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WO2002000872A2 - Compositions et methodes pour le traitement ou la detection de pathologies neurodegeneratives - Google Patents

Compositions et methodes pour le traitement ou la detection de pathologies neurodegeneratives Download PDF

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WO2002000872A2
WO2002000872A2 PCT/FR2001/002058 FR0102058W WO0200872A2 WO 2002000872 A2 WO2002000872 A2 WO 2002000872A2 FR 0102058 W FR0102058 W FR 0102058W WO 0200872 A2 WO0200872 A2 WO 0200872A2
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WO
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calcineurin
nucleic acid
use according
polypeptide
sequence
Prior art date
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PCT/FR2001/002058
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WO2002000872A3 (fr
Inventor
Ali AÏT IKHLEF
Annelies Resink
Fabien Schweighoffer
Original Assignee
Exonhit Therapeutics Sa
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Filing date
Publication date
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Publication of WO2002000872A3 publication Critical patent/WO2002000872A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • compositions and methods for the treatment or detection of neurodegenerative pathologies are provided.
  • the present invention relates to the field of biology, genetics and medicine. It relates in particular to new methods for the detection, characterization and / or treatment (or management) of neurodegenerative pathologies, in particular of amyotrophic lateral sclerosis.
  • the invention also relates to methods for the identification or screening of active compounds in these pathologies.
  • the invention also relates to the compounds, genes, cells, plasmids or compositions useful for the implementation of the above methods.
  • the invention describes in particular the role of calcineurin in these pathologies and its use as a therapeutic, diagnostic or experimental target.
  • Amyotrophic lateral sclerosis (SAL or ALS for Amyotrophic Lateral Sclerosis) is a neurodegenerative disease, associated with different types of inclusions such as Lewis bodies and characterized by apoptosis of spinal and cortical motoneurons, the fatal outcome of which is sometimes associated with frontal dementia.
  • Sporadic forms without any mutation described, coexist with familial forms (FALS) associated with mutations in the SOD1 gene coding for superoxide dismutase.
  • FALS familial forms
  • the majority of cases are sporadic, familial forms (FALS) being very rare. It is likely that a long asymptomatic period precedes the onset of clinical symptoms which are varied and whose classification is complex.
  • mice which express the human SOD1 gene carrying one of the mutations prevailing in FALS (mutation G93A) are available from Jackson Laboratory, subject to obtaining a license to use from NorthWestem University. This model reproduces in 120 days the fatal outcome of the disease with symptoms comparable to those of human disease.
  • the appearance of ALS symptoms linked to the G93A mutation in SOD1 is not the consequence of a reduction in superoxide dismutase activity but of a gain in function which increases the capacity of the enzyme to generate radicals free.
  • the molecular events that govern the different stages of ALS are poorly understood.
  • Identifying the different specific molecular events of the different phases of the pathology must make it possible to identify new therapeutic targets as well as new diagnostic markers.
  • One of the most effective approaches to achieve this identification is to identify genes and proteins whose expression characterizes a pathophysiological state.
  • the present invention now describes the identification of genetic events involved in the phenomena of excitotoxicity and neuronal death.
  • the present invention thus provides new therapeutic and diagnostic approaches for the pathologies associated with these phenomena, as well as new targets for the identification of active compounds.
  • RNA extracted from brain and spinal cord samples without prior isolation of the neurons was carried out using RNA extracted from brain and spinal cord samples without prior isolation of the neurons in order to take into account a maximum of alternative splicing events linked to the development of the pathology.
  • This analysis was carried out by qualitative differential screening according to the DATAS technique (described in application No. WO99 / 46403), which has unequaled advantages.
  • the present patent application stems in particular from the construction by the applicant of a directory of splicing alterations in the brains of 60 day old ALS model animals.
  • This repertoire which contains more than 200 distinct sequences, involves key players in the phenomenon of excitotoxicity such as potassium channels and the NMDA receptor.
  • Sequences derived from RNAs coding for proteins involved in the stress response, including heat shock proteins, are also part of this repertoire, highlighting the implication of this response in the early phases of ALS.
  • An alteration in energy metabolism clearly appears to affect the cortical motor neurons of animals that develop the pathology. For example, intron 6 of the mitochondrial form of creatine kinase is isolated specifically from messenger RNAs expressed under pathological conditions in animals aged 60 days.
  • RNA RNA of the calcineurin catalytic subunit.
  • This fragment corresponds to an exon fragment specifically present in the control animals and therefore specifically deleted in transgenic animals for SOD1G93A at the 60-day stage.
  • This fragment covers the nucleotides 1 348 to 1 579 referenced from the ATG.
  • This region is essentially coding and contains an auto-inhibiting domain of the enzyme located at the C-terminal end of the enzyme.
  • This short isoform is distinguished from the long form by a deletion of nucleotides 1341 to 1741 (inclusive) and therefore of amino acids 447 to 524, the calcineurin stop codon corresponding to nucleotide 1 641 (the complete calcineurin sequence and its DNA, of murine or human origin, is available on a database, in particular GeneBank).
  • the cDNA sequence coding for human calcineurin (2 119 bp) is represented on the sequence SEQ ID No. 1.
  • the protein sequence is represented on the sequence SED ID No. 2. Residues 348 to 368 of SEQ ID No.
  • sequences SEQ ID No. 3 and 4 represent, respectively, the nucleic acid sequence and the amino acid sequence of the splicing variant of calcineurin, according to the invention.
  • the deletion of nucleic acid residues 1341 to 1741 inclusive results in a deletion of the C-terminal amino acids from residue 447, and the creation of a C-terminal end of sequence KLYFGEGGD (residues 448 to 456 of SEQ ID No. 4).
  • calcineurin auto-inhibitory domain corresponds to amino acids 467 to 490 and that the absence of this domain results in constitutive activation of calcineurin.
  • Calcineurin is involved in the relay of signaling pathways which depend on calcium and calmodulin.
  • the interaction of calmodulin with calcineurin stimulates the activity of the latter.
  • Deletion of the auto-inhibitory domain of calcineurin increases the basal level of activity of this enzyme but keeps it susceptible to activation by calmodulin.
  • the present invention therefore describes an original and new molecular event (splicing), which results in constitutive activation of calcineurin and which is correlated with the phenomenon of excitotoxicity and / or neuronal death.
  • the invention also shows, for the first time, that a constitutive activation of calcineurin is associated with the early stages of ALS. Calcineurin therefore constitutes a new and important therapeutic target in the development of therapeutics for these pathologies, which can be used in particular at the early stages of their development, and which is intended for the true molecular bases of the pathology and not for the associated symptoms or immune components.
  • a first object of the invention lies more particularly in the use of a nucleic acid comprising all or part of a sequence derived from the messenger RNA of the catalytic subunit of calcineurin for the implementation of a method of diagnosing or detecting a situation of neuronal stress and more particularly the situation of excitotoxicity.
  • the invention generally resides in the use of a nucleic acid complementary to all or part of the calcineurin gene or messenger, for the detection of pathological events of the excitotoxicity, stress or neuronal death type, etc.
  • the invention is particularly intended for the detection, screening, diagnosis or characterization of an excitotoxicity associated with the early forms of neurodegenerative diseases, in particular ALS, Parkinson's disease or Alzheimer's disease.
  • nucleic acids capable of demonstrating a deleted form of the calcineurin mRNA, in particular a splicing variant, in particular, in which an auto-inhibitory domain is deleted, in particular the bases. 1341 to 1741 (or the corresponding region of the gene or human DNA).
  • the invention indeed shows the existence of splicing events affecting the calcineurin gene, associated with the development of neuronal excitotoxicity, and proposes methods of detection or screening for dysfunctions based on the demonstration of the presence of these forms spliced in biological samples.
  • the nucleic acid comprises all or part of the sequence coding the auto-inhibitory domain of calcineurin (between nucleotides 1401 and 1503 from ATG, for the murine form, or homologous residues in the human sequence , for example amino acids 467-490 of the sequence SEQ ID NO: 2), or of the sequence resulting from the junction between the non-deleted regions, or a sequence complementary to these.
  • the invention uses a nucleic acid complementary to a region included in a following sequence:
  • the complementarity is preferably perfect to ensure better specificity of hybridization. However, it is understood that certain mismatches may be tolerated.
  • the nucleic acid used for the implementation of the above methods can be DNA or RNA, preferably DNA of synthetic origin. It preferably comprises from 10 to 500 bases, typically from 10 to 100 bases. It is understood that a longer nucleic acid can be used, if desired, although this is not preferred.
  • the nucleic acid is advantageously a single-stranded DNA, from 10 to 500 bases, complementary to at least one region of the sequence coding for the autoinhibitory domain of calineurin or of the sequence resulting from splicing affecting at least part of this area.
  • the nucleic acid can be labeled, for example by radioactive, enzymatic, luminescent, fluorescent, chemical, etc.
  • a biological sample of a subject, containing a nucleic acid is brought into contact in vitro with a nucleic acid as defined above, and the formation of a hybrid.
  • the biological sample can be a sample of blood, fluid, cell, tissue, etc.
  • the nucleic acid can be immobilized on a support, of the glass, silica, nylon type, etc.
  • the invention also relates to methods of detection, assay, screening, diagnosis, etc. in vitro, using an antibody specific for a spliced form of calcineurin, for example an antibody specific for the KLYFGEGGD polypeptide region.
  • this domain is specific for a new form of calcineurin and does not exist in wild-type calcineurin. Antibodies directed against this domain therefore make it possible to demonstrate, by conventional immunological methods, the presence of a splicing variant and therefore of a predisposition or of the initiation of a phenomenon of neuronal excitotoxicity.
  • the antibodies can be prepared by any technique known to those skilled in the art.
  • An object of the invention also resides in an antibody binding a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 4.
  • the binding is preferably a selective binding, the antibody does not specifically recognize the calcineurin of sequence SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the invention resides in an antibody capable of binding the KLYFGEGGD sequence.
  • Another object of the invention is an antibody produced by immunization with a polypeptide comprising the sequence KLYFGEGGD or an immunogenic fragment thereof.
  • Antibodies can be polyclonal or monoclonal. It can also be fragments or derivatives of such antibodies, in particular fragments or derivatives of such antibodies having the same antigenic specificity, such as, for example, Fab, Fab'2, CDR fragments, humanized antibodies, single chain antibody (ScFv), etc. Antibodies can be produced in a conventional manner, by immunization with a polypeptide as defined above, and recovery of the serum (polyclonal) or of the spleen cells (to make hybridomas by fusion with an appropriate line).
  • Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced for example according to Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327.
  • the antibodies according to the invention can be coupled to different heterologous groups, such as markers, toxins from therapeutic agents, etc.
  • markers such as diphtheria or botulinum toxin
  • therapeutic agents are cytokines, growth factors, trophic factors, etc.
  • the antibodies of the invention can be used in diagnosis or in therapy, as well as for the purification of the antigen. They can also be used for the screening of active compounds.
  • the invention is applicable to the diagnosis or detection of various pathologies such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, Huntington's chorea or cerebral ischemia. It can be used for early detection, highlighting a predisposition, choosing and adapting a treatment, monitoring the evolution of the pathology, etc. It is particularly suitable for the early detection of multiple sclerosis.
  • Another object of the invention lies in the use of a compound capable of inhibiting or reducing the expression or the activity of calcineurin, for the preparation of a composition intended for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular in early phase, more preferably to reduce the excitotoxicity of the early neuron associated with neurodegenerative diseases such as ALS, Alzheimer or Parkinson.
  • treatment designates preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down the progression of the disease ), etc.
  • the treatment can also be carried out in combination with other agents or treatments, in particular addressing late events in the pathology, such as caspase inhibitors or other active compounds.
  • Another object of the invention resides in the use of a compound capable of inhibiting (preferably selectively) the expression or the activity of calcineurin of sequence SEQ ID No. 4 for the preparation of a composition intended to reduce neuronal excitotoxicity.
  • the compound is an antisense nucleic acid, capable of inhibiting the transcription of the calcineurin gene or the translation of the corresponding messenger.
  • the antisense nucleic acid may comprise all or part of the calcineurin gene sequence, a fragment thereof, the calcineurin messenger, or a sequence complementary thereto.
  • the antisense can in particular comprise a region complementary to the form of splicing identified, and inhibit (or reduce) its translation into protein. This antisense thus comprises, by way of example, a sequence complementary to nucleotides 1333 to 1347 of SEQ ID No. 3.
  • the compound is a peptide or an antibody specific for a spliced form of calcineurin. It may especially be a peptide comprising the sequence KLYFGEGGD or an antibody specific for the protein of sequence SEQ ID No. 4, and not recognizing the protein SEQ ID No. 2.
  • the compound is a chemical compound, of natural or synthetic origin, in particular an organic or inorganic molecule, of vegetable, bacterial, viral, animal, eukaryotic, synthetic or semi-synthetic origin, capable of modulating the expression or activity of calcineurin.
  • the compound is chosen from FK506 and cyclosporin A.
  • calcineurin inhibitors have been described in the prior art. Some of these are commercially available drugs. This is the case of tacrolimus (or FK506) and cyclosporine A. These two compounds are immunosuppressants which bind to immunophilins, respectively the protein FKBP12 (FK506 binding protein 12) and cyclophilin A. Inhibition calcineurin, during the administration of these compounds, takes place by the formation of a complex between the compound, the immunophilin which it targets and the catalytic subunit of calcineurin. These immunophilins are peptidyl-prolyl-cis / trans-rotamases whose activity is also inhibited by their chemical ligands.
  • the present invention therefore provides, for the first time, calcineurin as a therapeutic target for the treatment of molecular events associated with excitotoxicity.
  • the invention can be used to inhibit or reduce neuronal excitotoxicity in the early phase of neurodegenerative diseases. It is applicable in particular to the treatment of Alzheimer's disease, of the disease of Parkinson's, multiple sclerosis, Huntington's chorea or cerebral ischemia.
  • the invention relates to methods of treating ALS comprising administering to a subject an inhibitor compound as described above.
  • the invention also relates to methods for reducing neuronal excitotoxicity comprising the administration to a subject of an inhibitor compound as defined above.
  • the invention also relates to methods of treating ALS or neuronal excitotoxicity comprising the administration of a compound selectively inhibiting the expression or activity of calcineurin of sequence SEQ ID No. 4.
  • the methods of the invention are used for the early phase treatment of neurodegenerative diseases.
  • the administration can be carried out by any method known to a person skilled in the art, preferably by injection, typically by intraperitoneal, intra-cerebral, intravenous or intra-arterial route. These injected doses can be adapted by those skilled in the art. Typically, from about 0.01 mg to 100 mg / kg are injected, for inhibiting compounds of a chemical nature, such as FK506. For compounds such as antibodies, doses of 1 mg to 100 mg can be used. For nucleic compounds, the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose. It is understood that repeated injections can be carried out, possibly in combination with other active agents or any pharmaceutically acceptable vehicle (e.g., buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.)
  • any pharmaceutically acceptable vehicle e.g., buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.
  • cyclosporine A for the preparation of a composition intended to inhibit the activity of calcineurin in patients suffering from ALS
  • FK506 for the preparation of a composition intended to inhibit the activity of calcineurin in patients suffering from ALS.
  • Other subjects of the invention relate to methods of selection, identification, or characterization of compounds active on pathologies associated with excitotoxicity, or with neuronal stress, comprising bringing test compounds into contact with a cell expressing a variant d splicing of calcineurin lacking an auto-inhibitory domain, and the identification of compounds inhibiting the expression or activity of this protein.
  • the methods can be implemented with different cell populations, such as primary cells or cell lines of mammalian origin (human, murine, etc.).
  • cells which do not naturally express calcineurin are used, transfected with a nucleic acid encoding the desired variant. In this way, the selectivity of the method is increased.
  • the screening methods can also be carried out in a cell-free system, by measuring the capacity of test compounds to bind the desired calcineurin variant.
  • Another subject of the invention relates to a polypeptide derived from calcineurin, lacking the auto-inhibitory domain, in particular amino acids 467-490, preferably 467-521.
  • This polypeptide can be of varied origin, in particular murine, human, synthetic or semi-synthetic, etc.
  • a specific example of such a polypeptide comprises the sequence SEQ ID No. 4 or a region of this polypeptide comprising at least residues 441 to 456.
  • Another subject of the invention is a polypeptide comprising the sequence KLYFGEGGD (residues 448-456 of SEQ ID NO: 4) or an immunogenic fragment thereof, preferably comprising at least 5 contiguous amino acids.
  • Another subject of the invention relates to any nucleic acid encoding a polypeptide as defined above, the vectors containing it, recombinant cells, and uses.
  • the vector may be a plasmid or a viral vector, such as for example a vector derived from an adenovirus, a retrovirus (including an Ientivirus), an AAV, a herpes virus, etc.
  • the vector can comprise a promoter ensuring a constitutive or regulated expression (eg, inducible), ubiquitous or specific for tissues, strong or weak. It can be a promoter of a domestic gene (PGK, albumin, apolipoprotein), a promoter ensuring specific expression in nerve cells (GFAP, etc.) or a viral promoter (CMV-IE , LTR-RSV, etc.).
  • a promoter ensuring a constitutive or regulated expression (eg, inducible), ubiquitous or specific for tissues, strong or weak. It can be a promoter of a domestic gene (PGK, albumin, apolipoprotein), a promoter ensuring specific expression in nerve cells (GFAP, etc.) or a viral promoter (CMV-IE , LTR-RSV, etc.).
  • the compound FK506, but not Riluzole protects the primary neurons of cerebellar granules against the excitotoxicity induced by NMDA / Serine.
  • the differential qualitative analysis was carried out using poly adenylated RNA (poly A +) extracted from samples of animal brains corresponding to the different stages, without prior isolation of the neurons in order to take into account a maximum of alternative splices linked to the development of pathology.
  • poly A + poly adenylated RNA
  • Poly A + RNAs are prepared according to techniques known to those skilled in the art. It may in particular be a treatment with agents chaotropics such as guanidium thiocyanate followed by extraction of total RNA by means of solvents (phenol, chloroform for example). Such methods are well known to those skilled in the art (see Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), and can be readily practiced using commercially available kits. From these total RNAs, poly A + RNAs are prepared according to conventional methods known to those skilled in the art and offered by commercial kits. These poly A + RNAs serve as a template for reverse transcription reactions using reverse transcriptase.
  • agents chaotropics such as guanidium thiocyanate
  • solvents phenol, chloroform for example
  • reverse transcriptases lacking RNase H activity are used which make it possible to obtain first strands of complementary DNA of sizes larger than those obtained with conventional reverse transcriptases.
  • Such reverse transcriptase preparations without RNase H activity are commercially available.
  • the poly A + RNAs as well as the single stranded cDNAs are prepared from transgenic animals (T) and syngeneic control animals (C).
  • hybridizations of mRNA are carried out with cDNAs (T) and reciprocal hybridizations of mRNA (T) with cDNAs (C).
  • RNA sequences not paired with complementary DNA are released from these heteroduplexes under the action of RNase H, this enzyme degrading the paired RNA sequences.
  • RNase H this enzyme degrading the paired RNA sequences.
  • These unpaired sequences represent the qualitative differences which exist between RNAs which are otherwise homologous to one another. These qualitative differences can be localized anywhere on the RNA sequence, as well in 5 ′, 3 ′ or inside the sequence and in particular in the coding sequence. Depending on their location, these sequences can be not only modifications of splicing but also the consequences of translocations or deletions.
  • the RNA sequences representing the qualitative differences are then cloned according to techniques known to those skilled in the art and in particular those described in the patent for the DATAS technique.
  • sequences are grouped within cDNA banks which constitute differential qualitative banks.
  • One of these banks contains exons and introns specific to the healthy situation; the other banks contain the splicing events characteristic of the pathological conditions.
  • the differential expression of the clones was verified by hybridization with probes obtained by reverse transcription from messenger RNA extracted from the different situations studied. The differential hybridization clones were retained for further analysis.
  • the sequences identified by DATAS correspond to introns and / or exons expressed in a differential manner by splicing between the pathological situations and the healthy situation. These splicing events may be specific to a given stage in the development of the pathology or characteristic of the healthy state.
  • the compound is administered intraperineally, at different doses, according to protocols known to those skilled in the art and derived from the protocols used to take advantage of their immunosuppressive properties, from animals 45 days of age.
  • FK506 protects primary cultures of neurons against excitotoxicity.
  • FK506 works by binding to an immunophilin: FKBP12. This protein is endowed with a rotamase activity which is inhibited by FK506.
  • FKBP12 when linked to FK506 acquires the property of inhibiting the activity of calcineurin.
  • the implication of calcineurin inhibition in the specificity of this effect is underlined by the fact that an immunosuppressant which acts on the rotamase activities of immunophilins, rapamycin, has no effect on the model studied.
  • FK506 protects by 50% against the toxicity induced by the NMDA / Ser treatment.
  • the FK506 provides protection of almost 80%.
  • concentrations such as 10 ⁇ M for example, the protection is not more important, a toxicity specific to large doses of FK506 being manifested.
  • riluzole which is the only compound registered in the treatment of ALS, is not able to protect excitotoxic neurons by treatment with NMDA / Ser.
  • any nucleic acid fragment including antisense RNA in order to inhibit the expression of calcineurin in patients suffering from such pathologies
  • any chemical compound in particular the cyclosporine A or of compound FK506, or of any pharmaceutical composition containing them, with the aim of inhibiting the activity of calcineurin in patients suffering from such pathologies

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la détection, la caractérisation et/ou le traitement (ou la prise en charge) de pathologies neurodégénératives, notamment de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le screening de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en oeuvre des méthodes ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle de calcineurine dans ces pathologies et son utilisation comme cible thérapeutique, diagnostique ou expérimentale.

Description

Compositions et méthodes pour le traitement ou la détection de pathologies neurodegeneratives
La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la détection, la caractérisation et/ou le traitement (ou la prise en charge) de pathologies neurodegeneratives, notamment de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le screening de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en œuvre des méthodes ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle de calcineurine dans ces pathologies et son utilisation comme cible thérapeutique, diagnostique ou expérimentale.
De nombreuses pathologies neurodegeneratives ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité. C'est le cas de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques et de la chorée de Huntington.
La sclérose amyotrophique latérale (SAL ou ALS pour Amyotrophic Latéral Sclerosis) est une maladie neurodégénérative, associée à différents types d'inclusions tels les corps de Lewis et caractérisée par une apoptose des motoneurones spinaux et corticaux dont l'issue fatale est parfois associée à une démence frontale. Des formes sporadiques, sans aucune mutation décrite, coexistent avec des formes familiales (FALS) associées à des mutations dans le gène SOD1 codant pour la superoxide dismutase. La majorité des cas est sporadique, les formes familiales (FALS) étant très rares. Il est vraisemblable qu'une longue période asymptomatique précède l'apparition des symptômes cliniques qui sont variés et dont la classification est complexe. Les futurs développements thérapeutiques substitueront aux traitements de la symptomatologie des stratégies basées sur les causes moléculaires de la pathologie. Au niveau cellulaire, ces symptômes sont associés à une mort des motoneurones corticaux et des motoneurones spinaux. Cette mort neuronale a été reliée à différents phénomènes qui constituent la base de plusieurs pathologies neurodegeneratives. C'est le cas de l'excitotoxicité liée au glutamate, du stress oxydatif, d'une certaine auto immunité dirigée contre des marqueurs neuronaux (les canaux calciques dans le cas de l'ALS) ainsi que d'anomalies du cytosquelette. Si ces phénomènes sont décrits, la ou les causes de ces maladies, dont l'ALS, sont obscures. Même si les FALS sont liées à des mutations dans le gène SOD1 qui code pour la superoxide dismutase, les mécanismes qui engagent les neurones vers la mort cellulaire dont au moins une composante est l'apoptose sont inconnus.
Identifier les événements moléculaires impliqués dans les différents phénomènes impliqués dans la mort cellulaire permettra de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'étude de ces événements est difficilement réalisable à partir de biopsies humaines. Ces biopsies proviennent évidemment d'échantillons post-mortem dont la qualité est difficilement contrôlable et ne représentent que des états pathologiques représentatifs des phases tardives de la maladie.
Les modèles animaux donnent accès à des échantillons biologiques qui permettent d'analyser différentes étapes du développement d'une pathologie et de comparer ces étapes à des témoins sains. A cet égard, des souris transgéniques qui expriment le gène humain SOD1 portant l'une des mutations qui prévaut dans les FALS (mutation G93A) sont disponibles auprès de Jackson Laboratory, sous condition de prise d'une licence d'utilisation auprès de la NorthWestem University. Ce modèle reproduit en 120 jours l'issue fatale de la maladie avec des symptômes comparables à ceux de la maladie humaine. L'apparition des symptômes d'ALS liés à la mutation G93A dans SOD1 n'est pas la conséquence d'une réduction de l'activité superoxyde dismutase mais d'un gain de fonction qui augmente la capacité de l'enzyme à générer des radicaux libres. Malgré ces informations, les événements moléculaires qui président aux différentes étapes de l'ALS sont mal connus. La complexité de ces événements moléculaires reflète l'évolution de la pathologie : Dans le modèle transgénique étudié, aucune dérégulation neuronale ou manifestation clinique n'a été rapportée à 30 jours. 60 jours correspondent à un stade qui précède de peu les premiers symptômes, mais qui est déjà caractérisé au niveau cérébral par des changements dans la physiologie cellulaire tels qu'une altération du métabolisme mitochondrial, un stress et une mort neuronale associés à un phénomène d'excitotoxicité. A 90 jours, 50% des motoneurones corticaux et spinaux sont morts et un processus actif d'apoptose neuronale est engagé parallèlement à une activation astrocytaire. Le phénomène d'excitotoxicité n'est plus observé à ce stade. La mort neuronale y est associée à l'activation de caspases qui ne semblent pas impliquées dans les phases précoces de la pathologie.
Identifier les différents événements moléculaires spécifiques des différentes phases de la pathologie doit permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques aussi bien que de nouveaux marqueurs diagnostiques. L'une des approches les plus efficaces pour réaliser cette identification consiste à identifier les gènes et les protéines dont l'expression caractérise un état physiopathologique.
La présente invention décrit à présent l'identification d'événements génétiques impliqués dans les phénomène d'excitotoxicité et de mort neuronale. La présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées à ces phénomènes, ainsi que de nouvelles cibles pour l'identification de composés actifs.
Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits d'échantillons de cerveau et de moelle épinière sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum d'événements d'epissages alternatifs liés au développement de la pathologie. Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS (décrite dans la demande n° WO99/46403), qui présente des avantages inégalés.
La présente demande de brevet découle notamment de la construction par la demanderesse d'un répertoire des altérations d'épissage dans le cerveau des animaux modèles de l'ALS âgés de 60 jours. Ce répertoire qui contient plus de 200 séquences distinctes, implique des acteurs clefs du phénomène d'excitotoxicité tels que les canaux potassiques et le récepteur NMDA. Des séquences dérivées d'ARNs codant pour des protéines impliquées dans la réponse au stress, dont des protéines de choc thermique, font également partie de ce répertoire, soulignant l'implication de cette réponse dans les phases précoces de l'ALS. Une altération du métabolisme énergétique apparaît clairement affecter les motoneurones corticaux des animaux qui développent la pathologie. Par exemple, l'intron 6 de la forme mitochondriale de la creatine kinase est isolé spécifiquement à partir des ARN messagers exprimés en conditions pathologiques chez les animaux âgés de 60 jours. Cette interruption de la séquence codante par cette rétention d'intron aboutit à un ARN messager qui code pour une forme inactive de l'enzyme. Cette observation est en accord avec les observations biochimiques qui ont montré une diminution de l'activité creatine kinase mitochondriale corrélée avec une diminution de la quantité de cette enzyme dans les neurones des animaux du même modèle transgénique. La spécificité des séquences qui constituent ce répertoire est attestée par le fait que la même analyse différentielle qualitative de l'expression génétique réalisée sur des animaux âgés de 90 jours aboutit à un répertoire différent dont sont absents notamment les différents marqueurs de l'excitotoxicite. L'analyse des modifications d'épissage confirme que les événements moléculaires sont différents selon le stade de la pathologie.
La réalisation de DATAS sur des ARN d'animaux contrôles et transgéniques âgés de 60 jours a permis d'isoler un fragment d'ADNc dérivé de l'ARNm de la sous-unité catalytique de la calcineurine. Ce fragment correspond à un fragment d'exon spécifiquement présent dans les animaux contrôles et donc spécifiquement délété dans les animaux transgéniques pour SOD1G93A au stade 60 jours. Ce fragment recouvre les nucléotides 1 348 à 1 579 référencés à partir de l'ATG. Cette région est essentiellement codante et contient un domaine auto-inhibiteur de l'enzyme situé à l'extrémité C-terminale de l'enzyme. Par des expériences de RT PCR, une nouvelle isoforme de la sous-unité catalytique de la calcineurine a été mise en évidence. Cette isoforme courte se distingue de la forme longue par une délétion des nucléotides 1341 à 1741 (inclus) et par conséquent des acides aminés 447 à 524, le codon stop de la calcineurine correspondant au nucléotide 1 641 (la séquence complète de la calcineurine et son ADN, d'origine murine ou humaine, est disponible sur banque de données, notamment GeneBank). La séquence d'ADNc codant la calcineurine humaine (2 119 pb) est représentée sur la séquence SEQ ID n° 1. La séquence protéique est représentée sur la séquence SED ID n° 2. Les résidus 348 à 368 de SEQ ID n° 2 correspondent au domaine de liaison à la calcineurine Béta ; les résidus 391 à 414 au domaine de liaison à la calmoduline et les résidus 467 à 490 au domaine auto-inhibiteur. Les séquences SEQ ID n° 3 et 4 représentent, respectivement, la séquence nucléique et la séquence en acides aminés du variant d'épissage de la calcineurine, selon l'invention. La délétion des résidus nucléiques 1341 à 1741 inclus entraîne une délétion des acides aminés C- terminaux à compter du résidu 447, et la création d'une extrémité C-terminale de séquence KLYFGEGGD (résidus 448 à 456 de SEQ ID n° 4).
Des expériences de mutagenèse et de délétions ont montré que le domaine auto-inhibiteur de la calcineurine correspond aux acides aminés 467 à 490 et que l'absence de ce domaine aboutit à une activation constitutive de la calcineurine. La calcineurine est impliquée dans le relais des voies de signalisation qui dépendent du calcium et de la calmoduline. L'interaction de la calmoduline avec la calcineurine stimule l'activité de cette dernière. La délétion du domaine auto-inhibiteur de la calcineurine augmente le niveau basai d'activité de cette enzyme mais la maintient susceptible à l'activation par la calmoduline. La présente invention décrit donc un événement moléculaire original et nouveau (un épissage), qui aboutit à une activation constitutive de la calcineurine et qui est corrélé au phénomène d'excitotoxicité et/ou de mort neuronale. L'invention montre également, pour la première fois, qu'une activation constitutive de la calcineurine est associée aux stades précoces de l'ALS. La calcineurine constitue donc une cible thérapeutique nouvelle et importante dans le développement de thérapeutiques de ces pathologies, utilisables notamment à des phases précoces de leur développement, et s'adressant aux véritables bases moléculaires de la pathologie et non aux symptômes ou composantes immunitaires associées.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans l'utilisation d'un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la sous-unité catalytique de la calcineurine pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic ou de détection d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité.
L'invention réside, généralement, dans l'utilisation d'un acide nucléique complémentaire de tout ou partie du gène ou du messager de la calcineurine, pour la détection d'événements pathologiques de type excitotoxicite, stress ou mort neuronale, etc. L'invention est particulièrement destinée à la détection, au dépistage, au diagnostic ou à la caractérisation d'une excitotoxicite associée aux formes précoces de maladies neurodegeneratives, notamment de l'ALS, de la maladie de Parkinson ou de la maladie d'Alzheimer.
Il s'agit plus particulièrement d'acides nucléiques capables de mettre en évidence une forme délétée de l'ARNm de la calcineurine, notamment un variant d'épissage, en particulier, dans lequel un domaine auto-inhibiteur est délété, en particuler les bases 1341 à 1741 (ou la région correspondante du gène ou ADN humain). L'invention montre en effet l'existence d'événements d'épissage affectant le gène de la calcineurine, associés au développement de l'excitotoxicite neuronale, et propose des méthodes de détection ou dépistage de dysfonctionnements basés sur la mise en évidence de la présence de ces formes épissées dans des échantillons biologiques.
Avantageusement, l'acide nucléique comprend tout ou partie de la séquence codant le domaine auto-inhibiteur de la calcineurine (compris entre les nucléotides 1401 et 1503 à partir de l'ATG, pour la forme murine, ou des résidus homologues dans la séquence humaine, par exemple les acides aminés 467- 490 de la séquence SEQ ID NO :2), ou de la séquence résultant de la jonction entre les régions non délétées, ou une séquence complémentaire de celles-ci.
Selon des modes particuliers de mise en œuvre, l'invention utilise un acide nucléique complémentaire d'une région comprise dans une séquence suivante :
- résidus 1341 à 1741 de SEQ ID n° 1
- résidus 1333 à 1347 de SEQ ID n° 3.
La complémentarité est, de préférence parfaite, pour assurer une meilleure spécificité d'hybridation. Toutefois, il est entendu que certains mesappariements peuvent être tolérés. L'acide nucléique utilisé pour la mise en œuvre des méthodes ci-dessus peut être un ADN ou un ARN, de préférence un ADN d'origine synthétique. Il comporte de préférence de 10 à 500 bases, typiquement de 10 à 100 bases. Il est entendu qu'un acide nucléique plus long peut être utilisé, si désiré, bien que cela ne soit pas préféré. L'acide nucléique est avantageusement un ADN simple brin, de 10 à 500 bases, complémentaire d'une région au moins de la séquence codant le domaine auto-inhibiteur de la calineurine ou de la séquence résultant d'un épissage affectant au moins une partie de ce domaine. L'acide nucléique peut être marqué, par exemple par voie radioactive, enzymatique, luminescente, fluorescente, chimique, etc. Pour la mise en œuvre des méthodes selon l'invention, on met en contact in vitro un échantillon biologique d'un sujet, contenant un acide nucléique, avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus, et on détecte la formation d'un hybride. L'échantillon biologique peut être un échantillon de sang, de fluide, de cellule, de tissu, etc. L'acide nucléique peut être immobilisé sur un support, de type verre, silice, nylon, etc.
L'invention concerne également des méthodes de détection, dosage, dépistage, diagnostic, etc. in vitro, utilisant un anticorps spécifique d'une forme épissée de la calcineurine, par exemple un anticorps spécifique de la région polypeptidique KLYFGEGGD. Comme indiqué ci-avant, ce domaine est spécifique d'une forme nouvelle de calcineurine et n'existe pas dans la calcineurine de type sauvage. Des anticorps dirigés contre ce domaine permettent donc de mettre en évidence, par des méthodes immunologiques classiques, la présence d'un variant d'épissage et donc d'une prédisposition ou de l'initiation d'un phénomène d'excitotoxicité neuronale.
Les anticorps peuvent être préparés par tout technique connue de l'homme du métier.
Un objet de l'invention réside également dans un anticorps liant un polypeptide de séquence SEQ ID NO :4. La liaison est préférentiellement une liaison sélective, l'anticorps ne reconnaissant pas de manière spécifique la calcineurine de séquence SEQ ID NO :2. Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps capable de lier la séquence KLYFGEGGD. Un autre objet de l'invention est un anticorps produit par immunisation avec un polypeptide comprenant la séquence KLYFGEGGD ou un fragment immunogène de celle-ci.
Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Il peut également s'agir de fragments ou dérivés de tels anticorps, en particulier de fragments ou dérivés de tels anticorps ayant la même spécificité antigénique, comme par exemple des fragments Fab, Fab'2, CDR, des anticorps humanisés, des anticorps simple-chaîne (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits de manière conventionnelle, par immunisation avec un polypeptide tel que défini ci- avant, et récupération du sérum (polyclonal) ou des cellules de la rate (pour fabriquer des hybridomes par fusion avec une lignée appropriée).
Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux chez différentes espèces ont été décrites par exemple dans Vaitukaitis et al., (1971) J Clin Endocrinol Metab 33(6): 988-91. En bref, l'antigène est combine avec un adjuvant (e.g. Freund's) et injecté, par exemple par voie sous-cutanée, à un animal. Des échantillons de sang sont collectés et les anticorps sont séparés.
Pour la production d'anticorps monoclonaux, on peut se référer par exemple à Harlow et al (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988), à Kohler et al (Nature 256 (1975) 495), ou à Ward et al (Nature 341 (1989) 544), incorporés à la présente par référence. Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par exemple selon Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327.
Les anticorps selon l'invention peuvent être couplés à différents groupes hétérologues, tels que des marqueurs, des toxines des agents thérapeutiques, etc. Des exemples de toxine sont la toxine diphtérique ou botulique, des exemples d'agents thérapeutiques sont des cytokines, facteurs de croissance, facteurs trophiques, etc. Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés en diagnostic ou en thérapeutique, ainsi que pour la purification de l'antigène. Ils peuvent également servir pour le screening de composés actifs.
L'invention est applicable au diagnostic ou la détection de différentes pathologies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la chorée de Huntington ou l'ischémie cérébrale. Elle peut être utilisée pour la détection précoce, la mise en évidence d'une prédisposition, le choix et l'adaptation d'un traitement, le suivi de l'évolution de la pathologie, etc. Elle est particulièrement adaptée à la détection à un stade précoce de la sclérose en plaques. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable d'inhiber ou de réduire l'expression ou l'activité de la calcineurine, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodegeneratives, notamment en phase précoce, plus préférentiellement pour réduire l'excitotoxicite neuronade précoce associée aux maladies neurodegeneratives telles l'ALS, Alzheimer ou Parkinson.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements, notamment adressant les événements tardifs de la pathologie, tels que des inhibiteurs de caspases ou autres composés actifs.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé capable d'inhiber (de préférence de manière sélective) l'expression ou l'activité de la calcineurine de séquence SEQ ID n° 4 pour la préparation d'une composition destinée à réduire l'excitotoxicite neuronale.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique antisens, capable d'inhiber la transcription du gène de la calcineurine ou la traduction du messager correspondant. L'acide nucléique anti-sens peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène de la calcineurine, d'un fragment de celle-ci, du messager de la calcineurine, ou d'une séquence complémentaire à celles-ci. L'antisens peut notamment comprendre une région complémentaire de la forme d'épissage identifiée, et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine. Cet antisens comprend ainsi, à titre d'exemple, une séquence complémentaire aux nucléotides 1333 à 1347 de SEQ ID n° 3.
Selon un autre mode de réalisation, le composé est un peptide ou un anticorps spécifique d'une forme épissée de la calcineurine. Il peut s'agir notamment d'un peptide comprenant la séquence KLYFGEGGD ou d'un anticorps spécifique de la protéine de séquence SEQ ID n° 4, et ne reconnaissant pas la protéine SEQ ID n° 2.
Selon un autre mode de réalisation, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi-synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de la calcineurine.
A titre d'exemple préféré, le composé est choisi parmi le FK506 et la cyclosporine A.
Un travail antérieur réalisé in vitro et in vitro à l'aide de lymphocytes T a montré que la superoxyde dismutase (SOD) protège la calcineurine de son inactivation mais n'a pas du tout étendu ces observations à des modèles neuronaux. Au contraire, une étude plus récente menée sur des modèles de neurones a montré qu'une forme mutée de SOD1 qui correspond à une mutation retrouvée dans les formes familiales de l'ALS n'a pas un tel impact sur la calcineurine. De plus, cette étude documente le fait que dans ce système, les inhibiteurs de calcineurine comme le FK506 augmentent la mortalité cellulaire. Un lien direct entre ALS et augmentation de l'activité de la calcineurine, de même que toute possibilité d'intervention thérapeutique dans cette pathologie avec le FK506 ou tout autre inhibiteur de calcineurine sont donc exclus par ces enseignements.
Plusieurs inhibiteurs de la calcineurine ont été décrits dans l'art antérieur. Certains de ceux-ci sont des médicaments disponibles commercialement. C'est le cas du tacrolimus (ou FK506) et de la cyclosporine A. Ces deux composés sont des immuno-suppresseurs qui se lient à des immunophilines, respectivement la protéine FKBP12 (FK506 binding protein 12) et la cyclophiline A. L'inhibition de la calcineurine, lors de l'administration de ces composés, se fait par formation d'un complexe entre le composé, l'immunophiline qu'il cible et la sous-unité catalytique de la calcineurine. Ces immunophilines sont des peptidyl-prolyl-cis/trans-rotamases dont l'activité est inhibée également par leurs ligands chimiques.
Certains rapports sont disponibles sur l'action neuroprotectrice de certains immunosuppresseurs in vitro. Les rapports les plus récents documentent que ces effets neuroprotecteurs, de même que les effets neurotrophiques de ces composés sont obtenus avec des immunophillines non immunosuppressives qui ont perdu la capacité d'inhiber la calcineurine. De même, les résultats obtenus chez l'animal en ischémie confirment les résultats in vitro. Ainsi, aucun effet significatif des composés cyclosporine A ou FK506 n'a été décrit en modèle animal de l'ALS ou chez des patients atteints de cette maladie. A notre connaissance aucun essai n'a été mené sur le modèle murin. Chez l'homme, aucun essai n'a été rapporté avec le FK506 et l'absence de résultats probants avec la cyclosporine est parfaitement compatible avec le fait que ce composé franchit mal la barrière hématoencéphalique (contrairement au FK506).
Aujourd'hui, il n'existe donc pas d'évidence selon laquelle l'inhibition de la calcineurine par le FK506 ou la cyclosporine A pourrait ralentir la progression de l'ALS. D'autre part, il est à souligner qu'aucune étude n'a été entreprise en pathologie humaine ou à l'aide d'un modèle animal pour tirer partie de la capacité du FK506 et de la cyclosporine A à inhiber l'activité de la calcineurine. Les différents essais, y compris ceux entrepris pour traiter les syndromes neurodégénératifs , tendaient à inhiber la composante immunitaire associée à ces pathologies.
La présente invention propose donc, pour la première fois, la calcineurine comme cible thérapeutique pour le traitement des événements moléculaires associés à l'excitotoxicite. Selon des modes de mise en œuvre particuliers, l'invention peut être utilisée pour inhiber ou réduire l'excitotoxicite neuronale en phase précoce des maladies neurodegeneratives. Elle est applicable notamment au traitement de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorée de Huntington ou de l'ischémie cérébrale.
L'invention concerne des méthodes de traitement de l'ALS comprenant l'administration à un sujet d'un composé inhibiteur tel que décrit ci-avant.
L'invention concerne également des méthodes pour réduire l'excitotoxicite neuronale comprenant l'administration à un sujet d'un composé inhibiteur tel que défini ci-avant.
L'invention concerne également des méthodes de traitement de l'ALS ou de l'excitotoxicite neuronale comprenant l'administration d'un composé inhibant sélectivement l'expression ou l'activité de la calcineurine de séquence SEQ ID n° 4.
De préférence, les méthodes de l'invention sont utilisées pour le traitement en phase précoce des maladies neurodegeneratives.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra- cérébrale, intra-veineuse ou intra-artérielle. Ces doses injectées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique, tels le FK506. Pour des composés tels des anticorps, des doses de 1 mg à 100 mg peuvent être utilisées. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (e.g., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.)
D'autres objets de l'invention résident dans :
. l'utilisation des composés ci-dessus pour le traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicite neuronale en phase précoce de l'ALS,
. l'utilisation de la cyclosporine A pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la calcineurine chez les patients atteints d'ALS, ou . l'utilisation de FK506 pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la calcineurine chez les patients atteints d'ALS.
D'autres objets de l'invention concernent des méthodes de sélection, identification, ou caractérisation de composés actifs sur les pathologies associées à l'excitotoxicite, ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact de composés tests avec une cellule exprimant un variant d'épissage de la calcineurine dépourvu de domaine auto-inhibiteur, et la mise en évidence des composés inhibant l'expression ou l'activité de cette protéine.
Les méthodes peuvent être mises en œuvre avec différentes populations cellulaires, telles que des cellules primaires ou des lignées de cellules d'origine mammifère (humaine, murine, etc.). On utilise avantageusement des cellules qui n'expriment pas naturellement la calcineurine, transfectées avec un acide nucléique codant le variant souhaité. De cette manière, la sélectivité de la méthode est augmentée. On peut également utiliser des cellules encaryotes inférieures (levure, etc.) ou des cellules procaryotes.
Les méthodes de screening peuvent également être réalisées en système acellulaire, par mesure de la capacité de composés tests à lier le variant de calcineurine souhaité.
Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide dérivé de la calcineurine, dépourvu du domaine auto-inhibiteur, en particulier des acides aminés 467-490, de préférence 467-521. Ce polypeptide peut être d'origine variée, notamment murine, humaine, synthétique ou semi-synthétique, etc. Un exemple spécifique de tel polypeptide comprend la séquence SEQ ID n° 4 ou une région de ce polypeptide comportant au moins les résidus 441 à 456.
Un autre objet de l'invention est un polypeptide comprenant la séquence KLYFGEGGD (résidus 448-456 de SEQ ID NO : 4) ou un fragment immunogene ce celui-ci, de préférence comportant au moins 5 acides aminés contigus. Un autre objet de l'invention concerne tout acide nucléique codant un polypeptide tel que défini ci-dessus, les vecteurs le contenant, cellules recombinantes, et utilisations. Le vecteur peut-être un plasmide ou un vecteur viral, comme par exemple un vecteur dérivé d'un adénovirus, d'un rétrovirus (y compris un Ientivirus), d'un AAV, d'un herpès-virus, etc. Le vecteur peut comprendre un promoteur assurant une expression constitutive ou régulée (e.g., inductible), ubiquitaire ou spécifique de tissus, forte ou faible. Il peut s'agir d'un promoteur d'un gène domestique (PGK, albumine, apolipoprotéine), d'un promoteur assurant une expression spécifique dans les cellules nerveuses (GFAP, etc.) ou d'un promoteur viral (CMV-IE, LTR-RSV, etc.).
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 :
Le composé FK506, mais pas le Riluzole protège les neurones primaires de granules cérébelleux contre l'excitotoxicite induite par NMDA/Sérine.
EXEMPLES
1. Identification d'un variant de la calcineurine
L'analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN poly adénylés (poly A+) extraits d'échantillons de cerveaux d'animaux correspondant aux différents stades, sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum d'événements d'epissages alternatifs liés au développement de la pathologie.
Les ARN poly A+ sont préparés selon des techniques connues de l'homme de métier. Il peut s'agir en particulier d'un traitement au moyen d'agents chaotropiques tels que le thiocyanate de guanidium suivi d'une extraction des ARN totaux au moyen de solvants (phénol, chloroforme par exemple). De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier (voir Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), et peuvent être aisément pratiquées en utilisant des kits disponibles dans le commerce. A partir de ces ARN totaux, les ARN poly A+ sont préparés selon des méthodes classiques connues de l'homme de métier et proposées par des kits commerciaux. Ces ARN poly A+ servent de matrice à des réactions de transcription inverse à l'aide de reverse transcriptase. Avantageusement sont utilisées des reverse transcriptases dépourvues d'activité RNase H qui permettent d'obtenir des premiers brins d'ADN complémentaire de tailles supérieures à ceux obtenus avec des reverse transcriptases classiques. De telles préparations de reverse transcriptases sans activité RNase H sont disponibles commercialement. Pour chaque point de la cinétique de développement de la pathologie (30 jours, 60 jours et 90 jours) les ARN poly A+ ainsi que les ADNc simple brins sont préparés à partir des animaux transgéniques (T) et des animaux contrôles syngéniques (C).
Conformément à la technique DATAS, pour chaque point de la cinétique sont réalisées des hybridations d'ARNm (C) avec des ADNc (T) et des hybridations réciproques d'ARNm (T) avec des ADNc (C).
Ces hétéroduplex ARNm/ADNc sont ensuite purifiés selon les protocoles de la technique DATAS.
Les séquences d'ARN non appariées avec un ADN complémentaire sont libérées de ces hétéroduplex sous l'action de la RNase H, cette enzyme dégradant les séquences d'ARN appariées. Ces séquences non appariées représentent les différences qualitatives qui existent entre des ARN par ailleurs homologues entre eux. Ces différences qualitatives peuvent être localisées n'importe où sur la séquence des ARN, aussi bien en 5', 3' ou à l'intérieur de la séquence et notamment dans la séquence codante. Selon leur localisation, ces séquences peuvent être non seulement des modifications d'épissage mais également des conséquences de translocations ou de délétions. Les séquences d'ARN représentant les différences qualitatives sont ensuite clonées selon les techniques connues de l'homme de métier et notamment celles décrites dans le brevet de la technique DATAS.
Ces séquences sont regroupées au sein de banques de cDNA qui constituent des banques qualitatives différentielles. Une de ces banques contient les exons et les introns spécifiques de la situation saine ; les autres banques contiennent les événements d'épissage caractéristiques des conditions pathologiques. L'expression différentielle des clones a été vérifiée par hybridation avec des sondes obtenues par reverse-transcription à partir d'ARN messagers extraits des différentes situations étudiées. Les clones hybridant de façon différentielle ont été retenus pour analyse ultérieure. Les séquences identifiées par DATAS correspondent à des introns et/ou à des exons exprimées de façon différentielle par épissage entre les situations pathologiques et la situation saine. Ces événements d'épissage peuvent être spécifiques d'une étape donnée du développement de la pathologie ou caractéristiques de l'état sain.
La comparaison de ces séquences avec les banques de données permet de classifier les informations obtenues et de proposer une sélection raisonnée des séquences selon leur intérêt diagnostique ou thérapeutique.
Cette étude a permis de mettre en évidence une nouvelle isoforme de la sous- unité catalytique de la calcineurine, spécifique des cellules (ou échantillons biologiques) pathologiques (SEQ ID NO : 3 et 4). Cette isoforme courte se distingue de la forme longue par une délétion des nucléotides 1341 à 1741 inclus et par conséquent des acides aminés 447 à 524, le codon stop de la calcineurine correspondant au nucléotide 1641.
2. L'administration de FK506 à des souris transgéniques modèles de l'ALS ralentit la progression de la pathologie.
Le composé est administré par voie intrapérinonéale, à différentes doses, selon des protocoles connus de l'homme de métier et dérivés des protocoles utilisés pour mettre à profit leurs propriétés immuno-suppressives, dès les animaux âgés de 45 jours.
Les résultats indiquent clairement que le résultat optimal est obtenu avec une dose de 1mg/kg injectée de façon quotidienne. Ce traitement permet d'obtenir une prolongation de la survie de ces animaux de 20 jours, ce même décalage étant obtenu pour l'apparition des symptômes.
3. Le FK506 protège des cultures primaires de neurones contre l'excitotoxicite.
Des résultats obtenus in vitro sur cultures primaires de neurones montrent que le FK506 protège de l'excitotoxicite.
Le FK506 exerce ses actions en se liant à une immunophiline : la FKBP12. Cette protéine est douée d'une activité rotamase qui est inhibée par le FK506. D'autre part, la protéine FKBP12, lorsqu'elle est liée au FK506 acquiert la propriété d'inhiber l'activité de la calcineurine. L'implication de l'inhibition de la calcineurine dans la spécificité de cet effet est soulignée par le fait qu'un immuno-suppresseur qui agit sur les activités rotamases des immunophilines, la rapamycine, n'a aucun effet sur le modèle étudié. Réalisation expérimentale :
Les cultures primaires de cellules granulaires de cervelet sont réalisées à partir de rats âgés de 6 à 8 jours. Après 9 jours de différenciation selon des procédures connues de l'homme de métier, ces cellules deviennent vulnérables aux acides aminés excitateurs. A ce stade, l'excitotoxicite est réalisée en présence de 100μM de N-methyl-D- aspartate (NMDA) et de 10μM de D-sérine. Le pourcentage de toxicité est mesuré par test MTT selon les techniques bien connues et largement utilisées par l'homme de métier. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Selon les conditions expérimentales retenues, 30 à 35% des neurones sont toxifiées. En présence de 0,1 μM de FK506, les mêmes conditions n'induisent que 18% de toxicité. En d'autres termes, 0,1 μM de FK506 protège de 50% contre la toxicité induite par le traitement NMDA/Ser. A 1 μM, le FK506 confère une protection de près de 80%. A des concentrations supérieures, comme à 10μM par exemple, la protection n'est pas plus importante, une toxicité propre aux fortes doses du FK506 se manifestant.
En comparaison, le riluzole qui est le seul composé enregistré dans le traitement de l'ALS n 'est pas capable de protéger les neurones excitotoxifiées par traitement au NMDA/Ser.
D'autres aspects et applications de l'invention résident dans :
- l'utilisation de tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la sous-unité catalytique de la calcineurine à des fins de diagnostic ou de dépistage ou de caracterisation de pathologies neurodegeneratives ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la chorée de Huntington ou l'ischémie cérébrale,
- l'utilisation de tout fragment d'acide nucléique y compris des ARN anti-sens dans le but d'inhiber l'expression de la calcineurine chez les patients atteints de telles pathologies, - l'utilisation de tout composé chimique, notamment de la cyclosporine A ou du composé FK506, ou de toute composition pharmaceutique les contenant, dans le but d'inhiber l'activité de la calcineurine chez les patients atteints de telles pathologies,
- l'utilisation de tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la sous-unité catalytique de la calcineurine à des fins de caracterisation du tissu et de la situation ischémique

Claims

Revendications
1. Utilisation d'un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée de l'ARN messager de la sous-unité catalytique de la calcineurine pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic ou de détection d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'acide nucléique comprend tout ou partie de la séquence codant le domaine auto-inhibiteur de la calcineurine, ou une séquence complémentaire de celle-ci.
3. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'acide nucléique est complémentaire d'une forme délétée de l'ARNm de la calcineurine.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique comprend au moins les résidus 1 333 à 1 347 de SEQ ID n° 3 ou les résidus 1341 à 1741 de SEQ ID n° 1.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour le diagnostic ou la détection de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorée de Huntington ou de l'ischémie cérébrale.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la détection à un stade précoce de la sclérose en plaques.
7. Utilisation d'un composé capable d'inhiber ou de réduire l'expression ou l'activité de la calcineurine, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodegeneratives.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le composé est acide nucléique anti-sens, capable d'inhiber la transcription du gène de la calcineurine ou la traduction du messager correspondant.
9. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi le FK506 et la cyclosporine A.
11. Utilisation selon l'une des revendications 7 à 10, pour inhiber ou réduire l'excitotoxicite neuronale en phase précoce des maladies neurodegeneratives.
12. Utilisation selon l'une des revendications 7 à 11 , pour le traitement de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques, de la chorée de Huntington ou de l'ischémie cérébrale.
13. Utilisation selon l'une des revendications 7 à 12, pour le traitement de l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicite neuronale en phase précoce de l'ALS.
14. Utilisation de la cyclosporine A pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la calcineurine chez les patients atteints d'ALS.
15. Utilisation de FK506 pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de la calcineurine chez les patients atteints d'ALS.
16. Polypeptide dérivé de la calcineurine, ledit polypeptide étant dépourvu de domaine auto-inhibiteur fonctionnel.
17. Polypeptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n° 4 ou un fragment de celle-ci comprenant au moins les résidus 441 à 456.
18. Polypeptide comprenant la séquence KLYFGEGGD.
19. Acide nucléique codant un polypeptide selon l'une des revendications 16 à 18.
20. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 19.
21. Cellule comprenant un acide nucléique selon la revendication 19 ou un vecteur selon la revendication 20, de préférence d'origine mammifère.
22. Utilisation d'une cellule selon la revendication 21 , pour la production d'un polypeptide ou pour le criblage de composés modulant l'activité dudit polypeptide.
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