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WO2002000191A2 - Bdellosomen - Google Patents

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WO2002000191A2
WO2002000191A2 PCT/EP2001/007454 EP0107454W WO0200191A2 WO 2002000191 A2 WO2002000191 A2 WO 2002000191A2 EP 0107454 W EP0107454 W EP 0107454W WO 0200191 A2 WO0200191 A2 WO 0200191A2
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WO
WIPO (PCT)
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group
monomers
particles
binding
cooh
Prior art date
Application number
PCT/EP2001/007454
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English (en)
French (fr)
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WO2002000191A9 (de
WO2002000191A3 (de
Inventor
Gerd Fricker
Rüdiger Marcus FLAIG
Original Assignee
Bernina Biosystems Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10118312A external-priority patent/DE10118312A1/de
Priority claimed from DE2001118852 external-priority patent/DE10118852A1/de
Application filed by Bernina Biosystems Gmbh filed Critical Bernina Biosystems Gmbh
Priority to US10/312,441 priority Critical patent/US20040062815A1/en
Priority to AU2001281921A priority patent/AU2001281921A1/en
Priority to EP01960426A priority patent/EP1333806A2/de
Publication of WO2002000191A2 publication Critical patent/WO2002000191A2/de
Publication of WO2002000191A3 publication Critical patent/WO2002000191A3/de
Publication of WO2002000191A9 publication Critical patent/WO2002000191A9/de

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)

Definitions

  • the invention relates to solid particles for transporting active pharmaceutical ingredients, processes for their production, medicaments containing these particles and the use of these particles in various selected indications.
  • a main goal of pharmaceutical research is to intensify the desired effects of known active substances and to minimize the systemic side effects, which is particularly important for substances with high intrinsic and thus unavoidable toxicity (e.g. cytostatics).
  • This can be achieved both by reducing the total dose required for the therapeutic effect and by accumulating the effectors at the desired site of action, both of which are due to the controlled, spatially specific release of effector molecules in the broadest sense (proteins, peptides, nucleic acids or low-molecular substances) can be accomplished in the desired target tissue.
  • this means the specific transfer of therapeutically or diagnostically usable substances into defined biological targets (“drug delivery”, “drug targeting”), which is an important goal of current pharmaceutical research.
  • the antibody technology available today allows the generation of high-affinity binding partners for almost any biological structure;
  • numerous natural ligands for cellular receptors have been characterized and cloned, so that it is no longer a problem to generate molecules with high and specific affinity for the desired targets.
  • low molecular weight ligands e.g. glycosides
  • these “searcher molecules”, whether micro- or macromolecular, generally do not themselves perform any pharmaceutically usable function, while the effectors themselves are not target-specific.
  • a main focus must therefore The aim is to bridge this separation and to combine the therapeutic potential of the available effectors with the target specificity of the searcher molecules.
  • An efficient way to do this is to store the substances in question in colloidal carrier particles, which are linked to antibodies against or natural ligands for characteristic molecular structures of the target and at the same time are protected against the immune system by inert coating of their surface.
  • a widely used method for the colloidal packaging of pharmaceuticals is to enclose the effectors in lipid membrane-enveloped vesicles (liposomes).
  • liposomes lipid membrane-enveloped vesicles
  • anti-immunogenic coatings e.g. polyethylene glycol
  • the advantages of this system are offset by the following serious disadvantages: -
  • the thermal and temporal stability of the vesicles consisting of a single lipid bilayer is limited, as is the tightness.
  • the permeability of the membranes for hydrophilic substances can be reduced, but the required modified (e.g. fluorinated) lipids are not biologically harmless.
  • the liposomes are loaded (apart from a few special cases) by simply enclosing part of the aqueous phase and are accordingly inefficient: Typically ⁇ 0.5% of the effector substance is enclosed in the vesicles. Here, the substance is exposed to considerable thermal and chemical loads 5 (the working temperature must be above the critical phase transition temperature of the lipid mixture for a long time, and the reactive groups required for the covalent modification only survive this at a very low pH).
  • Nanoparticles are available as an alternative.
  • Particles in the micrometer and submicron range made of hydrophobic polymers can in principle be produced by finely dispersing the polymer taken up in a non-polar solvent: by removing the solvent, the polymer precipitates in the form of particles whose diameter is below that of the droplets;
  • Loading with hydrophobic substances can be accomplished by simply adding the substance to the non-polar solvent: After removing the solvent, the active substance is almost 100% associated with the polymer and remains when the particles are introduced into an aqueous phase by Van der Waals forces and steric entrapment, non-covalently, but bound to the particle matrix in the long term.
  • DE 198 10 965 A1 describes polymolecular nanoparticles made of a polyelectrolyte complex of polycations and polyanions, which is treated with a crosslinking agent.
  • No. 6,117,454 describes in particular polymolecular nanoparticles which are suitable for penetrating the blood-brain barrier due to a coating of fatty acid derivatives.
  • high-affinity ligands generally against biological structures (e.g. proteins) i.a. are not available on a scale that they are suitable for immediate surface coating (which requires comparable amounts to the particle matrix) even if appropriate physical properties are present (which is not the case for antibodies), and also wherever possible is strongly advised against the introduction of such masses of molecules that bind highly affinity to biological targets and which are to be expected to partially detach from the particles and to bind independently of these to their targets.
  • No. 5,641,515 describes polymolecular nanoparticles made of polycyanoacrylate containing insulin, which release the complex-bound insulin in a controlled manner.
  • a polymeric polyol in particular polyvinyl alcohol, is esterified with, for example, polycondensing hydroxycarboxylic acid, so that, starting from the polyol backbone, polycondensed side chains of different lengths and a terminal free OH group are formed with the aim of changing the properties of the polyol esters.
  • the production process of the polymer is considerably more complex and ( due to the influence of numerous process parameters) less robust and also leads to a less structured polymer, which is not able to automatically form monomolecular particles, but is converted "by controlled precipitation into colloidal form".
  • the resulting “colloidal associates” lack due to the lack of defined end pieces of the surface layer that is chemically different from the rest of the particle, although covalently associated with it, with which a defined surface modification can be carried out.
  • the particles according to DE 198 39 515 are therefore for one Use in the field of "drug targeting", particularly unsuitable for surface modification in the sense of this invention, and can only be used as "sustained release” formulations.
  • polycondensed molecular side chains composed of chain-forming monomers each having at least one binding group (y) and at least one binding group (x ') or composed of different chain-forming monomers, of which one monomer has at least two binding groups (y) and another
  • Monomer has at least two binding groups (x '), or built up from different chain-forming monomers, of which one monomer has at least two binding groups (y), another monomer has at least two binding groups (x') and another at least one binding group (y) and at least one has a binding group (x '), where (x') is a covalent bond with
  • the molar ratio between the monomers of the molecular backbone and the side chain end pieces (c) is approximately equimolar
  • x, x ', y and y' are independently selected from OH, SH, COOH or NH 2 under the condition that x / x ', x' / y and y / y 'respectively correspond to pairs of bonds x / x', x '/ y or y / y' (with the corresponding bond) selected from OH / COOH (ester
  • z is selected from CH 3 , OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a suitable protective group,
  • protective groups for certain functional residues and their removal are well known to the person skilled in the art. Possible protective groups would be, for example, FMOC to protect an amino function, the removal being carried out by treatment with catalytic amounts of piperidine.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which the effect and minimization of the side effects are increased by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule.
  • the particles encompassed by the invention are preferably solid, colloidal and / or lipid-free particle systems.
  • a particular advantage of the groups according to the invention is that due to the presence of functional groups, in particular amino groups, which are not otherwise found in the polymer particle, the surface layer is formed in such a way that the particles are encased in a polar zone caused by the charge of these functional groups, the charge of which counteracts the flocculation and thereby stabilizes the particle suspension, and
  • the size, shape and surface of the molecule are clearly defined in a controllable manner, since the choice of molar ratios determines the structure of the resulting molecule, while reaction parameters such as time, temperature, pressure etc. do not have any significant influences under normal conditions.
  • the polymeric side chains furthermore enable the particles to bind and transport large amounts of various active ingredients with different chemical properties in a non-covalent manner by "steric entrapment".
  • the invention also relates, inter alia, to solid particles for transporting amphiphilic or lipophilic active substances or hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances, comprising a molecule of a branched polycondensate, the polycondensate consisting of a backbone made of a multifunctional, preferably unbranched or at most three branched , Macromolecule, preferably polyvinyl alcohol, whose functional groups (in the case of polyvinyl alcohol, ie the OH groups) are covalently linked to secondary, preferably also unbranched or at most three-branched, polycondensate chains, which in the following are referred to as secondary chains of linked polycondensate chains bifunctional or ganic monomers (which may be heterobifunctional molecules or their derivatives or an equimolar mixture of two homobifunctional molecules or their derivatives), preferably from esterified hydroxycarboxylic acids or a combination of diols and dicarboxylic acids in a molar ratio 1
  • this monofunctional molecule in the sense of the condensation reaction is provided with a second functional group, which is protected during the condensation reaction by a protective group and cannot otherwise be found in the molecule and which can be split off in a second step after the completion of the condensation reaction, so that after In the second reaction step, the chains end with specific functional groups.
  • Fig. 2a the formation and structure of a general polycondensate from an unbranched, multifunctional backbone, a heterobifunctional side chain monomer and an end piece matching this combination is shown schematically.
  • the original monomers which split off water or other small molecules in the condensation reaction, or their corresponding derivatives, for example anhydrides, lactones, etc. or other derivatives formed by the separation of small molecules, can be used in each case in the formation of the side chains. It is also possible to use “prefabricated” oligomers with functional groups (for example oligopeptides) that are freely available in the sense of the condensation reaction, alone or in any combination with homo- or heterobifunctional monomers; such prefabricated building blocks are also subsumed below under the name “monomers” become.
  • Desired exposed group (s) this must be provided with a suitable protective group before synthesis in order to prevent inclusion in the polycondensation process
  • Backbone molecule (defines the orientation of the side chains through its functional groups).
  • Telo-End i.e. Telo-Alanyl-Polylactid or equivalent
  • Telo-End i.e. Telo-Alanyl-Polylactid or equivalent
  • the whole molecule therefore as backbone-Moiekuiarweight-telo ⁇ free group ⁇ End
  • Communicating-Poly-Monomer with animal side chain weight-at, so for example Polyvinyl 200'000-telo ⁇ amino ⁇ alanyl polylactide 50 oat, polyacryl 50'000-telo ⁇ amino-no.
  • Sulfhydro ⁇ cysteyl-poly (glycol: adipine) 8000at (or equivalent).
  • polymers described in the list have different suitability depending on the objective; for example amino-containing, but thiol-free searcher molecules with appropriate variation of the protocol (first linking the finder and linker, then reaction of the particles with the searcher-linker complex) by means of the usual, however reversed oriented NHS-ester-PEG-vinylsulfone linker Particles of thioctenate, inverse thioctenate or thioamidoctenate are coupled.
  • the particles according to the invention contain non-covalently bound, hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredient.
  • Hydrophobized active substances are originally understood to be more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic as a result of chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances.
  • Another preferred object of the invention which also solves the problem and has the preferred properties mentioned, are monomolecular solid particles for transporting hydrophobic or hydrophobized active ingredients which can be prepared by a process in which the unbranched or maximally three-branched polymer backbone composed of monomers with at least one binding group (x) on each monomer
  • chain-forming side chain monomers each having at least one binding group (y) and at least one binding group (x '), where (x') can form both a covalent bond with (x) and with (y),
  • - x, x ⁇ y and y ' are independently selected from OH, SH, COOH or NH 2 under the condition that x / x', x '/ y and y / y' respectively correspond to bond pairs x / x ', x '/ y or y / y' (with the corresponding bond) selected from OH / COOH (ester bond -OC (O) -), NH 2 / COOH (amide bond -NH-C (O) -), SH / COOH (thioester bond -SC (O) -), COOH / OH (ester bond -OC (O) -), COOH / NH 2 (amide bond -NH-C (O) -) or Form COOH / SH (thioester bond -SC (O) -),
  • - z is selected from CH 3 , OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a suitable protective group and
  • the side chain monomers can be used as pure monomers or derivatives such as intramolecular anhydrides or lactones, as long as they can still form chains with themselves and / or other side chain monomers.
  • Another preferred object of the invention which also achieves the object and has the preferred properties mentioned, are monomolecular solid particles for transporting hydrophobic or hydrophobized active substances which can be prepared by a process in which unbranched or at most three times branched Polymer backbone made up of monomers with at least one binding group (x) on each monomer
  • polycondensed molecular side chains composed of monomers each having at least one binding group (y) and at least one binding group (x ') or composed of different monomers, of which one monomer has at least two binding groups (y) and another monomer has at least two binding groups (x') , or built up from different monomers, of which one monomer has at least two binding groups (y), another monomer has at least two binding groups (x ') and another at least one binding group (y) and at least one binding group (x'), where (x ' ) can form a covalent bond with (x) as well as (y), whereby at the end of the molecular side chains in each case covalently via a (y) - (y ') bond, side chain end pieces which have at least one binding group (y'), no binding group (y) and at least one free group (z) optionally provided with a protective group, where (y ') can form a covalent bond with (y), s ind,
  • the molar ratio between the monomers of the molecular backbone and the side chain end pieces (c) is approximately equimolar
  • x, x ', y and y' are independently selected from OH, SH, COOH or NH 2 under the condition that x / x ', x' / y and y / y 'respectively correspond to pairs of bonds x / x', x '/ y or y / y '(with the corresponding bond) selected from OH / COOH (ester bond -OC (O) -), NH 2 / COOH (amide bond -NH-C (O) -), SH / COOH (Thio-ester bond -S- C (O) -), COOH / OH (ester bond -OC (O) -), COOH / NH 2 (amide bond -NH-C (O) -) or COOH / SH (thioester bond -SC (O) -) form and
  • z is selected from CH 3 , OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a protective group.
  • the free OH groups of the polyvinyl alcohol backbone are esterified with the hydroxycarboxylic acid forming polycondensates, while the non-hydroxycarboxylic acid serve as end pieces of these side chains.
  • the function of the non-hydroxycarboxylic acid is analogous to that of the free radical scavengers used to determine the average chain length in free-radical polymerization reactions.
  • the contacting takes place in an anhydrous organic solvent, preferably pyridine, although it is also favorable and a preferred embodiment of the process if the contacting takes place in the presence of thionyl chloride and / or - if necessary - for example after the reaction protective groups may be split off with thionyl chloride.
  • thionyl chloride preferably pyridine
  • protective groups for certain functional residues and their removal are well known to the person skilled in the art. Possible protective groups would be, for example, FMOC to protect an amino function, the removal being carried out by treatment with catalytic amounts of piperidine.
  • Preferred monomolecular particles of the invention have a length, diameter and volume as indicated in the application. Both the size and the shape of the particle can be controlled by suitable modification of the polymeric structure. A long polymer backbone with shorter side chains results in elongated particles, whereas a short polymer backbone with long side chains gives spherical particles. Usually, however, the bulbosomes form elongated particles, particles with a length of approx. 2 ⁇ m with a diameter of as small as 5 nm being able to be produced compared to the usually spherical liposomes. Both the shape and the smaller size compared to classic liposomes offer great advantages in targeted
  • the molecular backbone made from a polymer made up of monomers can be a backbone made from only one type of monomer (homopolymer) or a backbone made from more than one type of monomer (copolymer).
  • Preferred polymers composed of only one monomer for the backbone are polyvinyl alcohol, polyvinylamine or polyacrylic acid.
  • the copolymers composed of more than one monomer are preferably those of 2 to 5, particularly preferably of 2 different monomers. These monomers can be selected from the monomers for the polymers for the backbone mentioned in the description.
  • Monomers for polyvinyl alcohol, polyvinylamine or polyacrylic acid are preferred.
  • the molecular backbone preferably comprises an average of 500 to 20,000 monomer units, particularly preferably from 1,000 to 10,000, particularly preferably from 2,000 to 7,000 monomer units.
  • the monomer units for the polymer backbone each contain at least one binding group x, preferably from 1 to 4 binding groups x, particularly preferably 1 or 2 binding groups x.
  • the molecular side chains preferably comprise on average from 10 to 10,000 monomer units, more preferably from 50 to 5000 and particularly preferably from 80 to 2000 monomer units.
  • the ratio of monomer units in the side chain to the side chain end piece is usually much larger than one. Preferred are the ranges which result from the ranges given above for the number of monomer units in the molecular side chain.
  • the molar ratio of monomers of the molecular backbone to the side chain end pieces is usually approximately equimolar, preferably from 1: 0.8 to 0.8: 1, more preferably 1: 0.9 to 0.9: 1, most preferably equimolar.
  • This information relates to unbranched molecular side chains.
  • the molecular side chains can also be branched, with little branching being preferred when there are branches, i.e. preferably 1 to 4 branches per side chain, particularly preferably 1 or 2 branches per side chain. If such branches exist, the molar ratio of monomers of the molecular backbone to the side chain end pieces changes accordingly.
  • the linkers preferably linkers made of polyalkylene glycols, particularly preferably polyethylene glycol, usually have a molecular weight in a range which is customary for these molecules, for example as indicated in the examples, but preferably in the range from 500 to 10,000, more preferably from 1500 to 5000th
  • the side chain end pieces can have free groups (z).
  • the selection of side chain end pieces can be such that a variable proportion of side chains has a free group (z). So 100% to 0% of the side chains can have a free group (z), depending on the desired further modification possibilities.
  • Suitable proportions of free groups (z) are, for example, from 1 to 10%, from 1 to 25%, or also from 50 to 99%, from 75 to 95% and from 80 to 90%.
  • the monomolecular particles according to the invention can be easily prepared in good yields from the polymers described here and loaded with active ingredients. Usually, simply dissolving in suitable solvents together with the active substance substance of interest is sufficient. Surprisingly, large proportions of the polymers can be converted into monomolecular particles loaded with the active ingredient without mechanical treatment, which is not disadvantageous, however. According to the invention conversions of more than 50% can be achieved, preferably more than 80%, more preferably more than 90% and particularly preferably more than 95%, by mass. Particles in the desired submicrometer range are obtained.
  • the monomolecular particles preferred in the present invention are particularly suitable for the transport of active substance molecules.
  • the present invention therefore also claims the use of the particles described for the manufacture of a medicament and for the application of active substances.
  • the invention also includes a method for the use of active substances, in which the particles according to the invention are used as active substance carriers.
  • the preferred ranges described in the present application also apply here.
  • Alternative methods of producing the ktenate for example by solid phase synthesis according to Merrifield, are also the subject of the present invention as long as the basic structure of the finished molecules corresponds to the given definitions of the ktenate.
  • a further process step then follows, in which the product is then dissolved together with the hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredient to be transported in an anhydrous organic solvent, then the solution is incubated for some time, preferably overnight, preferably at room temperature, o then the solution is saturated with water and then the water-saturated solution is dissolved in a larger volume of water, optionally followed by mechanical treatment (preferably not by ultrasound) and then optionally the particles are cleaned and isolated.
  • dialysis is preferably used if this is necessary at this stage of the process.
  • the anhydrous organic solvent dissolves in water in the ratio solvent: water between 1:10 and 1:50, preferably between 1:20 and 1:40 , in particular between 1:20 and 1:30, and / or is preferably selected from:
  • Methylene chloride or benzyl alcohol preferably benzyl alcohol.
  • the polymer backbone is unbranched or branched at most once, preferably unbranched.
  • the monomers of the side chain each have a maximum of two groups (y) and a maximum of two groups (x ') and / or
  • the group (y) in the monomers of the side chain corresponds to the group (x) in the polymer backbone and / or
  • the group (x ') in the monomers of the side chain corresponds to the group (y') in the side chain end piece and / or
  • the group (z) is selected from the “free groups” OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a protective group,
  • the monomers of the side chain each have a maximum of 2 to 10 C atoms, preferably 2 to 6 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or
  • the monomers of the side chain which have both the group (y) and the group (x '), either only 1 group (y) and 1-2, preferably 1, groups (x') or only 1 group (x ') and 1-2, preferably 1, groups (y) and / or
  • the monomers of the side chains are identical except for the side chain end piece with 1 group (y) and 1 group (x '), or the monomers of the side chains are constructed identically and monotonously alternating except for the side chain end piece from alternating monomer with 2 groups (x' ) and a monomer with 2 groups (y).
  • the term “free groups” as a definition for group (z) as selected from OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a protective group is a fixed definition in the sense of this invention ,
  • the polymer backbone is selected from
  • Polyvinyl alcohol polyacrylic acid, polyvinylamine, polysaccharide or polyamino acid,
  • the monomers of the side chain are selected from
  • Hydroxycarboxylic acids amino acids, the combination of diamines and dicarboxylic acids or the combination of diols and dicarboxylic acids, or their derivatives
  • hydroxycarboxylic acids or the combination of diols and dicarboxylic acids or their derivatives
  • hydroxycarboxylic acids such as lactic acid, glycolic acid, tartaric acid or citric acid or their derivatives.
  • the side chain end pieces are selected from
  • unprotected amino acids N-protected amino acids, COOH-protected amino acids, unprotected amino alcohols, N-protected amino alcohols, O-protected amino alcohols, unprotected thiol alcohols, O-protected thio alcohols, S-protected thio alcohols or unprotected thiol acids, S-protected Thiol acids, COOH-protected thiol acids, unprotected thioamines, S-protected thioamines or N-protected thioamines,
  • unprotected amino acids such as alanine
  • N-protected amino acids such as N-FMOC- ⁇ -alanine
  • unprotected thiol acids such as S-protected thiol acids.
  • A-protected means that a functional group “A” of the molecule in question is provided with a protective group of any nature, which can be removed following the condensation reaction.
  • the polymer backbone, the monomers of the side chain or their derivatives and the side chain end piece or its derivatives are selected from one of the following combinations:
  • the particles are nanoparticles and accordingly have a length ⁇ 5 ⁇ m, preferably ⁇ 3 ⁇ m, in particular ⁇ 2 ⁇ m and / or a thickness and width of ⁇ 200 nm, preferably ⁇ 75 nm, in particular ⁇ 30 nm.
  • Nanoparticles are particles with a size of less than 1 ⁇ m in at least two dimensions. In particular, nanoparticles have a volume of less than 1 ⁇ m 3 . Nanoparticles are solid colloidal particles.
  • the particles according to the invention are specially surface-modified. It is precisely these particles that achieve the object of the invention in an outstanding manner, since they are particularly suitable for targeted transport.
  • the invention therefore furthermore relates to particles according to the invention for the transport of pharmaceutical active substances, to the linker molecules, which have a reactive group (z ') selected from groups which, with one of the groups (z) selected from the "free groups" already defined above.
  • (z) selected from OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group can enter into a covalent bond, preferably have an amino- or thiol-reactive group, in particular an amino-reactive group, covalently via (z ') - ( z) bonds with groups (z) selected from the “free groups” on the surface of the particle.
  • these “free groups” (z) are made available on the surface (optionally after removal of the protective group) by the side chain end pieces.
  • Linker molecules are understood to mean polymers, in particular unbranched or at most three-branched polymers, which change the properties, in particular the surface properties, of the particle, but in particular serve for the sterically favorable attachment of other bioactive compounds to the particles or, if appropriate, also the particles Protect sterically from degradation.
  • Reactive group [(z ') and also other (z ”)] are to be understood in particular as groups known in the prior art which are slightly covalently attached to the“ free groups ”(z), in particular amino groups, defined above. , Thiol, carboxy or hydroxy groups bind, as well as to epoxy or vinyl groups.
  • the linker molecules are bifunctional and, in addition to the reactive group (z ') which binds to the particle according to the invention, also a further reactive group (z ") at another end of the molecule, selected from reactive groups with one of the groups (z) selected from the "free groups” (z) selected from OH, SH, COOH or NH 2 and the vinyl or epoxy group can form a covalent bond, preferably a thiol-reactive group, where z ' ⁇ z "is.
  • the thiol-reactive group binds to the particle according to the invention and (for bifunctional linkers) would be, for example, an amino-reactive group at another end of the linker molecule.
  • the choice of the reactive groups of the linker molecules depends on the one hand on the free group (s), preferably the free group, on the particle according to the invention to which the linker binds. On the other hand, it depends on any further modification or the surface property transferred by the linker, in particular a possible second reactive group on the linker molecule is determined by the nature of a molecule which may still be synthesized or already synthesized on the linker.
  • the linker molecules are a mixture of the described bifunctional molecules and monofunctional molecules which, in addition to the reactive group (z ') which binds to the particles according to the invention, preferably the amino- or thiol-reactive group, in particular the amino-reactive group have no other, differently reactive functional group (z ") with z ' ⁇ z" at any other end of the molecule.
  • These particles are very cheap because bulky residues such as antibodies can be attached to the bifunctional residues without hindrance, while the monofunctional linkers sterically prevent degradation. These particles are also known as acanthus. It is again particularly preferred if significantly more, preferably at least 100% more, monofunctional than bifunctional molecules are covalently bound to the surface of these particles (acanthospheres).
  • bioactive macromolecules or “searcher” molecules selected from peptides, proteins; preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as “single-chain” antibodies are attached to the bifunctional linker molecules; Hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars, which are coupled via a bond to the reactive group (z "), are coupled or were coupled before the surface modification.
  • finder in the sense of this invention is generally understood to mean compounds which can be coupled to the particles according to the invention and which are capable, with high affinity, of the biological targets of the active substances, as if there were proteins, peptides, polysaccharides, oligosaccharides To bind lipoproteins, glycoproteins or other biological molecules that are expressed either in healthy tissue (physiological) or in or near diseased tissue (pathological).
  • “Finder” molecules can include, for example, peptides, proteins, for example antibodies, antibody fragments or antibody derivatives target-binding properties such as "single-chain" antibodies; hormones, sugars, for example glycosides; synthetic or natural receptor ligands. Antibodies, derivatives, fragments and glycosides are particularly preferred.
  • bioactive macromolecules or generally “searcher” molecules preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as “single-chain” antibodies, in particular with a free cysteine group, are attached to the bifunctional linker molecules Binding to the reactive group (z ”) are coupled, are coupled or before the surface modification were connected. This applies in particular to particles whose coating contains significantly more monofunctional than bifunctional molecules.
  • a completely covalently linked macromolecule is obtained in this way, which has the following architecture: a central axis made of polyvinyl alcohol (or another high molecular weight polymer), of whose OH groups (or corresponding functional groups) hydrophobic polycondensates starting from hydroxycarboxylic acids (or other condensable monomers) which terminate with non-hydroxycarboxylic acids (or other suitable end pieces), which either end freely in hydrophilic groups or which are linked to polymeric, more hydrophilic linkers, part of these linkers in turn being “seekers "Connect molecules.
  • bioactive micromolecules or “searcher” molecules preferably sugars, in particular thiosugars, hormones or proteins, in particular with a free cysteine group, are coupled to the bifunctional linker molecules via a bond to the reactive group (z ”) , be coupled or were coupled before the surface modification.
  • searcher preferably sugars, in particular thiosugars, hormones or proteins, in particular with a free cysteine group
  • the linker molecules are monofunctional molecules which, in addition to the reactive group (z ') which binds to the particle according to the invention, preferably the amino- or thiol-reactive group, in particular the amino-reactive group, at no other end of the molecule have another, differently reactive group (z ") with z ' ⁇ z".
  • the linker molecules are polyglycolides, preferably polyethylene glycol derivatives, in particular NHS ester polyethylene glycol or NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol.
  • any subsequent cleaning or isolation is preferably carried out via dialysis, preferably with selective exclusion membranes.
  • the pharmaceutical active ingredient to be transported is a synthetic or natural active ingredient, a protein, peptide, lipid, sugar or nucleic acid or a low molecular weight organic or high molecular weight organic active ingredient, for example a hormone, an antineoplastic substance, an antibiotic, antifungal, parasiticide, virustatic or antihelmintic, a cardiovascular active substance; a central active substance, especially an analgesic, antidepressant or antiepileptic; is.
  • the particle according to the invention is linked directly or via a linker, preferably via bifunctional polyethylene glycol molecules, to a “seeker” molecule selected from:
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain” antibodies; hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars.
  • the processes for producing particles according to the invention are also an important part of the invention.
  • the invention therefore furthermore relates to a process for the preparation of a particle according to the invention, in which an unbranched or at most three-branched polymer backbone composed of monomers with at least one binding group (x) on each monomer Monomers each having at least one binding group (y) and at least one binding group (x '), where (x') can form a covalent bond with both (x) and (y),
  • the molar ratio between the monomers of the molecular backbone and the side chain end pieces (c) is approximately equimolar
  • x, x ', y and y' are independently selected from OH, SH, COOH or NH 2 under the condition that x / x ', x' / y and y / y 'respectively correspond to pairs of bonds x / x', x '/ y or y / y' (with the corresponding bond) selected from OH / COOH (ester bond -OC (O) -), NH 2 / COOH (amide bond -NH-C (O) -), SH / COOH (thioester bond -S- C (O) -), COOH / OH (ester -Bond -OC (O) -), COOH / NH 2 (amide bond -NH-C (O) -) or COOH / SH (thio-ester bond -SC (O) -),
  • z is selected from CH3, OH, SH, COOH or NH2 and the vinyl or epoxy group, optionally protected by a protective group and
  • the side chain monomers can be used as pure monomers or derivatives such as intramolecular anhydrides or lactones, as long as they can still form chains with themselves and / or other side chain monomers,
  • an anhydrous organic solvent preferably pyridine
  • thionyl chloride if appropriate in the presence of thionyl chloride and then if appropriate purified, preferably by dialysis against H 2 O, and if appropriate isolated
  • the particles with the hydrophobic or hydrophobized active ingredient to be transported are dissolved in an anhydrous organic solvent, then the solution is incubated for some time, preferably overnight, preferably at room temperature, then the solution is saturated with water and then the water-saturated solution is dissolved in a larger volume of water, optionally followed by mechanical treatment and then optionally the particles are cleaned, preferably by dialysis against H 2 O, and isolated.
  • Another object of the invention is a method for producing a particle according to the invention (with linker molecule), in which particle according to the invention (without linker molecule), which contains a group (z) selected from the free groups with a linker molecule containing a reactive group (z '), which can form a covalent bond with group (z), under for training brings this covalent bond into contact with suitable conditions and then optionally cleans the particles, preferably by dialysis against H 2 O, and isolates them. For example, neutral to weakly basic conditions are suitable.
  • Another object of the invention is a process for the production of a particle according to the invention (with linker molecule and "finder” molecule), in which particles (with linker molecule) which are subsequently produced and which are linked to the bifunctional molecule Linker molecules have a free reactive group (z ") with bioactive macromolecules or" finder “molecules as defined above to form a bond between the group (z") and the bioactive macromolecules or “finder” molecules under suitable conditions in Brings contact and optionally then cleans the particles, preferably by dialysis against H 2 O, and isolated.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms for enhancing the desired effects of known active substances and for minimizing systemic side effects by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule. They are therefore suitable and intended to be used in a wide variety of therapeutic agents.
  • the invention therefore furthermore relates to medicaments which contain particles according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • the pharmaceuticals according to the invention can be administered as liquid dosage forms in the form of aerosols, injection solutions, drops or juices or as semi-solid dosage forms in the form of granules, tablets, pellets or capsules.
  • Suitable additives and / or auxiliaries are, for example, solvents or diluents, stabilizers, suspending agents, buffer substances, preservatives, and also dyes, fillers and / or binders.
  • the choice of excipients and the amounts to be used depends on whether the medicament is to be administered, for example, by inhalation, orally, orally, parenterally, intravascularly, intravenously, intraperitoneally, rectally, subcutaneously or intramuscularly.
  • Preparations in the form of tablets, dragees, capsules, granules or suspensions such as drops, juices and syrups are suitable for oral applications, suspensions and easily reconstitutable dry preparations are suitable for other applications.
  • the particles according to the invention are also particularly suitable as diagnostics since, for example, they can specifically introduce markers into the correct cell.
  • Another object of the invention is therefore a diagnostic that contains particles according to the invention and optionally suitable additives and / or auxiliary substances.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which an enhancement of the effect and minimization of the side effects is achieved by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule, so that these particles can be used generally for the production of therapeutic agents and are of course generally suitable for an unlimited number of indications. Without wishing to restrict the use of the particles according to the invention to this, their use lends itself to special indications.
  • Another object of the invention is therefore the use of the particles according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, for the treatment of infectious diseases and parasitoses, for the treatment of diseases and symptoms with a central nervous cause, for use in gene therapy or for genomic targeting.
  • the use in targeting cytostatic agents on tumor cells, in the transport of therapeutically usable substances through the blood-brain barrier and in the treatment of serious infections (in particular by eukaryotes) is also preferred.
  • Other possible uses include, for example, the transfer of plant alkaloids with a microbicidal effect in trypanosomes and of antioxidants and anti-inflammatory compounds [vitamin E, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine, 2,6-bis (tert-butyl) -4 -Mercaptophenol, Ibuprofen and Gentisinkla] in (degenerative) Gehimer diseases, the transfer of substances in hepatocytes, primarily for the treatment of neoplasms, also the increase in the effect of Primaquin on the P / asmooVwm hypnozoites that persist in the liver cells.
  • the particles according to the invention are also effective against Trypanosoma brucei bruce
  • Another object of the method is also the treatment of a person or animal who needs this treatment with or using the particles according to the invention.
  • This treatment is particularly suitable for the aforementioned indications and types of use.
  • Figure 1 shows schematically the general structure and shape of particles according to the invention, simple particles, simple stealth particles, target-seeking actinospheres and target-seeking acanthospheres.
  • Figures 2a and 2b show the synthesis of ktenates.
  • the resulting molecule (a ⁇ 4000, b ⁇ 100) has a comb-shaped architecture that leads to a "bottle brush" shape. It is able to form monomolecular particles with a MW of> 30,000 kDa between them without additional protective colloid The exposed amino groups of these particles can react with NHS esters and in this way can be linked with PEG spines.
  • Figure 3 shows the overall structure of a finished monomolecular particle with spines, also called "Bdellosom” (Greek from lactic acid-ß-alanine ktenate.
  • Ligands bound to distal ends of the PEG via vinyl sulfone; z. B. BSA, IgG (picture) and antibody fragments, transferrin ...
  • Loading e.g. B. alkaloids, daunomycin
  • Figure 4 shows an electron micrograph of BSA-conjugated ktenate particles (acanthospheres).
  • Figure 5 shows the results of a model test on the unicellular parasite Trypanosoma bruce. The binding of particles produced according to the invention to the target cells correlates with the parasiticidal action of the contained daunomycin.
  • nanoparticles in which it is possible to incorporate active substances into colloidal carrier particles.
  • These can optionally be linked, for example, with antibodies to or natural ligands for characteristic molecular structures of the target or other “searcher molecules”.
  • the nanoparticles can also be protected against the immune system, for example, at the same time by inert coating of their surface.
  • the examples described here are from Particles of Colloidal Lipid-Free Particle Systems Included in the Invention Some of the particles described herein that are encompassed by the invention are hereinafter referred to with the general terms actinospheres and acanthospheres (see Fig. 1). These terms are used because they are structural concepts and not steric basic forms denote regardless of the actual geometry.
  • the particles are generally referred to as Bdellosomes.
  • the example is based on monomolecular particles made from a complex structured polylactide derivative, referred to as ktenate due to its comb structure.
  • the particle systems are realized by synthesizing monomolecular particles based on polyvinyl alcohol as the "backbone", to whose OH groups chains of polymeric lactic acid (or another suitable hydroxycarboxylic acid) are condensed.
  • the length of the polyvinyl backbone therefore determines the size of the particle in one dimension (longitudinal axis) and is referred to below as a.
  • each of these monomers has an OH end to which the next acid molecule (either a similar monomer or a terminating molecule of non-hydroxycarboxylic acid) can attach, and a COOH end that connects with another Hydroxyl group (either that of a similar monomer or an OH group of the polyvinyl backbone which leads to the end of chain growth), it is possible to provide “end pieces” by adding small but mutually equimolar amounts of acid-free alcohol and non-hydroxylated carboxylic acid whose concentration regulates the chain length relative to the concentration of the hydroxycarboxylic acid.
  • the alcohol groups of the polyvinyl backbone serve as the COOH-soapy end piece, and any other carboxylic acid serves as the OH-side end piece.
  • the molarity of the carboxylic acid to be added at the OH-terminal must correspond to the molarity of the OH groups of the polyvinyl alcohol in order to create defined reaction conditions. This results in the following ratio b, which corresponds to the average chain length of the side chains and, together with a, defines the geometry of the nanoparticles that are formed:
  • the synthesis proceeds by reacting the reaction mixture of polyvinyl alcohol, hydroxycarboxylic acid and non-hydroxy carboxylic acid in an anhydrous environment with thionyl chloride, which converts the acid groups into the corresponding chlorides, which then react with hydroxyl groups to form water and form polycondensates (see Fig. 2. ).
  • the result is a comb-shaped molecule with a side chains hanging down from the polyvinyl backbone and having an average length of b monomer units, which end with a non-hydroxylated end piece. If suitable monomers are selected, this arrangement is energetically unfavorable in the aqueous environment and leads to the “rolling up” of the molecular structure to a spatial structure in which the side chains loop around the backbone on all sides (“bottle brush” structure). The backbone is largely stretched out by the side chains, so that the dimensions of the nanoparticle are in the following range:
  • Length a * length of the polyvinyl monomer
  • the protective group can be split off at the end of the synthesis reaction (in the case of FMOC by treatment with catalytic amounts of piperidine), which makes side chains with terminal, spatially exposed in the aqueous environment Amino groups are obtained which not only stabilize the structure and prevent flocculation in the aqueous medium due to their hydrophilicity, but also can serve as starting points for surface reactions (see Example 2).
  • the finished lactic acid alanine ktenate is washed with dichloromethane and then dissolved in an appropriate volume of benzyl alcohol without further purification together with the substance of interest.
  • the solution is incubated overnight at room temperature, then saturated with water and finally taken up in a larger volume of water. Without further mechanical treatment (ultrasound), the droplets of the organic phase dissolve within a few hours and form a homogeneous suspension of substance-laden ktenate particles.
  • the other components consist of a bifunctional linker, in particular a polyethylene glycol molecule, which carries an amino-reactive group on one end and a different group with a different reactivity on the other end.
  • This bifunctional polyethylene glycol removes the particles from the immune system by sterically blocking the surface with an inert molecule (similar tests have been carried out in connection with liposomes under the name “stealth technology”) and moreover further stabilized, on the other hand the possibility is offered to add further molecules, which convey the actual target specificity, to the particles in a spatially favorable and flexible position.
  • These molecules can be micromolecules, for example sugar, in which case the bifunctional polyethylene glycol can be used exclusively (actinospheres), or macromolecules such as antibodies (acanthospheres), in which case it is advisable for steric reasons to to implement only a small part of the functional groups on the particle surface with bifunctional polyethylene glycol and to saturate the rest with monofunctional polyethylene glycol, which then serves only for the physical and immunological stabilization of the particles.
  • the finished Bdellosomes according to Example 1 were covalently linked via the functional surface groups to “spikes” made of polyethylene glycol (MW ⁇ 3400 Da), at the distal ends of which antibodies or other molecules that can be used for targeting can be added.
  • Conjugation of the particles with “spikes” made of NHS-ester-PEG is carried out by simple mixing and incubation at room temperature, preferably in a weakly basic medium, followed by dialysis against 500 times the volume of water (at a MWCO of 12-14 kDa both unbound PEG- Spines as well as unconjugated ktenate particles, but not ktenate-PEG conjugates escape) for cleaning.
  • the stability and packaging efficiency of Bdellosome are extremely high compared to other colloidal packaging systems.
  • the loading efficiency was examined using the example of the clinically used cytostatic Daunomycin. With the model substance daunomycin, packaging rates of over 80% of the material used were achieved. When using a small portion of 3 H-labeled Daunomycin achieved a yield of up to 99% of the total amount used.
  • a reduction in the undesirable uptake of the particles by the reticulo-endothelial system in the rat model was achieved in the case of Bdellosomes covalently linked with “spikes” made of polyethylene glycol (MW 3400) via the functional surface groups, to the distal ends of which antibodies or other molecules that can be used for targeting can be added shown.
  • Trypanosoma brucei brucei is a protozoan (Ord. Kinetoplasfida) parasite that is not itself pathogenic to humans, but is of direct economic importance due to the Nagana disease it causes in African livestock and also as a laboratory model for combating closely related human pathogens Forms Trypanosoma cruzi (Chagas disease,> 20 million infected in South America), Trypanosoma brucei gambiense and Trypanosoma brucei rhodesiense (sleeping sickness, large prevalence in the Central African population) as well as some smaller trypanosome species (T. equinum, T. equiperdum, T.
  • Leishmania donovani pathogen of the Kala-Azar or visceral Ielmaniosis
  • L. tropica Caused by the oriental bump
  • L. brasiliensis mucosal leishmaniasis
  • the treatment of parasitic protozoa is generally difficult and is mainly based on suramin, pentamidine and organic arsenic and antimony compounds such as melarsoprol and stibophen, the tolerance of which is poor in the concentrations required for therapy.
  • the trypanosomes pass into the CNS in the late stage of infection, where they are largely removed from chemotherapy by the host's blood-brain barrier. Trypanosomes are therefore doubly suitable as models, on the one hand for direct targeting and on the other hand for transfer via the blood-brain barrier. Direct targeting is described below.
  • Daunomycin used (corresponding to a concentration of 10 "5 mol daunomycin per I suspension), which had a tritium label of approx. 1000 cpm / ⁇ g. Free From a concentration of 10 "7 mol in the medium, daunomycin hinders the growth of trypanosomes.
  • the particles were produced as described in Example 1.
  • the Bellello domes were either linked to monofunctional PEG via their surface amino groups or linked to cysteine residues of various proteins via bifunctional (NHS-ester- ⁇ / inylsulfone-) PEG with an average molecular weight of 3400 Da: human transferrin in various concentrations, bovine serum albumin and single-chain antibody against the transferrin receptor. Finally, free coupling groups were saturated with cysteine.
  • Another aspect of the invention relates to solid particles for transporting pharmaceutical
  • Active substances processes for their preparation, medicaments containing these particles and the use of these particles in various selected indications.
  • a main goal of pharmaceutical research is to intensify the desired effects of known active substances and to minimize the systemic side effects, which is particularly important for substances with high intrinsic and thus unavoidable toxicity (e.g. cytostatics).
  • This can be achieved both by reducing the total dose required for the therapeutic effect and by accumulating the effectors at the desired site of action, both of which are achieved by the controlled, spatially specific release of effector molecules in the broadest sense (proteins, peptides, nucleic acids or low-molecular substances) in the desired manner
  • Target tissue can be accomplished.
  • An efficient way to do this is to store the substances in question in colloidal carrier particles, which are linked to antibodies against or natural ligands for characteristic molecular structures of the target and at the same time are protected against the immune system by an inert coating on their surface.
  • a widely used method for the colloidal packaging of pharmaceuticals is to enclose the effectors in lipid membrane-enveloped vesicles (liposomes).
  • liposomes lipid membrane-enveloped vesicles
  • anti-immunogenic coatings e.g. polyethylene glycol
  • the thermal and temporal stability of the vesicles consisting of a single lipid bilayer is limited, as is that Tightness.
  • the permeability of the membranes for hydrophilic substances can be reduced, but the required modified (e.g. fluorinated) lipids are not biologically harmless.
  • a single “hit” of the complement system is sufficient to leak a complete vesicle.
  • the liposomes are loaded (apart from a few special cases) by simply enclosing part of the aqueous phase and are accordingly inefficient: Typically ⁇ 0.5% of the effector substance is enclosed in the vesicles. The substance is exposed to considerable thermal and chemical stresses (the working temperature must be above the critical phase transition temperature of the lipid mixture for a long time, and the reactive groups required for the covalent modification only survive this at a very low pH).
  • Nanoparticles Solid colloidal particles
  • Particles in the micrometer and submicron range made of hydrophobic polymers can in principle be produced by finely dispersing the polymer taken up in a non-polar solvent: by removing the solvent, the polymer precipitates in the form of particles whose diameter is below that of the droplets; loading with hydrophobic substances (in which category most pharmaceuticals fall) can be accomplished by simply adding the substance to the non-polar solvent: after removing the solvent, the active substance is approximately 100% associated with the polymer and remains when the particles are in a aqueous phase are introduced by Van der Waals forces and steric "entrapment" non-covalently, but in the long term stably bound to the particle matrix.
  • AI describes colloidal polymer-active substance associates with a property-optimized branched polyol ester for use in particular on mucosal tissues.
  • No. 5,641,515 describes polymolecular nanoparticles made of polycyanoacrylate containing insulin, which release the complex-bound insulin in a controlled manner.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which an enhancement of the effect and minimization of the side effects is achieved by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule.
  • the particles encompassed by the invention are preferably solid, colloidal and / or lipid-free particle systems.
  • hydrophobized active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • the organic solvent or solvents are dissolved in water in the ratio solvent: water between 1:10 and 1:50, preferably between 1:20 and 1:40, in particular solve between 1:20 and 1:30 and / or are preferably selected from:
  • Methylene chloride or benzyl alcohol preferably benzyl alcohol.
  • a suitable solvent is by no means restricted to methylene chloride or benzyl alcohol.
  • the water-insoluble organic polymer material is dissolved together with the hydrophobic pharmaceutical active substance (s) and the amphiphilic organic polymer material is first separated therefrom, optionally with the supplementary substance (s) and only then are the solutions for preparing the solution after step (a) mixed.
  • a further preferred form of production of the particles according to the invention comprises that the separately dissolved amphiphilic organic polymer material and / or a supplement, if appropriate also dissolved, before mixing with the non-polar polymer material in a concentration of between 10 and 45% (w / v), preferably between 20 and 40% (w / v), in particular 35% (w / v).
  • the water-insoluble organic polymer material before step (b) in a concentration of between 3 and 0.1% (w / v), preferably between 2 and 0.5% (w / v), in particular 1.7% (w / v).
  • the particles according to the invention are produced by a process in which the solution in step (b) is ultrasonically between 1 h and 15 h, preferably 4 h or 5 h to 10 h, in particular 5 h to 6 h is treated.
  • the ultrasound treatment preferably takes place at maximum power.
  • the concentration ratio in% (w / v) between the water-insoluble organic polymer material from step (a) and the amphiphilic polymer material from step (b) after the completion of step (b) is between 1: 2 and 1:32, is preferably between 1: 4 and 1:28, in particular between 1: 8 and 1:20, preferably between 1:12 and 1:16, in particular 1:14.
  • step (a) is selected from
  • Polyesters preferably polylactic acid (polylactide), polyglycolide or polylactide, polyglycolide copolymers (PLGA), in particular pure polylactide, pure polypropylene glycol, or polylactide / polyglycolide copolymer
  • biocompatible, degradable synthetic polymers such as, for example Corresponding polyanhydrides, polyamino acids, polycyanoacrylates, polyacrylamides or polyurethanes can be used.
  • amphiphilic organic polymer material from step (a) is selected from
  • Polyvinyl alcohol or derivatives of polyvinyl alcohol preferably pure polyvinyl alcohol, esters of polyvinyl alcohol and a hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) or coesters, in which each molecule of the polyvinyl alcohol contains at least one hydrophobic
  • Carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid is esterified.
  • Alkali or alkaline earth metal salts of organic acids especially magnesium salts, preferably magnesium acetate.
  • process steps (a) to (c) take place at physiological temperatures, preferably between 35 and 40 ° C., in particular at 37 ° C.
  • Another object of the invention that fulfills the object of the invention is solid particles for transporting hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active substances, which comprise a core organic, water-insoluble polymer material and a
  • amphiphilic polymer material Contain outer layer of non-covalently bound to the molecules of the core amphiphilic polymer material and in which the amphiphilic polymer material is selected from
  • the particles contain non-covalently bound, hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredient.
  • amphiphilic polymer material is selected from among these particles according to the invention
  • amphiphilic organic polymer material used is selected from polyesters of polyvinyl alcohol in which each molecule of the polyvinyl alcohol is esterified with at least one hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid, wherein the hydrophobic carboxylic acid is preferably selected from fatty acids with a length between 10 and 24 carbon atoms, which are preferably not or not substituted with COOH, OH, SH or NH 2 , in particular not substituted with COOH or OH, preferably selected from
  • the second, different carboxylic acid is selected from carboxylic acids which are preferably not substituted with COOH or OH and preferably with SH or NH, preferably NH2, in particular
  • Amino acids preferably alanine
  • Polyvinyl alcohol is esterified with at least one fatty acid and at least one amino acid, in particular polyvinyl laurate-co-ß-alanate, preferably polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%).
  • the particles are nanoparticles and or accordingly have a length of between 10 and 500 nm, preferably ⁇ 150 nm, in particular 50 to 100 nm, in at least two dimensions.
  • Nanoparticles are understood in the narrower sense of this invention to mean particles which have a length of less than 1 ⁇ m in each dimension and, in a broader sense, particles which have a length of less than 1 ⁇ m in at least two dimensions. Among the closer In particular, the definition also includes all particles which have a volume of less than 1 ⁇ m, preferably 0.01 ⁇ m, in particular 0.0001 ⁇ m. Nanoparticles are solid colloidal particles.
  • the invention therefore furthermore relates to particles for transporting pharmaceutical active substances to which linker molecules which have an amino- and / or thioheactive, preferably an amino-reactive, grouping are covalently above (ie before modification by linking the particle to the linkers) free NH 2 or SH groups, preferably NH 2 groups, are bound on the surface of the particle.
  • Linker molecules are understood to mean polymers, in particular unbranched polymers, which change the properties, in particular the surface properties, of the particle, but in particular serve for the sterically favorable attachment of other bioactive compounds to the particles or, if appropriate, also sterically protect the particles from degradation.
  • Reactive group is to be understood in particular as groups known in the prior art which bind easily to amino, thiol or hydroxyl groups, and also epoxy or vinyl groups.
  • linker molecules are bifunctional and, in addition to an amino- or thiol-reactive, preferably amino-reactive grouping at another end of the molecule also have a further, differently reactive functional grouping, preferably a thiol-reactive grouping.
  • linker molecules are a mixture of bifunctional molecules - as described above - and monofunctional molecules which only carry either the amino-reactive or the thioheactive, preferably the amino-reactive, grouping.
  • Another preferred object of the invention are particles for the transport of pharmaceutical active substances, in which a mixture of two types of linker molecules is present on the surface of the particle, which are covalently bonded to the surface of the particle at one end of the linker molecule via a reactive grouping , one type of linker molecule (bifunctional) carrying at least one other end of the molecule a further reactive grouping, while the other type of linker molecule (monofunctional)
  • 1 ⁇ carries no reactive groups at any other end of the molecule.
  • Both of the aforementioned groups of particles are very favorable, since bulky residues such as antibodies can be attached to the bifunctional residues without hindrance, while the monofunctional linkers sterically prevent degradation.
  • These particles are also known as acanthus. It is again particularly preferred if significantly more, preferably at least 100% more, monofunctional than bifunctional molecules are covalently bound to the surface of the two aforementioned particle types (acanthospheres).
  • linker molecules are polyglycolides, preferably polyethylene glycol derivatives, in particular NHS ester polyethylene glycol or NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol.
  • the particles according to the invention provided with linkers are nanoparticles.
  • the particles are particles according to the invention previously described in the preceding sections without mention of linkers.
  • bioactive macromolecules or “searcher” molecules selected from peptides, proteins; preferably antibodies, are attached to the bifunctional linker molecules.
  • Antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain”antibodies; hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars, are coupled, coupled or coupled before the surface modification
  • the term “finder” molecule in the sense of this invention is generally understood to mean compounds which can be coupled to the particles according to the invention and which are capable, with high affinity for the biological targets of the active substances, as if there were proteins, peptides, polysaccharides, oligosaccharides, lipoproteins , Glycoproteins or other biological molecules that are expressed either in healthy tissue (physiological) or in or near diseased tissue (pathological).
  • Finder molecules can, for example, peptides, proteins, for example antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain”antibodies; hormones, sugars, for example glycosides; synthetic or natural receptor ligands. Antibodies, derivatives, fragments and glycosides are particularly preferred.
  • bifunctional linker molecules are bioactive macromolecules or generally “searcher” molecules, preferably antibodies, antibody fragments or
  • Antibody derivatives with target binding properties such as "Single-chain” antibodies, in particular with a free cysteine group, are coupled, are coupled or were coupled before the surface modification. This applies in particular to particles whose coating contains significantly more monofunctional than bifunctional molecules.
  • bioactive micromolecules or “searcher” molecules are attached to the bifunctional linker molecules
  • any subsequent cleaning or isolation is preferably carried out via dialysis, preferably with selective exclusion membranes.
  • the pharmaceutical active ingredient to be transported is a synthetic or natural active ingredient, a protein, peptide, lipid, sugar or nucleic acid or a low molecular weight organic or high molecular weight organic active ingredient, for example a hormone, an antineoplastic substance, an antibiotic , Antifungal, parasite, antiviral or anti-mint, a cardiovascular active substance; a central active substance, especially an analgesic, antidepressant or antiepileptic; is.
  • the particle is direct or via a Linker, preferably via bifunctional polyethylene glycol molecules, is linked to a “viewfinder” molecule selected from:
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain" -
  • Antikö ⁇ ern Hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars.
  • bifunctional polyethylene glycol molecules for the surface modification of particles for the transport of active pharmaceutical ingredients is an important part of this invention.
  • Another object of this invention is therefore the use of pure bifunctional polyethylene glycol molecules, preferably NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol; or mixtures of bifunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules, preferably NHS ester
  • Polyethylene glycol with NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol for the production of surface-substituted solid particles for the transport of active pharmaceutical ingredients.
  • “seeker” molecules are selected from the bifunctional polyethylene glycol molecules
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as single-chain antibodies; Hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thiozuckera
  • the particles are bound to the particles, preferably when using pure bifunctional polyethylene glycol molecules, gylycosides, especially thiosugar; when using mixtures of bifunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules, antibodies,
  • Antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as single-chain antibodies, preferably antibodies with free cysteine group.
  • the processes for producing particles according to the invention are also an important part of the invention.
  • the invention therefore furthermore relates to a process for producing a particle according to the invention, in particular the second type of particle with PLGA (polylactide / polyglycolide) described, which comprises the following steps:
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms for enhancing the desired effects of known active substances and for minimizing systemic side effects by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule. They are therefore suitable and intended to be used in a wide variety of therapeutic agents.
  • the invention therefore furthermore relates to medicaments which contain particles according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • the pharmaceuticals according to the invention can be administered as liquid dosage forms in the form of aerosols, injection solutions, drops or juices or as semi-solid dosage forms in the form of granules, tablets, pellets or capsules.
  • Suitable additives and / or auxiliaries are, for example, solvents or diluents, stabilizers, suspending agents, buffer substances, preservatives, and also dyes, fillers and / or binders.
  • the selection of excipients and the amounts to be used depend on whether the medicinal product is inhaled, orally, orally, parenterally, intravascularly, for example. should be administered intravenously, intraperitoneally, rectally, subcutaneously or intramuscularly.
  • Preparations in the form of tablets, dragees, capsules, granules or suspensions such as drops, juices and syrups are suitable for oral applications, suspensions and easily reconstitutable dry preparations are suitable for other applications.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which an enhancement of the effect and minimization of the side effects is achieved by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule, so that these particles are and are generally usable for producing therapeutic agents of course generally suitable for an unlimited number of indications. Without wishing to restrict the use of the particles according to the invention to this, their use lends itself to special indications.
  • Another object of the invention is therefore the use of the particles according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, for the treatment of infectious diseases and parasitoses, for the treatment of diseases and symptoms with a central nervous cause, for use in gene therapy or for genomic targeting.
  • cytostatics on tumor cells in the transport of therapeutically usable substances through the blood-brain barrier and in the treatment of serious infections (in particular by eukaryotes) is also preferred.
  • Further possible uses include, for example, the transfer of plant-based alkaloids with a microbicidal action in trypanosomes and of antioxidants and anti-inflammatory compounds [vitamin E, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine, 2,6-bis (tert-butyl) -4-mercaptophenol, ibuprofen and gentisic acid] in (degenerative) brain diseases, the transfer of substances in hepatocytes, primarily for the treatment of neoplasms, also the increase in the effect of primaquine on the Plasmodium hypnozoite cells that persist in the liver cells.
  • Another object of the method is also the treatment of a person or animal who needs this treatment with or using the particles according to the invention. This treatment is particularly suitable for the aforementioned indications and types of use.
  • Figure 1 shows schematically the general structure and shape of particles according to the invention, simple particles, simple stealth particles, target-seeking actinospheres and target-seeking acanthospheres.
  • Illustration? shows the uniformity in the size distribution of particles produced according to the invention according to Example 1.
  • the invention encompassed particles, in particular nanoparticles, in which the possibility is realized of incorporating active substances into colloidal particles. These can, for example, with Antibodies against or natural ligands for characteristic molecular structures of the target or other “searcher molecules” are linked. Optionally, the nanoparticles can also be protected against the immune system, for example, at the same time by inert coating of their surface.
  • the particles described by the invention and described here are examples Colloidal, lipid-free particle systems
  • Some of the particles described here, which are encompassed by the invention are referred to below with the general terms actinospheres and acanthospheres (see Fig. 1). These terms, because they denote structural concepts and non-steric basic forms, are independent of the maintain actual geometry.
  • the amphiphilic organic polymer is reactive functional Provide groups that make it possible to chemically couple additional components to it.
  • Polylactic acid polylactide, PLA
  • PLA polylactide
  • Existing literature on the production of particles in the size range of 1-10 ⁇ m proves the suitability of this substance, which has the advantage of biodegradability compared to most other polymers.
  • nanoparticles were based on the substance RG752 (from Boehringer Ingelheim), a block copolymer of 75%
  • the critical size for colloidal systems is ⁇ 150 nm; particles below this size can cross the blood-brain barrier in principle, ie when linked to suitable search molecules.
  • the temperature was largely in all tests end in the physiological range, or between 25 ° and 45 ° C.
  • the duration of the ultrasound treatment has no discernible influence on the particle size, but it does have an impact on the yield of usable particles: after a treatment of 15 minutes, around 90% of the counted particles, which together make up only ⁇ 1% of the total polylactide mass, in the desired size range, while the rest consists of microparticles; after sonication, the nanoparticle fraction comprises ⁇ 10% of the mass; after 5-6 hours, between 70% and 99% of the total polylactide is converted into nanoparticles.
  • the rest are in two largely discrete microparticle fractions, a smaller one with a diameter of half to whole and a larger one with a diameter of several micrometers, which could reflect a two-phase course of the dispersion process.
  • decomposition (recognizable by the discoloration) and clumping began, until after 24 h the entire reaction mixture had degenerated to a waxy mass.
  • the size distribution observed after filtration is comparable to that of a good preparation of liposomes; the advantage lies in the incomparably higher packaging efficiency.
  • the surface properties of the particles could be changed. Hydrophobization of the polyvinyl alcohol, the water solubility of which is at the upper limit for a coating substance, turned out to be essential, since the exclusive introduction of reactive groups increased the hydrophilicity of the polyvinyl alcohol to such an extent that the same simply went into solution and there was no longer any particle formation , This could be achieved by partial esterification with fatty acids via the acid chlorides.
  • the polyvinyl laurate (20%) obtained in this way showed particle binding properties which were superior to those of the original polyvinyl alcohol: With comparable amounts of protective colloid, somewhat smaller particles were formed with polyvinyl laurate in a significantly shorter sonication time and with a higher yield.
  • polyvinyl alcohol was reacted simultaneously with different amounts of lauryl chloride and ß-alanyl chloride, so that polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%) was formed.
  • This substance was comparable to polyvinyl laurate in its particle formation properties, but provided large amounts of covalently bonded primary amino groups. Due to the loose surface structure, which allows the charges of NH 4 + groups to be balanced by interposed acetate, no surface potential was observed, but the existence of the was to clearly detect supermolecular structures bound amino groups by chemical means.
  • Polyethylene glycol molecule that carries an amino-reactive group at one end and a different group with a different reactivity at the other end.
  • This bifunctional polyethylene glycol removes the particles from the immune system by sterically blocking the surface with an inert molecule (the same has been done in connection with liposomes under the name "Ste m-Teclmik”) and further stabilizes them; on the other hand, the possibility becomes possible required to add further molecules that convey the actual target specificity to the particles in a spatially advantageous and flexible position.
  • These molecules can be micromolecules, e.g.
  • bifunctional polyethylene glycol in which case the bifunctional polyethylene glycol can be used exclusively (actinospheres), or macromolecules such as antibodies (acanthospheres), in which case it is advisable for steric reasons, only one implement small part of the functional groups on the particle surface with bifunctional polyethylene glycol and the rest by Saturate monofunctional polyethylene glycol, which then serves only for the physical and immunological stabilization of the particles.
  • a covalently bound layer of fluorescence-labeled polyethylene glycol has a high surface area of the nanoparticles molecular density ("self-quenching" of fluorescence) and covered with a thickness of 10-15 nm (hydrated), as shown in the diagram of "actinospheres" (Fig. 1).
  • the particle formation properties of the polyvinyl laurate-co-ß-alanate were clearly superior to those of the unmodified polyvinyl alcohol.
  • particles coated with polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%) with NHS ester / vinyl sulfone-polyethylene glycol in a weakly basic environment and subsequent purification by dialysis against water particles can accordingly be obtained which are distal , largely freely movable end of the polyethylene glycol "spines" bound covalently to the particle surface carry thiol-reactive groups.
  • the loading of the nanoparticles was tested by means of the relatively hydrophobic fluorescent dye 4-Di-10ASP from the group of dialkylaminostyrenes (from Molecular Probes Inc.), which can be used for staining cell membranes, and met the expectations based on the measured size distributions: about 90% of the used Fluorescent dye was properly packed in nanoparticles.
  • 4-Di-10ASP from the group of dialkylaminostyrenes
  • the structural stability of the particles proved to be remarkably high: without the addition of preservatives or the like. no significant change in size distribution or 4-di-1 OASP loading was found after eight weeks of storage at room temperature without the addition of stabilizing substances.
  • Particles for the transport of active pharmaceutical ingredients with a volume ⁇ 1 ⁇ m loaded with tritium-labeled daunomycin were linked via their surface amino groups either to monofunctional polyethylene glycol (PEG) or via bifunctional (NHS-ester / vinylsulfone) PEG with an average molecular weight of 3400 Da with cysteine residues different "seeker" proteins coupled:
  • the acanthospheres were incubated with parasites of the parasitic unicellular type Trypanosoma brucei brucei and binding and cytotoxicity were determined.
  • the results of the binding and cytotoxicity studies show a correlation between cytotoxicity and binding.
  • the acanthospheres provided with "searcher” proteins significantly reduced the cell density of the parasites compared to controls, ie a pronounced cytotoxic effect was observed. In the absence of "searcher” proteins, however, no binding or cytotoxicity was observed with the same daunomycin concentration ,
  • Solid particles for the transport of hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active substances producible by a method with the following steps:
  • organic solvent or solvents dissolve in water in the ratio solvent: water between 1:10 and 1:50, preferably between 1:20 and 1:40, in particular 20 between 1:20 and 1:30, and / or preferably selected are made: Methylene chloride or benzyl alcohol, preferably benzyl alcohol,
  • step (b) that the solution in step (b) is treated with ultrasound between 1 h and 15 h, preferably 4 h or 5 h to 10 h, in particular 5 h to 6 h,
  • concentration ratio in% (w / v) between the water-insoluble organic polymer material from step (a) and the amphiphilic polymer material from step (b) after completion of step (b) is between 1: 2 and 1:32, preferably between 1: 4 and 1:28, in particular between 1: 8 and 1:20, preferably between 1:12 and 1:16, in particular 1:14,
  • process steps (a) to (c) take place at physiological temperatures, preferably between 35 and 40 ° C., in particular at 37 ° C.,
  • the water-insoluble organic polymer material is dissolved together with the hydrophobic pharmaceutical active substance (s) and the amphiphilic organic polymer material is first separated therefrom, optionally with the supplementary substance (s), and the solutions for preparing the solution after step (a) only then be mixed, it being preferred
  • PLGA Polylactide, pure polypropylene glycol, or polylactide polyglycolide copolymer (preferably in
  • amphiphilic organic polymer material from step (a) is selected from
  • Polyvinyl alcohol preferably pure
  • Polyvinyl alcohol esters of polyvinyl alcohol and a hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) or coesters, in which each molecule of the polyvinyl alcohol contains at least one hydrophobic
  • Carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid is esterified,
  • Alkali or alkaline earth metal salts of organic acids especially magnesium salts, preferably magnesium acetate. 4.
  • Solid particles for the transport of hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredients containing a core of organic water-insoluble polymer material and an outer layer of amphiphiles which are non-covalently bound to the molecules of the core
  • amphiphilic polymer material characterized in that the amphiphilic polymer material is selected from
  • Particles according to claim 4 characterized in that the particles contain non-covalently bound, hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredient.
  • amphiphilic polymer material is selected from coesters of polyvinyl alcohol in which each molecule of the polyvinyl alcohol is esterified with at least one hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid,
  • hydrophobic carboxylic acid is preferably selected from fatty acids with a length between 10 and 24 carbon atoms, which are preferably not or not substituted with COOH, OH, SH or NH 2 , in particular not with COOH or OH, preferably selected from C ⁇ o-Ci 6 fatty acids, especially lauric acid, and / or
  • the second, different carboxylic acid being selected from carboxylic acids which are preferably not substituted with COOH or OH and preferably with SH or NH 2 , in particular NH 2 , in particular amino acids, preferably alanine,
  • coesters in which the polyvinyl alcohol is esterified with at least one fatty acid and at least one amino acid, in particular
  • Polyvinyl laurate-co-ß-alanate preferably polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%).
  • Particles for the transport of active pharmaceutical ingredients characterized in that linker molecules which have an amino- and / or thioheactive, preferably QV ⁇ Q amino-reactive, grouping, covalently via NH 2 or SH groups previously present on the surface of the particle, preferably NH 2 -Gru ⁇ en, to which particles are bound.
  • linker molecules are bifunctional and, in addition to an amino- or thioheactive, preferably amino-reactive, grouping at another end of the molecule also have a further, differently reactive functional grouping, preferably a thioheactive grouping ,
  • linker molecules are a mixture of bifunctional molecules according to claim 10 and monofunctional molecules which carry only either the amino-reactive or the thioheactive, preferably the amino-reactive, grouping.
  • Particles for the transport of active pharmaceutical ingredients characterized in that on the surface of the particle A mixture of two types of linker molecules is present, which are covalently bonded to the surface of the particle at one end of the linker molecule via a reactive grouping, the one type of linker molecule being functional) at least one other end of the molecule having a further reactive one Grouping carries, while the other type of linker molecules (monofunctional) carries no further reactive groups at any other end of the molecule.
  • linker molecules are polyglycolides, preferably polyethylene glycol derivatives, in particular NHS
  • Particle according to one of claims 9 to 15 characterized in that the particles correspond to one of claims 1 to 8.
  • bioactive macromolecules or “searcher” molecules selected from peptides, proteins; preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as “single chain” are attached to the bifunctional linker molecules "-Antikö ⁇ ern; Hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars, are coupled, are coupled or were coupled before the surface modification.
  • bioactive macromolecules or “searcher” molecules preferably antibodies, antibody fragments or, are attached to the bifunctional linker molecules
  • Antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain” antibodies, in particular with a free cysteine group, are coupled, are coupled or were coupled before the surface modification.
  • bioactive micromolecules or “finder” molecules preferably sugars, especially thiosugars, peptides or hormones, in particular with a free cysteine group
  • bioactive micromolecules or “finder” molecules preferably sugars, especially thiosugars, peptides or hormones, in particular with a free cysteine group
  • the active ingredient to be transported is a synthetic or natural active ingredient, a protein, peptide, lipid, sugar or nucleic acid or a low-molecular organic or high-molecular organic active ingredient, for example a hormone antineoplastic substance, a
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as “single-chain” antibodies; hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor Ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars.
  • polyethylene glycol or mixtures of difunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules; preferably NHS ester polyethylene glycol with NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol; for the production of surface-modified solid particles for the transport of active pharmaceutical ingredients.
  • Peptides, proteins preferably antibodies, 5 antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain”antibodies; hormones, sugars, ' ' preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; proteins or peptides with a free 0 cysteine group or thio sugars
  • the particles are bound to the particles, preferably when using pure bifunctional polyethylene glycol molecules glycosides, in particular thiose sugar; when using mixtures of bifunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain" antibodies, preferably those with a free cysteine group.

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Abstract

Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.

Description

Bdellosomen
Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.
Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über An- Sammlung der Effektoren am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Effektormolekülen im weitesten Sinn (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) im gewünschten Zielgewebe bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in defi- nierte biologische Ziele («drug delivery», «drug targeting») zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist.
Die heute verfügbare Antikörpertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebige biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren charakterisiert und kloniert worden, so dass es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden (z. B. Glykoside) bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Jedoch üben diese «Suchermoleküle», ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, wäh- rend die Effektoren selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muss daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Effektoren mit der Zielspezifität der Suchermoleküle zu verbinden.
Der effizienteste bislang bekannte Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen (d.h. Submikrometer-) Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Zielsuchermoleküle gebunden werden können. Auf diese Weise werden sowohl optimales Verhältnis von Zielsucher- zu Effektormolekülen als auch maximale Flexibilität erreicht: Während durch direkte kovalente Kopplung an ein einzelnes Antikörper- oder anderes Ligandenmolekül nur wenige (<10) Effektormoleküle gebunden werden können (was bei einem Molekulargewicht eines Antikörpers von rund 150 kDa bedeutet, dass über 90% der Masse des Konjugats auf den Antikör- perteil entfallen) und Konjugate mit niedermolekularen Suchern üblicherweise ein molares Verhältnis von 1 :1 aufweisen, ist mit kolloidalen Systemen ein Effektor : Zielsucher- Verhältnis von 103 — 104 realisierbar. Überdies wird keine chemische Veränderung des Effektors benötigt, was in jeder Hinsicht vorteilhaft ist.
Eine effiziente Möglichkeit hierzu besteht darin, die betreffenden Substanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern, welche mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden.
Eine vielverwendete Methode zur kolloidalen Verpackung von Pharmaka besteht darin, die Effektoren in lipidmembranumhüllte Vesikel (Liposomen) einzuschließen. Durch Verwendung entsprechender Membrankomponenten ist es möglich, zum einen die gewünschten Zielsuchermoleküle an die Liposomenmembranen zu binden, zum anderen die Träger mit antiimmunogenen Beschichtungen (z. B. Polyethylenglykol) zu überziehen und dadurch vor der unspezifischen Entfernung aus dem Blutstrom durch das reti- kuloendotheliale System zu schützen. Den Vorteilen dieses Systems stehen folgende gravierende Nachteile gegenüber: - Die thermische und zeitliche Stabilität der aus einer einzelnen Lipiddoppelschicht bestehenden Vesikel ist begrenzt, ebenso die Dichtigkeit. Die Durchlässigkeit der Membranen für hydrophile Stoffe kann prinzipiell verringert werden, jedoch sind die benötigten veränderten (z. B. fluorierten) Lipide biologisch nicht unbedenklich. Überdies genügt
5 ein einzelner «Treffer» des Komplementsystems zum Auslaufen eines vollständigen Vesikels.
- Die mangelnde Stabilität der Membranvesikel begrenzt ihrerseits die mögliche Variabilität in der Oberflächengestaltung und limitiert dadurch die potentiellen Anwendungen.
- Nur hydrophile Substanzen können in der wässrigen Innenphase der Vesikel in genü- o gender Konzentration transportiert werden.
- Die Beladung der Liposomen erfolgt (von wenigen Spezialfällen abgesehen) durch einfachen Einschluss eines Teils der wässrigen Phase und ist dementsprechend ineffizient: Typischerweise werden <0.5% der Effektorsubstanz in die Vesikel eingeschlossen. Hierbei wird die Substanz beträchtlichen thermischen und chemischen Belastungen 5 ausgesetzt (die Arbeitstemperatur muss für längere Zeit oberhalb der kritischen Phasenübergangstemperatur des Lipidgemisches liegen, und die für die kovalente Modifikation benötigten reaktiven Gruppen überstehen dies nur bei sehr niedrigem pH-Wert).
- Die Hälfte der membranständigen reaktiven Gruppen, die zur Verknüpfung mit pro- teinösen Suchmolekülen benötigt wird, befindet sich nach der Vesikelbildung auf der o Innenseite und steht nicht zur Bindung zur Verfügung, wird jedoch nach der Auflösung der Liposomen im Organismus freigesetzt und kann zu unvorhersehbaren Reaktionen führen.
- Die chemische Kopplung von Proteinen an liposomale Membranen (z. B. über direkt oder über einen Polyethylenglykolarm mit Lipiden verknüpftes SPDP) führt zur Bildung 5 hochimmunogener Strukturen, die bereits zur Vakzinierung erfolgreich eingesetzt wur- den, auf dem Gebiet des «drug targeting» jedoch als unbrauchbar angesehen werden müssen, da sie zu einer Immunreaktion gegen die Partikel führen.
Als Alternative stehen solide Kolloidpartikel («Nanopartikel») zur Verfügung. Nanopartikel sind prinzipiell bekannt. Partikel im Mikrometer- und Submikrometerbereich aus hy- drophoben Polymeren können prinzipiell durch feine Dispergierung des in einem unpolaren Lösungsmittel aufgenommenen Polymers produziert werden: Durch Entfernung des Lösungsmittels fällt das Polymer in Form von Partikeln, deren Durchmesser unter dem der Tröpfchen liegt, aus; eine Beladung mit hydrophoben Substanzen (in welche Kategorie die meisten Pharmaka fallen) kann durch einfachen Zusatz der Substanz zum un- polaren Lösungsmittel bewerkstelligt werden: Nach Entfernen des Lösungsmittels liegt die Wirksubstanz zu annähernd 100% mit dem Polymer assoziiert vor und bleibt, wenn die Partikel in eine wässrige Phase eingebracht werden, durch Van-der-Waals-Kräfte und sterisches „Entrapment" nichtkovalent, aber längerfristig stabil an die Partikelmatrix gebunden. Essentiell ist hierbei, dass eine nachträgliche Koagulation der hydrophoben Partikel (deren große Kontaktfläche mit dem hydrophilen Medium energetisch ungünstig ist) verhindert wird. Bei aus dem Stand der Technik bekannten konventionellen Ansätzen geschieht dies meist durch Herstellung der Partikel in Anwesenheit einer amphiphi- len Substanz, welche zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium vermittelt.
Konventionelle Nanopartikel und deren Herstellung und Möglichkeiten einer Oberflächenvariation sind aus der WO 96/20698 bekannt, wobei das System hier insbesondere für den intravaskulären Einsatz, insbesondere bei der Restenose optimiert wurde. Die Patentanmeldung beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigen- schaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen.
Beispielhaft seien weiter die folgenden Dokumente genannt. Die DE 198 10 965 A1 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus einem Polyelektro- lytkomplex aus Polykationen und Polyanionen, der mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.
Die US 6,117,454 beschreibt insbesondere polymolekulare Nanopartikel, die durch ei- nen Überzug aus Fettsäurederivaten zum Durchdringen der Blut-Hirnschranke geeignet sind. Bei diesen von sich aus amphiphilen Liganden ist zu bedenken, dass zum einen hochaffine Liganden i.w.S. gegen biologische Strukturen (z. B. Proteine) i.a. nicht in einem Maßstab verfügbar sind, dass sie sich selbst bei Vorhandensein entsprechender physikalischer Eigenschaften (was z. B. auf Antikörper nicht zutrifft) zur unmittelbaren Oberflächenbeschichtung eignen (wofür mit der Partikelmatrix vergleichbare Mengen erforderlich sind), zum anderen selbst dort, wo dies möglich ist, von einem Einbringen solcher Massen hochaffin an biologischer Ziele bindender Moleküle, von denen zu erwarten ist, dass sie sich teilweise von den Partikeln ablösen und unabhängig davon an ihre Ziele binden, dringend abzuraten ist.
In der US 5,840,674 werden fest über einen „Linker" kovalent gebundene Komplexe aus Wirkstoff und Mikropartikel insbesondere zum Einsatz gegen Mikroorganismen beschrieben.
Die US 5,641 ,515 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus Polycyanacrylat enthaltend Insulin, die das komplex gebundene Insulin kontrolliert freisetzen.
In der DE 198 39 515 A1 werden kolloidale Polymer-Wirkstoffassoziate mit einem ei- genschaftsoptimierten verzweigten Polyolester zum Einsatz insbesondere an mucosalen Geweben beschrieben. Dabei wird ein polymeres Polyol, insbesondere Polyvinylalkohol, mit beispielsweise polykondensierenden Hydroxycarbonsäure verestert, so dass ausgehend vom Polyol-Rückgrat polykondensierte Seitenketten unterschiedlicher Länge und einer endständigen freien OH-Gruppe entstehen, mit dem Ziel, die Eigenschaften der Polyolester zu verändern. Die Tatsache, dass die Seitenketten der nach DE 198 39 515 A1 hergestellten Partikel ausschließlich in freien OH-Gruppen enden, ist sehr nachteilig, da OH-Gruppen in wässrigem oder alkoholischem Milieu nicht selektiv umzusetzen sind, so dass eine weitere Oberflächenmodifikation beispielsweise mit „Sucher"-Molekülen schwierig oder fast ausgeschlossen ist. Weiter ist für die Partikelbildung nach DE 198 39 515 ein Dispersionsschritt in einer wässrigen Phase zwingend nötig, so dass nach diesem Verfahren hergestellte Partikel nicht weiter zu modifizieren sind. Insbesondere verfügen aber die Partikel nach DE 198 39 515 auch nicht über eine ausreichend gesteuerte klar definierte Struktur, da keine Moleküle zugesetzt werden, über die definiert die Länge der Seitenketten durch Kettenabbruchsreaktion zu steuern sind und auch keine zur weiteren Modifikation günstigen Gruppen in die Oberfläche des Moleküls eingeführt werden. Auch ist das Herstellungsverfahren des Polymers u.a. wegen der endständigen OH-Gruppen wesentlich aufwendiger und (infolge des Einflusses zahlreicher Verfahrensparameter) weniger robust und führt auch zu einem weniger strukturierten Polymer, welches nicht zur selbsttätigen Bildung monomolekularer Partikel imstande ist, sondern „durch kontrollierte Fällung in kolloidale Form" überführt wird. Den resultierenden „kolloidalen Assoziaten" ermangelt es infolge des Fehlens von definierten Schlussstücken der chemisch vom Rest des Partikels verschiedenen, wiewohl kovalent damit verbundenen Oberflächenschicht, mit der eben eine definierte Oberflächenmodifikation ausgeführt werden kann. Insgesamt sind die Partikel nach DE 198 39 515 mithin für einen Einsatz auf dem Gebiet des „Drug Targeting" insbesondere durch Oberflächenmodifikation im Sinne dieser Erfindung ungeeignet und sind lediglich als „sustained release"- Formulierungen anwendbar.
Im Stand der Technik ist damit insgesamt das Problem der gezielten Applikation des Wirkstoffes am gewünschten Wirkort und der Stabilität der Nanopartikel nach Gabe bis zum Erreichen des Wirkortes, das „Drug Targeting", nur unzureichend gelöst. Ein zentrales Problem besteht in der Oberflächenmodifikation von Nanopartikeln. Wie oben bereits angeführt, stellen konventionelle solid-nanopartikuläre Systeme (im Gegensatz zu Liposomen) aufgrund ihrer extrem hohen spezifischen Interphase zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium ein energetisch ungünstiges System dar, das in Abwesenheit von Stabilisatoren instabil ist. Durch Zusammenlagerung von Partikeln wird die energetisch ungünstige Berührungsfläche minimiert, eine Ausfällung des hydrophoben Partikelmaterials ist die Folge.
Aus diesem Grund benötigen konventionelle Nanopartikel einen Überzug, beispielsweise aus amphiphilen Molekülen, die die Grenzflächenenergie herabsetzen und auf diese Weise die Partikel stabilisieren. Dieser Überzug deckt die Partikelmatrix vollständig ab und entzieht sie so dem Zugang modifizierender Agentien. Eine Modifikation gerade der amphiphilen Moleküle führt aber andererseits zu einer drastischen Veränderung der physikalischen Eigenschaften und damit zu einer Destabilisierung des Überzugs. Aus diesem Grund ist es kaum möglich, konventionelle Nanopartikel so zu modifizieren, dass Bindung von Liganden und damit ein Einsatz im Gebiet des „drug targeting" möglich ist, was wie bereits ausgeführt auch auf die DE 198 39 515 zutrifft.
Neben der Überwindung der genannten Nachteile des Standes der Technik war es Auf- gäbe der Erfindung, Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die
(a) durch „steric entrapment" eine große Bandbreite von Wirkstoffen transportieren können,
(b) einfach und stabil oberflächenmodifiziert werden können, und dabei insgesamt
(c) definierte und geeignete chemische Gruppen an der Oberfläche zeigen oder leicht damit hergestellt werden können und
(d) eine definierte Größe und insbesondere Form und Oberfläche des Moleküls zeigen
und insbesondere in der Lage sind, eine spezifische Freisetzung am Wirkort zu erreichen. Die Lösung dieser Aufgabe wird durch solide Partikel zum Transport hydrophober pharmazeutischer Wirkstoffe erreicht, die
a) ein unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Molekülrückgrat aus einem aus Monomeren aufgebauten Polymer mit mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer, wobei an die Bindungsgruppen (x) jeweils kovalent über eine
(x)-(x')-Bindung
b) polykondensierte Molekülseitenketten aufgebaut aus kettenbildenden Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x') oder aufgebaut aus verschiedenen kettenbildenden Monome- ren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und ein anderes
Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, oder aufgebaut aus verschiedenen kettenbildenden Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und ein weiteres mindestens eine Bindungsgruppe (y) und minde- stens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung mit
(x) und auch eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann, binden, wobei jeweils am Ende der Molekülseitenketten kovalent über eine (y)-(y')-Bindung
c) Seitenkettenendstücke, die mindestens eine Bindungsgruppe (y'), keine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehene freie Gruppe (z) aufweisen, gebunden sind,
wobei
- das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
- die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist, - das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Sei- tenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
- x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-
Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester- Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden und
- z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy- Gruppe, gegebenenfalls geschützt durch eine geeignete Schutzgruppe,
enthalten.
Schutzgruppen für bestimmte funktioneile Reste sowie deren Entfernung sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Mögliche Schutzgruppen wären beispielsweise FMOC zum Schutz einer Aminofunktion, wobei dabei die Entfernung durch Behandlung mit ka- talytischen Mengen von Piperidin erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders geeignete Formen, mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Generell handelt es sich bei den von der Erfindung umfassten Partikeln vorzugsweise um solide, kolloidale und/oder lipidfreie Partikelsysteme.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Gruppen ist, dass durch das Vorhandensein sonst im Polymerpartikel nicht zu findender funktionaler Gruppen, insbesondere Aminogruppen, die Oberflächenschicht so ausgebildet ist, dass - die Partikel mit einer durch die Ladung dieser funktionalen Gruppen bedingten polaren Zone ummantelt werden, deren Ladung der Flocculation entgegenwirkt und dadurch die Partikelsuspension stabilisiert, und
- funktionale Gruppen (insbesondere, jedoch nicht zwingenderweise ausschließlich, Aminogruppen), die zum Anfügen von Oberflächenmodifikationen nach der Bildung der mit der Substanz von Interesse beladenen Partikel geeignet sind, bereitgestellt werden.
Weiter sind funktionale Gruppen an der Oberfläche gezielt je nach Aufgabe über die Seitenkettenendstücke problemlos wählbar, und das Herstellungsverfahren für die erfin- dungsgemäßen Verbindungen ist einfach und robust.
Außerdem sind Größe, Form und Oberfläche des Moleküls steuerbar klar definiert, da die Wahl der molaren Verhältnisse die Struktur des resultierenden Moleküls bestimmt, während Reaktionsparameter wie Zeit, Temperatur, Druck etc. im Rahmen normaler Bedingungen keine bedeutenden Einflüsse ausüben.
Weiter sind die Partikel durch die polymeren Seitenketten ausgezeichnet in der Lage, durch „steric entrapment" große Mengen an verschiedensten Wirkstoffen unterschiedlicher chemischer Eigenschaften nichtkovalent zu binden und zu transportieren.
Gegenstand der Erfindung sind unter anderem auch solide Partikel zum Transport am- phi- oder lipophiler Wirkstoffe bzw. hydrophober Resorptionsester hydrophiler Wirkstof- fe, enthaltend ein Molekül eines verzweigten Polykondensats, wobei das Polykondensat aus einem Rückgrat aus einem multifunktionalen, vorzugsweise unverzweigten oder höchstens dreimal verzweigten, Makromolekül, bevorzugt Polyvinylalkohol, besteht, dessen funktioneile Gruppen (im Fall von Polyvinylalkohol also die OH-Gruppen) mit sekundären, vorzugsweise ebenfalls unverzweigten oder höchstens dreimal verzweig- ten, Polykondensatketten kovalent verbunden sind, welche im Folgenden als Seitenketten bezeichneten sekundären Polykondensatketten aus verknüpften bifunktionalen or- ganischen Monomeren (wobei es sich bei den Monomeren um heterobifunktionale Moleküle bzw. ihre Derivate handeln kann oder um ein äquimolares Gemisch zweier homo- bifunktionaler Moleküle bzw. ihrer Derivate), bevorzugt aus veresterten Hydroxycarbon- säuren oder einer Kombination aus Diolen und Dicarbonsäuren im molaren Verhältnis 1:1 bestehen, wobei das Ende jeder dieser Ketten aus einem im Sinne der Kondensationsreaktion monofunktionalen Molekül, bevorzugt einer Nichthydroxycarbonsäure, besteht. Es ist besonders, daß dieses im Sinne der Kondensationsreaktion monofunktionale Molekül mit einer während der Kondensationsreaktion durch eine Schutzgruppe geschützten zweiten funktionalen, sonst im Molekül nicht zu findenden Gruppe versehen ist, welche nach Abschluß der Kondensationsreaktion in einem zweiten Schritt abgespalten werden kann, so daß nach dem zweiten Reaktionsschritt die Ketten mit spezifischen funktionalen Gruppen enden.
In Abb. 2a ist exemplarisch die Bildung und Struktur eines allgemeinen Polykondensates aus einem unverzweigten, multifunktionalen Rückgrat, einem heterobifunktionalen Sei- tenkettenmonomer und einem zu dieser Kombination passenden Endstück schematisch dargestellt. Selbstverständlich ist auch die Kombination mehrerer Monomertypen und/oder Endstücke in einer einzelnen Synthesereaktion möglich. Im Folgenden wird ein solches Polykondensat mit unverzweigtem Rückgrat und nicht oder wenig verzweigten Seitenketten aufgrund seiner Form als Ktenat bezeichnet werden (gr. kteis=Kamm).
Hierbei können in die Bildung der Seitenketten jeweils die ursprünglichen Monomere eingesetzt werden, welche bei der Kondensationsreaktion Wasser oder andere kleine Moleküle abspalten, oder ihre entsprechenden durch Abspaltung kleiner Moleküle entstandenden Derivate, z.B. Anhydride, Lactone etc. oder andere Derivate. Eine Verwendung von „vorgefertigten" Oligomeren mit im Sinne der Kondensationsreaktion frei ver- fügbaren funktioneilen Gruppen (z.B. Oligopeptiden) allein oder in beliebigen Kombinationen mit homo- oder heterobifunktionellen Monomeren ist ebenfalls möglich; solche vorgefertigten Bausteine werden nachfolgend ebenfalls unter die Bezeichnung „Monomere" subsumiert werden. Nachfolgend sind ohne Anspruch auf Vollständigkeit einige Beispiele für im Sinne der Erfindung verwendbaren Substanzen und Kombinationen aufgelistet:
Rückgrat:
Figure imgf000013_0001
Seitenketten-Monomere:
Figure imgf000013_0002
Endstücke:
Figure imgf000013_0003
Figure imgf000014_0001
(X und Y: beliebige Molekülcorpora; Ω = Schutzgruppe)
Die Auswahl der Endstücke hängt hierbei von folgenden Faktoren ab:
gewünschte exponierte Gruppe(n) (diese ist bzw. sind, vor der Synthese mit einer geeigneten Schutzgruppe zu versehen, um eine Einbeziehung in den Polykondensations- prozess zu verhindern)
Seitenkettenmonomer(e)
Rückgratmolekül (definiert durch seine funktionellen Gruppen die Orientierung der Seitenketten).
Diese Seitenketten werden generell als Telo-Endstück-Poly-Monomer bezeichnet (also Telo-Alanyl-Polylaktid oder Entsprechendes), das Gesamtmolekül daher als Rückgrat- Moiekuiargewicht-telo{freie Gruppe}Endstück-Poly-Monomermittieres seitenkettengewicht-at, also Z.B. Polyvinyl 200'000-telo {amino} alanyl-polylaktid50ooat, Polyacryl50'000-telo {ami- no.sulfhydro} cysteyl-poly (glykol:adipin) 8000at (oder entsprechend).
Ein Überblick über einige ausgewählte Möglichkeiten sei in der folgenden Tabelle gege- ben, in der zugleich auch Trivialnamen für einige der interessantesten Grundstrukturen vorgeschlagen werden:
Figure imgf000015_0001
Polyamine car onsäuren und Diamine 1:1
Figure imgf000016_0001
Alle diese Möglichkeiten sind unabhängig von der Art und Orientierung der die Partikelmatrix dominierenden Bindungsstruktur Gegenstand dieser Erfindung, da sie alle in der gleichen langgestreckten, durch kovalente Bindungen zusammengehaltenen Partikelform und -Struktur mit hydrophobem Kern und funktionalisierter, hydrophiler Außen- schicht resultieren, welche nachfolgend als „Bdellosom" (griech. bdella = Egel) bezeichnet wird und die eingangs beschriebenen Anforderungen erfüllt.
Daher wird nachfolgend exemplarisch nur Synthese und Verwendung von regulärem Milchsäure-Alanin-Ktenat (exakte Bezeichnung gemäß obiger Nomenklatur: Polyvinyl- telo{amino}alanyl-polylaktidat) dargestellt werden, da die anderen Grundstrukturen nicht zu wesentlich verschiedenen Partikeln führen.
Die in der Auflistung beschriebenen Polymere besitzen unterschiedliche Eignungen je nach Zielsetzung; so können z.B. aminohaltige, aber thiolfreie Suchermoleküle unter entsprechender Variation des Protokolls (zuerst Verknüpfung von Sucher und Linker, dann Reaktion der Partikel mit dem Sucher-Linker-Komplex) vermittels des gebräuchli- chen, hierbei jedoch umgekehrt orientierten NHS-Ester-PEG-Vinylsulfon-Linkers an Partikel aus Thioktenat, inversem Thioktenat oder Thioamidoktenat angekoppelt werden.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die erfindungsgemäßen Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
Dabei versteht man unter hydrophobisierten Wirkstoffen ursprünglich hydrophilere Wirkstoffe, die durch chemische Modifikation hydrophober geworden sind. Ein Beispiel sind hydrophobe Resorptionsester hydrophiler Wirkstoffe. Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung, der auch die Aufgabe löst und die genannten bevorzugten Eigenschaften aufweist, sind monomolekulare solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter Wirkstoffe, die nach einem Verfahren herstellbar sind, in dem unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymer- rückgrat aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit
(a) kettenbildenden Seitenketten-Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x'), wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
(b) einer Mischung aus kettenbildenden Seitenketten-Monomeren, wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, oder
(c) einer Mischung aus kettenbildenden Seitenketten-Monomeren, wovon minde- stens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und mindestens ein weiteres Monomer mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
sowie mindestens einem Seitenkettenendstück, mit mindestens einer Bindungsgruppe (y'), ohne Bindungsgruppe (y) und mit mindestens einer gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehenen freien Gruppe (z), wobei (y') eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den Monomeren bzw. Monomeren- Gemischen der Seitenketten und dem Polymerrüchgrat sowie den Kettenendstücken und auch eine Polykondensation der Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenketten erlauben, in Kontakt gebracht wird,
wobei
- das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
- die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
- das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
- x, x\ y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester- Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester- Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden,
- z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy- Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine geeignete Schutzgruppe und
- die Seitenketten-Monomere als reine Monomere oder Derivate wie intramolekulare Anhydride oder Lactone eingesetzt werden können, solange sie noch mit sich und/oder anderen Seitenketten-Monomeren Ketten bilden können.
Ein ebenfalls weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung, der auch die Aufgabe löst und die genannten bevorzugten Eigenschaften aufweist, sind monomolekulare solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter Wirkstoffe, die nach einem Verfahren herstellbar sind, in dem unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymerrückgrat aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit
polykondensierten Molekülseitenketten aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x') oder aufge- baut aus verschiedenen Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, oder aufgebaut aus verschiedenen Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und ein weiteres mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, wobei jeweils am Ende der Molekülseitenketten kovalent über eine (y)-(y')- Bindung Seitenkettenendstücke, die mindestens eine Bindungsgruppe (y'), keine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehene freie Gruppe (z) aufweisen, wobei (y') eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann, gebunden sind,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den polykondensierten Molekülseitenketten und dem Polymer erlauben, in Kontakt gebracht wird,
wobei
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S- C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden und
z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy- Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe.
Dabei werden beispielsweise die freien OH-Gruppen des Polyvinylalkohol-Rückgrates mit der Polykondensate bildenden Hydroxycarbonsäure verestert, während die Nichthydroxycarbonsäure als Endstücke dieser Seitenketten dienen. Dabei ist die Funktion der Nichthydroxycarbonsäure denen der zur Festlegung der durchschnittlichen Kettenlänge verwendeten Radikalfänger bei radikalischen Polymersisationsreaktionen analog.
Dabei ist es bevorzugt, dass das Inkontaktbringen in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin, stattfindet, wobei es auch günstig und eine bevorzugte Ausführungsform der Verfahren ist, wenn das Inkontaktbringen in Gegenwart von Thionylchlorid stattfindet und/oder - sofern notwendig - beispielsweise nach der Umsetzung mit Thionylchlorid gegebenenfalls Schutzgruppen abgespalten werden. Schutzgruppen für bestimmte funktioneile Reste sowie deren Entfernung sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Mögliche Schutzgruppen wären beispielsweise FMOC zum Schutz einer Aminofunktion, wobei die Entfernung durch Behandlung mit katalytischen Mengen von Piperidin erfolgt.
Üblicherweise schließt sich entweder der Schutzgruppenabspaltung oder - wenn diese nicht nötig ist - direkt beispielsweise nach der Umsetzung mit Thionylchlorid ein Waschschritt, vorzugsweise mit Dichlormethan, aber natürlich auch mit anderen wasserfreien - meist unpolaren - organischen Lösungsmitteln, an. Im folgenden sind einige bevorzugte Ausführungsformen und vorteilhafte Effekte, die mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden können aufgelistet. Die hier gemachten Angaben beziehen sich auf alle erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren, hier beschrieben. Die bevorzugten Partikel der'vorliegenden Erfindung sind die monomolekularen soliden Partikel. Diese umfassen ein erfindungsgemäßes Bdellosomenmolekül. Es hat sich überraschender weise gezeigt, dass sich aus den hier beschriebenen Bdellosomen monomolekula- re Partikel zum Wirkstofftransport formen lassen. Diese Partikel zeichnen sich durch eine im Vergleich mit klassischen Liposomen im Schnitt geringere Größe aus. Bevorzugte monomolekulare Partikel der Erfindung haben eine Länge, sowie Durchmesser und Volumen, wie in der Anmeldung angegeben. Dabei sind sowohl die Größe als auch die Form des Partikels durch geeignete Modifikation des polymeren Gerüsts steuerbar. Ein langes Polymerrückgrat mit im Vergleich dazu kürzeren Seitenketten ergibt längliche Partikel, wohingegen ein kurzes Polymerrückgrat mit langen Seitenketten eher kugelförmige Partikel ergibt. Üblicherweise und bevorzugt formen die Bdellosomen jedoch längliche Partikel, wobei Partikel mit einer Länge von ca. 2μm bei einem Durchmesser von so gering wie 5nm herstellbar sind, verglichen mit den üblicherweise sphärischen Liposomen. Sowohl die Form als auch die im Ver- gleich zu klassischen Liposomen geringere Größe bietet große Vorteile bei der gezielten
Applikation von Wirkstoffen, da es mit den erfindungsgemäßen Partikeln möglich ist Wege in Zellen zu beschreiten, die für die klassischen Liposomen aufgrund ihrer Größe und/oder Form nicht möglich sind.
Das Molekülrückgrat aus einem aus Monomeren aufgebautem Polymer kann ein Rückgrat aus nur einer Sorte an Monomer (Homopolymer) oder ein Rückgrat aus mehr als einer Sorte an Monomer (Copolymer) sein. Bevorzugte aus nur einem Monomer aufgebaute Polymere für das Rückgrat sind Polyvinylalkohol, Polyvinylamin oder Polyacrylsäure. Die aus mehr als einem Monomer aufgebauten Copolymere sind bevorzugt solche aus 2 bis 5, insbesondere bevorzugt aus 2 unterschiedlichen Monomeren. Diese Monomere können ausgewählt werden unter den Monomeren für die in der Beschreibung genannten Polymere für das Rückgrat. Bevorzugt sind hierbei wiederum Monomere für Polyvinylalkohol, Polyvinylamin oder Polyacrylsäure. Das Molekülrückgrat umfasst bevorzugt durchschnittlich 500 bis 20000 Monomereinheiten, besonders bevorzugt von 1000 bis 10000, insbesondere bevorzugt von 2000 bis 7000 Monomereinheiten.
Die Monomereinheiten für das Polymerrückgrat enthalten jeweils mindestens eine Bindungsgruppe x, bevorzugt von 1 bis 4 Bindungsgruppen x, insbesondere bevorzugt 1 oder 2 Bindungsgruppen x.
Die Molekülseitenketten umfassen bevorzugt im Schnitt von 10 bis 10000 Monomereinheiten, stärker bevorzugt von 50 bis 5000 und insbesondere bevorzugt von 80 bis 2000 Monomereinheiten. Das Verhältnis von Monomereinheiten in der Seitenkette zum Seitenkettenendstück ist üblicherweise sehr viel größer als eins. Bevorzugt sind die Bereiche, die sich aus den oben angegebenen Bereichen für die Anzahl an Monomereinheiten in der Molekül- seitenkette ergeben.
Das molare Verhältnis von Monomeren des Molekülrückgrats zu den Seitenkettenendstük- ken ist üblicherweise etwa äquimolar, bevorzugt von 1:0,8 bis 0,8:1, stärker bevorzugt 1:0,9 bis 0,9:1, am meisten bevorzugt äquimolar. Diese Angaben beziehen sich auf unverzweigte Molekülseitenketten. Die Molekülseitenketten können jedoch auch verzweigt, sein, wobei, wenn Verzweigungen vorliegen, eine geringe Verzweigung bevorzugt ist, d.h. bevorzugt 1 bis 4 Verzweigungen pro Seitenkette, insbesondere bevorzugt 1 oder 2 Verzweigungen pro Seitenkette. Beim Vorliegen derartiger Verzweigungen verändert sich das molare Verhältnis von Monomeren des Molekülrückgrats zu den Seitenkettenendstücken entsprechend.
Die Linker, bevorzugt Linker aus Polyalkylenglycolen, insbesondere bevorzugt Polyethy- lenglycol, haben üblicherweise eine Molmasse in einem Bereich, der für diese Moleküle üblich ist, beispielsweise wie in den Beispielen angegeben, bevorzugt jedoch im Bereich von 500 bis 10000, stärker bevorzugt von 1500 bis 5000. Die Seitenkettenendstücke können freie Gruppen (z) aufweisen. Dabei kann die Auswahl an Seitenkettenendstücken so erfolgen, dass ein variabler Anteil an Seitenketten eine freie Gruppe (z) aufweist. So können 100% bis 0% der Seitenketten eine freie Gruppe (z) aufweisen, in Abhängigkeit von den gewünschten weiteren Modifikationsmölichkeiten. Geeignete Anteile an freien Gruppen (z) sind z.B. von 1 bis 10%, von 1 bis 25% , oder auch von 50 bis 99%, von 75 bis 95% und von 80 bis 90%.
Durch geeignete Auswahl der Bauteile in den oben beschriebenen Bereichen lassen sich sie überraschenden Effekte der vorliegenden Erfindung gezielt erreichen.
Die erfindungsgemäßen monomolekularen Partikel lassen sich in einfacher Weise in guten Ausbeuten aus den hier beschriebene Polymeren herstellen und mit Wirkstoffen beladen. Üblicherweise reicht dazu bereits einfaches Lösen in geeigneten Lösungsmittel, zusammen mit der Wirkstoffsubatanz von Interesse. Überraschenderweise lassen sich ohne mechani- sehe Behandlung, die jedoch nicht nachteilig ist, große Anteile der Polymere in monomolekulare Partikel, beladen mit dem Wirkstoff umwandeln. Erfindungsgemäß können Umwandlungen von mehr als 50% erreicht werdem, bevorzugt von mehr als 80%, stärker bevorzugt von mehr als 90% und insbesondere bevorzugt von mehr als 95%, bezogen auf die Masse. Dabei werden Partikel im erwünschten Submicrometerbereich erhalten.
Die in der vorliegenden Erfindung bevorzugten monomolekularen Partikel eignen sich in besondererweise zum Transport von Wirkstoffmolekülen. Daher beansprucht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der beschriebenen Partikel zum Herstellen eines Medikaments und zur Applikation von Wirkstoffen. Die Erfindung umfasst auch ein Verfah- ren zur Anwendung von Wirkstoffen, in welchem die erfindungsgemäßen Partikel als Wirkstoffträger eingesetzt werden. Auch hier gelten die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen bevorzugten Bereiche. Alternative Methoden der Herstellung des Ktenats, z.b. durch Festphasensynthese nach Merrifield, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange die Grundstruktur der fertigen Moleküle den gegebenen Definitionen des Ktenats entspricht.
Die entstandenen Partikel werden zum Einsatz mit dem zu transportierenden hydropho- 5 ben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff beladen. Daher schließt sich dann ein weiterer Verfahrensschritt an, bei dem das Produkt anschließend zusammen mit dem zu transportierenden hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel gelöst wird, dann die Lösung einige Zeit, vorzugsweise über Nacht, vorzugsweise bei Raumtemperatur, inkubiert wird, o dann die Lösung mit Wasser gesättigt wird und anschließend die wassergesättigte Lösung in einem größeren Volumen Wasser gelöst wird, sich gegebenenfalls eine mechanische Behandlung anschließt (vorzugsweise nicht durch Ultraschall) und dann gegebenenfalls die Partikel gereinigt und isoliert werden.
Eine solche Behandlung ist aber meist nicht nötig, und es ist im Rahmen dieser Erfin- 5 düng auch bevorzugt, wenn sich nach der Lösung der wassergesättigten Lösung in einem größeren Volumen Wasser keine mechanische Behandlung anschließt.
Zur abschließenden Reinigung (und Isolierung) wird vorzugsweise - sofern dies in diesem Verfahrensstadium notwendig ist - auf die Dialyse zurückgegriffen.
Bei der Wahl des Lösungsmittels für den Schritt zur Beladung mit Wirkstoff ist es bevor- o zugt, wenn das wasserfreie organische Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 :10 und 1 :50, vorzugsweise zwischen 1 :20 und 1:40, insbesondere zwischen 1:20 und 1 :30 löst, und/oder vorzugsweise ausgewählt ist aus:
Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol.
Darauf muss die Auswahl aber nicht beschränkt sein, solange ein definiertes Maß an 5 Wasserlöslichkeit gegeben ist. Es ist besonders bevorzugt, wenn bei den erfindungsgemäßen Partikeln das Polymerrückgrat unverzweigt oder maximal einmal verzweigt, vorzugsweise unverzweigt ist.
Auf besonders bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Partikel treffen alternativ einzeln, teilweise oder insgesamt die folgenden Bedingungen zu, dass näm- lieh:
die Monomere der Seitenkette jeweils maximal zwei Gruppen (y) und maximal zwei Gruppen (x') aufweisen und/oder
die Gruppe (y) in den Monomeren der Seitenkette der Gruppe (x) im Polymer-Rückgrat entspricht und/oder
die Gruppe (x') in den Monomeren der Seitenkette der Gruppe (y') im Seitenketten- Endstück entspricht und/oder
die Gruppe (z) ausgewählt ist aus den „freien Gruppen" OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe,
die Monomere der Seitenkette jeweils maximal 2 bis 10 C-Atome, vorzugsweise 2 bis 6 C-Atome, insbesondere 2 bis 4 C-Atome, aufweisen und/oder
die Monomere der Seitenkette, die sowohl die Gruppe (y) als auch die Gruppe (x') aufweisen, entweder nur 1 Gruppe (y) und 1-2, vorzugsweise 1, Gruppen (x') oder nur 1 Gruppe (x') und 1-2, vorzugsweise 1 , Gruppen (y) aufweisen und/oder
die Monomere der Seitenketten bis auf das Seitenkettenendstück identisch sind mit je- weils 1 Gruppe (y) und 1 Gruppe (x') oder die Monomere der Seitenketten bis auf das Seitenkettenendstück identisch monoton alternierend aufgebaut sind aus abwechselnd einem Monomer mit 2 Gruppen (x') und einem Monomer mit 2 Gruppen (y). Dabei ist u.a. der Begriff der „freien Gruppen" als Definition für die Gruppe (z) als ausgewählt aus OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe, eine feststehende Definition im Sinne dieser Erfindung.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel ist das Polymerrückgrat ausgewählt aus
Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyvinylamin, Polysaccharid oder Polyaminosäure,
vorzugsweise Polyvinylalkohol oder Polyacrylsäure,
insbesondere Polyvinylalkohol.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel sind die Monomere der Seitenkette ausgewählt aus
Hydroxycarbonsäuren, Aminosäuren, der Kombination aus Diaminen und Dicarbonsäuren oder der Kombination aus Diolen und Dicarbonsäuren, bzw. deren Derivaten
vorzugsweise Hydroxycarbonsäuren oder der Kombination aus Diolen und Dicarbonsäu- ren, bzw. deren Derivaten
insbesondere Hydroxycarbonsäuren wie Milchsäure, Glykolsäure, Weinsäure oder Zitronensäure bzw. deren Derivaten.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel sind die Seitenkettenendstücke ausgewählt aus
ungeschützten Aminosäuren, N-geschützten Aminosäuren, COOH-geschützten Aminosäuren, ungeschützten Aminoalkoholen, N-geschützten Aminoalkoholen, O- geschützten Aminoalkoholen, ungeschützten Thiolalkoholen, O-geschützten Thioalko- holen, S-geschützten Thioalkoholen oder ungeschützten Thiolsäuren, S-geschützten Thiolsäuren, COOH-geschützten Thiolsäuren, ungeschützten Thioaminen, S- geschützten Thioaminen oder N-geschützten Thioaminen,
vorzugsweise
ungeschützten Aminosäuren, N-geschützten Aminosäuren, ungeschützten Aminoalko- holen, N-geschützten Aminoalkoholen, ungeschützten Thiolalkoholen, S-geschützten Thioalkoholen oder ungeschützten Thiolsäuren, S-geschützten Thiolsäuren,
insbesondere
ungeschützten Aminosäuren, wie Alanin, N-geschützten Aminosäuren, wie N-FMOC-ß- Alanin, ungeschützten Thiolsäuren oder S-geschützten Thiolsäuren.
Dabei versteht man unter „A-geschützt" im Sinne dieser Erfindung, dass eine funktio- nelle Gruppe „A" des betreffenden Moleküls mit einer Schutzgruppe beliebiger Natur versehen ist, welche sich im Anschluß an die Kondensationsreaktion entfernen läßt.
Bei einer besonders ausgewählt bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel sind das Polymerrückgrat, die Monomere der Seitenkette bzw. deren Derivate und das Seitenkettenendstück bzw. dessen Derivate ausgewählt aus einer der folgenden Kombinationen:
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insbesondere
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Für alle vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Partikel ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, wenn die Partikel Nanopartikel sind und entsprechend eine Länge < 5 μm, vorzugsweise < 3 μm, insbesondere < 2 μm und/oder eine Dicke und Breite von < 200 nm, vorzugsweise < 75 nm, insbesondere < 30 nm aufweisen. Dabei versteht man unter Nanopartikel Partikel, die in mindestens zwei Dimension eine Größe unter 1 μm aufweisen. Insbesondere haben Nanopartikel ein Volumen unter 1 μm3. Bei Nanopartikeln handelt es sich um solide kolloidale Partikel.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsge- mäßen Partikel speziell oberflächenmodifiziert. Gerade diese Partikel lösen in hervorragender Weise die Aufgabe der Erfindung, da sie insbesondere zum zielgerichteten Transport geeignet sind. Daher sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung erfindungsgemäße Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, an die Linker-Moleküle, die eine reaktive Gruppe (z') ausgewählt aus Gruppen, die mit einer der Gruppen (z) ausgewählt aus den oben bereits definierten „freien Gruppen" (z) ausgewählt aus OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe eine kovalente Bindung eingehen können, vorzugsweise eine amino- oder thiolreaktive Gruppe, insbesondere eine aminoreaktive Gruppe, aufweisen, kovalent über (z')-(z)-Bindungen mit auf der Oberfläche des Partikels vorliegenden Gruppen (z) ausgewählt aus den „freien Gruppen", ge- bunden sind. Bei den erfindungsgemäßen Partikel werden diese „freien Gruppen" (z) an der Oberfläche (gegebenenfalls nach Entfernung der Schutzgruppe) durch die Seiten- kettenendstücke zur Verfügung gestellt.
Dabei versteht man unter Linker-Molekülen Polymere, insbesondere unverzweigte oder maximal dreimal verzweigte Polymere, die die Eigenschaften, insbesondere die Oberflä- cheneigenschaften, des Partikels verändern, insbesondere aber zur sterisch günstigen Anbindung von anderen bioaktiven Verbindungen an die Partikel dienen oder gegebenenfalls auch die Partikel sterisch vor Abbau schützen.
Unter „reaktiver Gruppe" [(z') sowie auch anderen (z")] sind insbesondere im Stand der Technik bekannte Gruppen zu verstehen, die leicht kovalent an die bereits oben defi- nierten „freien Gruppen" (z), insbesondere Amino-, Thiol-, Carboxy- oder Hydroxygrup- pen binden, sowie an Epoxy- oder Vinyl-Gruppen. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben der an das erfindungsgemäße Partikel bindenden reaktiven Gruppe (z') an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere reaktive Gruppe (z"), ausgewählt aus reaktiven Gruppen, die mit einer der Gruppen (z) ausgewählt aus den „freien Gruppen" (z) ausgewählt aus OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe eine kovalente Bindung eingehen können, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppe, aufweisen, wobei z' ≠ z" ist.
Dabei ist es ebenso eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, wenn beispielsweise die thiolreaktive Gruppe an das erfindungsgemäße Partikel bindet und (bei bi- funktioneilen Linkern) an einem anderen Ende des Linker-Moleküls beispielsweise eine aminoreaktive Gruppe wäre. Die Wahl der reaktiven Gruppen der Linker-Moleküle hängt zum einen von der oder den freien Gruppe(n), vorzugsweise der freien Gruppe, auf dem erfindungsgemäßen Partikel, an die der Linker bindet. Zum anderen hängt er von einer gegebenenfalls weiteren Modifikation oder den durch den Linker transferierten Oberflä- cheneigenschaft ab, insbesondere wird eine mögliche zweite reaktive Gruppe am Linker-Molekül von der Natur eines evt. noch an den Linker anzusynthetisierenden oder bereits ansynthetisierten Moleküls bestimmt.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn die die Linker-Moleküle eine Mischung der beschriebenen bifunktionellen Moleküle und monofunktioneller Moleküle, die neben der an das er- findungsgemäße Partikel bindenden reaktiven Gruppe (z'), vorzugsweise der amino- oder thiolreaktiven Gruppe, insbesondere der aminoreaktiven Gruppe, an keinem anderen Ende des Moleküls eine weitere, anders reaktive funktioneile Gruppe (z") mit z' ≠ z" aufweisen, sind.
Diese Partikel sind sehr günstig, da damit sperrige Reste wie Antikörper an den bifunk- tionellen Resten ungehindert angelagert werden können, während die monofunktionel- len Linker einen Abbau sterisch hindern. Diese Partikel werden auch als Akanthoshären bezeichnet. Dabei ist es wieder besonders bevorzugt, wenn an der Oberfläche dieser Partikel (Akanthosphären) deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktio- nelle als bifunktionelle Moleküle kovalent gebunden sind.
Es ist bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpem; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckem, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") ange- koppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
Unter dem Begriff „Sucher"-Molekül im Sinne dieser Erfindung versteht man allgemein an die erfindungsgemäßen Partikel ankoppelbare Verbindungen, die in der Lage sind, mit hoher Affinität an die biologischen Ziele der Wirkstoffe, als da wären Proteine, Pepti- de, Polysaccharide, Oligosaccharide, Lipoproteine, Glykoproteine oder andere biologische Moleküle, die entweder in gesundem Gewebe (physiologisch) oder in oder nahe krankem Gewebe (pathologisch) exprimiert werden, zu binden. „Sucher"-Moleküle können beispielsweise Peptide, Proteine, beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörper; Hormone, Zucker, beispielsweise Glykoside; synthetische oder natürliche Rezeptor- Liganden sein. Besonders bevorzugt sind Antikörper, -derivate, -fragmente und Glykoside.
Es ist weiter bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder allgemein „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfrag- mente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. „Single-chain"- Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikati- on angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung deutlich mehr monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle enthält. Unabhängig von der Reihenfolge der Reaktionen wird auf diese Weise ein vollständig kovalent verbundenes Makromolekül erhalten, das folgende Architektur aufweist: eine zentrale Achse aus Po- lyvinylalkohol (oder einem anderen hochmolekularen Polymer), von dessen OH- Gruppen (oder entsprechenden funktionalen Gruppen) hydrophobe Polykondensate aus Hydroxycarbonsäuren (oder anderen kondensierbaren Monomeren) ausgehen, die mit Nichthydroxycarbonsäuren (oder anderen geeigneten Endstücken) abschließen, welche entweder frei in hydrophilen Gruppen enden oder die mit polymeren, hydrophileren Lin- kern verknüpft sind, wobei sich an einen Teil dieser Linker wiederum „Sucher"-Moleküle anschließen.
Bevorzugt ist es auch, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Mikromole- küle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker, Hormone oder Proteine, insbesondere mit freier Cysteingruppe, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung überwiegend oder vollständig aus bifunktionellen Molekülen besteht.
Bevorzugt ist es weiter, wenn an den erfindungsgemäßen Partikeln nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen (z") ab- gesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
Es ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der oberflächenmodifizierten Partikel, wenn die Linker-Moleküle monofunktionelle Moleküle sind, die neben der an das erfindungsgemäße Partikel bindenden reaktiven Gruppe (z'), vorzugsweise der amino- oder thiolreaktiven Gruppe, insbesondere der aminoreaktiven Gruppe an keinem anderen Ende des Moleküls eine weitere, anders reaktive Gruppe (z") mit z' ≠ z" aufweisen. Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-Ester-Polyethylenglykol oder NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol.
Generell erfolgt eine gegebenenfalls anschließende Reinigung oder Isolierung vorzugs- weise über eine Dialyse vorzugsweise mit selektiven Ausschlussmembranen.
Für alle erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn der zu transportierende pharmazeutische Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularar organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplasti- sehe Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitizid, Virustatikum oder Antihel- mintikum, eine cardiovaskulär-aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
Generell ist es eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel, wenn das erfindungsgemäße Partikel direkt oder über einen Linker, vorzugsweise über bifunk- tionelle Polyethylenglykol-Moleküle, verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpem; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckem.
Auch die Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Partikel sind ein wichtiger Teil der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Partikels, bei dem ein unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymerrückgrat aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x'), wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
einer Mischung von Monomeren, wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bin- dungsgruppen (y) und mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, oder
einer Mischung von Monomeren, wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgrup- pen (x') und mindestens ein weiteres Monomer mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, , wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
sowie mindestens einem Seitenkettenendstück, mit mindestens einer Bindungsgruppe (y'), ohne Bindungsgruppe (y) und mit mindestens einer gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehenen freien Gruppe (z),
wobei
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S- C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden,
z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy- Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe und
die Seitenketten-Monomere als reine Monomere oder Derivate wie intramolekulare Anhydride oder Lactone eingesetzt werden können, solange sie noch mit sich und/oder anderen Seitenketten-Monomeren Ketten bilden können,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den Monomeren bzw. Monomeren- Gemischen der Seitenkette und dem Polymerrückgrat sowie den Seitenkettenendstük- ken als auch eine Polykondensation der Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenkette erlauben, in Kontakt gebracht wird,
gegebenenfalls in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin, gegebenenfalls in Gegenwart von Thionylchlorid und anschließend gegebenenfalls ge- reinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und gegebenenfalls isoliert wird,
sowie gegebenenfalls anschließend die Partikel mit dem zu transportierenden hydrophoben oder hydrophobisierten Wirkstoff in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel gelöst werden, dann die Lösung einige Zeit, vorzugsweise über Nacht, vorzugsweise bei Raumtemperatur, inkubiert wird, dann die Lösung mit Wasser gesättigt wird und anschließend die wassergesättigte Lösung in einem größeren Volumen Wasser gelöst wird, sich gegebenenfalls eine mechanische Behandlung anschließt und dann gegebenenfalls die Partikel gereinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfin- dungsgemäßen Partikels (mit Linker-Molekül), bei dem man erfindungsgemäßes Partikel (ohne Linker-Molekül), das eine Gruppe (z) ausgewählt aus den freien Gruppen mit einem Linker-Molekül enthaltend eine reaktive Gruppe (z'), die mit der Gruppe (z) eine kovalente Bindung eingehen kann, enthält, unter zur Ausbildung dieser kovalenten Bindung geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und gegebenenfalls anschließend die Partikel reinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert. Geeignet sind zum Beispiel neutrale bis schwach basische Bedingungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfin- dungsgemäßen Partikels (mit Linker-Molekül und „Sucher"-Molekül), bei dem man im Anschluss an das vorstehende Verfahren danach hergestellte Partikel (mit Linker- Molekül), die an bifunktionellen Linker-Molekülen eine freie reaktive Gruppe (z") aufweisen mit bioaktiven Makromolekülen oder „Sucher"-Molekülen wie oben definiert unter zur Ausbildung einer Bindung zwischen der Gruppe (z") und den bioaktiven Makromolekülen oder „Sucher"-Molekülen unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und gegebenenfalls anschließend die Partikel reinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert.
Die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders geeignete Formen zur Verstärkung der gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe und zur Minimierung systemischer Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Damit sind sie geeignet und vorgesehen in Therapeutika ver- schiedenster Art eingesetzt zu werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die erfindungsgemäße Partikel sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen in Form von Aerosolen, Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte oder als halbfeste Arznei- formen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets oder Kapseln verabreicht werden. Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z.B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittlern, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel z.B. inhalativ, oral, peroral, parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal, rektal, subkutan oder intramuskulär appliziert werden soll. Für orale Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten oder Suspensionen wie Tropfen, Säften und Sirupen, für andere Applikationen Suspensionen sowie leicht rekonstituierba- re Trockenzubereitungen.
Die erfindungsgemäßen Partikel sind auch besonders als Diagnostika geeignet, da sie beispielsweise Marker gezielt in die richtige Zelle einbringen können. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Diagnostikum, das erfindungsgemäße Partikel sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthält.
Weiter sind - wie oben ausgeführt - die erfindungsgemäßen Partikel besonders geeig- nete Formen mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird, so dass eine generelle Verwendbarkeit dieser Partikel zur Herstellung von Therapeutika vorliegt und sie sind natürlich generell für eine unbeschränkte Zahl von Indikationen geeignet. Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel darauf beschränken zu wollen, bietet sich deren Verwendung für besondere Indikationen an. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parasitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting. Weiter ist beispielsweise der Einsatz beim Targeting von Cyto- statika auf Tumorzellen, beim Transport von therapeutisch nutzbaren Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke und bei der Behandlung von schweren Infektionen (namentlich durch Eukaryonten) auch bevorzugt. Weitere Anwendungsmöglichkeiten umfassen z.B. den Transfer von pflanzlichen Alka- loiden mit mikrobicider Wirkung in Trypanosomen und von Antioxydantien und antiin- flammatorischen Verbindungen [Vitamin E, Gallsäure, N-Acetyl-L-Cystein, 2,6-bis(tert- butyl)-4-Mercaptophenol, Ibuprofen und Gentisinsäure] bei (degenerativen) Gehimer- krankungen, den Transfer von Substanzen in Hepatozyten, primär für die Behandlung von Neoplasmen, auch die Erhöhung der Wirkung von Primaquin auf die in den Leberzellen überdauernden P/asmooVwm-Hypnozoiten. Wirksam sind die erfindungsgemäßen Partikel auch gegen Trypanosoma brucei bruce
Unter den möglichen Anwendungen für die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders weiter zu nennen:
- Transport von sonst nicht gehirngängigen Pharmaka (z. B. Cytostatika, Psychopharmaka, Schmerzmittel, M' Alzheimer-Therapeutika) mit antikörper-konjugierten Trägern
I durch die Blut-Hirn-Schranke
- Zielgerichtetes Einbringen von Pharmaka (z. B. Virustatika, Cytostatika, Plasmodizide) mit glykosid-konjugierten Trägern in Hepatozyten
- Orale Verabreichung von sonst nur parenteral verfügbaren Pharmaka durch Targeting auf Darmepithelien
- Erhöhung der Wirkung von antiparasitischen Therapeutika durch Targeting auf para- siten-spezifische Oberflächenmoleküle
Ein weiterer Gegenstand des Verfahrens ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel. Besonders geeignet ist diese Behandlung bei den vorgenannten Indikationen und Anwendungsarten.
Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie dar- auf zu beschränken. Abbildungen:
Abbildung 1 zeigt schematisch den generellen Aufbau und die Gestalt von erfindungsgemäßen Partikeln, einfachen Partikeln, einfachen Stealth-Partikeln, zielsuchenden Ak- tinosphären und zielsuchenden Akanthosphären.
Abbildungen 2a und 2b zeigen die Synthese von Ktenaten. Das resultierende Molekül (a ~ 4000, b ~ 100) hat eine kammförmige Architektur, die zu einer „Flaschenbürsten"- Form führt. Es ist imstande, ohne zusätzliches Schutzkolloid monomolekulare Partikel mit einem MW von >30'000 kDa zu bilden, zwischen deren Seitenketten nieder- molekulare Substanzen eingefangen werden können. Die exponierten Aminogruppen dieser Partikel können mit NHS-Ester reagieren und auf diese Weise mit PEG-Stacheln verknüpft werden.
Abbildung 3 zeigt die Gesamtstruktur eines fertigen monomolekularen Partikels mit Stacheln, auch «Bdellosom» genannt (griech.
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aus Milchsäure-ß-Alanin- Ktenat.
Länge: ~ 1800 nm
Stachellänge: ~ 20nm
0: unbeladen ~ 4 nm
Beladungseffizienz: bis 80 % Stabilität: hoch
Oberflächenbeschichtung: PEG (MW = 3400), über NHS-Ester an terminale
Aminogruppen des Ktenats gebunden
Liganden: über Vinylsulfon an distale Enden des PEG gebunden; z. B. BSA, IgG (Bild) und Antikörperfragmente, Transferrin ...
Beladung: z. B. Alkaloide, Daunomycin
Abbildung 4 zeigt eine elektrononmikroskopische Aufnahme von BSA-konjugierten Ktenat-Partikeln (Akanthosphären). Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse eines Modellversuchs an dem einzelligen Parasiten Trypanosoma bruce Die Bindung eriϊndungsgemäß hergestellter Partikel an die Zielzellen korreliert mit parasitizider Wirkung des enthaltenen Daunomycins.
Beispiele
Allgemeine Bemerkungen:
Die nachfolgend ausgeführten Beispiele beschreiben von der Erfindung umfasste Partikel, insbesondere Nanopartikel, in denen die Möglichkeit realisiert ist, Wirksubstanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern. Diese können gegebenenfalls beispielsweise mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels oder anderen „Suchermolekülen" verknüpft. Optional können die Nanopartikel beispielsweise zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden. Generell handelt es sich bei den hier beispielhaft beschriebenen, von der Erfindung umfassten Partikel um kolloidale, lipidfreie Partikelsysteme. Einige der hier beschriebenen, von der Erfindung umfassten Partikel werden nachfolgend mit den allgemeinen Begriffen Aktinosphären und Akanthosphären bezeichnet (s. Abb. 1). Diese Bezeichnungen werden, da sie strukturelle Konzepte und nicht sterische Grundformen bezeichnen, unabhängig von der tatsächlichen Geometrie beibehalten.
Aufgrund ihrer Form werden die Partikel generell als Bdellosomen bezeichnet.
Beispiel 1:
Herstellung des Bdellosomen-Grundkörpers
a) Allgemeine Beschreibung des Grundkörpers
Das Beispiel basiert auf monomolekularen Partikeln aus einem komplex strukturierten Polylaktidderivat, aufgrund seiner Kammstruktur als Ktenat bezeichnet. Ktenat bildet in wässrigem Milieu fadenförmige Partikel, sogenannte Bdellosomen, mit durch Variation der Syntheseparameter frei wählbaren Dimensionen (Durchmesser im Nanometerbe- reich, Länge bis zu mehreren Mikrometern), nachfolgend Bdellosomen genannt (gr. Bdella = Egel). Es ist dabei imstande, einerseits niedermolekulare, bevorzugt hydrophobe Substanzen stabil einzulagern, andererseits an exponierten funktionellen Gruppen chemisch so modifiziert zu werden, dass ein «Targeting» erreicht werden kann. Die Realisierung der Partikelsysteme erfolgt durch Synthese von monomolekularen Partikeln auf der Basis von Polyvinylalkohol als «Rückgrat», an dessen OH-Gruppen Ketten aus polymerer Milchsäure (oder einer anderen geeigneten Hydroxycarbonsäure) ankondensiert werden. Mithin bestimmt die Länge des Polyvinylrückgrates die Größe des Partikels in einer Dimension (Längsachse) und wird nachfolgend als a bezeichnet.
Da die Seitenketten aus bifunktionalen Monomeren bestehen - jedes dieser Monomere hat ein OH-Ende, an das sich das nächste Säuremolekül (entweder ein gleichartiges Monomer oder ein zum Kettenabbruch führendes Molekül der Nichthydroxycarbonsäure) anhängen kann, und ein COOH-Ende, das mit einer weiteren Hydroxylgruppe (entweder der eines gleichartigen Monomers oder eine zur Beendigung des Kettenwachstums führende OH-Gruppe des Polyvinylrückgrates) reagieren kann, ist es möglich, durch Zusatz geringer, aber untereinander äquimolarer Mengen von säurefreiem Alkohol und nichthy- droxylierter Carbonsäure «Endstücke» zur Verfügung zu stellen, deren Konzentration relativ zur Konzentration der Hydroxycarbonsäure die Kettenlänge reguliert. Als COOH- seifiges Endstück dienen die Alkoholgruppen des Polyvinylrückgrates, als OH-seitiges Endstück eine beliebige andere Carbonsäure. Selbstverständlich muss die Molarität der OH-terminal anzufügenden Carbonsäure der Molarität der OH-Gruppen des Polyvinylal- kohols entsprechen, um definierte Reaktionsbedingungen zu schaffen. Es ergibt sich mithin folgendes Verhältnis b, das der durchschnittlichen Kettenlänge der Seitenketten entspricht und zusammen mit a die Geometrie der entstehenden Nanopartikel festlegt:
b = c(Hydroxycarbonsäure) : { c(OH-Gruppen) = c(Nicht-Hydroxy-Carbonsäure) } Die Synthese läuft durch Umsetzen des Reaktionsgemisches aus Polyvinylalkohol, Hydroxycarbonsäure und Nicht-Hydroxy-Carbonsäure im wasserfreien Milieu mit Thionylchlorid, welches die Säuregruppen in die entsprechenden Chloride überführt, die dann unter Wasserabspaltung mit Hydroxylgruppen reagieren und so Polykondensate bilden (s. Abb. 2.).
Es entsteht hierbei ein in der Schemadarstellung kammförmiges Molekül mit a vom Po- lyvinyl-Rückgrat herunterhängenden Seitenketten mit einer durchschnittlichen Länge von b Monomereinheiten, die mit einem nichthydroxylierten Schlussstück enden. Bei Auswahl geeigneter Monomere ist diese Anordnung im wässrigen Milieu energetisch ungünstig und führt zur «Aufrollung» der Molekülstruktur zu einer Raumstruktur, in der sich die Seitenketten auf allen Seiten um das Rückgrat schlingen («Flaschenbürsteη»- Struktur). Durch die Seitenketten wird das Rückgrat weitgehend ausgestreckt, so dass die Dimensionen des Nanopartikels sich in folgendem Bereich bewegen:
Länge: a * Länge des Polyvinyl-Monomers
Breite und Höhe: * Länge des Seitenketten-Monomers
Dient als Endstück der Seitenketten eine (z. B. mit FMOC) geschützte Aminosäure, kann am Ende der Synthesereaktion die Schutzgruppe abgespalten werden (im Fall von FMOC durch Behandlung mit katalytischen Mengen von Piperidin), wodurch Seitenketten mit terminaler, im wässrigen Milieu räumlich exponierter Aminogruppe erhalten wer- den, die nicht nur durch ihre Hydrophilie die Struktur stabilisieren und Flocculation im wässrigen Medium verhindern, sondern überdies auch als Ansatzpunkte für Oberflächenreaktionen (s. Beispiel 2) dienen können.
b) Konkrete Durchführung:
Es wurden aus geeigneten Mengen von Polyvinylalkohol 200O00 (Mowiol™), Milchsäu- re und Λ/-FMOC-ß-Alanin unter Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel durch Um- setzen mit Thionylchlorid und anschließendes Abspalten der FMOC-Gruppe mit Piperi- din Moleküle erzeugt, die als Polyvinyl(te/o-alanyl-polylaktid)at[a=4000, ό=100] bezeichnet werden können. Im Folgenden wird diese Substanzklasse mit der allgemeinen Bezeichnung Saüre-Sc/ϊ/ι/ßsfüc/c-Ktenat(a, b) (griech. kteis = Kamm) bezeichnet werden.
Das fertige Milchsäure-Alanin-Ktenat wird mit Dichlormethan gewaschen und dann ohne weitere Reinigung zusammen mit der Substanz von Interesse in einem angemessenen Volumen Benzylalkohol gelöst. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, dann mit Wasser gesättigt und schließlich in einem größeren Volumen Wasser aufgenommen. Ohne weitere mechanische Behandlung (Ultraschall) lösen sich die Tröpfchen der organischen Phase innerhalb von wenigen Stunden auf und bilden eine homogene Suspension von substanzbeladenen Ktenat-Partikeln.
Aufgrund der langgestreckten Form der Ktenat-Partikel sind Aussagen über die Dimensionen der Partikelpopulation naturgemäß schlecht zu treffen, jedoch konnte mit dem QELS-Verfahren gezeigt werden, dass >95% der Masse einer typischen Präparation (unfiltriert) in Form von Partikeln im Submikrometerbereich vorliegen.
Beispiel 2:
Herstellung der Aktinosphären und Akanthosphären
a) Allgemeine Anmerkungen
Sowohl in Aktinosphären als auch in Akanthosphären bestehen die weiteren Kompo- nenten aus einem bifunktionalen Linker, insbesondere einem Polyethylenglykolmolekül, das am einen Ende eine aminoreaktive Gruppe trägt, am anderen Ende eine davon verschiedene Gruppe mit anderer Reaktivität. Durch dieses bifunktionale Polyethylenglykol werden einerseits die Partikel durch sterische Blockade der Oberfläche mit einem inerten Molekül dem Zugriff des Immunsystems entzogen (Ähnliches wurde im Zusammen- hang mit Liposomen unter der Bezeichnung «Stealth-Technik» erprobt) und überdies weiter stabilisiert, zum anderen wird die Möglichkeit geboten, weitere Moleküle, die die eigentliche Zielspezifität vermitteln, in räumlich günstiger und flexibler Position an die Partikel anzufügen. Bei diesen Molekülen kann es sich um Mikromoleküle handeln, z.B. Zucker, in welchem Fall eine ausschließliche Verwendung des bifunktionalen Polyethy- lenglykols möglich ist (Aktinosphären), oder um Makromoleküle wie etwa Antikörper (Akanthosphären), in welchem Fall es aus sterischen Gründen ratsam ist, nur einen kleinen Teil der funktionalen Gruppen auf der Partikeloberfläche mit bifunktionalem Po- lyethylenglykol umzusetzen und den übrigen durch monofunktionales Polyethylenglykol, das dann alleine der physikalischen und immunologischen Stabilisierung der Partikel dient, abzusättigen.
b) Konkrete Durchführung anschließend an Beispiel 1
Zur Unterdrückung von Immunreaktionen wurden die fertigen Bdellosomen gemäß Beispiel 1 über die funktionalen Oberflächengruppen kovalent mit «Stacheln» aus Polyethylenglykol (MW ~ 3400 Da) verknüpft, an deren distalen Enden wiederum Antikörper oder andere für das Targeting verwendbare Moleküle angefügt werden können.
Konjugation der Partikel mit «Stacheln» aus NHS-Ester-PEG erfolgt durch einfaches Mischen und Inkubation bei Raumtemperatur, vorzugsweise in schwach basischen Medium, gefolgt von Dialyse gegen das 500fache Volumen Wasser (bei einem MWCO von 12-14 kDa können sowohl ungebundene PEG-Stacheln als auch unkonjugierte Ktenat- Partikel, nicht jedoch Ktenat-PEG-Konjugate entweichen) zur Reinigung.
Bei Verwendung von bifunktionalen NHSester-PEG-Vinylsulfon-Stacheln schließt sich die sekundäre Konjugation des Ktenat-PEG-Komplexes mit den «Sucher»-Proteinen an, gefolgt von Absättigung der eventuell noch freien Kopplungsgruppen mit Cystein (ca. 1 mg Cystein pro mg PEG entsprechend einem 20 - 30-fachen molaren Überschuss) und einem zweiten Aufreinigungsschritt durch erneute Dialyse, diesmal unter Verwendung einer Dialysemembran mit entsprechend höherem MWCO. Insgesamt ist es abschließend zu empfehlen, noch ungesättigte, freie Kopplungsgruppen mit Cystein oder einem anderen SH-Reagenz abzusättigen. Damit empfiehlt es sich, nach dem Umsetzen der Bdellosomen-PEG-Konjugate mit den „Sucher"-Molekülen eventuell noch freie Kopplungsgruppen an den distalen Enden der PEG-Stacheln mit 5 einem hohen molaren Überschuss eines geeigneten Reaktionspartners abzusättigen, im Fall von Vinylsulfon z.B. Cystein. Auf diese Weise wird verhindert, dass im Organismus diese Kopplungsgruppen mit körpereigenen Molekülen (z. B. Serumproteinen) reagieren und somit die Zielspezifität verfälscht wird.
Bei Verwendung der langsam reagierenden, relativ wasserstabilen Vinylsulfongruppe als 0 distale Reaktionsgruppe der PEG-Stacheln ist es möglich, diese thiophilen (Ktenat- )Partikel für alle Anwendungen in einem vereinheitlichten Standardverfahren herzustellen und erst nach der Aufreinigung mit den geeigneten «Suchermolekülen» zu verbinden, welche beliebiger chemischer Natur sein können und lediglich eine Sulfhydrylgrup- pe besitzen müssen, so dass Aktinosphären und Akanthosphären hergestellt werden 5 können. Bei Akanthosphären ist eine einfache Inprozesskontrolle des letzten Verknüpfungsschrittes durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten oder selber fluoreszierenden Proteinen (GFP) oder durch Western-Blot von Stichproben möglich, bei Aktinosphären durch Nachweis in der Dünnschichtchromatographie.
Beispiel 3:
o Eigenschaften von nach Beispiel 1 hergestellten Bdellosomen
Stabilität und Verpackungseffizienz von Bdellosomen sind im Vergleich zu anderen kolloidalen Verpackungssystemen außerordentlich hoch. Die Beladungseffizienz wurde am Beispiel des bereits klinisch eingesetzten Cytostatikums Daunomycin untersucht. Es wurden mit der Modellsubstanz Daunomycin Verpackungsraten von über 80% des ein- 5 gesetzten Materials erreicht. Bei Verwendung eines kleinen Anteils von 3H-markiertem Daunomycin wurde eine Ausbeute von bis zu 99% der eingesetzten Gesamtmenge erreicht.
Die Partikel zeigten auch nach mehrmonatiger Lagerung bei Raumtemperatur weder Zerfallserscheinungen noch Flocculation. Auch die sich aus der monomolekularen Parti- kelstruktur ergebende Einfachheit der Herstellung der Bdellosomen ist besonders hervorzuheben. Form und Größe der Partikel konnten nach schwacher Goldbedampfung im Rasterelektronenmikroskop sichtbar gemacht werden und entsprachen den Erwartungen (s. Abb. 4.); bei Verwendung von BSA, das mehrere freie Thiolgruppen besitzt, trat erwartungsgemäß eine leichte Vernetzung der Partikel ein. Bei über die funktionalen Oberflächengruppen kovalent mit «Stacheln» aus Polyethylenglykol (MW 3400) verknüpften Bdellosomen, an deren distalen Enden wiederum Antikörper oder andere für das Targeting verwendbare Moleküle angefügt werden können, wurde eine Verringerung der unerwünschten Aufnahme der Partikel durch das retikuloendotheliale System am Rattenmodell gezeigt.
Beispiel 4:
Effektivität von nach Beispiel 2 hergestellten Bedellosomen/
Bekämpfung des parasitischen Einzellers Trypanosoma brucei brucei durch mit Daunomycin beladene Akanthosphären
a) Zur Auswahl des Modellorganismus:
Trypanosoma brucei brucei ist ein protozoischer (Ord. Kinetoplasfida) Parasit, der selber nicht humanpathogen ist, jedoch sowohl durch die von ihm hervorgerufene Nagana- Seuche des afrikanischen Nutzviehs von unmittelbarer volkswirtschaftlicher Bedeutung ist als auch als Labormodell für die Bekämpfung der nahe verwandten humanpathoge- nen Formen Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit, >20 Mio. Infizierte in Südamerika), Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense (Schlafkrankheit, große Prävalenz in der zentralafrikanischen Bevölkerung) sowie einiger kleinerer Trypa- nosomen-Spezies (T. equinum, T. equiperdum, T. evansi) sowie der nahverwandten Leishmanien (Leishmania donovani, Erreger der Kala-Azar oder Eingeweideleishmanio- se; L. tropica, Verursacher der Orientbeule; L. brasiliensis, Schleimhaut-Leishmaniose) herangezogen werden kann.
Die Behandlung parasitischer Protozoen ist generell schwierig und basiert vorwiegend auf Suramin, Pentamidin und organischen Arsen- und Antimon-Verbindungen wie Melarsoprol und Stibophen, deren Verträglichkeit in den zur Therapie benötigten Konzentrationen schlecht ist. Überdies gehen die Trypanosomen im Spätstadium der Infek- tion ins ZNS über, wo sie durch die Blut-Hirn-Schranke des Wirtes einer Chemotherapie weitgehend entzogen werden. Trypanosomen eignen sich daher doppelt als Modell, zum einen für direktes Targeting, zum anderen für Transfer über die Blut-Hirn-Schranke. Nachfolgend wird direktes Targeting beschrieben.
Trypanosomen entziehen sich dem Immunsystem ihres Wirtes durch rekombinative Va- riation ihrer Zelloberflächenproteine, von der nur einige Rezeptoren (u. a. für Transferrin und Albumin) ausgenommen sind, welche jedoch so in Vertiefungen der Zelloberfläche positioniert sind, dass daran bindende Antikörper keine zur Zerstörung der Parasitenzelle führende Immunreaktion initiieren können. Es ist jedoch prinzipiell möglich, mit Zellgiften beladene Bdellosomen mit Liganden für diese Rezeptoren zu koppeln und solchermaßen endocytieren zu lassen.
b^ Herstellung der Akanthosphären auf Basis der Bdellosomen
Sowohl für Bindungs- als auch Cytotoxizitätsstudien wurden Bdellosomensuspensionen
(0,5 g Milchsäure-Alanin-Ktenat 4000, 100 pro Liter) mit einer Beladung von 1% (m/m)
Daunomycin verwendet (entsprechend einer Konzentration von 10"5 mol Daunomycin pro I Suspension), das eine Tritiummarkierung von ca. 1000 cpm / μg aufwies. Freies Daunomycin führt ab einer Konzentration von 10"7 mol im Medium zu Behinderung des Wachstums von Trypanosomen.
Herstellung der Partikel fand wie unter Beispiel 1 beschrieben statt. Die Bdellosomen wurden gemäß Beispiel 1 über ihre oberflächenständigen Aminogruppen entweder mit monofunktionalem PEG verknüpft oder über bifunktionales (NHS-Ester-Λ/inylsulfon- )PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da mit Cysteinresten verschiedener Proteine gekoppelt: humanes Transferrin in verschiedenen Konzentrationen, Rinderserumalbumin und single-chain-Antikörper gegen den Transferrinrezeptor. Abschließend wurden freie Kopplungsgruppen mit Cystein abgesättigt.
c) Bindungsstudien
Jeweils ~3 * 105 in gutem Wachstum befindliche Parasiten wurden 20 min lang bei Raumtemperatur mit einem 1:1-Gemisch einer der oben beschriebenen Bdellosomen- suspensionen und Wachstumsmediums inkubiert, dann wurde der Überstand abgezogen, die Zellen wurden in isotoner Kochsalzlösung gewaschen und schließlich in frischer Salzlösung aufgenommen. Die Tritiumaktivitäten in Überstand, Waschpuffer und zellulärer Fraktion wurden durch Szintillationszählung bestimmt.
d) Cvtotoxizitätsstudien
Jeweils 10 μl der oben beschriebenen Bdellosomensuspensionen wurden einer Suspension von ~105 in gutem Wachstum befindlichen Parasiten in frischem Nährmedium zugesetzt (so dass eine Endkonzentration von 10"7 mol erreicht wurde) und über Nacht unter Wachstumsbedingungen inkubiert, nach 24 Stunden ausgezählt, und die Zellzahlen der Parasiten wurden mit denen der lediglich mit isotoner Kochsalzlösung behandelten Kontrollen verglichen.
e) Konklusion Die Ergebnisse der Bindungs- und Cytotoxizitätsstudien zeigen eine Korrelation zwischen Cytotoxizität und Bindung von >97%. Die am stärksten bindende Fraktion (mit Antikörpern verbundene Bdellosomen) verringerte die Zelldichte der Parasiten auf ein Viertel der nur mit isotoner Kochsalzlösung behandelten Kontrolle, d.h., es wurde ein ausgeprägter cytotoxischer Effekt beobachtet. In Abwesenheit von „Sucher"-Proteinen hingegen waren bei gleicher Daunomycinkonzentration weder Bindung noch Cytotoxizität zu beobachten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer
Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.
Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über Ansammlung der Effektoren am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Effektormolekülen im weitesten Sinn (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) im gewünschten Zielgewebe bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in definierte biologische Ziele («drug delivery», «drug targeting») zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist. Die heute verfügbare Antiköφertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebige biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren charakterisiert und kloniert worden, so dass es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden (z. B. Glykoside) bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Jedoch üben diese «Suchermoleküle», ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, während die Effektoren selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muss daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Effektoren mit der Zielspezifϊtät der Suchermoleküle zu verbinden.
Der effizienteste bislang bekannte Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen (d.h. Submikrometer-) Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Zielsuchermoleküle gebunden werden können. Auf diese Weise werden sowohl optimales Verhältnis von Zielsucher- zu Effektormolekülen als auch maximale Flexibilität erreicht: Während durch direkte kovalente Kopplung an ein einzelnes Antikörper- oder anderes Ligandenmolekül nur wenige (<10) Effektormoleküle gebunden werden können (was bei einem Molekulargewicht eines Antikörpers von rund 150 kDa bedeutet, dass über 90% der Masse des Konjugats auf den Antikörperteil entfallen) und Konjugate mit niedermolekularen Suchern üblicherweise ein molares Verhältnis von 1:1 aufweisen, ist mit kolloidalen Systemen ein Effektor : Zielsucher- Verhältnis von 1O3 — 104 realisierbar. Überdies wird keine chemische Veränderung des Effektors benötigt, was in jeder Hinsicht vorteilhaft ist.
Eine effiziente Möglichkeit hierzu besteht darin, die betreffenden Substanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern, welche mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstnikturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden.
Eine vielverwendete Methode zur kolloidalen Verpackung von Pharmaka besteht darin, die Effektoren in lipidmembranumhüllte Vesikel (Liposomen) einzuschließen. Durch Verwendung entsprechender Membrankomponenten ist es möglich, zum einen die gewünschten Zielsuchermoleküle an die Liposomenmembranen zu binden, zum anderen die Träger mit antiimmunogenen Beschichtungen (z. B. Polyethylenglykol) zu überziehen und dadurch vor der unspezifischen Entfernung aus dem Blutstrom durch das retikuloendotheliale System zu schützen. Den Vorteilen dieses Systems stehen folgende gravierende Nachteile gegenüber:
- Die thermische und zeitliche Stabilität der aus einer einzelnen Lipiddoppelschicht bestehenden Vesikel ist begrenzt, ebenso die Dichtigkeit. Die Durchlässigkeit der Membranen für hydrophile Stoffe kann prinzipiell verringert werden, jedoch sind die benötigten veränderten (z. B. fluorierten) Lipide biologisch nicht unbedenklich. Überdies genügt ein einzelner «Treffer» des Komplementsystems zum Auslaufen eines vollständigen Vesikels.
- Die mangelnde Stabilität der Membranvesikel begrenzt ihrerseits die mögliche Variabilität in der Oberflächengestaltung und limitiert dadurch die potentiellen Anwendungen.
- Nur hydrophile Substanzen können in der wässrigen Innenphase der Vesikel in genügender Konzentration transportiert werden.
- Die Beladung der Liposomen erfolgt (von wenigen Spezialfällen abgesehen) durch einfachen Einschluss eines Teils der wäßrigen Phase und ist dementsprechend ineffizient: Typischerweise werden <0.5% der Effektorsubstanz in die Vesikel eingeschlossen. Hierbei wird die Substanz beträchtlichen thermischen und chemischen Belastungen ausgesetzt (die Arbeitstemperatur muss für längere Zeit oberhalb der kritischen Phasenübergangstemperatur des Lipidgemisches liegen, und die für die kovalente Modifikation benötigten reaktiven Gruppen überstehen dies nur bei sehr niedrigem pH- Wert).
- Die Hälfte der membranständigen reaktiven Gruppen, die zur Verknüpfung mit proteinösen Suchmolekülen benötigt wird, befindet sich nach der Vesikelbildung auf der Innenseite und steht nicht zur Bindung zur Verfügung, wird jedoch nach der Auflösung der Liposomen im Organismus freigesetzt und kann zu unvorhersehbaren Reaktionen fuhren.
- Die chemische Kopplung von Proteinen an liposomale Membranen (z. B. über direkt oder über einen Polyethylenglykolarm mit Lipiden verknüpftes SPDP) fuhrt zur Bildung hochimmunogener Strukturen, die bereits zur Vakzinierung erfolgreich eingesetzt wurden, auf dem Gebiet des «drug targeting» jedoch als unbrauchbar angesehen werden müssen, da sie zu einer Immunreaktion gegen die Partikel fuhren.
Als Alternative stehen solide Kolloidpartikel («Nanopartikel») zur Verfügung. Nanopartikel sind prinzipiell bekannt. Partikel im Mikrometer- und Submikrometerbereich aus hydrophoben Polymeren können prinzipiell durch feine Dispergierung des in einem unpolaren Lösungsmittel aufgenommenen Polymers produziert werden: Durch Entfernung des Lösungsmittels fällt das Polymer in Form von Partikeln, deren Durchmesser unter dem der Tröpfchen liegt, aus; eine Beladung mit hydrophoben Substanzen (in welche Kategorie die meisten Pharmaka fallen) kann durch einfachen Zusatz der Substanz zum unpolaren Lösungsmittel bewerkstelligt werden: Nach Entfernen des Lösungsmittels liegt die Wirksubstanz zu annähernd 100% mit dem Polymer assoziiert vor und bleibt, wenn die Partikel in eine wässrige Phase eingebracht werden, durch Van-der-Waals-Kräfte und sterisches „Entrapment" nichtkovalent, aber längerfristig stabil an die Partikelmatrix gebunden. Essentiell ist hierbei, dass eine nachträgliche Koagulation der hydrophoben Partikel (deren große Kontaktfläche mit dem hydrophilen Medium energetisch ungünstig ist) verhindert wird, was beispielsweise durch Herstellung der Partikel in Anwesenheit einer amphiphilen Substanz, welche zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium vermittelt, geschehen kann.
Konventionelle Nanopartikel und deren Herstellung und Möglichkeiten einer Oberflächenvariation sind aus der WO 96/20698 bekannt, wobei das System hier insbesondere für den intravaskulären Einsatz, insbesondere bei der Restenose optimiert wurde. Die Patentanmeldung beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigenschaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen.
Beispielhaft seien weiter die folgenden Dokumente genannt.
Die DE 198 10 965 AI beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus einem Polyelektrolytkomplex aus Polykationen und Polyanionen, der mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.
In der DE 198 39 515 AI werden kolloidale Polymer- Wirkstoffassoziate mit einem eigenschaftsoptimierten verzweigten Polyolester zum Einsatz insbesondere an mucosalen Geweben beschrieben.
Die US 6,117,454 beschreibt insbesondere polymolekulare Nanopartikel, die durch einen Überzug aus Fettsäurederivaten zum Durchdringen der Blut-Hirnschranke geeignet sind. In der US 5,840,674 werden fest über einen ,,Linker" kovalent gebundene Komplexe aus Wirkstoff und Mikropartikel insbesondere zum Einsatz gegen Mikroorganismen beschrieben.
Die US 5,641,515 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus Polycyanacrylat enthaltend Insulin, die das komplex gebundene Insulin kontrolliert f eisetzen.
Die bisher bekannten Nanopartikel und Methoden zu deren Herstellung weisen häufig Probleme in der Stabilität und Herstellbarkeit wie auch im Grad und Umfang der Beladung auf und sind bisher nur sehr begrenzt einsetzbar. Insbesondere ist auch das Problem der gezielten Applikation des Wirkstoffes am gewünschten Wirkort und der Stabilität der Nanopartikel nach Gabe bis zum Erreichen des Wirkortes, das „Drag Targeting" nur unzureichend gelöst. Ein zentrales Problem besteht in der Oberflächenmodifikation von Nanopartikeln. Wie oben bereits angeführt, stellen konventionelle solid-nanopartikuläre Systeme (im Gegensatz zu Liposomen) aufgrund ihrer extrem hohen spezifischen Lxterphase zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium ein energetisch ungünstiges System dar, das in Abwesenheit von Stabilisatoren instabil ist: Durch Zusammenlagerung von Partikeln wird die energetisch ungünstige Berührungsfläche minimiert, eine Ausfällung des hydrophoben Partikelmaterials ist die Folge.
Aus diesem Grund benötigen konventionelle Nanopartikel einen Überzug, beispielsweise aus amphiphilen Molekülen, die die Grenzflächenenergie herabsetzen und auf diese Weise die Partikel stabilisieren. Dieser Überzug deckt die Partikelmatrix vollständig ab und entzieht sie so dem Zugang modifizierender Agentien. Eine Modifikation gerade der amphiphilen Moleküle fuhrt aber andererseits zu einer drastischen Veränderung der physikalischen Eigenschaften und damit zu einer Destabilisierung des Überzugs. Aus diesem Grund ist es kaum möglich, konventionelle Nanopartikel so zu modifizieren, dass Bindung von Liganden und damit ein Einsatz im Gebiet des „drug targeting" möglich ist. Die bisher im Stand der Technik angebotenen Lösungen behandeln die Oberflächenmodifikation entweder nur generell oder so spezifisch an einem Problem ausgerichtet, dass eine generellere Anwendung nicht möglich ist oder die vorgelegte Lösung an sich schon nachteilig ist.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die die geschilderten Nachteile nicht aufweisen und insbesondere in der Lage sind, eine spezifische Freisetzung am Wirkort zu erreichen.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe erreicht, die durch ein Verfahren mit folgenden Schritten herstellbar sind:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls
Ergänzungsstoffe,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
Die erfindungsgemäßen Partikel, sind besonders geeignete Formen, mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Generell handelt es sich bei den von der Erfindung umfassten Partikeln vorzugsweise um solide, kolloidale und/oder lipidfreie Partikelsysteme.
Dabei versteht man unter hydrophobisierten Wirkstoffen, ursprünglich hydrophilere Wirkstoffe, die durch chemische Modifikation hydrophober geworden sind. Ein Beispiel sind hydrophobe Resorptionsester hydrophiler Wirkstoffe.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Nonopartikel ist es besonders bevorzugt, wenn das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1:10 und 1:50, vorzugsweise zwischen 1:20 und 1:40, insbesondere zwischen 1:20 und 1:30 lösen und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus:
Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol.
Dabei ist die Wahl des geeigneten Lösungsmittels aber keinesfalls auf Methylenchlorid oder Benzylalkohol beschränkt.
Weiter ist es bevorzugt, wenn bei der Herstellung der erfindungsgemässen Partikel das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden.
Eine weitere bevorzugte Form der Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel beinhaltet, dass das separat gelöste amphiphile organische Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45 % (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40 % (w/v), insbesondere von 35 % (w/v) vorliegt.
Genauso bevorzugt ist es, wenn das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und 0,1 % (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5 % (w/v), insbesondere von 1,7 % (w/v) vorliegt.
Weiter bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäßen Partikel nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird. Dabei die Ultraschallbehandlung bevorzugt bei maximaler Leistung statt.
Genauso bevorzugt ist es, wenn das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial aus Schritt (b) nach Abschluss von Schritt (b) zwischen 1 : 2 und 1 : 32, vorzugsweise zwischen 1 : 4 und 1 : 28, insbesondere zwischen 1 :8 und 1 :20, vorzugsweise zwischen 1 : 12 und 1 :16, insbesondere 1 : 14 beträgt.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyestern, vorzugsweise Polymilchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid Polyglykolid Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymer
(beispielsweise im Verhältnis 3:1).
Zur Herstellung der erfindungs gemäßen Partikel kann allerdings auch auf andere biokompatible, abbaubare synthetische Polymere wie z.B. entsprechende Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polycyanoacrylate, Polyacrylamide oder Polyurethane zurückgegriffen werden.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn das amphiphile organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben
Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden.
Ein weiterer, die Aufgabe der Erfindung erfüllender Gegenstand der Erfindung sind solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, die einen Kern aus organischem, wasserunlöslichen Polymermaterial und eine
Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen Polymermaterial enthalten und bei denen das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.
Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn bei diesen erfindungsgemäßen Partikeln das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
Es ist für alle vorstehend genannten erfindungsgemäßen Partikel eine ausgewählte Ausfuhrungsform, wenn das verwendete amphiphile organische Polymermaterial ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylalkohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist, wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH2, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus
Cιo-Ci6-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure,
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH , vorzugsweise NH2, substituiert sind, insbesondere
Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der
Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere Pofyvinyllaurat-co- ß -Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co-ß-Alanat(7%).
Für alle vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Partikel ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, wenn die Partikel Nanopartikel sind und oder entsprechend in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.
Dabei versteht man unter Nanopartikel im engeren Sinne dieser Erfindung Partikel, die in jeder Dimension eine Länge unter 1 μm aufweisen, in einem weiteren Sinne Partikel, die in mindestens zwei Dimension eine Länge unter 1 μm aufweisen. Unter die engere Definition fallen insbesondere auch alle Partikel, die ein Volumen unter 1 μm , vorzugsweise 0,01 μm , insbesondere 0,0001 μm , aufweisen. Bei Nanopartikeln handelt es sich um solide kolloidale Partikel.
Speziell oberflächenmodifizierte Partikel sind ein zentraler Gegenstand dieser Erfindung und lösen in hervorragender Weise die Aufgabe der Erfindung. Daher sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstpffe, an die Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thioheaktive, vorzugsweise eine aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher (d.h. vor Modifikation durch Verknüpfung des Partikels mit den Linkern) auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH2- oder SH-Gruppen, vorzugsweise NH2-Gruppen, gebunden sind.
Dabei versteht man unter Linker-Molekülen Polymere, insbesondere unverzweigte Polymere, die die Eigenschaften, insbesondere die Oberflächeneigenschaften, des Partikels verändern, insbesondere aber zur sterisch günstigen Anbindung von anderen bioaktiven Verbindungen an die Partikel dienen oder gegebenenfalls auch die Partikel sterisch vor Abbau schützen.
Unter „reaktiver Gruppe" sind insbesondere im Stand der Technik bekannte Gruppenn zu verstehen, die leicht an Amino-, Thiol- oder Hydroxygruppen binden, sowie Epoxy- oder Vinyl-Gruppen.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Linker-Moleküle bifünktionell sind und neben einer amino- oder thiolreaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktioneile Gruppierung, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppierung, aufweisen.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle - wie oben beschrieben - und monofunktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thioheaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, bei denen auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle (bifunktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker-Moleküle (monoftmktionell)
1 ι an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.
Beide vorgenannte Gruppen an Partikeln sind sehr günstig, da damit sperrige Reste wie Antikörper an den bifunktionellen Resten ungehindert angelagert werden können, während die monofunktionellen Linker einen Abbau sterisch hindern. Diese Partikel werden auch als Akanthoshären bezeichnet. Dabei ist es wieder besonders bevorzugt, wenn an der Oberfläche der beiden vorgenannten Partikel- Arten (Akanthosphären) deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle kovalent gebunden sind.
Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-Ester-Polyethylenglykol oder NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol.
Bevorzugt ist es auch, wenn die mit Linkern versehenen erfindungsgemäßen Partikel Nanopartikel sind.
Weiter ist es bevorzugt, wenn es sich bei den Partikeln um bisher in den vorstehenden Abschnitten ohne Erwähnung von Linkern beschriebene erfindungsgemäße Partikel handelt.
Es ist bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern,
Antiköφerfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifϊkation angekoppelt wurden. Unter dem Begriff „Sucher"-Molekül im Sinne dieser Erfindung versteht man allgemein an die erfindungsgemäßen Partikel ankoppelbare Verbindungen, die in der Lage sind, mit hoher Affinität an die biologischen Ziele der Wirkstoffe, als da wären Proteine, Peptide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Lipoproteine, Glykoproteine oder andere biologische Moleküle, die entweder in gesundem Gewebe (physiologisch) oder in oder nahe krankem Gewebe (pathologisch) exprimiert werden, zu binden. „Sucher"- Moleküle können beispielsweise Peptide, Proteine, beispielsweise Antiköφer, Antiköφerfragmente oder Antiköφerderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antiköφer; Hormone, Zucker, beispielsweise Glykoside; synthetische oder natürliche Rezeptor-Liganden sein. Besonders bevorzugt sind Antiköφer, -derivate, -fragmente und Glykoside.
Es ist weiter bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder allgemein „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antiköφer, Antiköφerfragmente oder
Antiköφerderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. „Single- chain"-Antiköφer, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung deutlich mehr monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle enthält.
Bevorzugt ist es auch, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker, Hormone oder Proteine, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung überwiegend oder vollständig aus bifunktionellen Molekülen besteht.
Bevorzugt ist es weiter, wenn an den erfindungsgemäßen Partikel nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
Generell erfolgt eine gegebenenfalls anschließende Reinigung oder Isolierung vorzugsweise über eine Dialyse vorzugsweise mit selektiven Ausschlussmembranen.
Für alle erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn der zu transportierende pharmazeutische Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularar organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitzid, Virustatikum oder Aiitmelmintikum, eine cardiovaskulär- aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
Generell ist es eine bevorzugte Ausfuhrungsform aller erfindungs gemäßen Partikel, wenn das Partikel direkt oder über einen Linker, vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol- Moleküle, verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antiköφern, Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-
Antiköφern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.
Gerade die Verwendung der bifunktionellen Polyethylenglykol- Moleküle zur Oberflächenmodifϊkation von Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe ist ein wichtiger Teil dieser Erfindung. Daher ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung die Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester-
Polyethylenglykol mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächensubstituierten soliden Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle „Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antiköφern, Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. single-chain- Antiköφern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer f eien Cysteingruppe oder Thiozuckera
an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Gylykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antiköφer,
Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. single-chain-Antikörpern, vorzugsweise Antiköφer mit freier Cysteingruppe.
Auch die Verfahren zur Herstellung erfϊndungsgemäßer Partikel sind ein wichtiger Teil der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Partikels, insbesondere der zweiten beschriebenen Art der Partikel mit PLGA (Polylaktid/Polyglykolid), das folgende Schritte aufweist:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial, (b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
Die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders geeignete Formen zur Verstärkung der gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe und zur Minimierung systemischer Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Damit sind sie geeignet und vorgesehen in Therapeutika verschiedenster Art eingesetzt zu werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die erfindungsgemäße Partikel sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen in Form von Aerosolen, Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte oder als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets oder Kapseln verabreicht werden.
Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z.B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel z.B. inhalativ, oral, peroral, parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal, rektal, subkutan oder intramuskulär appliziert werden soll. Für orale Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten oder Suspensionen wie Tropfen, Säften und Sirupen, für andere Applikationen Suspensionen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.
Wie oben ausgeführt, sind die erfindungsgemäßen Partikel besonders geeignete Formen mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Mϊnimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird, so dass eine generelle Verwendbarkeit dieser Partikel zur Herstellung von Therapeutika vorliegt und sie sind natürlich generell für eine unbeschränkte Zahl von Indikationen geeignet. Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel darauf beschränken zu wollen, bietet sich deren Verwendung für besondere Indikationen an. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parasitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting. Weiter ist beispielsweise der Einsatz beim Targeting von Cytostatika auf Tumorzellen, beim Transport von therapeutisch nutzbaren Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke und bei der Behandlung von schweren Infektionen (namentlich durch Eukaryonten) auch bevorzugt. Weitere Anwendungsmöglichkeiten umfassen z.B. den Transfer von pflanzlichen Alkaloiden mit mikrobicider Wirkung in Trypanosomen und von Antioxydantien und antimflammatorischen Verbindungen [Vitamin E, Gallsäure, N-Acetyl-L-Cystein, 2,6-bis(tert-butyl)-4- Mercaptophenol, Ibuprofen und Gentisinsäure] bei (degenerativen) Gehirnerkrankungen, den Transfer von Substanzen in Hepatozyten, primär für die Behandlung von Neoplasmen, auch die Erhöhung der Wirkung von Primaquin auf die in den Leberzellen überdauernden Plasmodium-HypnozoitQn.
Unter den möglichen Anwendungen für die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders weiter zu nennen:
- Transport von sonst nicht gehirngängigen Pharmaka (z. B. Cytostatika, Psychopharmaka, Schmerzmittel, M' Alzheimer- Therapeutika) mit antiköφer-konjugierten Trägern durch die Blut- Hirn-Schranke
- Zielgerichtetes Einbringen von Pharmaka (z. B. Virustatika, Cytostatika, Plasmodizide) mit glykosid-konjugierten Trägern in Hepatozyten
- Orale Verabreichung von sonst nur parenteral verfugbaren Pharmaka durch Targeting auf Darmepithelien
- Erhöhung der Wirkung von antiparasitischen Therapeutika durch Targeting auf parasiten-spezifϊsche Oberflächenmoleküle Ein weiterer Gegenstand des Verfahrens ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel. Besonders geeignet ist diese Behandlung bei den vorgenannten Indikationen und Anwendungsarten.
Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiele und Abbildungen:
Abbildungen:
Abbildung 1 zeigt schematisch den generellen Aufbau und die Gestalt von erfindungsgemäßen Partikeln, einfachen Partikeln, einfachen Stealth-Partikeln, zielsuchenden Aktinosphären und zielsuchenden Akanthosphären.
Abbildung? zeigt die Einheitlichkeit in der Größenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Partikel nach Beispiel 1.
Beispiele
Allgemeine Bemerkungen:
Die nachfolgend ausgeführten Beispiele beschreiben von der
Erfindung umfasste Partikel, insbesondere Nanopartikel, in denen die Möglichkeit realisiert ist, Wirksubstanzen in kolloidale Trägeφartikel einzulagern. Diese können gegebenenfalls beispielsweise mit Antiköφern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels oder andereren „Suchermolekülen" verknüpft. Optional können die Nanopartikel beispielsweise zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden. Generell handelt es sich bei den hier beispielhaft beschriebenen, von der Efϊndung umfassten Partikel um kolloidale, lipidfreie Partikelsysteme. Einige der hier beschriebenen, von der Erfindung umfassten Partikel werden nachfolgend mit den allgemeinen Begriffen Aktinosphären und Akanthosphären bezeichnet (s. Abb. 1). Diese Bezeichnungen werden, da sie strukturelle Konzepte und nicht sterische Grundformen bezeichnen, unabhängig von der tatsächlichen Geometrie beibehalten.
Beispiel 1:
Allgemeine Nanopartikel:
Es handelt sich hier um Partikel im Größenbereich zwischen 10 nm und 500 nm mit einem kompakten Innenteil aus organischem wasserunlöslichem Polymermaterial, das mit einer Schicht aus einem amphiphilen organischen Polymer überzogen ist, das aufgrund seiner Eigenschaften nichtkovalent, aber fest an die wasserunlösliche Partikelmatrix gebunden ist und die Partikel sowohl gegen das wässrige Milieu stabilisiert als auch vor dem Zusammenkleben und der sich daraus ergebenden Flocculation schützt. Ferner ist das amphiphile organische Polymer mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen versehen, die es ermöglichen, weitere Komponenten daran chemisch anzukoppeln.
Als Material für die Herstellung der Nanopartikel dieses Beispiels wurde Polymilchsäure (Polylaktid, PLA) gewählt. Vorhandene Literatur über die Herstellung von Partikeln im Größenbereich von 1- 10 μm (zu anderen Zwecken verwendet) belegt die Eignung dieser Substanz, die gegenüber den meisten anderen Polymeren den Vorteil der biologischen Abbaubarkeit hat. Ferner ist es möglich, PLA mit hydrophileren Endgruppen zu versehen, welche sich dann während der Herstellung an der Grenzschicht zum wässrigen Medium orientieren und entweder selbst als niedermolekulare Zielsucher fungieren oder als Ankeφunkt für proteinöse Zielsucher verwendet werden können.
Die Herstellung von Nanopartikeln wurde anhand der Substanz RG752 (Fa. Boehringer Ingelheim), eines Block-Copolymers aus 75%
Polylaktid und 25 % Polyglykolid mit einem MW von durchschnittlich 12 kDA, etabliert und auf das reine Polylaktid R202H
(Boehringer) und Polypropylenglykol 26000 (Sigma; bei
Raumtemperatur flüssig) erfolgreich angewendet. Das jeweilige Polymer wird - ggf. in Anwesenheit der darin zu transportierenden
Substanz - in Benzylalkohol gelöst (Endkonzentration 5%) und diese
Lösung mit dem doppelte Volumen eines hochosmotischen
Schutzkolloids (35% Polyvinylalkohol und 35% Magnesiumacetat) vermischt. Durch mehrstündige Ultraschallbehandlung wird das gelöste Polymer feinst dispergiert. Durch Dialyse des entstehenden milchigen Produktes gegen einen großen Überschuss an Wasser werden Magnesiumazetat und Benzylalkohol (in Wasser 1 :25 löslich) sowie überschüssiger Polyvinylalkohol entfernt, so dass eine wässrige Suspension von polyvinylalkoholbeschichteten Nanopartikeln zurückbleibt.
Evaluation des Herstellungsprozesses erfolgte nach dem Prinzip der „quasielastischen Lichtbrechung" (QELS) in einem Zetasizer-Gerät (Zetasizer 3000 HS, Fa. Malvern). Es konnte gezeigt werden, dass nach der einfachen Vermischung von gelöstem Polymer und Schutzkolloid (Rührer, Vortex) noch Flüssigpartikel im Mikrometerbereich vorliegen, die erst unter der Ultraschallbehandlung in Nanopartikel übergehen. In Übereinstimmung mit dem Modell, wonach der Polyvinylalkohol die Grenzflächen stabilisiert, ist die Polyvinylalkoholkonzentration der ausschlaggebende Faktor für den Durchmesser der entstehenden Nanopartikel: 10% Polyvinylalkohol führte zur Bildung von Partikeln im Bereich von 300-400 nm, 35% zu Partikeln von 50 - 100 nm. (Die kritische Größe für kolloidale Systeme liegt bei ~ 150 nm; Partikel unterhalb dieser Größe können prinzipiell d.h. bei Verknüpfung mit geeigneten Suchmolekülen, die Blut-Hirnschranke durchqueren.) Die Temperatur wurde bei allen Versuchen weitgehend im physiologischen Bereich, bzw. zwischen 25° und 45°C gehalten.
Die Dauer der Ultraschallbehandlung hat keinen erkennbaren Einfluss auf die Partikelgröße, wohl aber auf die Ausbeute an brauchbaren Partikeln: Nach einer Behandlung von 15 min sind rund 90% der gezählten Partikel, die zusammen jedoch nur ~ 1% der gesamten Polylaktidmasse ausmachen, im gewünschten Größenbereich, während der Rest aus Mikropartikeln besteht; nach lh Beschallung umfasst die Nanopartikel-Fraktion ~ 10% der Masse; nach 5-6h sind zwischen 70% und 99% des gesamten Polylaktids in Nanopartikel umgesetzt. Der Rest liegt in zwei weitgehend diskreten Mikropartikelfraktionen vor, einer kleineren mit einem Durchmesser von einem halben bis ganzen und einer größeren mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern, was einen zweiphasigen Verlauf des Dispersionsprozesses widerspiegeln könnte. Nach ca. 15- 18h begannen Zersetzung (an der Verfärbung erkennbar) und Verklumpung, bis schließlich nach 24h das gesamte Reaktionsgemisch zu einer wachsartigen Masse degeneriert war.
Bei manchen Messungen trat ein sekundärer Peak im Bereich von 250 - 300 nm auf; durch Verdünnungsversuche konnte jedoch gezeigt werden, dass es sich hierbei lediglich um Aggregate der relativen hydrophoben Partikel handelte. Höhere Partikeldichten führen überdies bei allen getesteten Substanzen zu einem scheinbaren
Durchmesser der Einzelpartikel, der um 20-30% über dem realen Durchmesser liegt, da offenbar Interaktionen der Partikel deren als
Grundlage für die QUELS-Messung dienende Bewegung hemmen.
Erwartungsgemäß waren beide Manifestationen dieser
Aggregationstendenz bei den stärker hydrophoben Substanzen R202H und Polypropylenglykol sowohl bei hoher als auch bei geringer Verdünnung erheblich deutlicher ausgeprägt als bei den korrespondierenden Proben von Nanopartikeln aus dem glykolidhaltigen Copolymer RG752.
Nachfolgend die Ergebnisse einer typische Messung (lVol. 5% RG752 in Benzylalkohol mit 2 Vol. 35% Magnesiumazetat/35% Polyvinylalkohol für 6 Stunden bei maximaler Leistung und 42° C beschallt, danach für 48 Stunden gegen 600 Vol. Wasser dialysiert [Ausschlussgröße der Membran 25 - 30 kDa, nach 24 Stunden Erneuern des Dialysewassers]; Proben vor der Messung jeweils 1:36 mit Wasser verdünnt):
-ungefiltert:
Figure imgf000084_0001
nach Filtration durch 800 nm-Filter (s. auch Abb. 2):
Die nach der Filtration beobachtete Größenverteilung ist mit der einer guten Präparation von Liposomen vergleichbar, der Vorteil liegt in der ungleich höheren Veφackungseffizienz. Durch Verknüpfung des als Schutzkolloid verwendeten Polyvinylalkohols mit verschiedenen organischen Säuren konnten die Oberflächeneigenschaften der Partikel verändert werden. Hierbei erwies sich eine Hydrophobisierung des Polyvinylalkohols, dessen Wasserlöslichkeit an der oberen Grenze für eine Beschichtungssubstanz liegt, als essentiell, da die ausschließliche Einführung reaktiver Gruppen die Hydrophilie des Polyvinylalkohols in solchem Maße steigerte, dass derselbe einfach in Lösung ging und es zu keiner Partikelbildung mehr kam. Dies konnte durch partielle Veresterung mit Fettsäuren auf dem Weg über die Säurechloride erreicht werden. Das so erhaltene Polyvinyllaurat (20%) zeigte Partikelbindungseigenschaften, die denen des ursprünglichen Polyvinylalkohols überlegen waren: Bei vergleichbaren Mengen Schutzkolloid wurden mit Polyvinyllaurat in wesentlich kürzerer Beschallungszeit und mit höherer Ausbeute etwas kleinere Partikel gebildet.
Im nächsten Schritt wurde Polyvinylalkohol mit unterschiedlichen Mengen von Laurylchlorid und ß-Alanylchlorid gleichzeitig umgesetzt, so dass Polyvinyllaurat(25%)-co- ß -alanat(7%) entstand. Diese Substanz war von ihren Partikelbildungseigenschaften her mit Polyvinyllaurat vergleichbar, aber stellte große Mengen von kovalent gebundenen primären Aminogruppen zur Verfügung. Aufgrund der lockeren Oberflächenstruktur, die einen Ausgleich der Ladungen von NH4 +-Gruppen durch dazwischengelagertes Acetat erlaubt, war kein Oberflächenpotential zu beobachten, doch war die Existenz der an supermolekulare Strukturen gebundenen Aminogruppen mit chemischen Mitteln eindeutig nachzuweisen.
Beispiel 2:
Herstellung der Aktinosphären und Akanthosphären
a) Allgemeine Anmerkungen
Sowohl in Aktinosphären als auch in Akanthosphären bestehen die weiteren Komponenten aus einem bifunktionalen
Polyethylenglykolmolekül, das am einen Ende eine aminoreaktive Gruppe trägt, am anderen Ende eine davon verschiedene Gruppe mit anderer Reaktivität. Durch dieses bifunktionale Polyethylenglykol werden einerseits die Partikel durch sterische Blockade der Oberfläche mit einem inerten Molekül dem Zugriff des Immunsystems entzogen (Ahnliches wurde im Zusammenhang mit Liposomen unter der Bezeichnung «Ste m-Teclmik» eφrobt) und überdies weiter stabilisiert, zum anderen wird die Möglichkeit geboten, weitere Moleküle, die die eigentliche Zielspezifität vermitteln, in räumlich günstiger und flexibler Position an die Partikel anzufügen. Bei diesen Molekülen kann es sich um Mikromoleküle handeln, z.B. Zucker, in welchem Fall eine ausschließliche Verwendung des bifunktionalen Polyethylenglykols möglich ist (Aktinosphären), oder um Makromoleküle wie etwa Antiköφer (Akanthosphären), in welchem Fall es aus sterischen Gründen ratsam ist, nur einen kleinen Teil der funktionalen Gruppen auf der Partikeloberfläche mit bifunktionalem Polyethylenglykol umzusetzen und den übrigen durch monofunktionales Polyethylenglykol, das dann alleine der physikalischen und immunologischen Stabilisierung der Partikel dient, abzusättigen.
Weiterhin empfiehlt es sich, nach dem Umsetzen der Nanopartikel- PEG-Konjugate mit den „Sucher"-Molekülen eventuell noch freie Kopplungsgruppen an den distalen Enden der PEG-Stacheln mit einem hohen molaren Überschuss eines geeigneten Reaktionspartners abzusättigen, im Fall von Vinylsulfon z.B. Cystein. Auf diese Weise wird verhindert, dass im Organismus diese Kopplungsgrappen mit köφereigenen Molekülen (z. B. Serumproteinen) reagieren und somit die Zielspezifität verfälscht wird.
b) konkrete Durchführung anschließend an Beispiel 1
Anschließend an die Herstellung der Nanopartikel gemäß Beispiel 1 wurden diese mit Polyethylenglykol auf der Oberfläche modifiziert. Durch Reaktion der mit Polyvinyllaurat(25%)-co-ß-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester Fluorescin-Polyethylenglykol im neutralen bis schwach basischen Milieu, gefolgt von Abtrennung des ungebundenen Polyethylenglykols durch Dialyse der Partikelsuspension gegen Wasser, wurden „Proto-Aktinosphären" erhalten, deren Eigenschaften anhand der Fluoreszenz und der physikalischen Eigenschaften der Polyethylenglykolmoleküle untersucht werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass eine kovalent gebundene Schicht aus fluoreszenzmarkiertem Polyethylenglykol die Oberfläche der Nanopartikel in hoher molekularer Dichte („self-quenching" der Fluoreszenz) und mit einer Dicke von 10-15 nm (hydratisiert) bedeckt, wie in der Schemazeichnung zu „Aktinosphären" dargestellt (Abb. 1). Die Partikelbildungseigenschaften des Polyvinyllaurat-co-ß-alanats waren denen unmodifizierten Polyvinylalkohols deutlich überlegen.
Durch Umsetzen der mit Polyvinyllaurat(25%))-co-ß-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol im schwach basischen Milieu und anschließende Aufreinigung durch Dialyse gegen Wasser können dementsprechend Partikel erhalten werden, die am distalen, weitgehend frei beweglichen Ende der kovalent an die Partikeloberfläche gebundenen Polyethylenglykol- „Stacheln" thiolreaktive Gruppen tragen.
Bei Verwendung der langsam reagierenden, relativ wasserstabilen Vinylsulfongruppe als distale Reaktionsgruppe der PEG-Stacheln ist es möglich, diese thiophilen Partikel für alle Anwendungen in einem vereinheitlichten Standardverfahren herzustellen und erst nach der Aufreinigung mit den geeigneten «Suchermolekülen» zu verbinden, welche beliebiger chemischer Natur sein können und lediglich eine Sulfhydrylgruppe besitzen müssen, so dass Aktinosphären und Akanthosphären hergestellt werden können. Bei Akanthosphären ist eine einfache Inprozesskontrolle des letzten Verl üpfungsschrittes durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten oder selber fluoreszierenden Proteinen (GFP) oder durch Western-Blot von Stichproben möglich, bei Aktinosphären durch Nachweis in der DürmscMchtchromatographie. Beispiel 3:
Wirksamkeiten und Eigenschaften von Nanopartikeln hergestellt nach Beispiel 1 oder 2
Die Beladung der Nanopartikel wurde mittels des relativ hydrophoben, zur Anfarbung von Zellmembranen verwendbaren Fluoreszenzfarbstoffes 4-Di-10ASP aus der Gruppe der Dialkylaminostyrole (Fa. Molecular Probes Inc.) getestet und entsprach den auf den gemessenen Größenverteilungen basierenden Erwartungen: Etwa 90% des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes wurden ordnungsgemäß in Nanopartikel veφackt. (In wässriger Lösung interferierten uncharakterisierte physikalische Effekte in inverser Abhängigkeit vom Verdünnungsgrad mit der Fluoreszenz, der 4-Di- 10 ASP-Gehalt konnte daher erst nach Auflösen der Partikel in einem Überschuß eines Methanol-Chloroform-Gemischs fluorimetrisch bestimmt werden.)
Die strukturelle Stabilität der Partikel erwies sich als bemerkenswert hoch: ohne Zugabe von erhaltenden Substanzen o.a. konnte nach einer achtwöchigen Lagerung bei Raumtemperatur ohne weiteren Zusatz stabilisierender Substanzen keine signifikante Veränderung der Größenverteilung oder 4-Di-l OASP-Beladung festgestellt werden.
Bei über die funktionalen Oberflächengruppen kovalent mit «Stacheln» aus Polyethylenglykol (MW 3400) verknüpften Nanopartikeln, an deren distalen Enden wiederum Antiköφer oder andere für das Targeting verwendbare Moleküle angefügt werden können, wurde eine Verringerung der unerwünschten Aufnahme der Partikel durch das retikuloendotheliale System am Rattenmodell gezeigt.
Beispiel 4:
Wirksamkeit von Akanthosphären
Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe mit einem Volumen < 1 μm beladen mit tritiummarkiertem Daunomycin wurden über ihre oberflächenständigen Aminogruppen entweder mit monofunktionalem Polyethylenglykol (PEG) verknüpft oder über bifunktionales (NHS-Ester-/Vinylsulfon-)PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da mit Cysteinresten verschiedener „Sucher"-Proteine gekoppelt:
• humanes Transferrin in verschiedenen Konzentrationen,
• Rinderserumalbumin und
• single-chain- Antiköφer gegen den Transferrinrezeptor.
Abschließend wurden freie Kopplungsgruppen mit Cystein abgesättigt. Es wurde auch eine Fraktion der Partikel ohne „Sucher"- Molekül hergestellt.
Die Akanthosphären wurden mit Parasiten vom Typ des parasitischen Einzellers Trypanosoma brucei brucei inkubiert und Bindung sowie Cytotoxizität bestimmt. Die Ergebnisse der Bindungs- und Cytotoxizitätsstudien zeigen eine Korrelation zwischen Cytotoxizität und Bindung. Und die mit „Sucher"-Proteinen versehenen Akanthosphären verringerten die Zelldichte der Parasiten deutlich im Vergleich zu Kontrollen, d.h., es wurde ein ausgeprägter cytotoxischer Effekt beobachtet. In Abwesenheit von „Sucher"-Proteinen hingegen waren bei gleicher Daunomycinkonzentration weder Bindung noch Cytotoxizität zu beobachten.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind in den nachfolgenden speziellen Ausführungsformen aufgelistet.
1. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, herstellbar durch ein Verfahren mit folgenden Schritten:
5 (a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem
Gemisch von organischen | Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoffes, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und 10 amphiphiles organisches Polymeπnaterial sowie gegebenenfalls Ergänzungsstoffe,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H2O
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der 15 entstehenden wässrigen Lösung.
2. Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 :10 und 1:50, vorzugsweise zwischen 1 :20 und 1:40, insbesondere 20 zwischen 1 :20 und 1 :30 lösen, und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus: Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol,
und/oder
dass das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und
0,1 % (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5 % (w/v), insbesondere von 1,7 % (w/v) vorliegt,
und/oder
dass die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird,
und/oder
dass das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial, aus Schritt (b) nach Abschluss von Schritt (b) zwischen 1 : 2 und 1 : 32, vorzugsweise zwischen 1: 4 und 1 : 28, insbesondere zwischen 1 :8 und 1 :20, vorzugsweise zwischen 1 : 12 und 1: 16, insbesondere 1 : 14 beträgt,
und/oder dass die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden,
und/oder
dass das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden, wobei es bevorzugt ist,
dass das separat ; ; gelöste amphiphile organische
Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45 % (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40 % (w/v), insbesondere von 35 % (w/v) vorliegt.
Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus Polyestern, vorzugsweise Polymilchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid/Polyglykolid
Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid Polyglykolid Copolymer (bevorzugt im
Verhältnis 3: 1).
und/oder
dass das amphiphile organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des
Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem
Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben
Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
und/oder
dass der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat. 4. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, enthaltend einen Kern aus organischem wasserunlöslichen Polymermaterial und eine Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen
Polymermaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.
5. Partikel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
6. Partikel gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
7. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylalkohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH2, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus Cιo-Ci6-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure, und/oder
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH2, insbesondere NH2, substituiert sind, insbesondere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere
Polyvinyllaurat-co- ß -Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co- ß -Alanat(7%).
8. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Nanopartikel sind und oder in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.
9. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thioheaktive, vorzugsweise QVΆQ aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH2- oder SH- Gruppen, vorzugsweise NH2-Gruρρen, an die Partikel gebunden sind.
10. Partikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben einer amino- oder thioheaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktionelle Gruppierung, vorzugsweise eine thioheaktive Gruppierung, aufweisen.
11. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle gemäß Anspruch 10 und monofunktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thioheaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.
12. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle ifunktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker- Moleküle (monofunktionell) an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.
13. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass an der Oberfläche der Partikel deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Linker-Moleküle kovalent gebunden sind.
14. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-
Ester-Polyethylenglykol oder NHS-Ester/Vinylsulfon-
Polyethylenglykol.
15. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Nanopartikel sind.
16. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen. 17. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antiköφern, Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antiköφern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
18. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antiköφer, Antiköφerfragmente oder
Antiköφerderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antiköφer, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
19. Partikel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Moleküle der Beschichtung bioaktive Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker; Peptide oder Hormone, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. 20. Partikel gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
21. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der zu transportierende Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularer organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein
Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitizid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär-aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
22. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er direkt oder über einen Linker; vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol-Moleküle; verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antiköφern, Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.
23. Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon-
5 Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifrmktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester-Polyethylenglykol mit NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächenmodifizierten soliden Partikeln zum Transport lp pharmazeutischer Wirkstoffe.
24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle „Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antiköφern, 5 Antiköφerfragmenten oder Antiköφerderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"- Antiköφern; Hormonen, Zuckern, ' ' vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien 0 Cysteingruppe oder Thiozuckern
an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Glykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antiköφer, Antiköφerfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antiköφer, vorzugsweise solche mit freier Cysteingruppe.
25. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H2O
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
26. Arzneimittel enthaltend Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
27. Verwendung von Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parsitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting.

Claims

Patentansprüche
1. Monomolekulare solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter Wirkstoffe enthaltend
a) ein unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Molekülrückgrat aus einem aus Monomeren aufgebauten Polymer mit mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer, wobei an die Bindungsgruppen (x) jeweils kovalent über eine (x)-(x')-Bindung
b) polykondensierte Molekülseitenketten aufgebaut aus kettenbildenden Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x') oder aufgebaut aus verschiedenen kettenbildenden Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, oder aufgebaut aus verschiedenen kettenbildenden Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und ein weiteres mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung mit (x) und auch eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann, binden, wobei jeweils am Ende der Molekülseitenketten kovalent über eine (y)-(y')-Bindung
c) Seitenkettenendstücke, die mindestens eine Bindungsgruppe (y'), keine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehene freie Gruppe (z) aufweisen, gebunden sind,
wobei
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist, • die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
• das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
• x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', xVy bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH- C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden und
• z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe.
2. Partikel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
3. Monomolekulare solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter Wirkstoffe herstellbar nach einem Verfahren, in dem unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymerrückgrat aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit
a) kettenbildenden Seitenketten-Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x'), wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
b) einer Mischung aus kettenbildenden Seitenketten-Monomeren, wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, oder
c) einer Mischung aus kettenbildenden Seitenketten-Monomeren, wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und mindestens ein weiteres Monomer mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') sowohl eine kovalente Bindung mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
sowie mindestens einem Seitenkettenendstück, mit mindestens einer Bindungsgruppe (y'), ohne Bindungsgruppe (y) und mit mindestens einer gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehenen freien Gruppe (z), wobei (y') eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenketten und dem Polymerrückgrat sowie den Kettenendstücken und auch eine Polykondensation der Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenketten erlauben, in Kontakt gebracht wird,
wobei
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist • x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH- C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NHz (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio- Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden,
• z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe und
• die Seitenketten-Monomere als reine Monomere oder Derivate wie intramolekulare Anhydride oder Lactone eingesetzt werden können, solange sie noch mit sich und/oder anderen Seitenketten-Monomeren Ketten bilden können.
Monomolekulare solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter Wirkstoffe herstellbar nach einem Verfahren, in dem unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymerrückgrat aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit
polykondensierten Molekülseitenketten aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x') oder aufgebaut aus verschiedenen Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, oder aufgebaut aus verschiedenen Monomeren, wovon ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und ein weiteres mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, wobei jeweils am Ende der Molekülseitenketten kovalent über eine (y)-(y')-Bindung Sei- tenkettenendstücke, die mindestens eine Bindungsgruppe (y'), keine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehene freie Gruppe (z) aufweisen, wobei (y') eine kovalente Bindung mit (y) eingehen kann, gebunden sind,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den polykondensierten Molekülseitenketten und dem Polymer erlauben, in Kontakt gebracht wird,
wobei
• das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
• die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x" ≠ der Gruppe z ist,
• das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
• x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH- C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH-C(O)-) oder COOH/SH (Thio- Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden und
• z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe.
5. Solide Partikel zum Transport gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin stattfindet.
6. Solide Partikel zum Transport gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen in Gegenwart von Thionylchlorid stattfindet.
7. Partikel gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass gegebenenfalls Schutzgruppen abgespalten werden.
8. Partikel gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich ein Waschschritt, vorzugsweise mit Dichlormethan, anschließt .
9. Partikel gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt anschließend zusammen mit dem zu transportierenden hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel gelöst wird, dann die Lösung einige Zeit, vorzugsweise über Nacht, vorzugsweise bei Raumtemperatur, inkubiert wird, dann die Lösung mit Wasser gesättigt wird und anschließend die wassergesättigte Lösung in einem grösseren Volumen Wasser gelöst wird, sich gegebenenfalls eine mechanische Behandlung anschließt und dann gegebenenfalls die Partikel gereinigt und isoliert werden.
10. Partikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich nach der Lösung der wassergesättigten Lösung in einem größeren Volumen Wasser keine mechanische Behandlung anschließt und/oder die Reinigung durch Dialyse vorzugsweise gegen H2O stattfindet.
11. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie organische Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 :10 und 1 :50, vorzugsweise zwischen 1 :20 und 1 :40, insbesondere zwischen 1:20 und 1 :30 löst, und/oder vorzugsweise ausgewählt ist aus: Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol.
12. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerrückgrat unverzweigt oder maximal einmal verzweigt, vorzugsweise unverzweigt ist.
13. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass
• die Monomere der Seitenkette jeweils maximal zwei Gruppen (y) und maximal zwei Gruppen (x') aufweisen und/oder
• die Gruppe (y) in den Monomeren der Seitenkette der Gruppe (x) im Polymer-Rückgrat entspricht und/oder
• die Gruppe (x') in den Monomeren der Seitenkette der Gruppe (y') im Seitenketten-Endstück entspricht und/oder
• die Gruppe (z) ausgewählt ist aus den „freien Gruppen" OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe,
• die Monomere der Seitenkette jeweils maximal 2 bis 10 C-Atome, vorzugsweise 2 bis 6 C-Atome, insbesondere 2 bis 4 C-Atome, aufweisen und/oder
• die Monomere der Seitenkette, die sowohl die Gruppe (y) als auch die Gruppe (x') aufweisen, entweder nur 1 Gruppe (y) und 1-2, vorzugsweise 1 , Gruppen (x') oder nur 1 Gruppe (x') und 1-2, vorzugsweise 1 , Gruppen (y) aufweisen und/oder
• die Monomere der Seitenketten bis auf das Seitenkettenendstück identisch sind mit jeweils 1 Gruppe (y) und 1 Gruppe (x') oder die Monomere der Seitenketten bis auf das Seitenkettenendstück identisch monoton alternierend aufgebaut sind aus abwechselnd einem Monomer mit 2 Gruppen (x') und einem Monomer mit 2 Gruppen (y).
14. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerrückgrat ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyvinylamin, Polysaccharid oder Polyami- nosäure,
vorzugsweise Polyvinylalkohol oder Polyacrylsäure,
insbesondere Polyvinylalkohol.
15. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Monomere der Seitenkette ausgewählt sind aus
Hydroxycarbonsäuren, Aminosäuren, der Kombination aus Diaminen und Dicarbonsäuren oder der Kombination aus Diolen und Dicarbonsäuren, bzw. deren Derivaten
vorzugsweise Hydroxycarbonsäuren oder der Kombination aus Diolen und Dicarbonsäuren, bzw. deren Derivaten
insbesondere Hydroxycarbonsäuren wie Milchsäure, Glykolsäure, Weinsäure oder Zitronensäure bzw. deren Derivaten.
16. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Seitenkettenendstücke ausgewählt sind aus
ungeschützten Aminosäuren, N-geschützten Aminosäuren, COOH-geschützten Aminosäuren, ungeschützten Aminoalkoholen, N-geschützten Aminoalkoholen, O-geschützten Aminoalkoholen, ungeschützten Thiolalkoholen, O-geschützten Thioalkoholen, S-geschützten Thioalkoholen oder ungeschützten Thiolsäuren, S- geschützten Thiolsäuren, COOH-geschützten Thiolsäuren, ungeschützten Thioaminen, S-geschützten Thioaminen oder N-geschützten Thioaminen,
vorzugsweise
ungeschützten Aminosäuren, N-geschützten Aminosäuren, ungeschützten Aminoalkoholen, N-geschützten Aminoalkoholen, ungeschützten Thiolalkoholen, S- geschützten Thioalkoholen oder ungeschützten Thiolsäuren, S-geschützten Thiolsäuren,
insbesondere
ungeschützten Aminosäuren, wie Alanin, N-geschützten Aminosäuren, wie N- FMOC-ß-Alanin, ungeschützten Thiolsäuren oder S-geschützten Thiolsäuren.
17. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerrückgrat, die Monomere der Seitenkette bzw. deren Derivate und das Seitenkettenendstück bzw. dessen Derivate ausgewählt sind aus einer der folgenden Kombinationen:
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, vorzugsweise
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18. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel eine Länge < 5 μm, vorzugsweise < 3 μm, insbesondere < 2 μm und/oder eine Dicke und Breite von < 200 nm, vorzugsweise < 75 nm, insbesondere < 30 nm aufweisen.
19. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass Linker-Moleküle, die eine reaktive Gruppe (z') ausgewählt aus Gruppen, die mit einer der Gruppen (z) ausgewählt aus den „freien Gruppen" (z) ausgewählt aus OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe eine kovalente Bindung eingehen können, vorzugsweise eine amino- oder thiolreaktive Gruppe, insbesondere eine aminoreaktive Gruppe, aufweisen, kovalent über (z')-(z)- Bindungen mit auf der Oberfläche des Partikels vorliegenden Gruppen (z) ausgewählt aus den „freien Gruppen", an die Partikel gebunden sind.
20. Partikel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben der an das Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 bindenden reaktiven Gruppe (z') an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere reaktive Gruppe (z"), ausgewählt aus reaktiven Gruppen, die mit einer der Gruppen (z) ausgewählt aus den „freien Gruppen" (z) ausgewählt aus OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe eine kovalente Bindung eingehen können, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppe, aufweisen, wobei z' ≠ z" ist.
21. Partikel gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle gemäß Anspruch 20 und monofunktioneller Moleküle, die neben der an das Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 bindenden reaktiven Gruppe (z'), vorzugsweise der amino- oder thiolreaktiven, insbesondere der aminoreaktiven, Gruppe an keinem anderen Ende des Moleküls eine weitere, anders reaktive funktioneile Gruppe (z") mit z' ≠ z" aufweisen, sind.
22. Partikel gemäß Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass an der Oberfläche der Partikel deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Linker-Moleküle kovalent gebunden sind.
23. Partikel gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"- Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
24. Partikel gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"- Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
25. Partikel gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Moleküle der Beschichtung bioaktive Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker; Peptide oder Hormone, insbesondere mit freier Cysteingruppe, über eine Bindung zur reaktiven Gruppe (z") angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
26. Partikel gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen (z") abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
27. Partikel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle monofunktionelle Moleküle sind, die neben der an das Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 bindenden reaktiven Gruppe (z'), vorzugsweise der amino- oder thiolreaktiven Gruppe, insbesondere der aminoreaktiven Gruppe, an keinem anderen Ende des Moleküls eine weitere, anders reaktive Gruppe (z") mit z' ≠ z" aufweisen.
28. Partikel gemäß einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-Ester-Polyethylenglykol oder NHS-EsterΛ/inylsulfon- Polyethylenglykol.
29. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der zu transportierende Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularer organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitizid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär-aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
30. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass er direkt oder über einen Linker; vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol- Moleküle; verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpem; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.
31. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein unverzweigtes oder maximal dreimal verzweigtes Polymerrückgrat (a) aufgebaut aus Monomeren mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (x) an jedem Monomer mit
• Seitenketten-Monomeren (b) mit jeweils mindestens einer Bindungsgruppe (y) und mindestens einer Bindungsgruppe (x'), wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
• einer Mischung von Seitenketten-Monomeren (b), wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y) und mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') aufweist, wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann, oder
• einer Mischung von Seitenketten-Monomeren (b), wovon mindestens ein Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (y), mindestens ein anderes Monomer mindestens zwei Bindungsgruppen (x') und mindestens ein weiteres Monomer mindestens eine Bindungsgruppe (y) und mindestens eine Bindungsgruppe (x') aufweist, , wobei (x') eine kovalente Bindung sowohl mit (x) als auch mit (y) eingehen kann,
sowie mindestens einem Seitenkettenendstück (c), mit mindestens einer Bindungsgruppe (y'), ohne Bindungsgruppe (y) und mit mindestens einer gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe versehenen freien Gruppe (z),
wobei
• das molare Verhältnis zwischen den Monomeren der Molekülseitenketten (b) und den Seitenkettenendstücken (c) » 1 ist,
• die Gruppe y ≠ der Gruppe z und die Gruppe x' ≠ der Gruppe z ist,
• das molare Verhältnis zwischen den Monomeren des Molekülrückgrats (a) und den Seitenkettenendstücken (c) etwa äquimolar ist
• x, x', y und y' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus OH, SH, COOH oder NH2 unter der Bedingung, dass x/x', x'/y bzw. y/y' entsprechende Bindungspaare x/x', x'/y bzw. y/y' (mit der entsprechenden Bindung) ausgewählt aus OH/COOH (Ester-Bindung -O-C(O)-), NH2/COOH (Amid-Bindung -NH-C(O)-), SH/COOH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-), COOH/OH (Ester-Bindung -O-C(O)-), COOH/NH2 (Amid-Bindung -NH- C(O)-) oder COOH/SH (Thio-Ester-Bindung -S-C(O)-) bilden, • z ausgewählt ist aus CH3, OH, SH, COOH oder NH2 sowie der Vinyl- oder Epoxy-Gruppe gegebenenfalls geschützt durch eine Schutzgruppe und
• die Seitenketten-Monomere (b) als reine Monomere oder Derivate wie intramolekulare Anhydride oder Lactone eingesetzt werden können, solange sie noch mit sich und/oder anderen Seitenketten-Monomeren Ketten bilden können,
unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenkette und dem Polymerrückgrat sowie den Seitenkettenendstücken als auch eine Polykondensation der Monomeren bzw. Monomeren-Gemischen der Seitenkette erlauben, in Kontakt gebracht wird,
gegebenenfalls in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin, gegebenenfalls in Gegenwart von Thionylchlorid und anschließend gegebenenfalls gereinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und gegebenenfalls isoliert wird
sowie gegebenenfalls anschließend die Partikel mit dem zu transportierenden hydrophoben oder hydrophobisierten Wirkstoff in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel gelöst werden, dann die Lösung einige Zeit, vorzugsweise über Nacht, vorzugsweise bei Raumtemperatur, inkubiert wird, dann die Lösung mit Wasser gesättigt wird und anschließend die wassergesättigte Lösung in einem größeren Volumen Wasser gelöst wird, sich gegebenenfalls eine mechanische Behandlung anschließt und dann gegebenenfalls die Partikel gereinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert werden.
32. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 enthaltend eine Gruppe (z) ausgewählt aus den freien Gruppen mit einem Linker-Molekül enthaltend eine reaktive Gruppe (z'), die mit der Gruppe (z) eine kovalente Bindung eingehen kann, unter zur Ausbildung dieser kovalenten Bindung geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und gegebenenfalls anschließend die Partikel reinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert.
33. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man in Anschluss an das Verfahren nach Anspruch 32 danach hergestellte Partikel, die an bifunktionellen Linker-Molekülen eine freie reaktive Gruppe (z") aufweisen mit bioaktiven Makromolekülen oder „Sucher"-Molekülen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25 unter zur Ausbildung einer Bindung zwischen der Gruppe (z") und den bioaktiven Makromolekülen oder „Sucher"-Molekülen unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und gegebenenfalls anschließend die Partikel reinigt, vorzugsweise durch Dialyse gegen H2O, und isoliert.
34. Arzneimittel enthaltend Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
35. Diagnostikum enthaltend Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
36. Verwendung von Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parsitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting.
. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, herstellbar durch ein Verfahren mit folgenden Schritten:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoffes, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls Ergänzungsstoffe,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
' Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß
Anspruch 3 9 gekennzeichnet durch folgende Schritte:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
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