WO2002006307A1

WO2002006307A1 - Fk228 reduit et son utilisation

Info

Publication number: WO2002006307A1
Application number: PCT/JP2001/005954
Authority: WO
Inventors: Hidenori Nakajima; Akito Tanaka; Minoru Yoshida; Sueharu Horinouchi
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2000-07-17
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2002-01-24
Also published as: DE60137932D1; EP1302476B1; US20040053820A1; EP1302476A4; ES2321584T3; JP4810784B2; ATE425177T1; EP1302476A1; US7056884B2

Description

明細書

還元型 F K 2 2 8およびその用途

技術分野

本発明は、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性を有する化合物ならびにその用途に関する。

背景技術

ヒストンデァセチラーゼは、活性中心に Z nを配位したメタ口脱ァセチル化酵素である（M. S. Finnin ら， Nature 401, 188-193 (1999)) 。本酵素は、各種ァセチル化ヒストンの D N Aに対する親和性を変化させると考えられている。これによってもたらされる直接的な生物現象は、クロマチン構造変化である。クロマチン構造の最小単位は、ヒストン 8量体（H 2 A、 H 2 B、 H 3及び H 4、各 2 分子、コアヒストン）に、 1 4 6 b pの D N Aが 1 . 8回左卷きに卷き付いたヌクレオゾームである。コアヒストンは、各ヒストンタンパク質の N末の正電価が D N Aと相互作用することにより、ヌクレオソ一ム構造を安定化している。ヒストンのァセチル化は、ヒストンァセチルトランスフェラ一ゼの関与するァセチル化反応とヒストンデァセチラ一ゼの関与する脱ァセチル化反応の平衡関係により調節されている。ヒストンのァセチル化は、ヒストンタンパク質 N末の進化的に良く保存されたリジン残基において起こり、これにより、コアヒストンタンパク質は、 N末の電価を失い、 D N Aとの相互作用が減弱され、ヌクレオゾームの構造が不安定になると考えられている。従って、ヒストンの脱ァセチル化は、この逆、すなわちヌクレオゾーム構造の安定化に向かうと考えられている。しかしながら、ァセチル化が、どの程度クロマチン構造を変化させるのか、また、それによって 2次的に誘導される転写調節等とどの様に関係しているのかについては、不明な点が多い。

一方、式（IV)

で表される化合物（以下 9 0 1 2 2 8物質ともいう）は、ヒストンデァセチラーゼを選択的に阻害することにより、強力な抗腫瘍活性を誘導することが報告されている。さらに当該物質は、処理した細胞にヒストンの高ァセチル化を引き起こし、結果として、各種遺伝子の転写調節活性、細胞周期阻害活性及びアポト一シス阻害活性を誘導する（特公平 7— 6 4 8 7 2号公報、 H. Nakajima ら， Ex p. Cell Res. 241, 126-166 ( 1998)) 。現在までに各種の天然物由来のヒストンデァセチラーゼ阻害剤が報告されているが、 F R 9 0 1 2 2 8物質は、ヒストンのァセチル化と発現する生物現象とを結びつけ、且つ臨床上でもその有用性が支持される最初の薬剤である。 F R 9 0 1 2 2 8物質は、分子内にジスルフイド結合を有する。

本発明の目的は、より強力なヒストンデァセチラーゼ阻害活性を有する化合物ならびに当該化合物からなるヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤を提供することにある。さらに本発明の別の目的は、当該ヒストンデァセチラーゼ阻害活性を有する化合物の医薬としての用途を提供することにある。

発明の開示

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、 F R 9 0 1 2 2 8 物質のジスルフィド結合を還元しチオール体とすることによって、より強いヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性が得られることを見出し、さらに当該化合物の医薬としての有用性を見出して本発明を完成するに至った。即ち本発明は下記の通りである。

(1) 式（I)

(式中 R¹およびはそれぞれ同一または異なって水素原子またはチオール保護基である）で表される化合物またはその塩。

(2) R¹および R²がそれそれ水素原子である上記（1) 記載の化合物またはその塩。

(3) 式（II)

(II)

(式中 R¹および R²はそれそれ水素原子である）で表される化合物（以下 FR1 35313物質ともいう）である、上記（2)記載の化合物またはその塩。 (4) 式（III)

で表される化合物（以下 FK 228ともいう）におけるジスルフイド結合を開裂する工程を含む、上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩の製造方法。

(5) 式 (III)化合物が、式 (IV)

で表される化合物（以下 FR 901228物質ともいう）である、上記（4)記載の製造方法。

(6) 式（IV)化合物を生産しうるクロモバクテリゥム属に属する菌株を水性栄養培地中で好気性条件下に培養し、当該化合物を回収する工程および該回収した式（IV)化合物におけるジスルフィド結合を開裂する工程を含む、上記（5)記載の製造方法。

(7) 上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩からなるヒストンデァセチラーゼ阻害剤。

(8) 有効成分として、上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病 (APL)、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療または予防用の医薬組成物。

(9) 有効成分として、上記（1) ~ (3) のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

(10) 医薬である上記（9) 記載の導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

(11) 医薬が遺伝子治療用である上記（10) 記載の導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

(12) 医薬的に有効量の、上記（1) ~ (3) のいずれかに記載の化合物またはその塩を患者に投与することを含む、腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病 (APL)、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療方法または予防方法。

(13) 医薬的に有効量の、上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩を患者に投与することを含む、導入遺伝子の発現増強方法または再活性化促進方法。

(14) 患者への投与が遺伝子治療において実施されるものである、上記（1 3) に記載の方法。

(15)腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病 (APL)、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療または予防用医薬組成物の製造のための、上記（1)〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩の使用。

(16) 導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤の製造のための、上記 (1) 〜（3) のいずれかに記載の化合物またはその塩の使用。

(17)導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤が遺伝子治療に使用されるものである、上記（16) に記載の使用。

' 発明の詳細な説明

本発明は、下記式（ I )

(式中 R¹および R²はそれそれ同一または異なって水素原子またはチオール保護基である）

で表される化合物またはその塩を提供する。好ましくはおよび: R²はともに水素原子であり、より好ましくは下記式

で表される F R 1 3 5 3 1 3物質である。

上記定義およびそれらの好ましい実施態様の詳細を、以下に詳細に説明する。本明細書中で用いられる用語「低級」は、他に示されない限り、 1〜6の炭素原子を意味する。

本発明において、適切なチオール保護基は通常当分野で用いられるものであり、以下のものが挙げられる：任意に置換基を有するベンジル基 [置換基としては低級アルコキシ（例えばメトキシ等）、ァシルォキシ（例えばァセトキシ等）、ヒドロキシ、ニトロ等が挙げられる] 、ビコリル、ピコリル一 N—ォキシド、アントリルメチル、ジフエニルメチル、フエニル、 t—プチル、ァダマンチル、ァシルォキシメチル（例えばビバロイルォキシメチル、第 3級プトキシルボニルォキシメチル等）等のチォェ一テルを形成してチオール基を保護するもの；低級アルコキシメチル（例えばメトキシメチル、イソブトキシメチル等）、テトラヒドロビラニル、ベンジルチオメチル、フエ二ルチオメチル、チアゾリジン、ァセトアミドメチル、ベンズアミドメチル等のモノチォ、ジチォあるいはァミノチオアセタールを形成してチォ一ル基を保護するもの；

第 3級ブトキシカルボニル（B O C ) 、ァセチルおよびその誘導体、ベンゾィルおよびその誘導体等のチォエステルを形成してチオール基を保護するもの；力ルバモイル、フヱニルカルバモイル、低級アルキル力ルバモイル（例えばメチルカルバモイル、ェチルカルバモイル等）等の力ルバミン酸チォエステルを形成してチオール基を保護するもの；

等が例示されるが本発明はこれらに何ら限定されるものではない。より具体的には PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Second Edition, T.W. Greene, P. G.M.Wuts WILEY-INTERSCIENCE に記載されている各保護基が好適に用いられる _c 上記式（ I ) の化合物は、不斉炭素原子および二重結合に基づく光学異性体または幾何異性体等の立体異性体を有することがあるが、これらすベての異性体及びそれらの混合物もこの発明の範囲に含まれる。さらに、式（ I ) 化合物は塩を形成することができ、これもまた本発明に包含される。当該塩は生物学的に許容される通常無毒の塩であり、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩）、有機塩基との塩（例えばトリェチルァミン塩、ジイソプロビルェチルァミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノ

—ルァミン塩、ジシクロへキシルァミン塩、 Ν'， Ν'—ジペンジルエチレンジァミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸もしくはスルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸 (例えばアルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩または酸付加塩が例示される。加えて、それらの溶媒和化合物

(例えば包接化合物（例えば水和物等））もまた、本発明に包含される。

本発明の式（ I ) 化合物は、式（I I I) で表される化合物（F K 2 2 8 ) のジスルフイド結合が開裂したものであって、いわゆる還元型 F K 2 2 8、あるいは

F K 2 2 8チオール体と称することができる（以下、一連の本発明化合物を総称して F Κ 2 2 8チオール体ともいう）。

本発明はまた、本発明の F K 2 2 8チオール体の製造方法を提供する。本発明の: F K 2 2 8チオール体の製造方法は、 F K 2 2 8のジスルフィド結合を開裂する工程を含むことを特徴とする。当該結合の開裂は、得られる FK 228チォール体のヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性に不利な影響を及ぼさない範囲内で当分野で公知の方法を用いて、また必要に応じて適当に改変することによって行なうことができる。

より具体的には当該ジスルフィド結合の開裂は、一般的にメルカプトエタノール、チォグリコール酸、 2—メルカプトェチルァミン、ベンゼンチオール、パラチォクレゾ一ル、ジチオスレィトール等の通常ジスルフィド結合を有するタンパク質の還元処理に用いられるチオール化合物の使用が例示される。好ましくはメルカプトエタノールならびにジチオスレィトールである。過剰なチオール化合物は透析やゲルろ過等により除去することができる。チオール化合物以外に、電気分解、テトラヒドロホウ酸ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、亜硫酸塩等を用いてもよい。

上記還元処理は、用いる還元剤の種類に応じて適宜、公知の手法により行なう例えばメルカプトエタノールゃジチオスレィトールを用いる場合には、当該試薬を FK 228に添加し室温〜加温下で、 15分〜一晚、好ましくは室温で一晩反応させる（生物化学実験法 8、 SH基の化学修飾、石黒正桓著、学会出版セン夕一、 IV，ジスルフイド結合の化学修飾；生物化学実験法 10、 SH基の定量法、松本博、国則登代著、学会出版センター、 III， SS結合の還元、等を参照）。本発明の FK 228チオール体の出発原料となる化合物、すなわち FK 228 またはその塩は、公知の物質であり、入手可能である。例えば、 FK 228の立体異性体の一つである FR 901228物質は、それを生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株を好気性条件下に培養、当該培養ブロスから当該物質を回収することによって得ることができる。 FR 901228物質を生産しうるクロモバクテリゥム属に属する菌株としては、例えばクロモバクテリゥム . ビオラセゥム WB 968 (FERM BP— 1968) が挙げられる。 FR 901228 物質はより具体的には特公平 7— 64872号公報に記載のとおりにして当該生産菌から得ることができる。 FR901228物質は、より容易に入手できるという点で、 F R 9 0 1 2 2 8物質を生産しうるクロモバクテリゥム属に属する菌株からの回収が好ましいが、さらなる精製工程が不要あるいは少なくてすむという点で、合成あるいは半合成の F R 9 0 1 2 2 8物質もまた有利である。また、 F K 2 2 8は、従来公知の方法により半合成、全合成する'ことができる。より具体的には Khan W.Li ,らによって報告されている方法（J. Am. Chem. Soc .， vol .

118, 7237-7238 ( 1996 ) ) に準じて製造することができる。

本発明の F K 2 2 8チオール体の別の態様は、 R¹およびまたは R²がチォ一ル保護基である化合物である。当該化合物は、 R ¹および R²が水素原子である本発明化合物にチオール保護基を導入することにより調製することができる。

本反応で用いられるチオール保護基の適切な導入剤は、導入する保護基に応じて適宜選択されるが、一般的に用いられるもの、例えば対応する保護基の塩化物 (例えばべンジルクロリド、メトキシペンジルクロリド、ァセトキシベンジルク口リド、ニトロべンジルクロリド、ビコリルクロリド、ピコリルクロリドー N— ォキシド、アントリルメチルクロリド、イソブトキシメチルクロリド、フエニルチオメチルクロリド等）やアルコール類（ジフエニルメチルアルコール、ァダマンチルアルコール、ァセトアミドメチルアルコール、ベンズアミドメチルアルコール等）、ジニトロフエニル、イソプチレン、ジメトキシメタン、ジヒドロビラン、クロロギ酸— t —ブチル等が例示される。

この反応は、使用する保護基導入剤に応じて適宜従来知られた手法あるいはそれらを適当に組み合わせて実施することができる。さらに当該保護基の脱保護も当業者には公知の技術である (PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Seco nd Edition, T.W. Greene, P. G.M.Wuts WILEY-INTERSCIENCE) 。具体的に一例を挙げると、導入剤がベンジルクロリドの場合、 2 N水酸化ナトリウムおよびエタノールの存在下、 3 0分間、 2 5 °Cで反応させることにより当該チオール基を保護し、ナトリウムおよびアンモニアの存在下で 1 0分間処理することにより脱保護することができる。

本発明の F K 2 2 8チオール体は、ヒトをはじめサル、マウス、ラット、ゥサギ、プ夕、ィヌ、ゥマ、ゥシ等種々の哺乳動物において強力なヒストンデァセチラーゼ阻害活性を有し、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤として有用である。

さらに、本発明の F K 2 2 8チオール体を含有する医薬組成物は、そのヒストンデァセチラーゼ阻害活性により、異常な遺伝子発現により引き起こされる疾患 (例えば、炎症性障害、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病（A P L ) 、原生動物感染など）のための治療薬および予防薬として有用である。さらに、本発明の医薬組成物は、抗腫瘍剤および免疫抑制剤（これは、以下に例示する臓器移植拒絶および自己免疫疾患を防止する）として有用である。より具体的には以下の疾患が対象となる。

臓器または組織（例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、滕臓、小腸、肢、筋肉、神経、椎骨間円板、気管、筋芽細胞、軟骨など）の移植による拒絶反応；

骨髄移植後の移植片対宿主反応；

自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺腫、多発性硬化症、重症筋無力症、 I型糖尿病など）；

病原性微生物 (例えば、ァスペルギルス · フミガーヅス、フザリウム■才キシスポルム、トリコフィトン 'ァステロイデスなど）により引き起こされる感染；炎症性または過剰増殖性皮膚障害または免疫仲介型疾患の皮膚兆候（例えば、乾癬、アトピ一性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、水疱性天疱瘡、表皮水疱瘡、尊麻疹、血管性浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、エリテマトーデス、にきび、および円形脱毛症）；

眼の自己免疫疾患（例えば、角結膜炎、春季カタル、ベーチェット病に付随するブドウ膜炎、角膜炎、ヘルぺス性角膜炎、円錐角膜炎、角膜表皮ジストロフィー、角膜白斑、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレイヴス眼障害、フォーグトー小柳—原田症候群、角結膜乾燥（ドライアイ）、小フリクテン、虹彩毛様体炎、サルコィド一シス、内分泌眼障害など）；

可逆的閉塞性気道疾患 [喘息（例えば、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、およぴ麈埃喘息）、特に慢性または難治性喘息（例えば、後期喘息および気道過敏症）、気管支炎など]；

粘膜または血管の炎症（例えば、胃潰瘍、虚血性または血栓性の血管障害、虛血性腸疾患、腸炎、壊死性腸炎、熱による火傷に関連する消化管の損傷、ロイコトリエン B 4仲介型疾患）；

消化管の炎症/アレルギー（例えば、腹腔の疾患、直腸炎、好酸性胃腸炎、肥胖細胞症、クロ一ン病、および潰瘍性大腸炎）；

胃腸管から離れた症候性発現を伴う食物関連アレルギー性疾患（例えば、偏頭痛、鼻炎、および湿疹）；

腎臓疾患（例えば、間隙性腎炎、グッドパスチヤ一症候群、溶血性尿毒症症候群、および糖尿病性腎障害）；

神経疾患（例えば、多発性筋炎、ギラン一バレ一症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発性神経炎、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化（A L S ) 、および神経根障害）；

脳虚血性疾患（例えば、頭部損傷、脳内における出血（例えば、くも膜下出血、脳内出血）、脳血栓、脳塞栓症、心停止、卒中、一過性脳虚血発作（T I A) 、および高血圧性脳障害）；

内分泌疾患（例えば、甲状腺機能亢進症、およびバセドウ病）；

血液疾患（例えば、赤芽球ろう、再生不能性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、顆粒球減少症、悪性貧血、巨大赤芽球貧血、および赤血球形成不全）；

骨疾患（例えば、骨粗鬆症）；呼吸器疾患（例えば、サルコィドーシス、肺線維症、および特発性間隙性肺炎）；

皮膚疾患（例えば、皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光線過敏症、および皮膚 T細胞リンパ腫）；

循環器疾患（例えば、動脈硬化、ァテローム性動脈硬化、大動脈炎症候群、結節性多発性動脈炎、および心筋症）；膠原疾患（例えば、強皮症、ヴヱーゲナー肉芽腫、およびシヱーグレン症候群）；

脂肪症；

好酸性筋膜炎；

歯周組織疾患（例えば、歯肉、歯周組織、歯槽骨、またはセメント質への損腎炎性症候群（例えば、糸球体腎炎）；

男性型脱毛症、老人性脱毛症；

筋ジストロフィー；

膿皮症およびセザリー症候群；

染色体異常関連疾患（例えば、ダウン症候群）；

アジソン病；

活性酸素媒介疾患 [例えば、臓器損傷（例えば、保存、移植、または塞栓症、心筋梗塞などの虚血疾患に関連する、臓器（例えば、心臓、肝臓、腎臓、消化管など）の虚血性循環障害；

腸管の疾患（例えば、エンドトキシンショック、偽膜性大腸炎、および薬物または放射線により誘発される大腸炎）；

腎臓疾患（例えば、虚血性急性腎機能不全、慢性腎不全）；

肺疾患（例えば、肺の酸素または薬物（例えば、パラコート、ブレオマイシンなど）により引き起こされる中毒、肺ガン、および肺気腫）；

眼の疾患（例えば、白内障、鉄貯蔵疾患（眼球鉄症）、網膜炎、色素沈着、老人斑、硝子体瘢痕、角膜のアルカリ火傷）；

皮膚炎（例えば、多形性紅斑、免疫グロプリン A水疱性線状皮膚炎、セメント皮膚炎） ] ；

ならびに他の疾患（例えば、歯肉炎、歯周炎、敗血症、滕臓炎、および環境汚染 (例えば、大気汚染）、加齢、発ガン物質、癌腫の転移、および高山病により引き起こされる疾患）；ヒスタミン遊離またはロイコトリエン C 4遊離により引き起こされる疾患；脈管形成後の冠状動脈再狭窄および外科手術後の癒着の防止；

自己免疫疾患および炎症性症状（例えば、原発性粘膜浮腫、自己免疫萎縮性胃炎、早発の閉経、男性不妊、若年性糖尿病、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感神経性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎、特発性白血球減少症、活性慢性肝炎、特発性肝硬変、円板状エリテマトーデス、自己免疫精巣炎、関節炎（例えば、変形性関節症、または多発性軟骨炎）；

ヒト免疫不全ウィルス（H I V) 感染、 A I D S ；

アレルギー性結膜炎；

外傷、火傷、または外科手術による、肥大性瘢痕およびケロイド。

さらに、本発明の F K 2 2 8チオール体は、そのヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性により、導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤としても有用である本発明において、導入遺伝子の発現増強とは、ヒトをはじめ、マウス、ラット、ブ夕、ィヌ、ゥマ、ゥシ等各種の動物細胞に、遺伝子工学的手法により導入される外来遺伝子の寄主細胞中での発現を増強することを意味する。当該導入遺伝子の発現増強は、細胞レベル（すなわちインビトロ）で行われるものであっても、動物レベル（すなわちインビボ）で行われるものであってもよい。好ましくはィンビボで行われる。

ここでインビボ、インビトロとは通常、当分野で用いられている用語どおりであり、すなわち、「インビボ」とは、対象とする生体の機能や反応が生体内で発現される状態を意味し、「インビトロ」とは当該機能や反応が試験管内（組織培養系、細胞培養系、無細胞系等）で発現されることを意味する。

本発明において、導入遺伝子の再活性化とは、ヒトをはじめ、マウス、ラット、ブ夕、ィヌ、ゥマ、ゥシ等各種の動物細胞に遺伝子工学的手法により導入された外来遺伝子の発現抑制 (サイレンシング) の解除を意味し、本発明は当該再活性化を促進することができる。さらに本発明はサイレンシングの解除以外に一定レベルで安定的に発現している導入遺伝子に対しても転写活性を促し、その発現を増強させることができる。このような効果も本発明の「導入遺伝子の再活性化」に包含される。当該導入遺伝子の再活性化促進は、細胞レベル（すなわちインビトロ）で行われるものであっても、動物レベル（すなわちインビボ）で行われるものであってもよい。好ましくはィンビボで行われる。

当該外来遺伝子の導入は、当分野で公知の手法を用いて行うことができる。例えば、物理的な方法による D N Aの導入（マイクロインジェクション法、エレクトロポレーシヨン法等）、化学的な方法による D N Aの導入（リン酸カルシウム法、 D E A Eデキストラン法等）、生物学的な方法（レトロウイルスやアデノウィルスといったウィルスベクタ一等）の他、 HVJ—リボソーム法等の新しい手法も好適に利用することができる。

本発明の F K 2 2 8チオール体またはその塩を医薬として用いる場合には、活性成分としての F K 2 2 8チオール体またはその塩を、経口または非経口適用に適した有機または無機の担体または賦形剤との混合物として含有する固体、半固体または液体形態の医薬組成物の形で使用できる。該活性成分は、例えば、散剤、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル剤、スプレー剤、その他の使用に適した形態用の、通常の、無毒性で、医薬として許容しうる担体と混ぜ合わせることができる。更に、必要ならば、助剤、安定剤、増粘剤等を使用してもよい。これらの担体、賦形剤は必要に応じて無菌化処理を施したものを使用してもよく、また製剤化した後に無菌化処理を行うこともできる。 F K 2 2 8チオール体またはその塩は、導入遺伝子の発現増強あるいは再活性化が必要とされる状態に対して所望の効果を生じるのに十分な量を当該発現増強剤や再活性化促進剤に含ませればよい。特に、本発明の発現増強剤や再活性化促進剤を遺伝子治療に使用する場合には、非経口的投与、即ち静脈内投与、筋肉内投与、組織内直接投与、鼻腔内投与、皮内投与、髄液内投与、胆管内投与、膣内投与等が好ましく、また、導入遺伝子の発現や再活性化が要求される部位や器官に直接投与し得るリボソーム法等も好適に使用することができる。

活性成分である F K 2 2 8チオール体またはその塩の治療上有効な用量は、処置すべき個々の患者の年齢および疾患、また、導入遺伝子の発現増強剤あるいは再活性化剤として使用する場合には当該導入遺伝子の種類や、当該遺伝子の発現増強や再活性化促進を必要とする疾患の種類によっても相違し、またそれらに依存して決定される。

本発明の F K 2 2 8チオール体またはその塩を有効成分として含有する医薬の投与方法も、所望とする効果が得られれば、特に限定されず、例えば、経口、非経口的に 1日 1回から数回にわたって投与することができる。特に遺伝子治療に使用する場合には、その使用の特殊性を考慮して、導入遺伝子の発現、再活性化に最も適した投与方法を適宜選択して使用する。例えば、腫瘍に対する遺伝子治療の場合、腫瘍細胞への直接投与（例えばリボソーム法）が好ましい。

本発明の導入遺伝子の発現増強剤ならびに再活性化促進剤は、導入遺伝子の発現を増強させること、ならびに発現抑制にある導入遺伝子の、その抑制を解除することを特徴とするものであり、当該効果は、導入遺伝子との相互作用が重要な要因となる。したがって、導入遺伝子の投与と、本発明の発現増強剤または再活性化促進剤の対象への投与（インビボ、インビトロ）は、所望の効果に応じて適宜決定される。例えば導入遺伝子の発現増強を目的とする場合には、当該導入遺伝子の投与と同時に、あるいは投与後に本発明の導入遺伝子発現増強剤を投与することが好ましい。一方、既に導入された遺伝子の再活性化の促進を目的とする場合には、導入遺伝子の投与後、再活性化が必要な時に本発明の導入遺伝子再活性化促進剤を投与することが好ましい。導入遺伝子の投与後に本発明の導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤を投与する場合、その投与のタイミングは、所望とする効果やその程度、先に導入された遺伝子の発現状況（発現の程度や導入遺伝子の存在場所等）に応じて適宜決定される。

本発明の導入遺伝子の発現増強剤ならびに再活性化促進剤は特に遺伝子治療に好適に使用することができる。例えば癌に対する遺伝子治療としては、自殺遺伝子の導入や D N Aワクチン等が挙げられる。自殺遺伝子の導入としては、抗癌剤

5—フルォロシトシン（ 5— F C ) の抗癌活性体への変換酵素であるシトシンデアミナーゼ遺伝子の癌細胞への導入が挙げられ、当該遺伝子の癌細胞内での発現を本発明により増強させることができる（癌細胞特異的に 5— F Cを効率的に活性体に変換することにより抗腫瘍効果を誘導する）。 D N Aワクチンとしては、癌細胞で特異的に発現している癌抗原遺伝子が挙げられ、当該遺伝子を癌患者に導入することにより、あるいは発現抑制されている内因性癌抗原遺伝子の再活性化により、また、あるいはその両方により、癌抗原遺伝子の機能発現を増強させることによって患者の癌免疫を高めることができる。

癌に対する遺伝子治療においては、他に p 5 3遺伝子や、サイトカイン遺伝子 (例えば I L 2、 I L 1 2遺伝子）、アンチセンス遺伝子（K一 r a sアンチセンス）等を用いることができる。また、嚢胞性線維症の遺伝子治療としては C F T R遺伝子を、血友病の遺伝子治療としては凝固因子遺伝子を使用することがでぎる。

実施例

以下、本発明を製造例ならびに実験例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

製造例： F R 1 3 5 3 1 3の製造

FR901228 FR135313

^2₄H₃₆N₄0₆o₂

^2₄h3₈N₄0₆S₂

Mol. Wt., 540.70

Mol. Wt, 542.71 特公平 7— 6 4 8 7 2号公報の記載に準じて単離、精製された F R 9 0 1 2 2 8を出発物質として用いた。 FR 90 1228 ( 5 1.6mg、 9 δ, πιο 1) , 水（40ml) およびァセトニトリル（ 10ml) の混合物に、ジチオスレィトール（412mg、 2.6 6mmo 1) を添加し、室温で一晩放置した。蒸留によりァセトニトリルを除去した後、該混合物を分取 H PLCで精製した（洗浄は 20 %ァセトニトリル/ 0.05%トリフルォロ酢酸水溶液で、溶出は 50%ァセトニトリル/ 0.05 %トリフルォロ酢酸水溶液でそれぞれ行なった）。

目的化合物を含有する画分を回収し、凍結乾燥して FR 135313を粉末として得た（ 14.8mg、収率 28.7%)

iH— NMR(500MHz, DMF-d_v) δ： 9.35 (1H， br s, 交換可能）， 8.15 (IH, br d, J=9Hz, 交換可能）， 8.01 (IH, br d, J=7Hz, 交換可能）， 6.83 (IH, d, J=7 Hz, 交換可能）， 6.81 (IH, q, J=7Hz), 5.72 (IH, m), 5.61-5.54 (2H, m), 4.6 0(1H, dd, J=10Hz, 5Hz), 4.55 (1H， m), 4.15 (1H， dd, J=9Hz₃ 8Hz)， 2.97-2. 88 (2H, m)， 2.73-2.63 (2H， m)， 2.55 (2H， m), 2.44 (IH, t， J=8Hz, 交換可能）， 2.34-2.27 (3H, m), 2.20 (IH, m)， 2.08 (IH, t, J二 8Hz, 交換可能）， 1.7 2 (3H, d, J=7Hz), 0.98 (3H, d, J=7Hz), 0.95 (3H, d, J=7Hz)₅ 0.88 (3H, d, J=7Hz), 0.87 (3H, d, J=7Hz)

MS m/e 654 (M+TFA)

目的化合物の純度は、下記条件下で H P L Cによって確認した。

HPL C条件

カラム： YMC- PACK ProC18 (YMC Co., Ltd)、 4. 6x150mm

溶出： 50 %ァセトニトリル/ 0. 05 %トリフルォロ酢酸水溶液

流速 : 1ml /分

検出： 2 14 nm、 254 nm

保持時間： 4. 0 1分（出発物質の FR 901228物質の保持時間は 4. 27 分）

実験例：ヒストンデァセチラーゼ活性の測定

製造例 1で合成した FR 135313物質のヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性を調べた。

1. 実験材料 ·実験方法

( 1 ) 細胞

マウス乳腺癌 FM 3 Aは、横浜市立大学医学部鮎沢大博士より分与された。本細胞は、 2%の FB Sを含む E S培地（Flow laboratories社、以後 E S培地と呼ぶ）で、 37°C、 5%C0₂存在下で継代培養した。

( 2 ) 薬剤

酪酸ナトリウムは和光純薬社より、 [³H]酢酸ナトリウムは Amersham社よりそれそれ購入した。

(3) 緩衝溶液等

リシスバッファ一（p H 6. 5 ) ： 10 mM T r i s— H C 1 (Sigma社）、 5 OmM重亜硫酸ナトリゥム（半井化学社）、 1 %T r i t 0 nX— 100 (半井化学社）、 10mM 塩化マグネシウム（半井化学社）、 8. 6%シュクロ一ス（半井化学社）

洗浄バッファー（pH 7. 4) ： 1 OmM Tr i s— HC1、 13 mM ED T A (Sigma社）

HDAバッファ一（pH7. 5) : 15mM リン酸カリウム（半井化学社）、 5%グリセロール、 0. 2mM EDTA

(4) [³H] ァセチル化ヒストンの調製

ヒストンデァセチラ一ゼの基質とする [³H] ァセチル化ヒストンは、 lx

10⁸個の；FM3A細胞（50mlの E S培地に懸濁）を 0. SmCiZmlの [³H] 酢酸ナトリウムと 5mMの酪酸ナトリウムの存在下で、 37°C：、 5%C 0₂存在下で 30分間培養し、以下に記した方法で直ちに、処理細胞よりヒストン画分を抽出することにより調製した。放射特異活性は 0. 45 Ci/mgヒストンであった。

(5) 細胞よりのヒストンタンパク質の抽出

培養細胞からのヒストンタンパク質の抽出は、吉田らの方法に従って行なった (M. Yoshida ら、 J. Biol. Chem. 265, 17174-17179 (1990)) 。 lxl 0⁸個の [³H] 酢酸ナトリゥムで標識した FM 3 A細胞を回収し、 PB Sで 1回洗浄した。洗浄した細胞を lmlの氷冷したリシスバッファ一に懸濁し、ダウンスホモジナイザーで破砕した。 1000回転で 10分間遠心して核を集めた後、リシスバッファ一で 3回、続いて洗浄バヅファーで 1回洗浄した。残渣を 0. lmlの氷冷した蒸留水に懸濁し、これに最終濃度 0. 4規定になるように濃硫酸（和光純薬社）を加え、 4°Cで 1時間放置した。微量遠心機で 15, 000回転、 5分間遠心し、上清を採取し、これに lmlのァセトンを加え、一晩— 20 °Cに放置した。沈殿物を微量遠心機で 15 , 000回転、 1◦分間遠心して回収し乾燥させた。

(6) 細胞からの粗ヒストンデァセチラ一ゼの抽出

マウスヒストンデァセチラ一ゼは、 FM 3 A細胞より粗精製した。 8L容のスピナ一培養瓶で懸濁培養した: F M 3 A細胞（ E S培地 4 Lに 1 X 10⁶個/ m 1 の濃度）を、遠心にて回収し、 40mlの HDAバッファーに懸濁した。細胞をダウンスホモジナイザーで破砕した後、細胞核を 35， O O Oxgで 10分間遠心することにより回収し、 1 M硫安溶液 20ml中にてさらに破砕した。白濁した破砕液を、超音波処理し、遠心することにより透明な抽出液とし、それに硫安を添加し、硫安濃度を 3. 5Mまで上昇させることにより、ヒストンデァセチラ —ゼを沈殿させた。沈殿を 10mlの HD Aバッファ一に溶解し、同バッファ一 4 Lに対して透析した。透析物は、 HDAバッファーで緩衝化した。 DEAE— セルロース（DE 52、 25x85 mm、 Whatman社）に付し、 300mlの N a C 1のリニア一グラジェント（0— 0. 6M) で溶出した。ヒストンデァセチラーゼ活性は、 0. 2— 0. 3 Mの N a C 1溶出区にシングルピークの活性として溶出された。本精製により、ヒストンデァセチラ一ゼは約 60倍の比活性に精製された。

(7) インビトロヒストンァセチル化反応

4〃1の [³H] ァセチル化ヒストン（2500 cpm/5〃g) と 96 zl の粗ヒストンデァセチラ一ゼ画分を混和し、これに種々の最終濃度になるように、上記製造例に従って調製した FR 135313物質のエタノール溶液 1 1を加え、 37°Cで 10分間反応させた。反応は 1 O zlの濃塩酸を加えることにより停止させ、放出された [³H]酢酸を lmlの酢酸ェチルで抽出し、その 0. 9 m 1を 5 m 1のトルエンシンチレ一シヨン溶液に添加し放射活性を測定した。 (8) 結果

還元体（チオール体）である FR 135313物質は、 I C₅。値で 1 ng/m 1以下のヒストンデァセチラ一ゼの阻害活性を示した。

チオール基は強力なキレ一ト作用を有し、従って還元環境下でチオール体となつた FR901228物質は、メタ口酵素であるヒストンデァセチラ一ゼに指向することによって、当該酵素の活性を阻害していると考えられる。

産業上の利用可能性

FK 228の還元体（チオール体）である式（I) 化合物、特に FR901 228物質の還元体（チオール体）である FR 135313物質、またはそれらの塩は強力なヒストンデァセチラーゼ阻害活性を有し、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害剤、および炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病 (APL)、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の予防■治療剤、さらには導入遺伝子の発現増強剤 ·再活性化促進剤として有用でめる。

チオール基の活性を調節することにより、ヒストンデァセチラ一ゼ阻害活性を調節することができ、従って種々の臨床的応用に適した医薬の開発が可能となる < 本発明は、日本で出願された特願 2000- 216584を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . 式（I )

(式中！^および R²はそれそれ同一または異なって水素原子またはチオール保護基である）で表される化合物またはその塩。

2 . R¹および R²がそれそれ水素原子である請求の範囲 1に記載の化合物またはその塩。

3 . 式（II)

o

HN〖

T ヽ

NH

(II) (式中 R¹および R²はそれそれ水素原子である）で表される化合物である、請求の範囲 2に記載の化合物またはその塩。

4. 式（III)

で表される化合物におけるジスルフィド結合を開裂する工程を含む、請求の範囲 1 ~ 3のいずれかに記載の化合物またはその塩の製造方法。

5. 式 (III) 化合物が、式 (IV)

で表される化合物である、請求の範囲 4に記載の製造方法。

6. 式（IV) 化合物を生産しうるクロモバクテリゥム属に属する菌株を水性栄養培地中で好気性条件下に培養し、当該化合物を回収する工程および該回収した式

( IV) 化合物におけるジスルフィド結合を開裂する工程を含む、請求の範囲 5記載の製造方法。

7 . 請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の化合物またはその塩からなるヒストンデァセチラーゼ阻害剤。

8 . 有効成分として、請求の範囲 1 ~ 3のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病 (APL )、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療または予防用の医薬組成物。

9 . 有効成分として、請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む、導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

1 0 . 医薬である請求の範囲 9に記載の導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

1 1 . 医薬が遺伝子治療用である請求の範囲 1 0に記載の導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤。

1 2 . 医薬的に有効量の、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の化合物またはその塩を患者に投与することを含む、腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病（APL)、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療方法または予防方法。

1 3 . 医薬的に有効量の、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の化合物またはその塩を患者に投与することを含む、導入遺伝子の発現増強方法または再活性化促進方法。

1 4 . 患者への投与が遺伝子治療において実施されるものである、請求の範囲 1 3に記載の方法。

1 5 . 腫瘍、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病合併症、ホモ接合サラセミア、線維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病（APL )、臓器移植拒絶または自己免疫疾患の治療または予防用の医薬組成物の製造のための、請求の範囲 1〜3のいずれかに記載の化合物またはその塩の使用。

1 6 . 導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤の製造のための、請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の化合物またはその塩の使用。

1 7 . 導入遺伝子の発現増強剤または再活性化促進剤が遺伝子治療に使用されるものである、請求の範囲 1 6に記載の使用。