WO2002065160A2

WO2002065160A2 - Dispositif d'observation d'echantillons par fluorescence, notamment de facon sequentielle

Info

Publication number: WO2002065160A2
Application number: PCT/FR2002/000435
Authority: WO
Inventors: Philippe Peltie; Dominique Derou-Madeline; Raymond Campagnolo
Original assignee: Commissariat A L'energie Atomique
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2002-08-22
Also published as: US20040113095A1; JP2004530111A; FR2820828A1; EP1358512A2; WO2002065160A3; FR2820828B1

Abstract

Pour observer au moins un échantillon (2), tel qu'un échantillon biologique, disposé sur un support (6), le dispositif comprend au moins une source de lumière (42) pour éclairer l'échantillon, des moyens (48) de réflexion de cette lumière vers l'échantillon, un objectif catadioptrique (38) pour observer l'échantillon, cet objectif formant une image de l'échantillon, et des moyens (52) d'acquisition de cette image. Les moyens de réflexion sont disposés entre l'objectif et le support.

Description

DISPOSITIF D'OBSERVATION D'ECHANTILLONS PAR FLUORESCENCE, NOTAMMENT DE FAÇON SÉQUENTIELLE

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne un dispositif d'observation d'échantillons par fluorescence, notamment de façon séquentielle.

Elle s'applique en particulier à l'analyse de la fluorescence d'échantillons biologiques qui sont déposés sur un support, selon des motifs régulièrement espacés les uns des autres.

Ce support est par exemple une plaque de micro-titration (« microtiter plate ») au fond des puits (« wells ») de laquelle sont déposés les échantillons biologiques.

Une application particulièrement importante de l'invention concerne l'analyse cellulaire à haut débit où des cellules marquées par un fluorophore sont déposées au fond des puits d'une plaque de icro- titration comportant par exemple 96 ou 384 puits.

On forme alors les images des cellules en observant les puits les uns après les autres. On mémorise ces images puis on les traite séquentiellement.

L'invention a notamment pour but d'analyser ce genre de plaque à grande cadence, le temps d'analyse de chaque puits étant de l'ordre de 1 seconde à 2 secondes, et permet ainsi de compléter l'instrumentation cellulaire qui utilise beaucoup les cytomètres . Toutefois, ces derniers sont limités à l'analyse de cellules en suspension dans un fluide et ne permettent souvent qu'une faible cadence de lecture.

Une autre application de l'invention consiste à former des images de biopuces (« biochips ») de faible complexité à partir de la fluorescence de ces biopuces, chacune de celles-ci étant logée au fond d'un puits d'une plaque de micro-titration comportant par exemple 96 puits. II est alors intéressant d'utiliser une grande quantité (plusieurs dizaines) de biopuces du genre MICAM (marque déposée) , comportant 128 électrodes, et de corréler les résultats obtenus pour ces puces, par exemple lorsqu'on étudie l'expression de gène_ts .

La plaque supportant les biopuces peut être pourvue de divers dispositifs, par exemple de moyens de circulation de fluides ou de moyens de surveillance (« monitoring ») de températures.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE

On connaît déjà un dispositif d'observation séquentielle d'échantillons. Il s'agit d'un microscope à épi- illumination et fluorescence, muni d'une caméra.

Ce microscope comporte une platine motorisée permettant de déplacer une plaque de micro- titration pour en illuminer successivement les puits et acquérir ainsi successivement les images relatives à- ces puits.

On utilise fréquemment un microscope inversé pour former l'image du fond de chaque puits. Ce dispositif connu est commercialement disponible auprès de la société Cellomics, Inc.

La plupart du temps, il utilise une source de lumière blanche, utilisant une lampe à mercure ou à xénon, pour l'illumination des échantillons contenus dans les puits.

Ce genre de source lumineuse possède un large spectre mais sa durée de vie n'excède pas 200 à

300 heures. Lorsqu'on dispose de marqueurs fluorescents classiques tels que la fluorescéine, les rhodamines ou les cynanines, il est préférable d'utiliser des lasers de faible puissance, de l'ordre de 10 mW à 50 mW, lasers dont la durée de vie est supérieure à 2000 heures.

La figure 1 illustre schématiquement un exemple d'un tel dispositif connu, destiné à l'observation d'échantillons 2 disposés dans les puits

4 d'une plaque de micro-titration 6 dont on voit le fond 8 ainsi que les parois 10 délimitant les puits.

Les échantillons sont excités par un rayonnement 12 issu d'un laser 14 et fournissent un rayonnement de fluorescence 16 à la suite de cette excitation. Le fond de la plaque de micro-titration est transparent à la lumière issue du laser ainsi qu'à ce rayonnement de fluorescence.

La lumière issue du laser est mise en forme grâce à une optique appropriée 18 puis filtrée grâce à un filtre approprié 20. La lumière ainsi filtrée est réfléchie, grâce à un miroir dichroïque 22, en direction de l'objectif 24 du microscope. Elle traverse cet objectif 24 qui la focalise sur l'échantillon étudié. On précise que les échantillons sont étudiés les uns à la suite des autres, la plaque de micro-titration étant pour ce faire disposée sur des moyens de déplacement appropriés, non représentés.

On voit aussi sur la figure 1 une caméra 26 qui est prévue pour capter l'image de l'échantillon étudié, grâce au rayonnement de fluorescence 16 émis par cet échantillon.

Ce rayonnement de fluorescence 16 traverse également l'objectif 24 du microscope puis le miroir dichroïque 22 (ce dernier étant apte à réfléchir le rayonnement 12 et à transmettre le rayonnement 16) et parvient à la caméra 26 après avoir traversé un autre filtre 28 prévu pour éliminer la lumière du laser susceptible de parvenir également à cette caméra. II convient de noter que l'utilisation du miroir dichroïque est rendue nécessaire, pour la séparation des rayonnements 12 et 16 (dont les longueurs d'onde respectives sont par exemple égales à 488 nm et à 520 nm) , par l'existence d'un trajet commun à ces rayonnements.

Il convient également de noter que le filtre n'est pas parfait de sorte qu'une petite quantité de lumière parasite parvient toujours à la caméra . On connaît aussi des dispositifs appelés

« fluorimètres ». Ils utilisent soit des lasers soit des lampes à large spectre que l'on filtre. Mais ces fluorimètres utilisent un photomultiplicateur pour détecter l'émission totale de fluorescence d'un puits étudié. Par conséquent, ils ne fournissent aucune image et ne peuvent donc être utilisés lorsqu'on veut en obtenir .

EXPOSÉ DE L'INVENTION

La présente invention a pour objet un dispositif d'observation d'échantillons par fluorescence, qui est rapide et plus simple que le dispositif connu, représenté sur la figure 1.

A titre d'exemple, un dispositif conforme à l'invention est susceptible de former 384 images de fluorescence en 10 minutes environ. De façon précise, la présente invention a pour objet un dispositif d'observation, par fluorescence, d'au moins un échantillon disposé sur un support, ce dispositif comprenant :

- des moyens d'éclairage de l'échantillon, ces moyens d'éclairage comprenant au moins une source de lumière,

- un objectif d'observation de l'échantillon suivant un axe d'observation, cet objectif d'observation étant prévu pour former une image de l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé,

- des moyens de déplacement relatif du support par rapport à l'objectif d'observation, pour disposer l'échantillon sur l'axe d'observation, et

- des moyens d'acquisition de l'image formée par l'objectif d'observation, ce dispositif étant caractérisé en ce que l'objectif d'observation est un objectif catadioptrique et en ce que les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens de réflexion de la lumière fournie par la source vers l'échantillon, ces moyens de réflexion étant disposés entre l'objectif d'observation et le support.

Selon un mode de réalisation préféré du dispositif objet de l'invention, l'objectif catadiotrique comprend : - un miroir parabolique prévu pour capter puis réfléchir une lumière émise par l'échantillon lorsque ce dernier reçoit la lumière émise par la source, et - un miroir auxiliaire qui est placé au foyer du miroir parabolique et prévu pour capter la lumière réfléchie par ce miroir parabolique et réfléchir cette lumière vers les moyens d'acquisition, les moyens de réflexion de la lumière fournie par la source étant disposés entre le miroir auxiliaire et le support . De préférence, les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens de mise en forme de la lumière émise par la source.

Cette source est de préférence un laser. Selon un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, les moyens d'éclairage comprennent une pluralité de sources, aptes à émettre des lumières de longueurs d'onde différentes, et des moyens d'activation de l'une quelconque de ces sources. Les moyens d'acquisition peuvent comprendre une caméra à dispositif à transfert de charges, ou caméra CCD . De préférence, le dispositif objet de l'invention comprend en outre des moyens de filtrage disposés entre l'objectif catadioptrique et les moyens d'acquisition et prévus pour ne laisser passer que la lumière émise par l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé .

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise un support apte à recevoir une pluralité d'échantillons et les moyens de déplacement relatif sont prévus pour disposer successivement ces échantillons sur l'axe d'observation, de façon à observer séquentiellement ces échantillons.

Ce support est par exemple une plaque de micro-titration comprenant une pluralité de puits dans lesquels s'ont respectivement placés les échantillons.

Dans ce cas, le dispositif peut comprendre en outre des moyens de positionnement automatique de puits sur l'axe d'observation.

Ces moyens de positionnement comprennent, par exemple, une photodiode à quatre quadrants.

Le dispositif objet de l'invention peut comprendre en outre des moyens de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition.

Dans le cas où le support est une plaque de micro-titration, le traitement comprend, de préférence, une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : " la figure 1 est une vue schématique d'un dispositif connu, permettant l'observation d'échantillons, et a déjà été décrite,

" la figure 2 est une vue en perspective schématique d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, " la figure 3 est une vue schématique de différents moyens optiques faisant partie du dispositif de la figure 2, " la figure 4 illustre schématiquement et partiellement un autre dispositif conforme à l'invention, utilisant des lasers de longueurs d'onde différentes, et

" la figure 5 est une vue schématique et partielle d'un autre dispositif conforme à l'invention, utilisant une photodiode à quatre quadrants.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS

On décrit maintenant un exemple du dispositif objet de l'invention en faisant référence aux figures 2 et 3.

Le dispositif que l'on voit sur ces figures est destiné à l'observation des échantillons 2 contenus dans les puits 4 de la plaque de micro-titration 6.

Ce dispositif comprend un microscope inversé 30 qui est équipé pour 1 ' épi-illuminâtion.

La plaque de micro-titration 6 comprend par exemple 384 puits. Cette plaque est maintenue horizontalement sur un cadre de support de plaque 32 qui est mobile par rapport au bâti 34 du microscope inversé .

Pour ce faire, on prévoit une platine 36 déplaçable en translation par rapport au bâti de microscope 34, suivant une direction horizontale x, et le cadre de support de plaque 32 forme aussi une platine mobile en translation par rapport à la platine 36, suivant une autre direction horizontale y qui est perpendiculaire à la direction x. Le dispositif des figures 2 et 3 comprend aussi une optique de microscope formant un objectif catadioptrique 38 également appelé « objectif à réflexion ». Cet objectif catadioptrique est porté par la tourelle (non représentée) que comporte le bâti 34 du microscope.

Le dispositif comprend aussi un laser d'excitation 42 prévu pour émettre un rayonnement 44 destiné à exciter l'échantillon 2 que l'on observe.

On précise que les échantillons sont étudiés les uns après les autres grâce à des déplacements appropriés du cadre de support 32 et de la platine 36 suivant les directions x et y.

A sa sortie du laser, ce rayonnement d'excitation 44 est mis en forme grâce à un ensemble optique de mise en forme 46. Il est ensuite réfléchi, par l'intermédiaire d'un miroir 48, vers le puits 4 dans lequel se trouve l'échantillon à étudier 2.

Le rayonnement d'excitation réfléchi par le miroir se propage suivant l'axe vertical Z de l'objectif catadioptrique 38, cet axe constituant l'axe optique du microscope. On précise que, grâce à des déplacements appropriés suivant les directions x et y, on a disposé le puits, dans lequel se trouve l'échantillon à étudier, sur cet axe optique Z. L'échantillon ainsi excité émet un rayonnement de fluorescence 50 qui se propage suivant l'axe Z et qui est envoyé, par l'intermédiaire de l'objectif catadioptrique 38, vers une caméra 52 que comporte le dispositif, après avoir été filtré par un filtre 54 prévu pour ne laisser passer que ce rayonnement de fluorescence 50.

A titre d'exemple, le grossissement de l'objectif catadioptrique 38 est de l'ordre de 4 à 15 et la caméra 52 est une caméra du genre CCD, refroidie par des moyens appropriés (non représentés) .

On voit sur les figures 2 et 3 la bague- allonge réductrice de champ 56 dont est munie la caméra 52 et qui se trouve sur la face d'entrée de cette caméra . Le dispositif des figures 2 et 3 comprend aussi des moyens électroniques de traitement 58 (ordinateur) destinés à traiter les images fournies par la caméra 52 et aussi à commander cette dernière ainsi que les déplacements suivant les directions x et y. L'ordinateur 58 est muni d'un moniteur vidéo 60 permettant, en particulier, d'observer les images acquises grâce à la caméra 52.

Dans l'exemple des figures 2 et 3, on utilise un seul laser mais, comme on le verra mieux par la suite, on peut utiliser plusieurs lasers si l'on utilise plusieurs marqueurs qui nécessitent plusieurs longueurs d'onde d'excitation.

De plus, dans cet exemple, on utilise des platines permettant des translations de grande précision mais on sait que de telles platines sont lentes .

Comme on le verra par la suite, pour minimiser le coût du dispositif on peut, au contraire, utiliser des platines de translation moins précises mais beaucoup plus rapides, conduisant donc à un dispositif beaucoup plus rapide, à condition d'utiliser, avec de telles platines moins précises, des moyens de positionnement automatique des puits, les uns après les autres, sur l'axe Z. En ce qui concerne la caméra 58 utilisée dans le dispositif des figures 2 et 3, on utilise par exemple une caméra comprenant 1300 x 1020 pixels dont la taille peut aller de 6,5 mm x 6,5 mm à 10 mm x 10 mm, cette caméra étant refroidie à 0°C. Pour former l'image d'un puits de 3 mm, cela correspond à une résolution meilleure que 3 μm. .

On peut donc travailler avec un grandissement de 4 x - 0,5 (0,5 correspondant à la bague-allonge réductrice de champ qui est placée devant la caméra), pour une caméra de petit format (6,5 mm), ou avec un grandissement de 15 x - 0,25 pour une caméra de grand format .

En ce qui concerne l'excitation des échantillons, l'objectif catadioptrique utilisé 38 comprend un miroir parabolique 62 et un petit miroir 64. La face réflectrice de ce miroir 64 est tournée vers le miroir 62 et le miroir 64 est disposé au foyer de ce miroir 62.

Le miroir 48 destiné à réfléchir le rayonnement émis par le laser est un petit miroir, qui a sensiblement la même taille que le miroir 64 et qui est fixé à ce miroir 64, au-dessus de ce dernier de façon à se trouver entre la plaque 6 et le miroir 64.

Le rayonnement émis par le laser 42 suivant une direction horizontale est réfléchi par le miroir 48, suivant l'axe optique Z, vers l'échantillon étudié.

Cet échantillon est alors excité et émet le rayonnement de fluorescence 50.

Ce rayonnement de fluorescence est capté par le miroir 62 et réfléchi vers le miroir 64 qui réfléchit à son tour ce rayonnement, suivant l'axe optique Z, vers la caméra 52, à travers le filtre 54.

On précise que le miroir parabolique 62, dont l'axe est l'axe Z, est -pourvu d'un trou central 66 qui est traversé par cet axe optique Z et permet le passage du rayonnement de fluorescence 50 réfléchi par le miroir 64.

Une caractéristique importante du dispositif des figures 2 et 3 réside donc dans le fait que le faisceau lumineux émis par le laser se trouve à l'extérieur du trajet optique dans le microscope. Ce faisceau laser ne traverse pas l'objectif catadioptrique .

On ne mélange donc pas le faisceau émis par le laser avec le rayonnement de fluorescence. De ce fait, on obtient un dispositif plus simple que celui qui est représenté sur la figure 1. Le dispositif des figures 2 et 3 nécessite seulement un filtre destiné à éliminer la lumière parasite susceptible d'être mélangée à la lumière de fluorescence . De plus, la mise en forme du faisceau émis par le laser, ou faisceau d'excitation, est plus simple que dans le dispositif de la figure 1 puisqu'il n'est pas focalisé par l'objectif du microscope.

En outre, du fait que le faisceau laser est placé à l'extérieur du trajet optique dans le microscope, on n'a pas besoin de miroir dichroïque pour séparer le faisceau laser d'excitation du faisceau fluorescent émis par l'échantillon étudié. Un seul filtre d'arrêt (coupant la longueur d'onde excitatrice) est suffisant .

L'ensemble optique 46 de mise en forme du faisceau 44 émis par le laser comprend deux optiques successives 68 et 70, prévues pour agrandir au moins trois fois le faisceau émis par le laser, de façon à couvrir chaque puits étudié.

A titre d'exemple, le faisceau émis par le laser a un diamètre de l'ordre de 0,8 mm et une divergence de l'ordre de 1 mrad. A la sortie de l'ensemble de mise en forme 46, ce faisceau laser 44, agrandi environ trois fois par cet ensemble 46, a un diamètre de l'ordre de 2,5 mm.

A titre purement indicatif et nullement limitatif, on utilise un objectif catadioptrique 15 x - ouverture 0,3 à 0,5, du genre de ceux qui sont commercialisés par la société Cohérent. De plus, a titre purement indicatif et nullement limitatif, on utilise une caméra CCD refroidie, du genre de celles qui sont commercialisées par la société Soft Imaging System. Dans le domaine de l'analyse cellulaire, on tend de plus en plus à utiliser plusieurs marqueurs (généralement deux ou trois) de couleurs différentes. On associe par exemple une fluorescéine (longueur d'onde d'excitation : 488 μm - longueur d'onde d'émission : 520 μm) et une rhodamine (longueur d'onde d'excitation : 550 μm - longueur d'onde d'émission : 580 μm) ou bien le couple cy₃/cy₅ (cy₃ : 540/570 μm - cy₅ : 630/670 μm) .

Dans un dispositif conforme à l'invention, il est facile de mélanger deux ou trois faisceaux laser distincts et d'utiliser un filtre multibande, qui existe en deux ou trois couleurs, ainsi que deux ou trois obturateurs (« shutters ») commutés automatiquement par logiciel et permettant d'activer successivement les lasers émettant les faisceaux, et de faire l'acquisition de deux ou trois images superposées, de couleurs distinctes (voire plus si l'on utilise un plus grand nombre de lasers) , et ceci pour chaque puits . Ceci est schématiquement illustré par la figure 4 où l'on voit, de façon schématique et partielle, un dispositif conforme à l'invention comprenant trois lasers 72, 74 et 76 prévus pour émettre des rayonnements d'excitation d'échantillons ayant des longueurs d'onde différentes (par exemple 488 μm, 532 μm et 550 μm) . Chacun de ces lasers 72, 74 ou 76 est successivement suivi par un ensemble optique 78, 80 ou 82 de mise en forme du faisceau fourni par ce laser, un obturateur 84, 86 ou 88 (chaque obturateur étant commandé par l'ordinateur 58) et un miroir 90, 92 ou 94. Ces miroirs sont prévus pour obtenir, en fonction de l'obturateur qui est actionné, un faisceau laser dirigé suivant un axe Y perpendiculaire à l'axe optique Z et rencontrant le miroir 48. Plus précisément, le miroir 94 associé au laser 76 est un miroir à 45°, simplement prévu pour réfléchir le faisceau correspondant à ce laser suivant un axe X parallèle à l'axe optique Z.

Le miroir 92 associé au laser 74 est disposé au-dessus du miroir 94 et prévu pour transmettre le faisceau réfléchi par ce miroir 94 et réfléchir le faisceau correspondant au laser 74 suivant cet axe X.

Le miroir 90 associé au laser 72 est prévu pour transmettre le faisceau émis par ce laser suivant l'axe Y et réfléchir la lumière provenant du miroir 92 pour que le rayonnement ainsi réfléchi se propage suivant cet axe Y (avant de se réfléchir sur le miroir 48) . Dans le cas du dispositif de la figure 4, on peut alors prévoir une mémoire-tampon dans l'ordinateur 58 associé à la caméra 52 pour y transférer une image d'une couleur pendant que l'on fait l'acquisition d'une image d'une autre couleur. Typiquement, l'acquisition est réalisée en un temps compris entre 200 ms et 500 ms . Le transfert est, quant à lui, effectué en moins de 500 ms .

Comme on l'a vu plus haut, dans un dispositif conforme à l'invention, on peut utiliser des platines de translation très précises et donc lentes, la précision étant de l'ordre 0,1 μm.

Cependant, il est possible d'utiliser des platines de translation beaucoup moins précises mais beaucoup plus rapides et peu chères, la précision étant de l'ordre de 10 μm ou supérieure à cette valeur.

L'utilisation de ces platines plus rapides est possible si l'on prévoit, dans le dispositif, des moyens de reconnaissance automatique d'un puits que l'on veut étudier lorsque ce puits passe devant l'objectif 38 du microscope.

Un exemple d'un tel dispositif est schématiquement illustré par la figure 5. On y utilise des moyens de reconnaissance automatique 96 comprenant une photodiode à quatre quadrants 98.

Sur la figure 5, on voit la plaque de micro-titration 6 qui reçoit le faisceau laser d'excitation 44. Une partie de ce faisceau émerge à l'extrémité supérieure du puits étudié 4. Le faisceau laser 100 émergeant de cette extrémité supérieure a une forme sensiblement conique.

La photodiode à quatre quadrants 98 est disposée au-dessus de la plaque de micro-titration 6 de façon que l'axe optique Z du microscope constitue l'axe de cette photodiode à quatre quadrants 98, cette dernière interceptant ainsi le faisceau émergent 100. Les quatre sorties électriques de cette photodiode à quatre quadrants sont bien équilibrées si le spot résultant du faisceau émergent 100 est circulaire . Or, lorsque le puits est bien positionné par rapport à l'axe optique Z, ce spot est circulaire. On dispose donc d'une consigne pour immobiliser les platines de translation à la position voulue : si le spot laser est symétrique les intensités des courants Iχ, I₂, I₃ et I fournis par la diode à quatre quadrants sont égales.

De plus, la somme I de ces quatre courants sortant de la photodiode représente l'intensité lumineuse contenue dans ce spot laser. On peut utiliser la somme de ces quatre courants soit pour réguler le laser qui émet le faisceau 44 soit comme information du bon fonctionnement de ce laser soit aussi pour la sécurité laser. Par exemple, on peut prévoir des moyens permettant d'empêcher d'enlever le couvercle de protection du dispositif lorsque le laser est en fonctionnement .

On considère maintenant le traitement des images.

On considère d'abord un procédé d'application du traitement d'images.

Ce traitement d'images peut être appliqué en temps réel ou en temps différé. Dans le cas où ce traitement est appliqué en temps réel, le dispositif d'analyse cellulaire enchaîne successivement les tâches suivantes pour chacun des N puits de la plaque de micro-titration : (1) déplacement sur^' le puits n (l≤n≤N) de la plaque de micro-titration, (2) acquisition de l'image de ce puits n, (3) traitement de l'image de ce puits n.

Dans le cas du traitement en temps différé, seules les opérations (1) et (2) sont réalisées et ce, successivement pour tous les puits. Une fois que l'on a acquis toutes les images pour la plaque de micro- titration considérée, le traitement d'images est effectué pour chacun des puits.

On considère maintenant la nature du traitement d'images. Le dispositif objet de l'invention permet l'analyse cytométrique de cellules de divers types par exemple les neurones, les kératinocytes , les fibroblastes et les cellules tumorales. Le traitement d'images a pour but d'analyser les cellules présentes dans les échantillons et d'en extraire des paramètres intéressants .

En fonction de l'application, le traitement d'images peut être plus ou moins spécifique. Dans tous les cas, ce traitement d'images comprend une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.

La segmentation de l'image permet d'identifier et de séparer les cellules du fond. Dans cette étape, on utilise avantageusement l'histogramme des niveaux de gris, pour déterminer le seuil de binarisation, et des algorithmes de morphologie mathématique. A ce sujet, on consultera les documents suivants :

[1] Digital image processing, Pratt William K, éd. Wiley, New York, 1978

[2] Rapport segmentation, GDR134 Traitement du signal et des images, CNRS-GRECO, décembre 1991

[3] Image analysis and mathematical morphology, J. Serra, Académie Press, Londres, 1982.

A titre purement indicatif et nullement limitatif, on peut utiliser un logiciel du genre de celui qui est commercialisé par la Société Soft Imaging

Systems sous le nom Analysis ou encore le logiciel qui est commercialisé par la Société Khoral Research sous le nom Khoros Pro . Les paramètres calculés pour chaque puits sont par exemple des paramètres de taille et de forme des cellules, le niveau maximal de fluorescence pour chaque cellule et le nombre de cellules. Dans cette étape, il est avantageux de faire appel à des algorithmes d'analyse de connexité . A ce sujet, on consultera les documents [1] et [3] susmentionnés.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif d'observation, par fluorescence, d'au moins un échantillon (2) disposé sur un support (6) , ce dispositif comprenant : - des moyens d'éclairage de l'échantillon, ces moyens d'éclairage comprenant au moins une source de lumière (42 ; 72, 74, 76),

- un objectif (38) d'observation de l'échantillon suivant un axe d'observation (Z) , cet objectif d'observation étant prévu pour former une image de l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé,

- des moyens (32, 36) de déplacement relatif du support

(6) par rapport à l'objectif d'observation (38), pour disposer l'échantillon sur l'axe d'observation, et — des moyens (52) d'acquisition de l'image formée par l'objectif d'observation, ce dispositif étant caractérisé en ce que l'objectif d'observation est un objectif catadioptrique (38) et en ce que les moyens (48) d'éclairage comprennent en outre des moyens (48) de réflexion de la lumière fournie par la source vers l'échantillon, ces moyens de réflexion étant disposés entre l'objectif d'observation (38) et le support (6) .

2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'objectif catadioptrique (38) comprend :

- un miroir parabolique (62) prévu pour capter puis réfléchir une lumière émise par l'échantillon lorsque ce dernier reçoit la lumière émise par la source (42) , et - un miroir auxiliaire (64) qui est placé au foyer du miroir parabolique et prévu pour capter la lumière réfléchie par ce miroir parabolique et réfléchir cette lumière vers les moyens d'acquisition (52), les moyens (48) de réflexion de la lumière fournie par la source étant disposés entre le miroir auxiliaire (64) et le support (48) .

3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans lequel les moyens d'éclairage comprennent en outre des moyens (46) de mise en forme de la lumière émise par la source.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans _t lequel la source de lumière est un laser (42 ; 72, 74, 76) .

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les moyens d'éclairage comprennent une pluralité de sources (72, 74, 76) aptes à émettre des lumières de longueurs d'onde différentes, et des moyens (84, 86, 88) d'activation de l'une quelconque de ces sources.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les moyens d'acquisition comprennent une caméra (52) à dispositif à transfert de charges.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre des moyens de filtrage (54) disposés entre l'objectif catadioptrique (38) et les moyens d'acquisition (52) et prévus pour ne laisser passer que la lumière émise par l'échantillon lorsque celui-ci est éclairé.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le support (6) est apte à recevoir une pluralité d'échantillons (2) et les moyens de déplacement relatif (32, 36) sont prévus pour disposer successivement ces échantillons sur l'axe d'observation (Z) , de façon à observer séquentiellement ces échantillons.

9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le support est une plaque de micro- titration (6) comprenant une pluralité de puits (4) dans lesquels sont respectivement placés les échantillons (2) .

10. Dispositif selon la revendication 9, comprenant en outre des moyens (96) de positionnement automatique de puits sur l'axe d'observation.

11. Dispositif selon la revendication 10, dans lequel les moyens de positionnement automatique comprennent une photodiode à quatre quadrants (98) .

12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre des moyens

(58) de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition (52) .

13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, comprenant en outre des moyens

(58) de traitement de chaque image acquise par les moyens d'acquisition (52), ce traitement comprenant une étape de segmentation d'image et une étape de calcul de paramètres pour chaque puits.