WO2002068661A1

WO2002068661A1 - FUSED PROTEIN HAVING β1,2-N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE II ACTIVITY AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME

Info

Publication number: WO2002068661A1
Application number: PCT/JP2002/001695
Authority: WO
Inventors: Kazuhito Fujiyama; Tatsuji Seki; Shin-Ichiro Nishimura; Hiroaki Nakagawa; Susumu Nishiguchi
Original assignee: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2002-09-06
Also published as: EP1371732A4; EP1371732B1; US20040110176A1; EP1371732A1; JPWO2002068661A1; DE60230594D1

Description

明細書

β 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I活性

を有する融合タンパク質及びその製造方法技術分野

本発明は、糖タンパク質プロセッシング酵素の一種である、 ΐ , 2 - Ν- ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I を、安価に効率よく生産する方法に関する。詳細には、マルト一ス結合タンパク質と ;6 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I タンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法に関する。さらに、本発明は質糖鎖に付加している糖鎖構造の改変に関する。

背景技術

種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖タンパク質などとして存在している。これら糖鎖の構造は生物種や組織特異的に異なっているだけでなく、同一生物種や同一組織内でもその発生時期や疾病等によっても異なる。従って, 糖鎖は従来考えられていたタンパク質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等のタンパク質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生 ·分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。

これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素である。また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通常、 1つのグリコシド結合は対応する 1つの糖転移酵素によって形成されると言われている。これら糖転移酵素は糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は、極僅かであり大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。 β 1, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II (以下、 GnTII と略称する場合もある。）は、糖タンパク質の複合型糖鎖の形成に関与する重要な酵素であり、少なくとも UDP-GlcNAc を糖供与体として、糖受容体である Man l-6(GlcNAc β l-2Man a l-3)Man β l-4GlcNAc β l-4GlcNAc-Rに GlcNAc を /31- 2 結合で転移し、 GlcNAc ]31 - Man o;卜 6 (GlcNAc 31- 2Man ο; l-3)Manj31-4G1CNACJ3卜 4GlcNAc-Rを生じる作用を有する酵素である（但し、 Rはァスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。該酵素は、複合型糖鎖形成の Key酵素という理由から、安定した供給が望まれていた。

この、 β 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIは、各種動物の臓器から分離精製されている。しかし、大量且つ安定した臓器の入手は困難であり、かつ単一のタンパク質にまで精製しょうとすると非常に手間がかかることから、遺伝子組換えによる生産が期待されている。

該酵素をコードする c DNAは、各種生体試料より単離されている。例えば、ヒト由来 jS 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIは、白血球から Tan et al. によって単離されており [Eur. J. Bioc em. , 231:317 - 328 (1995)]。また植物では、 Arabidopsisから Strasser, R. et al. によって単離されている [Glycoconj. J. , 16:787-791 (2000)]。

組換えタンパク質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌ゃ酵母などの微生物で該タンパク質を発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現したタンパク質の多くが不溶性の封入体 (inclusion body) として存在することがあり、精製に先立って可溶化 ·再生（renaturation) の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性タンパク質として発現した酵素についても、それを高純度で得るためには、各種クロマトグラフィー処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間およびコストがかかるために、商業生産用の発現系としては十分ではなかった。

—方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする方法として、目的タンパク質をダル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ（GST) やプロテイン Aなどとの融合タンパク質として発現させる方法がある。該方法では、 GSTとの融合タンパク質は、ダルタチオンをリガンドとするァフィ二ティカラムクロマトグラフィーにより、また、プロテイン Aとの融合タンパク質は IgG をリガンドとするァフィ二ティカラムクロマトグラフィ一により'、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前記と同様に封入体を生成する可能性が高い。この様な理由から β 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Π を大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。

また、上記のように高等生物のタンパク質の多くは糖タンパク質として存在しており、その糖鎖構造は細胞間の認識や生体内物質の吸収、分解などの代謝速度に深く関与している。それ故、例えば動物由来の生理活性タンパク質をコードする遺伝子を酵母や植物を宿主として発現生産させた場合、得られる糖タンパク質の糖鎖構造は元の動物由来のものとは異なるため、生理活性が低下したり（場合によっては無くなったり）、代謝速度が速くなつてしまったりすることがしばしばある。もし、この異なってしまった糖鎖を元の動物の糖鎖に改変できる方法があれば、非常に有用である。また、もともと結合していた糖鎖とは異なる糖鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。発現させる宿主を変更したり、糖転移酵素遺伝子を導入することにより宿主を改変することにより、発現させるタンパク質に結合する糖鎖は変わるが、必ずしも望むものにかわるとは限らず、 i n vi t ro で得られた糖タンパク質の糖鎖を改変できる方が望ましい。そのような方法として、エンドダリコシダ一ゼの糖転移反応を利用した方法がいくつか開示されている (例えば、特開平 5- 64594号公報）。しかしながら、エンドダリコシダ一ゼの糖転移反応は糖受容体に対する収率が一般に低く、効率よく糖鎖を改変できない。別の方法としては、ェキソグリコシダーゼと糠転移酵素を用いる方法があるが（Eur. J . Bi oc em. , 191 : 75-73 (1990) ) , せいぜい非還元末端の糖残基を改変する程度であり、本格的な糖鎖の改変とはいえない。また、エンドグリコシダーゼと糖転移酵素を用いる方法もある（J . Am. Chem. Soc . , 119 : 21 14-2118 (1997) )。ここでは、エンドグリコシダーゼで加水分解した後、蛋白質上に残った N—ァセチルダルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸 ¾させ、シァリルルイス X 4糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、結合している糖鎖は糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体を改変するという点では不十分である。これまでのェキソあるいはェンドグリコシダ一ゼと糖転移酵素を用いる糖鎖改変方法が十分ではない理由の一つとして、変換の Key酵素となる ]31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIの大量且つ安定な供給が困難であつたことが挙げられる。

したがって、本発明の目的は、 β L 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II活性を有するタンパク質を、安価に且つ効率的に提供することを目的とする。

さらに、本発明は糖タンパク質糖鎖に付加している糖鎖構造の改変を目的とする。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のベクターを作成した概略図である（実施例 2)。

図 2は、実施例 3で得られた融合タンパク質溶液（MBP— hGnTII) の反応性を示す HP L Cの結果を示す図である。図 2 Aは式 2及び式 3の標準ピリジルァミノ化オリゴ糖（宝酒造社製）の分析結果であり、図 2 Bは式 2で表されるピリジルァミノ化オリゴ糖を基質として 3 時間反応させた結果である（実施例 4)。

図 3は、実施例 3で得られた MBP— hGnTIIの至適反応温度を示す図である (実施例 6)。尚、 40°Cにおける活性を 1 0 0 %とした。

図 4は、実施例 3で得られた MBP— hGnTIIの熱安定性を示す図である（実施例 7)。尚、 1 0°Cにおける活性を 1 0 0 %とした。

図 5は、実施例 3で得られた MBP— hGnTIIの至適反応 p Hを示す図である (実施例 8 )。尚、カコジル酸緩衝液（pH7.0)での活性の値を 1 0 0 %とした。図 6は、実施例 3で得られた MBP— hGnTII の p H安定性を示す図である (実施例 9)。尚、ダリシン緩衝液（pH8.8)での活性の値を 1 0 0 %とした。図 7は.、順相 H P L Cによる、実施例 1 0の各工程で得られたサンプルの糖鎖分析を示す。 - 図 8は、実施例 1 0の工程 4のメインピークのマススぺクトル分析の結果を示す。

図 9は、項 2 4〜項 3 5に記載の発明の一実施態様を示す図である。

図 1 0は、項 3 6〜項 4 4に記載の発明の一実施態様を示す図である。図 1 1は、項 4 5〜項 5 3に記載の発明の一実施態様を示す図である。図 1 2は、項 5 4〜項 6 2に記載の発明の一実施態様を示す図である。図 1 3は、項 6 3〜項 7 0に記載の発明の一実施態様を示す図である。なお、図 9〜図 13において、 1、 m、 n、 xは 0〜 2 0の整数を示す。

発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子操作により S 1 , 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I Iを、マルトース結合タンパク質（以下、 MBPと略称する場合もある）等の糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させると、 /3 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ I I を可溶性夕ンパク質として得ることができ、また、該タンパク質は糖結合タンパク質の特異的親和性を利用したァフィ二ティ一クロマトグラフィーによって容易に精製でき、得られた融合タンパク質が )3 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I活性（以下、 GnTI I活性ということがある。）を有することを見出した。さらに、本発明者らは、糖結合タンパク質と GnTI I との融合部位の配列を特異的に切断するプロテア一ゼにより、該融合夕ンパク質から GnTI I も取得できることを見出した。

また、発明者らは大量且つ安定供給が可能になった GnTI I を用いて、 in vi t roでの糖タンパク質糖鎖の変換が可能であることを見出した。

さらに、固定化酵素を用いてこのような糖タンパク質糖鎖の変換が可能であることも見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

1 . 糖結合タンパク質と ΐ , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ I I との組換え融合タンパク質（糖結合タンパク質一 GnTI I)。 2. ]31, 2— N—ァセチルダルコサミニル卜ランスフェラーゼ IIがヒト由来である、項 1に記載の融合タンパク質。

3. /31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが、

(a)配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質；または

(b)上記（a)において、 1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II活性を有するタンパク質

である項 1に記載の融合タンパク質。

4. )31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIが、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号 29〜447で示されるアミノ酸配列を含む、項 3に記載のタンパク質。

5. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む項 1〜 4のいずれかに記載の融合夕ンパク質。

6. 糖結合タンパク質と j31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ II との間にプロテアーゼ認識配列を含有する項 1に記載の融合タンパク質。

7. 糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である項 1に記載の融合タンパク質。

8. 項 1〜 7のいずれかに記載の融合タンパク質をコ一ドする DNA。

9. 項 8の DNAを含む発現ベクター。

10. 項 9の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。

1 1. 以下の工程：

(1)大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合タンパク質をコードする DNAと 31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II をコードする DNAを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現べクタ一を用いて、大腸菌を形質転換し、

(2) 得られる形質転換体を培養して、糖結合タンパク質と j31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II との融合タンパク質を生成させ、

(3) 得られる培養物から、該融合タンパク質を分離すること、

を含む糖結合タンパク質一 ]31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ II融合タンパク質の製造方法。

1 2. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIがヒト由来である項 1 1記載の方法。

1 3. /31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIをコードする DNAが、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号 29〜447 で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項 1 2 記載の方法。

14. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIをコ一ドする DNAが、配列番号 1に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号 85 〜1341で示される塩基配列を含む項 1 2記載の方法。

1 5. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIをコードする DNAが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩碁配列を含む項 1 1に記載の方法。

1 6. β ΐ, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIをコ一ドする DNAが、配列番号 1に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む項 1 1に記載の方法。

1 7. 糖結合タンパク質が、マルト一ス結合タンパク質である項 1 1に記載の方法。

1 8. マルトース結合タンパク質をコードする DN Αが、 pMAL_p2 あるいは pMAL— c2に由来する項 1 7に記載の方法。

1 9. (3) 得られる培養物から、 2価金属イオンの存在下、該融合タンパク質を分離する、項 1 1に記載の方法。

20. 2価金属がマンガン（Mn²⁺) である項 1 9記載の方法。

2 1.項 1 1〜 2 0のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去して 31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II を採取する工程を含む、 β ί, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIの製造方法。

2 2. 糖結合タンパク質をコードする DNAが、該タンパク質の C末端側にプロテア一ゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテア一ゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去することを特徴とする項 2 1記載の方法。

2 3. プロテア一ゼが血液凝固第 Xa因子である項 2 2記載の方法。

24.以下の工程 1〜工程 4を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 1) 糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる；

(工程 2) 上記（工程 1 ) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NA c とともに /31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程 2) で得られた糖タンパク質にひ一マンノシダーゼを作用させる。

(工程 4) 上記（工程 3) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NAc とともに /31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIを作用させる。

2 5.工程 4の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徵とする項 24に記載の方法。

2 6. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラ一ゼ、フコシルトランスフエラ一ゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 2 5に記載の方法。

2 7.糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項 2 5に記載の方法。

2 8. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、 N-ァセチルダルコサミニダ一ゼ、フコシダーゼ、シァリダーゼ、キシロシダ一ゼ、及びマンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 2 4に記載の方法。

2 9. 糖加水分解酵素が α—マンノシダーゼである項 2 8に記載の方法。

3 0. 糖加水分解酵素が 1 , 2一マンノシダーゼである項 2 9に記載の方法。

3 1. α—マンノシダ一ゼが α—マンノシダ一ゼ I Iである項 2 4に記載の方法。

3 2. 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した )31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIである項 2 4に記載の方法。

3 3. 糖加水分解酵素、 β ΐ, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ I、 αマンノシダーゼ、及び )31， 2— N—ァセチルダルコサミニル卜ランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項

2 4に記載の方法。

3 4. 糖タンパク質が天然由来のものである項 2 4に記載の方法。

3 5.糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項 2 4に記載の方法。

3 6.以下の工程 1〜工程 3を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 1 ) 糖タンパク質上の糖鎖構造の全てあるいは一部が /31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iの基質となる構造を有している糖タンパク質に、 UD P— G l c NA cとともに ]31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させる；

(工程 2) 上記（工程 1 ) で得られた糖タンパク質に α—マンノシダ一ゼを作用させる；及び

(工程 3 ) 上記（工程 2 ) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NA c とともに jS l, 2 _N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIを作用させる。

3 7.工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項 3 6に記載の方法。

3 8. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラ一ゼ、フコシルトランスフエラ一ゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 3 7に記載の方法。

3 9.糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項 3 7又は 3 8 に記載の方法。

4 0. α—マンノシダ一ゼが a—マンノシダ一ゼ I Iである項 3 6に記載の方法。

4 1. ]31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIが項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した β 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIである項 3 6に記載の方法。

4 2. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I、 αマンノシダーゼ、及び ]31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項 3 6〜4 1のいずれかに記載の方法。

4 3. 糖タンパク質が天然由来のものである項 3 6に記載の方法。

4 4.糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項 3 6に記載の方法。

4 5.以下の工程 1〜工程 3を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糠鎖に変換する方法：

(工程 1 ) 糖夕ンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NA c とともに 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程 2) で得られた糠タンパク質に UD P— G 1 c NA c とともに ]31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIを作用させる。 4 6.工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項 4 5に記載の方法。

4 7. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラ一ゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 4 5に記載の方法。

4 8.糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項 4 6に記載の方法。

4 9. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、 N-ァセチルダルコサミニダ一ゼ、フコシダーゼ、シァリダーゼ、キシロシダ一ゼ、及びマンノシダ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 4 5に記載の方法。

5 0. β I, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIが項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテア一ゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した /31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIである項 4 5に記載の方法。

5 1. 糖加水分解酵素、 β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ I、及び /31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項 4 5に記載の方法。 5 2. 糖タンパク質が天然由来のものである項 4 5に記載の方法。

5 3.糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項 4 5に記載の方法。

54.以下の工程 1〜工程 2を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 1 ) 混成型糖夕ンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。

(工程 2 ) 上記（工程 1 ) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NA c とともに j31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIを作用させる。

5 5.工程 2の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項 5 4に記載の方法。 56. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 5 5に記載の方法。

57.糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項 5 5に記載の方法。

5 8.糖加水分解酵素が、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、及び /3 1， 4一 N—ァセチルダルコサミニダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 54に記載の方法。

59. ]31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIが項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した j31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIである項 54に記載の方法。

60. 糖加水分解酵素、及び β 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項 54に記載の方法。

6 1. 糖タンパク質が天然由来のものである項 54に記載の方法。

62.糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項 54に記載の方法。

63.以下の工程 1〜工程 3を含む糖夕ンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する方法であって、使用する糖加水分解酵素、 ]31， 2— Ν〜ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I、及び /31, 4—ガラクトシルトランスフエラーゼのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である方法：

(工程 1) 糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に UD Ρ— G 1 c NA c とともに ;61, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程 2) で得られた糖タンパク質に UDP— G a 1 ととも 1, 4一ガラクトシルトランスフェラ一ゼを作用させる。 6 4 .工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する項 6 3に記載の方法。

6 5 . 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラ一ゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラ一ゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 6 4に記載の方法。

6 6 .糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項 6 4に記載の方法。

6 7 . 糖加水分解酵素が、ガラクトシダ一ゼ、及びひ —マンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項 6 3に記載の方法。

6 8 . α —マンノシダーゼが α 1 , 2 —マンノシダ一ゼである項 6 3に記載の方法。

6 9 . 糖タンパク質が天然由来のものである項 6 3に記載の方法。

7 0 .糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項 6 3〜6 8のいずれかに記載の方法。発明の詳細な説明

本発明は、 GnTI I活性を有するタンパク質を、 GnTI I と糖結合タンパク質との融合タンパク質としたこと、該融合タンパク質は可溶化タンパクであることを特徴とするものである。

さらに、本発明は、 GnTI I を糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、 GnTI iを可溶性融合タンパク質として生成させるのを可能にしたこと、並びに糖結合タンパク質の有する特異的親和性を利用して融合タンパク質及び GnTI I を容易且つ大量に精製するのを可能にしたことを特徴とする。

さらに、本発明は糖蛋白質の糖鎖を糖加水分解酵素および糖転移酵素を用いることにより変換を可能にしたことを特徴とする。本発明の融合タンパク質

本発明において、 MBPなどの糖結合タンパク質と GnTII との融合タンパク質（以下、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の場合には、「MBP -GnTIIJ と省略する場合もある）は、糖結合タンパク質の有する特異的親和性、すなわち MBPの場合にはマルトース並びにマルト一ス残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持し、且つ GnTIIが有する酵素活性、すなわち UDP- GlcNAc を糖供与体として、糖受容体である Mana卜 6(GlcNAc β l-2Mana l-3)Mani3 l-4GlcNAc j3 l-4GlcNAc-R (但し、 Rはァスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）に GlcNAcを 0卜 2結合で転移し、 GlcNAc^ l-2Manひ 1-6 (GlcNAc β l-2Man a l-3)Manj3 l-4GlcNAc β卜 4GlcNAc - Rを生成する活性を保持する限り、いかなる形態のものであってもよい。更に、式 1 に示すごとく、少なくとも糖結合タンパク質部分を除去した後に得られる GnTII が本来の酵素活性、すなわち UDP- GlcNAc を糖供与体として、糖受容体である Man α卜 6 (GlcNAc 3 l-2Mana l-3)Mani3 l-4GlcNAc j3 l-4GlcNAc-R ^ GlcNAc を ]S卜 2 結合で転移し、 GlcNAc j3 2Man on-6(GlcNAc jS 2Man a l-3)Man/3 l-4GUNAc 31- 4GlcNAc- Rを生成する活性を保持するものがよい。

NAc-R

Man β 1 -4GlcNAc β 1 -4GlcNAc-R

3

ΘΙο ΑοβΙ-δΜβηαΙ^ 好ましくは、該融合タンパク質は、糖結合タンパク質の C末端側に GnTI I が連結されたものであり、特に好ましくは糖結合夕ンパク質と GnTI Iが融合部位において、酵素学的または化学的手段により容易に切断され得る構造を有するものである。

糖結合タンパク質とは、単糖類並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持するタンパク質であって、例えば、各種レクチン、マルト一ス結合タンパク質、セル口一ス結合タンパク質、キチン結合タンパク質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合タンパク質、セル口一ス結合タンパク質、キチン結合タンパク質等であり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質（以下 MBPと省略することがある。）である。

糖結合タンパク質は、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの'原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。また、該 MBPは、マルト一スまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよレ^公知のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、マルト一スまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオ一ス等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有するタンパク質が例示できる。

本発明においては、 M B Pをコ一ドする遺伝子として pMAL— p2あるいは pMAL - c2 (共に New Engl and B i o labs社製）に由来するものを使用することができる。

本発明の糖結合夕ンパク質は、該タンパク質の C末端側に配列特異性の高いプロテア一ゼによって認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第 Xa因子、トロンビン、レニン等が挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼ認識配列は第 Xa因子認識配列、すなわち、 U e— Glu— Gly— Arg (配列番号 3) である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質の C 末端側に導入すること- により、例えば、 MBP— GnTI Iの精製後に該プロテアーゼを作用させて、 MBP 部分を容易に除去することができる。

また、より好ましい態様においては、糖結合タンパク質は、糖結合タンパク部位とプロテアーゼ認識部位の間に 5〜15 アミノ酸残基程度のスぺーサ一配列を含む。該スぺーサー配列の存在により、糖結合タンパク質は GnT I I から遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、 MBP - GnTI I融合タンパク質の場合、 MBP部分のマルト一スゃアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明の場合には、配列番号 9のスぺーサー配列を含む pMAL- p2或いは pMAL_c2 (New Engl and Bi o l abs社製）を使用することができる。

GnTI Iも、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、 GnTI Iは、 GnT I I活性を保持する限り GnTI I全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。例えば、（a)配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質や（b)上記（a)において、 1又は複数のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、）3 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Π活性を有するタンパク質であってもよい。

特に、 GnTI I はゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、 MBP - GnTI Iを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメイン領域の全部又は一部を除いた GnTI I を使用することも、本発明の好ましい実施態様の 1つである。具体的には、配列番号 2のァミノ酸配列の少なくとも 29〜447 で示される'アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。

また、配列番号 2のアミノ酸配列の少なくとも 29〜447で示されるァミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸からなり、 β 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I活性を有するタンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質の製造方法

本発明において、糖結合タンパク質— GnTIIは、糖結合タンパク質をコードする DNAと GnTIIをコードする DNAを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写 ·翻訳されるように一すなわちインフレームに (inframe) 一連結したキメラ D N Aを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。本発明において、 GnTIIをコードする DNAは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、 GnTIIをコ一ドする DNAは、その転写翻訳産物が GnTII活性を保持する限り GnTII遺伝子の全コード領域を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。特に、 GnTII はゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、糖結合タンパク質一 GnTIIを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメインをコードする領域を除いた GnTII コード配列を使用することも、本発明の好ましい実施態様の 1つである。

GnTIIをコードする DNAは、公知の GnTI I遺伝子配列 [例えば、 Eur. J. Biochem.， 231:317-328 (1995)] の配列等に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知の GnTII遺伝子配列をもとに、 GnTIIのコード領域の全部または一部をカバ一する適当なオリゴヌクレォチドプライマ一対を合成し、 GnTIIを発現する細胞または組織から抽出した全 RN Aもしくはポリ A^WRNA或いは染色体 DNAを铸型として RT— PCR又は PCR を行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後のベクタ一へのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマ一の末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。

あるいは、公知の GnTII遺伝子配列をもとに適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いて GnTIIを発現する細胞または組織から常法により調製した cDNAライブラリ一をプラーク（またはコロニー）ハイプリダイゼーションによりスクリーニングすることによつてもクローニングすることができる。。さらに、 GnTII をコードする DNAは、部分または完全精製された GnTII の全部または一部を抗原として常法により抗体を作製し、これを用いて GnTII を発現する細胞または組織から常法により調製した cDNAライブラリ一を抗体スクリーニングすることによつてもクローニングすることができる。

あるいは、当該 DNAは、公知の GnTII遺伝子配列をもとに DNA/RN A自動合成機を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、 PCR法によってより長い部分配列を二本鎖 DNAとして得るという操作を繰り返すことによって、所望の DN A配列を得ることもできる。

本発明の好ましい態様においては、当該 DNAはヒト由来) 31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II (以下、 hGnTII と省略する場合もある）をコードする DN Aの全部または一部を含むものである。例えば、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号 29〜447で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号 1に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号 85〜1341 で示される塩基配列を含む DNAである。あるいは、 hGnTII をコードする DNAは、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む DNAである。 hGnTII の膜貧通ドメインは、疎水性プロット分析の結果から、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号 10〜28 で示される部分であると推定されている。したがって、該ドメインをコードする DNAは、好ましくは配列番号 1に示される塩基配列中、塩基番号 28 〜84で示される塩基配列である。

もちろん、 hGnTII をコードする DNAは、配列番号 2に示されるァミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含む DNA、好ましくは配列番号 1に示される塩基配列の全部を含む DN Aであってもよい。

本発明において、糖結合タンパク質をコードする DNAは、上述の各種夕ンパク質をコードする D N Aが例示され、好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質をコードする D N Aであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質をコードする D N Aである。

また、該 D N Aは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。また、該 MBPをコードする D N Aは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオ一ス等）もしくは多糖類（例えば、ァミロ一ス等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコ一ド領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。同様に、糖結合蛋白質は、結合する糖に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコ一ドする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。

大腸菌由来の MBPは、ペリブラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はその N末端にシグナルべプチドを含む。本発明の MBPをコードする D N Aは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルべプチドをコ一ドする塩基配列（シグナルコドン）を含むものであってもよいし、含まないものであつてもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、 MBPをコードする D N Aがシグナルコドンを含む場合であっても、発現した MBP— GnTI Iが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、 MBP— GnTI Iがペリブラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフエロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。但し、この場合には、特に GnTI Iの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、 MBP— GnTI I はペリブラズム空間に到達せずに内膜にとどまる可能性があり、該融合タンパク質の回収が煩雑 (こなるからである。

本発明の MBPをコードする D N Aは、該タンパク質の C末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列（プロテアーゼ認識配列）をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第因子、トロンビン、レニン等が挙げられる。該プロテア一ゼ認識配列は、好ましくは第 Xa因子認識配列、すなわち、 Ile-Glu-Gly-Arg (配列番号 3 ) である。このようなプロテア一ゼ認識配列を糖結合タンパク質の C 末端側に導入することにより、例えば、 MBP— GnTII の精製後に該プロテアーゼを作用させて、 MBP部分を容易に除去することができる。

より好ましい態様においては、糖結合タンパク質をコードする DNAは、糖結合タンパク質コード領域とプロテア一ゼ認識部位の間、または糖結合夕ンパク質コード領域と GnTIIコード領域の間に 5〜15アミノ酸残基程度のスぺ一サ一配列をコードする塩基配列を含む。該スぺーサー配列の存在により、糖結合タンパク質は GnTII から遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、 MBP— GnTII融合タンパク質の場合、 MBP部分のマルト一スやアミロースに対する特異的親和性が増大する。

MBPをコードする DNAは、公知の MBP遺伝子配列 [例えば、大腸菌由来 MBP (Duplay P. et al. , J. Biol. Chem. , 259:10606- 10613 (1984)) 等] をもとに、 GnTIIをコードする DNAについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法により MBPの C末端側に上記のプロテア一ゼ認織配列および Zまたはスぺ一サ一配列を導入することができる。本発明の好ましい実施態様の場合には、配列番号 8のスぺ —サ一配列を含む。

また、大腸菌由来 MBPをコードする DNAは、例えば、 New England Biolab 社製の PMAL— p2 (シグナルコドンを含む）あるいは pMAL— c2 (シグナルコドンを欠失する）のような市販のベクタ一から得ることができる。

糖結合タンパク質一 GnTII融合タンパク質をコードするキメラ DN Aの構築を容易にするために、糖結合タンパク質をコードする DNAの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。 GnTIIをコードする DN Aをベクター中にクローニングする際に、 GnTIIの N未端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合タンパク質をコードする DN Aにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。

本発明の発現べクタ一は、上記の糖結合タンパク質— GnTI I をコードするキメラ D N Aが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、 R N Aポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である- 35領域および- 10領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプ口モーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域として t rpプロモーター、 l acプロモーター、 recAプロモー夕一、 lppプ口モーター、 t acプロモータ一等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、 l acプロモータ一ではラクトースゃ IPTG) を添加するとリプレッサータンパク質のオペレータ一への結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスな Shine— Dal garno (SD)配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合タンパク質— GnTI Iをコードするキメラ D N Aの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネータ —を用いることができる。本発明の発現べクタ一は、上記のプロモーター領域およびターミネータ一領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、 Co lE l or i、 M13or i 等が挙げられる。

本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカ一遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿ま大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカ一遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。

本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販の XL1— Blue株、 BL— 21株、； ίΜ107株、 TBI株、 JM109株、 C600株、 DH5 ひ株、 HB101株等が挙げられる。

発現ベクターの宿主細胞への導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、 Cohenらの方法（塩化カルシウム法） [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972)] 、プロトプラスト法 [Mol. Gen. Genet. , 168:111 (1979)]、コンビテント法 [J. Mol. Biol. , 56:209 (1971)], エレクトロポレーシヨン法等が挙げられる。

糖結合タンパク質— GnTII は、上記の糖結合タンパク質一 GnTII をコードするキメラ DN Aを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合タンパク質一 GnTIIを回収することにより得ることができる。

用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、ダリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニゥム，塩化アンモニゥム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，パクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源 [例えば、無機塩（例えば、ニリン酸ナトリウムまたはニリン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミン Bl)、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など] を培地中に添加してもよい。

形質転換体の培養は、通常 PH5.5〜8.5、好適には pH6〜8、通常 18〜40°C、好適には 20〜35°Cで、 1〜150時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。

培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して 1〜24時間前培養した後、得られた培養物を大型タンク中に接種するのが好ましい。

糖結合タンパク質一 GnTIIの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモータ一系によって制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の 660nmにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、 l acプロモー夕一や t acプロモーターを使用する場合、 660nmにおける吸光度が 0. 4〜0· 6 になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオー^ —D—ガラクトシド（以下、 IPTG と省略する場合もある）を、例えば 0. 1〜 l . OmMとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することがでさる。

本発明の方法では、糖結合タンパク質— GnT I Iの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、その糖結合タンパク質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体を用いたァフイエティークロマトグラフィ一に付すことにより、一段階で達成することができる。

例えば、糖結合タンパク質が MBPの場合、 MBPをコードする D N Aが、シダナルコドンを欠失している場合、 MBP— GnTU は菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をァフィニティクロマトグラフィーに供することができる。

一方、 MBPをコードする D N Aがシグナルコドンを有する場合、発現した MBP一 GnT 11 は分泌されてペリブラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフエロプラスト化して MBP— GnTI I を溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をァフィ二ティクロマトグラフィーに供することができる。

本発明において、糖結合タンパク質— GnT I I含有画分は、 2価金属イオンの存在下、上記精製を行うのが好ましい。具体的には、培養終了後 2価金属イオン存在下で、培養物から菌体を集め、菌体破壌等を行って、糖結合タンパク質一 GnT I I含有画分を得るのがよい。 2価金属イオンとしては、マンガンイオン（Mn²⁺)、マグネシウムィォン（Mg²⁺) などが例示できるが、好ましくは、マンガンイオンである。マンガンイオンは、塩化マンガン、硫酸マンガン、硝酸マンガン、臭化マンガンなどのマンガン塩として使用することができる。

ァフィ二ティクロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、 MBPの場合には、アミロースをァガ口一スビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、 New England Biolabs 社製の Amylose resin column等）を使用することができるが、他の MBPに対するリガンドおよび他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリマー等）を使用してもよい。

糖結合タンパク質一 GnTIIは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合タンパク質と吸着体の結合を阻害する糖（例えば、 MBP の場合にはマルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合タンパク質一 GnTII含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合タンパク質一 GnTIIを溶出させることによって得ることもできる。

このようにして得られた本発明の ΜΒΡ— GnTII は、 GnTII 活性を有するので、このまま、酵素として使用することができる。

GnTIIの調製

上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合タンパク質一 GnTIIはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合タンパク質一 GnTIIに、該プロテアーゼを作用させることにより糖結合タンパク質部分が除去されて、所望の GnTII が生成する。好ましくは、該プロテア一ゼは第 Xa 因子である。本発明においては配列番号 3 の第 Xa 因子認識配列を含む pMAL- 2或いは pMAL-c2 (New England Biolabs 社製）を使用することができる。糖結合夕ンパク質一 GnTIIにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液の pH、反応時間等は、使用するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、第 Xa因子の場合、中性緩衝液中、 4〜40°Cで 1〜25時間反応させることにより、糖結合タンパク質と GnTII とを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間攪拌することにより、遊離した糖結合タンパク質のみが該吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することにより GnTIIのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによつても GnTIIを精製することができる。質糖鎖の変換

本明細書において高マンノース型糖鎖とは、 N-結合型糖鎖のコア構造である Man α卜 6 (Man α 1-3) Man 31-4G1CNACJS卜 4GlcNAc -の非還元末端のマンノース残基にマンノースのみが結合した構造の糖鎖をいい、具体的には Man l-2Man a 1-6 (Man o; 1-2 Man 1-3) Man 1-6 (Man 1 - 2Man l-2Man a l-3)Man β卜 4GlcNAc)3卜 4GlcNAc-の構造を有する糖鎖が例示されるが、細胞内で糖鎖構造が成熟化する過程で 1個または複数個のマンノース残基が分解を受けたものも含まれる。また、 α 1— 3結合したマンノ一スや 1一 6結合したマンノース及び、ガラクト一スを含む構造も知られている {Clinton E. Ballou et, al. , Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91:9327 (1994)}₀

また、本明細書において複合型糖鎖とは N-結合型糖鎖のコア構造である Man α 1-6 (Man α 1-3) Man /3 l-4GlcNAc β卜 4GlcNAc-の非還元末端のマンノース残基に結合する糖が N-ァセチルダルコサミンのみである構造を基本骨格とする構造の糖鎖をいい、基本骨格にはさらにガラクト一ス、シアル酸、フコ一ス、キシロース、 N-ァセチルダルコサミン等が結合していても良い。具体的には GlcNAc β 1 - an 1- 6(GlcNAc β l-2Man 卜 3) Man β l-4GlcNAc β 卜 4GlcNAc-或いは Gal β l-4GlcNAc β l-2Man α 1-6 (Gal β l-4GlcNAc l-2Man l-3)Man β l-4GlcNAc β HGlcNAc-或いは Sia 2-6Gal β l-4Glc"NAc β l-2Man l-6(Sia 2-6Gal l-4GlcNAc β l-2Man a l-3)Man β l-4GlcNAc β 卜 4GlcNAc-等の構造を有する糖鎖が例示されるが、 N-結合型糖鎖のコア構造 Man 1-6 (Man a 1-3) Man i3 l-4GlcNAc β 1 - 4GlcNAc-の非還元末端に結合する N -ァセチルダルコサミンの結合様式は必ずしも β 1-2 結合でなくてもよく、例えば、 131- 3結合、 ΐ- 4結合、 01- 6結合、 a 1 2結合、 α 1-3結合、 α 1 - 4結合、 α卜 6結合でもよい。

また、本明細書において混成型糖鎖とは Ν 結合型糖鎖のコア構造である Man a 1-6 (Man ο; 1-3) Man β l-4GlcNAc 31 - 4GlcNAc-の非還元末端の《 1— 6 マンノース残基に結合する糖がマンノースであり、 1一 3マンノース残基に結合する糖が N-ァセチルダルコサミンである構造を基本骨格とする構造の糖鎖をいい、基本骨格にはさらにガラクトース、シアル酸、フコース、キシロース、 N-ァセチルダルコサミン等が結合していても良い。具体的には Man 1-6 (Man l-3)Man a 1-6 (Sia a 2-3Gal l-4GlcNAc jS l-2Mana 1-3) (Xyl β l-2)Man)S l-4GlcNAc/ 1- (Fuc 1 - 3)GlcNAc等の構造を有する糖鎖が例示される。

マンノース残基が 9から 2個の範囲にある高マンノース型糖鎖を有する遺伝子組換えにより発現させた糖タンパク質は、例えば C H Oなどの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞、カビ、ニヮトリ細胞または鶏卵、藻類、植物細胞などの真核細胞を或いは哺乳動物、昆虫、植物体を宿主として遺伝子組換えを行って得られた糠タンパク質が例示される。

近年の遺伝子工学的手法を用い、糖鎖構造を改変した組換えタンパク質生産の為の宿主が改良されている。酵母 Saccharomyces cerevisiaeでは、 o c h l , mn n l , mn n 4の 3直変異株に Aspergi 1 lus saitoi由来 ο; 1 , 2—マンノシダーゼ遺伝子を導入した組換え酵母細胞では、糖タンパク質の糖鎖構造が iS l， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iの最適の基質となるマンノース残基が 5個からなるものも存在することが報告されている (C iba Y. , et al. , J. Biol. Chein. , 273:26298 - 26304 (1998))。この組換え酵母宿主にて、外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させると、マンノース残基が 5個からなる糖鎖構造を持ち、 ]31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I を作用させて GlcNAcj3 l-2Man l-3Man β 1-4 構造を持つ糖タンパク質に変換できる。或いは酵母 Saccharomyces cerevisiae では、 o c h l， m n n 1 , mn n 4の 3重変異株にて外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させた後に、 Aspergillus saitoi 由来 oi l , 2—マンノシダーゼ或いはマンノシダーゼ Iを作用させて、 /31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させて GlcNAcj31 - 2Manon-3Manj31-4 構造を持つ糖タンパク質に変換することもできる。

酵母 Saccharomyces cerevisiaeの別の変異株 o c h 1 , m n n 1 , a 1 g 3の 3重変異株では、マンノース残基が 5或いは 8個からなる糖鎖構造を持つ糖タンパク質が得られている（Nakanishi-Shindo Y.， J. Biol. Chem. , 268:26338 - 26345 (1993))。 Aspergillus saitoi 由来 α ΐ , 2—マンノシダ —ゼ或いはマンノシダ一ゼ Iを作用させて、 β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iを作用させて GlcNAcj3 l-2Mano! l-3Man/31-4 構造を持つ糖タンパク質に変換することもできる。

植物細胞では、 j31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I遺伝子に変異のある Arabidopsis thaliana が発見されている（von Schaewen A. et al. , Plant Physiol., 102: 1109 - 1113 (1993))。この変異植物体では、マンノース残基が 5個からなる糖鎖構造を持つ糖タンパク質が得られている。マンノース残基が 5個からなる糖鎖構造 Manひ 1-6 (Man α 1-3) Man a 1-6 (Man α 1-3) Man i31-4は j31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iのより好ましい基質である。また、植物からクローン化された β 1, 2 _Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iの c DN Aをタバコ植物に導入し、アンチセンス法或いはコサプレツシヨン法により形質転換植物の 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ活性が低下した植物体が得られている（Wenderoth I. and von Schaewen A., Plant Physiol. , 123:1097-1108 (2000))。そこでこの様な組換え植物宿主にて、外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させると、マンノース残基が 5個からなる糖鎖構造を持ち、インビトロで jS l, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させて GlcNAc j3 l-2Mana! l-3Man/31-4 構造を持つ糖タンパク質に変換できる。タンパク質の種類は問わず、全ての糖タンパク質が包含され、例えば RNase Bが挙げられる。

項 2 4の工程 1或いは項 6 3の工程 1では例えば混成型糖鎖（項 2 4、項 6 3) または高マンノース型糖鎖（項 2 4) (図 9及び図 1 3参照）から Man l-6(Mana l-3)Mano! l-6(Mana l-3)Manj31-4G1CNAC J3 l-4GlcNAc 構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、これらの工程に用いられる好ましい糖加水分解酵素は α 1 , 2一マンノシダーゼである。 a 1， 2—マンノシダーゼは、 1， 2—結合で結合したマンノース残基を加水分解する酵素であり、マンノシダーゼ I或いは Man₉_マンノシダ一ゼも本発明における α 1， 2—マンノシダ一ゼに含まれる。変換される糖夕ンパク質糖鎖の Outer Chainに a 1 一 3結合したマンノースや α ΐ — 6結合したマンノースが含まれている場合は α—マンノシダーゼを併用することも可能である。さらには、変換される糖タンパク質糖鎖にキシ口一ス、フコース、 Ν—ァセチルダルコサミン、ガラクトース、或いはシアル酸等が付加されている場合は、糖加水分解酵素としてキシロシダーゼ、フコシダーゼ、 Ν—ァセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトシダ一ゼ及びシァリダーゼ等の少なくとも 1種も併用することが可能である。

項 2 4の工程 3或いは項 3 6の工程 2では例えば Man α 1-6 (Man l-3)Man«l-6(GlcNAo9 l-2Man a l-3)Man j3 l-4GlcNAc )S l-4GlcNAc から Man al-6(GlcNAciS l-2Mano; l-3) Man /3 l-4GlcNAc /3 l-4GlcNAc 構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが（図 9及び図 1 0参照）、この場合に用いられる α 一マンノシダ一ゼは、 α— 1， 2—結合、 α— 1 , 3—結合、 α— 1 , 4 - 結合またはひ一 1， 6—結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素である。 α—マンノシダーゼ IIは、 α— 1， 3—結合、または α— Ι , 6 - 結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素であるが、その基質特異性は厳密であり、 Manひ 1-6 (Man l-3)Man a 1-6 (GlcNAc β l-2Man a l-3)Man l-4GlcNAc β l-4GlcNAc → Man a 卜 6 (GlcNAc β l-2Man 1-3) Man β l-4GlcNAc j3 l-4GlcNAc の反応を触媒し、 GlcNAc 3 卜 2Man a 1- 3)Man /3 l-4GlcNACiS l-4GlcNAc までマンノースを削除しないという点で本工程に用いるにおいてより好ましい酵素である U. Biol. Chem. 266:16876 (1991) }。項 45の工程 1では例えば混成型糖鎖又は高マンノース型糖鎖（図 1 1参照）から Man α卜 6 (Man 卜 3) Man 3卜 4GlcNAc /31 - 4GlcNAc構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、この工程に用いられる糖加水分解酵素は好ましくはひ一マンノシダーゼである。ひ'一マンノシダーゼは、一 1 , 2 _結合、 α— 1， 3—結合、 a— 1， 4一結合または a— 1， 6—結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素である。また、変換される糖タンパク質糖鎖にキシロース、フコース、 N—ァセチルグルコサミン、ガラクト一ス、或いはシアル酸等が付加されている場合は、これらを加水分解するキシロシダーゼ、フコシダーゼ、 N—ァセチルダルコサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、或いはシァリダーゼ等もひ—マンノシダーゼと併用することが可能である。項 5 4の工程 1では、例えば混成型糖蛋白質（図 1 2参照）から Mana 1-6(G1CNAC J3 l-2Manal-3) Man 3 l-4GlcNAc^ l-4GlcNAc 構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、これらの工程に用いられる糖加水分解酵素は好ましくは a l， 2—マンノシダーゼである。 α 1 , 2—マンノシダーゼは、 α 1 , 2一結合で結合したマンノース残基を加水分解する酵素であり、マンノシダ —ゼ I或いは Man₉-マンノシダ一ゼも本発明における α 1， 2—マンノシダーゼに含まれる。変換される糖タンパク質糖鎖の Outer Chainに 1一 3結合したマンノースや α 1— 6結合したマンノースが含まれている場合は α 一マンノシダ一ゼを併用することも可能である。さらには、変換される糖夕ンパク質糖鎖にキシロース、フコース、 Ν—ァセチルダルコサミン、ガラクトース、或いはシアル酸等が付加されている場合は、これらを加水分解するキシロシダーゼ、フコシダ一ゼ、 Ν—ァセチルダルコサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、或いはシァリダ一ゼ等も併用することが可能である。しかしながら、 β ί， 2— Ν—ァセチルダルコサミニダーゼは目的の構造である Man l-6(GlcNAc β l-2Mano; 1-3) Mani3 l-4GlcNAc β l-4GlcNAc の形成を阻害するため望ましくない。

)31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I(GnTI)とは、少なくとも UDP-GlcNAcを糖供与体として、糖受容体である Man a卜 6 (Man a 1 - 3)Mano:卜 6(MaiiQ! 1 - 3)Man|3 4GkNAc]31- 4GlcNAc - Rに GlcNAc を /3卜 2 結合で転移し、 Man α 1-6 (Man a l-3)Man a 1-6 (GlcNAc β l-2Man a l-3)Man β 1 - 4GlcNAcj31- 4GlcNAc- Rを生じる作用を有する酵素である（伹し、 Rはァスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。また、 Man α卜 6 (Manひ卜 3) Man β l-4GlcNAc β l-4GlcNAc- R或いは Man 1-6 (Man a l-2Man 1-3) Man l-6(Mano!l-3)Man_iS l-4GlcNAc 3卜 4GlcNAc_Rに対しても GlcNAcを - 2結合で転移できる。

また、 /31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II (GnTII) とは、少なくとも UDP- GlcNAc を糖供与体として、糖受容体である Mana 1-6 (GlcNAc j3 l-2Man l-3)Man β l-4GlcNAc 1-4G1 cNAc- R GlcNAc を /3 1-2 結合で転移し、 GlcNAc ]3 1 - 2Man ο; 1- 6(GlcNAc /3 1 - 2Manひ卜 3)Man 3 1 - 4GlcNAc/S卜 4GlcNAc- Rを生じる作用を有する酵素である（但し、 Rはァスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。

また、本発明に用いられる、 α ΐ , 2—マンノシダ一ゼ、 β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I、 α—マンノシダ一ゼ、及び |3 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である場合、糖鎖構造の変換された糖タンパク質の反応系からの分離がより容易になる。

項 2 4の工程 1では、高マンノース型糖鎖または混成型糖鎖を有する糖蛋白質の加水分解を以下のような条件で実施することができる。他の糖鎖を有する糖蛋白質についてもこれらを参照して適切な条件下に加水分解を行うことができることは当業者には自明である。例えば図 9の混成型糖鎖又は高マンノ一ス型糖鎖の Man α 1-6 (Man a 1-3) Man a 1-6 (Man 卜 3) Man β l-4GlcNAc^ l-4GlcNAc 構造への糖鎖構造の変換がなされる。本工程では、酢酸緩衝液（PH 5. 0)、 ME S緩衝液（pH 6. 5) などの pH5〜7程度の緩衝液中、室温から 40°C程度の温度下に、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質に適量のひ 1， 2—マンノシダーゼなどの糖加水分解酵素を 1 〜7 2時間程度作用させることで行うことができる。或いは a 1, 2—マンノシダ一ゼを作用させる前に小胞体マンノシダーゼをまず作用させることもできる。また、ひ 1 _ 3マンノース構造、 α 1一 6マンノース構造、或いはガラクト一スを含む場合には予め α—マンノシダーゼ或いはガラクトシダーゼを作用させることもできる。

また、本工程では、酢酸緩衝液（ρΗ 5. 0)、 ME S緩衝液（pH 6. 5) などの pH5〜7程度の緩衝液中、室温から 40 程度の温度下に、混成型糖鎖を含む糖タンパク質に適量の α 1， 2—マンノシダーゼを 1〜 7 2 時間程度作用させることで行うことができる。或いは α 1， 2—マンノシダーゼを作用させる前に小胞体マンノシダーゼをまず作用させることもできる。また、《 1— 3マンノース構造、ひ 1— 6マンノ一ス構造、シアル酸、ガラクトース、キシロース、フコース、 Ν—ァセチルダルコサミン等を含む場合には予め α—マンノシダ一ゼ、シァリダ一ゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダ一ゼ、 Ν—ァセチルダルコサミニダ一ゼ等を作用させることもできる。

反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができるが、固定化 1， 2—マンノシダーゼ等の固定化酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

項 24の工程 2は、酢酸緩衝液（ρΗ 5. 0)、 ME S緩衝液（ρΗ 6. 5) などの ρΗ5〜 7程度の緩衝液中、工程 1で ί寻られた糖タンパク質に等モルから過剰量の UD Ρ— G 1 c NA cとともに適量の 31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを、室温から 40°C程度で 1〜7 2 時間程度作用させ、実施することができる。 i31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iを作用させる糖タンパク質は、糖鎖構造の骨格が Mano!l-3Manj3卜 4のマンノースの非還元末端が遊離していることが望ましく、遊離した非還元末端マンノースが οΠ- 3結合した Man )3卜 4が存在するマンノース残基 5個からなる糖鎖構造 Man αΠ - 6 (Man α卜 3) Man ο; 1-6 (Man al-3)Man 3卜 4が /31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iの最も適した基質である。しかし、項 45の工程 2に見られるようなマンノース残基が 3個からなる糖鎖構造 Mano; l_6(Manon- 3)Mani3卜 4も j61， 2 —N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iのより好ましい基質である。マンノース残基が 6個からなる糖鎖構造 Mano; 1 - 6(MancH- 2Mano! 卜 3) Man α卜 6 (Manび卜 3) Man3卜 4も β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iの基質となる。また、糖鎖構造 MancU-6MancH-6(Man Q; l-3)Mari)31- 或いは Man «卜 3Man α卜 6 (Man α卜 3)Man ]3 4 も ΐ, 2— Ν —ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iの基質となり得る。このことから上記（1) のマンノシダーゼ処理過程では、マンノシダーゼ処理により得られる糖タンパク質の高マンノース型糖鎖のマンノース残基数は 3、 4 或いは 6でも構わない。目的とする糖タンパク質は、透析などにより精製することができる。

また、固定化 j31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ I を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

項 24の工程 3は、例えば Manal- 6(Mano -3)Manoa-6(GlcNAc0 l-2Man α 1- 3)Man;Q 1 - 4GlcNAcj3卜 4GlcNAc (図 9参照）から GnTIIの基質となる Man 1 - 6(GlcNAc/3 l-2Man a l-3)Man i3 l-4GlcNAci31-4G1 cNAc構造への変換がなされ得る。本工程は、酢酸緩衝液（pH 5. 0)、 ME S緩衝液（pH 6. 5 )、 T r i s -HC 1緩衝液（ p H 7. 5 ) などの pH 5〜 8程度の緩衝液中、工程 2で得られた糖タンパク質に適量の α—マンノシダーゼを作用させることにより、実施することができる。市販されているひ一マンノシダーゼとしては夕チナタマメ由来 α-マンノシダーゼ、ァ一モンド由来 α-マンノシダーゼが挙げられるが、その他生物起源より抽出精製した α—マンノシダ一ゼ或いは α—マンノシダーゼ I Iであってもよい。

ヒトではマンノシダーゼ I Iのァイソザィムあるいはホモログ遺伝子が報告されているので、これらを用いてもよい。また、細菌由来の α— 1， 2 Ζ 3結合或いはひ一 1 , 6結合を分解するマンノシダーゼ（例えば、 New England Biola 社製）も市販されており、これらを組み合わせて用いてもよい。

目的とする糖タンパク質は、透析などにより精製することができるが、固定化 a—マンノシダーゼを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。項 24の工程 4は、酢酸緩衝液（£ H 5. 0)、 ME S緩衝液（pH 6. 5) などの pH5〜 7程度の緩衝液中、上記工程 3で得られた糖タンパク質に等モルまたは過剰量の UD P -G 1 c NA c及び適量の β 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ I Iを、室温から 40°C程度の温度で 1〜7 2時間程度作用させ、透析などにより精製することにより、 1， 2—結合により G 1 c NAcを糖タンパク質に結合させる。また、固定化 1, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフエラ一ゼ（]3 1， 3-ガラクトシルトランスフェラーゼ或いは ]3 1 , 4_ガラクトシルトランスフェラ一ゼ等）と UDP— G a 1、シァリルトランスフェラ —ゼ（ α 2 , 6--シァリルトランスフェラーゼ或いは α 2, 3-シァリルトランスフェラーゼ等）と CMP— S i a、及びフコシルトランスフェラ一ゼ（ひ 1 , 2—フコシルトランスフエラ一ゼ、或いは α 1 , 3—フコシルトランスフェラーゼ、或いは《 1 , 4—フコシルトランスフェラ一ゼ、或いは a l， 6—フコシルトランスフェラ一ゼ等）と GD Ρ— F u cを作用させる操作へと適用できる。

また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。

項 3 6の工程 1は、項 24の工程 1で得られた糖タンパク質に代えて遺伝子組換えにより発現させた糖タンパク質を用いる以外は項 2 4の工程 2と同様にして実施することができる。

項 36の工程 2は、項 24の工程 2で得られた糖タンパク質に代えて項 3 6の工程 1で得られた糖タンパク質を用い、項 24の工程 3と同様にして実施することができる。

項 36の工程 3は、項 24の工程 3で得られた糖タンパク質に代えて項 3 6の工程 2で得られた糖タンパク質を用い、項 24の工程 4と同様にして実施することができる。

このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフエラーゼ（)3 1， 3-ガラクトシルトランスフェラーゼ或いは j3 1， 4-ガラクトシルトランスフェラ一ゼ等）と UDP— Ga 1、シァリルトランスフェラーゼ（ 2, 6-シァリルトランスフェラーゼ或いは α 2， 3-シァリルトランスフェラーゼ等）と CMP— S i a、及びフコシルトランスフェラーゼ（α 1， 2—フコシルトランスフェラーゼ、或いは（¾ 1， 3—フコシルトランスフェラーゼ、或いはひ 1， 4ーフコシルトランスフェラーゼ、或いは α ΐ , 6ーフコシルトランスフェラ一ゼ等）と GDP— F u cを作用させる操作へと適用できる。

項 45の工程 1は糖タンパク質糖鎖、例えば、高マンノース型糖鎖或いは混成型糖鎖（図 1 1参照）の Mana卜 3(Mana卜 6)Manj6卜 4GkNAcj3卜 4GlcNAc への糖鎖の変換がなされ得る。本工程は、酢酸緩衝液（pH 5. 0)、 ME S緩衝液（pH6. 5) などの pH5〜 7程度の緩衝液中、工程 2で得られた糖タンパク質に適量の一マンノシダ一ゼを作用させることにより、実施することができる。また、シアル酸、ガラクトース、キシロース、フコース、 N—ァセチルダルコサミン等を含む場合には予めシァリダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダ一ゼ、 N—ァセチルダルコサミニダーゼ等を作用させることもできる。

反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができが、固定化一マンノシダ一ゼ等の固定化酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

項 45の工程 2は項 24の工程 1で得られた糖タンパク質に代えて、項 4 5の工程 1で得られた糖タンパク質を用い、項 24の工程 2と同様に実施することができる。

項 45の工程 3は、項 24の工程 3で得られた糖タンパク質に代えて、項 45の工程 2で得られた糖タンパク質を用い、項 24の工程 4と同様に実施することができる。

このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフエラーゼ（]31, 3-ガラクトシルトランスフェラーゼ或いは j31， 4-ガラクトシル卜ランスフェラーゼ等) と UD P— G a 1、シァリルトランスフェラ —ゼ（Q; 2 , 6-シァリルトランスフェラーゼ或いは α 2, 3-シァリルトランスフェラーゼ等）と CM Ρ— S i a、及びフコシルトランスフェラ一ゼ（a 1 , 2—フコシルトランスフェラーゼ、或いは a 1， 3—フコシルトランスフェラ一ゼ、或いは a l, 4—フコシルトランスフェラーゼ、或いは a l， 6—フコシルトランスフェラ一ゼ等）と GDP— Fucを作用させる操作へと適用できる。

項 54の工程 1では、例えば糖タンパク質上の混成型糖鎖（図 12参照）から Mana 1-3(G1CNACJ3 l-2Man en l-6)Man /3 l-4GlcNAc31-4G1 cNAc構造への変換がなされ得る。本工程は、項 45の工程 1で用いる糖タンパク質が混成型糖鎖を持つ糖タンパク質のみである点と、用いる糖加水分解酵素に /31, 2—N—ァセチルダルコサミニダーゼを用いない点を除けば、項 45の工程 1と同様に実施することができる。

項 54の工程 2は項 45の工程 2で得られた糖タンパク質に代えて、項 5 4の工程 1で得られた糖タンパク質を用い、項 45の工程 3と同様に実施することができる。

項 63は工程 1〜 3の少なくとも一つに固定化酵素を用いる高マンノース型糖鎖をもつ糖タンパク質の混成型糖鎖への変換方法である。

項 6 3の工程 1は用いる糖タンパク質の糖鎖が高マンノース型のみである事を除けば、項 24の工程 1と同様に実施することができる。

項 63の工程 2は、項 24の工程 1で得られた糖タンパク質に代えて項 6 3の工程 1で得られた糖タンパク質を用いて、項 2 の工程 2と同様に実施することができる。

項 6 3の工程 3は、 ME S緩衝液（pH 6. 5 )、 T r i s — H C 1緩衝液（ p H 8. 0 ) などの pH 6〜 9程度の緩衝液中、 '項 6 3の工程 2で得られた糖タンパク質に等モルまたは過剰量の UDP— G a 1及び適量の) 31， 4一ガラクトシルトランスフェラーゼを、室温から 40°C程度の温度で 1〜 7 2時間程度作用させることにより実施することができる。反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができるが、固定化 ]31, 4— ガラクトシルトランスフェラーゼを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフエラ一ゼ（jS l , 3-ガラクトシルトランスフェラーゼ或いは /3 1 , 4 -ガラクトシルトランスフェラ一ゼ等）と UD P— G a 1、シァリルトランスフェラーゼ（ α 2 , 6 -シァリルトランスフェラ一ゼ或いは α 2， 3-シァリルトランスフェラーゼ等）と CMP— S i a、及びフコシルトランスフェラ一ゼ（α 1， 2—フコシルトランスフェラーゼ、或いはひ 1 , 3—フコシルトランスフェラーゼ、或いは《 1， 4ーフコシルトランスフェラ一ゼ、或いは α ΐ , 6—フコシルトランスフェラ一ゼ等）と GDT?— F u cを作用させる操作へと適用できる。

また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。

尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1 ： PCRによる hGnTII c DNA断片の取得

配列番号 1記載のヒト 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ II (hGnTII) cD N Aの塩基配列をもとに、配列番号 4および 5に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 4〜27で示される塩基配列であり、後者は配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 1341〜1377で示される塩基配列である。これらのォリゴヌクレオチドをプライマーに用い、白人女性胎盤由来ヒト染色体遺伝子 (Clontech社製）を铸型として、以下の条件で？ CR反応を行った。

{0. lmg/ml 白人女性胎盤由来ヒト染色体遺伝子 1 1、 lOpmole/^ 1 ブライマ一各 l x l、 Taq. DNA Polymerase (Takara PGR Kit, 宝酒造社製） 0.5 1、 10倍濃度 PCRバッファー（Takara PGR Kit, 宝酒造社製） 5μ1、 dNTP (Takara PCR Kit, 宝酒造社製） 4μ1、滅菌水 37.5/ l、反応液容量 50 反応温度（時間）：変性 94°C (2分間），アニーリング 50°C (2分間），伸長 72 (1分間）；サイクル数： 30サイクル }。

PCR反応後、反応液をァガロースゲル電気泳動にかけ、 PCR産物である D N A断片の確認を行つた。該 D N A断片を pGEM- TeasyOPromega社製）ベクタ一と TA クロ一ニング法を用いて T4DNAリガ一ゼにより連結し、大腸菌 JM109株を形質転換し、 50;ag/inlのアンピシリン、 IPTG， X-gal を含む LBプレート培地で選抜した。

大腸菌より該 DNA断片を保持するプラスミドを調製し、該 DNA断片のヌクレオチド配列を常法に従って決定したところ、配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 4〜1377で示される塩基配列と一致することが分かり、所望の hGnTIIが得られたことが確認された。

実施例 2 ：発現べクタ一 pMGNT— IIの構築

膜貫通部位欠損型 GnTII遺伝子取得を目的として、配列番号 1記載のヒト β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II (hGnTII) cD N Aの塩基配列をもとに、配列番号 6および 7に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 85〜105で示される塩基配列の 5'末端側に制限酵素 BamHI 認識部位を連結したものであり、後者は配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 1334~1359で示される塩基配列の 3'末端側に制限酵素 Hindlll 認識部位を連結したものである。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、実施例 1で得られた pGEM-Teasy上の hGnTIIcDN Aを铸型として、以下の条件で PCR反応を行つた

[0. lmg/ml実施例 1で得られた hGnTIIcDNAl 1、 10pmole/ i 1プライマ一各 1 1、 Taq. DNA Polymerase (Takara PCR Kit, 宝酒造社製） 0.5 し 10倍濃度 PCRバッファー（Takara PCR Ki t、宝酒造社製） 5 1、 dNTP (Takara PCRKit、宝酒造社製） 4 1、滅菌水 37.5 1、反応液容量 50 1、反応温度

(時間）：変性 94°C (2分間），アニーリング 50°C (2分間），伸長 72°C (1 分間）；サイクル数： 30サイクル]

PCR産物を制限酵素 BamHIおよび Hind ΠΙで切断しァガロースゲルから約 1. 2kbの断片を回収した。一方、プラスミド pMAL— c2 (New England Biolabs 社製）を制限酵素 BamHI および Hindlll で切断し、ァガ口一スゲルから約 6.6k の断片を回収した。これらの断片を T4DN Aリガーゼを用いてライゲ —シヨンさせ、新規なプラスミド pMGNT— Πを得た。

上記工程概略図を図 1に示す。実施例 3 ：組換え大腸菌を用いた MBP— hGnTII融合タンパク質の調製

常法に従い、実施例 2で得た発現ベクター pMGNT- IIで大腸菌 DH5o;株を形質転換した。得られた組換え大腸菌を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB培地 5ml の入った試験管 2本に一白金耳植菌し、 37°Cでー晚振とう培養した。得られた培養液 ΙΟιηΙを上記培地 1Lの入った培養フラスコに植菌した。

で振とう培養し、培養液の 610 における吸光度が 0.5に達した時点で、終濃度 lmMの IPTGを加え、さらに 37 で培養を 4時間続けた。

菌体を遠心分離して集め、 lOOmM ME S緩衝液（pH6.5， 20mM MnCl₂, 50mM NaCl, lmM 2—メルカプトエタノール含有） 23ml で再懸濁した。懸濁液を超音波破砕装置にて処理した後、遠心分離し、その上清を粗酵素液とした。予め上記緩衝液で平衡化しておいたアミ口一スレジン（New England Biolabs 社製）カラム（5mU に、粗酵素液を通液することにより、 MBP— hGnTII 融合タンパク質を吸着させた。上記緩衝液でカラムを洗浄した後、マルト一スを IOmM含む上記緩衝液で、吸着した融合タンパク質を溶出させた。溶出画分を集め得られた融合タンパク質を上記緩衝液にて透析したものを融合夕ンパク質溶液（MBP— hGnTII) とした。実施例 4 ： GnTII活性の確認

実施例 3で得た融合タンパク質溶液（MBP— hGnTII) 23/21、 308mMゥリジンー 5' —ジホスホー N—ァセチルダルコサミン（以下、 UDP- GlcNAcと省略する場合もある） 1 1、並びに式 2で表される IO Mピリジルァミノ化オリゴ糖（宝酒造社製） l/ l、

式 2

M an α 1 \

6

M anjS G IcNAcjS G IcNAc-PA

3

G IcN Ac^ 1-2M anal /

PA ： 2 -am in op y rid in e

an ：マンノース

G IcN A c ： N -ァセチルダルコサミンを含む反応液を 37°Cで 3時間反応させた。反応後、沸騰水中で 2分間ィンキュベー卜することにより反応を停止させた。これらの反応液を HPLCで分析することにより、 N—ァセチルグルコサミンが転移した生成物 (式 3) を確認した。

式 3

6

M ani81-4G IcNAciS G IcNAc-PA

3

G IcN Acj81-2M anal.

PA ： 2-¾m inopyridine

M an ：マンノース

G IcN A c ： N-ァセチルダルコサミン結果を図 2に示す。図 2 Aは式 2及び式 3の標準ピリジルァミノ化オリゴ糖（宝酒造社製）の分析結果であり、図 2 Bは式 2で表されるピリジルアミノ化ォリゴ糖を基質として 3時間反応させた結果である。図 2 Bの式 3で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖のピークが MBP— hGnTII によって生成したものである。

以上の結果から、本発明の方法で得られた MBP— hGnTIIは GnTII酵素活性を保持することが確認された。実施例 5 ： hGnTIIの基質特性の検討

実施例 3で得た MBP— hGnTII(23 1)、 308mM UDP-GlcNAc(l n 1), 並びに式 2及び式 4〜式 8で表される lOiiMピリジルァミノ化オリゴ糖〖^ 1 を含む反応液 50 / 1 を 37°Cでー晚反応させた。反応後、沸騰水中で 2分間ィンキュペートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例 4と同様な方法で HPLCで分析した結果、式 2で表されるピリジルァミノ化オリゴ糖の他は式 6で表されるピリジルァミノ化オリゴ糖のみ活性を示した（表 1 )。以上の結果から、発明の方法で得られた MBP— hGnTII は天然由来のものと同じ基質特異性を有することが確認された。

式 4

M an α 1

6

M an/31-4G Ic AciS G IcNAcH^A

PA ： 2 -am in op y rid in e

Man ：マンノ一ス

G IcN A c ： N-ァセチルダルコサミン式 5

6

M ani81- G lcNAci81- G lcN A c-f A

3

M an at 1,

PA ： 2 -am in op y rid ine

M an ：マンノース

G lc Ac ： N -ァセチルダルコサミン

式 6

6

Ic Ac-PA

A ： 2 -am in op y rid ine

M an ：マンノース

G lcNAc ： N-ァセチルダルコサミン

Fuc ：フコース

式 7 i/i an a k

6

anj81-4G Ic ACiS 1-4G IcNAc-PA

3

GalSHG lc Ac/31-2M ana!^

PA ： 2 -am in op y rid ine

an ：マンノース

G lcNAc ： N-ァセチルダルコサミン

Gal ：ガラク卜ース式 8

an ot 1

\

6

M ariiS MG lcl\l A c j81-4G Ic Ac-PA Gal)S1-4G IcN A c /31-2M an a ノ _FucQ!l/ ⁶

PA ： 2-am in op y rid in e

an ：マンノース

G IcN Ac ： N -ァセチルダルコサミン

Gal ：ガラク！ ^一ス

Fuc ：フコース

表 1

GnTII活性の有無

化 2 +

化 4

化 5

化 6 +

化 7

化 8 実施例 6.: MBP-hGnTIIの至適反応温度の解析

実施例 3で得た MBP— hGnTII(23 1)、 308mM UDP - GlcNAc (1 ^ 1)、並びに式 2で表される Ιθ ίΜピリジルァミノ化オリゴ糖 l 1 を含む反応液 50 1 を 0〜70°Cで 3時間反応させた。反応後、沸騰水中で 2分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例 4と同様にして HPLCで分析することにより GnTII活性を測定し、 MBP— hGnTIIの至適反応温度の解析を行った。

その結果、至適反応温度は 30と 40°Cの間に有ることが確認された（図 3)。実施例 7 ： MBP-hGnTIIの熱安定性の解析

実施例 3で得た MBP— hGnTII(23 1)を 0〜70°Cの各温度に 4時間保温した後、氷上で 5分間置き冷却を行った。これに、 308mMUDP-GlcNAc(l 1)、並びに式 2で表される 10 Mピリジルァミノ化オリゴ糖 l lを添加し、 37 にて 5時間反応を行った。

反応後、沸騰水中で 2分間ィンキュベ一卜することにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例 4と同様に HPLCで分析することにより GnTII 活性を測定し、 MBP— hGnTII の熱安定性の解析を行った。その結果、 MBP— hGnTIIは 40°Cまで熱安定性を有することが確認された（図 4)。実施例 8 ： MBP- hGnTIIの至適反応 pHの解析

実施例 3で得た MBP— hGnTII を 3mM ME S緩衝液（pH6.5, 2 mM MnCl₂, 60mM NaCl, 1.2raM 2—メルカプトエタノール含有) に対して透析を行い、バッファ—濃度を低下させた。得られた MBP— hGnTII (25 xl)、 PH4.0〜10.5 の 200fflMの各種緩衝液 5 1、式 2で表される IO M ピリジルァミノ化オリゴ糖 1.5 1、 308mM UDP- GlcNAc (1 1)を添加し、 37°Cにて 5 時間反応させた。反応後、沸騰水中で 2分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例 4と同様に HPLCで分析することにより GnTII 活性を測定し、 MBP— hGnTII の至適反応 pHの解析を行った。使用した緩衝液は酢酸緩衝液（pH4.0〜5.5)、力コジル酸緩衝液（pH5.5〜7.0)、 HE P E S緩衝液（pH7.0〜8.0)、トリシン緩衝液（pH8.0〜8.8)、ビシン緩衝液（pH8.0 〜8.8)、グリシン緩衝液（pH8.8〜10.5)である。

その結果、 MBP— hGnTIIの至適反応 pHは pH6.5〜9.0であることが確認された（図 5)。実施例 9 ： MBP-hGnTIIの pH安定性の解析

実施例 8と同様に透析し、得られた MBP— hGnTII(25 l ρΗ4.0〜10·5 の 200mMの各種緩衝液 5 1 を添加し、 25でにて 7時間保温した。保温後、 1M ME S緩衝液（pH6.5， 20mM MnCl₂, 50mM NaCl, lmM 2—メルカプトェ夕ノール含有）式 2で表される IO Mピリジルァミノ化オリゴ糖 2 U K 308mM UDP- GlcNAc(l 1)を添加し、にて 5時間反応させた。反応後、沸騰水中で 2分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例 4と同様に HPLCで分析することにより GnTII活性を測定し、 MBP— hGnTII の pH安定性の解析を行った。使用した緩衝液は酢酸緩衝液（pH4.0〜5.5)、力コジル酸緩衝液（pH5.5〜7.0)、 HE PE S緩衝液

(pH7.0〜8.0)、トリシン緩衝液（pH8.0〜8.8)、ビシン緩衝液（pH8.0~8.8)、グリシン緩衝液（pH8.8〜10.5) である。

その結果、 MBP- hGnTIIは pH5.5〜9.5で安定であることが確認された（図 6

実施例 1 0 ：高マンノース型糖鎖を持つ RNaseBの複合型糖鎖をもつ RNaseB への変換

( 1 ) 糖鎖変換反応

工程 1 : (¾ 1， 2—マンノシダーゼ消化

20mgの RNaseB を 360 / l の 20mM酢酸緩衝液（pH5.0) に溶解、の 0.5U/ml 1 , 2—マンノシダ一ゼを添加した後、 37°Cにて 18時間反応を行つた。これに 15 Uの 0.5U/ml a; 1， 2—マンノシダ一ゼを再添加し、 37でにてさらに 9時間反応を行った。さらにこれに 5 1 の 0.5U/mlひ 1， 2— マンノシダ一ゼを再添加し、 37でにてさらに 18時間反応を行った。

得られた反応液のうち、 300 1 を ΙΟΟηιΜ ME S緩衝液（pH6.5, 20mM MnCl₂, 50mM NaCl, lmM 2—メルカプトエタノール含有）に対して透析を行った。残り IOO U は蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。工程 2 ： β 1, 2— Ν—ァセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ I反応工程 1にて得られた《 1， 2—マンノシダ一ゼ消化 RnaseB(280 z 1)に、 60 z 1の 308mMUDP - GlcNAc、及び 660 1のマルトース結合夕ンパク質一 /31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I融合タンパク質（以後、 MBP-hGnTI と省略する場合もある）を添加し、 37°Cにて 18 時間反応を行つた。

得られた反応液のうち 666 1 を lOmM ME S緩衝液（pH6.0) に対して透析を行った。残りは蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。尚、 MBP- hGnTIは特開 200卜 Π8453号公報に記載の方法により得られたものを使用した。工程 3 ：タチナタマメ由来 —マンノシダーゼ消化

工程 2にて得られた MBP- hGnTI反応 RNaseB (750 1)に、 94 1 の 100mM M E S緩衝液（pH6.0)及びの夕チナタマメ由来 _マンノシダ一ゼ（生化学工業社製）を添加し、 37°Cにて 15.5時間反応を行った。反応後さらに 7^ 1 の夕チナタマメ由来 α—マンノシダ一ゼを再添加し、 37°Cにて 13.5 時間反応を行った。反応後、 47 1の夕チナタマメ由来 α—マンノシダーゼを再添加し、 37°Cにてさらに 10.5 時間反応を行った。反応後、 94 1 の夕チナ夕マメ由来ひ一マンノシダ一ゼを再添加し、 37°Cにてさらに Ί時間反応を行った。反応後、 94^ 1のタチナタマメ由来 α—マンノシダ一ゼを再添加し、 37°Cにてさらに 43.5時間反応を行い、合計 90時間の反応を行った。得られた反応液の内

1 を lOOmM ME S緩衝液（pH6.5, 20mM MnCl₂, 50mM NaCl, ImM 2—メルカプトエタノール含有）に対して透析を行った。残り 610 l は蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。工程 4 ： β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I反応工程 3 にて得られた夕チナ夕マメ由来 a—マンノシダ一ゼ消化 RNaseB(750 1)に、 60 1の 308mM UDP-GlcNAc及び 2.19mlの実施例 3で得られた MBP- hGnTII を添加し、 37°Cにて 40時間反応を行った。反応後、 1ml の MBP- hGnTII を再添加し、 37°Cfcてさらに 11時間反応を行った。反応後、 liiilの MBP- hGnTIlを再添加し、 37°Cにてさらに 12.5時間反応を行った。反応後、 300 1 の MBP - hGnTII を再添加し、 37°Cにてさらに 11 時間反応を行つた。反応後、 500 x l の MBP - hGnTII を再添加し、 37°Cにてさらに 10.5時間反応を行い、合計 85時間反応を行った。

得られた反応液を蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化の確認を行った。 (2) 糖鎖変化の確認

上記工程 1〜4で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い、 2—ァミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルァミノ化オリゴ糖を順相 HPLCにより分析を行った。

HPLCの条件は以下の通りである。

Column： Amide column S odex Asahi PAK>

Soln. A : 80¾CH₃CN, Soln.B : 20%CH₃CN, Gradient： 10→50→10¾Soln. B(5→25 →26min)>

Time： 40min,

Column temp. ： 30°C

(a)工程 1の確認

図 7の Aは標準ピリジルァミノ化オリゴ糖の分析結果であり、ピーク 1が式 4、ピ一ク 2が式 5、ピーク 3が式 9、ピ一ク 4が式 1 0、ピーク 5が式 1 1、ピーク 6が式 1 2、ピ一ク 7が式 1 3で表されるピリジルアミノ化ォリゴ糖に対応する。

未処理 RNaseBの糖鎖分析の結果（図 7 B)、図 7 Aのピ一ク 4〜7に対応する種々の高マンノース型糖鎖が存在していることが確認された。

次に、工程 1により得られたひ 1 , 2—マンノシダ一ゼ消化 RNaseBの糖鎖分析の結果（図 7 C)、図 7 Bで検出された種々の高マンノ一ス型糖鎖のピークは全てピーク 4 (式 1 0) に変換されていることが確認された。

(b) 工程 2の確認

図 7 Dもまた、標準ピリジルァミノ化オリゴ糖の分析結果であり、ピーク 1が式 5、ピーク 2が式 6、ピーク 3が式 3、ピーク 4が式 14で表されるピリジルアミノ化ォリゴ糖に対応する。

工程 2により得られた MBP-hGnTIの反応生成物である RNaseBの糖鎖分析の結果（図 7 E)、図 7 Dのピーク 4 (式 1 4) に対応するピークのみが検出された。 ( c ) 工程 3の確認

工程 3により得られた夕チナタマメ由来 α—マンノシダ一ゼ消化 RNaseB の糖鎖分析の結果（図 7 F)、図 7 Dのピーク 2 (式 6) に対応するピークが主反応産物であることが確認された。

(d) 工程 4の確認

工程 4により得られた MBP-hGnTIIの反応生成物である RNaseBの糖鎖分析の結果（図 7 G)、図 7 Dのピーク 3 (式 3) に対応するピークが主反応産物であることが確認された。

さらに、図 7 Gのメインピークを分取し、マススぺクトル分析に供した結果（図 8)、式 3で表されるピリジルァミノ化オリゴ糖の理論値（1395.32) とほぼ一致した値が得られたことから、工程 4により得られた 31， 2— N— ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ I I の反応生成物である RNaseBの糖鎖構造は式 1 5で表される構造を有することが確認された。

以上の結果から、種々の高マンノース型糖鎖をもつ RNaseBを複合型糖鎖を持つ RNaseBに酵素的に容易に変換できることが確認された。実施例 1 1 ： α—マンノシダーゼ I Iの調製

J. Biol. Chem. 266: 16876 (1991)に記載の方法に従い、マウス 30匹の肝臓をホモジネートした後、ゴルジ体リッチな膜画分を得、膜画分より α—マンノシダ一ゼ I Iを可溶化し、 T r i t o n X— 1 1 4による二相分離、ーキモトリプシンによる消化、 T r i t o n X— 1 1 4による二相分離、 Mo n o S (アマシャムフアルマシア社製) カラムクロマトグラフィー、 S u p e r o s e 6 (アマシャムフアルマシア社製）カラムクロマトグラフィ —による精製を行った。得られた一マンノシダ一ゼ I I画分をセントリコン YM— 30による膜濃縮を行い、 α—マンノシダーゼ I I溶液 0. 5m l を得た。実施例 1 2 ：高マンノース型糖鎖を持つ RNaseBの複合型糖鎖をもつ RNaseB への変換

工程 3においてタチナ夕マメ由来一マンノシダ一ゼの代わりに、実施例 1 1で得た α—マンノシダーゼ I I、 lOOmMME S緩衝液（pH6.0) の代わりに 0. l %T r i t o n X— 1 0 0を含む lOOmMM E S緩衝液（pH6.0) を用いる以外は実施例 1 0と同様に行い、 RNaseB の糖鎖を変換した。変換後の RNaseBの糖鎖を分析したところ、式 3に対応する生成物が確認された。実施例 1 3 ：固定化 ]3 1 , 2—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I Iの調製

実施例 3と同様にして、アミロースレジン（New England Bio labs社製）カラム（5ml) に、 MBP— hGnTII 融合タンパク質を吸着させ、 lOOmM ME S 緩衝液（pH6.5, 20mM MnCl₂, 50mM NaCl, IraM 2—メルカプトエタノール含有）で洗浄し、得られた樹脂をそのまま固定化酵素とした。実施例 1 4 ：固定化 ]3 1， 2—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iの調製

特開 2001- 178453号公報記載の MBP_hGnTI融合タンパク質生産組換え大腸菌を用いて、実施例 1 1と同様にして、固定化 j3 1， 2—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I (5m l ) を得た。実施例 1 5 ：固定化 α 1 , 2—マンノシダーゼの調製

予め 6 0 m 1の 1 mM塩酸で洗浄した NH S活性化セファロース 4 F F (アマシャムフアルマシア社製） 1m lに α ΐ , 2—マンノシダ一ゼ（生化学工業社製） 0. 5Uおよび牛血清アルブミン 2 Omgを含む 5 OmM Η £? £ 3緩衝液（ 117. 0) 5m lを加え、 4 °Cでー晚穩やかに振とうさせることで、酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、 5m lの 5 Om M HE P E S緩衝液（ ρ H 7. 0 ) で洗浄した。洗浄後 0. 1 M T r i s _HC 〖緩衝液（pH8. 0) 5m i中に樹脂を加え、 4°Cで 4時間穩やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をブロックした。 1 M塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化 Q! l , 2—マンノシダーゼ 1 m 1を 5 OmM酢酸緩衝液（pH 5. 0) 中に浸漬し、 4でで保存した。実施例 1 6 ：固定化 α—マンノシダーゼ I Iの調製

1 , 2—マンノシダーゼ（生化学工業社製） 0. 5Uの代わりに実施例 1 1で得た α—マンノシダーゼ I 1 0. 5m lを用いる以外は実施例 1 5と同様にして、固定化 α—マンノシダーゼ I I 1m lを得た。実施例 1 7 ：固定化] 3 1， 4一ガラクトシルトランスフェラーゼの調製

予め 1 0 0m lの 1 mM塩酸で洗浄した CNB r活性化セファロース 4 B (アマシャムフアルマシア社製) 3 m 1に ]3 1， 4—ガラクトシルトランスフエラーゼ（東洋紡績社製） 3 0 U、牛血清アルブミン 1 2 Omg、ゥリジン一 5 '—ジホスホガラクトース（以下 U DP— G a 1 と略する） lmM、 N—ァセチルダルコサミン 5 mM、塩化マンガン 2 5 mMを含む 5 0 mM HE P E S緩衝液（p H 7. 0) 1 0m lを加え、 4 °Cでー晚穏やかに振とうすることにより酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、 5 0mM H E P E S緩衝液（ ρ H 7. 0) 1 0m lで洗浄した。洗浄後 0. 1 M T r i s— HC 1緩衝液（pH 8. 0) 1 0m l中に樹脂を加え、 4°Cで 4時間穏やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をプロックした。 1 M塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化 )3 1 , 4 一ガラクトース転移酵素 3 m l を UD P— G a 1 (1 mM)および塩化マンガン 5mMを含む 2 5mM HE P E S緩衝液（pH 7. 0) 中に浸漬し、 4 ^aCで保存した。実施例 1 8 ：固定化 a; 2 , 6—シァリルトランスフェラーゼの調製

予め 1 0 0 m 1の 1 mM塩酸で洗浄した NH S活性化セファ口一ス 4 F F (アマシャムフアルマシア社製) 1. 0 gを α 2 , 6—シァリルトランスフェラーゼ（東洋紡績社製） 1. 2 U、牛血清アルブミン 7 5mg、シチジンー 5 ' —ジホスフエ一ト 1 mM、 N—ァセチルラク卜サミン 5 mMを含む 5 OmM HEPE S緩衝液（pH 7. 0) 1 0m lに加え、 4°Cでー晚穏やかに振とうすることにより酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、 5 OmM HEP E S緩衝液（ p H 7. 0 ) 1 0m lで洗净した。洗诤後 0. 1 M T r i s— HC 1緩衝液（p H 8. 0 ) 1 0m l中に樹脂を加え、 4 °C で 4時間穏やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をブロックした。 1M塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化 a 2 , 6—シアル酸転移酵素 3 m 1 をシチジン一 5，一モノホスホー N—ァセチルノイラミン酸（以下 CMP— N e u A cと略する） 1 mMを含む 2 5 mM HEP E S緩衝液（pH7. 0) 中に浸潰し、 4°Cで保存した。実施例 1 9 ：固定化 a—マンノシダ一ゼの調製

ひ一マンノシダーゼ（タチナタマメ由来、生化学工業社製） 3 0Uを用い、実施例 1 1と同様にして、固定化 a—マンノシダーゼを得、酢酸亜鉛 0. 0 lmMを含む5 0mM HE P E S緩衝液（ρΗ 7. 0) 中に浸漬し、 4 °C で保存した。実施例 20 ：固定化酵素を用いた RN a s e Bの高マンノース型糖鎖の混成型糖鎖への変換

( 1) 糖鎖変換反応

工程 1 ：高マンノース型糖鎖の固定化 α 1， 2—マンノシダ一ゼによるトリミング

RN a s e B (シグマ社製） l O Omgを 20 mM酢酸緩衝液（p H 5. 0 ) 2m l に溶解させ、ここに実施例 1 5で得られた固定化 α 1 , 2—マンノシダーゼ lm 1を加えて、 3 7°Cで 24時間穏やかに振とうさせながら反応させた。反応後、固定化 1 , 2—マンノシダ一ゼをろ別し、固定化 α ΐ , 2—マンノシダーゼを蒸留水 5 m 1で洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量 3. 5 kDの透析膜（スペクトラム社製）に入れ、外液蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥することにより、目的物である糖鎖がトリミングされた RN a s e B (87mg)を得た。工程 2 ：固定 0 1 , 2—Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I による糖鎖の伸長

糖鎖がトリミングされた RN a s e B (1 5mg)をゥリジン一 5 '—ジホスホー N—ァセチルダルコサミン（以下 UDP— G 1 c N A cと略する） 1 0mM、塩化マンガン 20mM、塩化ナトリウム 1 0mM、 2一メルカプトエタノール 0. 2mMを含む 1 0 0 mM ME S緩衝液（p H 6. 5) 1 m 1 に溶解し、ここに実施例 1 4で得られた固定化 j3 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I lm 1を加え、 2 5 °Cで穏やかに振とうしながら 24時間反応させた。反応後、固定化 /3 1， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iをろ別し、固定化 ;3 1 , 2 _N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを蒸留水 5m 1で洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量 3. 5 kDの透析膜（スペクトラム社製）に入れ、外液（塩化マンガン 1 0 mMを含む 50 mM HE P E S緩衝液（p H 7. 5)) に対して透析を行った。透析後、限外ろ過ユニットウル卜ラフリ —MC (ミリポア社製、分画分子量 5， 0 00) を用いて、 1m lまで濃縮した。工程 3 ：固定化 j3 1, 4—ガラクトシルトランスフェラ一ゼによる糖鎖の伸長

工程 2で得られた溶液に UD P— G a 1 を 1 0 mMになるように加えた後、実施例 1 7で得られた固定化) 3 1 , 4一ガラクトシルトランスフェラーゼ 1 m 1 を加え、 2 5でで穏やかに振とうしながら 24時間反応させた。反応後、工程 2と同様にして、目的物の溶液 lm 1を得た。工程 4 ：固定化ひ 2, 6—シァリルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長工程 3で得られた溶液 1m l に CMP— N e uAcを 1 0 mMになるように加えた後、実施例 1 8で得られた固定化 α 2, 6—シァリルトランスフエラーゼ l m 1 を加え、 2 5t:で穏やかに振とうしながら 48時間反応させた。反応後、工程 2と同様にして、透析外液に蒸留水を用いて透析した後、凍結乾燥し、目的物 1 0mgを得た。

(2) 糖鎖変化解析

上記工程 1〜 4で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い、 2—ァミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルァミノ化オリゴ糖を順相 HPLCにより分析を行った結果、工程 4で得られた凍結乾燥品の糖鎖構造が式 1 6で表される構造が主成分であることが確認された。 ― 実施例 2 1 ：固定化酵素を用いた RN a s e Bの高マンノース型糖鎖の複合型糖鎖への変換

(1) 糖鎖変換反応

工程 1 ：高マンノース型糖鎖の固定化 α 1 , 2一マンノシダーゼによる卜リミング

実施例 2 0の工程 1と同様の方法で、糖鎖がトリミングされた RN a s e B (87mg) を得た。

工程 2 ：固定化 ]3 1 , 2一 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iによる糖鎖の伸長

糖鎖がトリミングされた RN a s e B (1 5mg) を UD P— G 1 c N A c ( 1 0 mM)、塩化マンガン 20 mM、塩化ナトリウム 10 mM、 2—メルカプトエタノール 0. 2mMを含む l O OmM ME S緩衝液（ρH 6. 5) 1m lに溶解し、ここに実施例 14で得られた固定化 jS 1 , 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I (1m l ) を加え、 2 5でで穩やかに振とうしながら 24時間反応させた。反応後、固定化 /3 1, 2— N— ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iをろ別し、固定化 1 , 2 - N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを蒸留水 5m 1で洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量 3. 5 kDの透析膜（スぺクトラム社製）に入れ、外液（酢酸亜鉛 0. 0 I mMを含む 1 0 OmM ME S 緩衝液（pH6. 0)) に対して透析を行った。透析後、限外ろ過ユニットウルトラフリー MC (ミリポア社製、分画分子量 5， 000 ) を用いて、 1 m 1まで濃縮した。

工程 3 ：固定化ひ —マンノシダ一ゼによる糖鎖のトリミング

工程 2で得られた反応生成物溶液 l m 1 に実施例 1 9で得られた固定化ひ一マンノシダーゼ 1 m 1を加え、 2 5 °Cで穏やかに振とうしながら 24時間反応させた。反応後、透析外液として塩化マンガン 2 OmM、塩化ナトリゥム 1 0mM、 2—メルカプトエタノール 0. 2 mMを含む 1 00 mM M E S緩衝液（pH6. 5) を用いる以外は工程 2と同様にして、目的物の溶液 lm lを得た。

工程 4 ：固定化 3 1， 2—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I Iによる糖鎖の伸長

工程 3で得られた溶液に、 UDP— G 1 c NAcを 1 OmMになるよう加えた後、実施例 1 3で得られた固定化 i3 1， 2—N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I I lm 1を加え、 2 5 で穏やかに振うしながら 48時間反応させた。反応後、透析外液として、塩化マンガン 1 OmMを含む 5 OmM HE P E S緩衝液（p H 7. 5) を用いる以外は工程 2と'同様にして、目的物の溶液 1 m 1を得た。

工程 5 ：固定化 1 , 4一ガラクトシルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長

実施例 20の工程 3と同様にして、糖鎖の伸長を行い、目的物の溶液 lm 1を得た。

工程 6 ：固定化ひ 2， 6—シァリルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長反応時間を 7 2時間にする以外は実施例 2 0の工程 4と同様にして、糖鎖の伸長を行い、目的物 6 mgを得た。

(2) 糖鎖変化解析

上記工程 1〜 6で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い.、 2—ァミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルァミノ化オリゴ糖を順相 HPLCにより分析を行った結果、工程 6で得られた凍結乾燥品の糖鎖構造が式 1 7で表される構造が主成分であることが確認された。実施例 2 2：固定化酵素を用いた RN a s e Bの高マンノース型糖鎖の複合型糖鎖への変換

実施例 2 1の工程 3において固定化一マンノシダーゼの代わりに実施例 1 6で得られた固定化 Q!—マンノシダ一ゼ I Iを用いる以外は実施例 2 1と同様にして、 RN a s e Bの糖鎖の変換を行った。変換後の糖鎖を切り出し糖鎖構造を分析した結果、式 1 7で表される構造が主成分であることが確認された。

式 9

αΐ\

3 6

Man V Man /31-4GI cNAc β 1-4GI cNAc-PA

PA 2-aminopyridine

Man マンノース

GlcNAc N-ァセチルダルコサミン

式 1 0

ManS 1 -4G I cNAc /81 -4G I cNAc-PA

3

Man 1ノ

PA 2- ami nopyridine

Man マンノース

GlcNAc M-ァセチルダルコサミン式 1 1

6

Man a

3 '6

Man l^ Man β 1-4GlcNAc β 1-4GlcNAc-PA

Man 1一 2Man V

PA 2-aminopyridine

Man マンノース

GlcNAc N-ァセチルダルコサミン式 1 2

ManoM - 2

PA ： 2-aminopyridine

Man ：マンノース

GlcNAc ： PJ-ァセチルダルコサミン式 1 3

Man αト ana 1、

6

Man

3

Man ot l-2Man ManjS 1-4G1CNACJS1-4GICNAC-PA

Man a 1-2Man V

PA 2-aminopyridine

Man マンノース

GlcNAc N-ァセチルダルコサミン式 14

ManaK

6

ana K、6

Man a 1ノ Man jS1-4GI cNAc 31 - 4G I cNAc-PA

Gl cNAcjS l-EManal-

PA ： 2-aminopyridine

Man ：マンノース

GlcNAc ： M-ァセチルダリレコサミン式 1 5

GlcNAc^S 1-2Mana1\

Wlan/31-4GICNACJ61-4GlcNAc-

GlcNAc/S 1-2 ana1-

R 夕ンパク質又はポリぺプチド又は 0H基

Man マンノース

GlcNAc W -ァセチルダルコサミン

式 16

anjS 1-4GICNACJ81 -4G I cNAc-PA

Siaa2-6Gal j81 -4G I

PA 2-aminop ridine

Man マンノース

GlcNAc N-ァセチルダルコサミン

Gal ガラク卜ース

Sia シアル酸式 1 7

Siaa2-6Gal )81-4GlcNAc^1-2ManaK

6

arii81-4GlcNAcj8 l-4GlcNAc-PA

3

S i a ex 2- 6Ga I j8卜 4G I cNAc j8卜 2Man ¾

PA 2-aminopyridine Man マンノース

GlcNAc N -ァセチルダルコサミン

Gal ガラク I ^一ス

Sia シアル酸本発明の方法では、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することができる。また、融合タンパク質から N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II そのものも容易に得ることができ、得られた N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II を利用することにより、糖鎖合成や診断等に有用な N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II抗体を容易に得ることができる。

Claims

請求の範囲

1. 糖結合タンパク質と 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ Πとの組換え融合タンパク質。

2. β L 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II がヒト由来である、請求項 1に記載の融合タンパク質。

3. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが、

(a)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または

）上記（a)において、 1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、 β ί, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ —ゼ II活性を有するタンパク質

である請求項 1に記載の融合タンパク質。

4. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号 29〜447で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 3に記載のタンパク質。

5. β ί, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したァミノ酸配列を含む請求項 1に記載の融合夕ンパク質。

6. 糖結合タンパク質と 31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ II との間にプロテアーゼ認識配列を含有する請求項 5に記載の融合タンパク質。

7. 糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項 1に記載の融合タンパク質。

8. 請求項 1〜 Ίのいずれかに記載の融合タンパク質をコードする DN A_c . 請求項 8の DNAを含む発現べクタ一。

1 0. 請求項 9の発現べクタ一によって形質転換された形質転換体。

1 1. 以下の工程：

( 1) 大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合タンパク質をコードする DNAと（31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ II をコ一ドする DNAを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現べクタ一を用いて、大腸菌を形質転換し、

(2) 得られる形質転換体を培養して、糖結合タンパク質と ΐ, 2—Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II との融合タンパク質を生成させ、

を含む糖結合夕ンパク質一 /31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ II融合タンパク質の製造方法。

1 2. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIがヒト由来である請求項 1 1記載の方法。

1 3. ]31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIをコードする DNAが、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中、少なくともァミノ酸番号 29〜447 で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項 1 2記載の方法。

1 4. β I, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIをコードする DNAが、配列番号 1に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号 85〜1341で示される塩基配列を含む請求項 1 2記載の方法。

1 5. )31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIをコ一ドする DNAが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するァミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項 1 1記載の方法。

1 6. β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIをコードする DNAが、配列番号 1に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む請求項 1 1に記載の方法。

1 7. 糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項 1 1 に記載の方法。

1 8. マルト一ス結合タンパク質をコードする DNAが、 pMAL— ρ2 あるいは pMAL— c2に由来する請求項 1 7に記載の方法。

1 9. (3) 得られる培養物から、 2価金属イオンの存在下、該融合タンパク質を分離する、請求項 1 1に記載の方法。

20. 2価金属がマンガンである請求項 1 9記載の方法。

2 1. 請求項 1 1〜 20のいずれかに記載の方法により得られる融合夕ンパク質から、糠結合タンパク質部分を除去して /31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIを採取する工程を含む、 ]31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIの製造方法。

22. 糖結合タンパク質をコードする DNAが、該タンパク質の C末端側にプロテア一ゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテア一ゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去することを特徴とする請求項 2 1記載の方法。

23. プロテアーゼが血液凝固第 Xa因子である請求項 22記載の方法。 24. 以下の工程 1〜工程 4を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に U DP— G 1 c NAc とともに j31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程 2) で得られた糖タンパク質に α—マンノシダーゼを作用させる。

(工程 4) 上記（工程 3) で得られた糖タンパク質に UDP— G 1 cNAc とともに (31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIを作用させる。

2 5. 工程 4の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項 24に記載の方法。

2 6. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 25に記載の方法。

2 7. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項 2 5に記載の方法。

2 8. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、 N-ァセチルダルコサミニダーゼ、フコシダ一ゼ、シァリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 24に記載の方法。

2 9. 糖加水分解酵素が α;—マンノシダ一ゼである請求項 24に記載の方法。

30. 糖加水分解酵素がひ 1 , 2—マンノシダーゼである請求項 24に記載の方法。

3 1. α—マンノシダーゼが α—マンノシダーゼ I Iである請求項 24に記載の方法。

3 2. ]31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが請求項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した )81， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIである請求項 24に記載の方法。

3 3. 糖加水分解酵素、 /31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラ一ゼ I、ひマンノシダーゼ、及び β 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Π のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項 24に記載の方法。

34. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項 24に記載の方法。 3 5. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項 2 4に記載の方法。

3 6. 以下の工程 1〜工程 3を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 1) 糖タンパク質上の糖鎖構造の全てあるいは一部が 31， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iの基質となる構造を有している糖タンパク質に、 UDP— G 1 c NA cとともに 31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iを作用させる；

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に —マンノシダーゼを作用させる；及び (工程 3) 上記（工程 2) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NAc とともに i31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Πを作用させる。

3 7. 工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する請求項 3 6 に記載の方法。 '

3 8. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラ一ゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 3 7に記載の方法。

3 9. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項 3 7に記載の方法。

40. α—マンノシダ一ゼがひ一マンノシダーゼ I Iである請求項 3 6に記載の方法。

4 1. 1, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ. IIが請求項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合夕ンパク質もしくはプロテア一ゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した /31, 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIである請求項 3 6に記載の方法。

4 2. β 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I、マンノシダ一ゼ、及び 31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項 3 6に記載の方法。

43. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項 3 6に記載の方法。

44. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項 3 6に記載の方法。

4 5. 以下の工程 1〜工程 3を含む糖夕ンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c NAc とともに 2_N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程' 2) で得られた糖タンパク質に UD P— G 1 c N A c とともに j81, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIを作用させる。

46. 工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項 45に記載の方法。

47. 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 45に記載の方法。

48. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項 46に記載の方法。

49. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、 N-ァセチルダルコサミニダ —ゼ、フコシダ一ゼ、シァリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 45に記載の方法。

50. j61, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ IIが請求項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテア一ゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した^ 1， 2_N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ IIである請求項 45に記載の方法。

5 1. 糖加水分解酵素、 i31， 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ I、及び 31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ II のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項 45に記載の方法。

52. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項 45に記載の方法。 5 3. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項 4 5に記載の方法。

54. 以下の工程 1〜工程 2を含む糖タンパク質上の混成型糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法： (工程 1 )混成型糖夕ンパク質の混成型糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。 (工程 2 ) 上記（工程 1 ) で得られた糖タンパク質に U D P— G 1 c N A c とともに 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I Iを作用させる。

5 5 . 工程 2の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項 5 4に記載の方法。

5 6 . 糖転移酵素が、シァリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 5 5に記載の方法。

5 7 . 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項 5 5に記載の方法。

5 8 . 糖加水分解酵素が、マンノシダ一ゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、及び β 1 , 4—Ν—ァセチルダルコサミニダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 5 4に記載の方法。

5 9 . β 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I Iが請求項 1〜 7のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去した /3 1， 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ Πである請求項 5 4に記載の方法。

6 0 . 糖加水分解酵素、及び^ 1 , 2— Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフエラーゼ I I のうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項

5 4に記載の方法。

6 1 . 糖タンパク質が天然由来のものである請求項 5 4に記載の方法。

6 2 . 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項 5 に記載の方法。

6 3 . 以下の工程 1〜工程 3を含む糖タンパク質上の高マンノース型糖鎖を混成型糖鎖に変換する方法であって、使用する糖加水分解酵素、 β ί , 2 一 Ν—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I、及び β 1 , 4—ガラクトシルトランスフェラーゼのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である方法：

(工程 1 )糖タンパク質の高マンノース型糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。

(工程 2) 上記（工程 1) で得られた糖タンパク質に U D P— G 1 c NAc とともに j31, 2— N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ Iを作用させる；

(工程 3) 上記（工程 2) で得られた糖タンパク質に UDP— G a 1 とともに j31, 4—ガラクトシルトランスフェラーゼを作用させる。

64. 工程 3の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する請求項 6 3 に記載の方法。

6 5. 糖転移酵素が、シァリル卜ランスフェラーゼ、フコシルトランスフエラーゼ、ガラクトシルトランスフェラ一ゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、及び N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 64 に記載の方法。

6 6. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項 64に記載の方法。

6 7. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、及び —マンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項 63に記載の方法。

6 8. 0!—マンノシダーゼが α 1 , 2—マンノシダ一ゼである請求項 6 3 に記載の方法。

6 9. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項 6 3に記載の方法。 7 0. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項 6 3に記載の方法。