WO2002053592A1

WO2002053592A1 - Nouveau polypeptide et son adn

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Publication number: WO2002053592A1
Application number: PCT/JP2001/011428
Authority: WO
Inventors: Satoshi Orita; Rie Hayashi; Hikaru Sonoda; Kazuhiko Maekawa
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2002-07-11
Also published as: JP3910536B2; DE60129848T2; DE60129848D1; EP1354890A4; EP1354890A1; EP1354890B1; JPWO2002053592A1; ATE369563T1; US7371818B2; US20040110921A1

Description

新規ポリぺプチドおよびその D N A 技術分野

本発明は、骨細胞の分化抑制に関与するコルジンと類似構造を有する新規ポリべプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレ才チド、該ポリヌクレオチドに対する相補的ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該べクターで形質転換された形質転換体、該ポリぺプチドを認識する抗体、該ポリぺプチドのリガンド、該ポリぺプチドを利用した物質のスクリ一二ング方法、並びに該ポリべプチドおよび該ポリヌクレオチドの癌マーカーおよび骨疾患マ一力一としての用途に関する。背景技術

骨芽細胞の働きで骨が再生する現象、即ち、骨形成は、脊椎動物の生体維持などに重要な現象である。骨形成に関与する因子としては、これまでにホルモンではエストロゲン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ P H T ) が、増殖因子では骨形成因子（BMP : Bone Mo r phog e n e t i c P r o t e i n ) が、その他薬剤では活性化ビタミン D、カルシウム製剤、ピタミン K 2などが知られている。 BMPは T G F— >Sファミリ一に属する一群の液性因子であり、 20種類近くの遺伝子が存在することが報告されている（Mo l e cu l ar Med i c i n e， 37, 634 (2000) . ) 。その中でも B M P— 2および B M P— 4に関しては、骨分化調節活性があることが多数報告されている。一方、骨関連疾患の新規治療薬として期待されている BMPは、異所性形成シグナルとしての作用を有する唯一のサイトカインである。 BMPは、実際に骨折や骨欠損時の修復反応の際起こる、いわゆる軟骨性の仮骨から新生骨に置換されることによって起こる骨形成（軟骨内骨化）に有用であると考えられている（Deve l opme n t a 1 Bi o l og y, 1 74, 448 (1 996) . , J ou r na l of Bone and Mi ne r al Re sear c h, 9 (5) ， 651 (1 994) . ) 。また、多分化能を有する間葉系幹細胞は、培養条件により脂肪細胞、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化すること（Sc i ence， 284, 1 43 (1 999) . ) , BMP- 2で間葉系幹細胞を処理することにより骨分化が誘導されること（ J o u r n a 1 of Ce l l Bi o l og y, 1 1 3, 681 (1 991 ) . ) が報告されている。従って、骨分化誘導活性を有する B M Pが、骨形成が関与する疾患である関節リウマチ、変形性関節症、あるいは骨粗鬆症に関与していることが考えられ、実際、 BMPを使用した遺伝子治療も試られている（Mo l ecu l a r Me d i c i n e, 37, 709 (2000) . ) ₀ しかし、それらの疾患における B M Pの作用機構に関しては詳細な解析がされておらず、その解明が待望されていた。

BMPは、その受容体を介して繊維芽細胞から骨芽細胞への分化が誘導されることが、アル力リンホスファ夕ーゼ活性を指標に既に見出されている（Bi o chemi cal and Bi oph ys i cal Re sea r ch Commu ni cati ons, 1 72, 295 (1 990) . )。 BMPの作用が、スぺマンス才一ガナイザ一 (こよって分泌されるタンパク質であるコルジンにより抑制されること（Natu re, 382, 595 (1 996) . ) 、また、コルジンが BM P受容体に結合するのではなく、 BM Pそのものに結合してアンタゴニス卜として作用することが見出された（Ce l l , 86, 589 (1 996) . ) 。最近、コルジンはそのァミノ末端にシグナルペプチドおよびシスティンに富む 4つの繰り返し構造（CR 1から CR4) を有しており、その特徴的な構造（モチーフ）を介して BMPと結合することが、明らかにされた（Deve l opment, 1 27, 821 (2000) . ) ₀ また、コルジンと相同性の高い分泌タンパク質としてキエリンが報告されている（ P r o c e e d i n g s of the Nat i onal Academy of Sc i ences, 97 (1 0) , 5291 -529 6 ( 2000) . ) 。現在、キエリン以外にもコルジン様タンパク質が存在する可能性が示唆されている。しかし、その実態は明らかではなく、 BM Pの作用機構を解析する上でも、新規タンパク質の発見が待望されていた。 ■

一方、癌は生体内のぼとんどの組織で発症する疾患で、これまでに癌化の標的遺伝子である癌遺伝子および癌抑制遺伝子が数多く発見され、ヒト癌化機構は特定の遺伝子レベルで多段階的に描かれている。しかしながら、発癌機構は完全に解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。また、耳下腺癌、食道癌、十二指腸癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、小腸癌、直腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌においては、その原因遺伝子はまだ同定されていない。上記の状況の下、癌の発症に関わる新規遺伝子の同定および同遺伝子を用いた癌の診断方法が待望されていた。また、癌細胞は、脱分化状態で増殖をするとをその特徴としていることから、癌細胞の分化を調節する因子および薬剤を抗癌剤として使用する試みは数多くなされている。しかし、すべての癌を制御できるものはなく、新しい分化調節活性を有する因子や薬剤の発見が待望されていた。発明の開示

本発明は、癌および骨疾患の診断に有用な新規ポリぺプチドおよびポリヌクレオチドの提供を課題とする。さらに、当該ポリペプチドおよびその阻害剤を用いた、癌および骨疾患の治療薬を提供する。

本発明者らは、骨細胞の分化抑制に関与する新規遺伝子を単離を目的として、鋭意研究を行なつた結果、コルジン様新規ポリペプチド（C 0 7 8 3 ) をコードする新規な遺伝子を見出した。更に研究を進めた結果、該遺伝子の発現が各種癌組織中で増減しているしていることを見出し、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが癌マ一カーとして有用であることを確認した。更に研究を進めて結果、該遺伝子が、幹細胞が骨に分化する際発現上昇が認められることおよび該夕ンパク質が B M Pと結合して骨分化調節因子としての活性を有することを確認し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 配列番号 2の 1位の C y sから 6 5 5位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；

( 2 ) 配列番号 2の一 3 0位の M e tから 6 5 5位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有する（1 ) に記載のポリペプチドまたはその塩；

( 3 ) 配列番号 4の 1位の C y sから 5 9 7位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；

( 4 ) 配列番号 4の一 3 0位の M e tから 5 9 7位の A「 gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩；

( 5 ) ( 1 ) から（4 ) のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加から選択される少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列からなり、癌マーカーであるかまたは BMP結合活性を有するポリべプチドまたはその塩；

(6) 癌マーカー、骨疾患マーカー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする（1 ) から（5) のいずれかに記載のポリペプチド；

(7) ( 1 ) から（6 ) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレ才チド；

(8) 配列番号 1の 91番目の Tから 2055番目の Gで表わされる塩基配列を含有する（7) 記載のポリヌクレオチド；

(9) 配列番号 1の 1番目の Aから 2055番目の Gで表わされる塩基配列を含有する（7) 記載のポリヌクレオチド；

(1 0)配列番号 3の 91番目の丁から 1 881番目の Gで表わされる塩基配列を含有する（7) 記載のポリヌクレオチド；

(1 1 ) 配列番号 3の 1番目の Aから 1 881番目の Gで表わされる塩基配列を含有する（7) 記載のポリヌクレオチド；

(1 2) (7) から（1 1 ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、癌マーカ一であるかまたは B M P結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；

(1 3) ( 7 ) から（ 1 2 ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドのに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド；

(1 4) 癌マーカー、骨疾患マーカ一、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする（7) から（1 1 ) または（1 3) のいずれかに記載のポリヌクレオチド；

(1 5) 配列番号 1 または 3に記載の塩基配列中の連続した 5から 60塩基と同一配列を有するォリゴヌクレオチド、該才リゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体ォリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド；

(1 6) (7) から（1 3) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；

(1 7) (1 6) に記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体；

(1 8) (1 7) に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された（1 ) から（5) のいずれかに記載のポリべプチドを培養培地から回収する工程、を含有する該ポリべプチドまたはその塩の製造法；

(1 9) ( 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドを特異的に認識する抗体；

(20)下記の工程を含む、（1 9)に記載の抗体を用いることを特徴とする、（1 ) から（5) のいずれかに記載のポリぺプチドの検出または定量方法、

(a) ポリべプチドと該抗体とを接触させる工程および、

( b ) ポリべプチドと該抗体との結合を検出する工程；

(21 ) (1 9) に記載の抗体を用いることを特徴とする、（1 ) から（5)のいずれかに記載のポリべプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法；

(22) (1 9) に記載の抗体を含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キッ卜；

(23)下記の工程を含む（7) から（1 3) または（1 5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、（1 ) から（5)のいずれかに記載のポリペプチドの mRN A の検出または定量方法、

(a) mRN Aと言亥ポリヌクレオチドとを接触させる工程および、

(b) mRN Aと該ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程；

(24) (23) に記載の方法を用いることを特徴とする、（ 1 ) から（5)のいずれかに記載のポリぺプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法；

(25 ) (23) に記載の方法を用いることを特徴とする、（ 1 ) から（5) に記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する方法；

( 26 ) (7 ) から.（1 3) または（1 5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、（1 ) から（5) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DN Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制する方法；

(27) (7) から（1 3) または（1 5 ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キッ卜；

(28 )下記の工程を含む、（ 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドの結合物質のスクリーニング方法、

(a) (1 )から（5)のいずれかに記載のポリペプチドと被検物質とを接触させる工程および、 ( b )該ポリぺプチドと被検物質との結合を検出する工程；

(29) (1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドを含むことを特徴とする、該ポリべプチドの結合物質のスクリ一二ング用キッ卜；

(30) (28) に記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合物質；

(31 ) BMP— 2および BMP— 4である（30) に記載の結合物質；

(32)下記の工程を含む、（30) または（31 ) のいずれかに記載の結合物質と（ 1 ) から

( 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドとの結合活性調節物質のスクリ一二ング方法、

(a)被検物質の存在下または非存在下、（1 ) から（5) のいずれかに記載のポリべプチドと（30) または（31 )のいずれかに記載の結合物質を接触させる工程および、

( b ) 該ポリペプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程；

(33) (1 ) から（5) のいずれかに記載のポリペプチドおよび（30) または（31 ) のいずれかに記載の結合物質を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリ一ニング用キッ卜；

(34) (32) に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質；

(35)下記の工程を含む、（ 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリぺプチドの発現調節物質のスクリ一ニング方法、

( a) ( 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質とを接触させる工程および、

( b ) 該ポリぺプチドの発現量の変化を、（ 20) または（23 ) のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程；

( 36 ) ( 3 5 ) に記載の方法を用いることを特徴とする、（ 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング用キット；

( 37 ) ( 3 5 )に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、（ 1 ) から（ 5 ) のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質； (38) (1 ) から（5) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする D N Aを欠損または変異させた非ヒトノックァゥ卜動物；

(39) (1 ) から（5) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DN Aを発現または変異させた非ヒ卜トランスジエニック動物；

(40) (1 9)記載の抗体， (30)記載の結合物質、（34)記載の結合活性調節物質または（ 37 ) 記載の発現調節物質を含有してなる医薬；

に関する。

本発明のポリべプチドは、「配列番号 2に記載の 1位の C y sから 655位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 2に記載の一 30位の Me tから 655位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」であり、配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち 31 5位の G yから 372位の31 nまでの 58ァミノ酸残基を欠損した「配列番号 4に記載の 1位の C y sから 597位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩」および「配列番号 4に記載の一 3 0位の Me tから 597位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩」も包含する。「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、または酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。

本発明のポリべプチドは、「配列番号 2または 4のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加からなる群より選択される少なくとも 1 つの変異を有するァミノ酸配列からなり、癌マ一カーであるかまたは/および B M P結合活性を有するポリペプチドまたはその塩」も包含する。このポリペプチドは癌マ一カーであるかまたは BMP結合活性を有する。 1若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、 50個以下、好ましくは 30 個以下、より好ましくは 20個以下、さらに好ましくは 1 0個以下のアミノ酸残基を意味している。さらに、本発明のポリペプチドは、欠失、置換または付加によっても生物学的活性を有しており、癌マーカーとしての機能を有するかまたは B M P結合活性を有するポリぺプチドであり、配列番号 2または配列番号 4で表わされるアミノ酸配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは 8 0 %以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、 9 5 %以上の相同性を有するポリぺプチドを挙げることができる。

本明細書において「癌マーカー」とは、癌細胞または癌組織を検出するに使用される物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質が、癌疾患においてその発現が増加または減少する場合に、「癌マーカー」となりえる。「癌」としては、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指昜癌、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、白血病、大腸癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌などが例示される。「癌マーカー」は癌を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクォチド、ポリぺプチドおよび抗体などを使用することができる。

本明細書において「癌治療薬」とは、癌を治療するのに用いられる物質である。本発明のポリぺプチドが各種癌細胞や癌組織において発現が増加または減少することから、本発明のポリぺプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは各種癌の治療に有用であると考えられる。

本明細書において、「B M P結合活性」とは、各種 B M Pへの結合性を有することであり、好ましくは B M P— 2または B M P— 4への結合性を有することである。

また、本発明のポリペプチドが B M Pとの結合活性を有することおよび B M Pが骨分化誘導活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは B M Pに関連すると考えられる骨疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの「骨疾患マ一力一」および「骨疾患治療薬」として有用であると考えられる。「骨疾患マーカー」とは、骨疾患を検出するのに使用される物質である。ある種の m R N Aまたはタンパク質の発現が増加または減少する場合に、骨疾患マーカーとなり得る。「骨疾患マーカ一」は骨疾患を検出することができる物質であればよく、本発明のポリヌレクオチド、ポリぺプチドおよび抗体などを使用することができる。「骨疾患治療薬」とは、骨疾患を治療するのに使用される物質である。本発明のポリペプチドが B M Pとの結合活性を有することから、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体などは骨分化誘導活性を調整することにより、 B M Pに関連すると考えられる骨疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの治療に有用であると考えられる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする D N Aであり、本発明のポリヌクレオチドとしては「配列番号 1の 91番目の Tから 2055番目の Gで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号 1の 1番目の Aから 2055番目の Gで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」、「配列番号 3の 91番目の丁から 1881番目の G で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号 3の 1番目の Aから 1 8 81番目の Gで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」力《例示される。また、本発明のポリヌクレオチドには、「本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダィズし、癌マーカ一であるかまたは/および BMP結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」も包含される。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは「配列番号 1の 9 1番目の Tから 2055番目の Gで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」または「配列番号 3の 91番目の丁から 1 881番目の Gで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド」である。

ここで、「ストリンジェン卜な条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイプリダイゼーシヨン法あるいはサザンブロッ卜ハイプリダイゼーシヨン法などを用いることにより得られるポリヌクレォチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、 0. 7~1. OMの NaCl存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行つた後、 0. 1〜 2倍濃度の SSC (Sal i ne Sod um C i t rate ; 1 50 m 塩化ナトリウム、 1 5mM クェン酸ナトリウム）溶液を用い、 65°Cでメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼ一シヨンは、 Μο Ί e c u 1 a r C 1 ο η i η g : A Labo r ato r y Manual , Se cond E d i t i o n ( 1 989 ) (Col d S p r i ng Ha r bo r Labor ato r y P res s) _% Cu r rent P r otoco l s i n Mo l ecu l ar B i o o g y (1 994) (Wi l ey-I n te r sc i e nce) DNA Cl on i ng ： Co r e Techn i que s、 A P r acti cal App r oach, S econd Ed i t i on (1 995) (Oxf o rd Un i e r s i ty P res s) などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェン卜な条件でハイブリダィズする配列からは、好ましくは、アデニン（A) またはチミン（T) のみのからなる配列は除外される。

本明細書において「ハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号 1または配列番号 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドをコードする D N Aの塩基配列と少な〈とも 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、 Al ts chu l ら (The J ou r nal of Mol ecu l ar B i ol og y， 21 5, 403— 41 0 (1 990) . )の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラム B L A S Tを用いることにより、スコアで類似度が示される。

本発明のポリヌクレオチドは、「配列番号 1または 3に記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド」を包含する。その様なポリヌクレオチドは、酉己列番号 1または 3のいずれかに記載の塩基配列中の連続した塩基で、例えば、 5個、 8個、 1 0 個、 1 2個、 1 5個、 20個、 25個、 30個、 40個、 50個、 60個などからなる塩基配列と同一配列のォリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体才リゴヌクレオチドも包含される。「誘導体才リゴヌクレ才チド」としては、例えば、オリゴヌクレオチド中のりん酸ジエステル結合がホスホロチ才ェ一卜結合または N 3 ' — P 5，ホスホアミダイ卜結合などに変換された誘導体才リゴヌクレオチド、リボースとりん酸ジエステル結合がぺプチド結合に変換された誘導才リゴヌクレオチド、ォリゴヌクレォチド中のゥラシルが C— 5プロピオニルゥラシルまたは C一 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、ォリゴヌクレオチド中のシ卜シンが C— 5プロピオニルシ卜シンまたはフェノキサジン修飾シトシンなど置換された誘導体才リゴヌクレ才チド、 D N A中のリボースが 2，一0—プロピルリボースまたは 2' —メトキシェトキシリボースなどで置換された誘導体才リゴヌクレオチドなどを挙げることができる。その様なポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子マーカ一、 PC R用のプライマー、ハイブリダィゼーシヨン用のプローブとして有用である。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクタ一、該ベクタ一により形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いた本発明ポリペプチドの製造法が含まれる。また、ノックァゥ卜動物や卜ランスジエニック動物も本発明により提供される。これら改変動物は、ヒトを除く哺乳類であれば、いずれの動物でもよく、好ましくはマウス、ラヅ卜、ハムスター、モルモットなどの齧歯類が例示される。

本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。

本明細書において「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部またはその断片、誘導体、結合体、修飾体なども包含される。好ましくは、本発明のポリペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明のポリぺプチドを特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。

本発明のポリペプチドの「検出または定量」は、免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成することができる。そのような方法としては、例えば、 E LI SA (Enzyme L i n k e d Immuno So r bent Assay)法、 R IA (Rad i o Immuno

As say) 法、蛍光抗体法、ウェスタンプロッ卜法、免疫組織染色法などが挙げられる。本発明の抗体を用いて、癌および/または骨疾患を検出することができる。本発明のポリぺプチドは癌マーカ一および骨疾患のマ一カーとなり得ることから、前述のポリぺプチドの検出または定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を用いることにより達成することができる。

本発明はまた、本発明の抗体を含むことを特徴とする癌および/または骨疾患の診断用キットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体および標準試薬として本発明のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは癌マーカ一であるかあるいは BMP結合活性を有することから、前述の癌および骨疾患の検出方法に基づき、本発明のポリぺプチドを免疫学的に測定することができる。

本発明のポリぺプチドの m R N Aの「検出または定量」は、 m R N Aの測定を行う分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。そのような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法、ドッ卜ブロッ卜法、 RT— PCR法などが挙げられる。

本発明の m R N Aの測定方法により、癌および/または骨疾患を検出することができる。本発明のポリペプチドは癌マ一力一および骨疾患マー力一となり得ることから、前述の m R N Aの検出または定量と同様な分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いることにより達成することができる。

本発明は、本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの一部または全部、標準試薬およびポリヌクレオチドの一部または全部を含む、癌および/または骨疾患の診断用キッ卜に関する。本発明のポリヌクレオチドは、癌マ一カーおよび骨疾患マ一カーとなり得ることから、前述の癌または骨疾患の検出方法に基づき、ポリヌクレオチドを分子生物学的に測定することができる。

本発明のポリヌクレオチドを用いて、 D Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制することができる。本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドとハイプリダイズするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列中の連続した 5から 6 0個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよび誘導体オリゴヌクレオチドなどを適宜調製し、当該分野で周知なアンチセンス R N A / D N A技術を用いて、このポリぺプチドの D N Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制する方法を提供することができる。

本発明はまた、本発明のポリペプチドの結合物質に関する。「結合物質」とは本発明のポリべプチドまたはポリヌクレオチドに結合する任意の物質をいう。このような結合物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリぺプチドなどが挙げられる。

本発明の「結合物質のスクリーニング方法」は、当技術分野で公知となっている技術を適宜適応することにより fi¹うことができ、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示される。本発明の「結合物質のスクリーニング用キット」には、少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部が含まれる。このキッ卜を用いて、前述の本発明の結合物質を生化学旳手法によりスクリーニングすることができる。

本発明はさらに、「結合活性調節物質」に関する。「結合活性調節」とは、本発明のポリぺプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、「結合活性」は、 P e r c e n t M a i m u m B i n d i n g ( P M B ) により評価される。「結合活性調節物質」とは、本発明のポリペプチドと本発明の結合物質との結合活性を増強あるいは減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリべプチドなどが挙げられる。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となつている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリ一ニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアツセィおよび結合ァッセィなどが例示される。

本発明の「結合活性調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキッ卜を用いて、前述の結合活性調節物質をスクリ一ニング方法に基づき、結合活性調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。

また、本発明は、「発現調節物質」に関する。発現量とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質または m R N Aが発現される量を意味する。発現量は、本発明の抗体を用いた、例えば、 E L I S A法、 R I A法、蛍光抗体法、免疫組織染色法方法などの免疫学的測定方法などを含む適切な方法により本発明のタンパク質を測定することまたは本発明の m R A測定方法、例えば、ノーザンプロットハイプリダイゼーシヨン法、ドットプロット法、 R T— P C R法などの分子生物学旳測定方法により本発明のポリぺプチドの m R N Aを測定することにより評価することができる。「発現調節」とは、上記の免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリべプチドのタンパク質または m R N Aレベルでの発現量を増加または減少させることを意味する。「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される、本発明のポリぺプチドのタンパク質または m R N Aレベルでの発現量を増加または減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリぺプチドなどが例示される。

本発明の「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリ一ニング方法により本発明の結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアヅセィおよび結合アツセィなどが例示される。

本発明の「発現調節物質のスクリ一ニングキット」には少なくとも本発明のポリペプチドまたはその一部、ポリヌクレオチドまたはその一部などが含まれてる。本発明のキットを用いて、前述の発現調節物質をスクリ一二ング方法に基づき、発現調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。

本発明の「医薬」とは、少なくとも、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、結合物質、結合活性調節物質または発現調節物質を含有していればよく、特定の疾患、例えば、癌、骨疾患などの予防または治療に用い得る。図面の簡単な説明

第 1図は、 C 0783ポリべプチドの構造を表した模式図である。

ァミノ配列の第一 30位から第一 1位が、予想されるシグナルべプチド領域 ( S P； S i g n a 1 P e p t i d e ) 、第 20位から第 327位が、 C h o「 d i nのシスティンリツチ領域 (CR ; Cys-r i c h d omai n) と類似性を有する 5つの領域で、ァミノ末端側から順に C R 1、 CR 2、 CR3、 C R 4および C R 5で表しており、第 331位から第 655位が、 von Wi l l eb r and因子と類似する領域 ( v W F - 1 i k e domai n ; vo n

W i 1 1 e b r a n d因子様領域）を示している。

第 2図は、各種癌組織およびそれに対応する正常組織における C 0783ポリべプチ m R Aの発現量を表している。

脳、耳下腺、甲状腺、肺、食道、胃、小腸、十二指腸、直腸、結腸、腎臓、副腎、胆嚢、リンパ節、精巣、前立腺、膀胱、尿管における癌細胞およびそれに対応する正常細胞におけるノーザンブロッ卜解析を行い、正常細胞での C 0783ポリぺプチド m R N Aの発現量を 1とした相対的な発現量で示している。

第 3図は、骨分化誘導時における C 0783ポリペプチド m R N Aの発現量の変動を表している。

骨分化誘導活性を有する I L— 1 ?および FGF— 2、軟骨細胞分化誘導活性を有する I G F 一 Iを処理したヒト間葉系幹細胞のノ一ザンプロヅト解析を行い、対照区（無処理区）での C 0

U 783ポリべプチ Km R Aの発現量を 1とした相対的な発現量で示している。

第 4図は、 C 0783欠損型ポリべプチドの構造を表した模式図である。

CO 783欠損型ポリべプチドは 627個のアミノ酸よりなる分泌蛋白質である。第 1図の C

0783ポリペプチドの 31 5位から 372位の 58個のアミノ酸残基が欠損しており、 C07 83ポリペプチドの機能上重要と考えられる 5番目のシスティンリッチ領域 CR 5 (C y s- r

1 c h dome i n 5)および vonWi 1 1 e b rand因子様領域の一部が欠損している。第 5図は、 C 0783の骨分化誘導活性（アルカリフォスファターゼ活性）を表している。骨分化マーカーであるアル力リフォスファタ一ゼ活性を指標とし、 CO 783と BMP— 2、 BMP— 4およびレチノイン酸（RA) を処理した場合の骨分化誘導活性を示している。対照区 (無処理）でのアル力リフォスファターゼ活性を 1とした相対的な活性で示している。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明ポリヌクレオチドの調製、本発明ポリペプチドの調製、組換えべクタ一、形質転換体、製造方法、抗体、本発明ポリペプチドの定量方法、免疫学的検出方法、 mRNAの定量方法、 m R N Aの翻訳抑制方法、結合物質、結合物質スクリ一二ング方法、結合活性調節物質、結合活性調節物質スクリ一二ング方法、発現調節物質、発現調節物質スクリ一ニング方法、スクリ —ニング用キッ卜、ノックァゥ卜動物、卜ランスジエニック動物、癌または/および骨疾患の検出方法、遺伝子診断用キッ卜、医薬について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。

( 1 ) 本発明のポリヌクレオチドの取得

ヒ卜間葉系幹細胞、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺由来のヒト正常細胞、または、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸、結腸由来のヒ卜癌細胞より、常法により c D N Aライブラリーを作製する。

cDN Aライブラリ一作製法としては、 Μο Ί e c u， a r Cl on i ng : A L a b o r a t o r y M a n u a l , S e c o n d E d i t i o n ( 1 989) (Co l d S p r i n g H a r b o r L a b o r at o r y P r e s s) や C u r r e n t P r o t o c o 1 s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (1 994) (G r e e n P u b 1 i s h i h g A s s o c i a t e s an d Wi l e y— I n t e r s c i e n c e ) _N D N A C l o n i n g 1 -. C o r e T e c h n i q u e s^ A P r a c t i c a l A p p r o a c h, S e c o n d Ed i t i o n ( 1 995 ) (Ox f o r d U n i v e r s i t y P r e s s) などに記載された方法、あるいは市販のキヅ卜、例えば、 S u p e r S c r i p t P l a sm i d S y s t em f o r c D N A S y n t h e s i s a n d P 1 a s m i d C Ί o n i n g (インビトロジェン社製）や Z A P— c D N A S y n t h e s i s K i t s (ストラタジーン社製）などを用いる方法が挙げられる。また、ヒト癌細胞由来株 C O L0205 (A TC C ： CC L- 22 2 ；結腸腺癌由来株）から調製した m R N Aを用いて、 S u p e r s c r i p t F i r s t— s t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r R T-P C R (インビトロジェン社製）などの c DNA合成キッ卜などにより c DN Aを合成することもできる。

本発明の DN Aの両末端に E c o R Iリンカ一を付与した後、クローニングベクタ一、例えば、 p S p o r t 1 (インピトロジェン社製）の E c o R Iサイト (こ挿入する。本発明のプラスミドを用い、 E, c o 1 i E l e c t r oMAX D H 1 0 B (インビトロジェン社製）を形質転換して c DN Aライブラリーを作製する。作製した c DN Aライブラリーより目的とする DN Aを含むクローンを以下の方法で選択する。

上記で作製した c D N Aライブラリ一より、常法または市販のキット、例えば、 Q I AG E N P 1 a s m i d M ax i K i t (キアゲン社製）などを用いた方法によりプラスミドを調製する。

上記で調製した c D N Aライブラリ一からコルジンのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードする DN A断片を有するプラスミドを選択する。そのような D N A断片は、各コルジンのァミノ酸配列がよく保存されている領域を 2ケ所以上見出し、該領域のァミノ酸配列をコードする D N A配列に対応する縮重プライマーを設計し、 P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n (P C R) 法により増幅することで得られる。縮重プライマーの作製方法は、 PCR P r i me r ： A Labo r ato r y Manu al ( 1 995) (Go l d S p r i ng Har bo r Labo r ato r y P r es s) 、ザ'プロトコ一リレシリーズ「c D NAクローニング」（1 996) (井上純一郎、仙波憲太郎編；羊土社）および S c i e n c e, 241 , 42 (1 988) . などに記載の方法が挙げられる。 P C R法は M o 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g : A Labo r ato r y Man ual , Se cond Ed i t i on (1 989) (Co l d Sp r i ng Ha r bo r Labo r ato r y P r e s s) および PCR P r otocol s (1 989) (Acad emi c P r e ss) などに記載の方法が挙げられる。

このようにして PCR法で増幅した DNA断片を適当なプラスミドに挿入し、サブクロ一ニングする。サブクローニングは、増幅した D N A断片をそのままあるいは制限酵素や D N Aポリメラーゼで処理した後、常法によりプラスミドベクターに組み込むことにより行うことができる。そのようなベクタ一としては、 pBl ue sc r i pt I I SK十、 pBl ue s c r i p t I I SK—、 p PCR— S c r i pt Am p (ストラタジーン社製）、 p D I R E C T ( u c r e i c Ac i ds Rese arch, 1 8， 6069 ( 1 990) . ) p T 7 Bl ue (ノバゲン社製）、 pCR I I (インビトロジェン社製）、 pCR— TRAP (ジーンハン夕一社製） pNoTAT7 (Eppendo rf 5 p r i m e社製）などが例示できる。サブクローン化された P C R増幅断片の塩基配列をスクリーニングすることにより、既知のコルジンのァミノ酸配列とホモロジ一を有するが、完全には一致しないァミノ酸配列をコードする DN A断片を選択することができる。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガーらのジデ才キシ法（P r oceed i ng s of the Nat i onal Ac ademy of Sc i en ce s U S A , 74 , 5463 ( 1 977 ) . ) あるし、は 37 3 A DNAシークェンサ一（アプライドバイオシステムズ社製）などの塩基配列分析装置で角军析することができる。このようにして選択した DN A断片をプローブとし、上記で作製した cD NAライブラリ一に^^して、コロニーハイプリダイゼーシヨンやプラークハイブリダィゼ一ションなどのハイブリダイゼ一ション解析を行うことにより、既知のコルジンとホモロジ一を有するポリペプチドをコードする cDN Aを取得することができる。プローブは、該 DNA断片を³² P などの放射性同位体、ジゴキシゲニン（d i g o X i g e n i n) 、西洋ヮサビペルォキシダ一ゼなどの酵素などで標識したものを使用することができる。ハイブリダィゼ一シヨンは、通常用いられる方法、 ί列えば、 Mo l e cu l a r Cl o n i ng : A Labo rato r y M anual , S e co nd Ed i ti o n (1 989) (Co l d S p r i ng H a r b o r Labo r ato r y P r e s s ) などに記載の方法で行うことができる。

ハイブリダィゼーシヨンにより取得された c D N A断片をそのままあるいは適当な制限酵素で消化した後、常法によりプラスミドベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガーらのジデ才キシ法（P roc ceec ng s of the Nat i on a l Academy of Sc i ence s USA, 74， 5463 (1 977) , )あるいは 373 A D N Aシークェンサ一（アプライドバイオシステムズ社製）などの塩基配列分析装置を用いて塩基配列を分析することで目的とする DNAを取得することができる。

このようにして取得される D N Aとして、例えば、配列番号 2で表されるポリペプチドをコードする D N Aなどが挙げられ、具体的には、配列番号 1で表される塩基配列を有する D N Aを挙げることができる。配列番号 1の DN Aを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したプラスミドをあげることができる。

得られた DN Aを適当な発現べクタ一に組み込み発現プラスミドを構築し、該発現ベクターを適した宿主に導入することにより形質転換体を得ることができる。該発現べクタ一としては、該 c D N Aを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなべクタ一として pc DNA I . 1、 p c D N A 1. 1/Amp、 pCDM8、 p R E P (インビトロジェン社製）、 pHM6、 pHB6 (ロシュダイァグノスティックス社製）、 pKK223— 3、 p G Ε X (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）、 ρΕΤ— 3、 ρΕΤ— 1 1、 pBl ue s c r i ptl l SK (十）、 pBl uesc r i pt l l SK (-) (ストラタジーン社製）、 pUC1 9、 pT rxFus (インビ卜ロジェン社製）、 pUC 1 1 8、 pSTV28 (宝酒造社製）、 p MAし一 c 2 X (N ew E n g l a n d B i o L a b s社製）、 p AGE 1 07 (Cytotec hnol og y, 3 (2) ， 1 33 - 1 40 (1 990) . ；特開平 3— 22979) 、 p AG E 1 03 (T he J ou r n al of Bi oc hemi s t r y, 1 01 (5) , 1 307-1 31 0 (1 987) . pAMo pAMoA (T he J ou r na l of B i o 1 o g y c a 1 Chemi st r y, 268 (30) , 22 782-22787 ( 1 993 ) . ) , pAMo P R SA (特開平 5— 336963) 、 p A S 3— 3 (特開平 2— 227075) などを用いることができる。

該発現べクタ一の宿主への導入方法としては D N Aを導入する方法であればいずれの方法も用いることができる。宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーシヨン法 (Cy t o te c h n o l o g y， 3 {2 ) , 1 33- 1 40 ( 1 990) . ) _Ν リン酸カルシウム法（特開平 2— 227075) 、リポフエクシヨン法（P r o c e e d i n g s o f t he N at i o n a 1 Ac ad emy o f S c i e n c e s U SA, 84, 741 3 (1 987) . ； V i 1 o l og y, 52, 456 (1 973) . ) に記載の方法が例示される。

宿主としては発現ベクターに対応する適当な細胞または組織を用いることが可能で、例えば、動物細胞などが挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞の N am a 1 wa (バーキットリンノ月重、 ATCC ： CR L- 1 432) およびそのサブライン N a m a Ί wa K JM— 1、 HCT— 1 5 (ヒ卜大腸癌細胞、 ATCC ： CC L— 225) 、サル由来株細胞の C OS- 1 (ァフリカミドリザル腎細胞（ S V 40形質転換細胞）、 ATCC : CR L— 1 650) および C 0 S— 7 (アフリカミドリザル腎細胞（ S V 40形質転換細胞）、 ATCC : CR L— 1 651 ) 、ハムスター由来株細胞の CHO— K 1 (チャイニーズハムスター卵巣細胞、 A T C C ： C C L一 61 ) および H B T 5637 (特開昭 63— 299) などが例示されるが、好ましくは、 N ama l wa細胞、 Nama l w a K J M— 1細胞および H C T— 1 5細胞を用いる。本発明の形質転換体は、当該分野において周知憒用の常法により培養する。形質転換した宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、 Μ Ε Μ培地（Sc i e n c e, 1 30, 432 ( 1 959) . ) 、 D— ME M培地 (V i r o l og y, 8， 396 ( 1 959 ) . ) _s R PMI 1 640培地（T he J o u r n a 1 of t he Ame r i can Med i ca l As s o c i at i o n, 1 99， 51 9 (1 967) . ) 、 YT±咅地、 B EM± 地などが用いられる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、 M E M培地、 D- M E M培地、 R P I M培地などにゥシ胎児血清（FCS) を適量添加したものなどが用いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよく、例えば、ィソプロピル一 1ーチ才一; β— D—ガラクトビラノシン（I P TG) などを用いることができる。培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、 FCS、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、巿販されている培地も用いることができる。培養は pH 6. 0〜8. 0、 25〜40°G、 5% CO 2 存在下などの条 ί牛で行う。

所望の D Ν Αはコルジンが有する骨細胞の分化誘導抑制活性を指檫にし、該形質転換体によつて産生されたタンパク質をスクリーニングすることによつて選択することができる。骨細胞の分化誘導抑制活性とは、骨細胞の細胞増殖速度の上昇をもたらし、該細胞の形態変化を抑制させる活性を指す。該活性は、例えば、顕微鏡による骨細胞の形態学的観察や、骨細胞の分化マーカー、例えば、アルカリフォスファターゼ（C a n c e r Rese ar ch, 43, 4308-43 1 4 (1 983) . 、 Sci e nce, 1 99, 542-544 (1 978) . ) , 才ステオ力ルシン（Osteoca ci n e)や I型コラーゲンを測定することにより検出することが可能である。アル力リフォスファターゼは、例えば、細胞を超音波破砕により破壊し、細胞抽出液を得て、これをアルカリフォスファタ一ゼの基質である p—二トロフエニルフォスフエ一卜（p -n i t r op p he n yl p hos phate) を添加後、一定時間の反応させ生成した p— ニトロフエノール（p— n i t rophe nol ) の量を分光光度計により定量方法などにより測定することができる。アル力リフォスファターゼ活性が増加していれば、該 DN Aは骨細胞の分化誘導に関与する新規なコルジンをコードしていると考えることができる。

以上のようにして、ヒト間葉系幹細胞、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺由来のヒ卜正常細胞、または、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、'胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸、結腸由来のヒト癌細胞において、骨細胞の分化誘導に関与する、コルジン活性を有する新規ポリぺプチドをコードする D N Aを取得することができる。

また、上記方法で取得した D N Aとストリンジェン卜な条件でハイプリダイズする D N Aを選択することにより、配列番号 2記載のアミノ酸配列と比較して、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリべプチドをコードする D N Aを取得することができる。即ち、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ゥシ、サルなど由来の c D N Aライブラリ一に対してス卜リンジェントな条件でハィプリダィズする DN Aを選択することにより、目的の D N Aを取得することができる。

スクリーニングされた新規コルジンポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリべプチドをコードする DN Aを化学合成することによつても目的の DN Aを調製することができる。 D N Aの化学合成はりん酸トリエステル法、ホスホロアミダイ卜法、ホスホン酸エステル法などの方法により行うことができが A B I 392 (アプライドバイオシステムズ社製）などの市販の巿販の合成機器を用いて行うこともできる。

また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用し、、これら D N Aに相補的な m RN Aを発現している細胞の m R N Aから調製した c D N Aを踌型として、 PCRを行うことによつても、目的とする DN Aを調製することができる。

( 2 ) 本発明のポリぺプチドの製造

本発明のポリぺプチドは、 Mo l ecu l ar C 1 o n i n g ： A Labo r ato r y Manual , Se cond Ed i t i on (1 989) (Co l d Sp r i ng H a r b o r Labo r ato r y P r e ss) や Cu r r e nt P r otoco l s i n M o 1 e c u 1 a r Bi o l og y (1 994) (Wi 1 ey— I nte rsc i e n c e ) などに記載された方法を用い、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。

本発明のポリペプチドをコードする全長 DN Aを基に、必要に応じて、該ポリペプチドをコ一ドする部分を含む適当な長さの DN A断片を調製する。また、該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列は、宿主の発現に最適なコドンとなるようにしたものを調製する。該 DN Aは該ポリぺプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該 D N A断片または全長 D N Aは適当な発現ベクターのプロモータ一の制御下に挿入し、組換え体 DNA (組換えべクタ一）を作製する。言亥組換えべクタ一はそれに適合した宿主に導入することにより、本発明のポリぺプチドを産生する形質転換体を得ることができる。

宿主としては、大腸菌属などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、動物細胞、昆虫細胞、 ί直物細胞などの多細胞真核生物など目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。発現ベクターは、宿主において自立複製または染色体中への組込みが可能で、新規コルジン遺伝子の転写に適した位置にプ口モータ一を含有しているものが用いられる。

( 1 ) 原核生物を宿主として用いる場合

新規コルジン遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規コルジン遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、 pHM6、 p H B 6 (ロシュダイァグノスティックス社製）、 pKK223— 3、 p G EX (ァマシャムフアルマシアバイオテク社製）、 pSE280、 p T r X F u s_s p UC 1 9 (インビトロジェン社製）、 p B 1 u e s c r i p t I I SK ( + ) , pBl uesc r i pt I I SK (—）、 p ET Ex p r es s i on S ystem (ス卜ラタジーン社製）、 p G EM EX— 1 (プロメガ社製）、 pQE— 8 (キアゲン社製）、 pMAL— c2X (New E n g 1 and Bi o abs社製）、 pKYP I O (特開昭 58— 1 1 0600) 、 ρΚΥΡ 200 (Ag r i cau l tu r al Bi ol og ycal Chem str y, 45, 6 69 (1 984) . ) 、 pLSA1 (Ag r i cau l tu r al Bi o l og y cal C hemi st r y, 53, 277 (1 989) . ；) 、 p G E L 1 (P roceed i ngs o f the Nat i onal Academy of Sc i en ces USA, 82, 4 306 ( 1 985 ) . ) p E G 400 (J ou r nal of Bacte r i o l og y, 1 72, 2392 (1 990) . ) 、 pTe rm2 (特開平 3— 22979) 、 p P A 1 (特開昭 63— 233798) 、 p T r s 30 ( F E R BP - 5407) 、 p T r s 32 (F E R M B P - 5408) 、 pGH A 2 (F E RM B P— 400 )、 p G K A 2 ( F E R M B— 6798) などを例示することができる。

プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、 t r pプロモーター（Pt r.p)、 1 acプロモーター (P 1 a c)、 PLプロモータ一、 P Rプロモーター、 P S Eプロモータ一などの大腸菌やファージに由来するプロモ一夕一、 S P01プロモーター、 SP02プロモー夕一、 p e n Pプロモータ一などを挙げることができる。また、 P t r pを 2つ直列させた P t r p X 2プロモーター、 t a cプロモーター、 "I a c T 7、 l e t プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ—なども用いることができる。

リボソーム結合配列であるシャイン■ ダルガーノ（SD : S hi ne Dal g a r no) 酉己列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば 6~1 8塩基、に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

宿主としては、例えば、宿主としては、 E s c h e r i c h i a属、 S e r r a t i a属、 Bac i l l u s属、 B r ev i bacte r i um属、 Co r yn ebacte「 i um属、 Mi c r obacte r i u m属、 Pse udomona s属などの原核生物が挙げられ、 E s c h e r i c h i a属として E . col iの X L 1— B Ί u e株、 X L 2— B 1 u e株、 D H 1 株、 MC 1 000株、 KY 3276株、 W1485株、 JM1 09株、 H B 101株、 No. 4 9株、 W31 1 0株、 N Y49株、 BL21 (DE3)株、 BL21 (DE3) p L ys S株、 H S 1 74 (D E 3 ) 株および H MS 1 74 (D E 3) pL ys S株などが、 S e r r a t i a属として、 S . f i c a r i a株、 S . f ont i co l a株、 S . l i q uef ac e n s、 S . mar ces cens株などが、 Baci 1 1 u s属として、 B . s u b t i Ί i s株、 B . amyl o l q uef ac i en s株などが、 Br ev i bacte r i u m属として、 B . ammon i ag enes株、 B. Imma r i op h 1 urn (ATCC : 1 4068) 株、 B. sacc ha r o l y t i cum (ATCC： 1 066)株などが、 C o r y n e b a c t e r i u m属として、 C. g l utam i cum (ATCC : 1 3032)株、 C. g 1 u t a m i cum (ATCC： 1 4067)株、 C. gu l u tami cum (ATCC： 1 3 869)株、 C. acetoac i do p h i 1 um (ATCC : 1 3870)株などが、 M i c r obacte r u m属として、 M. ammon i aph i 1 u m (ATCC： 1 5354) 株などが、 Pseud omona s属として、 S . m e p h i t i c a株などが例示される。組換えべクタ一の導入方法としては、宿主へ D N Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（N u c 1 e i c Ac d s Re sea r c h, 1 6, 61 27 (1 988) . ) 、りん酸カルシウム法（P roceed i ng s of the Nat i on al Academy of Sc i e nce s USA, 69, 21 1 0 (1 972) . ) 、プロトプラス卜法（特開昭 63— 2483942) 、 Gene, 17， 1 07 ( 1 982) . や M o Ί e c u 1 a r & Ge ne r a Gen eti cs, 1 68, 1 1 1 ( 1 979 ) . に記載の方法などがあげられる。

(i i )酵母を宿主として用いる場合

宿主として酵母を用いる場合、発現べクタ一として、例えば、 Y E p 1 3 (ATCC ： 371 1 5) 、 Y E p 24 (ATCC ： 37051 ) , YC p 50 (ATCC : 3741 9) 、 pH S 1 9、 p H S 1 5などが挙げられる。

プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、 A

DH 1 (アルコールデヒドロゲナ一ゼ）プロモーター、 PH05 (酸性フォスファターゼ）プロモー夕一、 PGK 1 (ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、 GAPDH (グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナ一ゼ）プロモーター、 G A L 1 (ガラキト一スキナーゼ）プロモ一夕一、 GAL 1 0 (U D Pガラクトース 4ーェピメラーゼ）プロモータ一、 MF 1 (ひフエロモン）プロモーター、 CU P 1 (メタ口チ才ネイン）プロモーターなどが挙げられる。

宿主としては、仞 Jえば、 Saccha r omyce s属、 S . ce r ev i si ae種、 S c hi zosacc ha r omy ces属、 S . pombe種、 Kl uyve r omy ces属、 K . Ί act s種、 T r i c hos po r on属、 T . pu l u l an s種、 S c h w a n n i o m y c Θ s属、 S . a 1 1 u v i u s種および P i c h i a属、 P. pasto r i s種などが挙げられる。

組換えべク夕一の導入方法としては、宿主に D N Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（M e t h o d s i n En zymo l og y, 1 94, 1 82 (1 990) . ) 、スフエロプラスト法（P r oceed i ngs of t h e Nat i onal Academy of Sc i ences USA， 84， 1 929 (1 978) . ) 、酢酸リチウム法（J ou r nal of Bacte r i o l og y, 1 53, 1 63 ( 1 983 ) . および P r oceed i ng s of the Nat i onal Ac ad emy of Sc i ences U S A， 75 , 1 929 ( 1 978 ) . )記載の方法などが挙げられる。 (i i i ) 動物細胞を宿主として用いる場合

宿主として動物細胞を用いる場合、発現ぺク夕一として、例えば、 pcDNA1/Amp、 p cDNA 1、 pCDM8、 p R E P 4 (インピ卜ロジェン社製）、 pAGE 107 (Cytot echno l og y, 3， 1 33 (1 990) . ) p AG E 103 (T he J o u r nal of Bi ochemi st r y, 101 , 1 307 ( 1 987) . ) , pAMo、 pAMo A (p AMo P R S A) (The J ou r nal of B i o l og ycal Chemi st r y, 268, 22782-22787 ( 1 993) . ) _N p AS 3-3 (特開平 2— 22 705 ) などを用いることができる。

プロモータ—としては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒ卜サイ卜メガロウィルス（hCMV) の I E (Imed ate— ear l y)遺伝子のプロモータ一、 S V 40の初期プロモーター、モロニ一 · ミュリン■ ロイケミア . ウィルス（Mo 1 one y Mu r i ne L e u 1 e m i a Vi r us) のロング .タ一ミナル■ リピート ■ プロモータ一 (Long Te rmi nal Re peat P r omote r) 、レトロウイルスのプロモータ一、 HS Pプロモ一夕一、 S Rひプロモーターおよびメタ口チォネインのプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒ卜 CM Vの I E遺伝子のェンハンサ一をプロモータ一と共に用いてもよい。

宿主に用いる動物細胞としては、ヒ卜由来株細胞の H E K 293 (ヒ卜胎児腎細胞、 AT CC： CRL—1 573)、 N ama 1 wa (バーキッ卜リンパ腫、 ATCC : CRL— 1 432) 、 H e L a (子宮頸部癌細胞、 ATCC : CCL— 2) HBT 5637 (白血病細胞、特開昭 63 — 299) 、 BALL— 1 (白血病細胞）および HCT— 1 5 (大腸癌細胞）、マウス由来株細胞の S p2/0— Ag 1 4 (マウス骨髄種細胞、 ATCC : CRL—1 581 )および NSO (マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞の C 0 S— 1 (アフリカミドリザル腎細胞（ S V 40形質転換細胞）、 ATCC : CRL— 1 650) および C 0S-7 (ァフリカミドリザル腎細胞（ S V 40形質転換細胞）、 AT CC： C R L— 1 651 )、ハムスター由来株細胞の C H〇一 K 1 (チャィニーズハムスター卵巣細胞、 ATCC： CCL— 61 ) および BHK— 21 (C— 1 3) (シシリアンハムスター仔腎細胞、 ATCC : CCL— 1 0) 、ラッ卜由来株細胞の PC 1 2 (副腎褐色細胞腫、 ATCC : CRL-1 721 ) および Y Β 2/0 (ラット骨髄種細胞、 ATCC : CRL— 1 662 ) などを例示することができる。

組換えべクタ一の導入方法としては、宿主に D N Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法（C y t o t e c h n o 1 o g y, 3, 1 33, ( 1 990) . 、ヽリン酸カルシウム法（特開平 2— 22705) 、リポフエクション法（ P r oceea i ng s of t he Nat i ona l Academy of S c i e n c es, USA, 84, 741 3 (1 987) . 、 Vi ， o l og y， 52, 456 (1 973) . ) ,

(i v)昆虫細胞を宿主として用いる場合

宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファ一ベクタ一としては、例えば、 pVL 1 39 2、 pVL 1 393、 pB l ueBac I I I (インビトロジェン社製）などが、感染用ウィルスとしては、例えば、ョトウガ科昆虫に感染するバキュロウィルス（Vacu l ov i r us) Autog r apha Cal i f o r n i a nu cl ea r po l yhed r os s v i r u s (A cMN P V) Bac-N-B l ue D N Aなどが挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、 Bacu l ov i r us Exp r e ss i on Vec o r ： A Labo rato r y Man ual ( 1 992 ) (W. H - Fr eeman and Com pan y) 、 Mo l ecu l ar C 1 o n i n g : A Labo r ato r y Manual , Second Ed i ti on (1 989) (Co l d Sp r i ng Har bo r Lab o r ato r y P r ess) 、 Cu r r ent P rotoco l s i n M o 1 e c u 1 a r Bi o l og y (1 994) (Wi 1 ey— I nte r sc i en ce) B i oTe c hno l og y, 6, 47 (1 988) . などに記載の方法が用いれる。

昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファ一べクタ一および昆虫細胞への感染用のバキュロウィルス D N Aを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウィルスが昆虫細胞に感染することによりポリべプチドを発現することができる。

宿主に用いる昆虫細胞としては、 Spod opte ra f r ug i pe rda (ョトウガ）由来株細胞、 T r i c h o p 1 u s i a n i (イラクサキンゥヮバ）由来株細胞などが挙げられ、具体的には、 S. f r ug i pe rd a由来細胞としては、 Sf 9 (ATCC： C R L- 1 71 1、卵巣細胞）、 S f 21 (卵巣細胞）などが、 T . n i由来細胞株としては、 H i g h F i ve、 BT I-TN-5 B 1 -4 (卵細胞、インピトロジェン社製）などが例示される。組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平 2— 22705) 、リポフエクシヨン法（P r o c e ed i ng s of the N ati o nal A c a c e m y of Sci e nce s USA, 84, 741 3 (1 987) . )などを挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーシヨン法（Cytote chno l og y, 3， 1 33 ( 1 990 ) . ) なども用いることができる。

(V) 植物細胞を宿主細胞として用いる場合

宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養， 20 ( 1 994) . 、組織培養， 21 (1 995) . 、 T rend s i n Bi o techno l og y, 1 5, 4 5 ( 1 997) . ) に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、 T iプラスミド、タバコモザイクウィルスベクターなどを挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35 Sプロモーター、ィネアクチン 1プロモータ一などを挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコ一ル脱水素酵素遺伝子のィントロン 1などを揷入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。

宿主としては、ポテト、夕バコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルフアルファ、亜麻などの植物細胞が例示される。

組換えべクタ一の導入方法としては、宿主に DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム（Ag r o b ac t e r i um) を用いる方法（特開昭 59— 1 4088.5、特開昭 60— 70080、 W094/00977) 、エレクト口ポレーション法（特開昭 60— 251 887) 、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第 260685 6号、特許第 251 781 3号）などを挙げることができる。

(vi ) ±き養方法本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aを組み込んだ組換え体べクタ一を保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該ポリぺプチドを産生■蓄積させ、形質転換体または培養液より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育または栽培し、該ポリベプチドを産生 ·蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリべプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。

宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒ卜トランスジェニック動物を飼育し、雲亥組換え体 D N Aのコードする新規コルジン活性を有するポリべプチドを該動物中に産生■蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、新規コルジン活性を有するポリべプチドを製造することができる。動物個体中の産生■蓄積場所としては、例えば、言亥動物のミルク、唾液、卵などを挙げることができる。

宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する卜ランスジ二ニック植物を栽培し、該組換え体 D N Aのコードする新規コルジン活性を有するポリぺプチドを該植物個体中に産生■蓄積させ、植物個体中から該ポリべプチドを回収することにより、新規コルジン活性を有するポリべプチドを製造することができる。

宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体 D N Aのコードする新規コルジン活性を有するポリべプチドを培養液に産生■蓄積させ、該培養液から該ポリべプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。

本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、パクト卜リプトン、イーストェクストラクトおよび塩ィ匕ナトリゥムを含む Y T培地が好ましい。炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクト一ス、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、その他含窒素物質、並びに、ぺプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチ一プリカ一、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシゥム、塩化ナ卜リゥム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。

±咅養方法は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件で行う。 ±き養温度、 ±音養時間および培養液の pHは、各種宿主に適した範囲に設定し、通常 1 5〜40°C、 5時間〜 7日間、 pH3. 0〜9. 0で培養を行う。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行うことができる。また、必要に応じて、アンピシリンゃテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプ口モーターを用いた発現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサ一を培地に添加してもよい。例えば、 1 a cプロモータ一を用いた発現べクタ一で形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル一 — D—チ才ガラクトビラノシドなどを、 t r p プロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。

形質転換体が植物細胞や組織である場合、ジャ一ファ一メンタ一を用いて大量培養することができる。 ±き養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ 'アンド ·スクーグ（MS)培地、 Wh i te± 地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモンを添加した培地を用いることができる。

形質転換体が動物細胞や組織である場合、 ±咅養する培地としては、一般に使用されている RP M I 1 640 ±咅地 (T he J ou r na l of the Ame r i can Med i ca Ί Assoc i ati on, 1 99, 51 9 ( 1 967 ) . ) M E !\!±咅地（ S c i e n c e , 1 30, 432 (1 959) . )、 D— ME M培地（Vi r o l og y, 8， 396 (1 959) . )、 1 99培地（P r oceed i ng s of the Soc i e ty f o r t he B i o 1 o g i c a 1 Med i c i ne, 73, 1 ( 1 950) . ) またはこれら培地に牛胎児血清（ F C S ) などを添加した培地などが用いられる。

培養は、通常 pH 6~8、 25~40°C、 5% C 0₂存在下などの条件で 1〜7日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されている T NM— F H±咅地（ファーミンジェン社製）、 S f— 900 I I S FM培地（インビ卜ロジェン社製）、 ExCe 1 1 400, ExCe 1 1 405 (J R Hバイオサイエンシーズ社製〕、 G r ace' s I nse ctMed i um (Natu r e, 1 95, 788 (1 962) . ) などを用いることができる。 ( V i i ) 製造方法

本発明のポリべプチドは、形質転換体を培養し、培養液から本発明のポリべプチドを単離■精製することにより製造することができる。本発明のポリペプチドの単離 ·精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離 ·精製方法や S and 1 e rらの糖転移酵素の精製方法（Method s i n En z ymol og y, 83, 458) を用いることができる。

本発明のポリぺプチドが溶解性ポリぺプチドとして産生 ·蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離する。本発明のポリべプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体を S T E溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることがで ^る。

本発明のポリぺプチドの分離■精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS) や N—ラウロイルザルコシンナトリウム（サルコシル）などを含んでいてもよい。

得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離■精製方法は自体公知の各種分離■精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸ァンモウニゥムなどによる塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジェチルアミノエチル（DEAE) —セファロ一スクロマトグラフィー、 DIAION H PA—7 5 (三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、 S— Se p ha r o se FF (フアルマシア社製）などのリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、プチルセファロ一スなどの疎水性ク口マトグラフィ一ゃァフィニティーク口マトグラフィ一などの各種ク口マトグラフィ一法、 S D S -ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示される。ァフィ二ティ一クロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによつても行うことができる。

本発明のポリべプチドが不溶性ポリべプチドとして産生■蓄積される場合、上記同様に細胞または菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS) や N—ラウロイルザルコシンナトリウム（サルコシリレ）などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリべプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離 · $青製方法により精製標品を得ることができる。

また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合した夕ンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィ一を利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学， 13， 469— 474 (1 995) . ) 。融合タンパク質に使用する付加夕ンパク質としてはプロテイン A、 FLAGなどが例示される（Pro ceed i n g s of t n e Nat i onal Acad emy of Sci ence s USA, 86, 8227 ( 1 989) . Gene sDeve l o pment, 4， 1 288 ( 1 990) .、特開平 5— 336963、特開平 6— 823021 ) 。プロテイン Aを使用する場合、本発明のポリペプチドとプロティン Aの融合タンパク質を生産し、ィムノグロプリン Gを用いてァフィ二ティ一クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。 FLAGぺプチドを使用する場合、本発明のポリペプチドとと F LAGの融合タンパク質を生産し、抗 FLAG抗体を用いてァフィ二ティ一クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。

本発明のポリべプチドは、公知の方法に準じて、 i n V i t r o転写■翻訳系を用いてを生産することができる（J ou r na l of B i omo ] e cu l a「 NMR, 6, 1 29 一 1 34 (1 995) . 、 Sc i e nce, 242, 1 1 62 - 1 1 64 (1 988) . 、 T h e J ou r na l of B i ochemi st r y, 1 1 0, 1 66— 1 68 (1 991 ). )_c 本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、 Fmoc法（フルォレニルメチル才キシカルボニル法）、 tBoc法（t一ブチル才キシカルボニル法）などの化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、 APEX396 (ァドバンス卜ケムテック社製）、 433 A (ァプライドバイオシステムズ社製）、 PS3 (プロテインテクノロジ一ズ社製）、 9050 (パーセプティブ社製）、 P S S M— 8 (島津製作所製）などのぺプチド合成機器をにより化学合成することができる。

本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クロ —ニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、 1 993年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリぺプチドのコルジン活性は、公知の測定法（T he J o u r n a 1 of B i o 1 o g y c a 1 Chemi st r y, 258， 9893— 989 8 (1 983) . 、 T he J ou r na l of B i o Ί o g y c a 1 Chemi st r y, 262， 1 5649 - 1 5658 (1 987) . 、 T he J ou r nal of Bi o 1 o g y c a 1 Chemi s t r y, 273， 58-65 ( 1 998) . 、 The J ou r n a 1 of B i o 1 o g y c a 1 Chemi s t r y, 273, 433-440 (1 99 8) .、 The J ou r nal of B o l og ycal Chemi st r y, 273, 1 2770-1 2778 (1 998) . , Ar ch i ves of Bi ochemi st r y and Bi o ph ys i cs, 270， 630— 646 ( 1 989) . 、 Ar c h i ve s of Bi oc hemi st r y and Bi o phys i cs, 274, 1 4—25 (1 989) . 、特開平 6— 1 81 759) に準じて測定することができる。

( 3 ) 変異型ポリぺプチドの作製方法本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付カロは、 Mo l e c u l a r C l on i n g : A Labo r ato r y an u al , S e cond Ed i t i on (1 989) (Col d Sp r i ng Ha r bo r Labo r ato r y P r es s. ) 、 Cu r r e nt P r otocol s i n M o 1 e c u 1 a r Bi o l og y (1 994) (Wi 1 e y— I n te r s ci ence) _N N u c l e c

Ac i d s Res ear c h, 10， 6487 ( 1 982 ) . 、 P r oceed i ng s of the N at i ona l Acad emy of S ci e nces USA, 79， 6409 (1 982) . 、 Ge ne, 34, 31 5 ( 1 985 ) . 、 uc l e i c Ac i d s r e sea r ch, 1 3, 4431 (1 985) . , P r oceed i ng s of t h e at i o n al Academy of Sc i ences USA, 82, 488 (1 985) . 、 P r oc eed i ng s of the Nat i onal Acad emy o f Sc i en ces USA, 81， 5662 ( 1 984) . 、 Sc i ence, 224， 1 431 (1 984) . 、 WO 85/0081 7、 Natu r e, 31 6, 601 (1 985) . などに記載の方法に準じて調製することができる。

( 4 ) 本発明のポリぺプチドを認識する抗体の作製

(i ) ポリクロ一ナル抗体の作製

本発明のポリべプチドの全長、その部分べプチドもしくはその部分べプチド含むポリべプチドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ゥシ血清アルブミン（BSA) 、スカシガイのへモシァニン（key ho 1 e l i mpe t hemocyan i n ; KLH) ゃ牛チログロブリン（ B T G ) などに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（C FA) および不完全アジュバント（I FA) を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ハムスターなどを用いることができる。

ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ant i bod i e s : A Labo r a t o r y Man ua l , Se cond Ed i t i on (1 989) (Co l d S p r i n g Ha r be r Labor ato r y P r e s s ) )などに従って作製することができる。哺乳動物に抗原を 1回目の投与後、 1~2週間毎に 3〜10回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。

該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜1 0回行う。該抗原の投与量は 1回当たり動物 1匹に対し、 50~1 00 gが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やべプチド合成機で合成することができる。各投与後、 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ E L I S A法）：医学書院刊（1 976年）、 Ant i bod i es : A Labo rato r y Man ual , S e cond Ed i t i on (1 989； (Go l d Sp r i ng Ha r bo r L a b o r ato r y P r e s s) などに記載の方法で確認することができる。

免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクロ —ナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニゥムによる塩析、力プリル酸沈殿 (Ant i bod i e s : A Labo rato r y Manual , Second Ε d i t i on (1 989) (Col d Sp r i ng Har bo r Labo r ato r y P r e s s) または D E A E—セファロ一スカラム、陰イオン交換カラム、プロテイン Aカラム、 G 一力ラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーを単独または組み合わせることで行うことができる。

( i i ) モノクローナル抗体の作製

( a )抗体産性細胞の調製

モノクローナル抗体は、（i ) で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエ口一マ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラッ卜から樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケ一ラーとミルスタインの方法（Natu r e, 256, 495-497 (1 975 ) . ) に従って作製することができる。

本発明のポリべプチド、その部分べプチドもしくはその部分べプチドを含むポリぺプチドを投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後 3〜 7曰目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓を M EM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでぼぐし、 1， 200 r pmで 5分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞を T r i s—塩化ァンモニゥム緩衝液（pH7. 65) で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 M E M培地で 3回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。 (b) 骨髄腫細胞の調製

骨髄腫細胞としては、マウスまたはラッドから由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞 P 3— X 63 Ag 8 一 U 1株（以下、 P 3— U 1と略す）（Cu r r ent Topi cs i c r o b i o 1 o g y c a 1 Immun o l og y, 81 , 1 (1 978) . 、 Eu r op i an J ou r na 1 of Immuno l og y， 6, 51 1 (1 976) . ) 、 SP 2/0— Ag 1 4株（以下、 S P— 2と略す）（Natu r e, 276、 269 ( 1 978) . ) P3— X63— Ag 8653株（以下、 653と略す）（J ou r nal of Immuno l og y, 1 23, 1 548 ( 1 979) . ) 、 P 3-X63-Ag 8 (以下、 X 63と略す）（Nat u re, 2 56， 495 (1 975) . ) などが用いることができる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地（ 1 5 gZm Ί 8—ァザグァニンを含む正常培地（ 1. 5 mM グルタミン、 5 X 1 0— ⁵M 2—メルカプ卜エタノール、 1 0/ g/m 1 ジェン夕マイシンおよび 10% FCS (CSL社製）を含む RPMI 1 640培地））で継代し、細胞融合を行う 3 ~4日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を 2 X 1 0⁷個以上用いる。 (c) ハイプリドーマの作製

( a ) で調製した抗体産生細胞と（ b ) で調製した骨髄腫細胞を M E M培地または P B S (1 リットル当たり； 1. 83 gリン酸ニナ卜リゥム、 0. 21 gリン酸一力リウム、 7. 65 g N aC，、 pH 7. 2) で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞 5〜10倍になるよう混合し、 1 , 200 r pmで 5分間違心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞 1 0⁸当たり、ポリエチレングリコール溶液（2 g ポリエチレングリコール一 1 000 (P EG— 1 000) 、 2ml M EM培地、 0. 7ml ジメチルスルホキシド（DMSO) ) を 0. 2〜1 m 1を 37°Cで攪拌しながら添加し、更に 1〜 2分間毎に M E M培地 1 ~ 2 m Ίを数回添加する。 M E M±咅地で全量を 50 m 1になるように調製し、 900 r p mで 5分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画に H A T培地（正常培地、 10— ⁴M ヒポキサンチン、 1. 5 X 1 0— ⁵M チミジンおよび 4 X 1 0— ⁷M アミノプテリンを含む） 1 00m，を添加し、ゆるやかにぼぐし懸濁する。

該懸濁液を 96六 ±咅養用プレー卜の各六に 100/ 1六ずつ分注し、 37°C、 5% C〇₂存在下で 7〜14日間培養する。酵素免疫測定法（Ant i bod i es : A Labo r ato r y Manua l , Se cond Ed i t i on (1 989) (Co l d Sp r i ng H a r bo r Labo r ato r y P r ess) ) などに記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを選択する。

( 5 ) 本発明ポリぺプチドの免疫学的検出方法

本発明ポリぺプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリぺプチドまたはその部分べプチドに対する抗体を直接または間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックスなどに結合した標識体を用いることにより該ポリペプチドまたはその部分べプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ヮサビペル才キシダーゼやアル力リフォスファタ一ゼなどの酵素標識により検出する. E L I S A法や化学発光法、ルミノールや G F P (G r een Fl u o re s ce nce P r ote i n) などの蛍光標識を検出する FI T C法、 ¹²⁵ Iなどの放射性同位体標識を検出する R I A法、ラテツクスに結合したラテックス凝集法などが例示される。

また、そのような測定方法として、ゥヱスタンプロット法および免疫組織染色なども例示される。さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドを定量することもできる。

( 6 ) m R N Aの定量方法

本発明のポリヌクレオチドより調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または R T— P C R法により m R N Aを定量することで本発明のポリベプチドをコ― ドする D N Aの発現量を定量することができる。

正常あるいは疾患モデル動物、例えば、マウス、ラヅト、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどで m R N Aを定量する場合、必要によって抗癌剤などの薬剤などを投与し、一定時間経過後に、血液、脳、胃、腎臓などの臓器または組織を単離し、細胞を調製する。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法により m R N Aを抽出し、 R T— P C R法ゃノ一ザンブロッ卜ハイブリダィゼーシヨン法などで m R N Aを定量■角军析することができる。

本発明のポリぺプチドもしくはその部分べプチドを発現する形質転換体からの m R N Aを定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法により m R N Aを抽出し、 R T— P C R法ゃノ一ザンブロヅ卜ノ、イブリダイゼ一シヨン法などで m R N Aを定量■解析することができる。

( 7 ) 遺伝子構造の同定

現在、多くの機能未知のヒ卜染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがつて、本発明のポリヌクレオチド配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒ卜染色体遺伝子を同定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。 c D N Aの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、 c D N Aの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリべプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、ェクソンおよびイン卜ロン構造をスクリ一二ングすることができる。本発明のポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知憒用の常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロ卜コール、秀潤社（1 9 9 3年） . ）を用いて、該遺伝子のプロモータ一領域を取得することができる。プロモータ—領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモータ一領¾^が挙げられる。

( 8 ) 癌の検出方法

癌または癌転移検出方法としては、本発明のポリぺプチドの免疫学旳検出方法により、本発明のポリべプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドイッチ E L I S A法や¹²⁵ Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリべプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病患者の癌細胞においてその発現が増加し、小腸癌、直腸癌、大腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌患者の癌細胞においてその発現が減少していることから、この検出法は、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、 $吉腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌などの診断に利用することができる。

また、本遺伝子の多型を調べることにより、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、直腸癌、大腸癌、胆嚢癌および甲状腺癌の診断や予後の予測に利用できる。

さらに、本遺伝子の多型と、本遺伝子が発現している臓器（脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆嚢甲状腺、副腎、膀胱、前立腺）における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の診断にも利用できる。本遺伝子の多型解析は、本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンブロッ卜法、ダイレク卜シークェンス法、 PC R法、 D N Aチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる（臨床検査， 2, 1 5 07— 1 51 7 (1 998) . 、臨床検査， 42， 1 565 - 1 570 (1 998) . ) 。 (9) 骨疾患検出方法

骨疾患方法としては、本発明のポリぺプチドの免疫学的検出方法により、本発明のポリぺプチドと反応する異なるェピトープを認識する 2種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドィツチ E L I S A法や^{1 2 5} Iなどの放射性同位体で標識した本発明のポリぺプチドと該ぺプチドを認識する抗体を用いる競合 R I A法などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、関節リュウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの骨疾患の診断に利用することができる。

本発明のポリぺプチドは、間葉系幹細胞が骨細胞に分化する際に発現が上昇していることから、本遺伝子の多型を調べることにより、骨疾患の診断や予後の予測に利用できる。

( 1 0 ) 診断用キッ卜

本発明のポリヌクレオチドは、ノーザンハイプリダイゼ一ション法または P C R法を用いたそれら癌および骨疾患の診断に利用することが可能である。また、本発明の抗体を用いて免疫学的手法によっても癌および骨疾患の診断を行なうことができる。従って、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キッ卜中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。また、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリべプチドが含まれる。更にキッ卜中には標準曲線が含まれていてもよい。

( 1 1 ) m R N Aの翻訳抑制方法

本発明のポリヌクレオチドを投与することにより、本発明のポリぺプチドの生産を抑制することができる。即ち、本発明のポリヌクレオチドを用いて、本発明のポリペプチドをコードする D Aの転写の抑制、本発明のポリべプチドをコードする m R N Aの翻訳の抑制を行うことが可能である。

( 1 2 ) 結合物質のスクリ一二ング方法

本発明のポリべプチドまたはその部分べプチドは、本発明のポリべプチドに対する結合物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリぺプチドもしくはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩と被検物質とを接触させることを特徴とする本発明のポリぺプチドに対する結合物質のスクリ一二ング方法を提供する。被検物質としては、例えば、 B M P等の T G F (トランスフォーミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質、ヒトまたはマウス、ラッ卜、プタ、ゥシ、ヒッジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。これらの被検物質を本発明のポリべプチドに添加し、骨芽細胞分化誘導活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。具体的には、本発明の結合物質のスクリ一ニング方法は、本発明のポリべプチドもしくはその部分ペプチドを用いるか、組換え型ポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた結合アツセィ系を用いるか、または本発明のポリペプチドに結合して細胞刺激活性（例えば、ァラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内 Ca²⁺遊離、細胞内 cAM P生成、細胞内 cGMP生成、イノシ卜一ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性、または、 B M P— 4によるアル力リンホスファ夕ーゼ活性上昇に対する脱抑制活性など）を測定してスクリ一ニングすることができる。

まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリペプチドとしては、上記した本発明のポリペプチドまたは本発明の部分べプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリべプチドが適している。本発明のポリペプチドを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリぺプチドをコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコ一ドする DN A断片には、通常、相補 DN Aが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成 D N Aを用いてもよい。本発明のポリべプチドをコードする D N A断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス（n ucl e ar po l yhed r os i s v i r u s ; N P V ) のポリヘドリンプロモ一夕一、 S V40由来のプロモーター、レトロゥィルスのプロモータ一、メタ口チォネインプロモータ一、ヒ卜ヒートショックプロモータ一、サィ卜メガロウィルスプロモータ一、 S R orプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したポリぺプチドの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、 T he J ou r nal of Bi o l og i cal C hemi st r y, 267, 1 9555〜 1 9559 (1 992) . に記載の方法に従って行うことができる。

したがって、本発明の結合物質スクリ一二ング方法において、本発明のポリべプチドもしくはその部分べプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリべプチドもしくはその部分べプチドであってもよいし、該ポリぺプチドを含有する細胞またはその細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。本発明のポリべプチドを含有する細胞としては、本発明のポリぺプチドを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞上清画分としては、細胞の培養上清に含まれる画分のことをいう。

本発明のポリぺプチドまたはその塩に対する結合物質をスクリ一ニングするためには、適当なポリペプチド画分と、標識した試験物質が必要である。ポリペプチド画分としては、天然型のポリベプチド画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリペプチド画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した試験物質としては、 ³H、 ¹²⁵ I ¹⁴C、 ³⁵ Sなどで標識した、例えば、 8!\^などの丁0「

(トランスフォ一ミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質を挙げることができる。

具体的には、本発明のポリべプチドまたはその塩に対する結合物質のスクリーニング方法を行なうには、まず本発明のポリペプチドを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング方法に適したバッファーに懸濁することによりポリべプチド標品を調製する。バッファーには、 p

H4〜1 0、好ましくは pH6〜8のリン酸緩衝液、 T r i s-HC 1緩衝液などのリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween— 80 (花王—アトラス社）、ジギ卜ニン、デォキシコレ一トなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの各種夕ンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 □ィぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製）、ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01〜1 Om，の該ポリペプチド溶液に、一定量、好ましくは、 5000 0 171〜5000000 の³^1、 ¹²⁵I、 ¹⁴C、 ³⁵ Sなどで標識した試験物質を共存させる。非特異的結合量（ N S B ) を知るために大過剰の未標識の試験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は 0°Cから 50°G、好ましくは 4°Cから 37°Cで、 20分から 24時間、好ましくは 30分から 3時間で行なう。反応後、ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一ションカゥンターあるいはァ一力ゥンタ一で計測する。全結合量（ B ) から非特異的結合量（N S B ) を引いたカウント（B— N S B ) が 0 c pmを越える試験物質を本発明のポリべプチドまたはその塩に対する結合物質として選択することができる。

本発明のポリべプチドに対する結合物質をスクリ一ニングするためには、該ポリぺプチドを介する細胞刺激活性、例えば、ァラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内 Ca²⁺遊離、細胞内 cAM P生成、細胞内 G GM P生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性または、 B M P— 4によるアル力リンホスファ夕ーゼ活性上昇に対する脱抑制活性などを公知の方法または市販の測定用キッ卜を用いて測定することができる。具体的には、まず、ポリペプチドを含有する細胞をマルチウエルプレートなどに培養する。結合物質のスクリ一ニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、試験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質、例えば、ァラキドン酸などの生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。また、 c AMP産生抑制などの活性については、フ才ルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。 ( 1 3 ) 結合物質スクリーニング用キット

本発明のポリべプチドまたはその塩に結合する結合物質スクリーニング用キッ卜は、本発明のポリべプチドもしくはその塩、本発明の部分べプチドもしくはその塩、本発明のポリぺプチドを含有する細胞、または本発明のポリべプチドを含有する細胞上清画分などを含有するものである。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。

( i ) 結合物質スクリーニング用試薬

スクリ一ニング溶液および洗浄溶液として Han k' s B a l an c e d Sa l t S o 1 u t i o n (インピトロジェン社製）に 0. 05%のウジ血清アルブミン（シグマアルドリツチ社製）を加えたものを孔径 0. 45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Gで保存したものまたは用時調製したもの。

(a)本発明のポリペプチドを発現させた C HO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 0⁵個/六で継代し、 37°C、 5% CO ₂で 2日間培養したもの。

( b ) 標識被検物質

市販の³ H、 ^{1 25} I、 ^{1 4}C、 ³⁵ Sなどで標識した被検物質した溶液を 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、測定用緩衝液にて 1 Mに希釈するして用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、 DMS〇、メタノールなどに溶解する。

( c ) 非標識被検物質

標識物質と同じものを 1 0 0〜1 0 0 0倍濃度で調製したもの。

( i i ) 測定法

( a ) 1 2六組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 C H 0細胞を、測定用緩衝液 1 m 1 で 2回洗浄した後、 4 9 0 1 の測定用緩衝液を各穴に加える。

( b ) 標識被検物質を 5 f 1 加え、室温にて 1 時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を 5 μ 1 加える。

( c ) 反応液を除去し、 1 m 1 の洗浄溶液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を 0. 2 M N a 0 H ( 1 % S D Sを含む）で溶解し、 4 m 1 の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製）と混合する。

( d ) 液体シンチレーションカウンター（ベックマンコール夕一社製）を用いて放射活性を測定する。

本発明のポリペプチドまたはその塩に結合することができる結合物質としては、例えば、脳および肺など Iこ特異的に存在する物質などが挙げられ、具体的には、アンギオテンシン、ボンべシン、カナピノィド、コレシストキニン、グルタミン、セ口トニン、メラ卜ニン、ニューロべプチド丫、オビオイド、プリン、バソプレツシン、ォキシ卜シン、 PACA P、セクレチン、グルカゴン、カルシ卜ニン、アドレノメジユリン、ソマトスタチン、 GH R H、 C R F、 AC T H、 G R P、 P T H、 V I P (バツァクティブインテスティナルアンドリレイテツドポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、 CG R P (カルシトニンジーンリレーティウドペプチド）、ロイコトリェン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、 I L— 8、 G R Oひ、 G R〇y5、 G R Oァ、 A P— 2、 E N A— 78、 P F 4、 I P 1 0、 GC P— 2、 MC P— 1 、 H C 1 4、 MC P— 3、 1— 309、 M I P 1 ひ、 M I P— 1 yS、 R AN T E Sなどのひおよび/?ーケモカイン（c h e m o k i n e ) 、エンドセリン、ェンテロガストリン、ヒスタミン、ニュー□テンシン、 T R H、パンクレアティックポリぺプタイド、ガラニンおよび BM Pなどの T G F (トランスフォーミング増殖因子）ファミリに属するタンパク質などが用いられる。 ( 1 4 ) 結合活性調節物質のスクリーニング方法

本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドは、本発明のポリぺプチドに対する結合活性調節物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。本発明のポリべプチドと B M P— 2や B M P— 4に例示される結合物質との結合活性調節物質、すなわち、結合性を変化させる物質のスクリーニング方法としては、本発明のポリべプチドまたは該ポリペプチドを発現する組換え体発現系を構築し、バイオアツセィ系または結合アツセィ系を用いることによって、結合物質と本発明のポリべプチドとの結合性を変化させる物質、例えば、ぺプチド、タンパク質、非べプチド性物質、合成物質、発酵生産物などを効率よくスクリ一二ングすることができる。このような物質には、（ a ) 結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ァラキドン酸遊離、ァセチルコリン遊離、細胞内 C a ^{2 +}遊離、細胞内 c A M P生成、細胞内 c G P生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化または p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、（ b ) 結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。

すなわち、本発明は、（ i ) 本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質を接触させた場合および（ i i ) 本発明のポリペプチド、その部分ペプチドまたはそれらの塩と結合物質および被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリぺプチド、その部分べプチドまたはそれらの塩との結合活性調節物質のスクリ一二ング方法を提供する。本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、（ i ) および（ i i ) の場合において、該ポリペプチドと結合物質との結合量を、例えば、細胞刺激活性などを測定することにより比較することを特徴とする。

本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法として、具体的には、（ a ) 檫識した B M P— 2や B M P— 4に例示される結合物質を本発明のポリぺプチドなどに接触させた場合、および、標識結合物質およぴ被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質をスクリーニング方法、（ b ) 本発明のポリペプチドなどを含有する細胞または細胞培養液と標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触せた場合における、該細胞または細胞培養液における該ポリべプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリべプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、（ c ) 本発明のポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリペプチドなどと標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該ポリべプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリぺプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法などが挙げられる。

( 1 5 ) 結合活性調節物質のスクリーニング用キット

B M P— 2や B M P— 4に例示される結合物質と本発明のポリべプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング用キツ卜は、本発明のポリぺプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞または本発明のポリペプチドを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリ一二ング用キッ卜の例としては、次のものが挙げられる。 ( i ) 結合活性調節物質のスクリ一二ング用試薬

スクリーニング用溶液および洗浄用溶液として H a n k ' s B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n (インビトロジェン社製）に、 0. 05%のゥシ血清ァルプミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径 0. 45 y mのフィルタ一で濾過滅菌したものを、 4°Cで保存したものまたは用時調製したもの。

( a ) 本発明のポリぺプチド

本発明のポリぺプチドを発現させた C H 0細胞を、 1 2穴プレー卜に 5 X 1 0⁵個 Z 六で継代し、 37°C、 5% C 0₂、で 2日間培養したもの。

( b ) 標識被検物質

市販の³ H、 ^{1 25} I , ^{1 4}C、 ³⁵ Sなどで標識した被検物質した溶液を 4°Cあるいは — 20°Cにて保存し、測定用緩衝液にて 1 A6 Mに希釈するして用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、 DM S 0、メタノールなどに溶解する。

( c ) 非標識被検物質

標識物質と同じものを 1 00〜1 000倍濃度で調製したもの。

( i i ) 測定法

( a) 1 2穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現 C H 0細胞を、測定用緩衝液 1 m Ί で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

( b ) 標識被検物質を 5 1加え、室温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を 5 1加える。

( c ) 反応液を除去し、 1 m 1 の洗浄溶液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を 0. 2 M N a 0 H ( 1 % S D Sを含む）で溶解し、 4 m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製）と混合する。

( d ) 液体シンチレーシヨンカウン夕一（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。 ( 1 6 ) 発現調節物質のスクリーニング方法

本発明のポリべプチドまたはその部分べプチドの発現調節物質のスクリ一二ング方法は、本発明のポリヌクレオチドあるいは（ 4 ) 記載の抗体を用いることにより、本発明のポリべプチドまたはその部分べプチドの発現調節物質のスクリ一ニングに用いることができる。

すなわち、本発明は、例えば、（ i ) 非ヒ卜哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ i i ) 形質転換体などに含まれる本発明のポリベプチドまたはその部分べプチドの m R N A量あるいはタンパク質量を測定することにより、本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドの発現調節物質のスクリーニングを行うことができる。

( 1 7 ) 発現調節物質のスクリーニング用キット

本発明のポリべプチドの発現調節物質またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドを含有する細胞、または本発明のポリぺプチドを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、次のものが挙げられる。

( 1 8 ) 免疫学的定量方法に基づくスクリーニング用キッ卜

本発明ポリぺプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリぺプチドと反応する抗体のうちェピトープが異なる 2種類のモノク口一ナル抗体を用いたサンドイッチ E L I S A法、 ^{1 2 6}ェなどの放射性同位体で標識した本発明のポリべプチドとそれを特異的に認識する抗体とを用いるラジオィムノアッセィ法などが例示される。従って、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原として本発明のポリべプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。

( 1 9 ) 分子生物学的定量方法に基づくスクリーニング用キット

本発明のポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドから調製したオリゴヌクレォチドを用い、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または P C R法などにより、本発明のポリぺプチドをコ一ドする D Aの発現量を m R N Aレベルで定量することができる。

具体的には、（ i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラヅ卜、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどに対して、薬剤、例えば、抗癌剤などなどを投与し、一定時間経過した後、血液、特定の臓器、例えば、脳、胃、腎臓など、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリべプチドまたはその部分べプチドの m R Aは、例えば、当該分野において周知の抽出方法により m R N Aを抽出し、例えば、 T a q M a n P C Rなどの手法を用いることにより定量、または周知のノーザンプロット法により解析することもできる、または（ i i ) 本発明のポリぺプチドもしくはその部分べプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドの m R N Aを同様にして定量、解析することができる。また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キッ卜中には標識された本発明のポリヌクレオチドが含まれる。

( 20) 非ヒ卜ノックアウトおよび非ヒ卜トランスジエニック動物の作製

本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを用い、目的とする非ヒ卜動物、例えばゥシ、ヒッジ、ャギ、プタ、ゥマ、ニヮトリ、マウスなどの胚性幹細胞（ e m b r y o n i c s t e m c e 1 1 )において染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aを、例えば、 N a t u r e , 326 (6 1 1 0 ) , 2 95 ( 1 987 ) . 、 C e l l , 5 1 ( 3 ) , 503 ( 1 987 ) . などに記載の公知の相同組換えの手法により、 N a t u r e、 350 (6 3 1 5 ) , 243 ( 1 99 1 ) . などに記載のような不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる。

このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞 ( b 1 a s t c y s t) への注入キメラ法または集合キメラ法などの手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリベプチドをコードする D N Aに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリぺプチドをコードする D N Aの翻訳領域中への塩基の置換、欠失、揷入などの変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。.

またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性などを改変させることも可能である。さらに C r e— 1 o x P系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、該領域での目旳遺伝子欠失（C e l l , 87 (7 ) , 1 3 1 7 ( 1 996 ) · ) や C r eを発現するアデノゥィルスを用いて、目的の時期に臓器特異的な目的遺伝子欠失（ S c i e n c e , 2 78 , 5335 ( 1 997 ) . ) などが知られている。従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードする D N Aについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御または任意の欠失、置換、付加をその翻訳領域や、発現制御領域に有する非ヒトノックァゥトまたは非ヒ卜卜ランスジエニック動物を作製することが可能である。このようなノックァゥトおよびトランスジエニック非ヒ卜動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリべプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。従って、本発明のノックァゥ卜およびトランスジエニック非ヒト動物は、本発明のポリぺプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬などの評価用モデルとして非常に有用である。 ( 2 1 ) 医薬

本発明の抗体、結合物質、結合調節物質または発現調節物質を含有する医薬は、治療薬として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロヅプ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルピトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコ —ルなどのグリコ一ル類、ごま油、オリープ油、大豆油などの油類、 p —ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバ一、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一二ング用キットを用いて得られる物質またはその塩とは、結合物質、結合活性調節物質および発現調節物質であり、具体的には、（ a ) 結合物質と本発明のポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ァラキドン酸遊離、ァセチルコリン遊離、細胞内 C a ^{2 +}遊離、細胞内 c A M P生成、細胞内 c G M P生成、イノシ卜一ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化または p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性などを増強あるいは減少させる物質、（ b ) 結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合活性を増強あるいは減少させる物質、あるいは（ c ) 本発明のポリぺプチドの発現量を増強あるいは減少させる物質である。

該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよいく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。本発明のポリぺプチドなどに対するァゴニストは、本発明のポリぺプチドなどに対する結合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のポリぺプチドなどに対するアンタゴニストは、本発明のポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリぺプチドとの結合力を増強する物質は、本発明のポリぺプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質と本発明のポリペプチドとの結合力を減少させる物質は、本発明のポリぺプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。また、本発明のポリペプチドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の予防および/または治療剤本発明のポリぺプチドは前述のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従つて、本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドの発現量を変化させる発現調節物質は、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として用いることができる。該物質を本発明のポリべプチドの機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ぺヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コ一ンスターチ、卜ラガン卜、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミン卜、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、プドウ糖や補助薬を含む D —ソルビトール、 D —マンニトール、塩化ナトリウムなどの等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのアルコール類、ポリソルベ一卜 8 0や H C 0— 5 0など非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。

また、上記予防■ 治療剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリゥム緩衝液などの緩衝液、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなどの無痛化剤、ヒ卜血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどの安定剤、ベンジルアルコール、フエノールなどの保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒ卜ゃラット、マウス、ゥサギ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。該物質またはその塩の 1 回の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば体重 6 0 k gの高血圧症患者においては、一般に一日につき約 0.1 ~ 1 00 m g、好ましくは約 1 . 0〜50 m g、より好ましくは約 1 . 0〜20 m gであり、非経口的に投与、例えば、注射剤の場合は、例えば体重 60 k gの高血圧症患者においては、一般に一日につき約◦ . 0 1 ~3 Om g程度、好ましくは約 0 · 1〜20 m g程度、より好ましくは約 0. 1 ~ 1 0 m g程度を静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重 k g当たりに換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人 1 日当たり 1 O/U g S m g/k gである。実施例以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限り M o 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g : A Labo r ato r y Manual , Se cond Ed i t on (1 98 9) (Co l d Sp r i ng Har bo r Labo r ato r y P r ess) に言 S載された方法を用いた。実施例 1

コルジンと相同性を有する新規ポリペプチド（CO 783) をコードする c DN Aのクローニングヒト間葉系幹細胞（Bi oWh i 11 a k e r社製） 5X 1 0⁷個から、 TRI zol Reag e n t (インピ卜ロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全 R N Aを調製し、全 RN A 500 gを得た。得られた全 RN Aを Qu i c k P r e p i c ro m R N A Pu r i f i cat i on Ki t (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって P o 1 y (A) R N Aを調製した。 Su pe rsc r i pt Cho i ce Sys tem (ィンピトロジェン社製）を用いてポリ（A) +R N Aからクロ一ニング用 c D N A 断片を調製した。

ポリ（A) +RNA3/zgを O i' g o (d T) ₁₂一 ₁₈p r i me rおよび Su pe r Sc r i pt I I RTを用いてファース卜ストランド cDN Aを合成し、 E. col i D N A po 1 yme r aseおよび E. co 1 i RN a s e Hを用いてセカンドストランド c D N Aを合成した。得られた c DN Aを T 4 D N A P o Ί y m e r a s eで処理し、平滑末端をもつ cDNAを生成した後、 EcoR I (No t I) Ad apte rを T4 D A l i gaseを用いて 5' および 3 ' 両末端に付加した。アダプターを付加した c D N Aは T 4 ρ o l ynuc l eot i d e k Ί· η a s eを用いて 5 ' 末端をりん酸化した後、 c D Ν A s i z e f r act i on c o Ί u m n sで約 500 b p以上の c D N A断片を回収した。ベクタ一 p l asm i d pSpo r t 1 (インビトロジェン社製）を制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）で処理し、 T4 pol ynu c l eot i de ki naseを用いて 5' 末端をりん酸化した後、 T 4 DN A L i g a s eを用いて得られた c DN A断片をに組み込んだ。得られた組換えプラスミド D N Aをエタノ一ル沈殿後、 T E緩衝液（1 0mM T r i s— HC 1， p H 8. 0、 m EDTA) 20〃 1に溶解し、エレクト口ポーレーシヨン法（ N u c 1 e i c Ac d Re sear ch, 1 6, 61 27 (1 988) . ) により E l ect r oMAX D H 1 0 B (インビトロジェン社製）に導入し形質転換体を作製した。

形質転換体を S. 0. C. 培地（インビ卜ロジヱン社製） 1 ml中、 37°Cで 1時間培養し、 1 00 g /m 1のアンピシリンを含む L B寒天培地に塗布し、 37 °Cで一晚培養した。

その結果、 cDNAライプラリーとして約 100万個（挿入率 95%) のアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。

得られた形質転換体を別の L B寒天培地に塗布し、 37°Cで一晩培養し、コロニー約 1000 個から Qェ A p r e p Sp n M i n i p r e p K i t (キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがってプラスミドを調製した。 cDNAライブラリーからクロ一ニングした cD NAは DYEnami c E T Dye Te rmi nato r Ki t (Meg aBACE) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、 MegaBA C E 500 D N A Ana l ys i s S y s t e m (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）により c D N A断片の全塩基配列を決定した。コルジンとのァミノ酸配列比較のための至適アラインメントは、遺伝子情報処理ソフ卜ウェアである G E N ET YX (ソフトウェア社製）を用いて、 Li pman— Pea r son法（Sc i e n c e , 227， 1 435- 1 441 (1 985 ) . ) により実施した。

その結果、既知のコルジンァミノ酸配列とホモロジ一を有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号 5) を有するクローンを得た。

該 c D Ν Α断片を含むプラスミドを制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）で消化し、 Q I A q u i c k Ge l Ext r act on K i t (キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがって cDN A断片を得た。該 cDN A断片 5 Ongを Red i p r i me r I I D N A Labe l l i ng S y s t e m (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [ひ一³² P]d C T P (6000 C i /mmo 1 , 20 m C i /m 1 ) (N EN社製）で³² Pで標識した。 ³² P標識した c DN A断片をプローブとして用いコロニーハィブリダイゼーション角 ¥析を ί亍った。

ヒ卜脳 c DN Αライブラリ一 H uma n B r a i η (クロンテック社製）を 50枚の L Βプレートにプレー卜当たり約 1 X 1 0⁴コロニーとなるように塗布し、 37°Cで一晩培養してコロニ —を形成させた。そのようにして得られたコロニーを DN Aプロッティング用ナイロン膜 H y b o n d-N (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に転写した後、溶解溶液（1 0% S D S ) 、変性溶液（0. 5N N a〇H、 1. 5M N aCl ) 、中和溶液（ 0. 5 M T r i s —HC 、 pH7. 0 (1. 5M N aC Ίを含む））および 2 x S S Cで順次処理し、風乾した。転写した D Aは該ナイ口ン膜に紫外線照射することにより膜上に固定した。

上記で調製した標識プローブを Exp r e ssH y b H y b r i d zati o n So l ut i on (クロンテック社製）に添加し、該溶液に DN Aを固定したナイロン膜を浸し、 65°C で 1 6時間ハイブリダィゼ一シヨンを行なった。ハイプリダイゼーシヨン後のナイロン膜を 2 X SSC (20XSSC : 3 N aC 1 , 0. 3M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0) 室温にて 5分、 1 X S SCで 50°Cにて 30分、 0· 5 X S S Cで室温にて 5分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）共にイメージングプレー卜カセット（富士写真フィルム社製）に装着し、才一卜ラジオグラフィ一を行った後、ィメージアナライザー F L A 3000 Gで画像解析を行た。シグナルが検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダィゼ一シヨンを繰り返し行った。得られた単一クロ一ンコロニ一から Q I Ap r e p S p i n M i n i p r e p K i t (キアゲン社製）を用いてプラスミド D N Aを調製し、 D Y E n am i G E T D y e T e rm i n at o r K i t (Me g a B AC E) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い、；'忝付のマ二ュアルに従って、 Me g aBAC E 500 D N A An a l y s i s S ys t em (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）により全塩基配列を決定した。

その結果、 685個のァミノ酸よりなるポリぺプチド（配列番号 2 ；以下、 C 0783 ) をコ —ドする c DNA断片（配列番号 1 ) を含む cDNAを得た。 C 0783はァミノ末端の 1位の M e tから 30位の A s nまでの領域が、予想されるシグナルべプチド（ S i g n a Pe p t i d e : S P ) 領域で、 50位の C y sから 357位の C y sにはコルジンのシスティンリッチ（C y s— r i c h d o m a i n： C R ) 領域と類似性を有する 5つの領域（ァミノ末端から順に、 CR 1、 CR 2、 CR 3、 C R 4および C R 5 ) が存在し、ヒトのコルジンの CR領域と 20〜31 %の相同性を有していた（図 1 )。実施例 2

ヒト正常組織における C 0783mRN Aの発現実施例 1で得られた c DN Aライブラリ一のうち C 0783をコ一ドする c DN Aを含むプラスミドを制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）で消化し、 Q I Aq u i c k Ge Ex t r ac t i o n K i t (キアゲン社製）を用い添付のマニュアルにしたがって C 0783を含む c DNA断片を得た。得られた c DNA断片 50 n gを Re d i p r i me r I I D N A La b e l l i n g S y st em (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [a— ³²P]dCT P (6000 C i /m m o 1 , 20 m C i /m 1 ) (N EN社製）で³² Pで標識した。このようにして調製した³² P標識 c DNA断片をプローブとして用いノーザンプロッ卜解析を行った。上記で調製した標識プローブを Exp r e ssH y b Hy b r i d i z ati o n So l u t i on (クロンテック社製）に添加し、該溶液に Human Po l y A+ R N A B l ots 1 2 Maj o r T i ssu e No r the r n Bl ot (サヮディ一テクノロジ一社製）を浸漬し、 65°〇で1 6時間ハイブリダィゼーシヨンを行なった。ハイブリダィゼ —シヨン後のナイロン膜を 2XSSC (20XSSC ： 3M NaC1、 0. 3M クェン酸ナトリゥム、 p H 7. 0 ) で室温にて 5分、 1 XS S Cで 50°Cにて 30分、 0. 5 X S SCで室温にて 5分洗浄後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）共にィメ一ジングプレ一卜カセット（富士写真フィルム社製）に装着し、オートラジ才グラフィ一を行った後、ィメ一ジアナラィザ一 FLA3000Gで画像解析を行た。

その結果、 C 0783の m R N Aは、約 3. 8 k bの大きさで、脳および肺での発現が観察された。実施例 3

ヒ卜癌組織における C0783mRN Aの発現ヒ卜由来各種臓器の正常組織および腫瘍組織における当該遺伝子の発現量を調べた。

ヒ卜由来の 24種の癌組織および対応する正常組織から抽出した全 R N Aを固定したナイロン膜 48— Dot Tumo r/No rmal T i s sue Total R N A Dot B 1 o t (HAT D t-I ) (B i oChai n社製）を、ハイブリダィゼ一シヨンバッファ一（0. 5 M りん酸バッファ一、 pH 7. 2； 1 % (w/V) BSA、 1 m m o 1 /L EDTA、 7% (w/v) SDSを含む）に浸し、 65°Gで 1時間の予備ハイブリダィゼ一シヨンを行つた。次に、実施例 2と同様にして調製した C0783 cDN Aを含むプラスミドを制限酵素 Ec o R I (宝酒造社製）で消化し、 C 0783を含む cDNA断片 50ngを Red i pr i m e r I I D Ν A Labe l l i ng S y s t e m (アマシャムフアルマシアバイ才テク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [ひ—³² P]d CT P (6000 C i/mmo 1 , 2 0 m C i /m 1 ) ( N E N社製）で³² Pで標識することにより標識プロ一ブを調製した。該標識プロ一プを添加したハイブリダィゼ一シヨンバッファ一に、予備ノ \ィブリダイゼ一ション後のナイロン膜を浸し、 65°Cで 1 6時間ハイブリダィゼ一シヨンを行った。その後、該ナイロン膜を 2 X S S Cで室温にて 5分、 1 X S S Cで 50°Cにて 30分、 0. 5 X S S Cで 50°Cにて 30 分順次洗浄した後、風乾した。このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）共にイメージングプレー卜カセット（富士写真フィルム社製）に装着し、オートラジオグラフィ一を行った後、イメージアナライザ一 F LA3000Gで画像解析を行た。 1 8Sリボソーム R NAを対照区とし、該ナイロン膜をデハイブリダィズ後、添付の 1 8 Sリボソーム R N Aプロ一ブを用いて上記と同様に操作し、解析を行つた。対照区の解析結果に対する試験区の解析結果の発現量比を算出し、比率が 0. 01以上の場合を高発現とした。

その結果、正常組織においては、脳、食道、胃、肺、十二指腸、尿管、小腸癌、結腸、直腸、胆甲状腺、副腎、膀胱および前立腺、癌組織においては、脳、膀胱、前立腺、耳下腺、肺、食道、胃、十二指腸、腎臓、副腎、尿管、精巣、小腸および結腸で CO 783遺伝子は高発現していた。

また、対照区の解析結果を基に各組織での発現量を補正した後、正常組織に対応する癌組織での発現量比を算出し、各種癌組織における発現量を解析した（図 2) 。

その結果、 C 0783遺伝子の発現量は耳下腺、腎臓、胃、リンパ節、食道、尿管の癌組織で増加が、小腸、直腸、結腸の癌組織で減少が観察された。実施例 4

ヒト間葉系幹細胞における C0783mRN Aの発現ヒト間葉系幹細胞を、骨細胞に分化誘導した際の C 0783mR Aの発現変化を解析した。ヒト間葉系幹細胞 M e sen chymal Stem Ce l l (Bi o Whi ttake r社製) を Human Mesenchymal Stem Ce l l Basal e d i urn (Bi o Wh i ttake r社製）を用いて培養した。該細胞培養液に試験区として h u man I L一 1 3 ( R & D S y s t e m s社製）を最終濃度で 0. 5 n g/m 1になるよう添加したもの、 human IGF— I (R&D S y s t e m s社製）を最終濃度で 10 n g /m Ίになるよう添加したもの、 h um a n FGF-bas i c (FGF-2) (R&D S y s t e m s社製）を最終濃度で 1 0 n g/m 1になるよう添加したものおよび対照区として無添加のものをそれぞれ調製し、 37°C、 5% C0₂中で 1日間または 4日間培養を行った。各培養細胞から細胞を回収し、 TR I ZOL試薬（インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従い全 R N Aを抽出し、全 RNAを得た。得られた全 mRNA 1 O zgを 1 % ァガロースゲル（5. 5% ホルマリンを含む）電気泳動で分画後、ナイロン膜 H y b o n d— N (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）に転写した。該ナイロン膜をハイブリダィゼーシヨンバッファー（0. 5M りん酸バッファ一， pH 7. 2 ； 1 % (w/v) BS A, 1 m m o 1 / L EDTA, 7% (w/v) S DSを含む）に浸し、 65°Cで 1時間の予備ハイプリダイゼーシヨンを行った。次に、実施例 2と同様にして調製した C 0783 c DN Aを含むプラスミドを制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）で消化し、 C 0783を含む c D N A断片 50 n gを R ed i p r i me「 I I DNA Labe l l i ng S y s t e m (アマシャムフアルマシァバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [ひ一³² P]dCTP (6000 Ci /mmo Ί , 2 OmC i /m 1 ) (N E N社製）で³² Pで標識することにより標識プローブを調製した。該標識プローブを添加したハイブリダィゼ一シヨンバッファ一に、予備ノ、イブリダイゼーシヨン後のナイロン膜を浸し、 65°Cで 1 6時間ハイブリダィゼ一シヨンを行った。その後、該ナイロン膜を 2 XS SCで室温にて 5分、 1 XS SCで 50°Cにて 30分、 0. 5XSSCで室温にて 5分順次洗浄した後、風乾した。このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フイルム社製）共にイメージングプレー卜カセット（富士写真フィルム社製）に装着し、ォ一トラジオグラフィーを行った後、ィメ一ジアナライザ一 F L A 3000 Gで画像解析を行た。

各シグナル強度を測定し、対照区の解析結果に対する試験区の解析結果の比率を算出した。その結果、 C 0783の発現量は骨芽細胞分化誘導活性を有する I L一 1 ?および FGF— 2 処理区で増加したが、軟骨細胞分化誘導活性を有する I G F— I処理区で変化しなかった（図 3 )。 C0783は I L—1 3および FG F— 2処理により発現誘導され、 I G F— I処理により発現誘導されないことから、骨芽細胞分化に関与していることが示唆される。実施例 5

C 0783の欠損変異体の同定実施例 1で得られた CO 783 c DN Aの一部を含む配列番号 3で示される cDN A断片 50 n gを R e d i p r i me r I I D N A La b e l i n g S y s tem (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い添付のマニュアルに従って、 [ひ一³² P]dCT P (600 0 C i/m mo 1 , 2 OmC i /m 1 ) ( N E N社製）で³² Pで標識することにより標識プローブを調製した。実施例 1 と同様にして、該標識プローブおよびヒト脳 c DNAライブラリ一 H uman B r a i n (クロンテック社製）を用いてコロニーハイプリダイゼ一シヨン法により c DN Aライブラリ一をスクリーニングし、シグナルが検出されたコロニーについて単一クローンが得られるまでコロニーハイブリダィゼーシヨンを繰り返し行った。得られた単一クローンコロニーから Q I A p r e p S p i n Mi n i p r e p K i t (キアゲン社製）を用いてプラスミド D N Aを調製し、 D Y E n am i c E T D y e T e rm i n at o r K i t (Me g aBACE) (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、 Me g aBAC E 500 DNA An a l y s i s S y s t e m (アマシャムファルマシアバイ才テク社製）により全塩基配列を決定した。

その結果、 C 0783のアミノ酸配列のうち 31 5位の G 1 yから 372位の G 1 nまでの 5 8個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号 4) をコードする cDNAクローン（配列番号 3) を単離した（図 4) 。該 c DNAは C0783の活性に重要と考えられる CR 5を含む領 ±或を欠失していた。実施例 6

C 0783の哺乳類動物細胞での発現 p 3 X F L AG-CMV-1 4 (シグマアルドリッチジャパン社製）より 3 X F L A Gぺプチドをコードする塩基配列を PC R法により増幅し、クローニングベクター pC R 2 · 1 — TO P 0 (インビ卜ロジェン社製）に揷入し、プラスミド pCR— F LAGを構築した。次に、実施例 1で得られた c DN A断片から、配列番号 1で示される C 0783をコードする塩基配列を P C R— F L AGの S a Ί Iおよび N o t I部位に揷入することにより、カルボキシ末端に 3 X F L A Gポリペプチドをコードする c D N A配列を付加したべクタ一を構築した _c このプラスミドを制限酵素 X h o Iで消化し、発現べクタ一 pLXSN (クロンテック社製）の Xho I部位に揷入することにより C 0783発現ベクター p L X N S—C 0783 F L A Gを構築した。

p LXNS-00783 F LAGの宿主として H E K 293細胞（ヒト胎児腎細胞、 A T C C ： C R L— 1 573) を用いた。

1 0% (w/v) FCSを含む D— MEM培地を分注した 35mmのマルチディッシュに、 H E K 293細胞を 1 X 1 0⁵細胞 Zゥエルになるよう添加し、 5% C〇 ₂中 37°Cで 1 6時間培養を行った。該細胞培養液に 2 gの p LXNS— C0783FLAGおよびの Fu g e ne (ロシュダイァグノスティックス社製）を添加し、 5% C〇 ₂中 37°Cで 24時間培養を行った。その後、 ±咅地を交換し、さらに 5% C〇₂中 37°Cで 24時間培養を行った。

CO 783の発現は L a em Ί iの方法に従いウェスタンブロット法で解析を行った。

形質転換 H E K 2 9 3細胞の培養上清 1 O "!を S D S— P A G Eにより分画した後、 Imm ob i 1 o n-P (日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイロン膜をブロッキング溶液 (PBS、 p H 7. 4 ； 5% (v/v) スキムミルクを含む）に浸し、室温で 1時間振とう反応を行つた後、抗 F L A G M 2抗体ペル才キシダーゼ（ H R P ) 標識（シグマアルドリッチ社製）を添加した PBS (pH7. 4 ; 5% (v/v) スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で 1時間静置した後、該ナイ口ン膜を洗浄液で 1 0分間の洗浄を 3回行つた。該ナイロン膜と E C L P l u s W e a t e r n Bl ott i n g De tect i on Re agen t s (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜および X 線フィルム X— OMAT AR (コダック社製）を X—才マツト力セヅテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。形質転換していない H E K 293細胞の培養上清を同様に処理したものを対照区とした。

その結果、予想される 85 K dの大きさにシグナルが検出され、 C 0783が培養上清に分泌されるタンパク質であることが ί崔認された。実施例 7

C 0783のバキュロウィルスでの発現バキュロウィルスでの発現には B a c— t o— B a c Bacu l ov r us Exp r e s s i o n S y s t e m (インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作を行つた。

実施例 6で作製した C末端に 3 X F L A G付加した C0783をコ一ドする c D N A断片を、 p i asm i d p Fas tBac lの Xho Iにキ荦入し、 pFastBac— C0783 F LAGを構築した。該組換えプラスミドを Max Ef f i c i ency DH 1 0 B a c C ompetent C e 1 1 sに導入し、バキュロウィルスゲノム（ b a c m i d DNA) へ転移することにより組換え b a cm i d D N Aを構築した。該組換え b a c m i d DNAを Ce l 1 FECT I N Reagentを用いて Sf 9 (ATCC： CR L-171 1、卵巣細胞）細胞に導入し、組換えバキュロウィルスを得た。該バキュロウィルス感染 Sf 9細胞培養液 2 m Ίを 1 X 1 0⁶個/ m 1濃度の S f 9細胞培養液 50mlに添加し、 28 °Cで 40時間培養を行つた。該細胞培養液を遠心分離し上清画分に組換え C0783 FLAGを得た。

CO 783 F LAGの発現は実施例 6と同様にウェスタンプロッ卜法により確認した。

培養上清 1 Ομ 1を S D S— PAG Εにより分画した後、 Immob i 1 on— P (日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイ口ン膜をプロ、ソキング溶液（PBS、 pH 7. 4 ; 5% (v/v) スキムミルクを含む）に浸し、室温で 1時間振とう反応を行った後、抗 FLAG 2抗体ペル才キシダーゼ（ H R P )標識（シグマアルドリッチ社製）を添加した P B S ( p H 7. 4； 5% (v/v) スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で 1時間静置した後、該ナィ口ン膜を洗浄液で 1 0分間の洗浄を 3回行つた。該ナイ口ン膜と ECL Pl u s We a t e r n Bl ott i ng Detect i on Reag e nts (アマシャムファノレマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜および X線フィルム X—OMAT A R (コダック社製）を X—才マツト力セッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。組換えウィルス非感染 S f 9細胞の培養上清を同様に処理したものを対照区とした。

その結果、予想される 85 K dの大きさにシグナルが検出され、 C 0783が培養上清に分泌されるタンパク質であることが確認された。実施例 8

CO 783と BMPの結合実施例 7で調製したバキュロウィルス感染 S f 9細胞培養液 2 m 1を 1 X 10⁶個/ m 1濃度の S f 9細胞培養液 50mlに添加し、 28 °Cで 40時間培養を行つた後、該細胞培養液を違心分離し得られた上清画分 1 mlに抗 FLAG M 2ァガロースァフィ二ティーゲル（シグマアルドリッチ社製） 30 1を添加し、室温で 1時間振とう反応を行つた。組換えウィルス非感染 S f 9培養上清 1 m Ίに N— T e r m i n a 1 FLAG-BAP P r o t e i n (シグマアルドリツチ社製） 1 gを加えたものを対照区、また、組換えウィルス非感染 S f 9培養上清 1 m 1をネガティブな対照区として同様に処理して用いた。反応後の各ァガロースゲル溶液を 3等分し、 BMP結合試験を行った。

1つ目の各ゲル画分に 1 % (w/v) B S Aを含む生理食塩水 1 m Ίに h um a n BMP -2 (サヮデーテクノロジ一社製） 0. 1〃gを溶解した BM P— 2溶液を、 2つ目の各ゲル画分に 1 % (w/v) BS Aを含む生理食塩水 1 mlに human BMP— 4 (R&D S ystems社製） 0. 1 μ gを溶解した B M P— 4溶液を、 3つ目の各ゲル画分に 1 % (w/ V ) B S Aを含む生理食塩水 1 m 1のみを添加し、室温で 1時間振とう反応を行つた後、該ァガロースゲルを生理食塩水 1 mlにて 6回洗浄を行った。各種 BMPとの結合性はウェスタンブロット法により解析を行った。

BM P— 2を処理した各ァガロースゲルを S D Sで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、 Immob i 1 on— P (日本ミリポア社製）に電気的に転写した。該ナイロン膜をプロッキング溶液（P BS、 pH 7. 4； 5% (v/v) スキムミルクを含む）に浸し、窒温で 1時間振とう反応を行つた後、抗 B M P— 2ャギポリクローナル抗体 (San ta C r u z B i o t e c h n o 1 o g y社製）を添加した P B S ( p H 7. 4； 5% ( v/v) スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で 1時間静置した後、該ナイロン膜を洗浄液で 10分間の洗浄を 3回行つた。洗浄後のナイ口ン膜を H R P標識抗ャギ I g G抗体（C a p p e Ί社製）を添加した PBS (p H 7. 4)溶液中に浸し、室温で 1時間振とう反応を行った後、該ナイ口ン膜を洗浄液で 1 0分間の洗浄を 3回行つた。該ナイ口ン膜と ECL P l u s Weate「 n B otti ng Detect i o n Reagents (アマシャムファルマシアバイ才テク社製）を室温で反応させ、直ちに該ナイロン膜および X線フィルム X— OM A T A R (コダヅク社製）を X—才マット力セッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。

B M P— 4を処理した各ァガロースゲルについても同様に処理を行ってナイロン膜を調製し、抗 BM P— 4マウスモノクロ一ナル抗体である a n t i— h u m a n BMP— 4 mono c 1 o n a 1 an t i body (R&D S y s t e m s社製）および H R P標識抗マウス I g G抗体（Cappe Ί社製）を用いて B M P— 4との結合性を調べた。

その結果、 CO 783が BM P 4および BMP 2と結合性を有するタンパク質であることが i萑認された。実施例 9

C 0783の骨分化阻害活性実施例 7において C 0783と BMPが直接結合することが示されたので、 CO 783の骨分化への作用を検討した。検討には BMP— 2、 BMP-4, レチノイン酸および C 0783を用し、、細胞の骨分化を定量するために骨芽細胞の分化マーカ一であるアル力リフォスファータ一ゼの酵素活性を測定した。

マウス胎児細胞株 C 3 H/1 0 T 1 /2 c 1 o n e 8細胞（ A T C C ： C C L— 226 ) を 1 0 % F C Sを含む M i n i m u n Essent i al Med i um (MEM) a 1 p ha e d i u m ( 1 x ) Ί i q u i d (インビトロジェン社製）を用いて培養し、 24ゥエルディッシュ（コ一二ング社製）に 4X 1 0⁴細胞ノウエルになるよう分注した後、 37°Cで 1 6時間培養を行つた。該細胞培養液の培地を 5 % F C Sを含む Mi n i m u n E s s e n t i a 1 Med i um (MEM) al pha Med i um ( 1 x ) l i qu i d (インピトロジェン社製）に交換し、さらに 37°Cで 6時間培養を行った。

対照区は無添加、試験区は C 0783、レチノィン酸、レチノィン酸 + CO 783, BMP— 2、 BMP— 2+C0783、 BMP— 4、 BMP— 4 + C0783で各種被験物質を組合わせ、最終濃度で BM P— 2 (R&D S y s t ems社製）は 400 n g/m 1、 B P-4 (R & D 5 3 6 3社製）は200门9 1、レチノイン酸（シグマアルドリッチ社製）は 1 0— ⁸Mおよび CO 783は 800 n g/m 1になるよう細胞培養液に添加し、 37°Cで 3日間培養を行つた。該細胞培養液の培地を同濃度同被験物質を含む M i n i m u n Ess e nt i a 1 Med i um (MEM) al pha M e d i urn (1 ) l i q u i dに交換し、さらに 37 °Cで 3日間培養を行つた。

上記細胞培養液から培地を除去した後、破砕溶液（2mM MgCl ₂、 0. 2% N P-40 (V i s y s社製）） 20 1および A 1 k a 1 i n e P hos p hatase Su b s t r ate Ki t ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s社製）より添付のマニュアルに従って調製したアル力リフォスファタ一ゼ基質溶液 200 Ίを添加し、 37 °Cで 30分間反応を行つた。該反応液に、反応停止液（0. 4N NaOH) を 400 zl添加し、 405 nm における吸光度をプレートリーダ一 Emax (Mo l ecu l a r Devi ce s社製）を用いて測定した。

その結果、 C 0783を添加することにより、 BMP— 2および BMP— 4による骨芽細胞への分化誘導活性の阻害が確認された（図 5) 。産業上の利用の可能性

本発明により、耳下腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、腎臓癌、尿管癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、白血病、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胆嚢癌または甲状腺癌細胞等の消癌細胞の癌マーカーおよび治療薬、関節リュウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症などの骨疾患マ一力一および治療薬であるコルジン様新規ポリペプチド、該ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、該 D N Aが組み込まれた組換え体べクタ一、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドの製造法、該ポリべプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫学旳検出法、該抗体を含む癌診断用キット、該ポリペプチドの m R N Aの定量法、該ポリべプチドに対するリガンドのスクリ一ニング法、該ポリべプチドとリガンドとの結合性を変化させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドと B M P— 2あるいは B M P - 4との結合性を変化させる物質のスクリ一ニング法、該ポリぺプチドの発現を変動させる物質のスクリ一ニング法、ノックァゥト動物、卜ランスジェニック動物、本発明の抗体、リガンド、リガンドとの結合性を変化させる物質、または発現を変動させる物質を含有する医薬が提供される。

Claims

請求の範囲

I . 配列番号 2の 1位の C y sから 6 5 5位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩。

2 . 配列番号 2の— 3 0位の M e tから 6 5 5位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有する請求の範囲 1 に記載のポリペプチドまたはその塩。

3 . 配列番号 4の 1位の C y sから 5 9 8位の A r gで表わされるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩。

4 . 配列番号 4の一 3 0位の M e から 5 9 8位の A r gで表わされるアミノ酸配列を含有する請求の範囲 3に記載のポリぺプチドまたはその塩。

5 . 請求の範囲 1から 4のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加から選択される少なくとも 1つの変異を有するアミノ酸配列からなり、癌マーカーであるかまたは B M P結合活性を有するポリべプチドまたはその塩。

6 . 癌マーカ一、骨疾患マ一カー、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドまたはその塩。

7 . 請求の範囲 1から 6のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。

8 . 配列番号 1の 9 1番目の丁から 2 0 5 5番目の Gで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲 7記載のポリヌクレオチド。

9 . 配列番号 1の 1番目の Aから 2 0 5 5番目の Gで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲 7記載のポリヌクレオチド。

1 0 . 配列番号 3の 9 1番目の Tから 1 8 8 1番目の Gで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲 7記載のポリヌクレオチド。

I I . 配列番号 3の 1番目の Aから 1 8 8 1番目の Gで表わされる塩基配列を含有する請求の範囲 7記載のポリヌクレオチド。

1 2 . 請求の範囲 7から 1 1のいずれかに記載のポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、癌マーカ一であるかまたは B M P結合活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

1 3 . 請求の範囲 7から 1 2のいずれかに記載のポリヌクレ才チドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。

1 4 . 癌マ一力一、骨疾患マーカ一、癌治療薬、あるいは骨疾患治療薬として用いることを特徴とする、請求の範囲 7から 1 1 または 1 3のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

1 5 . 配列番号 1 または 3に記載の塩基配列中の連続した 5から 6 0塩基と同一配列を有するォリゴヌクレ才チド、亥オリゴヌクレ才チドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体ォリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるポリヌクレオチド。

1 6 . 請求の範囲 7から 1 3のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

1 7 . 請求の範囲 1 6に記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体。

1 8 . 請求の範囲 1 7に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドを培養培地から回収する工程、を含有する該ポリぺプチドまたはその塩の製造法。

1 9 . 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドを特異的に認識する抗体。

2 0 . 下記の工程を含む、請求の範囲 1 9に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリべプチドの検出または定量方法、

( a ) ポリべプチドと該抗体とを接触させる工程および、

( b ) ポリべプチドと該抗体との結合を検出する工程。

2 1 . 請求の範囲 1 9に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドが関連する癌または骨疾患の検出方法。

2 2 . 請求の範囲 1 9に記載の抗体を含むことを特徴とする、癌または骨疾患の診断用キッ卜。

2 3 . 下記の工程を含む請求の範囲 7から 1 3または 1 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドの m R N Aの検出または定量方法、

( a ) m R N Aと該ポリヌクレオチドとを接触させる工程および、

( b ) m R Aと該ポリヌクレオチドとの結合を検出する工程。

2 4 . 請求の範囲 2 3に記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載が関連する癌または骨疾患の検出方法。

2 5 . 請求の範囲 2 3記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する方法。

2 6 . 請求の範囲 7から 1 3または 1 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドをコードする D N Aの転写または m R N Aの翻訳を抑制する方法。

2 7 . 請求の範囲 7から 1 3または 1 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌または骨疾患の診断用キッ卜。

2 8 . 下記の工程を含む、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリべプチドの結合物質のスクリーニング方法、

( a ) 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリべプチドと被検物質とを接触させる工程、 ( b ) 該ポリぺプチドと被検物質との結合を検出する工程。

2 9 . 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、該ポリべプチドの結合物質のスクリーニング用キット。

3 0 .請求の範囲 2 8に記載の結合物質のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合物質。

3 1 . B M P - 2または B M P— 4である請求の範囲 3 0に記載の結合物質。

3 2 . 下記の工程を含む、請求の範囲 3 0または 3 1のいずれかに記載の結合物質と請求の範囲

1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドとの結合活性調節物質のスクリ一二ング方法、 ( a ) 被検物質の存在下または非存在下、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドと請求の範囲 3 0または 3 1のいずれかに記載の結合物質を接触させる工程、

( b )該ポリぺプチドと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程。

3 3 . 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドおよび請求の範囲 3 0または 3 1のいずれかに記載の結合物質を含むことを特徴とする、結合活性調節物質のスクリーニング用キット。

3 4 . 請求の範囲 3 2に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、結合活性調節物質。

35. 下記の工程を含む、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドの発現調節物質のスクリーニング方法、

(a) 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドを発現しうる細胞と被検物質とを接触させる工程および、

(b) 該ポリペプチドの発現量の変化を、請求の範囲 1 9または 22のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程。

36. 請求の範囲 35に記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリべプチドの発現調節物質のスクリーニング用キット。

37. 請求の範囲 35に記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とする、請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリぺプチドの発現調節物質。

38. 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DNAを欠損または変異させたノックァゥト動物。

39. 請求の範囲 1から 5のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DN Aを発現または変異させたトランスジエニック動物。

40. 請求の範囲 20記載の抗体、 30記載の結合物質、 34記載の結合活性調節物質または 3 7記載の発現調節物質を含有してなる医薬。