WO2002000850A1

WO2002000850A1 - Procede servant a preparer des cellules du muscle cardiaque et procede servant a rechercher des agents therapeutiques de maladies cardiaques

Info

Publication number: WO2002000850A1
Application number: PCT/JP2001/005520
Authority: WO
Inventors: Hideharu Kimura; Nobuyuki Koyama; Seiichi Tanida; Tadamitsu Kishimoto; Keiko Takihara; Hisao Hirota
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2002-01-03
Also published as: EP2090663A3; DE60136358D1; EP1295936B1; EP2090663A2; EP1295936A1; AU2001267844A1; ATE412766T1; US20030175847A1; US20080160553A1; EP1295936A4

Description

明細書心筋細胞の調製法および心疾患治療薬の探索法技術分野

本発明は、心筋細胞アポトーシス抑制作用あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する心疾患治療薬の探索に有用な、高純度初代心筋細胞の簡便な大量調製法および効率的かつ高感度な多検体対応型探索法等に関するものである ₍ さらに詳しくは、心疾患に対する予防 ·治療薬となりうる心筋細胞アポト一シス抑制作用あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する心疾患治療薬を初代培養心筋細胞を用いて探索するためこ、動物の胎仔又は新生仔の心臓より高純度の初代心筋細胞を簡便かつ大量に調製し、この心筋細胞を使用して心筋細胞のアポトーシスを効率的かつ高感度に検出することを特徵とする心疾患治療薬の探索法等に関するものである。背景技術，

アポト一シスは発生過程での形態、組織の形成や、ホメォスタシスの維持、生体の防御に深く関わり、個体の生命維持に重要な役割を持つ細胞の死である。遺伝子によって制御されたこの死の過程が、先天的、あるいは後天的に障害されると、アポトーシスが過剰に誘発されたりあるいは抑制されたりして、様々な臓器の機能障害を引き起こして病気に至る（米原伸、最新医学第 54巻、 825頁、 1999年）。従って、アポ! シスの観点からの疾患の把握と、その分子機構にもとづいた、診断法や、治療薬の開発が求められている。 '

アポト一シスは細胞増殖とは対局を成す。従って、これまで、増殖しない最終分化細胞である心筋細胞と、アポト一シスとの関わりは少ないと考えられてきた。しかし、近年、種々の心疾患の発症あるいは進展にアポトーシスが深く関わっていることが明らかとなってきた（R. Sanders Wi l l i ams, The New Engl and Journal o f Medi c ine 第 341卷、 759頁、 1999年) 。心筋細胞は増殖しないため、心筋細胞がアポトーシスを起こして脱落すると、生き残った細胞のみで収縮機能を維持しなければならないことになる。従って、心臓の収縮機能維持に必要な閾値を超えて心筋細胞の脱落が起こると、心機能に異常をきたし疾患へと進行するものと考えられる。実際、動物を用いた種々の心不全モデルゃヒト心不全患者では心筋細胞のアポトーシスが観察されており、アポトーシスによる心筋細胞の消失 ·脱落が心不全の発症や進展に関わっている可能性が指摘されている（Narula, J. et al . , The New England Journal of Medicine 第 335 巻、 1182頁、 1996年）。また、ヒト心不全患者の心筋細胞では、アポトーシス抑制因子 Bcl_2の過剰発現が認められ、これが心不全の代償機構である可能性が示されていること (Ol ivet t i , G. et al . , The New England Journal of Medic ine 第 336巻、 1131頁、 1997年）や、アポ! ^一シスを誘導することが知られている Fas受容体の膜貫通部分が欠損したドメインのみがスプライシングによつて分泌される可溶性 Fas (sFas；アポトーシス抑制活性を有する）の血漿中の濃度が、基礎疾患に無関係に NYHA (New York Heart Assoc iat i on Funct ional Class) 分類の重傷度に比例して有意に上昇することから、血漿 sFas濃度の上昇が心不全時のアポトーシスの亢進を抑制する代償性機序と考えられること

(Ni shigaki, K. et al. , Journal of the Amer i can Col lege of Cardiology 第 29巻、 1214頁、 1997年）、拡張型心筋症を起こした心臓では、正常人に比べて、アポトーシスの指標の一つと考えられる Deoxyribonucl ease KDNase I) を 7倍以上含有すること（Yao, M. et al .， Journal of Molecular & Cel l Cardiology 第 28巻、 95頁、 1996年）などが知られている。

一方、心筋細胞の保護に関連した最近の重要な知見として、 gpl30の心室特異的欠損マウスに関する研究成果が上げられる。このマウスの解析から、 gpl30 介在性受容体からのシグナル（gpl30シグナル）が心機能の保護に重要な役割を果たすことが明らかにされ、心疾患の治療に結びつく心筋細胞保護シグナルの新しい展開として注目を集めている（Hirota, et. al. , Cel l 第 97卷、 189 頁、 1999年、および Senior, K. Molecular Medicine Today 第 5巻、 283頁、 1999年）。

従って心筋細胞アポトーシス抑制作用あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物は新しい心疾患治療薬となる可能性が極めて高い。心疾患に対する予防 ·治療薬として有用な心筋細胞アポトーシス抑制作用を有する化合物、 gpl 30介在性受容体作動活性を有する化合物、あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物を探索する為には、心筋細胞のアポト一シスを指標としてこれを抑制する化合物を多数の検体の中から迅速かつ効率よく選別する必要がある。そのためには、動物そのものや心臓組織を用いて探索を行うのではなく、初代培養心筋細胞を簡便かつ大量に調製して探索を行うことが最善の方法と考えられる。

現在、心筋細胞の調製は、主に動物の心臓をトリプシンゃコラゲナーゼ等の蛋白質分解酵素で消化して、細胞を単離する方法で行われている。この際、トリブシンゃコラゲナーゼ等の蛋白質分解酵素での消化が容易だという理由で、一般的には胎仔や新生仔の心臓を細片化してから、蛋白質分解酵素で消化する方法が採られている（五島喜輿太、金子洋之、心臓 ·血管研究方法の開発（江橋節郎編)、 3頁、学会出版セン夕一 (1983) ) 。しかし、この方法では、血液の除去が十分行えないために、血液由来の細胞の混入により、得られる心筋細胞の純度が低くなることが問題であった。この問題を解決するためにフイコール等を使用して高純度心筋細胞を回収する方法 (Joj o, K. , et al . , Biochemical and Biophys ical Research Communicat ions 第 225卷、 340頁（1996) ) や、 DNA合成阻害剤（Bromodeoxyur idine) (Chacko , B. et al . , Journal of Cel l Biology 第 55巻、 36A頁（1972) )やカルシウムィオノホア（A23187) (Kaneko, H. et al . , Experimental Cel l Research 第 142卷、 407頁（1982) ) 等の薬剤を加えて非心筋細胞の増殖を選択的に抑制する方法などが考えられてきた。しかしこれらの方法も、フイコール等を使用した方法は回収に時間がかかり、 BrDUや A23187を用いた方法はそれら自身が細胞毒性を有するため、細胞の回収量や薬剤の心筋細胞への影響などの問題がある。かかる問題のため、このような調製法により調製した心筋細胞を用いて心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を迅速かつ効率よく選別することは困難であり、心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を多数の検体の中から迅速かつ効率よく選別する多検体対応型の探索のための心筋細胞の調製方法として好ましいものではなかった。その他の心筋細胞の調製方法としては、成熟した動物の心筋細胞を摘出してランゲンドルフ式灌流装置にセットし、血液を洗浄除去した後、

コラゲナーゼなどの蛋白質分解酵素液を還流する方法 (杉晴夫、平本幸男編、実験生物学講座第 10卷、 27頁（1984) ) が知られている。しかしこの方法も、特殊な装置が必要であったり、成熟動物の心筋細胞の生存率が極めて低く、手法の難易度が高いことや回収される心筋細胞の数や性質などに問題があり、上記調製法と同様、多検体対応型の探索には適していない。

このように、心筋細胞のアポト一シスを抑制する化合物を多数の検体の中から迅速かつ効率よく選別するためには初代培養心筋細胞を簡便かつ大量に調製する新たな方法を開発することが必要であった。

一方、心筋細胞のアポト一シス抑制作用を有する化合物、 gpl30介在性受容体作動活性を有する化合物、あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物を探索するためには、高純度の初代培養心筋細胞の簡便な大量調製法だけではなく、心筋細胞のアポトーシスを探索に適した簡便な方法で検出する必要がある。

例えば、培養液から血清を除去することによつて初代培養心筋細胞にアポト一シスを誘導する為には、密度が濃いと細胞同士の接触による保護シグナルの惹起、保護因子の産生などが考えられることから細胞密度をある程度低くする必要があるうえに、血清を除去したままの状態では生存している心筋細胞の細胞内脱水素酵素活性も低いため、 MTT (3- (4, 5- dimethyl thi azo卜 2- yl)- 2, 5- diphenyl tet razol ium bromide) 還元法（多田ら、ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジカル 'メソーズ（Journal of Immunological Methods) 第 93巻、 157頁（1986) ) などで心筋細胞のアポト一シスを定量的に検出することは困難であった。また、従来、心筋細胞のアポトーシスの検出には、トリパンブル一等で死細胞を染色したり、 MTTを添加して生細胞にホルマザンの結晶を作らせた後、生細胞数を計数する方法がとられてきた (Sheng, Z. et al . , The Journal of Biological Chemis try 第 272巻、 No. 9、 5783頁（1997) ) 。しかしこのような方法では多検体に対応させることは困難であり、心筋細胞のアポト一シス抑制作用を有する化合物、 gpl 30介在性受容体作動活性を有する化合物、あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物を探索するためには、心筋細胞のアポト一シスのより効率的で高感度な検出方法を考案する必要があつた。発明の開示

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、哺乳動物の胎仔又は新生仔の心臓組織を細片化したものを、トリプシンやコラゲナーゼなどの蛋白質分解酵素で処理する前にリン酸緩衝生理食塩水等で洗浄すること、および残留する赤血球を低張溶血操作で除去することによって、高純度初代心筋細胞を簡便かつ大量に調製できることを見出した。以下、該調製法を本発明の心筋細胞調製法と称することがある。

また、心筋細胞培養液より血清を除去することによって誘導したアポトーシスを、効率よく高感度に検出する方法として、培養液へ血清を添加して約 1 7 時間の回復培養を行った後に、 WST- 8 (2- (2-meihoxy-4-ni trophenyl)-3- (4-ni trophenyl) -5- (2, 4-disul fophenyl) -2H-tetrazol ium, monosodium sal t) • を発色基質とする細胞数計測キット（Cel l count ing ki t-8；同人化学研究所社製）などを用いて生細胞数を測定する方法を見出した。以下、該検出法を本発明のアポトーシス検出方法と称することがある。

本発明者らは、これらの方法を組み合わせてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、①心筋細胞アポトーシス抑制作用を有する化合物、 gpl 30 介在性受容体作動活性を有する化合物、あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物の探索に有用な、高純度初代心筋細胞の簡便な大量調製法、 ②これらの化合物を効率的よく高感度に検出しうる検出方法、 ③該調製法および該検出方法を組み合わせた多検体対応型の探索方法（スクリーニング法）、さらに、 ④該探索方法によって得られる化合物またはその塩を含有する心筋細胞アポトーシス抑制薬、 g p 1 3 0介在受容体作動薬、心筋細胞保護シグナル増強薬または心疾患予防'治療薬等に関する。

さらに詳しくは、本発明は、 -

( 1 ) 細片化した心臓組織から非心筋細胞を除去した後、該心臓組織を蛋白質分解酵素で消化することを特徴とする初代心筋細胞の調製法、 ( 2 ) 細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより非心' 筋細胞を除去することを特徴とする前記（1) 記載の調製法、

(3) 細片化した心臓組織を蛋白質分解酵素で消化した後に、赤血球を除去することを特徴とする初代心筋細胞の調製法、

(4)溶血処理を行うことにより赤血球を除去することを特徴とする前記（3) 記載の調製法、

( 5 ) 心臓組織より単離した心筋細胞を溶血処理することを特徴とする初代心筋細胞の調製法、

(6) 細片化した心臓組織から非心筋細胞を除去した後、該心臓組織を蛋白質分解酵素で消化し、赤血球を除去することを特徴とする初代心筋細胞の調製法、

(7) 細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより非心筋細胞を除去し、蛋白質分解酵素で消化した心臓組織を溶血処理に付すことにより赤血球を除去することを特徴とする前記（6) 記載の調製法、

( 8 ) 無血清培地で培養することによりアポトーシスの誘導された心筋細胞の培養液に血清を添加した後、培養し、生存心筋細胞数を測定することを特徴とする心筋細胞アポトーシスの検出方法、

( 9 ) 生存心筋細胞数が細胞内脱水素酵素活性を測定することにより測定される前記（8) 記載の検出方法、

(10) 血清添加後の培養時間が約 6〜 30時間である前記（8) 記載の検出方法、

(11) 細胞内脱水素酵素活性を MT Tまたは WS T一 8を用いて測定することを特徴とする前記（9) 記載の検出方法、

(12) 前記（1) 〜（7) のいずれかに記載の調製法により得られた初代心筋細胞を無血清培地で培養することを特徴とする前記（8) 記載の検出方法、 (13) (i) 試験化合物存在下でアポトーシスを誘導させた場合と、（ii) 試験化合物非存在下でアポトーシスを誘導させた場合との生細胞数を前記（12) 記載の検出方法により比較することを特徴とする、アポトーシスを阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、

(14) 前記（13) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する心筋細胞アポトーシス抑制薬、

(15) 前記（13) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する g p 130介在受容体作動薬、

(16) 前記（13) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する心筋細胞保護シグナル増強薬、

(17) 心疾患予防 ·治療薬である、前記（14) 記載の心筋細胞アポトーシス抑制薬、前記（15) 記載の gp 130介在受容体作動薬または前記（16) 記載の心筋細胞保護シグナル増強藥、

(18)哺乳動物に対して、前記（14)記載の心筋細胞アポトーシス抑制薬、前記（15) 記載の gp 130介在受容体作動薬または前記（16) 記載の心筋細胞保護シグナル増強薬の有効量を投与することを特徴とする心疾患の予防 ·治療方法、

(19) 心疾患予防 ·治療剤を製造するための前記（14) 記載の心筋細胞ァポト一シス抑制薬、前記（15) 記載の gp 130介在受容体作動薬または前記（16) 記載の心筋細胞保護シグナル増強薬の使用などに関する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1で行った、本発明の心筋細胞調製方法で得られた心筋細胞と、従来法で得られた心筋細胞の純度の比較結果を示す。図中、「従来法」は従来法で得られた心筋細胞の、「本方法」は本発明の心筋細胞調製方法で得られた心筋細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。

図 2は、実施例 2で行った、本発明のアポト一シス検出方法と従来法による hLIFの心筋細胞アポトーシス抑制活性検出感度の比較結果を示す。図中、「M TT還元法（従来法）」は MTTを発色基質として用いた従来法で測定した結果を、「MTT還元法（本方法）」は MTTを発色基質として用いた本発明のアポトーシス検出方法で測定した結果を、「WST— 8還元法（本方法）」は WST-8を発色基質として用いた本発明のアポトーシス検出方法で測定した結果を示す。

図 3は、実施例 4で行った、本方法による hIGF- 1の心筋細胞アポトーシス抑制活性の検出結果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳しく説明する。

( 1 ) 本発明の心筋細胞調製方法

本発明の方法はラットゃマウスの胎仔または新生仔のように、ランゲンドルフ灌流装置等では血液を洗い流すことが困難な心臓より心筋細胞を大量に調製するのに適しているが、それらのみに限定されるものではない。

例えばラットの新生仔などの場合は、心臓を摘出し、摘出した心臓をリン酸緩衝生理食塩水などで洗浄した後、細片化する。この細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水等で 4〜 5回程度洗浄することで、血液由来の非心筋細胞を効率よく除去することができる。

次にこの心臓組織片をトリプシンやコラゲナ一ゼなどの蛋白質分解酵素で消化して細胞を分離する。酵素の種類、反応温度、反応時間などの条件は動物の種類によって適宜選択することができる。酵素反応は血清を含'む培地等を加えることで停止させることができる。反応停止後の細胞含有液を遠心分離して細胞を集め、適当な培地に懸濁する。細胞塊を除去した後、細胞を含んだ培地をシャーレにまいて 1時間培養する。

この条件であれば多くの心筋細胞はまだ浮遊状態にあるが、繊維芽細胞様細胞などの大部分の非心筋細胞はシャーレに接着するため、浮遊細胞を回収することにより、シャーレに接着した非心筋細胞を除去することができる。本発明の心筋細胞調製方法では、この段階で、すでに血液由来の細胞や大部分の赤血球が除去されているため、繊維芽細胞様細胞などの非心筋細胞のシャーレへの接着効率が高まる結果、効率よく非心筋細胞を除去することができる。シャ一レから浮遊している細胞を回収し、低張液などを用いて溶血処理することにより残存する赤血球を除去する。低張液などで溶血処理した細胞を適当な培地に懸濁後、シャーレにまいて 2 4時間程度培養すれば心筋細胞はシャーレに接着する。

この時点でシャーレに接着していない細胞は、殆どが傷害をうけた心筋細胞であり、れはシャーレを軽く震盪し、シャーレ内の培養液を攪拌後、培地を交換するだけで簡単に除去することができる。

従来の方法で得られる純度の低い心筋細胞では、混入する血液由来の非心筋細胞や傷害をうけた心筋細胞が凝集してプレートに接着するため、シャーレの震盪による攪拌と培地交換では十分に除去できない。このため純度の高い心筋細胞を得るためには、心筋細胞を接着させたプレートをさらに洗浄する必要が生じる。しかし心筋細胞に影響を与えずに、これらの好ましくない細胞を洗浄除去することは困難であり、従来の方法で多検体対応型の探索に必要な大量の心筋細胞を得ることは不可能であった。

さらに具体的に本発明の心筋細胞調製法について記述する。

例えば、ラットの新生仔などの心筋細胞を調製する場合は、まずラット新生仔をエーテルなどで麻酔し、腹部を消毒して心臓を摘出する。摘出した心臓はリン酸緩衝生理食塩水（PH 7. 4) などで洗浄した後、ハサミ等を用いて細片化する。細片の大きさは 1 mm³以下が好ましい。この細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水（pH 7. 4) 等で 4〜 5回程度洗浄し、血液由来の非心筋細胞をよく除去する。 '

次にこの心臓組織片をトリプシンゃコラゲナ一ゼなどの蛋白質分解酵素で消化して細胞を分離する。最適な酵素の種類、反応温度、反応時間などの条件は用いる動物の種類によって異なるが、例えば、ラットの新生仔の心筋細胞を用いる場合、新生仔 10匹分の組織片に対して 5 mlの酵素液（1mlの PBSに 1. 5 mgのトリプシン（ディフコ社製）と 0. 25 mgのコラゲナーゼ（シグマ社製）を溶解したもの）を加えて 1 5分間処理した後、 1 5分ごとに 2. 5 mlの酵素液を二回追加し、 37°Cに保ちながらスタ一ラーで攪拌して行うことができる。酵素反応は終濃度 10 %FCSなどの血清を含む Med ium l 9 9等の培地を加え、停止させる。反応停止後の細胞含有液を遠心分離して細胞を集め、 Medium 1 9 9等の適当な培地に懸濁する。これを、例えばセルストレイナー（ファルコン社製）などのフィルターを用いて濾過して細胞塊を除去した後、細胞を含んだ培地をシャーレにまいて 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 1時間培養する。細胞濃度は、新生仔 10匹分の細胞あたり培地 50 ml程度が好ましい。次に、シャーレから浮遊している細胞を回収し、'低張液で溶血処理して残存する赤血球を除去する。具体的には、新生仔 10匹分の心筋細胞を 2 mlの低張液（8. 29 g NH₄C1 , 1. Og KHC0₃, 37 mg EDTA/2Naを 1 Lの水に溶かしたもの)に懸濁し、 3分間放置することにより赤血球を破砕することができる。低張液で溶血処理した細胞を Medium 1 9 9 等の適当な培地に、 3 x 1 O w e 1 1 ( 9 6穴プレート）程度になるように懸濁後、シャーレにまいて 5 % C0₂、 37 °C に設定した C0₂インキュベータ一中で 2 4時間程度培養する。培養後、シャ一レを軽く震盪し、シャーレ内の培養液を攪拌後、培地を交換し、純度の高い心筋細胞を得る。

( 2 ) 本発明のアポトーシス検出方法

本方法によって得られた心筋細胞を、適切な細胞密度になるように調整して血清を含まない培地で培養するとアポトーシスを誘導することができ、 4日間の培養後に心筋細胞の生存率を 50%以下に下げることができる。

血清を除いたままの状態では生存している細胞の脱水素酵素活性などの生細胞の指標となる酵素の活性も低いため、 MTT還元法などで生細胞数を知ることは困難である。それに対し、本発明によれば、血清を除くことによりアポト一シスを誘導した心筋細胞培養液に再び血清を添加し、さらに約 6〜 3 0時間（好ましくは、約 17時間）培養して、生細胞内の脱水素酵素活性を高めることで、心筋細胞のアポトーシスを WST- 8を発色基質とする市販の細胞数計測キッ卜などで、簡便かつ高感度に検出することができる。血清除くことによりアポト —シスを誘導した心筋細胞培養液に血清を添加することにより生細胞内の脱水素酵素活性を高める方法を利用すれば、心筋細胞のアポトーシスの検出は、 MTT 還元法などでも行うこともできるが、感度面で発色基質に WST- 8を使用することで、さらに感度を高めることが出来る。

さらに具体的に本発明のアポト一シス検出方法について記述する。

本方法によって得られた心筋細胞を、細胞密度が 3 X 1 C^Zw e 1 1 ( 9 6穴プレート）程度になるように調製して血清を含まない培地 Med ium 1 9 9培地などで、 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 4日培養し、ァポトーシスを誘導させ、心筋細胞の生存率を 50%.以下に下げる。培養液に、例えば、終濃度 1 0 %になるように FCSなどの血清を添加し、さらに約 17時間培養し、 MTTまたは WST- 8を発色基質として脱水素酵素の活性 (還元活性）を測定することにより生細胞数を測定する。

本発明によれば、大量の高純度初代心筋細胞を従来の方法によるものと比べて簡便に得ることができる。また、培養液より血清を除去することによって誘導した心筋細胞のアポトーシスを効率的かつ高感度に検出することができる。本発明の方法はラットのみならず、マウス、モルモット、ゥサギ、ィヌ等の哺乳動物由来の心筋細胞にも応用することができる。

( 3 ) 心疾患予防 ·治療薬候補化合物のスクリーニング

本発明の心筋細胞調製方法により得られた心筋細胞を用いて、本発明のアポト一シス検出方法を実施することにより、アポト一シスを阻害する化合物またはその塩のスクリーニングを行うことができる。

具体的には、本発明の心筋細胞調製方法により得られた心筋細胞を用いて（i) 試験化合物存在下でアポトーシスを誘導させた場合と、（i i) 試験ィヒ合物非存在下でアポト一シスを誘導させた場合との生細胞数を比較することにより、ァポト一シスを阻害する化合物またはその塩のスクリーニングを行うことができる。以下、かかるスクリ一二ング方法を本発明のスクリ一ニング方法と称することがある。

具体的には後述の実施例に記載した方法またはそれに準じた方法によりスクリーニングを行うことができる。

かかるスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩は心筋細胞ァポトーシス抑制作用、 g p 1 3 0介在受容体作動活性または（および）心筋細胞保護シグナル増強作用を有するため、心疾患（例、うつ血性心筋症、肥大型閉塞性心筋症、肥大型非閉塞性心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、慢性心不全など）などの予防 ·治療薬として用いることができる。

試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であつてもよい。例えば、上記（i) の場合における生細胞数が上記（i i) の場合に比べて、約 2 0 %以上、好ましくは 3 0 %以上、より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を心筋細胞のアポトーシスを阻害す'る化合物として選択することがでさる。

本発明のスクリーニング方法で得られた化合物としては、 2— （2—ピリジル）一 4 H— 1， 3—ベンゾチアジン一 4一オン (化合物 1 ) などが挙げられる。

本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、心筋細胞のアポ] ^一シスを阻害する活性を有する化合物である。

該化合物の塩としては、酸（無機酸、有機酸）または塩基（無機塩基、有機塩基）との薬理学的に許容される塩などが挙げられる。

本発明のスクリニング方法により得られる化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、得られる化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記夕ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール (例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベー卜 8 0 ^TM、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど) 、保存剤 (例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど) 、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、トリ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、など）に対して投与することができる。得られる化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象などにより差異はあるが、例えば、心筋梗塞の予防 ·治療剤として該化合物またはその塩を投与する場合、一般的に成人（6 O k gとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約 0 . l m g〜l 0 O m g、好ましく'は約 1 . 0〜5 O m g、より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する。以下に実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。実施例は本発明の一例にすぎず、本発明はこれに限定されるものではない。実施例 1 本発明の方法により得られた心筋細胞と従来法により得られた心筋細胞の細胞数と純度の比較

実験は全てチヤ一ルスリバ一社製のウィスターラットの新生仔（生後 1日以内のもの）を使用して行った。ラット新生仔をエーテル麻酔し、 70 %ェタノ一ルで消毒後、ピンセットで心臓を摘出した。摘出した心臓はリン酸緩衝生理食塩水 (タ力ラ社製 T900)で洗浄後、手術用のハサミで細片化した。

従来法（五島喜輿太、金子洋之、心臓 ·血管研究方法の開発（江橋節郞編)、 3頁、学会出版センタ一刊行（1983) ) ではこの組織片を直接トリプシンゃコラゲナーゼなどの蛋白質分解酵素で消化した。一方、本発明の方法ではこれをリン酸緩衝生理食塩水で 4〜 5回洗浄して大部分の血液由来の非心筋細胞を除去してから酵素消化を行った。血液由来の非心筋細胞の洗浄除去は、セルストレイナ一（ファルコン社製）に心臓組織片を入れてリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することで行った。酵素消化は、新生仔 10匹分の組織片に対して 5 mlの酵素液（1mlの PBS (-) に 1. 25 mgのトリプシン（ディフコ社製）と 0. 25 mgのコラゲナ一ゼ（シグマ社製）を溶解したもの）を加えて 1 5分間処理した後、 1 5分とに 2. 5 mlの酵素液を二回追加し、 37T:に保ちながらスターラーで攪拌して行った。この過程で個々の細胞は組織片から分離された。反応終了後 10 % 牛胎仔血清（バイオウイカー社製）を含む Medium 199 (ギブコ社製）を酵素液の 1/2量添加して酵素反応を停止させ、これをセルストレイナーで濾過後、 400 X gで 5分間遠心分離して細胞を集めた。次に新生仔 10匹分の細胞を 50 mlの 10 % 牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁し、 100匪シャーレ（イワキ社製）に 10 ml ずつまいて 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 1時間培養した。浮遊.状態の細胞を回収してセルストレイナ一で濾過後、 400 X gで 5分間遠心分離して心筋細胞を集めた。

次に新生仔 10匹分の心筋細胞を 2 mlの低張液（8. 29 g NH₄C1, 1. Og KHC0₃, 37 mg EDTA/2Naを 1リツトルの水に溶かしたもの）に懸濁し、 3分間放置して赤血球を破碎した。これに 10 mlの 10 %牛胎仔血清を含む Medium 199を加えてから、 400 X gで 5分間遠心分離して心筋細胞を集めた。これを 10 %牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁してセルストレイナ一で濾過した。従来法ではこの低張溶血操作を行わなかった。

得られた細胞懸濁液の一部を取ってこれに 0. 3 %のトリパンブル一を添加した後に軽く混合して心筋細胞数を血球計算板を用いて計数した。従来法ではラット新生仔 10匹分の心臓から 7. 8 X 10⁶個の心筋細胞が得られたが、心筋細胞の約 7倍数の赤血球が混入していた。これに対して、本発明の方法では、ラット新生仔 10匹分の心臓から赤血球をほとんど含まない心筋細胞が 1. 4 X 10⁷個得られた。 . '

従来法および本発明の方法で調製した細胞をそれぞれ 4 X 10⁵個 /mlの濃度で 10 %牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁して 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂ インキュベータ一中で 24時間培養後、接着している細胞を回収して心筋細胞の純度をフローサイトメトリ一（FACScan、べクトン 'ディッキンソン社製）を用いて確かめた。 2 10⁶個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で 2回洗浄後、 70 % エタノールで固定した。この固定化細胞を Wash Buf f er ( 0. 2 %牛胎仔血清、 0. 1 % NaN₃を含むリン酸緩衝生理食塩水）で 2回洗浄後、 200 ^ 1の Wash Buf f er に懸濁し、マウス抗 a -ァクチニン抗体（シグマ社製）を添加して、 4でで 30 分暗所で保温した。これを Wash Buf f erで 2回洗浄後、 200 1の Wash Buf fer に懸濁し、 F ITCラベル化抗マウス抗体 (ジャクソン ·ィムノリサ一チ ·ラポラトリ一社製）を添加して、 4 で 30分暗所で保温した。さらに、 Wash Buf f er で 2回洗浄後、 500 lの Wash Buf ferに懸濁し、これをフ口一サイトメトリ一で分析した。その結果を図 1に示す。心筋細胞の純度は従来法によるものが約 70 %、本方法によるものが約 90 %であった。

実施例 2 Leukemi a Inhib i tory Fac torによるアポ! ^一シス抑制作用の検出感度の比較

実施例 1記載の本発明の心筋細胞調製方法により得られたラット新生仔心筋細胞を使用して、培養液より血清を除去して誘導したアポトーシスの、組換え体ヒト Leukemi a Inhib i tory Fac tor (hLIF ;ぺプロテック社製）による抑制を、 MTTを発色基質として用いた従来法と、 WST- 8又は MTTを発色基質として用いた本発明のアポトーシス検出方法とで検出し、その感度を比較した。

まず本発明の心筋細胞調製方法により得られた心筋細胞を 3 X 10⁵個 /mlとなるように 10 %牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁し、 96穴プレートに 0. 1 ml/we l lずつまいて 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 1 日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まない Med ium 199と 3回交換して血清を除去し、 0〜1000 U/mlの hLIFを添加した。培養液をさらに 4日間培養してアポトーシスを誘導した。従来法では、この培養液中の生細胞数を直接 MTTを発色基質として測定した。これに対して本発明の検出方法では牛胎仔血清を 10 %となるように添加し、 5 % C0₂、 37 °C に設定した C0₂インキュベータ一中でさらに約 Π時間培養した後、 WST-8又は MTTを発色基質として生細胞数を測定した。

図 2に種々の濃度の hLIFの心筋細胞アポトーシス抑制活性を MTTを発色基質として用いた従来法と、' WST- 8又は MTTを発色基質として用いた本発明のアポトーシス検出方法とで測定した結果を示す。従来法では hLIFによる心筋細胞ァポトーシス抑制傾向は見えるものの、 1000 U/mlの hLIFを添加しても hLIFを添加していない対照群と比較して吸光度平均値の上昇が 0. 03以下と非常に小さかった。これは測定機器の検出限界以下であり、従来法を多検体対応型の探索に用いることはできない。これに対して、本発明のアポト一シス検出方法において MTTを発色基質として用いた場合は、 hLIFを添加していない対照群の吸光度の平均値が 0. 1以上あり、これに 1000 U/mlの hLIFを添加することによつて吸光度がさらに 0. 1近く上昇するため、従来法より遥かに高感度である。この方法を用いれば、検体自身の吸光度や濁度が問題にならない場合や、 1000 U/mlの hLIFと同等以上の非常に強いアポ卜一シス抑制活性を示す検体の選択を目的とした探索は可能と考えられる。しかし実際の探索では、測定機器の検出感度、検体自身の吸光度や濁度に起因するノィズなどが問題となることが多いため、的確に活性を示す検体を選択するためには、 0. 1以上の吸光度の上昇を選択基準としうることが望まれる。本発明のアポトーシス検出方法において、 ST-8を発色基質として使用した場合はさらに感度が高く、 hLIFを添加していない対照群の吸光度の平均値は 0. 2以上あり、これに 1000 U/mlの hLIFを添加することによつて吸光度の平均値は 0. 3以上上昇し、しかもノィズにも強いことがわかった。以上のことから、本発明のアポト一シス検出方法を用いれば、 1000 U/mlの hLIFと同等の心筋細胞アポト一シス抑制活性、 gpl 30介在性受容体作動活性あるいは心筋細胞保護シグナル増強活性を示す検体はもちろんのこと、適切な選択基準を設定することで、多検体の混合物であっても活性を検出することが可能であることがわかった。

実施例 3 多検体対応型測定の実施

96穴プレートを用いて本発明の心筋細胞調製方法により得られた心筋細胞を培養し、培養液より血清を除去して誘導したアポトーシスを 1000 U/mlの hLIFを用いて抑制し、これを WST-8を発色基質として検出する方法で、多検体対応型の探索が可能か否かを検討した。 .

まず実施例 1記述の方法で得られた心筋細胞を 3 X 10⁵個/ mlとなるように 10 %牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁し、 3枚の 96穴プレートの 2〜11列に 0. 1 ml/we l lずつまいた。この際、 1列目と 12列目は細胞を含まないブランクとした。これを 5 ¾ C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 1 日培養した後、マイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌し、血清を含まない Med ium 199と 3回交換して血清を除去した。次に各プレートの 2〜6列に 1000 U/mlの hLIFを添加した。これを 4日間培養してアポトーシスを誘導した後、牛胎仔血清を 10 %となるように添加し、 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ—中でさらに _{1 7}時間培養した後、 WST-8を発色基質として生細胞数を測定した。

表 1にその結果を示す。

プレート 1、 2、 3、の hLIFを含まない対照群の吸光度の平均値はそれぞれ 0. 22 ± 0. 039、 0. 15 ± 0. 028、 0. 13土 0. 020で 1000 U/mlの hLIFを添加することによつてそれぞれ 0. 54± 0. 055、 0. 45 ±0. 035、 0. 43 ± 0. 059まで上昇した。実際の探索では、検体自身の吸光度や濁度に起因するノイズが問題となるため、的確に検体を選択するためには、 0. 1以上の吸光度の上昇を選択基準としうることが望ましい。従って、この方法を用いれば、仮に吸光度を対照群よりも 0. 15 以上上昇させる活性を選択基準として設定すれば、 240検体の中から l OOO U/nil の hL IFと同等の心筋細胞アポト一シス抑制活性、 gpl 30介在性受容体作動活性あるいは心筋細胞保護シグナル増強活性を示す 120検体を選別することが可能であることがわかった。

ϊ 実施例 4 Insulin Like Growth Factor- 1のアポ! ^一シス抑制作用の検出

Insulin Like Growth Factor_l (hIGF-1)は Aktを活性化することによって心筋細胞のアポトーシスを抑制することが知られている（Fujio Y. et al., Circulation 第 101巻、 660頁、 2000年）。そこで、組換え体ヒト IGF-1 ( IGF-1；ペブロテック社製）を用いて、培養液より血清を除去して誘導した心筋細胞のァポ! シスに対する抑制作用を、 WST- 8を発色基質とする本発明のアポトーシス検出方法で測定した。

まず本発明の心筋細胞調製方法で得られた心筋細胞を 3 X 10⁵個/ mlとなるように 10%牛胎仔血清を含む Medium 199に懸濁し、 96穴プレートに 0.1 ml/well ずつまいて、 5%C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベータ一中で 1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まない Medium 199と 3回交換して血清を除去し、終濃度 0〜100 nMになるように hIGF-1を添加した。培養液をさらに 4日間培養してアポトーシスを誘導した。これに牛胎仔血清を 10 %となるように添加し、 5 % C0₂、 37 °Cに設定した C0₂インキュベ一夕一中でさらに約 17時間培養した後、 WST-8を発色基質として生細胞数を測定した。

図 3に種々の濃度の hlGF- 1の心筋細胞アポトーシス抑制活性を測定した結果を示す。このように、本方法を用いれば、 gpl30シグナルと異なるメカニズムで心筋保護作用を示す化合物の探索も可能であることがわかった。

参考例 1 2— （2—ピリジル） -4H- 1, 3一べンゾチアジン— 4—オン

(化合物 1 )

チォサリチル酸メチル（1.6 g, 9.5 ImM)と 2—シァノピリジン (1. 0 g, 9. 6 OmM) とをトルエン（2ml) に溶解し、これにトリェチルァミン（2ml， 14. 4mM) を加え、 8時間加熱還流後、トルエンを留去した。残留物にエタノールを加え、析出物を濾取して粗結晶（1. 7 g) を得た。これを: (へキサン：クロ口ホルム二 5

1→クロ口ホルム）で精製し、表題化合物を結晶として得た（1. 0 g， 43.

4%) 。

元素分析値 C₁₃H₈N₂〇Sとして

計算値（％) € : 64. 98, H : 3. 36, N : l l. 66

実測値（％) C : 64. 93, H : 3. 31, N : l l. 59

^-NMR (CDC 1₃) δ ： 7. 50 - 7. 75 (m， 4 H) , 7. 85— 8. 00 (m, 1 H) ， 8. 50— 8. 60 (m， 2 H) , 8. 70-8. 8 0 (m， 1H) .

I R (KB r) : 1660 cm-¹

融点： 173. 5 - 174. 3

実施例 5

化合物 1 (10 Omg) 、ラク ] ス（165mg) 、コーンスターチ（2 5mg) 、ポリビニールアルコール (4mg) およびステアリン酸マグネシゥム（lmg) を用いて、常法により錠剤を製造する。産業上の利用可能性

本発明の心筋細胞調製方法により高純度、簡便かつ大量に心筋細胞を簡便かつ大量に調製することができる。また、本発明のアポト一シス検出方法により、心筋細胞のアポトーシスを、効率よく高感度に検出することができる。

さらに、本発明のスクリーニング方法により、心筋細胞のアポトーシスを阻害する化合物またはその塩を効率よく高感度にスクリ一ニングすることができ，多数の検体の中から迅速かつ効率よく選別する多検体に対応することができ、心筋細胞アポト一シス抑制作用を有する化合物、 gpl 30介在性受容体作動活性を有する化合物、あるいは心筋細胞保護シグナル増強作用を有する化合物を得ることができる。かかる化合物は心疾患の予防 ·治療薬として有用である。

Claims

請求の範囲

I . 細片化した心臓組織から非心筋細胞を除去した後、該心臓組織を蛋白質分解酵素で消化することを特徵とする初代心筋細胞の調製法。

2 . 細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより非心筋細胞を除去することを特徴とする請求項 1記載の調製法。

3 . 細片化した心臓組織を蛋白質分解酵素で消化した後に、赤血球を除去することを特徴とする初代心筋細胞の調製法。

4. 溶血処理を行うことにより赤血球を除去することを特徴とする請求項 3記載の調製法。

5 . 心臓組織より単離した心筋細胞を溶血処理することを特徴とする初代心筋細胞の調製法。

6 . 細片化した心臓組織から非心筋細胞を除去した後、該心臓組織を蛋白質分解酵素で消化し、赤血球を除去することを特徴とする初代心筋細胞の調製法。

7 . 細片化した心臓組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより非心筋細胞を除去し、蛋白質分解酵素で消化した心臓組織を溶血処理に付すことにより赤血球を除去することを特徴とする請求項 6記載の調製法。

8 . 無血清培地で培養することによりアポトーシスの誘導された心筋細胞の培養液に血清を添加した後、培養し、生存心筋細胞数を測定することを特徴とする心筋細胞アポトーシスの検出方法。

9 . 生存心筋細胞数が細胞内脱水素酵素活性を測定することにより測定される請求項 8記載の検出方法。

1 0 .血清添加後の培養時間が約 6〜 3 0時間である請求項 8記載の検出方法。

I I . 細胞内脱水素酵素活性を MT Tまたは WS T— 8を用いて測定することを特徴とする請求項 9記載の検出方法。

1 2 . 請求項 1〜 7のいずれかに記載の調製法により得られた初代心筋細胞を無血清培地で培養することを特徴とする請求項 8記載の検出方法。

1 3 . (0 試験化合物存在下でアポトーシスを誘導させた場合と、（i i)試験化合物非存在下でアポトーシスを誘導させた場合との生細胞数を請求項 1 2記載の検出方法により比較することを特徴とする、アポトーシスを阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

1 4 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する心筋細胞アポトーシス抑制薬。

1 5 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する ¾ P 1 3. 0介在受容体作動薬。

1 6 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を含有する心筋細胞保護シグナル増強薬。

1 7 . 心疾患予防 ·治療薬である、請求項 1 4記載の心筋細胞アポト一シス抑制薬、請求項 1 5記載の g p 1 3 0介在受容体作動薬または請求項 1 6記載の心筋細胞保護シグナル増強薬。

1 8 . 哺乳動物に対して、請求項 1 4記載の心筋細胞アポトーシス抑制薬、請求項 1 5記載の g p 1 3 0介在受容体作動薬または請求項 1 6記載の心筋細胞保護シグナル増強薬の有効量を投与することを特徴とする心疾患の予防 ·治療方法。

1 9 . 心疾患予防 ·治療剤を製造するための請求項 1 4記載の心筋細胞アポト一シス抑制薬、請求項 1 5記載の g p 1 3 0介在受容体作動薬または請求項 1 6記載の心筋細胞保護シグナル増強薬の使用。