低融点ァガロースゲルで電気泳動し、 プラスミド MBClL(A)/pUC19 から 215bp(c2')、 プラスミド11!\¾(11^ / 1](；19ぉょび^¾[；11^ / 1](；19からそれぞ れ 3218bp(hal',hdl')の DNA断片を GENECLEANII Kit (BI0101)を用いてゲルから回 収、 精製した。
al\ hdl'断片をそれぞれ c2'断片に連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に 形質転換した。 50^g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画 分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。 こ れらをそれぞれプラスミド m/hMBClLaA/pUC19、 m/hMBClLc /pUC19とした。
得られたプラスミ Hm/ MBClLaA/pUC19, m/MBClLd λ /pUC19を EcoRIで消化し た。 それぞれ 743bpの DNA断片を 2%低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GE NECLEANII Kit (BI0101)を用いてゲルから回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA溶液 20 1に溶解した。
各 DNA断片 4 1を前述の BAP処理した HEFベクター 1 a 1に連結し、 大腸菌 JM1 09コンピテント細胞に形質転換した。 50 ig/mlアンピシリンを含有する 2XYT培 地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてブラ スミドを精製した。
精製した各プラスミドを、 20πιΜ Tris-HCl (ρΗ8· 5), 10mM MgCl2, ImM DTT, 10 OmM KC1, Hindlll (宝酒造） 8U， Pvul (宝酒造） 2Uを含有する反応混合液 20 ^ 1中 で 37°Cにて 1時間消化した。 断片が正しい方向に挿入されていれば 5104/2195bp、 逆方向に挿入されていれば 4378/2926bpの消化断片が生じることより、 プラスミ ドの確認を行った。 これらをそれぞれマウス FR1, 2Zヒト FR3, 4ハイプリッド抗体 L鎖をコードする発現ベクターを m/hMBClLaA/neo、 ni/hMBClLdA/neoとした。
(ii) FR 1ZFR 2ハイプリッド抗体の作製
CDR1内にある SnaBI切断部位を利用することによって、 同様に FR1と FR2のハイ プリッド抗体を作製した。
プラスミド MBC1L (λ)/ηεο及び h/mMBClLU)/neoの各 10/zgを 10mM Tris-HCl (p H7.9)， 10mM MgCl2, ImM DTT, 50mM NaCl, 0.01¾(w/v)BSA, SnaBI (宝酒造） 6 U を含有する反応混合液 20 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 次に 20mM Tris-HCl (pH8.5) , 10mM MgCl2, ImM DTT, lOOmM KC1, 0.01%( /v)BSA, Pvul 6 Uを含 有する反応混合液 50^ 1中で 37°Cにて 1時間消化した。
反応液を 1.5%低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 プラスミド MBCIL(A) /neoから 4955bp(ml)および 2349bp(m2)、 プラスミド h/mMBClL (え）/ neoから 4955bp (hml)および 2349bp ( m2)の各 DNA断片を GENECLEANII Kit (BI0101)を用いてゲル から回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA溶液 40 1に溶解した。
ml、 hml断片 1 1をそれぞれ hm2、 m2断片 4 1に連結し、 大腸菌 JM109コンビテ ント細胞に形質転換した。 50 ig/nilアンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養 し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを精 製した。
精製した各プラスミドを、 10mM Tris- HC1 (pH7.5), 10mM MgCl2, liM DTT, Ap al (宝酒造） 8U、 または ApaLI (宝酒造） 2Uを含有する反応混合液 1中で 37°Cにて 1時間消化した。
各断片が正しく連結されていれば、 Apalで 7304bp、 ApaLIで 5560/1246/498bp (m ト hm2)、 Apalで 6538/766bp、 ApaLIで 3535/2025/1246/498bp Oim卜! n2)の消化断 片が生じることにより、 プラスミドの確認を行った。 これらをそれぞれヒト FR1 ノマウス FR2， 3, 4ハイプリッド抗体 L鎖をコ一ドする発現ベクターを h匪 MBC1L (A)/neo、 マウス FR1/ヒト FR2/マウス FR3, 4ハイプリッド抗体 L鎖をコードす る発現べクタ一を fflhmMBClL(A)/neoとした。
(4)ヒト型化抗体 L鎖の構築
ヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体 L鎖を、 PCR法による CDR-グラフティングにより作 製した。 ヒト抗体 HSU03868 (GEN- BANK、 Deftos Mら， Scand. J. Immunol. , 39, 9 5-103, 1994)由来の FR1、 FR2および FR3、 並びにヒト抗体 S25755 (NBRF-PDB)由来 の FR4を有するヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体 L鎖 （バージョン" a") の作製のため に 6個の PCRプライマ一を使用した。
CDR-グラフティングプライマー MBC1LGP1 (配列番号 29)及び MBC1LGP3 (配列番号 3 0)はセンス DNA配列を有し、 そして CDRグラフティングプライマー MBC1LGP2 (配列 番号 31)及び MBC1LGP4(配列番号 32)はアンチセンス DNA配列を有し、 そしてそれぞ れプライマ一の両端に 15から 21bpの相補的配列を有する。 外部プライマー MBC1LV S1 (配列番号 33)及び MBC1LVR1 (配列番号 34)は CDRグラフティングプライマ一 MBC1L GP1及び MBC1LGP4とホモロジ一を有する。
CDR-グラフティングプライマ一 MBC1LGP1、 MBC1LGP2, MBC1LGP3および MBC1LGP4 は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning:A Labo ratory Manual, Sambrook¾, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 ァ ルからの抽出は crush and soak法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Sa mbrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。 すなわち、 それぞれ lnmoleの CDR-グラフティングプライマ一を 6 %変性ポリァ クリルアミドゲルで分離し、 目的の大きさの DNA断片の同定をシリカゲル薄層板 上で紫外線を照射して行い、 crush and soak法にてゲルから回収し 20 1の 10mM Tris-HCl (pH7.4) , ImMEDTA溶液に溶解した。
PCRは、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を用い、 100 1の反応混合液に上記の様に 調製した CDR-グラフティングプライマー MBC1LGP1、 MBC1LGP2, MBC1LGP3および MB C1LGP4をそれぞれ l l、 0.25mMの dNTP、 2.5Uの TaKaRa Ex Taqを含む条件で添付 緩衝液を使用して 94°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイ クルで 5回行い、 この反応混合液に 50pmoleの外部プライマー MBC1LVS1及び MBC1L VR1を加え、 さらに同じ温度サイクルで 30回反応させた。 PCR法により増幅した DN A断片を 3%Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用いたァガロースゲ ル電気泳動により分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEANII Kit (BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い丽 A断片を精製した。 得られた PCR反応混合物 を BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した PUC19にサブクローニング し、 塩基配列を決定した。 こうして得られたプラスミドを hMBCL/pUC19と命名し た。 しかしながら CDR4の 104位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 96位） のァミノ 酸がアルギニンになっていたため、 これをチロシンに修正するための修正プライ マー MBC1LGP10R (配列番号 35)を設計し、 合成した。 PCRは TaKaRa Tad (宝酒造） を 用い、 100 ilの反応混合液に鍀型 DNAとして 0. のプラスミド hMBCL/pUC19、 プ ライマーとして MBC1LVS1及び MBC1LGP10Rをそれぞれ 50pmole、 2.5Uの TaKaRa Ex TaQ (宝酒造） 0.25mMの dNTPを含む条件で添付の緩衝液を使用して 50^1の鉱油を上 層して 94°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回 行った。 PCR法により増幅した DM断片を 3 % Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用いたァガ口一スゲル電気泳動により分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガ口一ス片を切取り、 GENECLEANII Kit (BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い]) NA断片を精製した。 得られた PCR反応混合物 を BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した PUC19にサブクローニング した。
M13 Primer M4プライマ一及び M13 Primer RVプライマ一を用いて塩基配列を 決定した結果、 正しい配列を得ることができたので、 このプラスミドを Hindlll および Blnlで消化し、 416bpの断片を 1 %ァガロースゲル電気泳動により分離し た。 GENECLEANII Ki t (BIOIOI)を用い、 キット添付の処方に従い丽 A断片を精製 した。 得られた PCR反応混合物を Hindlllおよび Blnlで消化することにより調製し たプラスミド CAZpUC19に導入し、 プラスミド hMBClLaA/pUC19と命名した。 こ のプラスミドを EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコードする配列を含む配列をブラ スミド pCOSnこ導入し、 EFlaプロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが 位置するようにした。 こうして得られたプラスミドを hMBClLaA/pCOSlと命名し た。 ヒト型化 L鎖バージョン" a"の塩基配列 （対応するアミノ酸を含む） を配列 番号 66に示す。 また、 バージョン aのアミノ酸配列を配列番号 47に示す。
バージョン" b"を PCR法による変異導入を用いて作製した。 バ一ジョン" b"で は 43位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 43位） のグリシンをプロリンに、 49位0( abatの規定によるアミノ酸番号 49位） のリジンをァスパラギン酸に変更するよう に設計した。 変異原プライマー MBC1LGP5R (配列番号 36)とプライマー MBC1LVS1に よりプラスミド hMBClLaA/pUC19を錶型として PCRを行い、 得られた DNA断片を Bam HIおよび Hindlllで消化し、 pUC19の BamHI, Hindlll部位にサブクローニングし た。 塩基配列決定後、 制限酵素 Hindlllおよび ΑΠΙΙで消化し、 Hindlllおよび ΑΠ 11で消化した11¾¾(11^ぇ/ 1](；19と連結した。
こうして得られたプラスミドを hMBClLbA/pI!C19とし、 このプラスミドを EcoRI で消化し、 ヒト型化 L鎖をコードする]) NAを含む断片をプラスミド pCOSlに導入し、 EF1 αプロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得られたプラスミドを BClLiU/pCOSlと命名した。
バ一ジョン" c "を PCR法による変異導入を用いて作製した。 バージョン" c "で は 84位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 80位） のセリンをプロリンに変更するよ うに設計した。 変異原プライマー MBC1LGP6S (配列番号 37)とプライマー M13 Prim er によりプラスミド MBClLaA/pUC19を鎳型として PCRを行い、 得られた DNA 断片を BamHIおよび Hindlllで消化し、 BamHIおよび Hindlllで消化することにより 調製した PUC19にサブクローニングした。
塩基配列決定後、 制限酵素 BstPIおよび Aor51HIで消化し、 BstPIおよび Aor51HI で消化した JiMBClLaA/pIJC19と連結した。 こうして得られたプラスミドを hMBClLc A/pUC19とし、 このプラスミドを制限酵素 EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコ一ド する配列を含む配列をプラスミド pCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFlaプロモータ 一の下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得られた プラスミドを hMBClLcA/pCOSlと命名した。
バージョン" d" 、 "e " 及び" f " を PCR法による変異導入を用いて作製した。 各パ一ジョンとも順に" a" 、 "b" 、 "c " バージョンの 91位（Kabatの規定によ るアミノ酸番号 87位） のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。 変 異原プライマ一 MBC1LGP11R (配列番号 38)とプライマ一 M- S1 (配列番号 44) により それぞれ hMBClLaA/pCOSl, hMBClL A /pCOSl, hMB LcA/pCOSlを鎳型として PCR を行い、 得られた DNA断片を BamHIおよび Hindlllで消化し、 BamHIおよび Hind III で消化することにより調製した PUC19にサブクローニングした。 塩基配列決定後、 Hindlllおよび Blnlで消化し、 Hindlllおよび Blnlで消化することより調製した C AZpUC19と連結した。
こうして得られたプラスミドを順に hMBClLdA/pUC19、 hMBClLeA/pUC19, MBC lLfA/pUC19とした。 これらのプラスミドを EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコード する配列を含む配列をプラスミド pCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFlaプロモー夕 —の下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得られた プラスミドをそれぞれ順に liMBClLdA/pCOSl、 hMBClLe λ /pCOSK hMBClLf λ /pCOS 1と命名した。
パージヨン" g" 及び" h" を PCR法による変異導入を用いて作製した。 各バー ジョンとも順に" a" 、 "d" バージョンの 36位（Kabatの規定によるアミノ酸番 号 36位） のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。 変異原プライマー MBC1LGP9R (配列番号 39)および M13 Primer RVをプライマ一として用いて、 MBC1 LaA/pUC19を鎢型として PCRを行い、 得られた PCR産物と M13 Primer M4をプライ マーとして用いて、 プラスミド hMBClLaA/pUC19を錶型としてさらに PCRを行った c 得られた DM断片を Hindlllおよび Blnlで消化し、 Hindlllおよび Blnlで消化する ことで調製したプラスミド CAZpUC19にサブクロ一ニングした。 このプラスミ ドを鐯型として、 プライマー MBC1LGP13R (配列番号 40)と MBC1LVS1をプライマーと した PCRを行った。 得られた PCR断片を Apalおよび Hindllで消化し、 Apalおよび Hi ndl IIで消化したプラスミド BClLaA/pUC19および hMBClLc /pUC19に導入した。 塩基配列を決定し、 正しい配列を含むプラスミドを順に hMBClLgA/pUC19および h MBClLlU/pUC19とし、 これらのプラスミドを制限酵素 EcoRI消化し、 ヒト型化 L 鎖をコードする配列を含む配列をプラスミド pCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFla プロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうし て得られたプラスミドをそれぞれ順に liMBClLgA/pCOSlおよび hMBClLi /pCOSlと 命名した。
バージョン" i " 、 "j " 、 "k" 、 " 1 " 、 "m" 、 "n" および" o" を PCR法 による変異導入を用いて作製した。 変異原プライマー MBC1LGP14S (配列番号 41)と プライマ— V1RV ) (配列番号 43)によりプラスミド IiMBClLaA/pUC19を錶型とし て PCRを行い、 得られた DNA断片を Apalおよび Blnlで消化し、 Apalおよび Blnlで消 化することにより調製したプラスミド111^[；11^人/ 1]( 19にサブクローニングした。 塩基配列決定を行い、 それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクロー ンを選択した。 こうして得られたプラスミドを 1IMBC1LXA/PUC19 (x= i， j , k, 1， m, n， o) とし、 このプラスミドを EcoRI消化し、 ヒ卜型化 L鎖をコ ードする配列を含む配列をプラスミド pCOSlの EcoRI部位に導入し、 EF1 プロモ 一夕一の下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得ら れたプラスミドを JiMBClLxA/pCOSl (x= i， j , k, 1 , m, η, ο) と命名 した。 バージョン" j " 、 " 1 " 、 "m" および" o" の塩基配列 （対応するアミ ノ酸を含む） をそれぞれ配列番号 67、 68、 69、 70に示す。 また、 これらの各バー ジョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 48、 49、 50、 51に示す。
ノ 一ジョン "p" 、 "q" 、 " r " 、 " s " および" t " は、 ノ 一ジョン" i " 、 " j " 、 "m" 、 " 1 " または" o" のアミノ酸配列の 87位のチロシンをイソロイ シンに置換したバージョンであり、 FR3内にある制限酵素 Aor51MI切断部位を利用 して、 バージョン" h" を、 各バ一ジョン" ' 、 "j " 、 "m" 、 " 1 " または" o" とつなぎ換えることにより作製したものである。 すなわち、 発現プラスミ ド hMBClLxA/pCOSl (x= i , j， m, 1 , o) 中、 CDR3並びに FR3の一部及び FR 4を含む Aor51HI断片 514bpを除き、 ここに発現プラスミド hMBClLhA /pCOSl中、 CD R3並びに FR3の一部及び FR4を含む Aor51HI断片 514bpをつなぐことにより 91位（Kab atの規定によるアミノ酸番号 87位） のチロシンがイソロイシンとなるようにした。 塩基配列決定を行い、 各バ一ジョン" i " 、 "j " 、 "m" 、 " 1 " および" o" の 91位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 87位） のチロシンがイソロイシンに置換さ れたクローンを選択し、 対応するバージョンをそれぞれ "p" 、 "q" 、 " s " 、 " r " および" t " とし、 得られたプラスミドを JIMBCIIJU/PCOSI (x = p, q, s， r , t ) と命名した。 バージョン "Q" 、 " r " 、 " s " および" t " の塩基 配列 （対応するアミノ酸を含む） をそれぞれ配列番号 71、 72、 73、 74に示す。 ま た、 これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 52、 53、 54、 55に 示す。
プラスミド腿 BCILQA/PCOSIを Hindlllおよび EcoRIで消化し、 Hindlllおよび Ec oRIで消化したプラスミド PUC19にサブクローニングし、 プラスミド hMBClLQA/pU C19と命名した。
ヒト型化 L鎖の各パージョンにおける置換アミノ酸の位置を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000052_0001
表中、 Yはチロシン、 Ρはプロリン、 Κはリジン、 Vはバリン、 Dはァスパラ ギン酸、 Iはイソロイシンを示す。
なお、 前記プラスミ ド hMBClHcDNA/pUC19および hMBClLq;i /pUC19を有する大腸 菌は Escherichia coli JM109(hMBClHcDNA/pUC19)および Escherichia coli JM1 09(hMBClLq;i/pUC19)として、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センタ一 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に、 平成 8年 8月 1 5日に、 Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19)については FERM BP- 5629 Escherichia coli JM109 (hMBClLq;L /pUC19)については FERM BP- 5630としてブ ダぺスト条約に基づき国際寄託されている。
(5)C0S- 7細胞へのトランスフエクシヨン
ハイプリッド抗体およびヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体の抗原結合活性および中和 活性を評価するため、 前記発現プラスミドを COS- 7細胞で一過性に発現させた。 すなわち L鎖ハイプリッド抗体の一過性発現では、 プラスミド hMBClHcDNA/pC 0S1と h/mMBClL(A)/neo、 hMBClHcDNA/pCOSlと m/liMBClLaA/neo、 hMBClHcDNA/ CO S m/hMBClL( /neo、 hMBClHcDNA/pCOSlと h匪 MBC1L (λ ) /neo、 または hMBClHcDN A/pCOSlと mhiiiMBClL (A)/neoとの組み合わせを、 Gene Pulser装置（Bio Rad)を用 いてエレクトロポレーシヨンにより COS- 7細胞に同時形質導入した。 PBS (-)中に 1 X107細胞/ mlの細胞濃度で懸濁されている COS- 7細胞 0.8mlに、 各プラスミド]) NA 10 _t gを加え、 1, 500V, の静電容量にてパルスを与えた。 室温にて 10 分間の回復期間の後、 エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を 2%の Ultra L ow IgGゥシ胎児血清（GIBC0)を含有する DMEM培養液（GIBC0)に懸濁し、 10cm培養 皿を用いて C02 インキュベータ一にて培養した。 72時間の培養の後、 培養上清を 集め、 遠心分離により細胞破片を除去し、 ELISAの試料に供した。
ヒト型化 #23-57-】37- 1抗体の一過性発現では、 プラスミド hMBClHcDNA/pCOSlと hMBClLxA/pCOSl (x = a〜 t) のいずれかの組み合わせを Gene Pulser装置（Bi o Rad)を用いて、 前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法により C0S-7細胞に トランスフエクシヨンし、 得られた培養上清を EUSAに供した。
また、 C0S-7細胞の培養上清からのハイプリッド抗体またはヒト型化抗体の精 製は、 AiiiGel Protein A MAPSIIキット（BioRad)を用いて、 キット添付の処方 に従って行った。
(6) ELISA
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のための ELISAプレートを次のようにして調製した。 ELISA用 96穴 プレート（Maxisorp, NUNC)の各穴を固相化バッファ一（0.1M NaHC03、 0.02% NaN3 )で 1 g/mlの濃度に調製したャギ抗ヒト IgG抗体（TAG0) 100 1で固相化し、 20 0 1の希釈バッファー（50mM Tris - HC1、 ImM MgCl2、 0.1M NaCK 0.05% Twee n20、 0.02% NaN3、 1 %牛血清アルブミン（BSA)、 pH7.2) でブロッキングの後、 ハイプリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させた COS- 7細胞の培養上清あるい は精製ハイプリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。 1時 間室温にてィンキュペートし PBS- Tween20で洗浄後、 アル力リフォスファターゼ 結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAG0) 100 1を加えた。 1時間室温にてィンキュベ一ト し PBS- Tween20で洗浄の後、 lmg/mlの基質溶液（Sigmal04、 p—二トロフエ二ルリ ン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405MIでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad)で測定した。 濃度測定のスタンダードとして、 Hu IgG Purified (The Bi nding Site)を用いた。
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のための ELISAプレートを、 次のようにして調製した。 ELISA用 96 穴プレートの各穴を固相化バッファ一で 1 g/mlの濃度に調製したヒト PTHrP (卜 34) 100/^1で固相化した。 20021の希釈バッファーでブロッキングの後、 ハイ プリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させた COS- 7細胞の培養上清あるいは精 製ハイプリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。 室温にて ィンキュベ一トし PBS- Tween20で洗浄後、 アルカリフォスファターゼ結合ャギ抗 ヒト IgG抗体（TAG0) 100 i lを加えた。 室温にてインキュベートし PBS-Tween20で 洗浄の後、 lmg/mlの基質溶液（Sigmal04、 p—ニトロフエニルリン酸、 SIGMA)を 加え、 次に 405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad)で測定した。 (7)活性確認
(i) ヒト型化 H鎖の評価
ヒト型化 H鎖バ一ジョン" a"とキメラ L鎖を組み合わせた抗体は、 キメラ抗体 と PTHrP結合能が同等であった。 この結果は、 H鎖 V領域のヒト型化はバ一ジョ ン" a"で十分なことを示す。 以下、 ヒト型化 H鎖バージョン" a"をヒト型化抗体 の H鎖として供した。
(ii)八イブリッド抗体の活性
(ii - a) FR1, 2/FR3, 4ハイプリッド抗体
L鎖が h/mMBCIL (λ)の場合、 活性は全く認められなかったが、 m/hMBClLaAあ るいは m/liMBClLdAの場合はいずれもキメラ #23- 57-137- 1抗体と同等の結合活性 を示した。 これらの結果は、 FR3, 4はヒト型化抗体として問題ないが、 FR1, 2内に 置換すべきァミノ酸残基が存在することを示唆する。
(ii-b) FR1/FR2ハイブリッド抗体
L鎖が mkiMBClL(A)の場合、 活性は全く認められなかったが、 h匪 MBCIL(A)の 場合はキメラ #23- 57- 137- 1抗体と同等の結合活性を示した。 これらの結果は、 FR 1, 2のうち FR1はヒト型化抗体として問題ないが、 FR2内に置換すべきアミノ酸 残基が存在することを示唆する。
(iii) ヒト型化抗体の活性
L鎖としてバージョン" a" から" t " の各々一つを用いたヒト型化抗体につ いて、 抗原結合活性を測定した。 その結果、 L鎖バ一ジョン" j " 、 " 1 " 、 " m" 、 "o" 、 "q" 、 " r " 、 " s " 、 " t " を有するヒト型化抗体はキメラ抗 体と同等の PTHrP結合能を示した。
(8) CHO安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、 前記発現プラスミドを CH0細 胞 (MB 11)に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、 CH0細胞用発現プラスミド hMB ClHcDNA/pCHOlと MffiClLnU/pCOSlまたは hMBClHcDNA/pCHOlと hMBClLt /pCOSlあ るいは hMBClHcDNA/pCHOlと hMBClLrA/pCOSlの組み合わせで、 Gene Pulser装置 (Bio Rad)を用いてエレクトロボレ一シヨンにより CHO細胞に同時形質導入した。 それぞれの発現ベクターを制限酵素 Pvulで切断して直鎖 DNAにし、 フエノールお よびクロ口ホルム抽出後、 エタノール沈殿で DNAを回収し、 エレクトロボレ一シ ヨンに用いた。 PBS (-)中に lxlO7 細胞 Zinlの細胞濃度で懸濁されている CHO細胞 0. 8mlに、 各プラスミド DNA を加え、 1, 500V, 25 Fの静電容量にてパルスを 与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、 エレクトロボレ一シヨン処理された細 胞を 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)添加、 MEM- 培地（GIBC0)に懸濁し、 96穴プレート (Falcon)を用いて C02 インキュベータ一にて培養した。 培養開始翌日に、 10%ゥ シ胎児血清（GIBC0)および 500mg/mlの GENETICIN (G418 Sulfate, GIBC0) 添加、 リポヌクレオシドおよびデォキシリポヌクレオシド不含 MEM- α培地（GIBC0)の選 択培地に交換し、 抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。 選択培地交換後、 2 週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、 順調な細胞増殖が認められた後に、 上記抗 体濃度測定 ELISAにて抗体産生量を測定し、 抗体産生能の高い細胞を選別した。 樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、 ローラーポトルにて 2 %の U1 tra Low IgGゥシ胎児血清添加、 リポヌクレオシドおよびデォキシリポヌクレオ シド不含 MEM- α培地を用いて、 大量培養を行った。 培養 3ないし 4日目に培養上 清を回収し、 0.2^111のフィルター （Millipore) により細胞破片を除去した。
CH0細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、 P0R0Sプロテイン Aカラム （P erSeptive Biosystems) を用いて、 ConSep LC100 (Millipore) にて添付の処方 に従つて行い、 中和活性の測定および高カルシゥム血症モデル動物での薬効試験 に供した。 得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、 上記 ELISA 系にて測定した。
〔参考例 5〕 中和活性の測定
マウス抗体、 キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、 ラット骨肉 腫細胞株 R0S17/2.8- 5細胞を用いて行った。 すなわち、 R0S17/2.8- 5細胞を、 10% 牛胎児血清（GIBC0)を含む Ham'S F-12培地（GIBC0) 中にて、 C02 インキュベータ 一で培養した。 R0S17/2.8- 5細胞を 96穴プレートに 104 細胞 Z100 μ 1/穴で蒔込 み 1日間培養し、 4mMの Hydrocortisoneと 10%牛胎児血清を含む Ham' S F- 12培地 (GIBC0)に交換する。 さらに 3ないし 4日間培養した後、 260 1の Ham'S F- 12培 地（GIBC0)にて洗浄し、 lmMのイソブチル -卜メチルキサンチン（IBMX、 SIGMA)お ょび10%の牛胎児血清と10111の1^?£3を含む80 1の¾111' s F- 12を加え、 30分間 37°Cでィンキュベートした。
中和活性を測定するマウス抗体、 キメラ抗体またはヒト型化抗体を、 あらかじ め 10/xg/ml、 3.3 g/mK 1.1 g/mlおよび 0.37 g/mlの群、 10 g/ml、 2 x /mK 0.5 g/inlおよび 0.0l g/mlの群、 または 10 g/ml、 5 g/mK 1.25^g/mK 0.63 g/mlおよび 0.31 zg/mIの群に段階希釈し、 4ng/mlに調製した PTHrP(l- 34)と等 量混合し、 各抗体と PTHrP(l_34)の混合液 80 lを各穴に添加した。 各抗体の最終 濃度は上記抗体濃度の 4分の 1になり、 PTHrP(l- 34)の濃度は lng/mlになる。 10 分間室温にて処理した後、 培養上清を捨て、 PBSにて 3回洗浄したした後、 100 1の 0.3%塩酸 95%エタノールにて細胞内の cAMPを抽出する。 水流ァスピレーター にて塩酸エタノールを蒸発させ、 cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAL' S)付属の EIA バッファー 120/ilを添加し cAMPを抽出後、 cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAL'S)添 付の処方に従って cAMPを測定した。 その結果、 キメラ抗体と同等の抗原結合を有 する L鎖バージョンのうち、 91位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョ ン "d"、 "r"、 "s "、 "t "を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示 し、 その中でも、 パ一ジョン" Q"がもっとも強い中和能を示した。 配列表フリーテキスト
西曰 Pし列ノリ^ g 丄 ·， 合 TINA 口 Lfl
i丄n1/ 西曰 P Gッ iリl "^ · 口 Ui n
曰 Ciグリ^ ^ *- · 口 P iif in 曰しツリ^^ゥ * ·
合成籠
丄 西 S pu列ノリ番号つ a A成 DN
配列 合成 DNA
酉己歹 11番号 11 合成 DNA
配列番号 12 合成 DNA
SDyU 7? lo 口 i A
20 配列番号 14 合成 DNA
配列番号 15 .合成 DNA
配列番号 16 ：合成 DNA
配列番号 17 ：合成 DNA
配列番号 18 ：合成 DNA
25 配列番.号 19 ：合成 DNA
配列番号 20 ：合成 DNA
配列番号 21 ：合成 DNA
配列番号 22 ：合成 DNA 配列番号 23：合成 DNA
配列番号 24 ·合成 DNA
配列番号 25 ·合成 DNA
配列番号 26 合成 DNA
配列番号 27 合成飄
配列番号 28 合成 DNA
配列番号 29 合成]) NA
配列番号 30 合成 DNA
配列番号 31 合成 DNA
配列番号 32 合成 DNA
配列番号 33 合成飄
配列番号 34 合成 DNA
配列番号 35 合成 DNA
配列番号 36 合成 DNA
配列番号 37 合成 DNA
配列番号 38 .合成 DNA
配列番号 39 .合成 DNA
配列番号 40 ：合成 DNA
タリ资 丄
配列番号 42 ：合成 DNA
配列番号 43 ：合成 DNA
配列番号 44 ：合成 DNA 本明細書で引用した刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書 に取り入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害す る物質を有効成分として含有する関節疾患治療剤が提供される。 また、 本発明に より、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有 効成分として含む関節疾患に起因する症状の改善剤が提供される。
上記物質の投与により、 関節疾患治療剤モデルにおける骨量低下の改善が認め られたことから、 上記物質は骨量減少抑制剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
I . 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有 効成分として含む、 関節疾患に起因する症状の改善剤。
2 . 関節疾患が慢性関節リゥマチ及び Z又は変形性関節症である請求の範囲 1 記載の改善剤。
3 . 関節疾患に起因する症状が、 関節近傍の骨量減少である請求の範囲 1又は 2記載の改善剤。
4 . 物質が副甲状腺ホルモン関連ペプチド受容体に対するアン夕ゴニストであ る請求の範囲 1〜 3いずれか一項に記載の改善剤。
5 . 物質が抗副甲状腺ホルモン関連べプチド抗体である請求の範囲 1〜 3いず れか一項に記載の改善剤。
6 . 物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体断片及び Z又はその修飾物で ある請求の範囲 1〜3いずれか一項に記載の改善剤。
7 . 抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲 5又は 6記載の改善剤。
8 . 抗体がヒト型化又はキメラ化されたものである請求の範囲 7記載の改善剤 c
9 . ヒト型化抗体がヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体である請求の範囲 8記載の改善 剤。
1 0 . 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を 有効成分として含む、 関節疾患治療剤。
I I . 関節疾患が慢性関節リウマチ及び 又は変形性関節症である請求の範囲 1 0に記載の治療剤。
PCT/JP2001/007044 2000-08-16 2001-08-15 Agents destines a soulager les symptomes provoques par des maladies articulaires WO2002013865A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01956906A EP1312378A4 (en) 2000-08-16 2001-08-15 AGENTS FOR THE RELIEF OF SYMPTOMS CAUSED BY JOINT DISEASES
US10/344,733 US20040067231A1 (en) 2000-08-16 2001-08-15 Agents for ameliorating symtoms caused by joint diseases
AU2001278742A AU2001278742A1 (en) 2000-08-16 2001-08-15 Agents for ameliorating symptoms caused by joint diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000247013 2000-08-16
JP2000-247013 2000-08-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002013865A1 true WO2002013865A1 (fr) 2002-02-21

Family

ID=18737191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/007044 WO2002013865A1 (fr) 2000-08-16 2001-08-15 Agents destines a soulager les symptomes provoques par des maladies articulaires

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20040067231A1 (ja)
EP (2) EP1312378A4 (ja)
AU (1) AU2001278742A1 (ja)
TW (1) TWI274586B (ja)
WO (1) WO2002013865A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7318925B2 (en) * 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
CA2535156A1 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Abgenix, Inc. Antibodies directed to parathyroid hormone (pth) and uses thereof
US11103537B2 (en) 2016-06-23 2021-08-31 Tithon Biotech Inc. Cells expressing parathyroid hormone 1 receptor and uses thereof
CA3028422A1 (en) * 2016-06-23 2017-12-28 Tithon Biotech, Inc. Cells expressing parathyroid hormone 1 receptor and uses thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04228089A (ja) * 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高カルシウム血症治療・予防剤
JPH07316195A (ja) * 1994-05-25 1995-12-05 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途
WO1996003437A1 (en) * 1994-07-28 1996-02-08 Sandoz Ltd. PTH OR PTHrP ANTAGONISTS
WO1997035607A1 (en) * 1996-03-26 1997-10-02 Genetics Institute, Inc. Methods of tissue induction using a combination of bone morphogenetic protein and parathyroid hormone-related peptide
EP0962467A1 (en) * 1996-09-26 1999-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against human parathormone related peptides
WO2000000219A1 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedes contre des crises d'hypercalcemie
JP2000080100A (ja) * 1998-06-17 2000-03-21 Japan Tobacco Inc 副甲状腺ホルモン関連タンパクに対するヒトモノクローナル抗体
EP1004313A1 (en) * 1997-05-15 2000-05-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cachexia remedy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0759763B2 (ja) 1986-03-24 1995-06-28 株式会社バイオマテリアル・ユニバース 高強度、高弾性率ポリビニルアルコ−ル繊維およびその製造法
US5001223A (en) * 1987-05-26 1991-03-19 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties
US4771124A (en) * 1987-05-26 1988-09-13 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology
US5217896A (en) * 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5849695A (en) * 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
US5626845A (en) * 1995-01-23 1997-05-06 Xenotech Incorporated Method to ameliorate osteolysis and metastasis
US5993817A (en) * 1995-01-23 1999-11-30 Xenotech Method to ameliorate osteolysis and metastasis
WO1996025944A1 (fr) * 1995-02-20 1996-08-29 Yukio Kato Remedes contre la polyarthrite rhumatoide et les affections articulaires inflammatoires
US5660826A (en) * 1995-06-06 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP
TWI255718B (en) * 1999-07-02 2006-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ameliorative agent for low vasopressin concentration

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04228089A (ja) * 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高カルシウム血症治療・予防剤
JPH07316195A (ja) * 1994-05-25 1995-12-05 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途
WO1996003437A1 (en) * 1994-07-28 1996-02-08 Sandoz Ltd. PTH OR PTHrP ANTAGONISTS
WO1997035607A1 (en) * 1996-03-26 1997-10-02 Genetics Institute, Inc. Methods of tissue induction using a combination of bone morphogenetic protein and parathyroid hormone-related peptide
EP0962467A1 (en) * 1996-09-26 1999-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against human parathormone related peptides
EP1004313A1 (en) * 1997-05-15 2000-05-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cachexia remedy
JP2000080100A (ja) * 1998-06-17 2000-03-21 Japan Tobacco Inc 副甲状腺ホルモン関連タンパクに対するヒトモノクローナル抗体
WO2000000219A1 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedes contre des crises d'hypercalcemie

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE, (BETHESDA, MD, USA); 7 September 2001 (2001-09-07), accession no. STN international *
KOHNO H. ET AL.: "Synovial fluids from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis contain high levels of parathyroid hormone-related peptide", J. BONE MINER. RES., vol. 12, no. 5, 1997, pages 847 - 854, XP002946237 *
See also references of EP1312378A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20040067231A1 (en) 2004-04-08
AU2001278742A1 (en) 2002-02-25
EP1312378A1 (en) 2003-05-21
EP1849479A1 (en) 2007-10-31
EP1312378A4 (en) 2004-03-17
TWI274586B (en) 2007-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4516711B2 (ja) 安定な抗体組成物及び注射製剤
US7468184B2 (en) Therapeutic agent for cachexia
KR100847441B1 (ko) 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체
AU753131B2 (en) Remedies for hypercalcemic crisis
JP4372240B2 (ja) 悪液質治療剤
JP3416035B2 (ja) ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体
WO2002013865A1 (fr) Agents destines a soulager les symptomes provoques par des maladies articulaires
WO2001002011A1 (fr) REMEDES CONTRE LES MALADIES CAUSEES PAR PTH OU PTHrP
WO2001082968A1 (fr) Inhibiteurs de proliferation cellulaire
US7655227B1 (en) Agents for ameliorating low vasopressin level
WO2001054725A1 (fr) Remèdes et agents prophylactiques pour maladies dentaires
WO2001064249A1 (en) Tissue decomposition inhibitor
WO2002092133A1 (fr) Inhibiteurs d'angiogenese
AU2003203622B2 (en) Cachexia remedy
WO2001002012A1 (fr) Remedes contre l'hypercalcemie chimio-resistante
US7794711B2 (en) Agent for treating chondroma and chondrosarcoma
KR100571060B1 (ko) 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체
JP2006306895A (ja) 悪液質治療剤
AU2004222761A1 (en) Remedies for drug-resistant hypercalcemia
AU2005203262A1 (en) Remedies for diseases caused by PTH or PTHrP

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10344733

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001956906

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001956906

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 2001956906

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001956906

Country of ref document: EP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载