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WO2002012538A2 - Acides nucleiques et proteines d'e. coli pathogenes, et leurs utilisations - Google Patents

Acides nucleiques et proteines d'e. coli pathogenes, et leurs utilisations Download PDF

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WO2002012538A2
WO2002012538A2 PCT/FR2001/002536 FR0102536W WO0212538A2 WO 2002012538 A2 WO2002012538 A2 WO 2002012538A2 FR 0102536 W FR0102536 W FR 0102536W WO 0212538 A2 WO0212538 A2 WO 0212538A2
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WO
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coli
sεq
nucleic acid
pathogenic
sequence
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PCT/FR2001/002536
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Inventor
Sylvie Perelle
Patrick Fach
Françoise Dilasser
Joël GROUT
Original Assignee
Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments (Afssa)
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to new markers of pathogenicity to 'Escherichia coli, which can be used in particular for the detection of pathogenic Escherichia coli of serotype 0157 producing shiga-toxins.
  • Escherichia coli is a ubiquitous bacterium, frequently isolated in medical or food microbiology laboratories, and present in the normal state in the intestinal flora of man. Some strains are pathogenic, however, and associated with many intestinal and non-intestinal infections. Identification of the different strains of E. coli is conventionally based on the serological typing of their antigens O (somatic antigen) and H (flagellar antigen) by immunological methods.
  • E. serotypes most common coli pathogens have been classified into 5 main groups, according to their mechanism of infection of the digestive tract: - ⁇ P ⁇ C, for: "enteropathogenic E. coli", which groups the classic enteropathogenic genes,
  • ⁇ T ⁇ C for: "enterotoxigenic E. coli", which includes E. coli producing a stable or heat-sensitive toxin,
  • ⁇ I ⁇ C for: "enteroinvasive E. coli", which groups together E. coli which mimic the capacity of Shigella to invade and multiply in the cells of the intestinal epithelium, and
  • VT ⁇ C for: "verotoxin producing E. coli", or ST ⁇ C "shiga-toxin producing E. coli”, which groups together E. coli producing cytotoxins, called “Shiga- like toxins”, because of their analogy with the toxin secreted by Shigella dysenteriae type 1 or also verotoxins (VT), due to their toxic activity on Vero cells.
  • ST ⁇ C colibacilli producing shiga-toxins
  • HUS hemolytic uremic syndrome
  • PTT thrombotic thrombocytopenic purpura
  • Hemolytic uremic syndrome occurs mainly in young children; it represents approximately 9% of STEC infections diagnosed in the United States. It is also the main cause of acute renal failure in children, and the fatality observed is around 3 to 5/1000. In France, recent studies have shown that the average annual incidence of HUS is 0.7 / 10,000 in children under the age of 15 and 1.8 / 10,000 in children under the age of 5 (DECLUDT et al , 2000, Epidemiol. Infect. 124: 215-220).
  • STEC are also involved in animals, in more or less serious digestive infections. Symptoms observed include diarrhea and dysentery in calves or edema in pigs. In addition, healthy carriers of cattle could play a role in the transmission of STEC to humans, via water or contaminated foodstuffs of animal origin (meat, raw milk and milk-based products of raw milk), (BONNET et al., 1998, J.
  • VT2 vha, VT2 vhb, SLTII-v (VT ⁇ ) and SLT Il-va (NT ⁇ -va) were identified as the main pathogenicity factors involved in these infections (CALD ⁇ RWOOD et al., 1987, Proc. ⁇ at. Acad. Sci. 84: 4364-4368).
  • shiga-toxins are not responsible on their own for the pathogenicity of ST ⁇ C; other bacterial virulence factors could also play a role in the pathogenic power of these colibacilli:
  • enterocytic erasure locus L ⁇ which codes for proteins involved in the adhesion of bacteria and the alteration of the cytoskeleton of intestinal cells, in particular the intimin coded by the eae gene (B ⁇ BAKH ⁇ et al., 1992, F ⁇ MS Microbiol Lett. 70: 63-68; Me DANIEL et al., 1995, Proc. Nat. Acad., Sci. 92: 1664-1668; Me DANIEL et al., 1997, Mol. Microbiol. 23: 399-407) ,
  • fEHEC factor for adhesion has been described as a factor which contributes to the adhesion capacity of the bacterium (NICHOLLS et al., 2000, Mol. Microbiol., 35: 275-288), and
  • This control involves the sensitive and specific detection of STEC responsible for these pathologies and in particular STEC serotype 0157.
  • the virulence plasmid of 90 kb is present in ST ⁇ C pathogens of other serotypes (BONNET et al., cited above), and the LEE locus is present both in pathogenic STECs of different serotypes (PRADEL et al., cited above) and in EPECs, notably in O127: H6 (PERNA et al., 1998, Infect. Immun., 66: 3810-3817; PRADEL et al, cited above).
  • Cytotoxicity tests on cell cultures constitute the reference method used in food hygiene to detect the presence of bacteria producing shiga-toxins or verotoxins.
  • the principle of these tests is based on the cytopathogenicity of verotoxins on African green monkey kidney cells. Subsequently, confirmation of the antigenic types of verotoxin is required using anti-VT1 and anti-VT2 antibodies.
  • This technique has the advantage of being very sensitive, however it is not specific to the colibacilli producing shiga-toxins of serotype 0157.
  • a series of transfers in selective media is necessary in order to promote the development of verotoxic bacteria. prior to the determination of toxins on a cell culture; it takes 5 to 6 days before obtaining the first results, and costs are high. This test is therefore not a routine method usable in the food industry.
  • E. coli O157: H7 and O157: H " which do not ferment sorbitol in 24 hours, and which in addition do not produce ⁇ -glucuronidase.
  • E. coli O157 : H7 and O157: H " appear as white colonies on sorbitol agars, while the colibacilli producing shiga-toxins of other serotypes (026, OU I and 0103) and the numerous non-pathogenic colibacilli, which are capable of fermenting sorbitol, appear as pigmented colonies. These methods are however insufficient because there are atypical mutants of E.
  • the ⁇ LISA type immunological methods are based on the detection of O and H antigens or shiga toxins (VT1 and VT2) using specific antibodies.
  • the immunological tests currently available are not satisfactory; in fact, other bacteria such as Citrobacter freundii, Salmonella O from group N and Hafnia senior have cross-reactivity with respect to the anti-0157 sera used (B ⁇ TT ⁇ LH ⁇ IM et al, 1993, J. Clin. Microbiol, 31: 760 -761; BORCZYK et al, 1987, Int. J. Food Microbiol, 4: 347-349; CHART et al, 1992, Epidemiol. Infect, 108: 77-85; SHIMADA et al, 1992, Curr. Microbiol, 25: 215-217).
  • STEC 0157 cannot be identified using a single PCR reaction targeting one of these genes. Indeed, the somatic antigens 0157 and flagellar H7, which can be carried by strains of E. non-pathogenic coli alone are not markers of pathogenicity.
  • verotoxin genes are by definition carried by all STEC strains; the virulence factors described on the 90 kb plasmid (enterohemolysin, catalase peroxidase, serine protease) are present in STECs of different serotypes (BONNET et al, cited above) and a homolog of the LEE locus is present in both STECs of different serotypes (PRADEL et al, cited above) and in EPECs (PERNA et al, cited above). Consequently, the demonstration of only one of these virulence genes is not sufficient to identify a STEC of serotype 0157.
  • the inventors have identified strains of E. pathogenic coli, in particular in all pathogenic colibacilli of serotype 0157 producing shiga- toxins, the presence of a nucleic acid insert representing a new locus, absent from the non-pathogenic strains.
  • This locus is inserted between positions 93848 and 93849 of the genome sequence of E. coli Kl 2 (GenBank U82664); this insertion site is precisely located between the stop codons of two open reading phases (Genbank AAB40241 and Genbank AAB40242) in opposite orientation, which in the genomic sequence of E. strains non-pathogenic coli such as strain K12 are directly adjacent.
  • the inventors also noted the presence of a similar locus, inserted at the same position, in pathogenic E. coli strains, belonging to serotypes other than 0157. On the other hand, they observed no insertion at this position in all of the non-pathogenic strains that have been tested. The presence of an insert at this position therefore constitutes a new genetic marker of virulence useful for the detection of strains of E. pathogenic coli.
  • nucleic acid sequences originating from such an insert also constitute markers useful for the detection of strains of E. pathogenic coli, and in particular for the specific detection of strains of pathogenic bacteria carrying said insert; for example, nucleic acid sequences originating from the insert present in a strain of serotype 0157 producing shiga-toxins allow a specific detection of all the E. coli of serotype 0157 producing shiga-toxins.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule derived from a pathogenic strain of E. coli, characterized in that it is selected from the group consisting of: a) a nucleic acid molecule representing a locus inserted into the genome of said pathogenic strain, at the location of said genome corresponding to that located in E. coli Kl 2, between positions 93848 and 93849 of the GenBank sequence U82664; b) a nucleic acid molecule comprising the molecule a) defined above, and between 1 and 2500 bp of the sequence upstream of the insertion site of said molecule, and / or between 1 and 2500 bp downstream of the site insertion of said molecule. c) a nucleic acid molecule constituting a fragment of at least 15 bp, preferably at least 25 to 30 bp, of the molecule a) above; d) a nucleic acid molecule constituting a fragment of at least
  • said fragment comprising at least a portion of the molecule a) and at least a portion of the sequence upstream from the insertion site of said molecule a), or at least a portion of the sequence downstream of the insertion site of said molecule a).
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention can in particular be derived from the genome of a pathogenic bacterium of the species Escherichia coli, chosen from E. coli ST ⁇ C of serotype 0157, 077, 079, or 0145, the Escherichia coli ST ⁇ C or ⁇ P ⁇ C of serotype 055, and Escherichia coli ⁇ P ⁇ C of serotype 0127.
  • a pathogenic bacterium of the species Escherichia coli chosen from E. coli ST ⁇ C of serotype 0157, 077, 079, or 0145, the Escherichia coli ST ⁇ C or ⁇ P ⁇ C of serotype 055, and Escherichia coli ⁇ P ⁇ C of serotype 0127.
  • nucleic acid molecules according to the invention derived from the genome of E.
  • coli O157: H7 are represented in the sequence list in the annex under respectively the numbers S ⁇ Q ID NO: 1, S ⁇ Q ID NO: 2, S ⁇ Q ID NO: 11 to 17, S ⁇ Q ID NO: 19, S ⁇ Q ID NO: 21 and S ⁇ Q ID NO: 23.
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules capable of specifically hybridizing, under stringent conditions, with any of the molecules a) to d) above.
  • the oligonucleotides P388M, P388G, P388D, P388F and P388C are in particular usable as molecular hybridization probes, useful for the detection, of a nucleic acid molecule a) in accordance with the invention derived from the genome of a bacterium E coli ST ⁇ C of serotype 0157.
  • the present invention encompasses in particular the pairs of primers which can be used for the amplification of a nucleic acid molecule a) b) c) or d) according to the invention.
  • the present invention further relates to the recombinant vectors, and in particular the recombinant plasmids containing a nucleic acid molecule according to the invention.
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention can for example be obtained by polymerase chain reaction, from the DNA of a pathogenic E. coli strain comprising the locus defined above. Especially :
  • a nucleic acid molecule a) in accordance with the invention can be obtained by using a pair of amplification primers, one of which hybridizes comprising a primer which hybridizes at each of the ends of the molecule a),
  • a nucleic acid molecule b) according to the invention can be obtained by using a pair of amplification primers comprising a primer hybridizing upstream of the insertion site of molecule a) and a primer hybridizing downstream of the insertion site of molecule a); suitable primers can be chosen by a person skilled in the art, respectively from the 2500 bp sequence upstream from position 93848 of the GenBank U82664 sequence, and from the 2500 bp sequence downstream from position 93849.
  • Amplification conditions will of course be used to amplify large fragments, and in particular comprising a step of extending primers of sufficient duration.
  • the pair of primers P388L / P388P can be used, which hybridizes on either side of the site of insertion of a molecule a) according to the invention.
  • This pair amplifies a fragment of 682 bp when the amplification is carried out from the genome of the non-pathogenic E. coli type strain Kl 2, whereas it amplifies a larger size with pathogenic E. coli; it amplifies in particular a fragment of 3316 bp (S ⁇ Q ID NO: 11) with all the E. coli producing shiga-toxins of serotype 0157.
  • a nucleic acid molecule c) according to the invention can be obtained by using a pair of primers which hybridize with internal sequences of the molecule a)
  • a nucleic acid molecule d) according to the invention can be obtained using a pair of primers comprising a primer hybridizing with an internal sequence of the molecule a) and a primer hybridizing with a sequence located upstream of the insertion site of molecule a) or a primer hybridizing with a sequence located downstream of the insertion site of molecule a).
  • P388P / P388L (S ⁇ Q ID NO: 9 / S ⁇ Q ID NO: 3), P388L / P388M (S ⁇ Q ID NO: 3 / S ⁇ Q ID
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid molecule in accordance with the invention for screening for E. pathogenic coli, and in particular for the specific screening for E. strains. coli serotype 0157 producing shiga toxins.
  • the present invention relates to a method for screening for E. pathogenic coli, characterized in that it comprises the detection of the presence in the genome of the E. coli bacteria present in the test sample, of a locus inserted at the location of said genome corresponding to that located in E. coli K12, between positions 93848 and 93849 of the GenBank sequence U82664.
  • the detection method comprises at least one step of chain amplification by polymerase using a pair of primers comprising a primer hybridizing with the genome region of E. coli defined by the 2500 bp sequence upstream of position 93848 of the GenBank sequence U82664, and a primer hybridizing with the genome region of E. coli defined by the 2500 bp sequence downstream of position 93849 of the GenBank sequence U82664.
  • the determination of the size of the amplification product, and its comparison with that obtained using the same pair of primers, from the genome of a non-pathogenic strain, for example the strain type E. coli K12 makes it possible to detect insertion of a locus according to the invention.
  • the size of the amplification product for the same pair of primers can also make it possible to distinguish different groups of E. pathogenic coli.
  • the amplification is carried out under conditions which do not make it possible to amplify large fragments.
  • the absence of amplification product makes it possible, in this case, to detect the insertion of a locus in accordance with the invention.
  • this mode of implementation does not make it possible to distinguish different groups of E. pathogenic coli.
  • the detection method comprises at least one step of chain amplification by polymerase using a pair of primers which hybridize with internal sequences of a molecule a) as defined above.
  • the detection method comprises at least one step of chain amplification by polymerase using a pair of primers comprising a hybridizing primer with an internal sequence of a molecule a) as defined above, and a primer hybridizing with the region of the genome of E. coli defined by the 2500 bp sequence upstream of position 93848 of the GenBank sequence U82664, or a primer hybridizing with the region of the genome of E. coli defined by the 2500 bp sequence downstream of position 93849 of the GenBank sequence U82664.
  • the inventors studied the sensitivity and the specificity of the pairs of primers P388C / P388D, P388F / P388D and P388F / P388G for the detection of ST ⁇ C-0157.
  • the three pairs of primers have equivalent sensitivity and detect the 55 ST ⁇ C-O157 tested as well as the E. coli of serotype 055, which is explained by the clonal origin of these two serotypes (F ⁇ NG et al, 1998, J. Infect. Dis, 177: 1750-1753; WHITTAM et al, 1993, Infect. Immun, 61: 1619-1629).
  • no signal is obtained with the bacteria Citrobacter and Hafnia alvei which exhibit cross-immunological reactions with the 0157 antigen.
  • the pair P388F / P388D is preferably used for the specific detection of all E. coli producing shigotoxins of serotype 0157.
  • this pair of primers has a particularly high specificity and does not give any positive reaction with STECs from other serotypes (30 serotypes tested) as well as with non-STEC E. coli of serotype 0157 or other serotypes ( 55 tested) and bacteria from other species.
  • the oligonucleotides in accordance with the invention can also be used as primers in a PCR-ELISA type technique.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule obtained by polymerase chain reaction of a non-pathogenic E. coli with using the pair of primers P388P / P388L.
  • This molecule can be used as a control, in the context of a detection method according to the invention.
  • said molecule is obtained from E. coli Kl 2 and is constituted by a fragment of 682 bp (S ⁇ Q ID NO: 10).
  • the present invention also relates to any protein encoded by an open reading frame present on a nucleic acid molecule according to the invention, and in particular on a molecule derived from a strain of E. coli serotype 0157 producing shiga toxins.
  • FIG. 1 illustrates the genetic organization of the E. locus. coli O157: H7, called SIL 0157 , inserted into the genome of E. coli between positions 93849 and 93848, (with reference to the genome type of non-pathogenic E. coli Kl 2, Genbank U82664).
  • the regions indicated in white represent the homologous regions between the sequence of E.
  • non-pathogenic coli Kl 2 (Genbank U82664) and the sequence of ST ⁇ C O157. ⁇ 7.
  • the regions indicated in black represent the SIL 0157 locus.
  • the large black arrows including accession numbers represent the open reading phases described in non-pathogenic E. coli.
  • the large white arrows represent the potential open reading phases included in locus SIL 0157 .
  • the small arrows indicate the positions of the different primers used for the PCR amplifications.
  • the inventors analyzed this locus SIL 015 7, and thus highlighted highlighted open reading frames and, in particular 4 open reading frames encoding proteins hereinafter named IHP1, IHP2, IHP3 and IHP4, of respectively 338 , 140, 120 and 159 amino acids.
  • the amino acid sequences of the proteins IHP1, IHP2, IHP3 and IHP4 are presented in the list in the appendix, respectively under the numbers S ⁇ Q ID NO: 18, 20, 22 and 24, the corresponding nucleotide sequences are presented in the list in the appendix, respectively under the numbers S ⁇ Q ID NO: 17, 19, 21 and 23.
  • the proteins according to the invention represent new antigens potentially usable for the detection of pathogenic E. coli.
  • the protein IHP1 which has homologies with proteins of the outer membrane and adhesins of other bacteria (Salmonella flagellin and adhesin from Neisseria, Yersinia, Haemophilus and Staphylococcus) constitutes a surface antigen which can potentially be used for the detection of E. coli producing shiga-toxins of serotype 0157.
  • the present invention also relates to any peptide representing a fragment of at least 5 amino acids, and preferably at least 7 to 15 amino acids of a protein according to the invention.
  • the present invention further relates to: - expression cassettes comprising the nucleotide sequences coding for the proteins or peptides in accordance with the invention, placed under the transcriptional control of an appropriate promoter, in particular a promoter allowing the expression of said proteins or said peptides in transformed host cells.
  • the expression cassettes contain the sequences coding for one of the proteins IHP1 to IHP4, as defined above (SEQ ID NO: 17, 19, 21 and 23).
  • vectors comprising an insert consisting of the nucleotide sequences coding for the proteins or peptides in accordance with the invention.
  • these vectors are expression vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • Many vectors into which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the intended use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • the subject of the invention is furthermore prokaryotic or eukaryotic cells transformed with a plasmid or a recombinant vector in accordance with the invention.
  • the recombinant vectors and the transformed cells according to the invention are useful in particular for the production of proteins and peptides according to the invention.
  • the present invention also relates to antibodies, polyclonal or monoclonal, directed against a protein or a peptide in accordance with the invention.
  • antibodies can be obtained by conventional methods, known in themselves, comprising in particular the immunization of an animal with a protein or a peptide in accordance with the invention, in order to make it produce antibodies directed against said protein or said peptide. Where appropriate, these antibodies may undergo additional steps of purification and / or elimination of any cross-reactions with other antigens, in particular by immuno-adsorption techniques.
  • the techniques for the production and purification of recombinant proteins, the methods of immunization and the production of antibodies and the immunological techniques based on the detection of antigen-antibody complexes (ELISA, RIA, Western-Blot) are known in themselves. ; by way of example, there may be mentioned those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, W ⁇ ley and son Inc, Library of Congress, USA) and in Current protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, W ⁇ ley and son Inc, Library of Congress, USA) .
  • the present invention also relates to the use of at least one protein, a peptide, or an antibody in accordance with the invention for obtaining a medicament, intended for the prevention or treatment of an infection induced by a pathogenic E. coli bacterium, in particular an E. coli bacterium of serotype 0157 producing shigatoxins.
  • the subject of the present invention is also the use of at least one protein, a peptide, or an antibody in accordance with the invention for the immunological detection of pathogenic E. coli, in particular for the screening of producing E. coli of serotype 0157. of shiga toxins.
  • nucleic acid molecules, proteins and peptides, as well as the antibodies in accordance with the invention can also constitute reagents which can be used for the detection of strains of E. pathogenic coli, including all strains of E. coli producing shiga toxins of serotype 0157.
  • the reagents according to the invention can be used for the search for E. strains. pathogenic coli, including all strains of E. coli of serotype 0157 producing shiga toxins in food products, in particular water, fresh food products such as meats, raw milk and derived products (cheeses, dairy products).
  • E. coli infections in particular E. coli infections producing shigotoxins of serotype 0157 in humans and animals, from a biological sample, for example in faeces.
  • the invention further relates to an E. coli detection kit.
  • pathogenic coli including all strains of E. coli producing shiga toxins of serotype 0157, characterized in that it includes at least one reagent according to the invention.
  • EXAMPLE 1 IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A LOCUS INSERTED IN THE CHROMOSOME OF E. COLI 0157: H7 BY ANALYSIS OF DNA POLYMORPHISM BY RAPD (RANDOMLY AMPLIFIED POL YMORPHIC DNA). 1. Identification of a specific DNA fragment from E. coli O157: H7 by RAPD
  • E. coli 10 strains of ST ⁇ C [3 strains O157: H7 and 1 strain (0157: H “ , O26: Hl l, 091: H21, O103: H2, Ol ll: H + , O113: H4 and O128: H2) J and 2 strains of E. coli serotype 0157, not producing shiga-toxins (O157-non ST ⁇ C).
  • TSB medium Teryptone Soy Broth
  • the total bacterial DNA is extracted using the INSTAGENE matrix (BIO-RAD), following the manufacturer's instructions.
  • coli strains are analyzed by RAPD, using the READY TO GO kit (PHARMACIA BIOT ⁇ CH). PCR is carried out in a final volume of 25 ⁇ l, in the presence of 10 ng of purified total bacterial DNA and of 25 pmol of the oligonucleotide primer PI (PHARMACIA-BIOT ⁇ CH).
  • PCR amplification (GENE-AMP PCR SYSTEM 9600, P ⁇ RKJN ⁇ LM ⁇ R) is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 95 ° C for 5 min is followed by 45 cycles alternating a denaturation step at 95 ° C for 1 min, a step priming hybridization at 36 ° C for 1 min and an extension step at 72 ° C for 2 min.
  • the amplification product is separated by electrophoresis in a 2% agarose gel containing ethidium bromide, in TB ⁇ buffer (Tris-Borate- ⁇ DTA). The amplified DNA fragments are visualized under an ultraviolet lamp.
  • the profile of the RAPD analysis shows that a 387 bp fragment is amplified randomly, only in the colibacilli producing shiga-toxins of serotype 0157 (3 strains of serotype O157. ⁇ 7 and 1 strain of serotype O157. ⁇ " ).
  • the 387 bp fragment is isolated from the agarose gel, purified using the QIAEXII extraction kit (QIAG ⁇ N) and cloned into the pMOS Blue vector (AM ⁇ RSHAM PHARMACIA BIOT ⁇ CH), using the cloning kit blunt ends of AMERSHAM LIFE SCIENCE, to give the plasmid pSP7.
  • a probe corresponding to the 387 bp insert (P7 probe) is synthesized by PCR and labeled with digoxigenin using the PCR reagent DIGOXIGENIN LABELING MIX (ROCHE MOLECULAR). This probe is hybridized, by Dot-blot, with the DNA of the 12 strains of E. coli analyzed by RAPD.
  • the hybridization is carried out on nylon membranes (ROCHE MOLECULAR), overnight at 65 ° C., in a conventional hybridization buffer (ROCHE MOLECULAR) containing 20 ng / ml of denatured probe labeled with digoxigenin, following the protocols classics described in MANIATIS et al. (Molecular Cloning: a laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboartory, Cold Spring Harbor, New York). Then, the hybridization of the digoxigenin-labeled probe is detected by luminescence (DIG LUMINESCENT DETECTION KIT, ROCHE MOLECULAR) on BIOMAX films (KODAK). The results of the hybridization show that the labeled P7 probe recognizes only STECs of serotype 0157. This result suggests that the 387 bp fragment obtained by RAPD could come from a specific locus of the colibacillus strains producing shiga-toxins from serotype 0157.
  • the chromosomal DNA of the strain ⁇ DL 933 (ATCC 43895) from E. coli O157: H7, purified using the QIAGEN GENOMIC TIP SYSTEM kit (QIAG ⁇ N) is fully digested with Hind III (ROCHE MOLECULAR), following the manufacturer's instructions. Then 300 ng of this digested DNA is ligated with 10 ng of the plasmid pUC 18, digested with Hind III and dephosphorylated (PHARMACIA-BIOTECH), in the presence of 5 IU of the T4 DNA ligase (ROCHE MOLECULAR), in a volume 20 ⁇ l reaction at 16 ° C overnight. Competent E.
  • coli MOS Blue bacteria are transformed by the ligation product and spread on LB-agar dishes containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin, 25 ⁇ g / ml of isopropyl ⁇ -D-thiogalacto-pyranoside and 25 ⁇ g / ml of X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) and incubated overnight at 37 ° C., according to the conventional protocols described in MANIATIS et al, cited above.
  • the plasmids pSP7 and pSP26 were sequenced by standard techniques and the sequence obtained was compared with the sequences available in the databases using the BLAST program.
  • sequences of the plasmids pSP7 and pSP26 shows that the sequence of the insert of 387 bp of the plasmid pSP7 comprises the 3 ′ end of the sequence of the insert of 4.4 kb of the plasmid pSP26, added with 127 nucleotides additional, located at its 3 'end ( Figure 1).
  • Example 1 non-pathogenic coli type K12 (Genbank U82664).
  • the results obtained in Example 1 also indicate that this locus is also present in other ST ⁇ Cs of serotype 0157 but that it is absent from colibacillus strains producing shiga-toxins from other serotypes as well as strains of E . coli of serotype 0157 which do not produce shigotoxins.
  • the sequence of the locus inserted into the chromosome of E. coli O157: H7 was supplemented with the amplification product obtained with the primers sense P388D (position 4205 to 4230 of the 4.4kb fragment of pSP26, table I) and antisense P388P (positions 93436 to 93460 of E. coli non-pathogenic type K12, table I).
  • the PCR reaction is carried out in a final volume of 100 ⁇ l containing, 3 ⁇ l of total DNA purified as described in example 1, 10 ⁇ l of PCR buffer 10 times concentrated (100 mM Tris HC1 pH 8.5, 250 mM KC1, 50 mM (NH4) 2 SO 4 , 20 mM MgSO 4 ), 200 ⁇ M of each deoxynucleotide, 600 nM of each primer and 2.5 IU of DNA polymerase PWO (ROCHE MOLECULAR).
  • the PCR amplification is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C for 2 min is followed by 30 cycles alternating a denaturation step at 94 ° C for 40 s, a priming hybridization step at 69 ° C, for 40 s and an extension step at 72 ° C, for 50 s and a final elongation step is carried out at 72 ° C for 10 min.
  • FIG. 1 The relative arrangement of the different sequenced fragments is illustrated in FIG. 1.
  • the sequence of the 1299 bp amplification product shows that the 413 bp of its 3 'end have 92% identity with the sequence of E. non-pathogenic coli (positions 93848 to 93436, with reference to the genome sequence of non-pathogenic E. coli type K12, Genbank U82664).
  • the sequence of SILoisi has no homology with a known sequence and has a G + C content of 44 , 4%, which is significantly lower than that of the entire E. genome coli (50.8%, BLATTN ⁇ R et al, 1997, Science, 277: 1453-1474). This locus is inserted between positions 93848 and 93849, with reference to the sequence of the genome of E. non-pathogenic coli type K12, Genbank U82664).
  • this locus is precisely inserted between the stop codons of 2 open reading phases (Genbank AAB40241, homologous to the open phase, reading HI0293 to 'Haemophilus influenzae and Genbank AAB40242) which are in opposite orientation.
  • the stop codons of these 2 open reading phases are directly attached.
  • the SIL 0157 locus includes 4 potential open reading phases of more than 100 amino acids, respectively called IHP1 (Inserted Hypothetical Protein 1), IHP2 (Inserted Hypothetical Protein 2), IHP3 (Inserted Hypothetical Protein, 3) and IHP4 (Inserted Hypothetical Protein 4), corresponding respectively to proteins of 338 (S ⁇ Q ID NO: 18), 140 (S ⁇ Q ID NO: 20), 120 (S ⁇ Q ID NO: 22) and 159 (S ⁇ Q ID NO: 24) amino acids.
  • IHP1 Inserted Hypothetical Protein 1
  • IHP2 Inserted Hypothetical Protein 2
  • IHP3 Inserted Hypothetical Protein
  • IHP4 Inserted Hypothetical Protein 4
  • IHP3 has homologies with a phosphate-dependent human renal sodium transporter (Genbank AAA36354), as well as with Bacillus thuringiensis transposase (Genbank Q99335).
  • IHP4 has no homology with known proteins.
  • E. enterohemorrhagic coli O157: H7 contains a small locus (SIL 0157 ) inserted into its chromosome.
  • the insertion of this locus is specific for E. strains. coli producing shiga toxins of serotype 0157 (ST ⁇ C-O157) and includes 4 potential open reading phases, one of which (IHP1) probably codes for an adhesin-like surface membrane protein which could play a role in the pathogenicity of ST ⁇ C serotypes 0157.
  • E. coli 211 strains of E. coli: 56 strains of ST ⁇ C of serotype 0157, 93 strains of ST ⁇ C of other serotypes, 55 strains of E. non-shiga-toxin-producing coli and 7 strains of bacteria of other species, originating from reference laboratories or isolated from food or biological samples, are cultured in TSB (Tryptone Soy Broth) medium, at 37 ° C, overnight. Total bacterial DNA is extracted using the INSTAGENE matrix (BIO-RAD), following the manufacturer's instructions.
  • TSB Teryptone Soy Broth
  • the PCR is carried out using the GENEAMP PCR SYSTEM 9600 (P ⁇ RKIN ⁇ LM ⁇ R) and primers obtained by conventional techniques of oligonucleotide synthesis.
  • the sequence of the different primers used is presented in Table I below, in which the positions in SIL 0157 relate to the sequence of the
  • the following pairs of primers P388C / P388D, P 388F / P388D and P388F / P388G are used in a reaction volume of 50 ⁇ l containing 200 ⁇ M of each of the deoxynucleotides (dNTP), 600 nM of each of the primers, 5 ⁇ l of buffer 10X GENE AMP (PERKTN ELMER), 2.5 IU to 'TAQ GOLD AMP (PERKIN ELMER) and 3 ⁇ l (approximately 10 ng) of purified bacterial DNA.
  • the PCR amplification is carried out in the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C for 10 min is followed by
  • the amplification products are separated by electrophoresis in a 2% agarose gel containing ethidium bromide, in TBE buffer (Tris-Borate-EDTA) and visualized under an ultraviolet lamp.
  • TBE buffer Tris-Borate-EDTA
  • MOLECULAR are used as a size marker.
  • primer P388F whose position is internal to the 300 bp fragment amplified using the primers P388C / P388D
  • primer P388G located 5 'of this sequence (Table I and Figure 1). These primers were selected so that the primers P388F, P388G and P388D which are used in pairs (P388F / P388D and P388F / P388G) have close melting temperatures.
  • EPEC b 2 strains out of 3 are EPEC b: 3 strains are EPEC c: 1 strain out of 2 is a strain of E. colo enteroaggregative d: This strain is the reference strain of EPEC e: this strain is an EPEC
  • the strains of colibacilli producing shiga-toxins of other serotypes (30 different serotypes tested on a total of 93 strains) are not amplified with the pairs of primers P388F / P388D and P388F / P388G.
  • the serotypes 0145, 077 and 079 which are amplified with the primers P388C / P388D are not amplified with these two pairs of primers.
  • P388F / P388G 7 strains of 3 other bacterial genera including those which give cross-reactions with 0157 by immunological techniques (Citrobacter and Hafnia alvei) are not amplified with the pairs of primers P388F / P388D and P388F / P388G, the strains of E. coli of serotype 055 (ST ⁇ C and non-ST ⁇ C) are also amplified with the pairs of primers P388F / P388D and P388F / P388G, which is explained by the clonal origin of serotypes 055 and 0157 which has been clearly demonstrated
  • E. strains. coli not producing shiga-toxins of other serotypes are not amplified by the pairs of primers P388F / P388D and P388F / P388G, at l exception of O127: H6 which is amplified with the P388F / P388G couple but not with the couple
  • EXAMPLE 3 ANALYSIS OF THE CONSERVATION OF THE LOCUS SIL 0157 INSERTION SITE IN E. COLI AND EVIDENCE OF A HOMOLOGATED LOCUS IN THE COLIBACILLA GROUP
  • the reactions are prepared according to the protocol described in Example 1 and the PCR amplification is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C for 10 min is followed by 35 cycles alternating with a denaturation step at 94 ° C for 40 s, a priming hybridization step at 65 ° C, for 40 s and an extension step at 72 ° C, for 50 s and a final elongation step is carried out at 72 ° C for 10 min .
  • the sequences of the primers used and the size of the fragments expected with ST ⁇ C-O157 or with the strain E. coli Kl 2 are presented in Tables VI and VII respectively below. In table VI the positions in SIL 0157 relate to the fragment of 5478 bp (SEQ ID NO: 1) and the positions in E. coli Kl 2 relate to the Genbank sequence U82664.
  • the EPEC strain E2348 / 69 (0127: H6) was amplified using the pair of primers P388P / P388L, under the following conditions which make it possible to amplify large products: an initial denaturation step at 94 ° C for 10 min is followed by 35 cycles alternating a denaturation step at 94 ° C for 25 s, a priming hybridization step at 62 ° C, for 25 s and an extension step at 72 ° C, for 2 min 15 s and a final elongation step is carried out at 72 ° C for 7 min.
  • the strain of E. coli O157. ⁇ 7 (strain ⁇ DL 933) is used as a positive amplification control.
  • the products obtained were hybridized with a probe called FD probe, corresponding to the amplification product of the strain O157: H7 using the primers P388F and P388D, under the conditions described in Example 1.
  • the results obtained are the following: - an amplification product of 682 bp which does not hybridize with the FD probe is observed with the strains which do not have a locus inserted between minutes 9 and 11 of the genome of E. non-pathogenic coli,
  • locus SIL 0157 or a homologous locus inserted between positions 93848 and
  • K12, Genbank U826664 therefore constitutes a new means of specifically detecting strains of E. pathogenic coli and in particular all ST ⁇ C-O157.
  • EXAMPLE 4 PRODUCTION AND PURIFICATION OF IHP1 PROTEIN
  • the outer membrane protein IHP1 was produced in the form of a recombinant protein tagged with a C-terminal 6X-Histidine epitope, and purified according to the steps described below.
  • the gene coding for the IHP1 protein was amplified with the following primers:
  • the PCR reaction is carried out in a volume of 100 ⁇ l containing 3 ⁇ l of DNA from ST ⁇ C O157: H7 ( ⁇ DL 933), 10 ⁇ l of 10X buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.85 (20 ° C), 250 mM KC1 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM MgSO 4 ), 200 ⁇ M of each dNTP, 600 nM of PQP1 and PQP3, and 2.5 U of DNA polymerase PWO.
  • 10X buffer 100 mM Tris-HCl, pH 8.85 (20 ° C
  • 250 mM KC1 250 mM KC1
  • 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 20 mM MgSO 4
  • 200 ⁇ M of each dNTP 600 nM of PQP1 and PQP3, and 2.5 U of DNA polymerase PWO.
  • the PCR amplification is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C for 2 min is followed by 30 cycles alternating a denaturation step at 94 ° C for 40 s, a step of hybridization of the primers at 57 ° C for 40 s and an extension step at 72 ° C, for 50 s. A final extension step is carried out at
  • the amplification product obtained and the expression vector PQ ⁇ 70 (QIAG ⁇ N) were digested with the restriction enzymes EcoRl and Bgil and ligated, so as to obtain the plasmid pSP46 containing the open reading phase of IHP1 under the control of the promoter. strong and inducible from PQ ⁇ 70.
  • 6Xhis is strongly induced by IPTG during the culture of the strain of E. coli M15 [pR ⁇ P4] carrying the plasmid pSP46.
  • the purification of IHPl-6Xhis was carried out with NI-NTA agarose under denaturing conditions following the recommended protocol by QIAGEN, with the difference that 18 mM imidazole and 0.1% Triton were added to the buffers used, to improve the quality of the purification of IHP1-6XHis.
  • the purified protein IHPl-6XHis can be detected by western-blot using anti-PentaHis antibodies
  • the IHP1-6XHis protein can be used to immunize animals, and produce antibodies specific for the IHP1 protein, for the immunological detection of STECs of serotype 0157.

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Abstract

Nouveaux marqueurs de pathogénicité d'Escherichia coli, utilisables notamment pour la détection des Escherichia coli pathogènes de sérotype O157 productrices de shiga-toxines.

Description

ACIDES NUCLEIQUES ET PROTEINES D'E. COLI PATHOGENES, ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention est relative à de nouveaux marqueurs de pathogénicité à ' Escherichia coli, utilisables notamment pour la détection des Escherichia coli pathogènes de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines.
Escherichia coli (E. coli) est une bactérie ubiquitaire, fréquemment isolée dans les laboratoires de microbiologie médicale ou alimentaire, et présente à l'état normal dans la flore intestinale de l'homme. Certaines souches sont toutefois pathogènes, et associées à de nombreuses infections intestinales et non-intestinales. L'identification des différentes souches d'E. coli repose de façon classique, sur le typage sérologique de leurs antigènes O (antigène somatique) et H (antigène flagellaire) par des méthodes immunologiques.
Les sérotypes d 'E. coli pathogènes les plus courants ont été classés en 5 groupes principaux, en fonction de leur mécanisme d'infection du tube digestif : - ΕPΕC, pour : "enteropathogenic E. coli", qui regroupe les entéropatho gènes classiques,
ΕTΕC, pour : "enterotoxigenic E. coli", qui regroupe les E. coli produisant une toxine stable ou sensible à la chaleur,
ΕAGGΕC, pour "enteroagregative E. coli", qui regroupe les E. coli qui se caractérisent par un profil particulier d'adhésion appelé "adhésion agrégative",
ΕIΕC, pour : " enteroinvasive E. coli", qui regroupe les E. coli qui miment la capacité de Shigella à envahir et à se multiplier dans les cellules de Pépithélium intestinal, et
VTΕC, pour : "verotoxin producing E. coli", ou STΕC "shiga-toxin producing E. coli", qui regroupe les E. coli produisant des cytotoxines, dénommées "Shiga- like toxins", du fait de leur analogie avec la toxine sécrétée par Shigella dysenteriae de type 1 ou également vérotoxines (VT), du fait de leur activité toxique sur les cellules Véro.
Parmi les souches d'E. coli pathogènes, les colibacilles producteurs de shiga-toxines dénommés STΕC, sont des microorganismes émergents de plus en plus reconnus comme responsables de toxi-infections alimentaires (GANNON et al, 1993, J. Clin. Microbiol. 31 : 1268-1274 ; BΕGUM D. et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31 : (12) 3153-3156). Chez l'homme l'infection par des STΕC se traduit par des symptômes plus ou moins graves qui peuvent aller d'une simple diarrhée, à une colite hémorragique, jusqu'à un syndrome hémolytique et urémique (SHU) ou un purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT), et peut parfois être fatale (GRIFFIN et al., 1991, Epidemiol. Rev. 13 : 60-98 ; NATARO et al., 1998, Microbiol. Immunol. 42 :371-376 ; PATON et al., 1998, Clin. Microbiol. Rev. 11 : 450-479). Le syndrome hémolytique et urémique survient principalement chez les jeunes enfants ; il représente environ 9% des infections à STEC diagnostiquées aux Etats- Unis. Il est par ailleurs la principale cause d'insuffisance rénale aiguë chez l'enfant, et la létalité observée est de l'ordre de 3 à 5/1000. En France, des études récentes ont montré que l'incidence annuelle moyenne du SHU est de 0,7/10000 chez les enfants de moins de 15 ans et de 1,8/10000 chez les enfants de moins de 5 ans (DECLUDT et al, 2000, Epidemiol. Infect. 124 :215-220). Les STEC sont également impliqués chez l'animal, dans des infections digestives plus ou moins graves. Les symptômes observés sont notamment des diarrhées et des dysenteries chez les veaux ou la maladie de l'œdème chez le porc. En outre, des bovins, porteurs sains, pourraient jouer un rôle dans la transmission des STEC à l'homme, par l'intermédiaire de l'eau ou de denrées alimentaires d'origine animale contaminées (viande, lait cru et produits laitiers à base de lait cru), (BONNET et al., 1998, J.
Clin. Microbiol. 36 :1777-1780 ; PRADEL et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38 : 1023-1031).
Initialement, un seul sérotype d 'E. coli avait été associé au SHU : il s'agit du sérotype O157:H7. Il a été ultérieurement observé que d'autres sérotypes notamment O157:H", O26:Hl l, Ol l l :H" et O103:H2 pouvaient être impliqués dans des infections à STΕC (BRIAN et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30 : 1801-1806). Parmi ces sérotypes, 0157 est le sérotype majeur, impliqué dans 75 à 80% des syndromes hémolytiques et urémiques (DΕCLUDT et al., précité). Les shiga-toxines produites par les STΕC, notamment SLT1 (NT1), SLT2
(VT2) et leurs variants VT2 vha, VT2 vhb, SLTII-v (VTΕ) et SLT Il-va (NTΕ-va) (ZAWLIΝ et al., 1993, Microbiol. Immunol., 37 : 543-548), ont été identifiés comme les principaux facteurs de pathogénicité impliqués dans ces infections (CALDΕRWOOD et al., 1987, Proc. Νat. Acad. Sci. 84 :4364-4368). Cependant, les shiga-toxines ne sont pas responsables à elles seules, de la pathogénicité des STΕC ; d'autres facteurs bactériens de virulence pourraient également jouer un rôle dans le pouvoir pathogène de ces colibacilles :
- le locus d'effacement entérocytaire (LΕΕ) qui code des protéines impliquées dans l'adhésion des bactéries et l'altération du cytosquelette des cellules intestinales, notamment l'intimine codée par le gène eae (BΕΕBAKHΕΕ et al., 1992, FΕMS Microbiol. Lett. 70 : 63-68 ; Me DANIEL et al., 1995, Proc. Nat. Acad., Sci. 92 :1664- 1668 ; Me DANIEL et al., 1997, Mol. Microbiol. 23 : 399-407),
- le gène efa 1 fEHEC factor for adhérence) a été décrit comme un facteur qui contribue à la capacité d'adhésion de la bactérie (NICHOLLS et al., 2000, Mol. Microbiol., 35 : 275-288), et
- un plasmide de 90 kb (BURLAND et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26 : 4196-4204), qui code des facteurs de virulence potentiels tels qu'une entérohémolysine (SCHMIDT et al., 1995, Infect. Immun., 63 : 1055-1061 ;SCHMIDT et al., 1996, Microbiol., 142 : 907-914)), une catalase-peroxydase (BRUNDER et al., 1998, Microbiol., 142 : 3305-3315), une sérine-protéase (BRUNDER et al., 1997, Mol. Mirobiol., 24, 767- 778) et un système de sécrétion de type II (SCHMIDT et al., 1997, FEMS Microbiol. Letter, 148 : 265-272). Pour prévenir les pathologies associées aux colibacilles producteurs de shiga-toxines (STEC) et en particulier les pathologies les plus graves (colite hémorragique, SHU, PTT) associées aux plus pathogènes d'entre eux, il est nécessaire de disposer de moyens de détection de ces colibacilles, afin d'être en mesure de contrôler systématiquement l'eau et les aliments susceptibles d'être contaminés, et en particulier les produits frais d'origine animale (viande, lait cru et produits laitiers à base de lait cru).
Ce contrôle implique la détection sensible et spécifique des STEC responsables de ces pathologies et notamment des STEC de sérotype 0157.
Cette détection est complexe du fait que, comme mentionné ci-dessus, la pathogénicité des STEC n'est pas simplement liée à un sérotype particulier, mais qu'elle résulte de l'association d'un certain nombre de facteurs de virulence dont la combinaison exacte n'est pas connue. En outre, certains facteurs de virulence, sont communs aux STEC et à d'autres groupes d'E. coli pathogènes ou à d'autres espèces de bactéries, ce qui constitue un problème supplémentaire pour la détection spécifique des STΕC et notamment des STΕC de sérotype 0157. Par exemple, le plasmide de virulence de 90 kb est présent chez des STΕC pathogènes d'autres sérotypes (BONNET et al., précité ), et le locus LEE est présent à la fois chez des STEC pathogènes de différents sérotypes (PRADEL et al., précité) et chez les EPEC, notamment chez O127:H6 (PERNA et al., 1998, Infect. Immun., 66 :3810-3817 ; PRADEL et al, précité).
Des tests de cytotoxicité et différentes méthodes biochimiques, immunologiques (ELISA) ou génétiques ont été proposées pour détecter les STEC (NATARO et al., 1998, Clin. Microbiol. Rev., 11 :142-201 ; PATON et al, 1998, Clin. Microbiol. Rev., 11 :450-479 ; FENG et al, 1993, Mol. Cell. Probes, 7 : 151-154 ; HUCK et al., Int. J. Food Microbiol., 25 : 277-287).
• Les tests de cytotoxicité sur des cultures de cellules constituent la méthode de référence utilisée en hygiène alimentaire pour détecter la présence de bactéries productrices de shiga-toxines ou vérotoxines. Le principe de ces tests est basé sur la cytopathogénicité des vérotoxines sur des cellules de rein de singe vert d'Afrique. Par la suite, une confirmation des types antigéniques de vérotoxine est nécessaire à l'aide d'anticorps anti-VTl et anti-VT2. Cette technique a l'avantage d'être très sensible, cependant elle n'est pas spécifique des colibacilles producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157. En outre, une série de transferts en milieux sélectifs est nécessaire afin de favoriser le développement des bactéries vérotoxiques préalablement au dosage des toxines sur une culture de cellules ; il faut compter 5 à 6 jours avant d'obtenir les premiers résultats, et les coûts sont élevés. Ce test ne constitue donc pas une méthode de routine utilisable dans l'industrie agro-alimentaire.
• Les méthodes biochimiques utilisent les caractéristiques de la majorité des E. coli O157:H7 et O157:H", qui ne fermentent pas le sorbitol en 24 heures, et qui en outre ne produisent pas de β-glucuronidase. Les E. coli O157:H7 et O157:H" apparaissent sous forme de colonies blanches sur des géloses au sorbitol, alors que les colibacilles producteurs de shiga-toxines d'autres sérotypes (026, OU I et 0103) et les nombreux colibacilles non-pathogènes, qui sont capables de fermenter le sorbitol, apparaissent sous forme de colonies pigmentées. Ces méthodes sont toutefois insuffisantes car il existe des mutants atypiques d 'E. coli O157:H7 et O157:H" qui sont capables de fermenter le sorbitol ( OUNZΕR et al, 1992, J. Clin. Microbiol, 30 : 1807-1810 ; KARCH et al, 1997, J. Food. Prot, 60 :1454-1457).
• Les méthodes immunologiques de type ΕLISA reposent sur la détection des antigènes O et H ou des shiga-toxines (VT1 et VT2) à l'aide d'anticorps spécifiques. Les tests immunologiques actuellement disponibles ne sont pas satisfaisants ; en effet, d'autres bactéries telles que Citrobacter freundii, Salmonella O du groupe N et Hafnia aîvei présentent une réactivité croisée vis-à vis des sérums anti-0157 utilisés (BΕTTΕLHΕIM et al, 1993, J. Clin. Microbiol, 31 : 760-761 ; BORCZYK et al, 1987, Int. J. Food Microbiol, 4 : 347-349 ; CHART et al, 1992, Epidemiol. Infect, 108 : 77-85 ; SHIMADA et al, 1992, Curr. Microbiol, 25 : 215-217).
En outre, la plupart des tests immunologiques disponibles sont limités à la détection de l'antigène 0157 et ne permettent pas de différencier les STEC 0157 des E. coli non pathogènes de sérotype 0157. Enfin, ces méthodes sont en général trop peu sensibles ou trop peu spécifiques pour permettre une détection dans les aliments. • Des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), permettant la détection spécifique de gènes codant des facteurs bactériens impliqués dans la virulence ont été proposés. L'amplification des gènes suivants a été rapportée :
- les gènes de shiga-toxines (stx), (CHEN et al, 1998, Appl. Environ. Microbiol, 64 : 147-152 ; Demande EP 0 864 657 au nom du CNEVA ; GANNON et al, 1992, Appl. Environ. Microbiol, 58 : 3809-3818 ; JACKSON, 1991 ; J. Clin. Microbiol, 29 : 1910-1914 ; KARCH et al, 1989, J. Clin. Microbiol, 27 : 2751-2757 ; LIN et al, 1993, Microbiol. Immunol, 37 : 543-548 ; POLLARD et al, J. Clin. Microbiol, 1990, 28 : 540- 545 ; POLLARD, 1990, J. Infect. Dis, 162, 1195-1198 ; READ et al, 1992, Mol. Cell. Probes, 6 : 153-161), - le gène de l'intimine (eae) porté par le locus LEE (SANDHU et al, 1996,
Epidemiol. Infect, 116 : 1-7 ; WILLSHAW et al, 1994, J. Clin. Microbiol, 32 : 897-902),
- le gène de l'hémolysine codé par le plasmide de 90 kb (E-hlya), (SCHMIDT et al, 1995, précité), - des gènes impliqués dans la biosynthèse de l'antigène O (locus rfb), (DESMARCHELIER et al, 1998, J. Clin. Microbiol, 36 : 1801-1804 ; MAURER et al, 1999, Appl. Environ. Microbiol, 65 : 2954-2960), et
- le gène codant l'antigène flagellaire H7 (fliCM), (FIELDS et al, J. Clin. Microbiol, 1997, 35 : 1066-1070).
Ces méthodes sont plus sensibles et plus spécifiques que les méthodes biochimiques ou immunologiques. Cependant, les STEC 0157 ne peuvent pas être identifiés à l'aide d'une seule réaction PCR ciblant l'un de ces gènes. En effet, les antigènes somatiques 0157 et flagellaire H7, qui peuvent être portés par des souches d'E. coli non pathogènes ne constituent pas à eux seuls des marqueurs de pathogénicité. En outre, les gènes de vérotoxines sont par définition portés par toutes les souches de STEC ; les facteurs de virulence décrits sur le plasmide de 90 kb, (entérohémolysine, catalase péroxydase, serine protéase) sont présents chez des STEC de différents sérotypes (BONNET et al, précité) et un homologue du locus LEE est présent à la fois chez les STEC de différents sérotypes (PRADEL et al, précité) et chez les EPEC (PERNA et al, précité). Par conséquent, la mise en évidence d'un seul de ces gènes de virulence ne suffit pas à identifier un STEC de sérotype 0157.
Des tests permettant l'amplification simultanée de plusieurs gènes en une seule réaction (PCR-multiplex) ont été proposés (CEBULA et al, 1995, J. Clin. Microbiol, 33 : 1048 ; DENG et al, 1996, J. Food Prot, 59 : 570-576 ; FRATAMICO et al, 1995, J. Clin. Microbiol, 33 : 2188-2191 ; GANNON et al, 1997, J. Clin. Microbiol, 35 : 656-662 ; NAGANO et al, 1998, Microbiol. Immunol, 42 : 371-376 ; PATON et al, 1998, J. Clin. Microbiol, 36 : 598-602).
Ces techniques qui sont adaptées à la détection d'une souche bactérienne isolée ne sont pas utilisables pour l'analyse d'échantillons biologiques complexes, tels que des aliments ou des selles, qui sont susceptibles de contenir un mélange de bactéries. En effet, comme rapporté par DENG et al. (précité), la PCR-multiplex ne permet pas de conclure si les signaux correspondants aux différents gènes détectés proviennent d'une seule souche bactérienne, ou bien de l'effet additif de gènes présents dans des souches différentes de bactéries. Cet inconvénient majeur, qui implique l'isolement systématique de chaque souche afin de vérifier que les différents gènes amplifiés par PCR sont bien présents dans la même souche, n'est pas adapté au diagnostic de routine en laboratoire d'hygiène alimentaire ou d'analyses médicales.
La comparaison de la séquence nucléotidique de certains gènes communs aux STEC de sérotype 0157 et à d'autres E. coli pathogènes a permis d'identifier des mutations ponctuelles. Ainsi certains auteurs ont proposé des amorces spécifiques ciblant les gènes portés par les STEC 0157 qui permettent leur détection en une seule réaction PCR. Ainsi, l'amplification des régions suivantes a été rapportée : la région 3' du gène eae (LOUIE et al, 1994, Epidemiol. Infect, 112 : 449-461), la région immédiatement adjacente à la région 5' du gène eae (MENG et al, 1996, Int. J. Food Microbiol, 32, 103-113 ; MENG et al, 1997, Lett. Appl. Microbiol, 24 : 172-176 ; ZHAO et al, 1995, FEMS Microbiol. Lett, 133 : 35-39) ou le gène H7 (WANG et al, 2000, J. Clin. Microbiol, 38 : 1786-1790). II apparaît donc qu'on ne dispose à l'heure actuelle que de très peu de marqueurs spécifiques et faciles à mettre en œuvre pour détecter les E. coli pathogènes, et notamment les STEC de sérotype 0157.
Les Inventeurs ont identifié dans des souches d'E. coli pathogènes, notamment dans tous les colibacilles pathogènes de sérotype 0157 producteurs de shiga- toxines, la présence d'un insert d'acide nucléique représentant un nouveau locus, absent des souches non-pathogènes. Ce locus est inséré entre les positions 93848 et 93849 de la séquence du génome d'E. coli Kl 2 (GenBank U82664) ; ce site d'insertion est précisément situé entre les codons stop de deux phases ouvertes de lecture (Genbank AAB40241 et Genbank AAB40242) en orientation opposée, qui dans la séquence génomique des souches d 'E. coli non-pathogènes comme la souche type K12 sont directement adjacentes.
Les Inventeurs ont également constaté la présence d'un locus similaire, inséré à la même position, chez des souches à' E coli pathogènes, appartenant à des sérotypes autres que 0157. En revanche, ils n'ont observé aucune insertion à cette position chez l'ensemble des souches non-pathogènes qui ont été testées. La présence d'un insert à cette position constitue donc un nouveau marqueur génétique de virulence utile pour la détection de souches d'E. coli pathogènes.
Les séquences d'acide nucléiques issues d'un tel insert constituent également des marqueurs utiles pour la détection de souches d'E. coli pathogènes, et en particulier pour la détection spécifique des souches de bactéries pathogènes portant ledit insert ; par exemple, des séquences d'acide nucléiques issues de l'insert présent dans une souche de sérotype 0157 productrice de shiga-toxines permettent un détection spécifique de l'ensemble des E. coli de sérotype 0157 produisant des shiga-toxines.
En conséquence, la présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique issue d'une souche pathogène d'E. coli, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une molécule d'acide nucléique représentant un locus inséré dans le génome de ladite souche pathogène, à l'emplacement dudit génome correspondant à celui situé chez E. coli Kl 2, entre les positions 93848 et 93849 de la séquence GenBank U82664 ; b) une molécule d'acide nucléique comprenant la molécule a) définie ci- dessus, et entre 1 et 2500 pb de la séquence en amont du site d'insertion de ladite molécule, et/ou entre 1 et 2500 pb en aval du site d'insertion de ladite molécule. c) une molécule d'acide nucléique constituant un fragment d'au moins 15 pb, de préférence d'au moins 25 à 30 pb, de la molécule a) ci-dessus ; d) une molécule d'acide nucléique constituant un fragment d'au moins
15 pb, de préférence d'au moins 25 à 30 pb, de la molécule b) ci-dessus, ledit fragment comprenant au moins une portion de la molécule a) et au moins une portion de la séquence en amont du site d'insertion de ladite molécule a), ou au moins une portion de la séquence en aval du site d'insertion de ladite molécule a).
Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent en particulier être issues du génome d'une bactérie pathogène de l'espèce Escherichia coli, choisie parmi les E. coli STΕC de sérotype 0157, 077, 079, ou 0145, les Escherichia coli STΕC ou ΕPΕC de sérotype 055, et les Escherichia coli ΕPΕC de sérotype 0127. Par exemple, des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention issues du génome d'E. coli O157:H7, sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous respectivement les numéros SΕQ ID NO: 1, SΕQ ID NO: 2, SΕQ ID NO: 11 à 17, SΕQ ID NO: 19, SΕQ ID NO: 21 et SΕQ ID NO: 23.
La présente invention a également pour objet des molécules d'acide nucléique capables de s'hybrider spécifiquement, en conditions stringentes, avec l'une quelconque des molécules a) à d) ci-dessus. •
Ceci englobe notamment des oligonucléotides utilisables comme amorces d'amplification pour l'obtention d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, ou comme sondes pour la détection de ladite séquence, et en particulier les oligonucléotides P388L, P388M, P388G, P388D, P388F, P388C et P388P, correspondant respectivement aux séquences SΕQ ID NO: 3 à 9 dans la liste de séquences en annexe. Les oligonucléotides P388M, P388G, P388D, P388F et P388C sont en particulier utilisables comme sondes d'hybridation moléculaire, utiles pour la détection, d'une molécule d'acide nucléique a) conforme à l'invention issue du génome d'une bactérie E. coli STΕC de sérotype 0157. La présente invention englobe en particulier les couples d'amorces utilisables pour l'amplification d'une molécule d'acide nucléique a) b) c) ou d) conforme à l'invention.
La présente invention a en outre pour objet les vecteurs recombinants, et notamment les plasmides recombinants contenant une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention.
Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent par exemple être obtenues par amplification en chaîne par polymérase, à partir de l' ADN d'une souche E. coli pathogène comprenant le locus défini ci-dessus. Notamment :
- une molécule d'acide nucléique a) conforme à l'invention peut être obtenue en utilisant un couple d'amorces d'amplification dont l'une s'hybride comprenant une amorce s'hybridant à chacune des extrémités de la molécule a),
- une molécule d'acide nucléique b) conforme à l'invention peut être obtenue en utilisant un couple d'amorces d'amplification comprenant une amorce s'hybridant en amont du site d'insertion de la molécule a) et une amorce s'hybridant en aval du site d'insertion de la molécule a) ; des amorces appropriées peuvent être choisies par l'homme de l'art, respectivement à partir de la séquence de 2500 pb en amont de la position 93848 de la séquence GenBank U82664, et de la séquence de 2500 pb en aval de la position 93849.
On utilisera, bien entendu des conditions d'amplification permettant d'amplifier des fragments de grande taille, et comprenant notamment une étape d'extension d'amorces de durée suffisante.
Avantageusement, on peut utiliser le couple d'amorces P388L/P388P, qui s'hybride de part et d'autre du site d'insertion d'une molécule a) conforme à l'invention.
Ce couple amplifie un fragment de 682 pb lorsque l'amplification est effectuée à partir du génome de la souche type E. coli non pathogène Kl 2, alors qu'il amplifie un fragment de plus grande taille avec des E. coli pathogènes ; il amplifie notamment un fragment de 3316 pb (SΕQ ID NO: 11) avec tous les E. coli producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157.
Une molécule d'acide nucléique c) conforme à l'invention peut être obtenue en utilisant un couple d'amorces s'hybridant avec des séquences internes de la molécule a)
Une molécule d'acide nucléique d) conforme à l'invention peut être obtenue en utilisant un couple d'amorces comprenant une amorce s'hybridant avec une séquence interne de la molécule a) et une amorce s'hybridant avec une séquence située en amont du site d'insertion de la molécule a) ou une amorce s'hybridant avec une séquence située en aval du site d'insertion de la molécule a).
On peut avantageusement utiliser un couple d'amorces sélectionné dans le groupe constitué par : P388C/P388D (SΕQ ID NO: 8/SΕQ ID NO: 6), P388F
/P388G (SΕQ ID NO: 7/SΕQ ID NO: 5), P388F /P388D (SΕQ ID NO: 7/SΕQ ID NO: 6),
P388P/P388L (SΕQ ID NO: 9/SΕQ ID NO: 3), P388L/P388M (SΕQ ID NO: 3/SΕQ ID
NO: 4) et P388P/P388D (SΕQ ID NO: 9/SΕQ ID NO: 6).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention pour le dépistage d'E. coli pathogènes, et notamment pour le dépistage spécifique des souches d'E. coli de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines.
En particulier, la présente invention a pour objet un procédé de dépistage d'E. coli pathogènes, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence dans le génome des bactéries E. coli présentes dans l'échantillon à tester, d'un locus inséré à l'emplacement dudit génome correspondant à celui situé chez E. coli K12, entre les positions 93848 et 93849 de la séquence GenBank U82664. Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé de détection conforme à l'invention, il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces comprenant une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en amont de la position 93848 de la séquence GenBank U82664, et une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en aval de la position 93849 de la séquence GenBank U82664.
La détermination de la taille du produit d'amplification, et sa comparaison avec celui obtenu en utilisant le même couple d'amorces, à partir du génome d'une souche non-pathogène, par exemple la souche type E. coli K12 permet de détecter l'insertion d'un locus conforme à l'invention.
En outre, la taille du produit d'amplification pour un même couple d'amorces peut également permettre de distinguer différents groupes d'E. coli pathogènes.
Par exemple si l'on utilise le couple d'amorces P388L/P388P, on observe en présence d'E. coli pathogènes de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines, un fragment d'amplification de 3316 pb spécifique de ces bactéries.
Selon une variante, l'amplification est effectuée dans des conditions ne permettant pas d'amplifier des fragments de grande taille. L'absence de produit d'amplification permet, dans ce cas, de détecter l'insertion d'un locus conforme à l'invention. Ce mode de mise en œuvre ne permet toutefois pas de distinguer différents groupes d'E. coli pathogènes.
Selon un mode de mise en œuvre du procédé de détection conforme à l'invention, il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces s'hybridant avec des séquences internes d'une molécule a) telle que définie ci-dessus.
Par exemple, pour la détection de STΕC de sérotype 0157, l'utilisation des couples d'amorces suivants : P388C/P388D, P388F/P388D, P388F/P388G produit des fragments d'amplification de respectivement 300 pb (SΕQ ID NO: 12), 125 pb (SΕQ ID NO: 13) et 578 pb (SΕQ ID NO: 14) avec tous les STΕC de sérotype 0157 alors qu'aucun produit d'amplification n'est observé avec la souche type d 'E. coli K12 utilisée comme contrôle.
Selon encore un autre un mode de mise en œuvre du procédé de détection conforme à l'invention, il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces comprenant une amorce s'hybridant avec une séquence interne d'une molécule a) telle que définie ci-dessus, et une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en amont de la position 93848 de la séquence GenBank U82664, ou une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en aval de la position 93849 de la séquence GenBank U82664.
Par exemple, pour la détection de STΕC de sérotype 0157, l'utilisation des couples d'amorces suivants : P388P/P388D, P388L/P388M, produit des fragments de respectivement 1299 pb (SΕQ ID NO: 15) et 419 pb (SΕQ ID NO: 16) avec tous les STΕC de sérotype 0157 alors qu'aucun produit d'amplification n'est observé avec les souches d 'E. coli non pathogènes.
Les Inventeurs ont étudié la sensibilité et la spécificité des couples d'amorces P388C/P388D, P388F/P388D et P388F/P388G pour la détection des STΕC- 0157.
Sur 211 souches bactériennes testées, les trois couples d'amorces ont une sensibilité équivalente et détectent les 55 STΕC-O157 testés ainsi que les E. coli de sérotype 055, ce qui s'explique par l'origine clonale de ces deux sérotypes (FΕNG et al, 1998, J. Infect. Dis, 177 :1750-1753 ; WHITTAM et al, 1993, Infect. Immun, 61 : 1619-1629). En outre, avec les trois couples d'amorces, aucun signal n'est obtenu avec les bactéries Citrobacter et Hafnia alvei qui présentent des réactions immunologiques croisées avec l'antigène 0157.
Pour la détection spécifique de tous les E. coli producteurs de shiga- toxines de sérotype 0157, on utilise de préférence le couple P388F/P388D. En effet ce couple d'amorces présente une spécificité particulièrement élevée et ne donne aucune réaction positive avec les STEC d'autres sérotypes (30 sérotypes testés) ainsi qu'avec les E. coli non-STEC de sérotype 0157 ou d'autres sérotypes (55 testés) et les bactéries d'autres espèces.
Les oligonucléotides conformes à l'invention peuvent également être utilisés comme amorces dans une technique de type PCR-ELISA. Dans ce cas, on peut, par exemple, utiliser l'oligonucléotide P388D préalablement immobilisé sur un support solide, en tant que sonde de capture pour fixer le produit d'amplification de 578 pb obtenu avec les amorces P388G et P388F ; ce produit d'amplification peut alors être révélé soit directement (par exemple s'il a été marqué de façon appropriée par incorporation de nucléotides marqués au cours de la réaction d'amplification) soit par l'intermédiaire d'une sonde de détection marquée.
Différentes méthodes pour fixer des acides nucléiques sur un support solide, ainsi que celles pour les marquer à l'aide de marqueurs froids ou radioactifs sont bien connues de l'homme du métier à titre d'exemple on citera celles décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wïley and son Inc, Library of Congr s s, USA).
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique obtenue par amplification en chaîne par polymérase d'un E .coli non pathogène à l'aide du couple d'amorces P388P/P388L. Cette molécule est utilisable à titre de témoin, dans le cadre d'un procédé de détection conforme à l'invention.
Avantageusement, ladite molécule est obtenue à partir d'E. coli Kl 2 et est constituée par un fragment de 682 pb (SΕQ ID NO: 10). La présente invention a également pour objet toute protéine codée par un cadre ouvert de lecture présent sur une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention, et notamment sur une molécule issue d'une souche d'E. coli de sérotype 0157 productrice de shiga-toxines.
En effet, à partir d'une banque génomique d'E. coli O157:H7, les Inventeurs ont isolé une séquence de 5478 pb (SΕQ ID NO: 1) contenant un locus conforme à l'invention dénommé SIL0157, défini par la séquence présentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SΕQ ID NO: 2. La figure 1 illustre l'organisation génétique du locus d'E. coli O157:H7, dénommé SIL0157, inséré dans le génome d'E. coli entre les positions 93849 et 93848, (en référence au génome type d 'E. coli non-pathogène Kl 2, Genbank U82664). Les régions indiquées en blanc représentent les régions homologues entre la séquence d 'E. coli non pathogène Kl 2 (Genbank U82664) et la séquence de STΕC O157.Η7. Les régions indiqués en noir représentent le locus SIL0157. Les grandes flèches noires comprenant des numéros d'accession représentent les phases ouvertes de lecture décrites dans E. coli non pathogène. Les grandes flèches blanches représentent les phases ouvertes de lecture potentielles comprises dans le locus SIL0157. Les petites flèches indiquent les positions des différentes amorces utilisées pour les amplifications PCR.
Les Inventeurs ont analysé ce locus SIL0157, et ont ainsi mis en évidence mis en évidence des cadres ouverts de lecture et, notamment 4 cadres ouverts de lecture codant des protéines dénommées ci-après IHP1, IHP2, IHP3 et IHP4, de respectivement 338, 140, 120 et 159 acides aminés.
Les séquences en acides aminés des protéines IHP1, IHP2, IHP3 et IHP4 sont présentées dans la liste en annexe, respectivement sous les numéros SΕQ ID NO: 18, 20, 22 et 24, les séquences nucléotidiques correspondantes sont présentées dans la liste en annexe, respectivement sous les numéros SΕQ ID NO: 17, 19, 21 et 23. Les protéines conformes à l'invention représentent de nouveaux antigènes potentiellement utilisables pour la détection des E. coli pathogènes.
Notamment, dans le cas des protéines dont les gènes sont portés par le locus SIL0157, mentionné ci-dessus, la protéine IHP1, qui présente des homologies avec des protéines de la membrane externe et des adhésines d'autres bactéries (flagelline de Salmonella et adhésine de Neisseria, Yersinia, Haemophilus et Staphylococcus) constitue un antigène de surface potentiellement utilisable pour la détection des E. coli producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157. La présente invention a également pour objet tout peptide représentant un fragment d'au moins 5 acides aminés, et de préférence d'au moins 7 à 15 acides aminés d'une protéine conforme à l'invention.
La présente invention a en outre pour objet : - des cassettes d'expression comprenant les séquences nucléotidiques codant les protéines ou les peptides conformes à l'invention, placées sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié, notamment un promoteur permettant l'expression desdites protéines ou desdits peptides dans des cellules hôtes transformées. Avantageusement, les cassettes d'expression contiennent les séquences codant l'une des protéines IHP1 à IHP4, telles que définies ci-dessus (SEQ ID NO: 17, 19, 21 et 23).
- des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par les séquences nucléotidiques codant les protéines ou les peptides conformes à l'invention. Avantageusement, ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus -en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
L'invention a en outre pour objet des cellules procary otes ou eucaryotes transformées par un plasmide ou un vecteur recombinant conforme à l'invention.
Les vecteurs recombinants et les cellules transformées conformes à l'invention sont utiles notamment pour la production des protéines et des peptides conformes à l'invention.
La présente invention a également pour objet des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, dirigés contre une protéine ou un peptide conforme à l'invention.
Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. Le cas échéant, ces anticorps pourront subir des étapes complémentaires de purification et/ou d'élimination d'éventuelles réactions croisées avec d'autres antigènes, notammment par des techniques d'immuno-adsorption. Les techniques de production et de purification de protéines recombinantes, les méthodes d'immunisation et de production d'anticorps et les techniques immunologiques reposant sur la détection de complexes antigène-anticorps (ELISA, RIA, Western-Blot) sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple on peut citer celles décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wïley and son Inc, Library of Congress, USA) et dans Current protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wïley and son Inc, Library of Congress, USA).
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins une protéine, un peptide, ou un anticorps conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament, destiné à la prévention ou au traitement d'une infection induite par une bactérie E. coli pathogène, notamment une bactérie E. coli de sérotype 0157 productrice de shiga- toxines.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins une protéine, un peptide, ou un anticorps conforme à l'invention pour la détection immunologique des E. coli pathogènes, notamment pour le dépistage des E. coli de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines.
Les molécules d'acide nucléique, les protéines et les peptides, ainsi que les anticorps conformes à l'invention peuvent également constituer des réactifs utilisables pour la détection de souches d'E. coli pathogènes, notamment de toutes les souches d 'E. coli productrices de shiga-toxines de sérotype 0157.
Les réactifs conformes à l'invention sont utilisables pour la recherche de souches d'E. coli pathogènes, notamment de toutes les souches d'E. coli de sérotype 0157 produisant de shiga-toxines dans les produits alimentaires, en particulier l'eau, les produits alimentaires frais tels que les viandes, le lait cru et les produits dérivés (fromages, produits laitiers).
Ces réactifs peuvent également être utilisés pour le diagnostic des infections à E. coli pathogènes, notamment les infections à E. coli producteurs de shiga- toxines de sérotype 0157 des humains et des animaux, à partir d'un échantillon biologique, par exemple dans les fèces.
L'invention a en outre pour objet une trousse de détection d'E. coli pathogènes, notamment de toutes les souches d 'E. coli producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins un réactif selon l'invention.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement et la caractérisation d'une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention, et son utilisation pour l'identification & Escherichia coli pathogènes, et en particulier des Escherichia coli de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines. EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D'UN LOCUS INSERE DANS LE CHROMOSOME D'E. COLI 0157:H7 PAR ANALYSE DU POLYMORPHISME DE L'ADN PAR RAPD (RANDOMLY AMPLIFIED POL YMORPHIC DNA). 1. Identification d'un fragment d'ADN spécifique d'E. coli O157:H7 par RAPD
1.1. Extraction de l'ADN bactérien et amplification PCR
12 souches d 'E. coli : 10 souches de STΕC [3 souches O157:H7 et 1 souche (0157: H", O26:Hl l, 091: H21, O103:H2, Ol l l :H+, O113:H4 et O128:H2)J et 2 souches d'E. coli de sérotype 0157, non productrices de shiga-toxines (O157-non STΕC) .sont cultivées dans du milieu TSB (Tryptone Soy Broth), à 37°C, pendant une nuit et l'ADN bactérien total est extrait à l'aide de la matrice INSTAGENE (BIO-RAD), en suivant les instructions du fabricant. Les souches d'E. coli sont analysées par RAPD, en utilisant le kit READY TO GO (PHARMACIA BIOTΕCH). La réaction de PCR est réalisée dans un volume final de 25 μl, en présence de 10 ng d'ADN bactérien total purifié et de 25 pmoles de l'amorce oligonucléotidique PI (PHARMACIA-BIOTΕCH). L'amplification PCR (GENE-AMP PCR SYSTEM 9600, PΕRKJN ΕLMΕR) est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 95°C pendant 5 min est suivie de 45 cycles alternant une étape de dénaturation à 95°C pendant 1 min, une étape d'hybridation des amorces à 36°C, pendant 1 min et une étape d'extension à 72°C, pendant 2 min. Le produit d'amplification est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 2 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBΕ (Tris-Borate-ΕDTA). Les fragments d'ADN amplifiés sont visualisés sous une lampe à ultraviolet.
Le profil de l'analyse RAPD montre qu'un fragment de 387 pb est amplifié de façon aléatoire, uniquement dans les colibacilles producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157 (3 souches de sérotype O157.Η7 et 1 souche de sérotype O157.Η").
1.2. Hybridation du fragment obtenu par RAPD
Le fragment de 387 pb est isolé à partir du gel d'agarose, purifié à l'aide du kit d'extraction QIAEXII (QIAGΕN) et clone dans le vecteur pMOS Blue (AMΕRSHAM PHARMACIA BIOTΕCH), à l'aide du kit de clonage d'extrémités franches d'AMERSHAM LIFE SCIENCE, pour donner le plasmide pSP7. Une sonde correspondant à f insert de 387 pb (sonde P7) est synthétisée par PCR et marquée à la digoxigénine à l'aide du réactif PCR DIGOXIGENIN LABELING MIX (ROCHE MOLECULAR). Cette sonde est hybridée, par Dot-blot, avec l'ADN des 12 souches d'E. coli analysées par RAPD. L'hybridation est réalisée sur des membranes de nylon (ROCHE MOLECULAR), pendant une nuit à 65°C, dans un tampon d'hybridation classique (ROCHE MOLECULAR) contenant 20 ng/ml de sonde dénaturée marquée à la digoxigénine, en suivant les protocoles classiques décrits dans MANIATIS et al. (Molecular Cloning : a laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboartory, Cold Spring Harbor, New York). Puis, l'hybridation de la sonde marquée à la digoxigénine est détectée par luminescence (DIG LUMINESCENT DETECTION KIT, ROCHE MOLECULAR) sur des films BIOMAX (KODAK). Les résultats de l'hybridation montrent que la sonde P7 marquée ne reconnaît que les STEC de sérotype 0157. Ce résultat suggère que le fragment de 387 pb obtenu par RAPD pourrait provenir d'un locus spécifique des souches de colibacilles productrices de shiga-toxines de sérotype 0157.
2. Identification et localisation d'un locus inséré dans le chromosome d'E. coli O157:H7.
2.1 Construction d'une banque d'ADN d'E. coli O157:H7
L'ADN chromosomique de la souche ΕDL 933 (ATCC 43895) d'E. coli O157:H7, purifié à l'aide du kit QIAGEN GENOMIC TIP SYSTEM (QIAGΕN) est digéré, dans sa totalité, par Hind III (ROCHE MOLECULAR), en suivant les instructions du fabricant. Puis 300 ng de cet l'ADN digéré est ligué avec 10 ng du plasmide pUC 18, digéré par Hind III et déphosphorylé (PHARMACIA-BIOTECH), en présence de 5UI de la ligase à ADN de T4 (ROCHE MOLECULAR), dans un volume réactionnel de 20 μl, à 16°C, pendant une nuit. Des bactéries E. coli MOS Blue compétentes sont transformées par le produit de ligation et étalées sur des boîtes de LB-agar contenant 100 μg/ml d'ampicilline, 25 μg/ml d'IPTG isopropyl β-D-thiogalacto-pyranoside et 25 μg/ml de X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-D-galactoside) et incubées une nuit à 37°C, selon les protocoles classiques décrits dans MANIATIS et al, précité.
La présence du fragment isolé par RAPD dans l'ADN plasmidique des colonies résistantes à l'ampicilline est analysée par hybridation homologue à l'aide de la sonde P7.
L'analyse de 1000 colonies de bactéries transformées a permis d'isoler le plasmide pSP26 contenant un fragment de 4,4kb du génome d E. coli O157:H7. 2.2. Localisation du locus inséré dans le chromosome d'E coli O157:H7
Les plasmides pSP7 et pSP26 ont été séquences par les techniques classiques et la séquence obtenue a été comparée avec les séquences disponibles dans les banques de données à l'aide du programme BLAST.
L'alignement des séquences des plasmides pSP7 et pSP26 montre que la séquence de l'insert de 387 pb du plasmide pSP7 comprend l'extrémité 3' de la séquence de l'insert de 4,4 kb du plasmide pSP26, additionnée de 127 nucléotides supplémentaires, situés à son extrémité 3' (Figure 1).
L'analyse de la séquence du fragment de 4,4 kb de pSP26 montre que son extrémité 5' présente 98% d'identité avec la séquence génomique des minutes 9 à 11 (positions 96304-93849, en référence à la séquence génomique d 'E. coli non pathogène de type Kl 2, Genbank U82664). En revanche, l'extrémité 3' de ce fragment (nucléotides 2457 à 4418) et la totalité de la séquence de 387 pb du plasmide pSP7 ne présentent aucune homologie avec la séquence de souches non pathogènes d'E. coli (Figure 1). Ces résultats démontrent que le génome d 'E. coli O157:H7 contient un locus inséré entre les positions 93848 et 93849, en référence à la séquence génomique d 'E. coli non pathogène de type K12 (Genbank U82664). Les résultats obtenus à l'exemple 1 indiquent également que ce locus est également présent dans d'autres STΕC de sérotype 0157 mais qu'il est absent de souches de colibacilles productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes ainsi que des souches d'E. coli de sérotype 0157 non productrices de shiga- toxines.
2.3. Séquençage complet du locus inséré dans le chromosome d 'E. coli O157:H7
La séquence du locus inséré dans le chromosome d'E. coli O157:H7 a été complétée à partir du produit d'amplification obtenu avec les amorces sens P388D (position 4205 à 4230 du fragment de 4,4kb de pSP26, tableau I) et antisens P388P (positions 93436 à 93460 d'E. coli non-pathogène de type K12, tableau I).
La réaction de PCR est réalisée dans un volume final de 100 μl contenant, 3 μl d'ADN total purifié comme décrit à l'exemple 1, 10 μl de tampon PCR 10 fois concentré (100 mM Tris HC1 pH 8,5, 250 mM KC1, 50 mM (NH4)2 SO4, 20 mM MgSO4), 200 μM de chaque désoxynucléotide, 600 nM de chaque amorce et 2,5 UI de polymérase à ADN PWO (ROCHE MOLECULAR). L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 30 cycles alternant une étape de dénaturation à 94°C pendant 40 s, une étape d'hybridation des amorces à 69°C, pendant 40 s et une étape d'extension à 72°C, pendant 50 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72°C pendant 10 min.
Ces amorces n'amplifient aucune séquence d'E. coli non-pathogène de type K12, en revanche un produit d'amplification de 1299 pb dénommé Amp 388P/388D, (figure 1) est amplifié à partir de l'ADN d'E. coli O157:H7 (souche ΕDL 933).
La disposition relative des différents fragments séquences est illustrée à la figure 1.
La séquence du produit d'amplification de 1299 pb montre que les 413 pb de son extrémité 3' présentent 92% d'identité avec la séquence d 'E. coli non-pathogène (positions 93848 à 93436, en référence à la séquence du génome d'E. coli non pathogène de type K12, Genbank U82664). Les séquences du produit d'amplification de 1299 pb et du fragment de
4,4 kb de pSP26 ont permis d'identifier une nouvelle séquence de 5478 pb (SΕQ ID NO: 1), dans E. coli O157:H7. Cette séquence contient un petit locus de 2634 pb (positions 2457 à 5090 de la séquence de 5478 pb) inséré dans le chromosome d'E. coli O157:H7, flanqué de part et d'autre part des séquences conservées d 'E. coli non pathogènes. Ce locus dénommé SIL0157 (Small Inserted Locus in STEC 0157) est présenté dans la liste en annexe sous le numéro SΕQ ID NO: 2. La séquence de SILoisi ne présente aucune homologie avec une séquence connue et possède un contenu en G+C de 44, 4%, qui est nettement plus faible que celui de l'ensemble du génome d 'E. coli (50,8%, BLATTNΕR et al, 1997, Science, 277 : 1453- 1474). Ce locus est inséré entre les positions 93848 et 93849, en référence à la séquence du génome d'E. coli non pathogène de type K12, Genbank U82664). De façon remarquable, dans les colibacilles entérohémorragiques de sérotype O157:H7, ce locus est précisément inséré entre les codons stop de 2 phases ouvertes de lecture (Genbank AAB40241, homologue à la phase ouverte, de lecture HI0293 à' Haemophilus influenzae et Genbank AAB40242) qui sont en orientation opposée. En revanche, dans la séquence d 'E. coli non- pathogène de type Kl 2, les codons stop de ces 2 phases ouvertes de lecture sont directement joints.
3. Analyse des phases ouvertes de lecture potentielles du locus SIL0157
Le locus SIL0157 comprend 4 phases ouvertes de lecture potentielles de plus de 100 acides aminés, dénommées respectivement IHP1 (Inserted Hypothetical Protein 1), IHP2 (Inserted Hypothetical Protein 2), IHP3 (Inserted Hypothetical Protein ,3) et IHP4 (Inserted Hypothetical Protein 4), correspondant respectivement à des protéines de 338 (SΕQ ID NO: 18), 140 (SΕQ ID NO: 20), 120 (SΕQ ID NO: 22) et 159 (SΕQ ID NO: 24) acides aminés. Le brin positif code IHP1 (nucléotides des positions 3364 à 4380 de la séquence de 5478 pb, SΕQ ID NO: 17) et IHP2 (nucléotides des positions 4465 à 4887 de la séquence de 5478 pb SΕQ ID NO: 19), dans la même phase, et le brin négatif code IHP3 (nucléotides des positions 2997 à 2635 de la séquence de 5478 pb SΕQ ID NO: 21) et IHP4 (nucléotides des positions 4002 à 3523 de la séquence de 5478 pb SΕQ ID NO: 23), dans la même phase.
L'analyse de la protéine IHP1, à l'aide des programmes PSORT et BLAST indiqué respectivement la présence d'une séquence N-terminale clivable de 23 acides aminés, et des homologies avec des protéines de membrane et des adhésines bactériennes. En particulier, on peut noter des homologies avec les protéines suivantes ; une adhésine/invasive potentielle de Neisseria meningitidis (Genbank AAF 42321 et Genbank AAF41395), l'invasine Yopl de Yersinia pseudotuberculosis (Genbank CAA32088), l'adhésine YadA de Yersinia enter ocolitica (Genbank CAA32086), l'adhésine HIA (Genbank AAC43721) et la protéine HSF (produit du locus de fibrille, dénommé locus hsf numéro d'accession Genbank AAC44560) ά 'Haemophilus influenzae, la flagelline H-l de Salmonelle rubislaw (Genbank CAA28190) et l'autolysine/adhésine de la protéine de surface Aas de Staphylococcus saprophyticus (Genbank CAA03852). L'analyse de la protéine IHP2 indique la présence d'une séquence N- terminale clivable de 27 acides aminés et peu d'homologie avec des protéines connues, mis à part avec la protéine YCCF de Bacillus subtilis (Genbank CAB 12066).
IHP3 présente des homologies avec un transporteur rénal humain du sodium, dépendant du phosphate (Genbank AAA36354), ainsi qu'avec la transposase de Bacillus thuringiensis (Genbank Q99335).
IHP4 ne présente pas d'homologie avec des protéines connues.
L'ensemble de ces résultats montre que la souche d 'E. coli entérohémorragique O157:H7 contient un petit locus (SIL0157) inséré dans son chromosome. L'insertion de ce locus est spécifique des souches d'E. coli productrices de shiga-toxines de sérotype 0157 (STΕC-O157) et comprend 4 phases ouvertes de lecture potentielles dont une (IHP1) code vraisemblablement pour une protéine membranaire de surface de type adhésine qui pourrait jouer un rôle dans la pathogénicité des STΕC de sérotype 0157.
EXEMPLE 2 : DETECTION DES STEC-O157 PAR PCR 1. Extraction d'ADN et réaction PCR
211 souches d'E. coli : 56 souches de STΕC de sérotype 0157, 93 souches de STΕC d'autres sérotypes, 55 souches d'E. coli non productrices de shiga-toxines et 7 souches de bactéries d'autres espèces, provenant de laboratoires de référence ou bien isolées à partir d'aliments ou d'échantillons biologiques, sont cultivées dans du milieu TSB (Tryptone Soy Broth), à 37°C, pendant une nuit. L'ADN bactérien total est extrait à l'aide de la matrice INSTAGENE (BIO-RAD), en suivant les instructions du fabricant.
La PCR est réalisée à l'aide du GENEAMP PCR SYSTEM 9600 (PΕRKIN ΕLMΕR) et d'amorces obtenues par les techniques classiques de synthèse oligonucléotidique. La séquence des différentes amorces utilisées est présentée dans le tableau I ci-dessous, dans lequel les positions dans SIL0157 sont relatives à la séquence du
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Les couples d'amorces suivants : P388C/P388D, P 388F/P388D et P388F/P388G sont utilisés dans un volume réactionnel de 50 μl contenant 200 μM de chacun des désoxynucléotides (dNTP), 600 nM de chacune des amorces, 5 μl de tampon 10X GENE AMP (PERKTN ELMER), 2,5 UI à 'AMPLI TAQ GOLD (PERKIN ELMER) et 3 μl (environ lO ng) d'ADN bactérien purifié. L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 10 min est suivie de
35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94°C pendant 25 s, une étape d'hybridation des amorces à 71°C, pendant 30 s et une étape d'extension à 72°C, pendant 30 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72°C pendant 10 min. Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 2 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) et visualisés sous une lampe à ultraviolet. L'échelle de
1 kb (BIOLABS NEW ENGLAND) ou le marqueur de poids moléculaire VI (ROCHE
MOLECULAR) sont utilisés comme marqueur de taille.
La taille des fragments attendus par amplification d'un STEC de sérotype O157:H7 (figure 1) ou bien d'une souche d 'E. coli non pathogène de type K12, avec les différents couples d'amorces, est présentée dans le tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Figure imgf000021_0001
2. Etude de la spécificité des couples d'amorces P388C/P388D, P388F/P388D et P388F/P388G a) couple d'amorces P388C/P388D
Dans une première série d'expériences, le couple P388C/P388D a été utilisé dans les conditions d'amplification décrites ci-dessus. Les résultats obtenus avec les 211 souches testées sont les suivants : un produit de 300 pb est amplifié dans toutes les souches de STEC de sérotype 0157, aucun produit n'est amplifié dans la majorité des souches de colibacilles productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes (STEC-non 0157) aucun produit n'est amplifié dans les souches d 'E. coli de sérotype 0157 non productrices de shiga-toxines (O157-non STΕC), - aucun produit n'est amplifié dans les bactéries d'autres espèces, en particulier Hafnia alvei et Citrobacter.
Les résultats obtenus montrent que le couple d'amorces utilisé permet de détecter spécifiquement les STΕC de sérotype 0157. En outre, l'utilisation de cette méthode de détection évite les problèmes de réactions croisées des sérums anti-0157 avec les antigènes & Hafnia alvei ou de Citrobacter, observées avec les méthodes immunologiques
(ELISA).
Il a également été observé que lorsque la température d'hybridation du couple d'amorce P388C/P388D était abaissée jusqu'à 60°C, un produit d'amplification était observé dans les souches d'E. coli de sérotype suivant (055, 077, 079, 145 et O127:H6). b) couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G
Pour augmenter la spécificité de la détection des STEC de sérotype 0157, deux autres amorces ont été testées : l'amorce P388F dont la position est interne au fragment de 300 pb amplifié à l'aide des amorces P388C/P388D, et l'amorce P388G, située en 5' de cette séquence (Tableau I et figure 1). Ces amorces ont été sélectionnées de façon à ce que les amorces P388F, P388G et P388D qui sont utilisées en couple (P388F/P388D et P388F/P388G) aient des températures de fusion proches.
Les mêmes 211 souches de bactéries ont été testées avec les 2 couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G et les résultats obtenus avec ces souches sont illustrés dans les 2 premières colonnes des Tableaux III, IV et V ci-dessous.
TABLEAU
Figure imgf000023_0001
souches guéries du plasmide de 60 MDa TABLEAU IV :
Figure imgf000024_0001
a : 2 souches sur 3 sont des EPEC b : les 3 souches sont des EPEC c :1 souche sur 2 est une souche d'E. coli entéroaggrégative d : Cette souche est la souche de référence des EPEC e : cette souche est un EPEC
TABLEAU V :
Figure imgf000024_0002
Ces résultats montrent que : toutes les souches de colibacilles productrices de shiga-toxines de sérotype 0157 (56 souches de STEC de sérotype 0157 testées dont 38 souches de sérotype O157:H7 incluant 4 souches guéries du plasmide de 60 Mda, 1 souche de sérotype O157:H" et 17 autres souches de STEC de sérotype 0157 (5 O157:NM (Non Mobile) et 12 0157 :ND (Non Déterminé)] sont amplifiés par les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G. En outre, l'observation d'un produit d'amplification dans les souches d'E. coli O157:H7 guéries du plasmide de 60 MDa confirme également la localisation chromosomique du locus
- les souches de colibacilles productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes (30 sérotypes différents testés sur un total de 93 souches) ne sont pas amplifiés avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G. En particulier les sérotypes 0145, 077 et 079 qui sont amplifiés avec les amorces P388C/P388D ne sont pas amplifiés avec ces deux couples d'amorces.
- aucune des souches de sérotype 0157 non productrices de shiga-toxines (44 souches testées) n'est amplifiée avec les couples d'amorces P388F/P388D et
P388F/P388G, 7 souches de 3 autres genres bactériens dont celles qui donnent des réactions croisées avec 0157 par les techniques immunologiques (Citrobacter et Hafnia alvei) ne sont pas amplifiées avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, les souches d'E. coli de sérotype 055 (STΕC et non-STΕC) sont également amplifiées avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, ce qui s'explique par l'origine clonale des sérotypes 055 et 0157 qui a été clairement démontrée
(FΕNG et al, 1998, J. Infect. Dis, 177 : 1750-1753 ; WHITTAM et al, 1993, Infect.
I mun, 61 : 1619-1629). les souches d'E. coli non productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes (non-STΕC et non-0157 ; 5 sérotypes testés sur un total de 8 souches) ne sont pas amplifiés par les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, à l'exception d'O127:H6 qui est amplifié avec le couple P388F/P388G mais pas avec le couple
P388F/P388D.
L'ensemble des résultats démontre que les deux couples d'amorces P388F/P388G et P388F/P388D permettent de détecter l'ensemble des souches de colibacilles productrices de shiga-toxines • de sérotype 0157. Le couple P388F/P388D présente cependant une spécificité plus élevée que le couple P388F/P388G.
EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA CONSERVATION DU SITE D'INSERTION DU LOCUS SIL0157 DANS E. COLI ET MISE EN EVIDENCE D'UN LOCUS HOMOLOGUE DANS LE GROUPE DES COLIBACILLES
ENTEROPATHOGENES (EPEC)
1. Analyse de la conservation du site d'insertion du locus SILoι-;7 dans E. coli
La conservation du site d'insertion du locus SIL0157 a été étudiée par PCR dans les 211 souches de bactéries analysées à l'exemple 2, à l'aide des 3 couples d'amorces suivants : les couples P388L/P388M et P388P/P388D qui amplifient respectivement les jonctions gauches et droites du locus SIL0157 et le couple P388P/P388L qui amplifie un produit de 682 pb dans toutes les souches d'E. coli non pathogènes comme la souche K12 (Figure 1).
Les réactions sont préparées selon le protocole décrit à l'exemple 1 et l'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 10 min est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94°C pendant 40 s, une étape d'hybridation des amorces à 65°C, pendant 40 s et une étape d'extension à 72°C, pendant 50 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72°C pendant 10 min. Les séquences des amorces utilisées et la taille des fragments attendus avec les STΕC-O157 ou avec la souche E. coli Kl 2 sont présentées respectivement dans les tableaux VI et VII ci-dessous. Dans le tableau VI les positions dans SIL0157 sont relatives au fragment de de 5478 pb (SEQ ID NO: 1) et les positions dans E. coli Kl 2 sont relatives à la séquence Genbank U82664.
TABLEAU VI :
Figure imgf000026_0001
TABLEAU VII
Figure imgf000026_0002
Les résultats sont illustrés dans les 3 dernières colonnes des tableaux III, IV et V. Les résultats obtenus montrent qu'en utilisant des durées d'élongation courtes (40s) pour le couple P388P/P388L, aucun produit d'amplification n'est observé dans toutes les souches de colibacilles producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157, et que la majorité des autres souches sont identiques à la souche d'E. coli Kl 2 dans la région des minutes 9 à 11 et ne contiennent pas le locus SILoιs7- Cependant, quelques souches testées ont un profil d'amplification particulier :
1) Les souches de sérotype 055 (STΕC et non-STΕC), la souche de sérotype 079 (STΕC) et une souche de sérotype 077 (STΕC) ont un profil analogue à celui des STΕC de sérotype 0157 ce qui suggère la présence, dans ces souches d'un locus homologue au SIL 157, inséré entre les positions 93849 et 93848 du génome d 'E. coli., en référence au génome d'E. coli non-pathogène de type K12 (Genbank U82664)
Néanmoins, à l'exception des souches de colibacilles de sérotype 055, qui du fait de leur parenté avec le sérotype 0157 sont amplifiées par les amorces P388F/P388D et P388F/P388G, le locus homologue au SIL0157, présent dans les colibacilles de séroytype 079 et 077 n'est pas amplifié par les amorces P388F/P388D et P388F/P388G. En conséquence, la présence d'un locus homologue à SIL0157 dans ces colibacillles n'empêche pas la détection spécifique des STEC de sérotype 0157 à l'aide des amorces P388F/P388D et P388F/P388G.
2) 2 souches de sérotype 077 (STEC), 3 souches de sérotype 0145 (STEC) et une souche d'EPEC (O127:H6) donnent des résultats négatifs avec les 3 couples d'amorces ce qui indiquent qu'elles possèdent, inséré dans cette même région, un locus dont la séquence diffère de façon significative de celle du SIL0157.
Figure imgf000027_0001
La souche d'EPEC E2348/69 (0127: H6) a été amplifiée à l'aide du couple d'amorces P388P/P388L, dans les conditions suivantes qui permettent d'amplifier des produits de grande taille : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 10 min est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94°C pendant 25 s, une étape d'hybridation des amorces à 62°C, pendant 25 s et une étape d'extension à 72°C, pendant 2 min 15 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72°C pendant 7 min. La souche d'E. coli O157.Η7 (souche ΕDL 933) est utilisée comme témoin positif de l'amplification.
Les produits obtenus ont été hybrides avec une sonde dénommée sonde FD, correspondant au produit d'amplification de la souche O157:H7 à l'aide des amorces P388F et P388D, dans les conditions décrites à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont les suivants : - un produit d'amplification de 682 pb qui n'hybride pas avec la sonde FD est observé avec les souches qui ne possèdent pas de locus inséré entre les minutes 9 et 11 du génome d 'E. coli non pathogènes,
- un produit d'amplification de 3316 pb, hybridant avec la sonde FD est observé avec la souche O157:H7 et - un produit d'amplification de taille légèrement supérieure à 3316 pb, hybridant avec la sonde FD est observé avec la souche O127:H6.
Ces résultats démontrent que la souche d'ΕPΕC O127.Η6 contient un locus homologue au locus SIL0157.
Ils démontrent également que le locus SIL0157 isolé dans la souche ΕDL933 de STΕC-O157:H7 est présent dans :
- tous les colibacilles producteurs de shiga-toxines de sérotype 0157,
- des souches d'E. coli pathogènes de sérotype 055 (STΕC ou ΕPΕC) ; ce qui s'explique par l'origine clonale des sérotypes 055 et 0157, et
- dans d'autres sérotypes de STΕC, notamment dans les colibacilles producteurs de shiga-toxines de sérotype 077, 079 et 0145.
La présence du locus SIL0157 ou d'un locus homologue inséré entre les positions 93848 et
93849 du génome d 'E. coli (en référence au génome d'E. coli non pathogènes de type
K12,Genbank U82664) constitue donc un nouveau moyen de détecter spécifiquement des souches d 'E. coli pathogènes et notamment l'ensemble des STΕC-O157. EXEMPLE 4: PRODUCTION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE IHPl
La protéine de membrane externe IHPl a été produite sous la forme d'une protéine recombinante taggée avec un épitope 6X-Histidine en C-terminal, et purifiée selon les étapes décrites ci-après. Le gène codant pour la protéine IHPl a été amplifié avec les amorces suivantes :
PQP1 (SEQ ID NO: 25) :
5' MTTTCACACAGAATrCATTA GAGGAGA TTMGCATGAAMCTGTAMœTAœT^ et PQP3 (SEQ ID NO: 26) :
Figure imgf000028_0001
qui portent respectivement dans leurs régions 5' les sites de restriction EcoRl et BgUl (indiqués en caractères gras).
La réaction PCR est effectuée dans un volume de 100 μl contenant 3 μl d'ADN de STΕC O157:H7 (ΕDL 933), 10 μl de tampon 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.85 (20°C), 250 mM KC1, 50 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4), 200 μM de chaque dNTP, 600 nM de PQP1 et PQP3, et 2,5 U d'ADN polymérase PWO.
L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 30 cycles alternant une étape de dénaturation à 94°C pendant 40 s, une étape d'hybridation des amorces à 57°C pendant 40 s et une étape d'extension à 72°C, pendant 50 s. Un étape finale d'extension est effectuée à
72°C pendant 10 min.
Le produit d'amplification obtenu et le vecteur d'expression PQΕ70 (QIAGΕN) ont été digérés avec les enzymes de restriction EcoRl et Bgïïl et ligaturés, de façon à obtenir le plasmide pSP46 contenant la phase ouverte de lecture de IHPl sous le contrôle du promoteur fort et inductible de PQΕ70.
Après transformation, une souche d'E. coli M15[pRΕP4] (QIAGΕN) portant le plasmide recombinant pSP46 a été sélectionnée. La séquence nucléotidique de l'insert de pSP46 a été confirmée par séquençage. L'expression de la protéine IHPl fusionnée à l' épitope 6XHis (IHP1-
6Xhis) est fortement induite par l'IPTG lors de la culture de la souche de E. coli M15[pRΕP4] portant le plasmide pSP46. La purification de IHPl-6Xhis a été réalisée avec le NI-NTA agarose dans des conditions dénaturantes en suivant le protocole recommandé par QIAGEN, à la différence que 18 mM d'imidazole et 0,1% de Triton ont été ajoutés dans les tampons utilisés, pour améliorer la qualité de la purification de IHPl-6XHis.
La protéine purifiée IHPl-6XHis peut être détectée par western-Blot à l'aide d'anticorps anti-PentaHis
La protéine IHPl-6XHis peut être utilisée pour immuniser des animaux, et produire des anticorps spécifiques de la protéine IHPl, en vue de la détection immunologique des STEC de sérotype 0157.

Claims

REVENDICATIONS
1) Molécule d'acide nucléique issue d'une souche pathogène d'E. coli, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une molécule d'acide nucléique représentant un locus inséré dans le génome de ladite souche pathogène, à l'emplacement dudit génome correspondant à celui situé chez E. coli K12, entre les positions 93848 et 93849 de la séquence GenBank U82664 ; b) une molécule d'acide nucléique comprenant la molécule a) définie ci- dessus, et entre 1 et 2500 pb de la séquence en amont du site d'insertion de ladite molécule, et/ou entre 1 et 2500 pb en aval du site d'insertion de ladite molécule. c) une molécule d'acide nucléique constituant un fragment d'au moins
15 pb, de préférence d'au moins 25 à 30 pb, de la molécule a) ci-dessus ; d) une molécule d'acide nucléique constituant un fragment d'au moins 15 pb, de préférence d'au moins 25 à 30 pb, de la molécule b) ci-dessus, ledit fragment comprenant au moins une portion de la molécule a) et au moins une portion de la séquence en amont du site d'insertion de ladite molécule a), ou au moins une portion de la séquence en aval du site d'insertion de ladite molécule- a).
2) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite bactérie pathogène est choisie parmi les Escherichia coli STΕC de sérotype 0157, 077, 079, ou 0145, les Escherichia coli STΕC ou ΕPΕC de sérotype 055, et les Escherichia coli ΕPΕC de sérotype 0127.
3) Molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences : SΕQ ID NO: 1, SΕQ ID NO: 2, SΕQ ID NO: 11 à SΕQ ID NO: 17, SΕQ ID NO: 19, SΕQ ID NO: 21 et SΕQ ID NO: 23. 4) Molécule d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement en conditions stringentes avec une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 4, choisie parmi les oligonucléotides P388L (SΕQ ID NO: 3), P388M (SΕQ ID NO: 4), P388G (SΕQ ID NO: 5), P388D (SΕQ ID NO: 6), P388F (SΕQ ID NO: 7), P388C (SΕQ ID NO: 8) et P388P (SΕQ ID NO: 9).
6) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 5 pour le dépistage d'E. coli pathogènes.
7) Procédé de dépistage d'E. coli pathogènes, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence dans le génome des bactéries E. coli présentes dans l'échantillon à tester, d'un locus inséré à l'emplacement dudit génome correspondant à celui situé chez E. coli K12, entre les positions 93848 et 93849 de la séquence GenBank U82664. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces comprenant une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en amont de la position 93848 de la séquence GenBank U82664, et une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E . coli définie par la séquence de 2500 pb en aval de la position 93849 de la séquence GenBank U82664.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on utilise le couple d'amorces P388L/P388P.
10) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces s'hybridant avec des séquences internes d'une molécule a) selon la revendication 1.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on utilise un couple d'amorces choisi parmi l'utilisation des couples d'amorces suivants : P388C/P388D, P388F/P388D, P388F/P388G. 12) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un couple d'amorces comprenant une amorce s'hybridant avec une séquence interne d'une molécule a) telle que définie ci-dessus, et une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en amont de la position 93848 de la séquence GenBank U82664, ou une amorce s'hybridant avec la région du génome d'E. coli définie par la séquence de 2500 pb en aval de la position 93849 de la séquence GenBank U82664.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit couple d'amorces est choisi parmi P388P/P388D et P388L/P388M.
14) Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre pour la détection d'E. coli de sérotype 0157 productrices de shiga- toxines
15) Protéine codée par un cadre ouvert de lecture présent sur une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, et notamment sur une molécule issue d'une souche d'E. coli de sérotype 0157 productrice de shiga-toxines. 16) Protéine selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les protéines IHPl IHP2, IHP3, et IHP4 de séquences respectives
SΕQ ID NO: 18, 20, 22 et 24.
17) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une protéine selon une quelconque des revendications 15 ou 16. 18) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, codant une protéine ou un peptide selon une quelconque des revendications 15 à 17. 19) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 17, 19, 21 et 23.
20) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule d'acide nucléique codant une protéine selon une quelconque des revendications 18 ou 19 placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
21) Vecteur d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 18, ou 19, ou une cassette d'expression selon la revendication 20. 22) Cellule transformée par au moins un vecteur selon la revendication 21.
23) Anticorps, dirigé contre une protéine ou un peptide selon une quelconque des revendications 15 à 17.
24) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon une quelconque des revendications 15 à 17 pour la détection de souches d'E. coli pathogènes. 25) Utilisation d'un anticorps selon la revendication 23 pour la détection de souches d 'E. coli pathogènes.
26) Utilisation selon une quelconque des revendications 6, 24, ou 25, caractérisée en ce que lesdites souches d'E. coli pathogènes sont des souches d'E. coli de sérotype 0157 productrices de shiga-toxines, 27) Utilisation selon une quelconque des revendications 6, ou 24 à 26, caractérisée en ce que la recherche de souches d'E. coli pathogènes est effectuée dans un produit alimentaire.
28) Utilisation selon une quelconque des revendications 6, ou 24 à 26, caractérisée en ce que la recherche de souches d'E. coli pathogènes est effectuée dans un échantillon de fécès.
29) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide selon une quelconque des revendications 15 à 17 pour la préparation d'un vaccin.
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