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WO2002064158A2 - Verwendung eines konjugats aus il-6 und seinem rezeptor zur induktion der zellulären expression von scf und flt-3l - Google Patents

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stem
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Stefan Rose-John
Malte Peters
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Stefan Rose-John
Wobus Anna M
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    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells

Definitions

  • IL-6 interleukin-6
  • SCF stem cell factor
  • FI.-3L flat-3 ligand
  • the present invention relates to the use of a conjugate of (IL-6) and its receptor for inducing the cellular expression of SCF and FI.-3L.
  • This use is preferably used in the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, in particular those of the hematopoietic system , used.
  • stem or progenitor cells especially those of the hematopoietic system
  • the regeneration or replacement of tissues and organs is of great importance.
  • B. hematopoietic stem or progenitor cells can be stimulated differently according to the stage of their differentiation, which leads to functional changes in the hematopoietic system during development.
  • Hematopoietic stem or progenitor cells from different organ compartments show considerable differences in their capacity for proliferation and self-renewal. The ability for proliferation and self-renewal can be found e.g.
  • the present invention addresses the technical problem of overcoming these disadvantages of the methods used in the prior art, i.e. To provide means that allow simple and efficient ex vivo expansion of stem or progenitor cells.
  • stem or progenitor cells in particular those of the hematopoietic system, can be expanded easily and efficiently, when a conjugate of IL-6 and its receptor, in particular an IL-6 / slL-6R fusion protein, is added to the culture medium.
  • IL-6 is a pleiotropic cytokine that interacts with a wide range of target cells.
  • IL-6 is primarily a mediator of cell growth and differentiation, e.g. that of the hematopoietic system.
  • IL-6 acts on the target cells via a receptor complex consisting of a specific IL-6 binding protein (IL-6R) and a signal-transmitting molecule (gp 130).
  • IL-6R IL-6 binding protein
  • gp 130 signal-transmitting molecule
  • the IL-6 / IL-6R complex induces the homodimerization of two gp 130 molecules, which in turn initiates intracellular signaling.
  • Soluble forms of IL-6R (slL-6R) are found in different areas of the body and are increased in patients with various chronic diseases associated with inflammation and haematological diseases.
  • the IL-6 / slL-6R fusion protein (Hyper-IL-6) is a fusion polypeptide that is a human slL-6R polypeptide, i.e. comprises the extracellular or soluble subunit of an IL-6 receptor, and a human IL-6 peptide, the two polypeptides being linked to one another via a polypeptide linker.
  • the structure of "Hyper-IL-6" and its amino acid sequence are described in DE 196 08 813 C2.
  • Hyper-IL-6 also led to induction of cellular expression of SCF and FI.-3L on murine NIH / 3T3 fibroblasts and human prepuce fibroblasts.
  • human fibroblasts (HTB 158) were stimulated with Hyper-IL-6 and then co-cultivated with umbilical cord blood CD34 + cells, a significant upregulation of the colony growth of the umbilical cord blood CD34 + cells was observed.
  • the present invention thus relates to the use of a conjugate of IL-6 and its receptor, in particular an IL-6 / slL-6R fusion protein (Hyper-IL-6) for inducing the cellular expression of SCF and FI.-3L
  • conjugate of IL-6 and its receptor includes any conjugate in which IL-6 and its receptor or parts thereof can be covalently linked to one another.
  • the conjugate can be one in which IL-6 and its receptor or parts thereof are linked to one another via a linker, such as a disulfide bridge, a peptide or a chemical agent.
  • the conjugate is preferably a fusion protein, in particular an IL-6 / slL-6R fusion protein (Hyper-IL-6), as described in DE 196 08 813 C2 or a fusion protein that is different from the fusion protein described in DE 196 08 813 C2 distinguishes that it has deletions, additions and / or substitutions of one or more amino acids and / or (a) modified amino acid (s) in the IL-6, slL-6R and / or linker portion, the biological activity not is significantly influenced. Whether such a fusion protein still has the desired biological properties can be determined using conventional methods, e.g. by means of the methods described in the examples below.
  • the cells may be expedient to bring the cells into contact with the conjugate by culturing them in a medium containing the conjugate or by transforming them with a vector which leads to intracellular expression of the conjugate and subsequent secretion.
  • suitable transformation systems and vectors e.g. for gene therapy, and in this connection reference is also made to DE 196 08 813 C2 (see also Examples 1 to 4 below).
  • the person skilled in the art is able to decide which procedure is most advantageous in the respective case.
  • the person skilled in the art is also familiar with suitable cultivation methods and media in order to be able to cultivate mammalian cells, for example hematopoietic stem or precursor cells; see, for example, DE 19608 813 C2, EP-B1 0695351 or Examples 1, 5 and 6 below.
  • the person skilled in the art can also determine the optimum concentration of the conjugate for the desired purpose using simple experiments; see for example DE 196 08 813 C2.
  • the basic medium, which contains the conjugate, among others can be any medium which is usually used for the cultivation of mammalian cells.
  • the basic medium in which the conjugate is contained is DMEM (Life Technologies, Düsseldorf, Germany).
  • the desired cells are in the above medium under suitable conditions, optionally with (partial) renewal of the medium in suitable Intervals, bred.
  • suitable conditions for example with regard to suitable containers, temperature, relative air humidity, 0 2 content and CO 2 content of the gas phase, are known to the person skilled in the art.
  • the cells are cultured in the above medium under the following conditions: (a) 37 ° C, (b) 100% rel. Humidity and (c) 5% C0 2 .
  • the conjugate as an additive to a medium is prepared in accordance with customary methods, the conjugate preferably being produced recombinantly as described in Example 2 of DE 196 08 813 C2 using the DNA sequence described in Example 1 of DE 196 08 813 C2.
  • the DNA sequence coding for the conjugate is inserted into a suitable vector, preferably expression vector, under the control of a suitable promoter, suitable promoters are known to the expert.
  • a suitable vector preferably expression vector, under the control of a suitable promoter
  • suitable promoters are known to the expert.
  • the vector containing the DNA sequences can be transfected in various ways: a) Lipid or liposome-packed DNA or RNA, e.g. generally described by Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Be.
  • a bacterium as a transport vehicle for the expression vector.
  • Suitable bacteria are e.g. (attenuated) listeria [e.g. Listeria monocytogenes], Salmonella strains [e.g. Salmonella spp.]. In general, this technique is described by Medina et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999), 693-699, and Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28: 1807-1814 (1998).
  • the vector is preferably a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or an AAV virus.
  • Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV as well as fowlpox virus, canarypox virus, influenza virus or Sindbis virus.
  • a preferred use relates to the use of a conjugate for the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, in particular those of the hematopoietic system.
  • the cells are grown or kept as described above or in Examples 1, 5 and 6 below, preferably using a medium containing the conjugate.
  • suitable stem or progenitor cells are those of the mesenchymal or hematopoietic system, with stem or progenitor cells of the latter, such as CD34 + cells, being particularly preferred.
  • the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, in particular of CD34 + cells, is preferably carried out by co-cultivation with feeder cells as cell turf, in particular human fibroblasts, preferably HTB-158 fibroblasts, which had previously been treated with the conjugate, for example as in the Examples 1, 5 and 6 below.
  • Another preferred use relates to the in vivo use of a conjugate for the treatment of diseases which are associated with a reduced expression of SCF and Ftl-3L or in which an increase in the expression or concentration of SCF and F.I-3L is desirable.
  • diseases which are associated with a reduced expression of SCF and Ftl-3L or in which an increase in the expression or concentration of SCF and F.I-3L is desirable.
  • diseases are tumor or degenerative diseases.
  • the conjugate is preferably used as a component of a medium in a concentration of 5 to 100 ng / ml.
  • FIG. 1 Cellular SCF expression in the liver of mice transgenic with respect to IL-6 and IL-6 / slL-6R. Immunohistochemical analysis of SCF expression in the liver from 4 (A), 8 (B) and 16 (C) weeks old, double-transgenic mice for IL-6 / slL-6R, a 16-week-old mouse (D) which was individually transgenic for IL-6, a 16-week-old mouse (E) which was individually transgenic for slL-6R and a non-transgenic mouse Mouse as a control (F). The bars correspond to 100 ⁇ .
  • FIG. 2 SCF-mRNA expression in the liver of transgenic mice and control mice.
  • Total RNA from the liver was prepared and a Northem blot analysis was carried out with it.
  • Lanes 1-7 show the mRNA of 4 to 16 week old mice transgenic for IL-6 / slL-6R
  • lanes 8-13 show the mRNA of individually transgenic mice for IL-6 aged 4 to 16 16 weeks and in lanes 14 and 15 the mRNA from a 4 week or 16 week old control mouse.
  • the RNA gel stained with ethidium bromide is shown for the detection of the same sample amounts for all lanes.
  • FIG. 3 Cellular SCF expression in the spleen of mice transgenic for IL-6 and IL-6 / slL-6R. Immunohistochemical analysis of the SCF expression in the spleen of 6 weeks (AC) and 16 weeks (A'-C) transgenic mice that expressed both IL-6 and slL-6R (A, A '), only slL-6R (B, B') or only IL-6 (C, C) in the liver. The bars correspond to 100 tm.
  • FIG. 4 Immunoprecipitation of the membrane-bound and soluble form of SCF-2 from the spleen of mice transgenic for IL-6 / slL-6R and single transgenic mice.
  • Splenic tissue from transgenic and non-transgenic mice (as indicated in the figure) was homogenized and immunoprecipitation using a polyclonal rabbit anti murine SCF antibody subjected.
  • the immunoprecipitates were loaded on an SDS-polyacrylamide gel and then a Western blot was carried out using the polyclonal rabbit anti-murine SCF antibody.
  • FIG. 5 Flt-3 expression in the liver of mice transgenic for IL-6 and IL-6 / slL-6R. Immunohistochemical analysis of Flt-3L expression in the spleen of 6 weeks (AC) and 16 weeks (A'- C) old transgenic mice expressing either both IL-6 and slL-6R (A, A '), only slL-6R (B, B') or only IL-6 (C, C) in the liver. The bars correspond to 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 SCF and Flt-3L expression on murine NIH / 3T3 cells and primary human prepuce fibroblasts
  • NIH / 3T3 cells AC, A'-C
  • primary human prepuce fibroblasts A "-C", A “'- C”
  • the cells were stimulated with the corresponding cytokines for 24 hours: only with medium (A-A '"), with 10 ng / ml IL-6 (BB"') or with 10 ng / ml Hyper-IL-6 (CC "
  • An analysis by immunofluorescence was then carried out and primary antibodies against SCF (AC, A "-C”) and FI.-3L (A'-C, A '"- C") were used as described in Example 1.
  • Figure 7 Expansion of human umbilical cord blood CD34 + cells by co-cultivation with human fibroblasts.
  • Human CD34 + cells obtained from umbilical cord blood were purified by means of immunomagnetic beads (Dynabeads) which were coated with an onoclonal anti-CD34 antibody.
  • A, B 10,000 cells were seeded on human HTB-158 fibroblasts which, as indicated in Example 1, with IL-6 (50 ng / ml) or Hyper-IL-6 (10 ng / ml) in 3 ml culture medium had been treated. After two weeks, the cells were counted and seeded in soft agar in the presence of SCF (100 ng / ml) IL-3, IL-6, EPO (10 U / ml) and G-CSF (200 ng / ml). ml).
  • C, D 10,000 cells were seeded in 3 ml culture medium as indicated and either treated with medium or with IL-6 (50 ng / ml) or Hyper-IL-6 (10 ng / ml). After two weeks the cells were counted and in the presence of SCF (100ng / ml), IL-3, IL-6, EPO (10th U / ml) and G-CSF (200 ng / ml) sown in soft agar (1000 cells / ml). After a further two weeks, the colonies were stained and counted.
  • mice transgenic for human slL-6R and human IL-6 is described in Peters et al., J.Exp.Med. 183 (1996), 1399 and Fattori et al., Blood 83 (1994), 2570.
  • IL-6 / SIL-6R mice hemizygous double transgenic mice
  • the expression of the slL-6R transgene is under the control of the neonatal PEPCK promoter, which is transcriptionally activated 3 days after birth and has no intra-uterine developmental effects, the IL-6 transgene is under the control of the murine metallothionein-1 - Promotors (Fattori et al., 83 (1994), 2570).
  • Anti-Gr-1 (RB6-8C5), Mac-1 (M1 / 70), B220 (RA3-6B2), CD4 (H129.19), and CD8a (53-6.7) (all of Pharmingen, San Diego, USA; these monoclonal antibodies were used as line-specific markers), goat anti-human SCF-IgG polyclonal antibody (R + D, Wiesbaden, Germany), rabbit polyclonal anti-mouse SCF- IgG (Genzyme, Cambridge, USA) and polyclonal goat anti-mouse / human-Ftl-3L-IgG (Santa Cruz, USA).
  • the following secondary antibodies were used: FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (Dianova, Hamburg, Germany) and FITC-conjugated mouse anti-goat IgG (Dianova).
  • Murine fibroblasts (NIH / 3T3) and primary prepuce fibroblasts were grown in DMEM at 5% CO 2 in a water-saturated atmosphere. All cell culture media were supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 100 mg / L streptomycin and 60 mg / L penicillin. (D. Isolation and cultivation of human CD34 + cells
  • Human CD34 + cells from umbilical cord blood were purified using immunomagnetic beads (Dynabeads) coated with a monoclonal anti-CD34 + antibody.
  • the liquid culture and assays for hematopoietic progenitor cells were carried out as described by Fischer et al. (Nature Biotech. 15 (1997), 142). For this purpose, 10,000 cells were seeded on human HTB-158 fibroblasts treated with IL-6 (50 ng / ml) or hyper-IL-6 (10 ng / ml) in a 3 ml culture as indicated in the legend to FIG. 7.
  • the cells were counted and seeded in soft agar (500 cells.) In the presence of SCF (100 ng / ml), IL-3, IL-6, EPO (10 U / ml) and G-CSF (200 ng / ml) per ml). After a further two weeks, colonies were stained and counted. In a control experiment, 10,000 cells were seeded in 3 ml cultures without fibroblasts that did not contain either cytokine, IL-6 or Hyper-IL-6. The experiment was then carried out as described above, except that 1000 cells were sown in the soft agar.
  • Immunohistochemical studies were performed using the "ABC” method. Frozen sections of murine liver and spleen from transgenic and non-transgenic animals were analyzed. Polyclonal rabbit anti-mouse SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) and polyclonal goat anti-mouse / human-Flt-3L-IgG (Santa Cruz, USA) was used as the primary antibody and this was used in a dilution of 1:50 at 4 ° C. as the secondary antibody was biotin conjugated goat -anti-rat-IgG (Dianova, Hamburg, Germany). The signal was developed with horseradish-peroxidase-coupled streptavidin and diaminobenzidine as chromogen. The sections were counter-stained with Mayer's haemalum and eosin. The sections were viewed microscopically and microphotographs were taken with taken with an Olympus "NHH" microscope.
  • Murine NIH / 3T3 cells, human HUT-158 cells and human primary prepuce fibroblasts were grown in DMEM in glass chamber carriers (LabTeks; Nunc Nalgene, Nasperville, USA) until 80% confluency was reached. The cells were stimulated with the appropriate cytokines for 24 hours. After stimulation, the cells were washed twice with PBS and fixed in 50% methanol / 50% acetone for 15 min at -20 ° C. The slides were air dried and incubated for 30 min in PBS / 5% bovine serum albumin.
  • the cells were washed at 4 ° C with the polyclonal rabbit anti-mouse SCF antibody (Genzyme, USA) at a dilution of 1:50 in PBS / 1% bovine serum albumin. incubated. A FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova, Germany) at a dilution of 1: 100 in PBS / 1% bovine serum albumin.
  • the carriers were evaluated using fluorescence microscopy.
  • the mouse SCF cDNA fragment was obtained by reverse transcription using an "RT-PCR" kit (Invitrogen, USA) of total mRNA obtained from murine NIH / 3T3 fibroblasts that were exposed to 10 ng for 24 hours / ml IL had been stimulated.
  • the following primers were used: 5'-GTC AAA ACC AAG GAG ATC TGC-3 '(sense) and 5'-AGG GAG CTG GCT GCA ACA GGG-3' (antisense).
  • the fragment obtained (577 bp) was cloned into a pBS + vector (Stratagene, la Jolla, USA) and the correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • Spleen homogenates were prepared from transgenic and non-transgenic mice.
  • the supernatants of the homogenates were pre-clarified with 100 ⁇ g Protein A-Sepharose TM (20 mg / ml; Pharmacia, USA) for 4 hours at 4 ° C.
  • the samples were then immunoprecipitated at 4 ° C for a further 4 hours using a polyclonal rabbit anti-murine SCF antibody (Genzyme, Cambridge, MA, USA) at a concentration of 2 / tg / ml.
  • Sepharose-bound SCF was obtained by centrifugation, once with TNET buffer (Tris / HCl, 10 mM , pH 7.4; Na deoxycholate, 0.4%; EDTA, 60 mM; Triton-x-100, 1%) and washed twice with PBS / 0.05% Tween, then resuspended in 2x Laemmli buffer and over SDS-PAGE separated.
  • TNET buffer Tris / HCl, 10 mM , pH 7.4; Na deoxycholate, 0.4%; EDTA, 60 mM; Triton-x-100, 16%
  • PBS / 0.05% Tween PBS / 0.05% Tween
  • the separated proteins were electrically blotted on nitrocellulose membranes and finally a western blot analysis was carried out using rabbit anti-murine polyclonal SCF antibody at a concentration of 2 yg / ml.
  • a peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova, Hamburg, Germany) was used as the secondary antibody.
  • the "enhanced chemiluminescence System” (ECL) from Amersham (Arlington Heights, USA).
  • SCF-mRNA is double transgenic in the liver for IL-6 / slL-6R
  • FIG. 1 shows that the expression of SCF in the liver of 4 to 16 week old mice for IL-6 / slL-6R double transgenic mice is increased as a function of age (FIG. 1A-C).
  • FIG. 1D shows that the expression of SCF in the liver of 16-week-old animals that were individually transgenic for IL-6 (FIG. 1D) or slL-6R (FIG. 1E) or in control animals (FIG. 1F) ,
  • SCF mRNA expression in the liver was also examined using Northem blot analysis.
  • total RNA from the liver of IL-6 / slL-6R double-transgenic mice (FIG. 2, lanes 1-7), of IL-6 single-transgenic mice (FIG. 2, lanes 8-13) or of control animals was used ( Figure 2, tracks 14 and 15) prepared at the age levels indicated in the figure. Consistent with the data obtained from immunohistochemical studies, an age-dependent increase in SCF-mRNA expression could only be detected in the IL-6 / slL-6R double-transgenic mice. In the animals that were individually transgenic for IL-6, some (basal) expression of SCF was shown in the 4 and 8 week old animals, but not in the 16 week old animals.
  • SCF was then immunoprecipitated from the spleen of transgenic and non-transgenic animals from a litter.
  • significant amounts of SCF protein can only be immunoprecipitated from the spleen of mice transgenic for IL-6 / slL-6R, but not from mice transgenic for IL-6 or slL-6R or from non-transgenic Mice of a litter.
  • a strong band at approximately 26 kD and a weaker band at approximately 20 kD appeared in immunoprecipitates from the spleen of mice transgenic for IL-6 / slL-6R. These bands most likely represent the membrane-bound and soluble forms of SCF-2 (KL-2).
  • SCF-2 Two alternatively spliced SCF transcripts encode the two membrane-bound proteins SCF-1 and SCF-2.
  • the expression of SCF-2 predominates predominantly in the spleen, due to the lack of sequences which comprise the main cleavage site in exon 6, compared to proteolytic cleavage is resistant. Due to a secondary cleavage site, presumably located in exon 7, SCF-2 is processed into soluble SCF-2, but not as efficiently as SCF-1
  • FIt-3L expression is upregulated in the liver of mice transgenic for IL-6 / slL-6R, but not in single transgenic mice
  • NIH / 3T3 cells (FIG. 6A-C, A'-C), human HTB-158 fibroblasts and primary human prepuce fibroblasts were used (Figure 6A "-C", A '"- C") 24 hours without cytokines ( Figure 6A-A "'), only with IL-6 ( Figure 6B-B '") or with the fusion protein Hyper-IL-6 (FIG. 6C-C "), in which IL-6 is covalently linked to the soluble receptor via a flexible amino acid linker.
  • the frequency of colony-forming units was also determined after a period of 14 days in order to estimate the expansion of immature progenitor cells.
  • FIG. 7B the pre-stimulation with IL-6 only led to a very slight increase in the number of colonies after 14 days.
  • pre-stimulation with Hyper-IL-6 resulted in double the colony count after 14 days compared to the control treatment.
  • the experiment was repeated in the absence of fibroblasts to demonstrate that the observed effects on colony growth were actually dependent on the presence of human fibroblasts ( Figures 7C and 7D).

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Abstract

Beschrieben wird die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und seinem Rezeptor, insbesondere eines IL-6/sIL-6R Fusionsproteins, zur Induktion der zellulären Expression von SCF und Flt-3L. Vorzugsweise wird diese Verwendung bei der ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, genutzt.

Description

Verwendung eines Konjugats aus lnterleukin-6 (IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression des Stammzellfaktors (SCF) und von Flat-3-Ligand (FI.-3L)
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Konjugats aus (IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression von SCF und FI.-3L Vorzugsweise wird diese Verwendung bei der ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, genutzt.
Die Möglichkeit der ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, hat für viele Bereiche der Forschung und Medizin, z.B. der Regeneration bzw. Ersatzes von Geweben und Organen, eine große Bedeutung. Es ist bekannt, daß z. B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen entsprechend dem Stadium ihrer Differenzierung unterschiedlich stimuliert werden können, was zu funktionellen Veränderungen des hämatopoetischen Systems während der Entwicklung führt. Hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen aus verschiedenen Organkompartimenten zeigen beträchtliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Kapazität für Proliferation und Selbsterneuerung. Die Fähigkeit zur Proliferation und Selbsterneuerung findet sich z.B. in fötalen Leberzellen, Nabelschnurblutzellen und in adulten Knochenmarkzellen (in ansteigendem Ausmaß). Der funktionelle Unterschied zwischen diesen Zelltypen wird höchstwahrscheinlich durch ein entwicklungsreguliertes Expressionsmuster der Zytokin/Wachstumsfaktor-Rezeptoren repräsentiert. Allerdings war bisher die ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, in der Praxis mit einer Reihe von Schwierigkeiten verbunden. Beispielsweise mußten den zur Expansion der Zellen verwendeten Kulturmedien Faktoren, wie SCF und FI.-3L, zugegeben werden, was wegen Ihrer Verfügbarkeit oft schwierig und mit hohen Kosten verbunden war.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, diese Nachteile der im Stand der Technik angewandten Verfahren zu überwinden, d.h. Mittel bereitzustellen, die eine einfache und effiziente ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erlauben.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Überraschenderweise wurde gefunden, daß Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere solche des hämatopoetischen Systems, einfach und effizient expandiert werden können, wenn dem Kulturmedium ein Konjugat aus IL-6 und seinem Rezeptor, insbesondere ein IL-6/slL-6R Fusionsprotein, zugegeben wird.
IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit einem großen Spektrum von Zielzellen interagiert. So ist IL-6 vor allem ein Vermittler des Wachstums und der Differenzierung von Zellen, z.B. solcher des hämatopoetischen Systems. IL-6 wirkt auf die Zielzellen über einen Rezeptorkomplex, der aus einem spezifischen IL-6 bindenden Protein (IL-6R) und einem signalübertragenden Molekül (gp 130) besteht. Der IL-6/IL-6R-Komplex induziert die Homodimerisierung von zwei gp 130-Molekülen, was wiederum die intrazelluläre Signalgebung einleitet. Lösliche Formen von IL-6R (slL-6R) finden sich in verschiedenen Körperbereichen, sind in Patienten mit verschiedenen chronischen, mit Entzündungen einhergehenden Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen erhöht. Beim Menschen wird die Spaltung von IL-6R zu slL-6R als Antwort auf Akut-Phase-Proteinen und bakterielle Toxine ausgelöst. Bei dem IL-6/slL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6) handelt es sich um ein Fusionspolypeptid, das ein humanes slL-6R- Polypeptid, d.h. die extrazelluläre bzw. lösliche Untereinheit eines IL-6-Rezeptors, und ein humanes IL-6- Peptid umfaßt, wobei die beiden Polypeptide über einen Polypeptidlinker miteinander verknüpft sind. Die Struktur von "Hyper-IL-6" sowie dessen Aminosäuresequenz sind in DE 196 08 813 C2 beschrieben.
Bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten stellte sich z.B. heraus, daß durch intrazelluläre Expression eines IL-6/slL-6R Fusionsprateins (Hyper-IL-6) und nachfolgender Sezernierung bzw. durch Zusatz dieses Fusionsproteins zu einem Zuchtmedium die zelluläre Expression von SCF sowie von FI.-3L induziert werden kann. In den Experimenten konnte durch immunhistochemische Untersuchungen gezeigt werden, daß die zelluläre Expression von SCF und FI.-3L in der Leber und Milz von doppelt transgenen Mäusen (also Mäusen, die sowohl IL-6 als auch slL-6R exprimierten) induziert wurde, nicht jedoch in für IL-6 bzw. slL-6R einzeln transgenen Mäusen. Außerdem konnte gezeigt werden, daß auf murinen NIH/3T3-Fibroblasten und humanen Präputium-Fibroblasten die Stimulation mit Hyper-IL-6 ebenfalls zu einer Induktion der zellulären Expression von SCF und FI.-3L führte. Bei Stimulierung humaner Fibroblasten (HTB 158) mit Hyper-IL-6 und nachfolgender Co-Kultivierung mit Nabelschnurblut-CD34+-Zellen konnte eine signifikante Hochregulation des Koloniewachstums der Nabelschnurblut-CD34+-Zellen beobachtet werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und seinem Rezeptor, insbesondere eines IL-6/slL-6R Fusionsproteins (Hyper-IL-6) zur Induktion der zellulären Expression von SCF und FI.-3L
Der verwendete Ausdruck "Konjugat aus IL-6 und seinem Rezeptor" umfaßt jegliches Konjugat bei dem IL-6 und sein Rezeptor bzw. Teile von diesen kovalent miteinander verbunden sein können. Beispielsweise kann das Konjugat ein solches sein, bei dem IL-6 und sein Rezeptor bzw. Teile davon über einen Linker, wie eine Disulfidbrücke, ein Peptid oder ein chemisches Agens miteinander verbunden sind. Vorzugsweise ist das Konjugat ein Fusionsprotein, insbesondere ein IL-6/slL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6), wie in DE 196 08 813 C2 beschrieben oder ein Fusionsprotein, daß sich gegenüber dem in DE 196 08 813 C2 beschriebenen Fusionsprotein dadurch unterscheidet, daß es Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) im IL-6-, slL-6R-und/oder Linker-Anteil aufweist, wobei die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflußt wird. Ob ein solches Fusionsprotein noch die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweist, kann mittels üblicher Verfahren, z.B. mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung kann es zweckmäßig sein, die Zellen mit dem Konjugat dadurch in Kontakt zu bringen, daß sie in einem das Konjugat enthaltenden Medium gezüchtet werden oder mit einem Vektor transformiert worden sind, der zu einer intrazellulären Expression des Konjugats und nachfolgender Sezemierung führt. Der Fachmann kennt geeignete Transformationssysteme und Vektoren, z.B. zur Gentherapie, und in diesem Zusammenhang wird auch auf DE 196 08 813 C2 verwiesen (siehe außerdem die nachstehenden Beispiele 1 bis 4). Der Fachmann ist in der Lage zu entscheiden, welche Vorgehensweise in dem entsprechend Fall am vorteilhaftesten ist.
Der Fachmann kennt ferner geeignete Züchtungsverfahren und Medien, um Säugerzellen, z.B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen kultivieren zu können; siehe z.B. DE 19608 813 C2, EP- B1 0695351 oder die nachstehenden Beispiele 1 , 5 und 6. Der Fachmann kann auch anhand einfacher Versuche die optimale Konzentration des Konjugats für den gewünschten Zweck bestimmen; siehe z.B. DE 196 08 813 C2. Das Grundmedium, das u.a. das Konjugat enthält, kann jedes Medium sein, das üblicherweise für die Züchtung von Säugerzellen verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mediums ist das Grundmedium, in dem das Konjugat enthalten ist, DMEM (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland). Die gewünschten Zellen werden in dem vorstehenden Medium unter geeigneten Bedingungen, gegebenenfalls unter (teilweiser) Erneuerung des Mediums in geeigneten Zeitabständen, gezüchtet. Geeignete Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich geeigneter Behälter, Temperatur, relativer Luftfeuchte, 02-Gehalt und C02-Gehalt der Gasphase sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die Zellen in dem vorstehenden Medium unter den folgenden Bedingungen kultiviert: (a) 37°C, (b) 100% rel. Luftfeuchte und (c) 5% C02.
Die Herstellung des Konjugats als Zusatz zu einem Medium erfolgt gemäß üblicher Verfahren, wobei vorzugsweise das Konjugat rekombinant wie in Beispiel 2 von DE 196 08 813 C2 beschrieben unter Verwendung der in Beispiel 1 von DE 196 08 813 C2 beschriebenen DNA-Sequenz hergestellt wird.
Wird das Konjugat nicht direkt, z.B. als Zusatz zu einem Medium, verwendet, sondern erfolgt dessen Bereitstellung für die Zelle durch intrazelluläre Expression und nachfolgender Sezernierung, so ist die für das Konjugat kodierende DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor, vorzugsweise Expressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inseriert, wobei geeignete Promotoren dem Fachmann bekannt sind. Dabei kann der die DNA-Sequenzen enthaltende Vektor über verschiedene Wege transfiziert werden: a) Lipid- bzw. Liposomen-verpackte DNA oder RNA, z.B. allgemein beschrieben von Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, (1996), 15388-15393 (siehe auch Nair et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 364 ff; b) Mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor. Geeignete Bakterien sind beispielsweise (attenuierte) Listerien [z.B. Listeria monocytogenes], Salmonellen-Stämme [z.B. Salmonella spp.]. Allgemein ist diese Technik von Medina et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999), 693-699, sowie Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28 (1998), 1807-1814 beschrieben worden. Desweiteren wird auf WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews 158 (1997), 159-169 und US-A-5,830,702 verwiesen; c) Mit einem Virus als Vektor (Kim et al., J. of Immunotherapy 20(4) (1997), 276-286; d) Mittels Gene-Gun (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991), 2726-2730.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV-Virus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV sowie Fowlpox-Virus, Canarypox-Virus, Influenza-Virus oder Sindbis-Virus.
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren oder Plasmiden, die die vorstehenden DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), beschrieben sind.
Eine bevorzugte Verwendung betrifft die Verwendung eines Konjugats zur ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems. Dabei erfolgt die Züchtung bzw. Haltung der Zellen wie vorstehend bzw. in den nachstehenden Beispielen 1, 5 und 6 beschrieben, vorzugsweise unter Verwendung eines das Konjugat enthaltenden Mediums. Beispiele für geeignete Stamm- oder Vorläuferzellen sind solche des mesenchymalen oder hämatopoetischen Systems, wobei Stamm- oder Vorläuferzellen des letzteren, wie CD34+-Zellen, besonders bevorzugt sind. Die ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von CD34+-Zellen erfolgt vorzugsweise durch Co-Kultivierung mit Feederzellen als Zellrasen, insbesondere humanen Fibroblasten, vorzugsweise HTB-158 Fibroblasten, die vorher mit dem Konjugat behandelt worden waren, z.B. wie in den nachstehenden Beispielen 1, 5 und 6 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte Verwendung betrifft die in vivo Verwendung eines Konjugats zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Expression von SCF und Ftl-3L in Zusammenhang stehen oder bei denen eine Erhöhung der Expression oder Konzentration von SCF und F.I-3L wünschenswert ist. Beispiele solcher Krankheiten sind Tumor- oder degenerative Erkrankungen.
Weitere bevorzugte Verwendungen eines Konjugats sind folgende:
(a) Verwendung zur Verbesserung der Rekonstitution und Reinigung von mit Tumorzellen kontaminierten Stamm- oder Vorläuferzellen-Transplantaten, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems erfolgt, was letztlich ein effizienteres Purgen erlaubt.
(b) Verwendung zur Verbesserung der Mobilisation von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems zum peripheren Blut, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erfolgt. (c) Verwendung zur Verbesserung des Gentransfers in Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere solchen des hämatopoetischen Systems, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erfolgt.
Das Konjugat wird als Bestandteil eines Mediums vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 100 ng/ml eingesetzt.
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Zelluläre SCF-Exoression in der Leber von bezüglich IL-6 und IL-6/slL-6R transgenen Mäusen Immunhistochemische Analyse der SCF-Expression in der Leber von 4 (A), 8 (B) und 16 (C) Wochen alten, für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen, einer 16 Wochen alten, für IL-6 einzeln transgenen Maus (D), einer 16 Wochen alten, für slL-6R einzeln transgenen Maus (E) und einer nicht-transgenen Maus als Kontrolle (F). Die Balken entsprechen 100 μ .
Figur 2: SCF-mRNA-Expression in der Leber von transgenen Mäusen und Kontrollmäusen Gesamt-RNA aus der Leber wurde präpariert und mit dieser eine Northem-Blot-Analyse durchgeführt. In den Spuren 1 - 7 ist die mRNA von 4 bis 16 Wochen alten, für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen gezeigt, in den Spuren 8 - 13 die mRNA von für IL-6 einzeln transgenen Mäusen im Alter von 4 bis 16 Wochen und in den Spuren 14 und 15 die mRNA von einer 4 Wochen bzw. 16 Wochen alten Kontrollmaus. Im unteren Teil der Figur ist das mit Ethidiumbromid gefärbte RNA-Gel zum Nachweis der für alle Spuren gleichen Probenmengen gezeigt.
Figur 3: Zelluläre SCF-Expression in der Milz von für IL-6 und IL-6/slL-6R transgenen Mäusen Immunhistochemische Analyse der SCF-Expression in der Milz von 6 Wochen (A-C) und 16 Wochen (A'- C) alten transgenen Mäusen, die entweder sowohl IL-6 als auch slL-6R (A,A'), nur slL-6R (B,B') oder nur IL-6 (C,C) in der Leber exprimierten. Die Balken entsprechen 100 tm.
Figur 4: Immunpräzipitation der membrangebundenen und löslichen Form des SCF-2 aus der Milz von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen und einzeln transgenen Mäusen Milzgewebe von transgenen und nicht-transgenen Mäusen (wie in der Figur angegeben) wurde homogenisiert und einer Immunpräzipitation unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-anti- murinen-SCF-Antikörpers unterzogen. Die Immunpräzipitate wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen und danach wurde ein Western-Blot unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-anti- murinen-SCF-Antikörpers durchgeführt. Eine starke Bande bei etwa 29 kD und eine schwächere Bande bei etwa 20 kD erscheint nur in Immunpräzipitaten aus der Milz von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen. Diese Banden entsprechen höchstwahrscheinlich der membrangebundenen und löslichen Form von SCF-2 (KL-2).
Figur 5: Flt-3-Expression in der Leber von für IL-6 und IL-6/slL-6R transgenen Mäusen Immunhistochemische Analyse der Flt-3L-Expression in der Milz von 6 Wochen (A-C) und 16 Wochen (A'-C) alten transgenen Mäusen, die entweder sowohl IL-6 als auch slL-6R (A,A'), nur slL-6R (B,B') oder nur IL-6 (C,C) in der Leber exprimierten. Die Balken entsprechen 100 μm.
Figur 6: SCF- und Flt-3L-Expression auf murinen NIH/3T3-Zellen und primären humanen Präputium- Fibroblasten
NIH/3T3-Zellen (A-C, A'-C) und primäre humane Präputium-Fibroblasten (A"-C", A"'-C") wurden auf mit Gelatine beschichteten Glaskammerträgem ausgesät und in DMEM in einer wassergesättigten Atmosphäre bei 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden 24 Std. mit den entsprechenden Zytokinen stimuliert: Nur mit Medium (A-A'"), mit 10 ng/ml IL-6 (B-B"') oder mit 10 ng/ml Hyper-IL-6 (C-C"). Danach erfolgte eine Analyse über Immunfluoreszenz. Primäre Antikörper gegen SCF (A-C, A"-C") und FI.-3L (A'-C, A'"-C") wurden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.
Fiαur 7: Expansion humaner Nabelschnurblut-CD34+-Zellen durch Co-Kultivieruno mit humanen Fibroblasten.
Aus Nabelschnurblut erhaltene humane CD34+-Zellen wurden mittels immunmagnetischer Perlen (Dynabeads) gereinigt, die mit einem onoklonalen anti-CD34 Antikörper beschichtet waren. (A,B) 10.000 Zellen wurden auf humane HTB-158 Fibroblasten ausgesät, die, wie in Beispiel 1 angegeben, mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) in 3 ml Kulturmedium behandelt worden waren. Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml) IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (500 Zellen/ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden die Kolonien angefärbt und gezählt. (C,D) 10.000 Zellen wurden in 3 ml Kulturmedium, wie angegeben, ausgesät und entweder mit Medium behandelt oder mit IL-6 (50 ng/ml) bzw. Hyper-IL-6 (10 ng/ml). Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml), IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (1000 Zellen/ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden die Kolonien angefärbt und gezählt.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Allgemeine Verfahren
(A) Erzeugung transoener Mäuse
Die Erzeugung von für menschliches slL-6R und menschliches IL-6 transgenen Mäusen ist in Peters et al., J.Exp.Med. 183 (1996), 1399 und Fattori et al., Blood 83 (1994), 2570 beschrieben. Durch Kreuzung homozygoterslL-6R- und IL-6-Mäuse wurden hemizygote doppelt transgene Mäuse (IL-6/slL-6R-Mäuse) erhalten, die beide Transgene coexprimieren (Peters et al., J.Exp.Med. 185 (1997), 755). Die Expression des slL-6R-Transgens steht unter der Kontrolle des neonatalen PEPCK-Promotors, der 3 Tage nach der Geburt transkriptioneil aktiviert wird und keine intra-uterine Entwicklungseffekte bewirkt, das IL-6- Transgen unter der Kontrolle des murinen Metallothionein-1 -Promotors (Fattori et al., 83 (1994), 2570).
(B) Antikörper
Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Gr-1 (RB6-8C5), Mac-1 (M1/70), B220 (RA3-6B2), CD4 (H129.19), und CD8a (53-6.7) (alle von Pharmingen, San Diego, USA; diese monoklonalen Antikörper wurden als Linien-spezifische Marker verwendet), polyklonaler Ziegen-anti-humanes-SCF-lgG-Antikörper (R+D, Wiesbaden, Deutschland), polyklonales Kaninchen-anti-Maus-SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) und polyklonales Ziegen-anti-Maus/humanes-Ftl-3L-lgG (Santa Cruz, USA). Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet: FITC-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) und FITC-konjugiertes Maus-anti-Ziegen-IgG (Dianova).
(C Zellkultur
Murine Fibroblasten (NIH/3T3) und primäre Präputium-Fibroblasten wurden in DMEM bei 5% C02 in einer wassergesättigten Atmosphäre gezüchtet. Alle Zellkulturmedien waren mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 mg/L Streptomycin und 60 mg/L Penicillin supplementiert. (D. Isolierung und Kultivierung humaner CD34+-Zellen
Humane CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut wurden mittels immunmagnetischer, mit einem monoklonalen anti-CD34+-Antikörper beschichteten Perlen (Dynabeads) gereinigt. Die Flüssigkultur und Assays für hämatopoetische Vorläuferzellen wurden wie von Fischer et al. (Nature Biotech. 15 (1997), 142) beschrieben durchgeführt. Dazu wurden 10.000 Zellen auf mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) behandelten humanen HTB-158-Fibroblasten in eine 3 ml-Kultur wie in der Legende zu Figur 7 angegeben ausgesät. Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml), IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (500 Zellen pro ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden Kolonien angefärbt und gezählt. In einem Kontrollexperiment wurden 10.000 Zellen in 3 ml-Kulturen ohne Fibroblasten ausgesät, die entweder kein Zytokin, IL-6 oder Hyper-IL-6 enthielten. Danach wurde das Experiment wie vorstehend beschrieben durchgeführt außer, daß 1000 Zellen in den Weichagar ausgesät wurden.
(E) Immunhistochemische Untersuchungen und Immunfluoreszenz
Immunhistochemische Untersuchungen wurden mittels des "ABC'-Verfahrens durchgeführt. Es wurden Gefrierschnitte von muriner Leber und Milz aus transgenen und nicht-transgenen Tieren analysiert. Polyklonales Kaninchen-anti-Maus-SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) und polyklonales Ziegen-anti- Maus/humanes-Flt-3L-lgG (Santa Cruz, USA) wurde als primäre Antikörper verwendet und diese wurden in einer Verdünnung von 1:50 bei 4°C ü.N. verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde Biotin- konjugieήes Ziegen-anti-Ratte-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) verwendet. Das Signal wurde mit Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin und Diaminobenzidin als Chromogen entwickelt. Die Schnitte wurden mit Mayer's Hämalaun und Eosin gegengefärbt. Die Schnitte wurden mikroskopisch betrachtet und Mikrophotographien wurden mit einem Olympus "NHH"-Mikroskop aufgenommen.
Murine NIH/3T3-Zellen, humane HUT-158-Zellen und humane primäre Präputium-Fibroblasten wurden in DMEM in Glaskammerträgern (LabTeks; Nunc Nalgene, Nasperville, USA) bis zum Erreichen von 80% Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden 24 Stunden mit den entsprechenden Zytokinen stimuliert. Nach der Stimulation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 50% Methanol/50% Aceton 15 Min. bei -20°C fixiert. Die Träger wurden luftgetrocknet und 30 Min. in PBS/5% Rinderserumalbumin inkubiert. Die Zellen wurden bei 4°C mit dem polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-SCF-Antikörper (Genzyme, USA) bei einer Verdünnung von 1:50 in PBS/1% Rinderserumalbumin ü.N. inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein FITC-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova, Deutschland) bei einer Verdünnung von 1 :100 in PBS/1% Rinderserumalbumin verwendet. Die Träger wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.
(F) Extraktion von Gesamt-mRNA aus Leber und Nachweis von SCF-mRNA über Northern-Blots Die Mäuse wurden durch cervikale Dislokation getötet und Gesamt-RNA aus der Leber wurde mittels des Phenol/Chloroform-Verfahrens isoliert (Rose-John, Carcinogenesis 9(5) (1988), 831). Pro Probe wurden 5 μg hitzedenaturierte RNA auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, das 7% Formaldehyd enthielt. Die aufgetrennte RNA wurde entsprechend den Angaben des Herstellers auf GenScreen-Plus™-Membranen (Dupont-New England Nuclear, Dreieich, Deutschland) transferiert. Die Filter wurden 2 Stunden bei 68°C in 10% Dextransulfat, 1 M NaCI, 1% SDS vorhybridisiert und in der gleichen Lösung mit cDNA- Fragmenten, die durch "random priming" mit [32P]-ATP markiert worden waren, inkubiert. Das Maus-SCF- cDNA-Fragment wurde durch reverse Transkription mittels eines "RT-PCR"-Kits (Invitrogen, USA) von Gesamt-mRNA erhalten, die aus murinen NIH/3T3-Fibroblasten erhalten worden war, die 24 Stunden mit 10 ng/ml IL stimuliert worden waren. Es wurden die folgenden Primer verwendet: 5'-GTC AAA ACC AAG GAG ATC TGC-3' (sense) und 5'-AGG GAG CTG GCT GCA ACA GGG-3' (antisense). Das erhaltene Fragment (577 bp) wurde in einen pBS+-Vektor (Stratagene, la Jolla, USA) kloniert und die Korrektheit des Konstrukts durch Sequenzierung bestätigt.
(G. Immunpräzipitation von murinem SCF aus Leber und Milz
Milzhomogenate wurden von transgenen und nicht-transgenen Mäusen präpariert. Die Überstände der Homogenate wurden mit 100μg Protein A-Sepharose™ (20 mg/ml; Pharmacia, USA) 4 Stunden bei 4°C vorgeklärt. Die Proben wurden anschließend bei 4°C für weitere 4 Stunden unter Verwendung eines polyklonaler) Kaninchen-anti-muriner-SCF-Antikörpers (Genzyme, Cambridge, MA, USA) bei einer Konzentration von 2/tg/ml immunpräzipitiert. Nach Zugabe von 100//I Protein A-Sepharose™ (20 mg/ml) und Inkubation bei 4°C für weitere 2 Stunden wurde der Sepharose-gebundene SCF durch Zentrifugation gewonnen, einmal mit TNET-Puffer (Tris/HCI, 10 mM, pH 7,4; Na-deoxycholat, 0,4 %; EDTA, 60 mM; Triton-x-100, 1 %) und zweimal mit PBS/0,05% Tween gewaschen, dann in 2x Laemmli-Puffer resuspendiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrozellulose- Membranen elektrisch geblottet und schließlich wurde eine Westem-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-anti-murinen-SCF-Antikörper bei einer Konzentration von 2 yg/ml durchgeführt. Als sekundärer Antikörper wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) verwendet. Zum Nachweis wurde das "enhanced chemiluminescence System" (ECL) von Amersham (Arlington Heights, USA) verwendet.
Beispiel 2
Die Expression von SCF-mRNA wird in der Leber von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen
Mäusen stark hochreguliert, nicht jedoch in einzeln transgenen Tieren
Die zelluläre Expression von SCF in doppelt transgenen Mäusen (IL-6/slL-6R) wurde mittels immunhistochemischen Untersuchungen der Leber von transgenen und nicht-transgenen Mäusen analysiert. Figur 1 zeigt, daß die Expression von SCF in der Leber von 4 bis 16 Wochen alten für IL- 6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen altersabhängig erhöht ist (Figur 1 A-C). Im Gegensatz dazu konnte durch dieses Verfahren in der Leber von 16 Wochen alten, für IL-6 (Figur 1D) oder slL-6R (Figur 1E) einzeln transgenen Tieren bzw. in Kontrolltieren (Figur 1 F) keine zelluläre Expression von SCF nachgewiesen werden.
Außerdem wurde die SCF-mRNA-Expression in der Leber mittels Northem-Blot-Analysen untersucht. Dazu wurde Gesamt-RNA aus der Leber von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen (Figur 2, Spuren 1-7), von für IL-6 einfach transgenen Mäusen (Figur 2, Spuren 8-13) oder von Kontrolltieren (Figur 2, Spuren 14 und 15) bei den in der Figur angegeben Altersstufen präpariert. In Übereinstimmung mit den durch immunhistochemische Untersuchungen gewonnenen Daten konnte ein altersabhängiger Anstieg der SCF-mRNA-Expression lediglich in den IL-6/slL-6R-doppelt transgenen Mäusen nachgewiesen werden. In den für IL-6 einzeln transgenen Tieren zeigte sich zwar in den 4 und 8 Wochen alten Tieren etwas (basale) Expression von SCF, nicht jedoch in den 16 Wochen alten Tieren. In einer 4 Wochen alten Kontrollmaus konnte eine schwache Bande nachgewiesen werden, in einer 16 Wochen alten Maus zeigte sich jedoch keine Expression. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Gegenwart von sowohl IL-6 als auch slL-6R, nicht jedoch von ausschließlich IL-6 zu einer erhöhten Expression von SCF- mRNA und einer erhöhten Konzentration des Proteins in der Leber führt.
Beispiel 3
Die zelluläre SCF-Expression wird in der Milz von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen hochreguliert, nicht jedoch in einzeln transgenen Mäusen
n Die zelluläre SCF-Expression in der Milz von transgenen und nicht-transgenen, 6 Wochen alten (Figur 3A-C) und 16 Wochen alten Mäusen (Figur 3A'-C) wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen analysiert. In der Milz aller analysierten Tiere mit einem Alter von 6 Wochen konnte eine basale Expression von SCF nachgewiesen werden (Figur 3A, I L-6/sl L-6R-doppelt transgen; Figur 3B, slL-6R- einfach transgen; Figur 3C, IL-6-einfach transgen). In den älteren Tieren mit einem Alter von 16 Wochen stieg die SCF-Expression in den für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen signifikant (Figur 3A'), nicht jedoch in den für slL-6R oder IL-6 einfach transgenen Mäusen (Figur 3B' bzw. 3C). Die SCF- Immunreaktivität war in Megakaryozyten mit peripherer (sub)membranärer Akzentuierung am stärksten, jedoch auch bei früheren Stadien der Granulopoese gut nachweisbar. In erythropoetischen Zellen, neutrophilen Granulozyten und reifen Lymphozyten konnte kein spezifisches Signal nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Co-Expression von IL-6 und slL-6R, nicht jedoch von lediglich IL-6, zu einer erhöhten Expression von SCF in der Milz führt.
Anschließend wurde SCF aus der Milz von transgenen und nicht-transgenen Tieren aus einem Wurf immunpräzipitiert. Wie in Figur 4 gezeigt können signifikante Mengen an SCF-Protein nur aus der Milz von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen immunpräzipitiert werden, nicht jedoch von für IL-6 oder slL-6R einfach transgenen Mäusen oder von nicht-transgenen Mäusen eines Wurfs. Eine starke Bande bei etwa 26 kD und eine schwächere Bande bei etwa 20 kD trat in Immunpräzipitaten von der Milz von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen in Erscheinung. Diese Banden repräsentieren aller Wahrscheinlichkeit nach die membrangebundenen und löslichen Formen von SCF-2 (KL-2). Zwei alternativ gespleißte SCF-Transkripte kodieren die zwei membrangebundenen Proteine SCF-1 und SCF- 2. In der Milz herrscht vorwiegend die Expression von SCF-2 vor, der aufgrund des Fehlens von Sequenzen, die die Hauptspaltstelle in Exon 6 umfassen, gegenüber proteolytischer Spaltung resistent ist. Aufgrund einer sekundären Spaltstelle, die vermutlich in Exon 7 liegt, wird SCF-2 zu löslichem SCF-2 prozessiert, allerdings nicht so effizient wie SCF-1
Beispiel 4
Die FIt-3L-Expression wird in der Leber von für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen hochreguliert, nicht jedoch in einzeln transgenen Mäusen
Es wurde die Flt-3L-Expression in der Leber von transgenen Mäusen bei einem Alter von 6 Wochen (Figur 5A-C) und 16 Wochen (Figur 5A'-C) analysiert. In 6 Wochen alten Tieren wurde eine basale Fit- 3L-Expression in für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen (Figur 5A), in für slL-6R einzeln transgenen Mäusen (Figur 5B) und in für IL-6 einzeln transgenen Mäusen (Figur 5C) beobachtet. In älteren Mäusen (Alter: 16 Wochen) war die Flt-3L-Expression nur in für IL-6/slL-6R doppelt transgenen Mäusen erhöht (Figur 5A'), nicht jedoch in für slL-6R (Figur 5B') und in für IL-6-einzeln transgenen Tieren (Figur 5C). Somit führte die Anwesenheit von IL-6 zusammen mit slL-6R, nicht jedoch von nur IL-6 zu einer Hochregulation des zellulären Flt-3L-Proteins in der Milz.
Beispiel 5 Untersuchungen zur Induktion von zellulärem SCF- und Flt-3L-Protein auf NIH/3T3-Zellen und primären humanen Präputium-Fibroblasten
Um die Auswirkungen von IL-6 und IL-6/slL-6R in vitro untersuchen zu können wurden NIH/3T3-Zellen (Figur 6A-C, A'-C), humane HTB-158-Fibroblasten und primäre humane Präputium-Fibroblasten (Figur 6A"-C", A'"-C") 24 Stunden ohne Zytokine (Figur 6A-A"'), nur mit IL-6 (Figur 6B-B'") oder mit dem Fusionsprotein Hyper-IL-6 (Figur 6C-C"), bei dem IL-6 über einen flexiblen Aminosäurerlinker mit dem löslichen Rezeptor kovalent verknüpft ist, inkubiert. In allen drei Zelltypen führte die Behandlung mit IL-6 nur zu einer sehr schwachen Hochregulation der Expression von SCF und FI.-3L (Figur 6B-B'"). Die Behandlung mit Hyper-IL-6 führte jedoch zu einer stark erhöhten Expression von SCF und FI.-3L (Figur 6C-C"). Somit führt in murinen und humanen Fibroblasten-Zellinien und humanen primären Fibroblasten die Co-Stimulation mit IL-6 und slL-6R zu einer starken Expression der hämatopoetischen Zytokine SCF und FI.-3L
Beispiel 6 Untersuchungen zur Expansion humaner Nabelschnurblut-CD34+-Zellen auf mit Hyper-IL-6 stimulierten humanen Fibroblasten
Es wurde untersucht, ob die beobachtete Hochregulation von SCF und FI.-3L als Antwort auf Hyper-IL-6 für die Expansion humaner Nabelschnurblut-Cd34+-Zellen in vitro ausreicht. In Anbetracht der Spezies- Spezifität zwischen humanen und murinen Zytokinen und ihren Rezeptoren und der Tatsache, daß sowohl humane als auch murine Fibroblasten-Zellinien SCF und FI.-3L gleichermaßen gut nach Stimulation mit IL-6 oder Hyper-IL-6 exprimierten, wurde die humane Fibroblasten-Zellinie HTB-158 für die Co-Kultivierungsexperimente verwendet. Dazu wurden HTB-158-Zellen mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) in 3 ml Kulturmedium behandelt. Im Anschluß daran wurden die Fibroblasten gemeinsam mit humanen Nabelschnurblut-CD34+-Zellen zwei Wochen kultiviert. Neben der Gesamtzellzahl (Figur 7A) wurde auch die Häufigkeit koloniebildender Einheiten nach einem Zeitraum von 14 Tagen zur Abschätzung der Expansion unreifer Vorläuferzellen bestimmt. Wie aus Figur 7B ersichtlich ist führte die Vorstimulation mit IL-6 nur zu einem sehr leichten Anstieg der Koloniezahl nach 14 Tagen. Die Vorstimulation mit Hyper-IL-6 ergab jedoch im Vergleich zu der Kontrollbehandlung nach 14 Tagen die doppelte Koloniezahl. Zum Nachweis darüber, daß die beobachteten Auswirkungen hinsichtlich des Koloniewachstums tatsächlich von der Gegenwart der humanen Fibroblasten abhängig war, wurde das Experiment in Abwesenheit von Fibroblasten wiederholt (Figur 7C und 7D). Dabei zeigte sich, daß die Stimulation von CD34+-Zellen mit IL-6 oder Hyper-IL-6 nicht zu einer Zunahme der Koloniebildung nach 14 Tagen führte (Figur 7D). Somit zeigt dieses Experiment, daß die in vitro Stimulation humaner Fibroblasten mit Hyper-IL-6 die Expansion humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen bei Co-Kultivierung steigert.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression von SCF und FI.-3L
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei der Rezeptor als slL-6R vorliegt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Konjugat ein Fusionsprotein ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Expression von SCF und FI.-3L in Zusammenhang stehen oder bei denen eine Erhöhung der Expression oder Konzentration von SCF und F.I-3L wünschenswert ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Erkrankung eine Tumor- oder degenerative Erkrankung ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 zur ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Konjugat Feederzellen als Zellrasen für die ex vivo- Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen zugegeben wird.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Feederzellen Fibroblasten sind.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Stamm- oder Vorläuferzellen solche des hämatopoetischen Systems sind.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 zur Verbesserung der Rekonstitution und Reinigung von mit Tumorzellen kontaminierten Stamm- oder Vorläuferzellen-Transplantaten.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 zur Verbesserung der Mobilisation von Stamm- oder Vorläuferzellen.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , wobei die Stamm- oder Vorläuferzellen solche des hämatopoetischen Systems sind.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 zur Verbesserung des Gentransfers in Stamm- oder Vorläuferzellen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Stamm- oder Vortäuferzllen solche des hämatopoetischen Systems sind.
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