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WO2002000836A2 - Variants de spinigerine, un peptide antibacterien et antifongique derive de pseudacanthotermes spiniger, leur procede de preparation et les compositions les contenant - Google Patents

Variants de spinigerine, un peptide antibacterien et antifongique derive de pseudacanthotermes spiniger, leur procede de preparation et les compositions les contenant Download PDF

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WO2002000836A2
WO2002000836A2 PCT/FR2001/002100 FR0102100W WO0200836A2 WO 2002000836 A2 WO2002000836 A2 WO 2002000836A2 FR 0102100 W FR0102100 W FR 0102100W WO 0200836 A2 WO0200836 A2 WO 0200836A2
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peptide
antibacterial
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Philippe Bulet
Jules Hoffmann
Mireille Lamberty
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Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs-
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Definitions

  • the present invention relates to new peptides having antibacterial and antifungal properties.
  • the invention also relates to the preparation of these peptides and the compositions containing them which can be used in agriculture and in human or animal therapy.
  • the production of antimicrobial peptides represents, in a wide variety of animal and plant species, an essential immune defense mechanism against infections. In particular, insects have a very effective resistance against bacteria and fungi. This response is largely based on the rapid synthesis of several families of antimicrobial peptides with a broad spectrum of activity. This synthesis is induced by a septic injury or by the injection of a small dose of bacteria.
  • insect antimicrobial peptides have been mainly characterized from insects having a complete metamorphosis during development, for example Diptera, Lepidoptera and Coleoptera.
  • insect antimicrobial peptides induced in these insects the following four groups can be distinguished:
  • - Cationic peptides of 4 Da forming two amphipathic ⁇ helices.
  • cecropins are particularly classified.
  • - Cationic peptides rich in proline of size between 2 kDa and 4 kDa which may be glycosylated, such as for example, drosocin, pyrrhocoricin, and lebocins, or non-glycosylated such as, for example, apidaecins and metalnikins .
  • polypeptides having a molecular weight of 8 to 27 kDa, for the most part cationic and frequently rich in glycine residues such as for example attacines, sarcotoxins II, diptericins and coleoptericin.
  • amino acids are represented by their one-letter code, but they can also be represented by their three-letter code according to the nomenclature below.
  • spinigerin corresponds to the formula below also given in the annex under the number ID NO: 1.
  • This molecule does not contain cysteine residues.
  • the Applicant has studied the spatial conformation of the molecule and the mutations capable of being made on its sequence so as to increase its bactericidal and / or fungicidal properties.
  • the subject of the present invention is therefore a peptide of sequence (I) as follows: ⁇ i ⁇ 2 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ e ⁇ 7 ⁇ 8 ⁇ ⁇ io ⁇ n ⁇ 12 ⁇ 13 ⁇ 14 ⁇ 15 ⁇ ie ⁇ i7 ⁇ is ⁇ 19 ⁇ 20 ⁇ 21 ⁇ 22 ⁇ 23 ⁇ 24
  • - ⁇ is a negatively charged or polar / broad amino acid
  • ⁇ is an amino acid chosen from glycine, serine, lanine or threonine
  • the peptides of formulas (I) advantageously exhibit an alpha helical conformation.
  • ⁇ ' ⁇ and ⁇ are chosen so that said peptides of formula (I) have such a conformation.
  • Fragments of the above sequence are understood to mean a peptide consisting of at least 10 and preferably at least 20 successive amino acids of the said sequence.
  • the invention more particularly contemplates a peptide of formula (I) above, including a group of 1 to 4 amino acids at one and / or the other of the N and / ends or C terminales is deleted.
  • Such peptides are those in which one or more of the amino acids ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 22, ⁇ 23, ⁇ 24, or ⁇ 25 are absent.
  • the invention more particularly contemplates a peptide of formula above in which the amino acids ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 and / or ⁇ 22, ⁇ 23, ⁇ 24, ⁇ 25 are absent, and therefore corresponding to the following formulas: ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ s ⁇ 9 ⁇ lO ⁇ l1 ⁇ l2 ⁇ l3 ⁇ 14 ⁇ 15 ⁇ l ⁇ ⁇ l7 ⁇ l8 ⁇ l9 ⁇ 20 21 ⁇ 22 3LZ ⁇ 24 ⁇ 25 (II) ⁇ l ⁇ 2 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 5 6 ⁇ 7 ⁇ 8 ⁇ 9 ⁇ l0 ⁇ l1 ⁇ l2 ⁇ l3 ⁇ 14 ⁇ 15 l6 ⁇ l7 ⁇ l8 ⁇ l9 ⁇ 20 ⁇ 21 (III) ⁇ ⁇ 5 ⁇
  • basic amino acid those chosen from arginine, lysine or histidine
  • - hydrophobic amino acid those chosen from valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine , or tryptophan
  • - negatively charged or polar / broad amino acid those chosen from aspartic acid, glutamic acid, asparagine, or glutamine.
  • a preferred example of a peptide according to the invention has the following sequence ID NO: 1: HVDKKVADKVLLLKQLRIMRL LTRL or a fragment thereof as defined above, and more particularly the sequences SEQ ID NO: 2, 3, 4 below: KVADKVLLLKQLRIMRLLTRL (SEQ ID NO: 2)
  • HVDKKVADKVLLLKQLRIMRL (SEQ ID NO: 3) KKVADKVLLLKQLRIMRL (SEQ ID NO: 4)
  • the peptides of the invention can be prepared by chemical synthesis or by genetic engineering.
  • the invention also relates to functional equivalents of the above peptides, the amino acid sequences of which include deletions, additions and / or conservative modifications at the level of one or more amino acids, since these deletions, additions and / or modification do not modify the antimicrobial activity of the peptide from which they originate, and for example not the alpha helix structure. Mention may in particular be made of the modifications resulting from the post-translational processes such as glycosylation or the degeneration of the genetic code, or else chemical modifications such as amidation, acetylation, acylation, coupling with lipids or sugars, coupling with nucleotides, etc.
  • the functional equivalents also include peptides of the invention in which one or more of the amino acids of the amino acids are enantiomers, diastereoisomers, natural amino acids of D conformation, rare amino acids including hydroxyproline, methyllysine, dimethyllysine and synthetic amino acids, including ornithine, norleucine, cyclohexylalanine and omega-a inoacids.
  • the invention also covers retropeptides and retro-inversopeptides.
  • Another subject of the invention is the use of the above peptides or analogues thereof, for preventing or treating a fungal or bacterial infection both in humans and animals and in plants.
  • the subject of the invention is therefore a composition, more particularly antibacterial or antifungal, comprising as active agent at least one peptide as defined above, advantageously combined in said composition with an acceptable vehicle.
  • the vehicle is chosen according to the type of application of the composition for pharmaceutical or agronomic purposes.
  • the invention relates in particular to pharmaceutical applications in humans and animals of these peptides and of compositions containing them, but it is also interested in agronomic applications.
  • the peptides of the invention are useful for making plants resistant against diseases, in particular fungal and bacterial.
  • a first form of implementation of this agronomic application consists in applying to plants an effective amount of peptide or of a composition containing them.
  • a second form of implementation of this agronomic application consists in transforming plant cells or plants with a nucleic acid sequence capable of expressing the peptide of the invention so as to confer on plants resistance to diseases.
  • Example 1 Materials and Methods Used for the Purification and Identification of Spinigerin.
  • Pseudacantho terme s spiniger (Order of isoptera, family of Termitidae, subfamily of Macrotermitinae). These insects come from a breeding carried out at the Joint Research Unit of the CNRS "development, Chemical communication", Dijon.
  • the extraction of antimicrobial compounds was carried out from whole insects which were frozen in liquid nitrogen.
  • the termites (200) were reduced to a fine powder in a mortar containing liquid nitrogen.
  • the peptides were extracted at pH3 with 100 ml of trifluoroacetic acid (TFA, 0.1%) containing aprotinin (10 ⁇ g / ml final concentration) as a protease inhibitor and phenylthiouree (20 ⁇ M final concentration) as melanization inhibitor.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the extraction was carried out in an ice-water bath with gentle agitation for 30 minutes.
  • Step 2 The second purification step was carried out on an Aquapore OD-300 analytical column (220 x 4.6 mm, Bro nlee TM). The elution was carried out using a biphasic gradient of acetonitrile in acidified water, from 2 to 18% for 10 min and from 22 to 42% for 100 min with a flow rate of 0.8 ml / min.
  • Step 3 The fraction containing the antimicrobial molecule was purified to homogeneity using a narrow bore C 18 column in reverse phase (Delta Pak HPIC 18 , 2x 150 mm, Waters TM). The column was equilibrated in acidified water and developed with the same linear gradient of acetonitrile as that described above in step 2.
  • the peptide sequences are analyzed according to the Edman degradation sequencing method using an Applied Biosystems 473A sequencer.
  • the molecule of molecular mass 2649.5 Da corresponds to that of 3000.7 Da devoid of the three residues of the amino-terminal end of the peptide.
  • the sequencing of a neighboring fraction (Fraction F2) containing a molecule of molecular mass 2516.2 Da made it possible to determine a third form of the peptide corresponding to the molecule of molecular mass 3000.7 Da devoid of the four carboxy-terminal amino acids. All of these results are reported in Table 1 below. Table 1
  • Example 2 synthesis of synthetic spinigerin.
  • the peptides according to the invention can also be obtained according to a FMOC chemical synthesis process (Atherton and Sheppard RC (1989), Solid Phase Peptide Synthesis (IRL, Oxford, UK). The chemical synthesis was carried out for spinigerin (HVDKKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL).
  • the peptide obtained has the same chromatographic properties as the native molecule. The mass measured is identical to that of the native molecule.
  • the synthetic molecule has the same antibacterial activity as the native molecule on the bacterium Micrococcus luteus.
  • the method was used for the detection of antimicrobial molecules during the various purification stages, for the determination of the spectrum of activity of the peptide and for the determination of the minimum concentration.
  • inhibitor MIC
  • the MIC was expressed as a concentration range [a] - [b] where [a] was the minimum concentration where growth began and [b] the concentration for which no growth was observed .
  • Examples of the specific activity of spinigerin vis-à-vis filamentous fungi and yeasts are given in Tables 2 and 3 below.
  • the bacteria are as follows: - Gram positive: B a c i 1 l u s megateri ⁇ m,
  • Gram negative Escheri chi a coli D22, Es cheri ch i a c o l i SBS 363, Kl ebsi el l a pneumoniae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa.
  • the antifungal activity was detected by a growth inhibition test in liquid medium.
  • the spores of the fungi to be tested were suspended in a “Potato-Glucose” type culture medium.
  • a “Potato-Glucose” type culture medium Preferably, 12 g of Potato Dextrose Broth medium (Difco) are used per 1 1 of demineralized water.
  • Two antibiotics were added to the culture medium: tetracycline (final concentration of 10 ⁇ g / ml) and cefotaxime (100 ⁇ g / ml).
  • 10 ⁇ l of each fraction to be analyzed are deposited in microtitration plates in the presence of 90 ⁇ l of culture medium containing the spores (at a final concentration of 10 4 spores / ml).
  • the incubation was carried out in a humid chamber at 30 ° C for 48 hours.
  • the fungal growth was observed under a light microscope after 24 h and quantified after 48 hours by measuring the absorbance at 600 nm using a microtiter plate reader spectrophotometer.
  • the different yeast strains were incubated in a culture medium of the "Sabouraud" type and incubated at 30 ° C for 24 h with slow shaking.
  • filamentous fungi and yeast that have been used are:
  • Aspergillus fumiga tus gift from Dr H. Koenig, Hôpital civil, France
  • Nectria haema tococca Fusari um culmorum, Tri choderma viride (mycotheque of the Catholic University of Leuven, Belgium); Neurospora crassa, Fusarium oxysporum, (mycotheque of the cios Clause, Paris); Candida albicans (donation from Dr H. Koenig, Hôpital civil, France).

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Abstract

La présente invention a pour objet des peptides de formule: β1 ζ2 υ3 β4 β5 ζ6 σ7 υ8 β9 ζ10 ζ11 ζ12 ζ13 β14 υ15 ζ16 β17 ζ18 ζ19 β20 ζ21 ζ22 σ23 β24 ζ25 dans laquelle: β est un acide aminé basique, ζ est un acide aminé hydrophobe, υ est un acide aminé chargé négativement ou de nature polaire/large, σ est un acide aminé choisi parmi la glycine, la sérine, l'alanine ou la thréonine. L'invention concerne aussi des compositions antibactériennes ou antifongiques pour être utilisées chez l'homme, l'animal ou les plantes comprenant au moins desdits peptides.

Description

PEPTIDES ANTIBACTERIENS ET ANTIFONGIQUES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT.
La présente invention à pour objet de nouveaux peptides ayant des propriétés antibactériennes et antifongiques. L'invention concerne également la préparation de ces peptides et les compositions les contenant utilisables en agriculture et en thérapie humaine ou animale. La production de peptides antimicrobiens représente, chez une grande variété d'espèces animales et végétales, un mécanisme essentiel de défense immunitaire contre les infections. En particulier, les insectes présentent une résistance très efficace contre les bactéries et les champignons . Cette réponse repose pour une large part sur la synthèse rapide de plusieurs familles de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité. Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par l'injection d'une faible dose de bactéries. A ce jour, les peptides antimicrobiens d'insectes ont été surtout caractérisés à partir d'insectes ayant une métamorphose complète pendant le développement, par exemple les diptères, lépidoptères et coléoptères . Parmi les peptides antibactériens induits chez ces insectes, on peut distinguer les quatre groupes suivants :
- Des peptides cationiques de 4 Da, formant deux hélices α amphipathiques . Dans ce groupe, on classe en particulier les cécropines . - Des peptides cationiques riches en proline, de taille comprise entre 2 kDa et 4 kDa qui peuvent-être glycosylés, comme par exemple, la drosocine, la pyrrhocoricine, et les lébocines, ou non glycosylés comme par exemple, les apidaecines et les métalniko ines . - Plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaires de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme par exemple les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines et la coléoptéricine.
- Des peptides comprenant des ponts disulfures intramoléculaires . Dans ce groupe, on classe les défensines d'insecte 4 kDa, 3 ponts disulfure) , la drosomycine (4 kDa, 4 ponts disulfure) et la thanatine (2 kDa, 1 pont disulfure) .
Dans les séquences peptidiques rapportées ci- après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci- dessous .
A Ala alanine
C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gin glutamine
R Arg arginine
S Ser serine
T Thr threonine
V Val valine
W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine Peu de travaux ont été entrepris à ce jour sur les insectes à métamorphose incomplète, en particulier les polyneopteres. Or il a précisément maintenant été isolé, à partir d'un insecte à métamorphose incomplète, le termite Pseudacantho termes spiniger, un peptide, qui présente des caractéristiques remarquables ainsi que des propriétés antibactériennes et antifongiques .
Ce peptide qui sera aussi désigné ci-après « spinigérine » répond à la formule ci-dessous aussi donnée en annexe sous le numéro ID NO :1.
H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L
Cette molécule, de taille réduite, ne comporte pas de résidus cystéine. La Demanderesse a étudié la conformation spatiale de la molécule et les mutations susceptibles d'être réalisées sur sa séquence de façon à augmenter ses propriétés bactéricides et/ou fongicides. La présente invention a donc pour objet un peptide de séquence (I) suivante : βi φ2 θ3 β4 βδ φe σ7 θ8 βθ φio φn Φ12 Φ13 β 14 Θ15 φie βi7 φis Φ19 β 20 Φ21 Φ22 σ23 β 24
ou un fragment de celle-ci, dans laquelle :
- β est un acide aminé basique,
- φ est un acide aminé hydrophobe,
- θ est un acide aminé chargé négativement ou de nature polaire/large, σest un acide aminé choisi parmi la glycine, la serine, l' lanine ou la threonine,
Les peptides de formules (I) présentent avantageusement une conformation en hélice alpha. Ainsi, β ' θ et σsont choisis de façon à ce que lesdits peptides de formule (I) présentent une telle conformation.
On entend par fragments de la séquence ci- dessus, un peptide constitués d'au moins 10 et de préférence d'au moins 20 acides aminés successifs de ladite séquence. A titre d'exemple de tels fragments, l'invention envisage plus particulièrement, un peptide de formule (I) ci-dessus dont un groupe de 1 à 4 acides aminés à l'une et/ou l'autre des extrémités N et/ou C terminales est supprimé.
De tels peptides sont ceux dont un ou plusieurs des acides aminés βl, φ2 , Θ3 , φ22, σ23 , β24, ou φ25 sont absents. L'invention envisage plus particulièrement, un peptide de formule ci-dessus dont les acides aminés βl, φ2 , Θ3 et/ou φ22, σ23, β24, φ25 sont absents répondant et donc répondant aux formules suivantes : β4 βδ φθ σ θs β9 φlO Φl1 Φl2 Φl3 β 14 Θ15 φlδ βl7 Φl8 φl9 β 20 21 Φ22 3lZ β 24 φ25 (II) βl φ2 Θ3β4β5 6σ7θ8β9φl0φl1 φl2 Φl3 β 14 Θ15 l6 βl7 Φl8 φl9 β 20 φ21 (III) β β5 φδ σ7 θ8 βθ φlO Φl1 Φl2 Φl3 β 14 Θ15 φl6 βl7 Φl8 Φl9 β 20 φ21 ( IV)
On entend plus particulièrement par : acide aminé basique, ceux choisis parmi l'arginine, la lysine ou l'histidine, - acide aminé hydrophobe, ceux choisis parmi la valine, la leucine, 1 ' isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, la tyrosine, ou le tryptophane,
- acide aminé chargé négativement ou de nature polaire/large, ceux choisis parmi l'acide aspartique, l'acide glutamique, 1 ' asparagine, ou la glutamine .
Un exemple préféré de peptide selon l'invention est de séquence ID NO :1 suivante : H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L ou un fragment de celle-ci comme défini précédemment, et plus particulièrement les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 4 ci-dessous : K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L (SEQ ID NO : 2)
H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L (SEQ ID NO : 3) K K V A D K V L L L K Q L R I M R L (SEQ ID NO : 4) Les peptides de 1 ' invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par génie génétique.
L'invention concerne aussi des équivalents fonctionnels des peptides ci-dessus, dont les séquences d'acides aminés comprennent des délétions, des additions et/ou des modifications conservatives au niveau d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que ces délétions, additions et/ou modification ne modifient pas l'activité antimicrobienne du peptide dont elles sont issues, et par exemple pas la structure en hélice alpha. On peut citer notamment les modifications résultant des processus postraductionnels comme des glycosylation ou de la dégénérescence du code génétique, ou encore des modifications chimiques telles que l'amidation, 1 ' acétylation, l'acylation, le couplage avec des lipides ou des sucres, le couplage avec des nucléotides, etc....
Les équivalents fonctionnels comprennent également des peptides de l'invention dont un ou plusieurs des acides aminés des acides aminés sont des énantiomères , des diastéréoisomères , des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment 1 'hydroxyproline, la méthyllysine, la diméthyllysine et les acides aminés synthétiques, notamment l'ornithine, la norleucine, la cyclohexylalanine et les oméga-a inoacides . L'invention couvre également les rétropeptides et les rétro-inversopeptides .
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des peptides ci-dessus ou d'analogues de ceux-ci, pour prévenir ou traiter une infection fongique ou bactérienne tant chez l'homme et l'animal que chez les plantes. L'invention a donc pour objet une composition, plus particulièrement antibactérienne ou antifongique, comprenant à titre d'agent actif au moins un peptide tel que défini précédemment, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable.
Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition à titre pharmaceutique ou agronomique .
L'invention concerne tout particulièrement les applications pharmaceutiques chez l'homme et l'animal de ces peptides et des compositions les contenant, mais elle s'intéresse aussi aux applications agronomiques. En effet, les peptides de l'invention sont utiles pour rendre des plantes résistantes contre des maladies notamment fongiques et bactériennes . Une première forme de mise en œuvre de cette application agronomique, consiste à appliquer sur les plantes une quantité efficace de peptide ou d'une composition les contenant. Une seconde forme de mise en oeuvre de cette application agronomique consiste à transformer des cellules végétales ou des plantes avec une séquence d'acide nucléique capable d'exprimer le peptide de l'invention de façon à conférer aux plantes une résistance aux maladies .
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la purification et l'identification de la spinigérine, la synthèse de la spinigérine synthétique et son activité antibactérienne et antifongique.
Exemple 1 : Matériels et Méthodes utilisés pour la purification et l'identification de la spinigérine .
1) Insectes .
Toutes les expériences ont été réalisées avec de s adu l t e s e s s aimant s dé s a i l é s de l ' e spè c e Pseudacantho terme s spiniger (Ordre des isopteres, famille des Termitidae, sous-famille des Macrotermitinae) . Ces insectes proviennent d'un élevage réalisé à l'Unité Mixte de Recherche du CNRS « développement, Communication chimique », Dijon.
2 ) Extraction des peptides.
L'extraction des composés antimicrobiens a été réalisée à partir des insectes entiers qui ont été congelés dans l'azote liquide. Les termites (200) ont été réduits en fine poudre dans un mortier contenant dé l'azote liquide. Les peptides ont été extraits à pH3 par 100 ml d'acide trifluoroacétique (TFA, 0,1%) contenant de l'aprotinine (10 μg/ml concentration finale) comme inhibiteur de protease et de la phenylthiouree (20 μM concentration finale) comme inhibiteur de mélanisation . L'extraction a été réalisée dans un bain-marie à eau glacée avec agitation douce durant 30 minutes. Après centrifugation (14 000 x g durant 30 min à 6°C) , le surnageant clarifié a été directement déposé sur une cartouche Sep-Pak C18 Vac (5g de phase, Waters™) . La cartouche a été conditionnée au méthanol et équilibrée avec de l'eau acidifiée (0,05% TFA), les élutions ont été réalisées avec des solutions de 5%, 40% et 80% d' acétonitrile dans de l'eau contenant 0,05% TFA. La fraction éluée par la solution d' acétonitrile à 40% a été lyophilisée avant passage sur HPLC en phase inverse.
3 ) Purification des peptides par HPLC. - Etape 1 : La fraction Sep-Pak 40% a été soumise à une chromatographie en phase inverse sur colonne semi-préparative Aquapore RP-300 C18 (250 x 7 mm, Brownlee™) . Equilibrée avec une solution d' acétonitrile à 2% dans de l'eau acidifiée. Les fractions ont été séparées à l'aide d'un gradient linéaire de 2% à 60% d' acétonitrile dans de l'eau acidifiée en 120 min avec un débit de 1,3 ml/min. A l'issue de cette étape, on obtient plusieurs fractions représentées sur la figure 1 présentant une activité antimicrobienne sur les germes suivants : E. coli 363, Neurospora crassa, Micrococccus luteus . Les composés actifs des fractions FI et F2 ont ensuite été caractérisées .
- Etape 2 : La deuxième étape de purification a été réalisée sur colonne analytique Aquapore OD-300 (220 x 4,6 mm, Bro nlee™) . L'élution a été réalisée à l'aide d'un gradient biphasique d' acétonitrile dans l'eau acidifiée, de 2 à 18% durant 10 min et de 22 à 42 % durant 100 min avec un débit de 0,8 ml/min.
- Etape 3 : La fraction contenant la molécule antimicrobienne a été purifiée à homogénéité en utilisant une colonne narrow bore C18 en phase inverse (Delta Pak HPIC18, 2x 150 mm, Waters™) . La colonne a été équilibrée dans de l'eau acidifiée et développée avec le même gradient linéaire d' acétonitrile que celui décrit ci- dessus dans l'étape 2.
Toutes les étapes de purification à température ambiante ont été réalisées sur un système Beckman Gold HPLC équipé d'un détecteur Beckman 168 photoarray. Pour les étapes de purification sous température contrôlée, un système HPLC ail PEEK Waters (modèle de pompe Waters 626) attaché à un détecteur à absorbance variable (Waters 486) a été utilisé. Au cours des étapes de purification HPLC les molécules éluées de la colonne ont été détectées par leur absorbance à 225 nm. Les fractions ont été collectées manuellement, séchées sous vide (Speed-Vac, Savant) et reconstituées dans de l'eau MilliQ (Millipore™) avant analyse de l'activité antimicrobienne .
4) Analyse par spectrométrie de masse. Elle est réalisée selon la technique dite de mesure du temps de vol après desorption laser assistée par matrice (Technique MALDI TOF) en utilisant un spectrometre de masse Bruker (Bremen) BIFLEX.
5) Analyse des séquences.
Les séquences des peptides sont analysées selon la méthode de sequençage par dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur Applied Biosystems 473A.
6) Identification des peptides de la fraction
FI-
Malgré la présence de deux composés peptidiques, la fraction purifiée active contre les souches microbiennes Eschericia coli , Micrococcus luteus et Neurospora crassa , a été soumise au sequençage. L'analyse des signaux PTH-acides aminés a mis en évidence deux séquences, l'une correspondant à une forme tronquée de l'autre dans sa partie N-terminale. Les masses moléculaires calculées à partir des séquences obtenues sont respectivement de 2649,4 et 3000,8 Da . Elles sont en accord avec les masses moléculaires mesurées par spectrométrie de masse MALDI-TOF de 2649,5 Da et 3000,7 Da confirmant que les séquences sont complètes. La molécule de masse moléculaire 2649,5 Da correspond à celle de 3000,7 Da dépourvue des trois résidus de l'extrémité amino-terminale du peptide. Le sequençage d'une fraction voisine (Fraction F2 ) contenant une molécule de masse moléculaire 2516,2 Da a permis de déterminer une troisième forme du peptide correspondant à la molécule de masse moléculaire 3000,7 Da dépourvue des quatre acides aminés carboxy-terminaux. L'ensemble de ces résultats est rapporté dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Figure imgf000011_0001
Exemple 2 : synthèse de la spinigérine synthétique.
Les peptides selon 1 ' invention peuvent également être obtenus selon un procédé synthèse chimique FMOC (Atherton and Sheppard R.C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis (IRL, Oxford, UK) . La synthèse chimique a été réalisées pour la spinigérine (HVDKKVADKVLLLKQLRIMRLLTRL ) . Le peptide obtenu présente les mêmes propriétés chromatographiques que la molécule native. La masse mesurée est identique à celle de la molécule native. La molécule synthétique présente la même activité antibactérienne que la molécule native sur la bactérie Micrococcus luteus .
L'ensemble des tests antibactériens est réalisé avec la molécule synthétique. Cette molécule a des propriétés antibactériennes vis-à-vis des bactéries à Gram négatif et à Gram positif, des bactéries phytopathogènes et des champignons phytopathogènes .
Exempl e détec ti on de s ac t ivi tés antimicrobiennes .
La méthode a été utilisée pour la mise en évidence des molécules antimicrobiennes au cours des différentes étapes de purification, pour la détermination du spectre d'activité du peptide et pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) à laquelle le peptide a été actif. La CMI a été exprimée comme un intervalle de concentration [a] - [b] où [a] a été la concentration minimale où l'on observe un début de croissance et [b] la concentration pour laquelle aucune croissance n'a été observée. Des exemples de l'activité spécifique de la spinigérine vis-à-vis des champignons filamenteux et des levures, sont donnés dans les tableaux 2 et 3 ci-après.
1) Détection de l'activité antibactérienne.
Pour chaque souche de bactérie utilisée
(Bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif) , une colonnie isolée est mise en suspension dans 10 ml de milieu PB (Poor Broth, milieu Luria Bertani dépourvu d'extrait de levure) DIFCO et incubée à 30°C pendant une nuit sous agitation lente. Les suspensions de bactéries à tester sont ajustées à une densité optique à 600 nm de 0,001 dans un milieu de culture frais. On dépose 10 μl de chaque fraction dans des plaques de microtitration en présence de 100 μl de la suspension bactérienne. Au bout de 24 heures d'incubation à 25°C, on évalue la croissance par la mesure de l' absorbance à 600 nm à l'aide d'un lecteur de plaque de microtitration.
Les bactéries sont les suivantes : - Gram positif : B a c i 1 l u s megateriυm,
Mi crococcus l u teus , Staphyl ococcus aureus , Streptococcus pyogenes .
Gram négatif : Escheri chi a coli D22, Es ch eri ch i a c o l i SBS 363, Kl ebsi el l a pneumoniae , Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa .
La tableau 2 ci-dessous rapporte l'activité de la spinigérine contre les bactéries. Tableau 2
Figure imgf000013_0001
*ND : activité non détectée jusqu'à une concentration de 100 μM.
2 ) Test de détection d'activité contre les champignons filamenteux et contre la levure Candi da albicans .
~ L'activité antifongique a été détectée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. Les spores des champignons à tester ont été mises en suspension dans un milieu de culture de type « Pomme de terre-Glucose ». De préférence, on utilise 12 g de milieu Potato Dextrose Broth (Difco) pour 1 1 d'eau déminéralisée. Deux antibiotiques ont été rajoutés au milieu de culture : la tétracycline (concentration finale de 10 μg/ml) et la céfotaxime (lOOμg/ml) . On dépose 10 μl de chaque fraction à analyser dans des plaques de microtitration en présence de 90 μl de milieu de culture contenant les spores (à une concentration finale de 104 spores/ml) . L'incubation a été réalisée en chambre humide à 30°C durant 48 heures. La croissance fongique a été observée au microscope photonique après 24 h et quantifiée après 48 heures par mesure de l' absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration . - Les différentes souches de levure ont été mises en incubation dans un milieu de culture de type « Sabouraud » et incubée à 30°C pendant 24 h sous agitation lente. L'échantillon à tester (10 μl) a été déposé dans des puits de plaque de microtitration dans lesquels ont été ajoutés 90 μl d'une culture diluée de levure dont la densité a été ajustée à DO 600 = 0,001. On évalue la croissance par la mesure de l' absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotometre lecteur de plaque de microtitration .
Les champignons filamenteux et levure qui ont été utilisé sont les suivants :
Aspergillus fumiga tus (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg) ; Nectria haema tococca, Fusari um culmorum, Tri choderma viride (mycothèque de l'Université Catholique de Leuven, Belgique) ; Neurospora crassa , Fusarium oxysporum, (mycothèque de la Société Clause, Paris) ; Candida albicans (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg).
Le tableau 3 ci-dessous rapporte l'activité de la spinigérine contre les champignons.
Tableau 3
Figure imgf000014_0001

Claims

REVENDICATIONS
1) Peptide de séquence (I) : βl φ2 03 β4 βδ Φδ σ7 θ8 βg φlO Φl1 Φl2 Φl3 β 14 015 Φl6 βl7 Φl8 Φl9 β 20
Figure imgf000015_0001
ou un fragment de celle-ci, dans laquelle : - les acides aminés βi , β4, βs, βθ, βι , βi7, β20 et β24 sont indépendamment choisis parmi les acides aminés basiques , - les acides aminés φ2, φβ, φio φi 1 , φi2 φl3
Φ16, φi8 φi 9, Φ21 / Φ22 et Φ25 sont indépendamment choisis parmi les acides aminés hydrophobes,
— les acides aminés Θ3, 08 et Θ15 sont indépendamment choisis parmi les acides aminés chargés négativement ou de nature polaire/large, les acides aminés σ et σ23 sont indépendamment choisis parmi la glycine, la serine, 1 ' alanine ou la threonine, éventuellement l'un au moins des acides aminés βi , φ2, Θ3, φ22 (?23/ β24, ou Φ25 est absent.
/
2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une configuration en hélice alpha.
3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'un groupe de 1 à 4 acides aminés à l'une et/ou l'autre des extrémités N et/ou C terminales est supprimé.
4) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il répond à une des formules suivantes : β4 β5 φδ σ7 08 βθ ΦlO Φl1 Φl2 Φl3 βl4 θ-|5 φl6 βl7 Φl8 Φl9 β20 φ21 Φ22 σ23 β24 φ25 ( II ) βl φ2 θ3 β4 βδ Φθ σ7 θ8 βg φlO Φ 1 Φl2 Φl3 βl4015 Φl6 βl7 Φl8 Φl9 β20 φ21 ( III ) β β5 φe σ7 θs βg Φ10 φn Φ12 Φ13 βu Θ15 φie βi7 φis Φ19 β20 Φ21 ( IV) .
5) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les acides aminés basiques sont choisis parmi l'arginine, La lysine ou l'histidine.
6) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les acides aminés hydrophobes sont choisis parmi la valine, la leucine, 1 ' isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, la tyrosine, ou le tryptophane.
7) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les acides aminés chargés négativement ou de nature polaire/large sont choisis parmi l'acide aspartique, l'acide glutamique, 1 ' asparagine, ou la glutamine.
8) Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'une des séquences suivantes : H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L (SEQ ID NO : 1)
K K V A D K V L L L K Q L R I M R L L T R L (SEQ ID NO :
2)
H V D K K V A D K V L L L K Q L R I M R L (SEQ ID NO : 3)
K K V A D K V L L L K Q L R I M R L (SEQ ID NO : 4)
9) Composition antibactérienne ou antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable. 10) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une composition pour le traitement ou la prévention d'une infection fongique ou bactérienne chez l'homme ou 1 ' animal .
11) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une composition pour le traitement ou la prévention d'une infection fongique ou bactérienne chez les plantes.
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