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WO2002052007A1 - Proteine de cellule de membrane synoviale - Google Patents

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WO2002052007A1
WO2002052007A1 PCT/JP2001/011289 JP0111289W WO02052007A1 WO 2002052007 A1 WO2002052007 A1 WO 2002052007A1 JP 0111289 W JP0111289 W JP 0111289W WO 02052007 A1 WO02052007 A1 WO 02052007A1
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protein
synoviolin
polynucleotide
activity
antibody
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PCT/JP2001/011289
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English (en)
French (fr)
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Toshihiro Nakajima
Tetsuya Amano
Original Assignee
Locomogene, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel protein related to rheumatoid arthritis (hereinafter abbreviated as RA), a polynucleotide encoding this protein, and uses of these proteins and polynucleotides. More specifically, the present invention relates to a novel protein that can be expected as a specific diagnostic marker for RA. It is also related to new genes that provide a new approach to RA drug development. '' Background technology
  • RA is a systemic chronic inflammatory disease with abnormal growth of synovial tissue in joints.
  • Synovial cells are fibroblast-like cells that form 16 epithelial layers in the synovium of joints and supply synovial fluid with proteogliin and hyaluronic acid. ing. Symptoms such as synovial tissue proliferation, the resulting multilayer structure, and infiltration of synovial cells into other tissues are observed in the joints of RA patients.
  • the presence of autoantibodies against the Fc region of its own IgG in the serum of RA patients is considered to be one of the autoimmune diseases, but its etiology has not yet been elucidated.
  • Diagnosis of RA based on detection of RA factor has problems such as specificity for the disease and the system that generates the antibody has not been elucidated, and its relation to the etiology is not clear.
  • RA The pathophysiology of RA is determined by the proliferative potential of joint synovium with various immune responses and bone destruction in vivo Considering the two aspects of disease, much research has been done on the former immune response, and its molecular mechanism is being elucidated. However, with regard to the latter study of synovial cells, even though it is the main body of RA, its cell biological characteristics have not yet been clarified. Elucidating the molecular mechanisms behind the onset and progression of chronic and refractory diseases, such as RA, is essential for the diagnosis, prevention and treatment of diseases. Furthermore, in the absence of signs that the progress of aging is stagnant, elucidation of the pathology of RA, which is an age-related disease, is an important social issue. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel protein that brings a new approach to the diagnosis and treatment of RA, and a novel gene encoding this protein.
  • the protein and the polynucleotide encoding the protein provided by the present invention are more closely related to the etiology of RA, provide useful information in diagnosis, and lead to drug discovery in the development of therapeutic techniques.
  • Another object of the present invention is to provide a transgenic animal expressing a gene encoding the protein, and a knockout animal deficient in the gene. These animals are useful for analyzing the function of the gene of the present invention and developing therapeutic methods and therapeutics for RA as model animals.
  • the present inventors performed immunoscreening of a cDNA library of synovial cells of RA patients using an anti-human synovial cell antibody obtained by using cultured human synovial cells of RA patients as an immunogen.
  • the protein encoded by this gene was named Synoviolin after synovial cell, the tissue in which this gene is expressed.
  • the present inventors have confirmed that the reactivity of the anti-human synovial cell antibody with respect to the molecular weight of the cultured synovial cells of about 80 kDa, 140 kDa, and 220 kDa is absorbed by the expression product of the synoviolin gene. In addition, these bands and the Synoviolin remains The gene expression product was found to show reactivity with antibodies present in the blood of RA patients.
  • anti-human synovial cell antibodies have been shown to be highly reactive with the synovial tissue of RA patients.
  • SL Synoviolin ligand
  • S1-5 a known gene called S1-5 contains a common nucleotide sequence in the 5'-terminal region and the 3'-terminal region. Natsuta The SL and S1-5 isolated by the present inventors have almost the same gene size, expression product molecular weight, etc.
  • S 5 [called “FBNL” (fibrill in-like) or “EFEMP1” (EGF-containing fibrillin—like extracellular matrix protein 1) is called human diploid fibroblast (human diploid). fibroblast) as a single gene (Xecka-Czemik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995). Structurally, it has an EGF-like domain (Epidermal Growth Factor-like dome in) that promotes DNA synthesis. SI-5 has been found to have an activity of promoting structure and nucleic acid synthesis (proliferating activity of Itoda cells). Recently, the mutation of S1-5
  • the present inventors produced transgenic mice into which the synoviolin gene was introduced and knockout mice in which the synoviolin gene had been deleted, and observed their phenotypes.
  • the Synoviolin molecule was overexpressed in mice, the joints showed synovial hyperplasia, bone and cartilage destruction, and showed symptoms very similar to chronic rheumatoid arthritis.
  • the Synoviolin gene was completely deleted (homo), Incomplete limb bud development and skeletal formation were noted.
  • the present inventors have completed the present invention by clarifying the utility of synoviolin and its gene, its antibody, or ligand for the treatment and diagnosis based on these novel findings. Furthermore, the present inventors have produced transgenic animals into which the synoviolin gene has been introduced, and have shown their usefulness as RA disease models. The present inventors have also created knock-in animals in which the synoviolin gene has been replaced with the lacZ gene. Knock-in animals with the synoviolin gene can analyze the effects of the synoviolin gene deficiency and detect LacZ (as ⁇ -galactosidase activity) expressed by the endogenous promoter of the synoviolin gene to detect the activity of the synoviolin gene promoter. Can be easily detected.
  • the gene found by the present inventors is closely related to the proliferation of synovial tissue, which is the main site of RA disease, and provides extremely important information in diagnosis.
  • the gene of the present invention involved in the growth of synovial tissue which is the cause of R R, its expression product, autoantibodies to the expression product, and the ligand of the expression product are also essential substances for explaining the pathology of RA. it is conceivable that.
  • the presence of autoantibodies that recognize synoviolin in the blood of RA patients offers a completely new approach to the diagnosis of RA.
  • these substances are also developing new approaches to RA treatment. It also brings.
  • synoviolin can be used for the diagnosis of these diseases, and compounds that regulate the binding between synoviolin ligand and synoviolin, compounds that act as ligands for synoviolin, and the like are drug candidates for these diseases.
  • Synoviolin is also expressed in undifferentiated mesenchymal cells during development. Therefore, undifferentiated mesenchymal cells can be separated using a cell sorter or the like with synoviolin as a cell marker. The isolated undifferentiated mesenchymal cells can be used for tissue regeneration in vitro. The ability to reconstruct joints in vitro could be useful in regenerative medicine not only for patients with chronic rheumatism but also for many patients who suffer from joint destruction.
  • the present invention relates to the following Synoviolin proteins, antibodies thereof, polynucleotides encoding the same, uses thereof, Synoviolin ligands and uses thereof, and transgenic animals having altered Synoviolin gene expression and uses thereof.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 which has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • [5] A vector into which the polynucleotide of [1] or [2] has been inserted.
  • [6] A transformed cell that carries the polynucleotide of [1] or the vector of [5].
  • the protein according to [3] to be analyzed is present in synovial cells.
  • a method for measuring an antibody that binds to the protein according to [3] and / or a partial peptide thereof in a biological sample comprising the following steps:
  • a method for measuring the protein according to [3] and / or a partial peptide thereof in a biological sample comprising the following steps:
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof;
  • a method for measuring the polynucleotide according to [1] or [2] in a biological sample comprising the following steps:
  • a method for detecting rheumatoid arthritis comprising the following steps, wherein the marker for rheumatoid arthritis is the polynucleotide according to [1], the protein according to [3], [3] A method which is at least one marker selected from the group consisting of the peptide of [3], an antibody that binds to the protein of [3], and an antibody that binds to the peptide of [3].
  • step ii) Step of relating the detection result of step i) to rheumatoid arthritis
  • the biological sample is blood of a subject
  • the rheumatoid arthritis marker is an antibody that binds to the protein according to (3) and / or an antibody that binds to the peptide according to (3); 23].
  • the biological sample is a subject's synovial tissue or synovial cells, and the marker for rheumatoid arthritis is the polynucleotide according to [1], and Z or the protein according to [3]. 3].
  • test compound a) contacting the test compound with the protein or peptide described in (3);
  • b) a step of observing the binding between a test compound and the protein or peptide [27] a method for screening a compound having an activity of binding to a protein or peptide according to [3], comprising the following steps: a) detecting the binding activity of the test compound to the protein or peptide according to [3] by the method according to [26]; and
  • a method for detecting an activity of inhibiting the binding of the protein of [3] to a ligand thereof comprising the following steps.
  • Step of selecting a high test compound [31] A method for detecting the activity of the test compound, which regulates signal transduction by the protein according to [3], comprising the following steps.
  • test compound a) contacting the test compound with the protein in the presence or absence of a ligand for the protein
  • [34] A method for screening a compound that regulates the expression of the polynucleotide according to [1], comprising the following steps.
  • a synoviolin stimulant comprising a compound obtainable by the screening method according to [27] as an active ingredient.
  • a binding inhibitor for synoviolin and a synoviolin ligand comprising as an active ingredient a compound obtainable by the screening method according to [30].
  • a synovial growth inhibitor comprising, as an active ingredient, a compound obtainable by the screening method of [30] or [32].
  • the polynucleotide of (1) or (2) is introduced exogenously, (3
  • transgenic non-human vertebrate in which expression of the endogenous polynucleotide according to any of [1] or [2] is suppressed.
  • transgenic non-human vertebrate of [42] wherein another gene is knocked-in;
  • the present invention also relates to a method for stimulating Synoviolin, comprising a step of administering a compound obtainable by the screening method according to [27].
  • the present invention relates to a method for inhibiting the binding between synopiolin and a synopiolin ligand, comprising a step of administering a compound obtainable by the screening method according to [30].
  • the present invention can be obtained by the screening method of [30] or [32].
  • a method for inhibiting synovial hyperplasia comprising the step of administering a compound capable of.
  • the present invention provides a polynucleotide selected from the group consisting of the polynucleotide according to (1) or (2), the protein or peptide according to (3), and the vector according to (5).
  • the present invention relates to a method for promoting synovial hyperplasia, which comprises the step of administering. Further, the present invention provides a method for regulating the expression of the polynucleotide according to (1), which comprises a step of administering a compound obtainable by the screening method according to (34) or (47). About.
  • the present invention also relates to the use of a compound obtainable by the screening method described in [27] in the production of a stimulant for synoviolin.
  • the present invention also relates to the use of a compound obtainable by the screening method described in [27] in the production of a stimulant for synoviolin.
  • the present invention also relates to the use of a compound obtainable by the screening method described in [27] in the production of a stimulant for synoviolin.
  • the present invention also relates to the use of a compound obtainable by the screening method described in [27] in the production of a stimulant for synoviolin.
  • [30] use of a compound obtainable by the screening method described in [30] in the manufacture of a binding inhibitor for synoviolin and a synopiolin ligand. Furthermore, the present invention relates to the use of a compound obtainable by the screening method of [30] or [32] in the production of a synovial hyperplasia inhibitor. In addition, the present invention relates to any one of the components selected from the group consisting of the polynucleotide according to (1) or (2), the protein or peptide according to (3), and the vector according to (5). For the production of a synovial growth promoter. Furthermore, the present invention relates to the use of a compound obtainable by the screening method of [34] or [47] in the manufacture of a pharmaceutical preparation for regulating the expression of the polynucleotide of [1]. About.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding synoviolin comprising the protein coding region having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA. Further, it may contain a modified nucleotide.
  • the polynucleotide encoding synoviolin according to the present invention can be cloned from the synovial cells of the RA patient by a known method (Nucleic Acid Res. 16: 7583-7600, 1988). Specifically, a cDNA library was prepared based on raRNA extracted from synovial cells derived from synovial tissues and tissues that developed arthritis of RA patients collected as cultured cells. Get an library (Nucleic Acid Research, 16, 7583, 1988). The synoviolin gene can be isolated by screening the hybridizing clone from this library using a probe set based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also includes a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the synoviolin described above.
  • a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to Synoviolin is referred to as a polynucleotide functionally equivalent to Synoviolin.
  • a functionally equivalent protein can firstly indicate a protein that is immunologically equivalent to synoviolin. That is, the protein functionally equivalent to synoviolin in the present invention can be a synoviolin domain as long as it specifically recognizes synoviolin and reacts with an antibody present in the serum of RA patients. Alternatively, it can be a fragment of a protein containing this immunologically active domain. These mutants can be easily selected by those skilled in the art by screening a fragment of Synoviolin using a serum panel of RA patients and sera of normal individuals.
  • Proteins functionally equivalent to Synoviolin according to the invention are defined not only on the basis of their immunological properties but also on the basis of their binding properties to SL (S1-5). That is, the present invention includes a fragment of Synoviolin having affinity for SL (S1-5). These mutants can be easily selected by those skilled in the art by screening candidate proteins using SL (S1-5). For example, SL (S1-5) found by the present inventors requires 120 amino acid residues corresponding to 1233-1592 in the cDNA of synoviolin as a region necessary for binding to synoviolin as shown in the Examples. . Therefore, a protein comprising the amino acid sequence constituting this region or a protein comprising this amino acid sequence constitutes a protein functionally equivalent to the synoviolin according to the present invention.
  • accession number AAA65590 (nucleotide accession U03877), 138449, NP-061489 (nucleotide accession marauder-018894), NP 004096 (nucleotide accession awake_004105), or the SI-5 protein specified in Q12805, or a protein similar thereto and having an activity of binding to the human synopiolin protein (SEQ ID NO: 2).
  • Proteins functionally equivalent to human synoviolin include proteins having an activity to promote synovial hyperplasia. In the transgenic mice into which the human sinobiolin gene had been introduced, a significant frequency of finger swelling accompanied by arthritis was observed. Histologically, these finger joints showed bone destruction with synovial hyperplasia and abnormal bone formation. Proteins functionally equivalent to the human synoviolin protein are also defined based on their activity in promoting synovial hyperplasia. The promotion of synovial healing can be verified by producing transgenic animals, or by local gene transfer into joints or by expressing proteins in in vitro cultured synovial cells. A method for obtaining a transgenic animal using the polynucleotide of the present invention will be described later.
  • Proteins functionally equivalent to human synoviolin include proteins having an activity contributing to normal bone formation or limb development. Synoviolin is strongly expressed in the bone and cartilage, such as the parietal bones, limbs, and ears, during development. During limb formation, Apical Ectodermal Ridge (AER) and cartilage and osteogenesis Strong expression was observed in the group. In knockout mouse embryos in which the endogenous synoviolin gene has been deleted by targeting, the length from the crown to the buttocks is short, and the formation of the skull and limbs tends to be immature. Morphological abnormalities were seen in the jawbone and ears, and a high probability of fetal death occurred.
  • AER Apical Ectodermal Ridge
  • Synoviolin gene homono In the case of quat mice, abnormal development of limb buds was observed during the embryonic period, formation of cartilage and bone was not observed, and synoviolin expression was observed in limb buds, cartilage and bone development sites. Is involved in skeletal formation and limb development.
  • LacZ expression in cells derived from synoviolin knockout (knock-in of the lacZ gene) mouse embryonic limb buds was considered to be the origin of cartilage 'bone and limb during undifferentiation. It was found only in leaf cells. Furthermore, it was confirmed by bone knockout caloriphosphatase staining, Kossa staining, and the like that the bone-cartilage-forming ability was delayed in cells derived from homo-knockout. Involvement in normal bone formation or limb development can be verified by the production of knockout animals, as well as analysis of the expression of bone and chondrocyte marker genes in in vitro culture and analysis of bone formation ability. It is also conceivable to do it.
  • the fact that a certain protein has an activity contributing to normal bone formation or limb development indicates that the protein encoded by the polynucleotide in a knockout animal or a cultured cell in which the expression of the polynucleotide of the present invention is suppressed. Can also be confirmed by complementation of the function lost by administration of DNA or expression of DNA or RNA encoding the protein.
  • proteins functionally equivalent to synopiolin according to the present invention are also defined based on the biochemical activity of synopiolin.
  • the biochemical activity of synopiolin can indicate, for example, tyrosine kinase ubiquitin ligase activity. These biochemical activities are supported by various motifs found in synopiolin and the results of Examples. That is, the present invention includes a Synoviolin fragment that retains at least one biochemical activity of Synoviolin. The method for confirming the synergistic activity of Synoviolin and the regions retaining the respective synergistic activities will be specifically described later.
  • proteins functionally equivalent to Synoviolin can be fusion proteins with other proteins.
  • FLAG tag, HA tag, or Histige A protein having an additional amino acid sequence such as a tag and maintaining at least one property as a protein functionally equivalent to the synoviolin is included in the functionally equivalent protein.
  • the protein to be added If the protein has an activity different from that of synoviolin, or if at least one function of synoviolin is maintained, the fusion protein is included in the functionally equivalent proteins according to the present invention. It is.
  • the polynucleotide composed of a base sequence containing a mutation with respect to the polynucleotide of the present invention can also be prepared by a method known to those skilled in the art (Experimental Medicine Supplement, Genetic Engineering Handbook, pp. 246-251, Yodosha, 1991) ). For example, by screening a library containing similar genes for the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or a fragment thereof) as a probe, it is possible to clone a DNA having a highly homologous nucleotide sequence. is there. Examples of such a library include a library obtained by randomly mutating the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a cDNA library of a synovial tissue derived from a species other than human.
  • the circular double-stranded vector in which the gene to be mutated is cloned is made into a single-stranded vector, and a synthetic oligonucleotide having a mutation at a target site is hybridized.
  • a phase-separated single-stranded DNA derived from a vector that has been cut and linearized with a restriction enzyme is annealed to the circular single-stranded vector, and the gap between the synthetic nucleotide and the synthetic nucleotide is filled with DNA polymerase.
  • the number of amino acids to be c- modified by further ligation to form a complete double-stranded circular vector is typically within 50 amino acids, preferably 30 amino acids. It is considered to be within amino acids, more preferably within 5 amino acids (eg, 1 amino acid).
  • the protein of the present invention includes a protein in which a conservative substitution has been added in the above amino acid substitution, and which is functionally equivalent to the human synoviolin protein (SEQ ID NO: 2). Conservative substitutions are considered to be important, for example, when substituting amino acids in domains important for protein activity. Such conservative substitutions of amino acids are well known to those skilled in the art.
  • amino acid group corresponding to the conservative substitution examples include basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), unloaded electrodes ⁇ "raw amino acids (eg, glycine, asparagine) , Gnoretamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar amino acids (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, pheninolealanine, methionine, tryptophan), J3-branched amino acids (eg, threonine, valine, Iso-isocyanate), and aromatic amino acids (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) and the like.
  • basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic
  • non-conservative substitution increases (eg, includes a constitutively activated protein) or decreases (eg, includes a dominant negative) the activity of the protein.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 one or more amino acids have the amino acid sequence of substitution, deletion, insertion, and Z or addition, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • Proteins that are functionally equivalent to proteins consisting of amino acid sequences include naturally occurring proteins.
  • eukaryotic genes have polymorphism, as is known for interferon genes and the like.
  • One or more amino acids may be replaced, deleted, inserted, and / or replaced by a change in the nucleotide sequence caused by this polymorphism. May be forced tl.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 which is a naturally occurring protein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, or substituted or added with an amino acid sequence.
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and functionally equivalent thereto is included in the present invention.
  • the present inventors confirmed the clone in which one amino acid had been deleted by cloning the gene of the present invention from a plurality of individuals and determining its base sequence.
  • a protein having a mutation in the amino acid sequence and a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the same are included in the present invention.
  • the nucleotide sequence of a clone lacking one amino acid confirmed by the present inventors is shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence encoded by this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 lacks gca corresponding to 1293-1295 in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 lacks Ala at position 412 in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence may not change even though the nucleotide sequence changes due to the polymorphism.
  • Such a mutation in the base sequence is called a silent mutation.
  • a gene consisting of a nucleotide sequence having a silent mutation is also included in the present invention.
  • the polymorphism means that a certain gene has a different base sequence between individuals in a population. Polymorphism is independent of the rate at which different genes are found.
  • a method for obtaining a protein functionally equivalent to synoviolin a method utilizing hybridization can be mentioned. That is, a polynucleotide that encodes the Synoviolin according to the present invention as shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof is used as a probe, and a polynucleotide that can hybridize with the polynucleotide is isolated. If hybridization is performed under stringent conditions, a polynucleotide with high homology is selected as the base sequence, and the resulting isolated protein includes a protein functionally equivalent to Synoviolin The likelihood is increased.
  • a highly homologous base sequence can show, for example, 70% or more, preferably 90% or more identity.
  • the stringent conditions specifically include, for example, 6 XSS (:, 40% formamide,
  • Hybridization at 25 ° C and washing at 1X SSC @ 55 ° C can be indicated.
  • Stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, or temperature. It is obvious that those skilled in the art will set these conditions to obtain the required stringency.
  • a polynucleotide encoding a synoviolin homolog in an animal species other than human can be isolated.
  • Synoviolin homologs encoded by polynucleotides obtainable from animal species other than humans, ie, mouse, rat, rabbit, swine, goat, etc., are functionally equivalent proteins in the present invention. Constitute.
  • the polynucleotide according to the present invention may have any origin. That is, it can be obtained by the synthesis and synthesis of cDNA and genomic DNA. Also, a polynucleotide having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as the protein of the present invention can be coded.
  • Proteins obtained by introducing mutations into human synoviolin (SEQ ID NO: 2) and proteins encoded by polynucleotides isolated using the above-described hybridization techniques are usually human synoviolin (SEQ ID NO: 2) And high homology in the amino acid sequence.
  • High homology refers to sequence identity of at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of the nucleotide sequence amino acid sequence can be determined using a homologous search site using the Internet [eg, FASTA, BLAST, PSI BLAST in Japan DNA Data Bank (DDBJ).
  • homology search such as SSEARCH can be used [For example, the website of the Japan DNA Data Bank (DDBJ) website for homology search (Search and Analysis); http://www.ddbj.nig.ac . jp / E-mail / homology -j. html] 0 or 7 this, in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) , it is possible to perform a search using the BLAST BLAST of (for example, the NCBI website web site Ncbi. Nlm. Nih. Gov / BLAST /; Altschul, SF et al., J. Mol. Biol., 1990, 215 (3): 403-10; Altschul, SF & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266: 460-480; Altschul, SF et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25: 338 9-3402)].
  • the blastp is used as the program, the Expect value is 10, the filters are all turned off, the BL0SUM62 is used as the matrix, the Gap existence cost, Per residue gap cost , And Lambda: search with the ratio set to 11, 1, 0.85 (default value), respectively, to obtain the identity value (%) (Karlin, S. and SF Altschul (1990) Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 87: 2264-68; Karlin, S. and SF Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7).
  • the present invention also provides uses other than protein production of these polynucleotides. That is, the present invention includes a polynucleotide encoding synoviolin provided by the present invention, or an antisense polynucleotide against a part thereof. Antisense preferably has a chain length of about 15-20 nucleotides, in order to effectively inhibit gene transcription. Given that synoviolin supports the abnormal growth of synovial cells, the role of synoviolin antisense in treating RA is significant. From the viewpoint of controlling gene expression, it is possible to design not only antisense but also ribozymes. That is, a ribozyme that recognizes RNA transcribed from the coding region of the DNA represented by SEQ ID NO: 1 and cleaves it can be designed.
  • the present invention also relates to polynucleotides having a chain length of at least 15 nucleotides which are complementary to these polynucleotides of the present invention or their complementary strands.
  • These polynucleotides are preferably polynucleotides having a chain length of at least 20 nucleotides, more preferably at least 25 nucleotides, and even more preferably at least 30 nucleotides, which are complementary to the above-described polynucleotide of the present invention or a complementary strand thereof. is there.
  • “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U for RNA) and G: C base pairs.
  • the term “complementary” is not limited to a case where the sequence is completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95%. Includes base sequences having homology on the base sequence of at least%.
  • the algorithm described in this specification can be used as an algorithm for determining homology. These include, for example, polynucleotides that hybridize with the above-mentioned polynucleotides of the present invention and have a chain length of at least 15 nucleotides.
  • the hybridization is specific for a polynucleotide of the invention.
  • specific is meant that under stringent hybridization conditions, there is no significant cross-hybridization with polynucleotides encoding other proteins.
  • the probe or primer according to the present invention has a chain length of at least about 15 mer so that specific hybridization can be performed with a given stringency group. Those having a base sequence capable of hybridizing to a sequence specific for synoviolin are preferred. It is obvious for a person skilled in the art to set a useful base sequence for a probe or primer based on a given base sequence.
  • the use of the synopiolin gene-specific probe or primer provided according to the present invention enables in situ hybridization-PCR of a synovial cell specimen. Since synopiolin is strongly expressed in the synovial tissue of RA patients, understanding its expression in the cells may provide important information for understanding RA joint inflammatory conditions.
  • Synopolin a novel protein according to the present invention, can be obtained from synovial tissue of RA patients. Since synovial cells can be cultured in vitro, it is possible to recover synoviolin from this culture. Specifically, synovectomy from RA patients
  • synovial cells can be recovered as adherent cells (J. Clin. Invest. 92: 186-193, 1993).
  • Synovialin is extracted and purified from the recovered cells by combining known protein purification techniques.
  • the present invention includes not only human synopiolin extracted from smooth B cells but also proteins functionally equivalent to synoviolin. That is, the protein of the present invention, whether artificial or naturally occurring, has one or more amino acids in the amino acid sequence of human synoviolin (SEQ ID NO: 2) substituted, deleted, or added. And / or a protein mutated due to insertion, etc., which is functionally equivalent to human synoviolin.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in these proteins are not limited as long as the function of Synoviolin is maintained.
  • Synoviolin fragments can be obtained by digestion with a protease. It can also be obtained by randomly cutting DNA encoding synoviolin shown in SEQ ID NO: 1 and inserting it into a phage vector to produce a phage library displaying domain peptides. be able to. If these libraries are subjected to immunoscreening with an antibody that recognizes synopiolin, immunologically active domains can be determined.
  • the method for specifying an immunologically active domain can be used as it is as a method for specifying a domain having ligand-binding activity. By determining the nucleotide sequence of the inserted fragment of the cloned phage, the amino acid sequence of the active tenusei domain can be determined.
  • the protein according to the present invention may have been subjected to physiological modifications such as bran chains, labels such as fluorescent or radioactive substances, or various modifications such as fusion with other proteins. It can be a protein.
  • physiological modifications such as bran chains, labels such as fluorescent or radioactive substances, or various modifications such as fusion with other proteins.
  • It can be a protein.
  • the sugar chain modification may differ depending on the host to be expressed.
  • any synoviolin according to the present invention or a functionally equivalent protein as long as it exhibits the same properties as the synoviolin protein disclosed herein. is there.
  • the violin can be obtained not only as a biomaterial but also as a recombinant by incorporating the gene encoding it into an appropriate expression system.
  • the aforementioned polynucleotide encoding Synoviolin may be incorporated into an appropriate expression system and expressed.
  • Examples of the host / vector system applicable to the present invention include an expression vector pGEX-5X-3 and Escherichia coli. Since pGEX-5X-3 can express a foreign gene as a fusion protein with daltathione S-transferase (GST) (Gene, 67: 31-40, 1988), pGEX-5X-3 incorporating the gene encoding synoviolin introducing 5X- 3 the E.
  • GST daltathione S-transferase
  • coli strain such as BL21 by heat shock, iso after a suitable incubation time P ropylthio_ i3 - D - by adding g alactoside (IPTG) to induce expression of GST fusion Shinobiorin.
  • a gene encoding sinopiolin can be obtained by amplifying by PCR or the like a type I cDNA library of synovial cells and the like. Since GST according to the present invention is adsorbed to daltathione sepharose 4B, the expression product can be easily separated and purified by affinity chromatography.
  • Other host Z vector systems for obtaining Synoviolin recombinants include the following.
  • a bacterium when used as a host, vectors for expressing a fusion protein using a histidine tag, an HA tag, a Flag tag, and the like are commercially available.
  • yeasts it is known that yeast of the genus Genus is effective in expressing a protein having a sugar chain.
  • an expression system using a noculovirus vector using an insect cell as a host is also useful (Bio / Technology, 6: 47-55, 1988).
  • transfection of vectors using promoters such as CMV, RSV or SV40 has been carried out using mammalian cells. Can be used as a system.
  • the gene can also be introduced using a virus vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • Novel protein synoviolin provided by the present invention A protein equivalent to is useful in the diagnosis of RA using its immunological features.
  • Antibodies recognizing Synoviolin are frequently detected in the blood of RA patients, and are virtually not detected in the blood of normal subjects. Therefore, the immunological analysis of the antibody possessed by the subject using the synoviolin according to the present invention as an antigen provides useful information in the diagnosis of RA. That is, when an antibody that reacts with synoviolin is detected in the body fluid of the subject, the subject can be diagnosed as RA.
  • the method of reacting an antigen-sensitized plate with an antibody in a sample and detecting the antibody to be detected captured on the plate surface with an antibody-specific labeled antibody is one of the immunological analysis methods for antibodies. Both methods are popular (Immunochemistry, 8: 871-879, 1971). A method using an enzyme for labeling is called an ELISA method, and is widely used. A method is also known in which latex particles on which an antigen is adsorbed are mixed with a sample to detect an antibody as an immunological agglutination reaction (Am. J. Med., 21: 888-892, 1956). Immunological particle agglutination is a method that enables rapid analysis with one reagent, and is a suitable method for large-scale screening.
  • the immunochromatography method has been generalized as a simple analysis method.
  • a reaction system in which an antibody in a sample inhibits a reaction between a labeled synoviolin and an anti-synoviolin antibody is constituted.
  • a sample is first contacted with labeled synoviolin, and the sample is arranged so as to be in contact with an anti-synoviolin antibody as a reagent component by chromatographic development.
  • the Synoviolin antibody is present in the sample, the labeled Synoviolin has already reacted, and therefore cannot react with the anti-Synoviolin antibody as a reagent component. If an anti-Synoviolin antibody is immobilized and the reaction state of the labeled Synoviolin in that region is observed, it is possible to perform immoassay only by dropping a sample.
  • an antibody such as IgG or IgM that can identify the class of immunoglobulin may be combined.
  • Infectious diseases usually show a rise in IgM antibody measurement at the initial stage of infection, followed by a transition in which IgM antibody measurement decreases and IgG antibody measurement increases.
  • class-specific antibody measurements may also be relevant to the clinical symptoms of RA in the present invention. More specifically, class-specific measurement of antibodies may lead to judgment of drug efficacy and prediction of RA onset.
  • a method using not only the antigen molecule itself but also a chemically synthesized oligopeptide as an antigen is often adopted. This is because a non-specific reaction is less susceptible to an assay system that is particularly predominant, or has a clinically meaningful epitope specificity. This approach is also valid for synopiolin.
  • a domain that functions as an epitope can be determined based on the above-described method for obtaining an immunologically active domain peptide. It is known that epitope can be composed of at least three amino groups. It is said that immunological discrimination from other proteins can be achieved with at least 8 amino acid residues.
  • the fragment that reacts with the above antibody is desirable as an antigen for detecting an antibody in the present invention.
  • those skilled in the art also know how to improve the immunological reactivity by adding various modifications to the oligopeptide constituting the epitope. For example, inactive proteins such as human serum albumin, or modifications, such as the addition of meaningless amino acid sequences, contribute to the improvement of immunological reactivity.
  • Synoviolin a protein functionally equivalent thereto, or a partial peptide thereof useful for the method for detecting RA according to the present invention is used as an immunological analysis reagent for analyzing antibodies recognizing these molecules. be able to.
  • the reagent for immunological analysis according to the present invention is useful for diagnosing RA and judging the therapeutic effect.
  • the Synoviolin according to the present invention also enables the development of a vaccine for treating or preventing RA. Synoviolin is thought to contribute to the proliferation of synovial cells by binding to its ligand, so if a vaccine that provides an antibody that blocks the binding of Synoviolin to its ligand would be provided, treatment and prevention of RA would be possible. Realize.
  • a vaccine for synoviolin is prepared by combining it with an adjuvant or carrier protein that induces immunostimulation with the domain peptide of synoviolin, which is originally a human protein, with a focus on the domain peptide that is a synoviolin epitope. It is.
  • the present invention provides an antibody that recognizes Synoviolin.
  • Synoviolin antibodies can be obtained by known methods using the synopioline according to the present invention or an immunologically equivalent protein or a fragment thereof as an immunogen.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by normal immunization (Harlow, E. & Lane, D .; Antibodies; A Laboratry manual. Cold Spring Harbor, New York, 1988). Can also be used to obtain a monoclonal antibody (Kohler, G. & Milstein, Nature 256: 495-7, 1975). Monoclonal antibodies are an important tool for achieving high sensitivity and specificity in Immunity.
  • an immunized animal is immunized with the synoviolin according to the present invention (or an immunologically equivalent protein or a fragment thereof) together with a suitable adjuvant.
  • a synoviolin fragment useful as an immunogen a peptide containing the following amino acid sequence can be shown.
  • An immunogen prepared by linking these peptides to a carrier protein gives an antibody that is specific for synoviolin and has sufficient binding affinity.
  • Carrier proteins to obtain the immunogen include keyhole limpet hemocyanin (KLH), (BSA) can be used. Eggs, mice, rats, goats, or sheep are commonly used as immunized animals. As an adjuvant, Freund's complete adjuvant (FCA) or the like is generally used (Adv. Tubercl. Res., 1: 130-148, 1956). Immunization is added at appropriate intervals, and when an increase in antibody titer is confirmed, blood can be collected to obtain antiserum. Further, if the antibody fraction is purified, it can be used as a purified antibody.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • a monoclonal antibody can be obtained by collecting antibody-producing cells and cloning by cell fusion or the like.
  • antibody-producing cells besides those derived from immunized animals, antibody-producing cells collected from RA patients that produce autoantibodies to synoviolin can also be used.
  • chimeric antibodies and humanized antibodies can be constructed based on the antibody genes of monoclonal antibody-producing cells derived from the immunized animal thus obtained. When antibodies are administered to humans, the antibodies in animals are undesirable because they are eliminated as foreign substances.
  • a chimeric antibody in which the constant region of an antibody with high antigenicity is replaced with a human antibody, or a humanized antibody in which the framework of the variable region as well as the constant region is replaced with a human gene is required.
  • a human antibody can be reconstituted, so that a highly safe antibody can be constructed more easily.
  • the chimeric antibody or humanized antibody that recognizes synopiolin provided according to the present invention is useful for a drug delivery system (DDS) targeting synovial cells of RA patients.
  • DDS drug delivery system
  • examples of substances that can be expected to be useful by linking to the antibody include Fas ligand II and anti-SL antibody.
  • the antibodies of the present invention are useful for detecting synoviolin.
  • Synoviolin is strongly expressed in synovial tissue of RA patients. Therefore, detection of synoviolin in synovial cells, synovial tissue, or body fluids provides useful information in the diagnosis of RA. Specifically, when synoviolin is detected in synovial tissue or blood, RA progresses. It is thought that it is running.
  • the antibody of the present invention can be used as a reagent for immunological detection of synoviolin. Methods for immunologically detecting proteins present in tissues and blood using antibodies are known.
  • the immunological analysis reagent containing the antibody of the present invention is useful for diagnosing RA and judging the therapeutic effect.
  • the antibody of the present invention can be used for separating or detecting cells expressing Synoviolin.
  • the synoviolin protein of the present invention was expressed in AER during development, and was also strongly expressed in undifferentiated mesenchymal cells that serve as primordia of synovium, bone / cartilage and limbs.
  • Synoviolin can be used as a marker for AER and undifferentiated mesenchymal cells. That is, AER and undifferentiated mesenchymal cells can be detected or separated using the expression of synoviolin as an index.
  • the antibody is appropriately labeled with fluorescence or the like.
  • cells expressing synopiolin can be separated by cell sorting or the like using an antibody against synoviolin.
  • the isolated undifferentiated mesenchymal cells are useful for in vitro bone and cartilage formation or joint reconstruction.
  • stroma such as bone, cartilage, muscle, tendon, fat, and bone marrow are formed in vitro (in vitro) or in vivo (in vivo) ( S.
  • undifferentiated mesenchymal cells can be differentiated in vitro to produce cells of the adipocyte lineage (adipocytic lineage), chondrocytic lineage, and osteocytic lineage (oste ocytic lineage) ( MF Pittenger et al., Science 284, 143-7, 1999).
  • adipocyte lineage adipocytic lineage
  • chondrocytic lineage chondrocytic lineage
  • osteocytic lineage osteocytic lineage
  • Adipocyte differentiation can be induced, for example, by treatment with 1-methyl-3-isobutylxanthine, dexamethasone, insulin, and indomethacin (M.
  • chondrocytes can be achieved, for example, by making the cells into microclusters by centrifugation or the like, and then stimulating them with transforming grow factor (TGF)- ⁇ 3 in a serum-free medium (AM Mackay et al., Tissue Eng. 4, 415-28, 1998; JU Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80A, 1745-57, 1998).
  • TGF transforming grow factor
  • Osteocyte differentiation can be induced with dexamethasone, jS-glycerol phosphate, and ascorbic acid, for example, in the presence of 10% fetal calf serum (SA Kuznetsov et al., J. Bone Miner. Res. 12, 1335-47, 1997; DJ Prockop Science 276, 71-4, 1997; CM Thompson and RA
  • chondrocytes in utero
  • fat cells muscle cells
  • cardiomyocytes bone marrow stromal cells
  • thymic stromal cells thymic stromal cells
  • undifferentiated mesenchymal cells can be isolated in vitro.
  • the tissue can be reconstructed in vivo. The reconstructed tissues and organs are expected to have regenerative medicine applications.
  • Synoviolin since Synoviolin is strongly expressed in rheumatoid synovial cells, it can be used as a cell marker for rheumatoid synovial cells.
  • the antibody of the present invention when used as a reagent for separating or detecting cells, the antibody can be combined with another solvent or solute to form a composition. For example, distilled water, pH buffer reagents, salts, proteins, surfactants, and the like can be combined.
  • Synoviolin is strongly expressed in synovial tissue of RA patients. In the blood of RA patients, antibodies (autoantibodies) that recognize synoviolin are frequently detected. On the other hand, synoviolin antibodies cannot be substantially detected in the blood of healthy subjects. In addition, Synoviolin inhibits the growth of cultured synovial cells in the mouth of Invito. This is considered to be because Synoviolin competes with a ligand that promotes the proliferation of synovial cells. Based on this information, the following mechanism can be expected. In other words, synoviolin strongly expresses synovial cells in synovial cells S, and promotes binding of synoviolin to a synoviolin ligand having a growth-promoting action on synovial cells, and as a result, proliferation of synovial cells is promoted. And the abnormal proliferation of synovial cells is nothing but the pathology of RA.
  • the present invention provides a method for detecting or diagnosing rheumatoid arthritis, comprising the following steps.
  • markers can be used as a marker in the method of detecting or diagnosing RA in the present invention.
  • the method for measuring these markers is as described above.
  • Synoviolin or a peptide functionally equivalent to Synoviolin
  • Antibodies that bind to Synoviolin or peptides that are functionally equivalent to Synoviolin For example, if a blood sample collected from a patient is found to react with Synoviolin or a protein or peptide that is functionally equivalent to Synoviolin, The patient is likely to have RA. Alternatively, the expression of synoviolin or a protein functionally equivalent to synoviolin in synovial tissue collected from a patient is indicative of synovial tissue formation due to RA. Protein expression can be detected using the presence of the protein or mRNA as an indicator.
  • the synoviolin of the present invention provides a new approach to the development of a therapeutic agent for RA.
  • a Synoviolin ligand can be detected using the binding activity to Synoviolin as an index. That is, the present invention relates to a method for detecting a binding activity to synoviolin, comprising the following steps.
  • the screening method of the present invention specifically includes the following steps. a) detecting the binding activity of the test compound to synoviolin or a protein functionally equivalent to synoviolin by the method for detecting binding activity to synoviolin, and
  • the candidate compound for the ligand may be not only a natural substance or a mutant thereof, but also a low-molecular organic compound.
  • the binding between the protein and the scavenger compound can be directly detected by labeling the scavenger compound.
  • the binding activity of the compound f can be evaluated by further contacting SL after contacting the candidate conjugate with the protein of the present invention.
  • binding inhibition is used as an index, only the known SL is required for labeling, which is a simple screening method.
  • step a) it is preferable to perform the same operation as in step a) in the absence of the test compound.
  • the test compound may be contained at a lower concentration than in step a).
  • the same operation as in step a) can be performed using a molecule known to bind to Synoviolin instead of the test compound, and a compound having a higher binding activity than that molecule can be selected.
  • a screening method for a ligand based on the gene described in the examples is possible.
  • a gene encoding a protein that binds to Synoviolin can be screened from a library containing genes encoding candidate ligands. This method is useful when screening natural ligands.
  • the ligand can be cloned by expression screening using a phage library incorporating cDNA and labeled Synoviolin. The present inventors have discovered SL, a natural ligand for Synoviolin, by this screening method.
  • SL may bind to synoviolin on the synovial cell surface and stimulate cell proliferation
  • measurement of blood levels of SL may be related to the pathology of RA.
  • SL can be measured based on the binding activity to synoviolin.
  • immunoassay can be performed with an anti-SL antibody, or SL can be measured by a sandwich method combining the two.
  • the present inventors have confirmed that addition of Synoviolin to cultured synovial cells has a suppressive effect on cell proliferation. This can be explained by neutralizing SL in the medium. It is thought that inhibiting the binding of orin to its ligand leads to the suppression of abnormal growth of synovial cells, and consequently has a therapeutic effect on RA.
  • the ligand obtainable by the screening method of the present invention competitively inhibits the binding of synopiolin to its natural ligand, and thus the activity of RA to effectively inhibit synovial cell proliferation (antagonist). Can be expected.
  • synoviolin ligand that can be obtained by the screening method of the present invention can be expected to have the activity of stimulating the activity of synoviolin (agonist) as in the case of the above SL.
  • Ligands that stimulate Synoviolin are useful as Synoviolin stimulants or bone formation promoters. More specifically, a ligand that stimulates Synoviolin can be used as a therapeutic agent for osteoporosis, fracture, or sports trauma.
  • the present invention has been developed by a method for detecting these binding activities and a screening method. Further, the present invention relates to a method for detecting the activity of inhibiting the binding of synoviolin or a functionally equivalent protein thereof to a synoviolin ligand, and a method for screening a compound. Provide a method for monitoring.
  • a method for detecting the activity of inhibiting the binding of synoviolin to a synopiolin ligand according to the present invention includes the following steps.
  • the present invention relates to the following screening methods.
  • step a) detecting the activity of the test compound to inhibit the binding of the test compound to Synoviolin or a protein functionally equivalent to Synoviolin and its ligand, and ) Step of selecting test compound having higher inhibitory activity compared to control
  • the test compound may be contained at a lower concentration than in step a).
  • performing the same operation as in step a) using a molecule known to inhibit the binding of synoviolin to its ligand in place of the test compound, and obtaining a compound having a higher binding activity than the molecule Can also be selected.
  • This screening can also provide compounds that act as antagonists to Synoviolin or a functionally equivalent protein thereof.
  • Synoviolin ligand for example, SL (S1-5) described in Examples can be used.
  • any protein having an activity of binding to the SI5 protein specified by accession number AAA65590, 138449, NP_061489, NP-004096, or Q12805, or a synoviolin protein can be used (Lecka -Czernik, B. et al., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995; Heon, E. et al., Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996; Ikegawa, S. et al.
  • compounds to be screened may be those that bind to the synoviolin side and block the binding to the ligand, and those that block the ligand side.
  • To screen for a compound that binds to the synoviolin side it is advisable to label the ligand and compete with the candidate compound. The opposite is true if a compound that binds to the ligand is a candidate.
  • the synoviolin antagoust obtained in this way is also presumed to have an effect of suppressing the proliferation of synovial cells, and a therapeutic effect for RA can be expected.
  • synoviolin ligand Sl-5 is a causative gene of Malattia Leventinese (ML) and Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD) (Stone, EM et al., Nature Genetics 22, 199-202). , 1999). These diseases produce deposits called crystal cavities (drusen) and exhibit symptoms similar to age-related macular degeneration (AMD). Given these facts, Synoviolin may also be involved in ML and DHRD. Testing for mutations and polymorphisms in Synoviolin may lead to the diagnosis of ML and DHRD. In addition, compounds that act as a Synoviolin ligand, compounds that inhibit the interaction between Synoviolin and S1-5, and the like, obtained by the screening of the present invention, are useful as medicaments that contribute to the prevention or treatment of these diseases. Use is expected.
  • synoviolin of the present invention can be used to evaluate the activity of a compound to regulate signal transduction by synoviolin, or to screen for a compound that regulates signal transduction by synoviolin.
  • the present invention provides a method for detecting the activity of a test compound to regulate signal transduction by synoviolin, comprising the following steps.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound having an activity of regulating synoviolin signal transduction, which comprises the following steps.
  • step a) it is preferable to perform the same operation as in step a) in the absence of the test compound.
  • the test compound may be contained at a lower concentration than in step a).
  • signaling by synoviolin The same operation as in step a) can be carried out using a molecule known to have promoting or inhibiting activity, and a compound having a higher modulating activity than that molecule can be selected.
  • signal transduction by synoviolin means that a stimulus given to synoviolin is transmitted to different molecules.
  • the type of stimulus is not limited. It is known that there are many modes of signaling in organisms.
  • a typical signal transduction is regulation of activity by modification of a protein. For example, the activity of certain proteins is regulated by phosphorylated acetylation. It is also known that the activity is controlled by cleavage of the protein. For more specific protein cleavage, the presence of molecules such as ubiquitin is important.
  • Signal transmission can be detected by using, as an index, a change in the activity or structure of a molecule constituting signal transmission caused by signal transmission. Alternatively, signal transduction can be detected using the formation of a complex for signal transduction as an index.
  • Signaling includes, in particular, phosphorylation or dephosphorylation signals. It is known that many cell proliferation signals are transmitted to downstream signal molecules via protein modification by protein phosphorylation or dephosphorylation. Since the synoviolin of the present invention also has a cell proliferation action, it is suggested that signal transduction via synopiolin is also transmitted by phosphorylation of protein. In fact, the present inventors have found a phosphorylation effect by synoviolin expression. Therefore, signal transmission via synoviolin can be measured by detecting protein phosphorylation.
  • Receptors involved in cell growth or differentiation have the following domains as their enzyme active sites (Experimental Medicine Separate Volume, Bioscience terminology library, revised site cytokine growth factor, Yodosha, 1998) Year).
  • Tyrosine kinase domain (VEGF receptor, PDGF receptor, HGF receptor, EGF receptor, etc.),
  • a tyrosine phosphatase domain such as RPTP
  • Serine / threonine kinase domain TGF beta receptor, etc.
  • violin also directly or indirectly retains these enzyme activities. Having indirectly enzymatic activity means that a molecule associated with synoviolin does not have an enzymatic activity site in the synoviolin molecule but has enzymatic activity.
  • molecules for example, TNF receptor and GM-CSF receptor are known. Therefore, for example, by detecting the phosphorylation activity of tyrosine, serine, and / or threoyun, signal transduction by synopiolin can be evaluated. At this time, by evaluating the effect of the test compound in the presence of the synoviolin ligand, it is possible to evaluate the effect of the test compound on synopiolin signal transduction triggered by the synoviolin ligand.
  • the activity of inhibiting or suppressing signal transduction to synoviolin by a synoviolin ligand can be detected.
  • the Synoviolin ligand the Synoviolin ligand S1-5 described in the present specification can be used.
  • the stimulating activity of the test compound on synoviolin can be evaluated.
  • phosphorylation of a specific amino acid can also be detected using a specific antibody against a phosphoprotein, such as a phosphoric acid schiguchi syn antibody.
  • phosphorylation of a signal transduction factor in a cell is successively transmitted to multiple molecules. In other words, a series of transmission paths forms a cascade. Therefore, by assessing changes in the phosphorylation level of the whole protein in a cell, The magnitude of the phosphoric acid signal can be compared.
  • Methods for evaluating the phosphorylation level of all intracellular proteins are known. For example, after stimulating cells with Synoviolin ligand, etc., develop the protein with SDS-APGE, plot it on a filter, and evaluate the phosphorylation level of the entire protein by Western blot using an anti-phosphorylated tyrosine antibody etc. .
  • cells are labeled with [ 32 P] orthophosphate, and cells are stimulated with a synoviolin ligand or the like, and then cellular proteins are developed by two-dimensional electrophoresis.
  • the protein is stained with Coomassie blue and autoradiographed.
  • the phosphorylation level can be evaluated by detecting the phosphorylated spot.
  • a change in the level of phosphorylation in a phosphorylated protein serving as a substrate for synoviolin can be specifically measured.
  • the phosphorylated protein serving as a substrate for synoviolin can be identified by, for example, recovering a spot phosphorylated in the above-described two-dimensional electrophoresis and conducting microsequence or mass spectrometry. Changes in the phosphorylation level of the identified substrate protein can be determined, for example, by performing immunoprecipitation using a specific antibody against the substrate protein, developing with SDS-APGE, and measuring the incorporation of [ 32 P] by autoradiography. Alternatively, it can be evaluated by Western blotting using an anti-phosphorylated tyrosine antibody (Bio Manual Series, Protein Experimental Methods for Molecular Biology Research, Tadaomi Takebashi, edited by Masaki Inagaki).
  • Examples of cells used in the above method include synovial cells (eg, RTF) and cells into which a synoviolin gene has been introduced exogenously. If the test compound decreases the level of phosphorylation or dephosphorylation by synoviolin, the compound is considered to be a compound that inhibits signal transduction by synoviolin. If the test compound increases the level of synoviolin-induced phosphorylation or dephosphorylation, it is determined that the compound promotes synoviolin-induced signal transduction.
  • the test compound may cause If synphosphorylation is suppressed, this compound is considered to be a compound that inhibits signal transduction by Synoviolin.
  • the present invention also relates to a method of inhibiting signal transduction by synoviolin using an inhibitor of a protein kinase or phosphatase such as, for example, tyrosine kinase, tyrosine phosphatase, or serine / threonine kinase.
  • Another suitable example of signal transduction by synoviolin includes a ubiquitination signal.
  • Protein structure prediction system SMART: Simple Modular Arc hitecture Research Too ⁇ (see website) http: // smart, embl-heidelberg.de/) Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, 1998; Presence of Ring finger motif (Joazeiro, CA et al., Science 286, 309-312, 1999) on synoviolin by Schulttz et al., Ucleic Acids Res. 28, 231-234, 2000) It has been shown. This motif is known to be present in E3 ubiquitin-protein ligase involved in protein degradation. The Ring finger motif is thought to be a binding site for E2 ubiquitin-binding enzyme.
  • signal transduction by synoviolin can be evaluated by detecting the ubiquitination signal by synoviolin.
  • the ubiquitination signal is evaluated, for example, by detecting ubiquitination of the substrate protein using an anti-ubiquitin antibody.
  • the binding of synoviolin to an E2 ubiquitin-conjugating enzyme or a substrate protein, or a ubiquitin ligase complex containing synoviolin may be detected.
  • cells transfected with a vector expressing a tagged Synoviolin are disrupted, [ 32 P] -labeled ubiquitin is added, and the mixture is reacted, followed by immunoprecipitation with an anti-tag antibody.
  • the ubiquitin ligase activity of synopiolin can be detected by developing with SDS-PAGE and performing autoradiography (Hashi Kunststoffae, R. et al., J. Biol. Chem. 276, 14537-14540, 2001). ).
  • Synoviolin substrate protein is, for example, Synoviolin
  • the yeast can be identified by two-hybrid screening or the like. Changes in the level of ubiquitination of the identified substrate protein can be determined by purifying the tagged substrate, adding purified El, E2, E3 and ubiquitin to the substrate, reacting, and immunoprecipitating with an anti-tag antibody. Can be evaluated by staining with an anti-ubiquitin antibody (Yokouchi, M. et al., J. Biol. Chem. 274, 31707-31712, 1999).
  • the compound is determined to be a compound that inhibits signal transmission by synoviolin.
  • the test compound increases the activity of synoviolin-mediated ubiquitination signal, the compound is determined to be a compound that promotes synoviolin-induced signal transduction.
  • a compound that inhibits the interaction between synoviolin and the E2 ubiquitin activating enzyme can effectively inhibit the synoviolin-induced ubiquitination signal.
  • the present invention also provides a method for blocking signal transduction by synoviolin using an inhibitor of an enzyme involved in ubiquitination signal. For example, synoviolin signaling can be inhibited by applying an inhibitor of E2 ubiquitin conjugating enzyme or E3 ubiquitin ligase to cells.
  • a compound having an activity of regulating synoviolin-mediated signal transduction can be selected by the above method.
  • Compounds that inhibit signal transduction by synoviolin are useful as therapeutic agents for diseases caused by synoviolin activation.
  • compounds that inhibit signal transduction by synoviolin are useful as synovial hyperplasia.
  • synovial hyperplasia By administering this compound, synovial hyperplasia can be suppressed, thereby making it possible to prevent and treat diseases associated with synovial hyperplasia such as RA.
  • These compounds can also be used as medicaments against ML and DHRD.
  • the compound that promotes this signal transduction can be used as a synoviolin stimulant, an osteogenesis promoter or the like. For example, it can be used as a therapeutic agent for osteoporosis, fracture, or sports trauma.
  • Synoviolin gene for example, RA and Synoviolin such as: New research on other diseases involving cancer.
  • RA and Synoviolin such as: New research on other diseases involving cancer.
  • the genome can be cloned based on the base sequence of the Synoviolin gene shown in SEQ ID NO: 1 to analyze the sequence of the expression control region.
  • the resulting Synoviolin transcription regulatory region can be used to search for Synoviolin transcription regulators.
  • the marker gene in the Synoviolin knockout animal of the present invention, if the marker gene is knocked-in and the marker gene is expressed under the control of the endogenous promoter of the Synoviolin gene, the marker gene can be obtained using this animal or cells derived from this animal. Drugs that control the expression of the Synoviolin gene can be screened using the expression of the as an index. For example, if a recognition sequence for a transcription regulatory factor is provided as a double strand, it functions as a decoy nucleic acid drug.
  • the biological role of the protein of the present invention in animals can be examined using the polynucleotide of the present invention.
  • the role of the protein of the present invention can be examined by, for example, introducing the DNA of the present invention, overexpressing or ectopically expressing (or ectopically expressing) the protein of the present invention, and verifying the effect. it can.
  • a transgenic animal of the DNA of the present invention may be prepared.
  • a loss-of-function (loss-of-function) experiment in which the expression or function of the DNA of the present invention is suppressed by gene targeting, administration of an antisense oligonucleotide, ribozyme, or the like is also effective. That is, the present invention provides a transgenic non-human vertebrate capable of inducing the alteration of the expression of the DNA of the present invention or the alteration. The expression may be modified as compared to the wild type, and when the modification is induced, may be changed as compared to before the induction.
  • the transgenic animal includes an animal in which a nucleic acid is exogenously introduced into a genome.
  • DNA expression may be the transcription level of DNA or the translation level of the transcript.
  • inducing modification means, for example, This includes expression change induced in an external stimulus and time-specific manner, and expression modification in progeny by crossing. It also includes altered expression in some cells or tissues.
  • mammals for example, mice, rats, hamsters, rabbits, stags, goats, higgins, magpies, and magpies, etc.
  • rodents for example, mice, rats, hamsters, rabbits, stags, goats, higgins, magpies, and magpies, etc.
  • species such as mice or rats.
  • the transgenic non-human vertebrate of the present invention includes a transgenic non-human vertebrate into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced exogenously.
  • a transgenic animal can be produced, for example, by introducing a vector expressing a DNA encoding the protein of the present invention into a fertilized egg.
  • the vector can be introduced by mixing the vector and the egg and then treating with calcium phosphate, electroporation, microinjection under an inverted microscope, or the like.
  • the vector of the present invention may be introduced into embryonic stem cells (ES cells), and the selected ES cells may be introduced into fertilized eggs (pulmonary blastocysts) by microinjection.
  • ES cells embryonic stem cells
  • fertilized eggs pulmonary blastocysts
  • the obtained fertilized egg can be transplanted into the oviduct of a pseudopregnant recipient by mating with a vasectomized male individual to obtain a litter.
  • heterozygotes can be obtained by crossing with a normal animal. Homozygotes can be obtained by crossing heterozygotes.
  • the transgenic non-human vertebrates of the present invention also include these progeny.
  • promoter used to express the DNA of the present invention in vivo examples include, for example, A systemically expressed promoter or other tissue-specific or stage-specific promoters can be used.
  • systemic motors include the actin promoter.
  • a -Peti] 3 actin promoter linked to a human cytomegalovirus enhancer contained in pCAGGS or the like can be used.
  • Cre- ⁇ system or the like When producing a transgenic animal that expresses the DNA of the present invention site-specifically or time-specifically, it is possible to use a Cre- ⁇ system or the like.
  • a transgenic animal having a Cre recombinase gene downstream of a site-specific or time-specific promoter is prepared, and a transgenic animal separately carrying a vector encoding a polypeptide encoding the polypeptide of the present invention downstream of a general-purpose promoter. Create a genetic animal.
  • a stop codon or a transcription termination signal inserted between a pair of ⁇ is inserted between the promoter and the DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be expressed along with the expression of Cre.
  • the transgenic non-human vertebrate of the present invention includes a transgenic non-human vertebrate in which the expression of a DNA encoding the endogenous protein of the present invention is suppressed.
  • a transgenic animal can be produced by, for example, gene targeting.
  • a targeting vector in which part or all of the DNA of the present invention has been deleted by substitution, deletion, addition and / or insertion, etc. 1) Transfect the cells into live stem (ES) cells and select cells that have undergone homologous recombination with chromosomal DNA. For the selection of homologous recombinants, known positive / negative selection can be performed.
  • a drug resistance gene such as the neomycin resistance gene
  • the negative selection marker is the diphtheria toxin (DT) -A gene or the HSV-tk gene.
  • Recombinant cells can be selected The cells obtained are the blastocyst space of a fertilized egg or blastocyst in the 8-cell stage And transplanted into the offspring of a pseudopregnant female individual prepared by mating with a ligated male vas deferens. Litter genomic DNA analysis is performed in the same manner as above, and heterozygotes and homozygotes can be obtained.
  • other genes can be knocked in.
  • a marker gene such as the lac Z gene can be used.
  • transgenic non-human vertebrates in which the expression of the DNA encoding the endogenous protein of the present invention is suppressed can also be produced by using the antisense method or the ribozyme method.
  • the antisense method a vector containing a DNA encoding an RNA complementary to the transcription product of the DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • the ribozyme method for example, the transcription of the DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • a vector containing a DNA encoding the RNA that cleaves the product is introduced into a mammalian embryonic stem cell in the same manner as described above, and this is injected into a mammalian embryo to obtain an individual from the embryo.
  • synoviolin causes the synovial cell proliferation symptoms of RA
  • the following uses for transgenic animals are considered. That is, the synoviolin gene or the SL gene is incorporated into an appropriate animal to produce a transgenic animal, and if this is strongly expressed, it can be used as a model for RA. In this transgenic animal, it becomes possible to proceed with the screening of drugs that control the synovial proliferation mechanism.
  • the gene can be used as a source of Synoviolin II SL by overexpressing these genes.
  • Transgenic animals expressing the synopiolin gene exhibit symptoms similar to RA, such as arthritis with synovial dysplasia. That is, this animal becomes a rheumatoid arthritis model animal.
  • the animals can be used to test or screen various compounds, including drug candidates against RA.
  • the test compound can be administered to the transgenic animal and the effect of the compound can be verified by observing remission or exacerbation of symptoms, or screening can be performed.
  • Examples of the test or screening method include the following methods.
  • a method for testing or screening a compound that ameliorates or exacerbates a joint abnormality comprising: (a) administering a test compound to a transgenic non-human vertebrate into which the DNA of the present invention has been introduced exogenously; and (B) assessing the administered animal for joint abnormalities.
  • a knockout animal of the synoviolin gene can be used for investigating side effects due to inhibition of the action of synoviolin, and for atherosclerosis screening of drugs that reduce the side effects.
  • synoviolin can be expressed locally or transiently in knockout animals, and the effect of synoviolin can be specifically verified.
  • SL synoviolin
  • Synoviolin knockout animals can serve as a model for ML and DHRD because Synoviolin may be involved in intracellular signaling of SL.
  • synoviolin gene homogenously or heterologously in a tissue-specific and B-phase specific manner.
  • the present invention relates to a method for detecting the activity of a test compound to regulate the expression of a synoviolin gene, which comprises the following steps.
  • This detection method can be used for screening compounds that regulate the expression of the synopiolin gene.
  • This method is a method of screening for compounds that modulate the expression of the synoviolin gene, a) in the knock-animal or knock-cells, applying a test compound, b) measuring the expression level of the marker gene, Contact and c) selecting a compound that increases or decreases the expression of the knocked-in gene. That is, expression of a marker gene is detected in an animal or cell to which a test compound has been applied, and a compound that increases or decreases the expression of the marker gene is selected. Detection of the expression of a marker gene when LacZ is used as a marker can be performed by the method described in the Examples. By this method, in addition to tests and screenings using individuals, for example, organs and tissues can be isolated and used, or similar tests can be performed using cells obtained from transgenic animals. Is also possible.
  • a test compound is administered via an appropriate route.
  • the test compound can be administered by a known administration method such as intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, oral administration, enteral administration, and nasal administration.
  • the test compound is added, for example, to the medium. Alternatively, it may be injected into cells by microinjection or the like.
  • the test compound is a gene
  • the gene can be introduced into cells as naked DNA in combination with a desired transfection reagent or by incorporating it into a known expression vector.
  • the nucleic acid containing the sequence of the promoter region of the Synoviolin gene is expected to act as a decoy and suppress the expression of Synoviolin.
  • the activity of regulating the expression of the synoviolin gene can be detected, for example, by the following steps.
  • the present invention relates to a method for screening for a compound that regulates the activity of an endogenous prokeyter of synoviolin or a polynucleotide functionally equivalent to synoviolin, comprising the following steps.
  • test compound synoviolin or synopio Measuring an activity that modulates the activity of an endogenous promoter of a polynucleotide functionally equivalent to phosphorus;
  • control examples include a case where the same operation as in step a) is performed in the absence of the test compound, or a case where the test compound is contained at a lower concentration than in step a). Also, for example, the same operation as in step a) can be performed using another compound to select a compound having a higher action than that compound.
  • Gene expression includes transcriptional and translational expression.
  • the gene linked downstream of the endogenous promoter of the Synoviolin gene may be the natural Synoviolin gene itself or an artificially linked reporter gene.
  • the endogenous promoter activity of the Synoviolin gene can be determined, for example, by Northern hybridization using a cDNA fragment of the gene linked downstream as a probe, RT-PCR, Western blotting using an antibody against the protein encoded by the gene, The detection can be performed by detecting the transcript or translation residue of the gene by immunoprecipitation, ELISA or the like.
  • a construct in which a reporter gene is linked downstream of the synoviolin gene promoter, screening can be performed using the transformed cells obtained by transfecting this into cells using the reporter gene expression as an index. You can do it too.
  • Such a construct can be prepared by ligating a desired reporter gene to the downstream of the genomic DNA in the upstream region of the Synoviolin gene containing the Synoviolin gene promoter.
  • the reporter gene There are no particular limitations on the reporter gene, and examples include LacZ, chloram phenicol acetinol transferase (CAT), luciferase, GFP (green fluorescent protein) and the like.
  • Compounds that decrease the expression of the Synoviolin gene may be an indication for M therapeutics.
  • test compound used in the test or screening of the present invention is not particularly limited.
  • Inorganic compounds, organic compounds, peptides, proteins, natural or synthetic low-molecular compounds, natural or synthetic high-molecular compounds, tissue or cell extracts, and microorganisms Culture supernatants, plants Examples include, but are not limited to, natural components derived from marine organisms.
  • An expression product of a gene library or an expression cDNA library can also be used.
  • a compound obtained by screening a compound that binds to Synoviolin or a compound that inhibits the binding of Synoviolin to SL can be administered as a test compound.
  • the method of administering the compound can be carried out by contact with cells including addition to a culture solution, introduction into cells using a microinjector or transfection reagent, or the like.
  • a microinjector or transfection reagent or the like.
  • intra-arterial injection intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, oral administration, enteral administration, intramuscular administration, eye drop, nasal administration, local injection into joints, etc.
  • enteral administration intramuscular administration, eye drop, nasal administration, local injection into joints, etc.
  • the compounds are suitably administered as a composition.
  • they can be mixed with water, saline, buffers, salts, stabilizers, preservatives, suspending agents and the like. .
  • Screening for a compound that regulates the expression of the Synoviolin gene can also be performed using a normal animal or cells derived from the animal instead of a transgenic animal.
  • the present invention relates to a method for detecting the activity of regulating the expression of Synoviolin or a polynucleotide functionally equivalent to Synoviolin, comprising the following steps.
  • the present invention relates to a method for screening a compound that regulates the expression of a polynucleotide functionally equivalent to synoviolin or synopiolin, comprising the following steps.
  • the expression level of Synoviolin or a polynucleotide functionally equivalent to Synoviolin can be measured by the method described above.
  • any compound that can be used as a test compound in the other screening methods described above can be used as a test compound.
  • As a control there may be mentioned, for example, a case where the same operation as in step a) is performed in the absence of the test compound.
  • the compound identified by the test or the screening method of the present invention becomes a drug candidate for other diseases associated with RA-sinovirin, and can be used for prevention or treatment of diseases such as RA.
  • These compounds can be combined with other solutes and solvents as appropriate in addition to the active ingredient to form a pharmaceutical composition.
  • the isolated compound itself may be directly administered to a patient, or may be used as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method. Administration can also be performed.
  • a suitable combination with a pharmacologically acceptable carrier or vehicle, specifically, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution, tablet, capsule, troche, puccal tablet, elixir, suspension, syrup, nasal solution, inhalation liquid or the like.
  • the content of the compound may be determined as appropriate.
  • Administration to a patient can be generally performed by, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, oral administration, intraarticular injection, or other methods known to those skilled in the art.
  • the dose varies depending on the patient's body weight and age, administration method, symptoms, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the general dosage varies depending on the effective blood concentration of the drug and the metabolic time, but a daily maintenance dose of about 0.1 mg / kg to about 1.0 g / kg, preferably about 0.1 mg / kg to About 10 mg / kg, more preferably about 0.1 mg / kg to about 1.0 mg / kg It is considered to be kg.
  • Administration can be carried out once to several times.
  • the compound can be encoded by a polynucleotide, it may be possible to incorporate the polynucleotide into a vector for gene therapy and perform gene therapy. All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 is a photograph of a positive colony in immunoscreening with anti-synovial cell antiserum.
  • FIG. 2 is a photograph showing expression of a recombinant Synoviolin protein in E. coli.
  • FIG. 3 is a photograph of an autoradiograph showing the expression of Synoviolin protein translated from Synoviolin cDNA in a test tube.
  • FIG. 4 is a photograph of an autoradiograph showing the results of analysis of Synoviolin gene expression by Northern blotting using Synoviolin cDNA as a probe.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of Western blotting of various cell lysates with anti-synovial cell antiserum and the results of antibody absorption experiments with GST-partial Synoviolin. Arrows indicate absorbed bands. The molecular weight of each band was about 220, 185, and 140 kDa in order from the top.
  • FIG. 6 is a photograph of an autoradiograph showing the results of a western blotting method using a synovial cell antiserum against a synovial cell lysate.
  • the left lane (pre-mune) used the rabbit antiserum before synovial cell immunization, and the right lane (after the immunization) used synovial cell antiserum.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph showing the results of fluorescent immunostaining of synovial cells with anti-synovial cell antiserum (A) and purified anti-synovial cell antibody (B).
  • FIG. 8 is a photomicrograph showing immunostaining of synovial tissue with anti-synthetic B megacellular antiserum and antibody absorption experiments with GST-partial synoviolin.
  • FIG. 9 is a micrograph showing the results of immunostaining of a synovial tissue with a purified anti-synovial cell antibody. The results obtained using the antiserum purified by the GST affinity column (upper panel) and the antiserum purified by the GST-partial Synoviolin affinity column (lower panel) are shown.
  • FIG. 10 is a photograph of an autoradiogram showing the detection results of anti-synoviolin antibodies in various human sera by Western blotting.
  • FIG. 11 is a photograph of an autoradiograph showing the result of analyzing the expression of the SL gene in synovial cells by Northern plotting using SL cDNA as a probe.
  • 1 2 [3 3 ⁇ 4] -labeled HA- Shinopiorin -HAHA and GST - is a photograph of an autoradiograph showing the binding of the SL fusion protein.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of analysis of the effect of Synoviolin on the proliferation of synovial cells using MTT Atssay. GST-partial Synoviolin was used.
  • FIG. 14 is a diagram showing the structure of a vector for synopolin gene transfer.
  • Synoviolin is expressed systemically by the -actin promoter with CMV enhancer.
  • the expression of the flag-tagged Synoviolin protein can be confirmed by using an anti-Flag-tag antibody.
  • FIG. 15 is a photograph showing the arthritic finger joint of a transgenic mouse of the Synoviolin gene. The finger appearance and soft X-ray image of a Synoviolin forced expression mouse are shown. On the right end, a soft X-ray image of a normal mouse finger is shown for comparison. Synoviolin-forced mice showed significant finger swelling.
  • FIG. 16 is a photograph showing histological findings of a finger joint presenting arthritis in a synoviolin gene transgenic mouse. Bone destruction and abnormal bone formation associated with remarkable synovial hyperplasia were observed in the finger joints where remarkable swelling was observed.
  • FIG. 17 is a photograph showing histological findings of a normal finger joint of a transgenic mouse. No abnormalities in articular cartilage, bone destruction and hyperplasia of the synovium are observed. The lower right panel shows the results of immunostaining with the anti-Flag antibody. No positive 1 "raw signal is observed.
  • FIG. 18 is a photograph showing the expression of Synoviolin in the finger joint of Synoviolin gene transgenic mice exhibiting arthritis. Immunostaining was performed with an anti-Flag antibody. Synoviolin expression was observed in the synovial tissue and chondrocytes that had proliferated in the finger joints where remarkable S Peng was shown.
  • FIG. 19 is a diagram showing the structure of a targeting vector that deletes the Synoviolin gene.
  • the lacZ gene was introduced into the translation initiation site of the mouse synoviolin gene fragment (the ATG codon that translates the first methionine; indicated by), and the neomycin resistance (neo) gene was introduced as a positive selection gene.
  • the diphtheria toxin A (DT-A) gene was also ligated and used as a negative selection marker. Individuals that have undergone homologous recombination have lost synoviolin gene expression; instead, 3-galactosidase is expressed and expression of the synoviolin gene from the promoter can be detected by LacZ staining using its enzymatic activity (Fig. 2 2). The position of the probe used for Southern blot analysis for genotyping (see Fig. 20) is also shown.
  • FIG. 20 is a photograph showing the result of analyzing the genotype of Synoviolin gene-deficient mice. DNA was extracted from the mouse tail (wild-type and hetero-deficient mice) or embryonic 14.5-day-old offspring (homo-deficient mice) at about 2 weeks of age, digested with Pstl, and then probed as shown in Figure 19 Was used for Southern plotting.
  • FIG. 21 is a photograph showing the result of Northern blot analysis of a synopiolin gene-deficient mouse. MRNA was extracted from wild type (+ / +), synoviolin gene knockout mouse (+/-), and homo knockout mouse (-/-), and Northern blotting was performed using the Synoviolin gene fragment as a probe ( Upper panel). The lower panel shows EtBr staining of the agarose gel.
  • FIG. 22 is a photograph showing the result of examining Synoviolin expression sites by LacZ staining. Embryos 12.5 days old or 13.5 days old embryos were stained with LacZ. Embryonic expression of synoviolin was strongly observed in areas where bone and cartilage are formed, such as the parietal bones, limbs, and ears.
  • FIG. 23 is a photograph showing Synoviolin expression during the limb formation phase. Synoviolin expression during the limb formation stage was strongly observed in Apical Ectoode 1 Ridge (AER; ectoderm crest), as was the expression of FGF4, BMP2, and BMP4.
  • AER Apical Ectoode 1 Ridge
  • FIG. 24 is a photograph showing Lac Z staining of a frozen section of a 13-day-old embryonic limb bud of a hetero-deficient mouse. Staining was performed for 4 hours. The blue color of LacZ is concentrated in undifferentiated mesenchymal cells (bone / cartilage primordium). Original magnification X 40.
  • FIG. 25 is a photograph showing Lac Z staining of a frozen section of a 13-day-old embryonic limb bud of a hetero-deficient mouse. Staining was performed for 4 hours. The blue color of LacZ is concentrated in undifferentiated mesenchymal cells (bone / cartilage primordium). Original magnification X 200. A, B, and C correspond to Figure 24.
  • FIG. 26 is a photograph showing a phenotype of Synoviolin gene homo-deficient mice at embryonic day 12.5 days and embryonic day 13 days.
  • Synovial gene homo-deficient mice at 12.5 days of age and 13 days of embryonic age tend to have shorter immature cranial and limb formation compared to hetero-deficient mice compared to hetero-deficient mice.
  • FIG. 27 is a photograph showing the phenotype of Synoviolin gene-deficient mice at embryonic age of 14.5 days. Embryos 14. Abnormal limb buds were observed in 5 days old Synoviolin homozygous mice.
  • FIG. 28 is a photograph showing the expression of LacZ (reflecting the expression of Synoviolin) in the hind limbs of embryos of Synovioline homozygous 14.5 days old embryos. LacZ was found to be expressed in the enriched sites of AER and undifferentiated mesenchymal cells in abnormal hind limbs of homozygous mice.
  • FIG. 29 is a photograph showing a phenotype of a Synoviolin gene-deficient mouse embryo at 15.5 days of age. In homozygous mice, abnormal limb buds, abnormal maxilla and mandible, and abnormal ear morphology were observed. No heart beat was observed and he was not alive.
  • FIG. 31 is a photograph showing a mouse arthritis model using anti-collagen antibody capsules in Synoviolin knockout mice.
  • Anti-collagen antibody potency was administered to wild-type mice [373 (+ / +)] or synopiolin knockout mice [372 (-/ +)] to induce arthritis (+ in the figure).
  • Untreated wild-type mice (-) were also observed [371 (+ / +)].
  • both the swelling and redness of the joints were milder in the synopiolin heteronockquat mice than in the wild type.
  • it was found that the induction of arthritis was weaker in the synoviolin-herited knockout mice than in the arthritis induced by wild-type mice.
  • FIG. 32 is a photograph showing LacZ staining and Archan blue staining of primary cultured cells obtained from the sprouts of a synoviolin gene homo-deficient mouse (13dpc fetus). LacZ-positive colonies (ie, synopiolin-expressing cells) and Alshan blue-stain positive colonies are consistent. This result suggests that synoviolin is involved in bone and cartilage differentiation. Passage 1 (pi). .
  • FIG. 33 is a photograph showing LacZ staining of primary cultured cells obtained from limb buds of a 13dpc mouse embryo. Cells from wild-type (+ / +), synoviolin gene hetero (+/-) or homozygous, deficient, or deficient mice are shown. LacZ expression is observed only in synoviolin gene-deficient mice (lacZ gene knock-in). Passage 1 (pi).
  • FIG. 34 is a photograph showing LacZ staining and Ocean blue staining of primary cultured cells obtained from limb buds of mouse (13dpc fetus) deficient for the synopiolin gene. Lac Z-positive colonies (ie, synoviolin expressing cells) and colonies positive for Alcian blue staining are consistent. Passage 1 (pi).
  • FIG. 35 is a photograph showing LacZ staining and Alcian blue staining of primary culture cells obtained from the buds of a wild-type mouse (13dpc fetus). No staining with LacZ was observed Ray. Passage number 1 (pl). ⁇
  • FIG. 36 is a photograph showing LacZ staining of primary cultured cells obtained from limb buds of a synoviolin gene hetero-deficient mouse (13dpc fetus). LacZ staining (expression of synoviolin) is also observed in typical chondrocytes with two nuclei (see image at ⁇ 200).
  • FIG. 37 is a photograph showing von Kossa staining of primary culture cells obtained from mouse embryonic limb buds. Cells from wild-type (WT), synoviolin gene hetero (Hetero) or homo (H omo) deficient mice are shown. In the Synoviolin gene-deficient mouse (Ho mo), a decrease in bone formation ability is observed. Passage number 1 (pl).
  • FIG. 38 is a photograph showing LacZ staining of primary cultured cells (passage number 3; p3) obtained from limb buds of synoviolin homo-deficient mouse embryos. Cultivated until subconfluent. After LacZ staining (overnight), hematoxylin-eosin (HE) staining was performed.
  • FIG. 39 shows the results of -gal atssay of primary cells of the synoviolin gene hetero-knockout mouse (lacZ gene knock-in). The sample was measured in triplicate, and the average and standard deviation were shown.
  • FIG. 40 is a diagram showing the results of examining the effects of various drugs on synoviolin promoter activity using the] 3-galassay of primary cells of a mouse knockout mouse (lacZ gene knockin) into the synoviolin gene. The samples were measured in triplicate and the average and standard deviation were shown.
  • FIG. 41 is a diagram showing the results of ELISA of mouse sera immunized with Syno-P3. Serum obtained from three individuals (Nos. 1 to 3) was diluted at the indicated magnification to perform ELISA. Serum from a non-immunized mouse (normal in the figure) was used as a control.
  • FIG. 42 is a diagram showing the results of ELISA of serum from mice immunized with Syno-P2. Serum obtained from three individuals (Nos. 1 to 3) was diluted at the indicated magnification to perform ELISA. Serum from a non-immunized mouse (normal in the figure) was used as a control.
  • FIG. 43 shows the results of ELISA of mouse sera immunized with Syno-Pl. 3 individuals ( ⁇ 1-3) Serum obtained was diluted at the indicated magnification and ELISA was performed. Serum from a non-immunized mouse (normal in the figure) was used as a control.
  • FIG. 44 is a photograph showing the results of Western blotting (A) and fluorescent immunostaining (B) of synovial cells derived from RA and OA patients using an anti-synopiolin monoclonal antibody.
  • FIG. 45 is a photograph showing the results of immunostaining of synovial tissue from RA patients with an anti-Synoviolin monoclonal antibody. Hematoxylin and eosin (HE) stained images were also shown.
  • FIG. 46 is a photograph showing the auto-ubiquitination activity of Synoviolin. FLAG-Sinopiolin was reacted in the presence of GST-HA-ubiquitin, ATP, El, and E2, and anti-FLAG and anti-HA antibodies detected ubiquitination of synoviolin.
  • CE cell extract.
  • IP immunoprecipitate.
  • Antisynovial cell antiserum was obtained using synovial cells prepared by the following procedure as an immunogen. Synovial tissue removed from 10 patients with rheumatoid arthritis (RA) by synovial removal surgery was aseptically washed with phosphate buffered saline (PBS). The washed tissue was cut into pieces of about 5 cubic cubes and digested with 0.25% trypsin / PBS at 37 ° C for 20 minutes. Excessive debris was removed from the digested synovial tissue, and the resulting cells were removed using Dulbecco's modified Eagle's medium (Virology, 8, 396, 1959) (10% FC S-DMEM) containing 10% fetal calf serum.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium (Virology, 8, 396, 1959) (10% FC S-DMEM) containing 10% fetal calf serum.
  • the 1 X 10 5 cells from patients synovial cells of 76cm 2 were suspended in 10% FCS-DMEM 20mL culture hula Cultured in sco. Change the medium every 3 days, remove the medium when the culture surface becomes full after 2 minutes, add 7% of 0.05% EDTA / PBS and 0.1% trypsin / PBS and add cells was removed and collected. The collected cells were washed with PBS to remove the medium components, and suspended in 1 mL of PBS to obtain an immunogen.
  • This immunogen was immunized by intravenous injection into the ear of a heron (one bird) within 2 hours after preparation. Immunization was performed 6 times at weekly intervals. At the time of the sixth immunization, a few mL of blood was collected from the ears of the egret and tested for antiserum, and it was confirmed by the fluorescent antibody method that it reacted with the synovial cells of rheumatic patients. One week after the sixth immunization, as much blood as possible was collected from the heart using force tables. The blood was allowed to stand at 4 ° C for coagulation to separate serum. Serum was supplemented with 0.1% sodium azide as a preservative and stored at 4 ° C as anti-synovial cell antiserum.
  • RNA was obtained from synovial cells of 10 RA patients obtained in Example 1 by acid guanidine / phenol chloroform method. The mRNA was purified using poly T beads (Analytical Biochemistry, 162, 159, 1987). Using the L ZAP vector (STRATAGENE), a cDNA library of synovial cells from RA patients was prepared according to a conventional method. Using a picoBlue immunoscreening kit (STRATAGENE), i-thigh unoscreening was performed with the anti-synovial cell antiserum of Example 1 above (FIG. 1).
  • STRATAGENE picoBlue immunoscreening kit
  • the obtained positive clone (phage) was converted into plasmid pBluescript II S, K (+) by helper phage.
  • the nucleotide sequence of the DNA introduced into Bluescripte II SK (+) was determined by ABI PRISM using M13PrimerM4 and M13PrimerRV (Takara) based on the dye terminator method ( proc . Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463, 1977). Determined by 377 DNA Sequencer (PERKIN ELMER).
  • the nucleotide sequence determined from 3 'end of the gene anti synovial cell antiserum described above encodes an antigen recognized (named "synoviolin”), the nucleotide sequence of 2 990 bp containing poly (A) + Town Clarified (SEQ ID NO: 1 at 42-3031).
  • synovial cell cDNA library 5, -RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85: 8998-9002, 1988).
  • the translation region of full-length synoviolin and the 5'-untranslated region And a 3031 bp base sequence including the poly (A) + chain was determined (SEQ ID NO: 1).
  • GenBank GenBank
  • CDNA (1799 bp; SEQ ID NO: 1233-3031 of SEQ ID NO: 1) encoding a part of Synoviolin was extracted from cDNA clones obtained by immunoscreening using anti-synovial cell antiserum after treatment with restriction enzymes EcoRI and Xhol. did.
  • the cDNA having the EcoRI / XhoI recognition sequence at the end was inserted into a dartathion S-transferase (GST) fusion protein expression vector pGE X-5X-3 and subcloned.
  • GST dartathion S-transferase
  • PGE X-5X-3 into which a part of Synoviolin cDNA was introduced was introduced into BL21 E. coli strain by heat shock at 42 ° C.
  • BL21 / synoviol in-GST gene / pGEX-5X-3 This BL21 was cultured in an LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin, and 0.1 ml of ImM isopropylthio-jS-D-galactoside (IPTG) was added and cultured at 37 ° C for 2 hours to induce the expression of the fusion protein. did.
  • IPTG ImM isopropylthio-jS-D-galactoside
  • the BL21 recovered by centrifugation was washed with PBS and digested with lmg / mL lysozyme at 0.1 ° /. Solubilized by TritonX-100.
  • the BL21-derived protein suspension containing the solubilized GST fusion protein was applied to Daltathione Sepharose 4B (GS4B), washed with PBS, and the target GST-partial synoviolin fusion protein was purified using 50raM reduced glutathione / PBS. .
  • HA hemagglutinin
  • GST glutathione S-transferase
  • a BL21-derived protein suspension containing the solubilized GST-Sinobiolin-HAHA protein is applied to daltathione Sepharose 4B (GS4B), washed with PBS, and treated with 50raM reduced glutathione / Tris-HC1 (pH 8.0).
  • the desired GST-Synobiolin-HAHA protein was purified.
  • SDS-PAGE GST-Synoviolin-HAHA protein was transferred to the membrane by electroblotting. This membrane was blocked with PBS containing 5% skin milk for 60 minutes at room temperature, and then incubated with anti-HA monoclonal antibody (Boehringer mannheira) diluted 400 times with PBS containing 0.5% skim milk. The immune reaction was performed for 60 minutes. After the reaction, the wells were washed with 0.1% Tween20 / PBS, and reacted with a horse radish pe roxidase (HRP) -labeled mouse IgG antibody as a secondary antibody at room temperature for 60 minutes, and washed with 0.1% Tween20 / PBS.
  • HRP horse radish pe roxidase
  • the target antigen was detected by detecting HRP activity.
  • HRP activity an ECL kit (Amersham) was used (Clinical Chemistry. 25, p 1531, 1979). The results are shown in FIG. From the molecular weight size of the GST-Synobiolin-HAHA fusion protein, the molecular weight of the Synoviolin protein was estimated to be about 80 kDa.
  • Example 6 Confirmation of synopiolin gene expression by Northern blotting mRNA was collected from synovial cells, A549 cell line, Jurkat cell line and HeLa cell line derived from RA patient obtained in Example 1 according to a standard method. did. One gram of this mRNA was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and transferred to a nip membrane by contact blotting. The membrane was treated at 80 ° C for 2 hours and prehybridized in Denhardt's solution at 42 ° C for 2 hours.
  • Example 3 • GST-partial synopiolin fusion protein prepared in Example 3 (positive control) First, a cell lysate solubilized with 1P-40 was prepared from various cells as samples. Each cell lysates 25mM Tris-HCl (P H6. 8), 0. 25% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0. 05% mercapto E ethanol, treated with 1% glycerin port Lumpur 0., 8% SDS polyacrylaraide Separated by electrophoresis (SDS-PAGE). After SDS-PAGE, various cell-derived proteins were transferred to a trocellulose (NC) membrane by the electroblotting method.
  • N trocellulose
  • the anti-synovial cell antiserum was diluted 1000-fold with the NC membrane in Tris buffered saline (TBS) containing 2.0 mg / raL of GST-partial synoviolin fusion protein and 5% skim milk, and diluted at room temperature with 60 times. A minute immunoreaction was performed. As a negative control, an experiment in which the same antibody solution was reacted with the NC membrane, or an experiment in which the GST-partial synoviolin fusion protein in the antibody solution was replaced with only GST was performed simultaneously. The NC membrane after the reaction was washed with 0.
  • TBS Tris buffered saline
  • the reactivity observed in bands other than 220 kDa was presumed to be fibronectin (molecular weight about 240 kDa) or a subunit of laminin (molecular weight about 200 kDa) based on the reactivity with other antibodies. Based on the results, the molecular weight of Synoviolin was estimated to be about 220 kDa. However, the molecular weight of Synoviolin identified in Example 5 is about 80 kDa. The difference between the two suggests that synoviolin may have a multimeric structure that does not dissociate in SDS ⁇ fe.
  • the synovial cells from the RA patient prepared in Example 1 were added at 1 ° /.
  • a cell disruption fraction solubilized with NP-40 was prepared.
  • This synovial cell lysate was treated with 25 mM Tris-HC1 (pH 6.8), 0.25 ° / osodium dodecyl sulfate (SDS), 0.05% mercaptoethanol, and 0.1% glycerol. Separation was performed by 8% SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE). After SDS-PAGE, the synovial cell-derived protein was transferred to a trocellulose (NC) membrane by electroblotting.
  • N trocellulose
  • the NC membrane was washed with 0.1% Tween20 / TBS, and immunoreacted with a horse radish peroxidase (HRP) -labeled anti-Egret IgG antibody as a secondary antibody at room temperature for 1 hour, and then with 0.1% Tween20 / TBS. After washing, the target antigen was detected by detecting the HRP activity.
  • HRP activity an ECL kit (Amersham) was used (Clinical Chemistry. 25, pl531, 1979). The results are shown in FIG.
  • Example 9 Expression of synoviolin in various cells and synovial tissue by immunostaining method
  • synovial cells were fixed on slide glass according to a conventional method, and the antisynovial cell antiserum of Example 1 was used. Immunostaining was performed. Specimens that were blocked for 30 minutes with 1% bovine serum albumin (BSA) at 1 ° / ° C. An anti-synovial cell antiserum diluted 100-fold with BSA was immunoreacted at room temperature for 60 minutes. In addition to the observation with the antiserum, an experiment using a purified anti-synovial cell antibody purified from the antiserum was also performed.
  • BSA bovine serum albumin
  • the purified anti-synovial cell antibody was prepared by immunoaffinity purification using a GST-partial synopioline fusion protein as a ligand.
  • a GST-fusion protein expression vector pGEX_5X-3 into which the synoviolin gene 1799 bp of SEQ ID NO: 1 from No. 1233-3031 was introduced into BL21 and introduced into BL21 for expression, and a glutathione Sepharose column was used.
  • GST-partial Syno -GS column was prepared by the method of Pharmacia .
  • an anti-GST antibody obtained by immunoaffinity purification of antiserum in the same manner using GST as a ligand was used.
  • the synovial tissue from RA patients was stained by fixing the synovial tissue on a slide glass according to a conventional method.
  • the specimen blocked with 1% BSA for 30 minutes was immunoreacted with anti-synovial cell antiserum diluted 100-fold with 1% BSA at room temperature for 60 minutes. After the reaction, the specimen was washed with PBS, and immunoreacted with an HRP-labeled anti-Egret IgG antibody as a secondary antibody.
  • the antigen immunoreactive with the anti-synovial cell antiserum was confirmed by the color development of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride based on HRP activity14.
  • GST-partial Synoviolin fusion protein As an antigen, detection of anti-Synoviolin antibody in serum from M patients was attempted by Western blotting. Same as Example ⁇ First, GST-partial Synoviolin fusion protein (100ng / lane) was electrophoresed by SDS-PAGE and transferred to NC membrane. Serum from RA patients (5 cases) was diluted 1000-fold with Tris buffered saline (TBS) as the primary antibody, and the GST-partial synoviolin fusion protein was transferred to the NC membrane for immunoreaction at room temperature for 60 minutes.
  • TBS Tris buffered saline
  • Synoviolin ligand was screened using a cDNA expression library derived from RA patient synovial cells prepared in Example 2 (Tadaomi Takebashi, Toshiki Watanabe, Biomanual UP Series "Protein Intermolecular Interaction Experiments” Kaelin, WG et al., Cell 70, 351-364, 1992; Skolnik, EY et al., Cell.
  • the library phage was infected into E. coli (XLl-Blue MRF ') by incubating at 37 ° C for 20 minutes, mixed with Topagarose, and spread on a plate. After culturing at 42 ° C for 3.5 hours, a nitrocellulose membrane immersed in lOmM IPTG and dried was placed on a plate, and further cultured at 37 ° C for 3.5 hours.
  • wash buffer [1 OmM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX-100, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 5 mM MgCl 2 , ImM DTT, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim)] for 5 minutes, and then blocking buffer [10 mM Tris-HCl (p H8. 0), 5% Skim milk, 0. 1% Triton X- 100, 150mM NaCl, ImM EDTA, 5raM MgCl 2, ImM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim Co.)] 1 hour immersion did.
  • the nucleotide sequence was determined for 100 bp near the 5 'end and 100 bp near the 3' end.
  • S1-5 [Lecka-Czernik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995 Accession number U03877 (cDNA)
  • AAA65590 protein
  • EFEMP1 Stone, EM et al., Nature Genetics 22, 199—202, 1999; called accession number Q12805 (protein)]; common sequence with known genes Became clear. The sizes of both genes and their translation products were almost the same, suggesting that they were the same protein.
  • Example 11 MRNA was rubbed from various cells in the same manner as in Example 6, and Northern blotting was performed using the SL cDNA obtained in Example 11 as a probe.
  • the cells used are as follows. Synovial cells from RA patients were found to strongly express the SL gene (Fig. 11)
  • the SL cDNA was introduced into the pGEX vector as in Example 3, a GST-SL fusion protein was prepared, GST-SL (500 ng) was applied to 10% SDS-PAGE, and GST (1 ⁇ g) was applied as a control.
  • GST-SL 500 ng
  • GST 1 ⁇ g
  • the DNA was transferred to a nylon membrane by the electroblotting method. This nylon membrane, 50mM containing 6M guanidine hydrochrolide ⁇ 5mM 2-Mercaptoethanol
  • C ⁇ ⁇ Regenerated nylon Tsukimo is a blocking buffer [lOmM Tris-HCl (pH 8.0), 5% Skim milk, 0.1% Triton X 100, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 5 mM MgCl 2 , ImM DTT, 5% glycerol, protease inh ibitor (complete, Boehringer Mannheim)] and washed with Blocking buffer (the same composition as above except for 0.5% skim milk).
  • TNT-coupled Transduction System Promega
  • pcDNA3-HA-Synoviolin-HAHA Synoviolin cDNA of SEQ ID NO: 1 1851bp; Synoviolin cDNA with HA-tag added to 60-1910 were introduced into expression vector pcDNA3.
  • [ 35 S] -labeled HA-Synoviolin-HAHA fusion protein [ 35 S] HA-Synobiolin-HAHA
  • the membrane is composed of 1 OmM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX-100, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 5raM MgCl 2 , ImM DTT, protease inhibitor ( complete, Boehringer Mannheim) and radioactivity was detected with an image analyzer (BAS2000, Fujix). Transferred to Nai port emission film GST-SL fusion proteins and [3 3 ⁇ 4] HA - Shinopiorin -HAHA, the binding of both individual is observed. No binding was observed between GST as a control and [ 35 S] HA-synoviolin-HAHA (FIG. 12). These results suggest that synoviolin and SL bind by protein interaction.
  • Example 14 a result was suggested that suggests that synovial cell proliferation is inhibited through neutralization of synoviolin ligand in the culture by synoviolin. Based on these results, mutations of SL with a structure corresponding to the synoviolin binding site of SL It is possible that the body has the effect of inhibiting synovial cell proliferation by antagonizing the synoviolin-SL binding. Furthermore, a synoviolin mutant having a structure corresponding to the SL binding site of synoviolin may be expected to have the same antagonistic inhibitory effect as the SL mutant.
  • the RA patient-derived synovial cells prepared in Example 1 were prepared using a 96- well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well, and GST or GST-partial Synoviolin was added to a final concentration of 0.01 to 1 ⁇ M. Was added to the cell supernatant. Cultured for 3 days 3 - (4, 5 - dimethyl - 2- thiazolyl) - 2, 5 - diphenyl- 2H- the tetrazolium bromide (MTT) / PBS was added to the cell supernatant, of 37 ° C, 5% C 0 2 Culture was performed under the conditions for 3 hours.
  • GST or GST-partial Synoviolin was added to a final concentration of 0.01 to 1 ⁇ M.
  • MTT tetrazolium bromide
  • the N-terminal of the DNA encoding the synoviolin protein is linked to Flag tag, 3 'was constructed synoviolin gene transfer vector bound with Po Li A signal toward downstream.
  • the vector was constructed based on pCAGGS (Niwa, H. et al., Gene 108: 193-9, 1991).
  • the promoter was 3 actin promoter, and the enhancer was human cytomegalo-noreth.
  • a ij-stage hennoensa human cytomegalovirus immediate early enhancer was used (Fig. 14).
  • the vector for synoviolin gene transfer was introduced into mouse egg cells by microinjection using a micro glass pipe connected to a manipulator under a microscope. DNA was injected into the male pronucleus of the fertilized egg, and the injected engineered egg was transferred into the oviduct of a female mouse (recipient mouse) in which pseudopregnancy was induced by mating with a vasectomized male mouse. 19 days after transplantation, pups were obtained by spontaneous delivery or cesarean section. Cesarean section In this case, the offspring mice were reared with the separately prepared female mice as foster parents. DNA was collected from the tail of each offspring, and PCR was used to confirm that the transgene was retained.
  • the lacZ gene was introduced into the translation initiation site of the mouse synoviolin gene fragment (ATG codon that translates first methionine), and a targeting vector was constructed.
  • the neomycin resistance (neo) gene was introduced as a marker gene, and the diphtheria toxin A (DT-A) gene was also linked to eliminate non-homologous recombination cell lines (Fig. 19).
  • Genotype was confirmed by Southern blot analysis.
  • DNA was extracted from about 3 thighs of the tail tip of a 2-week-old mouse.
  • Synoviolin homo-knockout mice tail, part of upper and lower limbs were collected from a fetal embryo at day 14.5 under a stereoscopic microscope, and DNA was extracted. The DNA obtained by digesting the DNA with the restriction enzyme Pstl was used.
  • Fig. 20 shows the analysis results. Pand was detected at 6.5 kbp in the wild type, 8.5 kbp in the homozygous mutant mouse, and at both positions in the heterozygous mutant mouse.
  • the expression of the synopolin gene was confirmed by Northern plotting.
  • the mRNA was extracted from wild-type, hetero-knock-out mouse, and homo-knock-out mouse (whole embryo at day 12.5) and electrophoresed at 20 / z g on each lane of a 1.2% agarose gel.
  • synoviolin mRNA was not detected in the homonoc-out mouse (-/-), and weaker mRNA expression was observed in the hetero-knock-out mouse (+/-) compared to the wild-type (+ / +) ( Figure 21).
  • the site of synoviolin expression in the mutant mice obtained in Example 17 was examined by LacZ staining. That is, the whole embryo was colored using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-] 3-D-galactoside (X-Gal), and the expression distribution of LacZ (as -galactosidase activity) was examined. The number of embryos observed was 32.
  • LacZ which reflects the expression of Synoviolin, in the enriched site of AER and undifferentiated mesenchymal cells (the site where future phalanges are formed) It was recognized (Fig. 28).
  • Collagen-induced arthritis (CIA) in mice is widely used as a model for arthritis in human rheumatoid arthritis.
  • the anti-collagen antibody capsule was administered to the synoviolin gene knockout mouse (heterozygote) or the wild-type mouse prepared in Example 17, and induced arthritis was observed.
  • synoviolin hetero-knockout mice induced less arthritis than wild-type mice (Fig. 31).
  • Example 21 Primary culture of fetal limb blast cells of Synoviolin gene knockout mouse Nutrition analysis
  • Alkaline phosphatase activity was detected using an alkaline phosphatase tissue staining kit (Sigma, Diagnostic Kits and reagents, alkaline phosphatase (AP), leukocyte, at. No. 86-R).
  • the effect of the test sample on the expression of the synoviolin gene was evaluated by J3-gal atssay using primary cultured cells of a mouse knockout mouse (lacZ gene knockin) to the synoviolin gene.
  • 3 times passaged per Ueru to Shinopiorin gene primary culture cells of terrorist knockout mouse to 24 ⁇ El plate was 0, 1 X 10 3, 3 X 10 3, 1 X 1 0 3 ⁇ 10 4 and 1 ⁇ 10 5 cells were seeded and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • a cell lysate (Promega) is added to the cell culture under unstimulated conditions in an amount sufficient to completely cover the cell layer (100 I / well), and the culture plate is transferred to a shaker. Shake gently for 15 minutes at room temperature to ensure that the cell layer is always immersed in the lysis solution.
  • the j3-galactosidase activity of the cells was measured as follows. To 20 il of the obtained cell extract, 1 ⁇ l of a Mg solution (0.1 mM MgCl 2 , 4.5 M 3 -mercaptoethanol) and 0 NPG solution (o-nitrophenyl——D—galactopyranoside) (0.1 M phosphate buffer ( pH 7.5) was added to 22 ⁇ l of 1 ⁇ 2g / ml) and 0.1 M phosphate buffer ( ⁇ 7.5) 57 ⁇ 1 to make the total amount ⁇ . Incubation was performed at 37 ° C for 6 hours, taking care not to dry.
  • Mg solution 0.1 mM MgCl 2 , 4.5 M 3 -mercaptoethanol
  • NPG solution o-nitrophenyl——D—galactopyranoside
  • the reaction was stopped by adding 150 1M sodium carbonate (21.2 g of Na 2 CO 3 dissolved in H 20 to make up to 200 ml and filtered with a 0. filter), and the absorbance at 420 nm was measured.
  • the 3-galactosidase activity was quantified.
  • the experiment was performed in triplicate. As a result, 3-lactosidase activity was detected in the lacZ gene knock-in mouse cells depending on the cell number (FIG. 39). ⁇ -galactosidase activity It was confirmed that the promoter activity could be evaluated (/ 3-gal atsie) using the index as an index.
  • a similar -gal assay was performed by adding various drugs to the primary cultured cells, and the same method was applied to the synopioline promoter activity.
  • prednisolone predn isolone (0.01-1 ⁇ ) and 12-0-t etradec ylphorbol 13-acetate (TPA; 0.001-0.1 ⁇ ) was used, prednisolone was a steroidal anti-inflammatory agent, and ⁇ was an activity of protein kinase C.
  • Monoclonal antibodies to Synoviolin were prepared as follows. As peptides for immunization, three kinds of peptides containing the following partial amino acid sequences of human synoviolin were synthesized. These amino acid sequences IJ were selected from the regions presumed to have antigenicity.
  • Myeloma cell line (P3U1) and mouse spleen cells are mixed 1:10, and 50% PEG (Wako) Cell fusion was performed in the presence of Junyakusha PEG1540). After the fusion, the cells were seeded on a 96-well plate so that the number of spleen cells became 5 ⁇ 10 5 cells / ml. After culturing in HAT medium for 10 to 14 days, cell growth was confirmed and the culture supernatant was assayed. For the assay of the culture supernatant, an ELISA plate on which each synthetic peptide was immobilized was used. The operation of the test is as follows. After allowing the culture supernatant to react with the ELISA plate, positive mice were selected using an anti-mouse IgG tag. The wells to be used for closing were selected, and the other positive wells were cryopreserved.
  • one 96-well plate per seed was seeded at 100 cells / plate (20 cells / ml) and cultured for 10 to 14 days. Colonies were determined and the culture supernatant was assayed. The assay of the culture supernatant was performed by applying the supernatant 501 to the above-mentioned antigen-immobilized ELISA plate for screening. As the second antibody, an anti-mouse IgG antibody-pox was used. After culturing, the selected colonies were recloned, cultured for 10 to 14 days, and colony determination and assay of the culture supernatant were performed as described above.
  • Fluorescent immunocytochemical analysis of synovial cells from RA patients was performed using the monoclonal antibody 10Db.
  • the procedure of immunostaining is as described in Example 9 except that the monoclonal antibody 10Db of Example 23 is used as the antibody and anti-mouse IgG hidge-FITC is used as the labeling antibody.
  • Synoviolin protein signals were strongly detected in synovial cells from RA patients, but not in controls that reacted only with the secondary antibody (Fig. 44B).
  • (3) Immunostaining of synovial tissue from RA patients with anti-sinopiolin monoclonal antibody Immunostaining of synovial tissue sections collected from RA patients was performed using monoclonal antibodies 10Db and 7Bc.
  • Example 9 The procedure of immunostaining is as described in Example 9 except that monoclonal antibodies 10Db and 7Bc of Example 23 are used as antibodies, and anti-mouse IgG higging-HRP is used as a labeled antibody.
  • Synoviolin protein signals were strongly detected in synovial tissue from RA patients (Fig. 45).
  • HE staining performed at the same time, a growth layer of synovial cells was observed, and it was confirmed that the portion was stained with the monoclonal antibody. From these results, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention specifically recognized the synovial tissue of RA patients.
  • detection and diagnosis of RA can be performed by detecting Synoviolin in a patient sample using Synoviolin antibodies.
  • E3 ubiquitin-protein ligase is known to self-ubiquitinate (Hashizume R et al., J. Biol. Chem. 276, 14537-14540, 2001). Therefore, it was examined whether synoviolin has an auto-ubiquitination activity. Plasmid obtained by introducing the FLAG-synopiolin gene into the pCAGGS vector was transfected into HEK-293 cells, and the cells were recovered 36 hours later.
  • Buffer B [25 ra M Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.01% Nonidet P_40, 10% glycerol, 1 mM EDT A), wash the beads twice, and add 30 il ubiquitin ligase reaction solution [50 mM Tris-HC1 pH 7.4, 5 mM MgCl 2 , 2 mM NaF, 10 nM okadaic acid, 2 mM ATP, 0 mM 6 mM DTT, 1.5 GST-HA-ubiquitin, 40 ng yeast-derived El, 0.3 ⁇ g UbcH5c (E2)] were added to the mixture, followed by reaction at 37 ° C.
  • a reaction was performed without adding any of GST-HA-ubiquitin, ATP, El or E2 (when GST-HA-ubiquitin was not added, the reaction was performed using GST).
  • Fig. 46 shows the results obtained using Synoviolin imraunopurified by washing with Buffer A containing 0.1% SDS.
  • a band having a size about 35 kDa larger than the molecular weight of Synoviolin was detected (arrow in FIG. 46). This band was also seen in the plot with the anti-FLAG antibody, suggesting that GST-HA-ubiquitin was potentiated by synopioline [].
  • the present invention has provided a gene "Synobiolin” encoding a novel protein involved in synovial membrane development and bone / cartilage / limb development.
  • the gene of the present invention is involved in RA, and RA patients produce antibodies against this gene product.
  • the gene and protein of the present invention are novel markers useful for RA diagnosis.
  • the “Sinovirin” of the present invention is strongly expressed in synovial cells of RA patients, and contributes to diagnosis of RA disease and determination of therapeutic effects by in situ high predication in situ PCR.
  • antibodies to Synoviolin can be found at high frequency in the blood of RA patients. Using this as a marker enables specific diagnosis of RA.
  • the Synoviolin protein provided by the present invention, or a partial peptide thereof, is useful for detecting an antibody against Synoviolin in patient serum.
  • Synoviolin is expressed in undifferentiated mesenchymal cells. If synoviolin is used as a cell marker, undifferentiated mesenchymal cells can be recovered from embryonic cells and the like. Undifferentiated mesenchymal cells are cells that differentiate into bone and cartilage, and are expected to be applied to regenerative medicine. In other words, if undifferentiated mesenchymal cells, in which synoviolin is collected as a cell marker, are differentiated in vitro or in vivo to form bone and cartilage and reconstruct joints, damaged bone, cartilage tissue and joints can be recovered. It is also possible to make a new reproduction.
  • the Synoviolin of the present invention and its ligand were found to be closely related to the proliferation of joint synovial cells, which is a major pathological condition of RA. Therefore, the Synoviolin or its ligand provided by the present invention is useful for the development of a method for treating RA. Gives important knowledge. More specifically, by screening for compounds involved in the binding of synoviolin to its ligand, the development of RA treatment techniques can be advanced with a completely different approach. In addition, synoviolin transgenic mice frequently developed joint synovium and swelling of the finger joints with arthritis. The transgenic animal of synoviolin provided by the present invention is extremely useful as a model for RA in the development of therapeutic techniques and pharmaceuticals.

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Description

明細書 滑膜細胞タンパク質 技術分野
本発明は、 慢性関節リウマチ （以下 RAと省略する） に関連する新規なタンパク質、 このタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そしてこれらタンパク質やポリヌ クレオチドの用途に関するものである。 より具体的には、 RAの特異的な診断マーカ 一として期待できる新規なタンパク質に関する。 また、 RAの治療薬開発に新しいァ ブローチを与える新規な遺伝子にも関連している。 ' 背景技術
RAは、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。 滑膜細胞 （synovial cell) は、 関節の滑膜で 1一 6層の上皮様層を形成する繊維 芽細胞様の細胞で、滑液にプロテオグリ力ンゃヒアル口ン酸を供給するものとされ ている。 RA患者の関節では、 滑膜組織の増殖、 その結果として引き起こされる多層 構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。 また RA患者 の血清中には、 自己の IgGの Fc領域に対する自己抗体が存在することから、 自己免 疫疾患のひとつとして考えられているがその病因については未だに解明されてい ない。
前述の自己の IgGを認識する自己抗体の存在は、 RAの特徴的な診断指標として古 くから利用されてきた。 最近では、 変性ヒト IgGを主成分とする自己抗体検出用キ ットが商業的に供給されている。 なお、 この自己抗体は RA因子とも呼ばれている。
RA因子の検出に基づく RAの診断は、疾患に対する特異性、抗体が生じるシステムの 解明がなされておらず病因との関連がはっきりしていない、といった問題点がある。
RAの病態を、生体内における多彩な免疫反応と骨破壊を伴った関節滑膜の増殖性 疾患という 2つの側面からとらえた場合、前者の免疫反応に関しては多くの研究が なされ、その分子機序が明らかにされつつある。 しかし後者の関節滑膜細胞の研究 に関しては、それが RAの主座であるのにも関わらず、その細胞生物学的な特徴すら 明らかにされていないのが現状である。 RAのような、 慢性 ·難治性疾患の発症や進 展の背後にある分子機序を解明することは、 疾患の診断、 予防、 そして治療に必要 不可欠である。 更に、 高齢ィヒの進行がとどまる気配の無い現状では、加齢性疾患で もある RAの病態解明は社会的に見ても重要な課題である。 発明の開示
本発明は、 RAの診断や治療に新しいアプローチをもたらす新規なタンパク質、 な らびにこのタンパク質をコードする新規な遺伝子の提供を課題としている。本発明 が提供するタンパク質とそれをコードするポリヌクレオチドは、 RAの病因により密 接に関連し、診断においては有用な情報を与え、治療技術の開発に当たっては創薬 に結びつくものである。 さらに本発明は、該タンパク質をコードする遺伝子を発現 するトランスジエニック動物、および該遺伝子を欠損させたノックァゥト動物を提 供することを課題としている。 これらの動物は、本発明の遺伝子の機能を解析し、 モデル動物として RAの治療法や治療薬を開発するために有用である。 本発明者らは、 RA患者の培養ヒ ト滑膜細胞を免疫原として得た抗ヒ ト滑膜細胞抗 体を用い、 RA患者の滑膜細胞の cDNAライブラリーをィムノスクリーニングすること により、 RA患者の滑膜糸且織で発現している新規な遺伝子の単離に成功した。そして この遺伝子がコードするタンパク質を、この遺伝子が発現している組織である滑膜 細胞 （synovial cell) にちなんでシノビオリン （Synoviolin) と名づけた。 本発明者らは、 前記培養滑膜細胞の分子量約 80kDa、 140kDa、 そして 220kDa 分画に対する抗ヒ ト滑膜細胞抗体の反応性が、前記シノビオリン遺伝子の発現産物 により吸収されることを確認した。 また、 これらのパンドや、 前記シノビオリン遺 伝子の発現産物が、 RA患者の血中に存在する抗体との反応性を示すことを見出した。 更に、抗ヒ ト滑膜細胞抗体は、 RA患者の滑膜組織に対して強い反応性を示すことを flfe認しだ。
また本発明者らは、生化学的な結合実験により、シノビォリンの天然リガンドで あるシノビオリンリガンド （以下、 SLと省略する） の存在を明らかにした。 SLは、 シノビオリンのリガンドとして本発明者らが初めて単離したタンパク質である。し かし SLをコードする DNAの塩基配列に基づく検索を試みたところ、 S1-5と呼ばれる 公知の遺伝子が、 5'末端領域と 3'末端領域において共通の塩基配列を含むことが明 らかとなつた。 本発明者らが単離した SLと S1 - 5は、 DNAの部分配列のみならず遺伝 子の大きさ、発現産物の分子量などがほぼ同じであり、 同一のタンパク質である可 能†生が高い。 S卜 5 [ "FBNL" (fibrill in- like) または "EFEMP1" (EGF-containi ng fibrillin— like extracellular matrix protein 1) と t>呼ば、れる] は、 ヒ ト 2 倍体繊維芽細胞（human diploid fibroblast)で過剰発現している遺伝子として単 离 gされに （Xecka- Czemik, B. et al. , Molecular and Cellular Biology, 15， 1 20-128, 1995) 。 構造的には、 DNA合成を促進する EGF様ドメイン （Epidermal Gro wth Factor-like dome in) を持つ。 SI - 5については構造と核酸合成の促進活性 （糸田 胞増殖活性） は見出されている。 また、 最近 S1- 5の変異が Malattia Leventinese
(ML) および Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD) と関連してレヽること力 s 報告 (Stone, E. M. et al. , Nature Genetics 22, 199-202, 1999) されているも のの、 RAとの関連については知られていない。 またシノビオリンとの親和性につい ては、 本発明者らによるまったく新規な知見であることは言うまでもない。
さらに本発明者らは、シノビオリン遺伝子を導入したトランスジエニックマウス およびシノビオリン遺伝子を欠損させたノックァゥトマウスを作製し、その表現型 を観察した。 シノビオリン分子をマウスで過剰に発現させた場合、 関節では滑膜の 増生、 骨、 軟骨破壊が認められ、 慢性リゥマチ関節炎と酷似した症状を示した。 一 方、 シノビオリン遺伝子を完全 （ホモ） に欠損させた場合には、 胎生期のマウスで 不完全な肢芽発生と骨格形成が認められた。 これらの表現型によると、滑膜組織だ けでなく、 軟骨 ·骨組織の発生 ·分化 ·再生、 および代謝へのシノビオリンの関与 が示唆される。 また、 シノビオリン強発現マウスの関節症の病変化部位では、滑膜、 軟骨、 骨組織への代謝、 再生が積極的に誘導されていた。 これらの結果は、 シノビ オリン分子が RAを含む関節症へ関与していることを明確に示すものである。更に、 シノビオリン強発現マウスが関節症モデル動物として有用であることが確認され た。
本発明者らは、 これらの新規な知見に基づいて、 シノビォリンとその遺伝子、 そ の抗体、あるいはリガンドの治療や診断への有用性を明らかにすることにより本発 明を完成した。 さらに本発明者らは、シノビォリン遺伝子を導入したトランスジェ ニック動物を作製し、 RAの疾患モデルとしての有用性を示した。また本発明者らは シノビオリン遺伝子を lacZ遺伝子に置換したノックイン動物を作成した。シノピオ リン遺伝子のノックイン動物は、シノビオリン遺伝子の欠損による影響の解析が可 能となる他、 シノビオリン遺伝子の内因性プロモーターにより発現される LacZ ( β -ガラクトシダーゼ活性として） の検出により、 シノビオリン遺伝子プロモーター の活性を容易に検出することができる。 このノックイン動物を利用して、 シノビォ リン遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングすることが可能となる。リゥ マチ患者の関節でのシノビオリン遺伝子の発現亢進を抑制することにより、滑 β莫增 生を防ぎ疾患を寛解させることも可能と考えられる。 ■
本発明者らが見出した遺伝子は、 RAの疾患の主座である滑膜組織の増殖に密接に 関連しており、 診断においてはきわめて重要な情報を与えるものである。 また、 R Αの病因である滑膜組織の増殖に関与する本発明の遺伝子、 その発現産物、 発現産 物に対する自己抗体、更に発現産物のリガンドも、 RAの病態を説明する上で不可欠 な物資と考えられる。特にシノビオリンを認識する自己抗体が RA患者の血中に見出 されることは、 RAの診断上まったく新しいアプローチをもたらすものである。また これらの物質は、 RAの治療方法の開発においても、今までに無い新しいアプローチ をもたらすものでもある。
また、 シノピオリンリガンドとして同定された S1 - 5の変異が、 MLおよび DHRDに関 連していること力、ら、 シノビオリンもまた、 これらの疾患の関与している可能性が ある。 従って、 シノビオリンはこれらの疾患の診断に利用され得る他、 シノビオリ ンリガンドとシノビオリンとの結合を調節する化合物や、シノピオリンのリガンド として作用する化合物等は、 これらの疾患に対する医薬の候補となる。
また、 シノビオリンは発生において未分化間葉系細胞で発現している。 したがつ てシノビオリンを細胞マーカーとして未分化間葉系細胞をセルソーターなどによ り分離することができる。 分離された未分化間葉系細胞は、試験管内での組織再生 のために利用することができる。試験管内で関節を再構築することができれば、慢 性リゥマチ患者のみならず、関節破壊に苦しむ多くの患者に対する再生医療に有用 でめる。
すなわち本発明は、 以下のシノビオリンタンパク質、 その抗体、 それをコードす るボリヌクレオチド、 それらの用途、 シノビオリンリガンドとその用途、 ならびに シノビオリン遺伝子の発現が改変されたトランスジヱニック動物およびその用途 に関する。
〔1〕 下記 （a ) から （e ) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリ ヌクレオチド、
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレ ォチド、
( c ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ 酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付カ卩したアミノ酸配列を有し、 配列 番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコ 一ドするポリヌクレオチド。
( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズし、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列 力 らなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
( e ) 配列番号： 1に記載の塩基配列と少なくとも 7 0 %以上の相同性を有 する塩基配列からなり、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
〔 2〕配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質の部分ぺプチドをコード するポリヌクレオチド。
〔3〕 〔1〕 、 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質 またはべプチド。
〔4〕 次の （1 ) 一 （3 ) からなる群から選択される少なくとも 1つの活性を有す る 〔3〕 に記載の蛋白質またはペプチド。
( 1 ) 慢性関節リゥマチ患者の血液中に見出される抗体と結合する
( 2 ) シノピオリンリガンド S1-5と結合する
( 3 ) 滑膜増生を促進する
〔5〕 〔1〕 、 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドが揷入されたベクター。 〔6〕 〔1〕 に記載のポリヌクレオチドまたは 〔5〕 に記載のベクターを保持する 形質転換細胞。
〔7〕 〔6〕 に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養上清 力 ら発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、 〔3〕 に記載 の蛋白質またはぺプチドの製造方法。
〔8〕 〔3〕 に記載の蛋白質またはペプチドに結合する抗体。
〔9〕 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチドを含む、 〔3〕 に記載のタンパク 質またはペプチドを認識する抗体を分析するための免疫学的分析用試薬。
〔1 0〕慢性関節リウマチの診断、 または治療効果の判定を目的とするものである 〔9〕 の免疫学的分析用試薬。
〔1 1〕 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチドと反応する抗体を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質を分析するための免疫学的分析用試薬。
〔1 2〕慢性関節リゥマチの診断、または治療効果の判定を目的とするものである
〔1 1〕 に記載の免疫学的分析用試薬。
〔1 3〕分析すべき〔3〕に記載のタンパク質が滑膜細胞に存在するものである〔1
2 ] の免疫学的分析用試薬。
〔1 4〕 次の工程を含む、 生体試料中の 〔3〕 に記載の蛋白質、 および/またはそ の部分ぺプチドに結合する抗体の測定方法。
(1)生体試料を 〔3〕 に記載の蛋白質、 および/またはその部分ペプチドと接 触させる工程、 および
(2) 〔3〕 に記載の蛋白質、 および/またはその部分ペプチドに結合する抗 体を検出する工程
〔1 5〕 次の工程を含む、 生体試料中の 〔3〕 に記載の蛋白質、 および/またはそ の部分ぺプチドの測定方法。
(1)生体試料を 〔8〕 に記載の抗体と接触させる工程、 および
(2)〔3〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドに結合する、 〔8〕 に記載の抗体を検出する工程
〔1 6〕配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補 鎖に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
〔1 7〕 次の工程を含む、 生体試料中の 〔1〕 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオ チドの測定方法。
(1)生体試料を 〔1 6〕 に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、 および
(2) 〔1〕 または〔2〕に記載のポリヌクレオチドにハイブリダィズする、 〔1 6〕 に記載のポリヌクレオチドを検出する工程
〔1 8〕 〔1 6〕 に記載のポリヌクレオチドを含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載の ポリヌクレオチドの測定用キット。
〔1 9〕 〔3〕 に記載のタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子の発現 を指標に、 該タンパク質を発現する細胞を検出または分離する方法。
〔2 0〕 細胞がリウマチ滑膜細胞である、 〔1 9〕 に記載の方法。
〔2 1〕 細胞が未分化間葉系細胞である、 〔1 9〕 に記載の方法。
〔2 2〕 〔8〕 に記載の抗体を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質を発現する細胞の 検出または分離用試薬。
〔2 3〕 次の工程を含む、 慢性関節リゥマチの検出方法であって、 慢性関節リゥマ チのマーカーが、 〔1〕 に記載のポリヌクレオチド、 〔3〕 に記載のタンパ ク質、 〔3〕 に記載のペプチド、 〔3〕 に記載のタンパク質に結合する抗体、 および 〔3〕 に記載のペプチドに結合する抗体からなる群から選択された少 なくともひとつのマーカーである方法。
i) 被検者の生体試料中に存在する慢性関節リゥマチのマーカーを検出する 工程、 および
ii) 工程 i)の検出結果を、 慢性関節リウマチと関連付ける工程
〔2 4〕 生体試料が被検者の血液であり、 慢性関節リウマチのマーカーが 〔3〕 に 記載のタンパク質に結合する抗体、 および/または 〔3〕 に記載のペプチド に結合する抗体である 〔2 3〕 に記載の方法。
〔2 5〕生体試料が被検者の滑膜組織または滑膜細胞であり、慢性関節リゥマチの マーカーが 〔1〕 に記載のポリヌクレオチド、 および Zまたは 〔3〕 に記載 のタンパク質である 〔2 3〕 に記載の方法。
〔2 6〕 次の工程を含む、 被験化合物の 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチド と結合する活性の検出方法。
a ) 被験化合物を 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるェ 程、 および .
b ) 被験化合物と前記タンパク質またはぺプチドとの結合を観察する工程 〔2 7〕 次の工程を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチドと結合する活 性を有する化合物のスクリーニング方法。 a ) 〔2 6〕 に記載の方法によって被験化合物の 〔3〕 に記載の蛋白質また はペプチドに対する結合活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記結合活性が高い被験化合物を選択する工程
〔2 8〕 次の工程を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質とそのリガンドとの結合を阻 害する活性の検出方法。
a ) 被験化合物存在下で 〔3〕 に記載のタンパク質またはペプチドとそのリ ガンドとを接触させる: 程、 および
b ) 前記タンパク質またはペプチドに結合するリガンド、 および Zまたは被 験化合物を検出する工程
〔2 9〕 リガンドがシノビォリンリガンド S1 - 5である 〔2 8〕 に記載の方法。 〔3 0〕 次の工程を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質とそのリガンドとの結合を阻 害する化合物のスクリーニング方法。
a ) 〔2 8〕 に記載の方法によって、 被験化合物の 〔3〕 に記載のタンパク 質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を検出する工程、 および b ) 対照と比較して前記阻害活性が高い被験化合物を選択する工程 〔3 1〕 次の工程を含む、 被験化合物の 〔3〕 に記載のタンパク質によるシグナル 伝達を調節する活性を検出する方法。
a ) 前記タンパク質のリガンドの存在下または不存在下で、 被験化合物と前 記タンパク質を接触させる工程、 および
b ) 前記タンパク質を介するシグナル伝達を検出する工程
〔3 2〕 次の工程を含む、 〔3〕 に記載のタンパク質によるシグナル伝達を調節す る活性を有する化合物のスクリーニング方法。
a ) 〔3 1〕 に記載の方法によって、 被験化合物の前記タンパク質によるシ グナル伝達を調節する活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記調節の活性が高い被験化合物を選択する工程 〔3 3〕 次の工程を含む、 〔 1〕 に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性 の検出方法であって、
a ) 被験化合物の存在下で 〔1〕 に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞 を培養する工程、 および
b ) 前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
〔3 4〕 次の工程を含む、 〔 1〕 に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する化合 物のスクリーユング方法。
a ) 〔3 3〕 に記載の方法によって、 被験化合物の 〔1〕 に記載のポリヌク レオチドの発現を調節する活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記活性に差を有する被験化合物を選択する工程 〔3 5〕 〔2 7〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を 有効成分として含む、 シノビオリン刺激剤。
〔3 6〕 〔3 0〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を 有効成分として含む、シノピオリンとシノビオリンリガンドとの結合阻害剤。 〔3 7〕 〔3 0〕 または 〔3 2〕 のスクリーニング方法によって得ることができる 化合物を有効成分として含む、 滑膜増生阻害剤。
〔3 8〕 〔1〕 若しくは 〔2〕 に記載のポリヌクレオチド、 〔3〕 に記載の蛋白質 若しくはペプチド、 および 〔5〕 に記載のベクターからなる群から選択され るいずれかの成分を有効成分として含有する医薬組成物。
〔3 9〕 〔1〕 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドの発現が改変きれているか、 または該改変を誘導することができるトランスジヱニック非ヒト脊椎動物。 〔4 0〕 〔1〕または 2に記載のポリヌクレオチドが外来的に導入されている、 〔3
9〕 に記載のトランスジェユック非ヒ ト脊椎動物。
〔4 1〕 慢性関節リゥマチモデル動物である、 〔4 0〕 に記載のトランスジヱニッ ク非ヒ ト脊椎動物。
〔4 2〕 内因性に持つ 〔1〕 または 〔2〕 のいずれかに記載のポリヌクレオチドの 発現が抑制されているトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物。 〔4 3〕 他の遺伝子がノックインされている、 〔4 2〕 に記載のトランスジェニッ ク非ヒト脊椎動物。
〔4 4〕 〔4 0〕 または 〔4 2〕 に記載のトランスジェエック非ヒ ト脊椎動物に由 来する細胞。
〔4 5〕 次の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドの内因性 プロモーターの活性を調節する活性の検出方法。
a ) 〔1〕 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドの内因性プロモーター の制御下にレポーター遺伝子を発現することができる発現系に、 被験化合物 を接触させる工程、 および
b ) レポータ一遺伝子の発現レベルを測定する工程
〔4 6〕 前記発現系が、 〔4 3〕 に記載のトランスジヱニック非ヒ ト脊椎動物また はこの動物に由来する細胞である 〔4 5〕 に記載の方法。
〔4 7〕 次の工程を含む、 〔1〕 または 〔2〕 に記載のポリヌクレオチドの内因性 プロモータ一の活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
a ) 〔4 5〕 に記載の方法によって、 被験化合物の 〔1〕 または 〔2〕 に 記載のポリヌクレオチドの内因性プロモーターの活性を調節する活性を測定 する工程、 および
b ) 対照と比較して、 前記活性に差がある被験化合物を選択する工程
〔4 8〕 〔3 4〕 、 または 〔4 7〕 に記載のスクリーニング方法によって得ること ができる化合物を有効成分として含む、 〔1〕 に記載のポリヌクレオチドの 発現を調節するための医薬組成物。
また本発明は、 〔2 7〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる 化合物を投与する工程を含む、 シノビオリンの刺激方法に関する。 あるいは本発明 は、 〔3 0〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与 する工程を含む、シノピオリンとシノピオリンリガンドとの結合阻害方法に関する。 更に本発明は、 〔3 0〕 または 〔3 2〕 のスクリーニング方法によって得ることが できる化合物を投与する工程を含む、滑膜増生阻害方法に関する。加えて本発明は、 〔1〕 若しくは 〔2〕 に記載のポリヌクレオチド、 〔3〕 に記載の蛋白質若しくは ペプチド、 および 〔5〕 に記載のベクターからなる群から選択されるいずれかの成 分を投与する工程を含む、 滑膜増生促進方法に関する。 更に本発明は、 〔3 4〕 、 または〔4 7〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投 与する工程を含む、 〔1〕 に記載のポリヌクレオチドの発現を調節するための方法 に関する。
また本発明は、 〔2 7〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる 化合物の、 シノビォリンの刺激剤の製造における使用に関する。 あるいは本発明は、
〔3 0〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、 シノビ ォリンとシノピオリンリガンドとの結合阻害剤の製造における使用に関する。更に 本発明は、 〔3 0〕 または 〔3 2〕 のスクリーニング方法によって得ることができ る化合物の、滑膜増生阻害剤の製造における使用に関する。加えて本発明は、 〔1〕 若しくは 〔2〕 に記載のポリヌクレオチド、 〔3〕 に記載の蛋白質若しくはぺプチ ド、 および 〔5〕 に記載のベクターからなる群から選択されるいずれかの成分の、 滑膜增生促進剤の製造における使用に関する。更に本発明は、 〔3 4 ]、または〔4 7 ] に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、 〔1〕 に記 載のポリヌクレオチドの発現を調節するための医薬品製剤の製造における使用に 関する。
本発明は、配列番号： 1に示す塩基配列の蛋白質コード領域を含むシノビォリン をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明においてポリヌクレオチドは、 DNAまたは RNAであってよい。 また、修飾されたヌクレオチドを含むものであっても よい。本発明によるシノビオリンをコ一ドするポリヌクレオチドは、前記 RA患者の 滑膜細胞から公知の方法によりクローニングすることができる （Nucleic Acid Re s. 16 : 7583-7600， 1988) 。 具体的には、 滑膜組織や培養細胞として回収した RA患 者の関節炎を発症した組織に由来する滑膜細胞から抽出した raRNAをもとに cDNAラ イブラリーを得る (Nucleic Acid Research, 16, 7583, 1988) 。 配列番号： 1に 示した塩基配列に基づいて設定したプローブを用いて、このライプラリーからハイ ブリダィズするクローンをスクリーユングすることによってシノビオリン遺伝子 を単離することができる。
本発明はまた、先に述べたシノビォリンと機能的に同等なタンパク質をコードす るポリヌクレオチドをも含む。本発明においてシノビオリンと機能的に同等な蛋白 質をコードするポリヌクレオチドを、シノビオリンと機能的に同等なポリヌクレオ チドと言う。機能的に同等なタンパク質とは、第 1にシノビォリンと免疫学的に同 等なタンパク質を示すことができる。すなわち本発明におけるシノビォリンと機能 的に同等なタンパク質とは、 シノビォリンを特異的に認識し、 RA患者の血清中に存 在する抗体と反応するものであれば、シノピオリンのドメインであることができる。 あるいはこの免疫学的に活性なドメインを含むタンパク質の断片であることもで きる。 これらの変異体は、 RA患者血清パネルと正常者の血清を使ってシノビオリン の断片をスクリーニングすることによって当業者であれば容易に選択することが できる。
本発明によるシノビオリンと機能的に同等なタンパク質は、免疫学的な特性のみ ならず SL (S1-5) との結合特性に基づいても定義される。 すなわち本発明は、 SL (S1-5) との親和性を備えるシノビォリンの断片を含む。 これらの変異体は、 SL (S1-5)を使って候補タンパク質をスクリーニングすることによって当業者であれ ば容易に選択することができる。 たとえば本発明者らが見出した SL (S1-5) は、 実施例に示したようにシノビォリンの cDNAにおいて 1233- 1592番目に相当する 120 アミノ酸残基をシノビオリンとの結合に必要な領域として要求する。したがって、 この領域を構成するアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいはこのアミノ酸配列 を含むタンパク質は本発明によるシノビオリンと機能的に同等なタンパク質を構 成する。 SLとしては accession number AAA65590 (nucleotide accession U03877)、 138449、 NP— 061489 (nucleotide accession匪— 018894)、 NP 004096 (nucleotide accession醒_004105)、 または Q12805 に特定される SI - 5タンパク質や、それら に類似したタンパク質であってヒ トシノピオリンタンパク質 （配列番号： 2 ) に結 合する活性を有するタンパク質を用いることができる（Lecka- Czernik, B. et al. ,
Mol. Cell. Biol. 15， 120—128, 1995； Heon, E. et al. , Arch. Ophthalmol. 1 14, 193-198, 1996； Ikegawa, S. et al. , Genomics 35, 590-592， 1996； Katsan is, N. et al. , Hum. Genet. 106, 66—72， 2000； Giltay, R. et al. , Matrix Bi ol. 18, 469-480, 1999； Stone, E. M. et al. , Nat. Genet. 22, 199-202, 199 9) 。
また、 ヒ トシノビオリンと機能的に同等なタンパク質としては、滑膜増生を促進 する活性を有するタンパク質が挙げられる。ヒ トシノビォリン遺伝子が導入された トランスジェニックマウスは、有意な頻度で関節炎を伴う指の膨脹が認められた。 組織学的には、これらの指関節では滑膜増生を伴う骨破壊と異常な骨新生が認めら れた。 ヒ トシノビォリンタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、滑膜増生を促 進する活性に基づいても定義される。 滑膜增生の促進は、 トランスジエニック動物 の作製により検証することができる他、関節への局所的な遺伝子導入、 あるいはィ ンビトロ培養滑膜細胞においてタンパク質を発現させることにより検証すること ができる。本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスジエニック動物を得る方法 は、 後に述べる。
また、 ヒ トシノビオリンと機能的に同等なタンパク質としては、正常な骨形成ま たは四肢の発達に貢献する活性を有するタンパク質が挙げられる。シノビオリンは 発生において頭頂骨、 四肢、耳などの骨および軟骨が形成される部位に強く発現し ており、 四肢形成期においては Apical Ectodermal Ridge (AER;外胚葉頂堤） およ び軟骨 ·骨原基に強い発現が観察された。 ターゲティングにより内因性シノビオリ ン遺伝子を欠損させたノックァゥトマウス胚は、頭頂部から臀部までの長さが短く、 頭蓋や四肢の形成が未熟である傾向が認められ、 ホモ接合体では肢芽、上下顎骨お よび耳に形態異常を示し高い確率で胎生致死となった。シノビオリン遺伝子ホモノ ックァゥトマウスは、 胎生期において肢芽の発生異常が認められ、 また、 軟骨及び 骨への形成が認められず、肢芽と軟骨、骨の発生部位にシノビオリンの発現が認め られたことから、シノビォリン分子が骨格形成おょぴ四肢の発達に関与しているこ とが示される。
explant法による培養系を用いた解析では、 シノビオリンノックアウト (lacZ遣 伝子のノックイン）マウス胎仔の肢芽由来の細胞における LacZの発現は軟骨 '骨お よび肢の原基となると考えられる未分化間葉系細胞にのみ認められた。さらにァノレ カリフォスファターゼ染色、 Kossaの染色などにより、 骨 '軟骨形成能がホモノッ クアウト由来の細胞では遅延していることが確認された。正常な骨形成または四肢 の発達への関与は、 ノックアウト動物の作製により検証することができる他、イン ビト口培養における骨 ·軟骨細胞のマーカー遺伝子の発現の解析や骨形成能の解析 などを利用して行うことも考えられる。またある蛋白質が正常な骨形成または四肢 の発達に貢献する活性を有することは、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制さ れたノックァゥト動物や培養細胞において、当該ポリヌクレオチドがコ一ドする蛋 白質の投与、あるいは当該蛋白質をコードする DNAまたは RNAの発現によって失われ た機能が相補されることによっても確認、することができる。
加えて本発明によるシノピオリンと機能的に同等なタンパク質は、シノピオリン が有する生化学的な活性に基づいても定義される。シノピオリンの生化学的な活性 とは、たとえばチロシンキナーゼゃュビキチンリガーゼ活性を示すことができる。 これらの生化学的な活性は、 シノピオリンに見出された各種のモチーフや、実施例 の結果に裏付けられている。すなわち本発明は、 シノビォリンが有する少なくとも 一つの生化学的な活性を維持したシノビオリンの断片を含む。シノビオリンの生ィ匕 学的な活性の確認方法や、それぞれの生ィヒ学的な活性を保持している領域について は後に具体的に述べる。
これらのシノビオリンに機能的に同等なタンパク質は、他のタンパク質との融合 タンパク質とすることができる。 たとえば、 FLAGタグ、 HAタグ、 あるいはヒスチジ ンタグなどの付加的なアミノ酸配列が付加され、前記シノビオリンに機能的に同等 なタンパク質としての少なくとも一つの性状を維持したタンパク質は、前記機能的 に同等なタンパク質に含まれる。付加するタンパク質力 シノビォリンとは異なる 活性を有している場合も、シノビォリンが有する少なくとも一つの機能を維持して いる場合には、 その融合タンパク質は、本発明に置ける機能的に同等なタンパク質 に含まれる。
前記本発明のポリヌクレオチドに対して変異を含む塩基配列で構成されるポリ ヌクレオチドも、 当業者によって公知の方法 （実験医学別冊'遺伝子工学ハンドブ ック， pp246- 251、 羊土社、 1991年発行） で単離することができる。 たとえば類似 する遺伝子を含むライブラリーを対象に、 配列番号： 1に示す塩基配列 （またはそ の断片） をプローブとしてスクリーニングすれば、相同性の高い塩基配列を持った DNAをクローニングすることが可能である。 このようなライブラリ一としては、 配 列番号： 1の塩基配列に対してランダムに変異を入れたもの、 ヒト以外の種に由来 する滑膜組織の cDNAライブラリ一等を示すことができる。
与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、 たとえば D NAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている （Proc. Natl. Acad. Sci. US A.， 79 : 7258 - 7260, 1982) 。 この方法では、 変異を導入したいセグメントを亜硝酸 処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入するこ とができる。 あるいはまた、 目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としては gapped duplex法等がある (Methods in Enzymol. , 154: 350 - 367, 1987) 。 変異を 導入すべき遺伝子をクローニングした環状 2本鎖のベクターを 1本鎖とし、目的と する部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダィズさせる。制限酵素 により切断して線状化させたベクター由来の相捕 1本鎖 DNAを、 前記環状 1本鎖べ クタ一にァニールさせ、 前記合成ヌクレオチドとの間のギャップを DNAポリメラー ゼで充填し、更にライゲーションすることにより完全な 2本鎖環状ベクターとする c 改変されるアミノ酸の数は、 典型的には 50アミノ酸以内であり、 好ましくは 30 アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内 （例えば、 1アミノ酸） であ ると考えられる。
アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、 もとのタ ンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記ァ ミノ酸置換において保存的置換が加えられたタンパク質であって、ヒトシノビオリ ン蛋白質 （配列番号： 2 ) と機能的に同等なタンパク質が含まれる。 保存的置換は、 タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要 であると考えられる。 このようなアミノ酸の保存的置換は、 当業者にはよく知られ ている。
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性ァミノ酸（例 えばリジン、 アルギニン、 ヒスチジン） 、 酸性アミノ酸 （例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸） 、 非荷電極 ^ "生アミノ酸 （例えばグリシン、 ァスパラギン、 グノレタミ ン、 セリン、 スレオニン、 チロシン、 システィン） 、 非極性アミノ酸 (例えばァラ ニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 プロリン、 フエニノレアラニン、 メチォ二 ン、 トリプトファン） 、 J3分岐アミノ酸 （例えばスレオニン、 バリン、 イソ口イシ ン） 、 および芳香族アミノ酸 （例えばチロシン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファ ン、 ヒスチジン) などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性 化型タンパク質などを含む）または下降（例えばドミナントネガティブなどを含む） させることも考えられる。
配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において、 1若しくは複数のァミノ酸が、 置 換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付カ卩したアミノ酸配列を有し、 配列番号： 2に記 載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、天然に存在する蛋白 質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られている ように、多型現象 (polymorphism)を有する。 この多型現象によって生じた塩基配列 の変化によって、 1または複数個のアミノ酸が、 置換、 欠失、 揷入、 および/また は付力 tlされる場合がある。 このように自然に存在する蛋白質であって、かつ配列番 号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が、 置換、 欠失、 挿入、 およびノまたは付カ卩したァミノ酸配列を有し、 配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 本発明に含まれる。
実際に本発明者らは、 本発明の遺伝子を複数の個体からクローユングし、 その塩 基配列を決定することによって、 1アミノ酸を欠失したクローンを確認した。 この ようなアミノ酸配列に変異を含む蛋白質、並びにそれをコードする塩基配列からな るポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。本発明者らが確認した 1アミノ酸を欠 失したクローンの塩基配列を配列番号： 6に、そしてこの塩基配列によってコード されるアミノ酸配列を配列番号： 7に示した。 配列番号： 6の塩基配列は、 配列番 号： 1における 1293- 1295に相当する gcaを欠損している。 その結果、 配列番号： 7 に記載のアミノ酸配列は、 配列番号： 2における 412位の Alaを欠損している。
あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらな い場合もある。 このような塩基配列の変異は、 サイレント変異と呼ばれる。 サイレ ント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。 なおここで言う 多型現象とは、集団内において、 ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有するこ とを言う。 多型現象は、 異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。
この他、 シノビォリンと機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイプリ ダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。 すなわち、 配列番号： 1に 示すような本発明によるシノビオリンをコ一ドするポリヌクレオチド、あるいはそ の断片をプローブとし、これとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチド を単離するのである。ハイブリダィゼーションをストリンジェントな条件下で実施 すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果と して単離されるタンパク質にはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質が含ま れる可能性が高まる。 相同性の高い塩基配列とは、 たとえば 70%以上、望ましくは 9 0%以上の同一性を示すことができる。 なおストリンジヱントな条件とは、具体的には例えば 6 XSS (：、 40%ホルムアミ ド、
25°Cでのハイブリダイゼーシヨンと、 1 X SSCヽ 55°Cでの洗浄といつた条件を示すこ とができる。 ストリンジエンシーは、 塩濃度、 ホルムアミ ドの濃度、 あるいは温度 といった条件に左右される力 当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェ ンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイプリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種に おけるシノビオリンのホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能であ る。 ヒト以外の動物種、 すなわちマウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ、 あるいはャギ等 の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコ一ドするシノビオリンのホ モログは、 本発明における機能的に同等なタンパク質を構成する。
本発明によるポリヌクレオチドは、 その由来を問わない。 すなわち、 cDNA、 ゲノ ム DNAのほ力、 合成によって得ることもできる。 また、 本発明のタンパク質をコー ドしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチド が含まれる。
ヒトシノビォリン （配列番号： 2 ) に変異を導入して得たタンパク質や、 上記の ようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドが コードするタンパク質は、 通常、 ヒトシノビォリン （配列番号： 2 ) とアミノ酸配 列において高い相同性を有する。 高い相同性とは、 少なくとも 30%以上、 好ましく は 50%以上、 さらに好ましくは 80%以上 （例えば、 95%以上） の配列の同一性を指 す。塩基配列ゃァミノ酸配列の同一性は、ィンターネットを利用したホモ口ジー検 索サイトを利用して行うことができる [例えば日本 DNAデータバンク （DDBJ) にお いて、 FASTA、 BLAST, PSI BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例 えば日本 DNAデータバンク （DDBJ) のウェブサイ トの相同性検索 （Search and Ana lysis) のへーシ ； http ://w w. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology-j. html] 0 ま 7こ、 National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、 BLASTを用い た検索を行うことができる （例えば NCBIのホームページのウェブサイトの BLASTの ページ; http://ww . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/; Altschul, S. F. et al. , J. Mol. Biol. , 1990, 215 (3) : 403-10； Altschul, S. F. & Gish, W. , Meth. Enzymol. , 1 996， 266 : 460 - 480; Altschul, S. F. et al.， Nucleic Acids Res. , 1997, 25 : 338 9-3402) ] 。
例えば Advanced BLAST 2. 1におけるァミノ酸配列の同一性の算出は、 プロダラ ムに blastpを用い、 Expect値を 10、 Filterは全て OFFにして、 Matrixに BL0SUM62を 用い、 Gap existence cost、 Per residue gap cost、 およひ Lambda ： ratioを れ ぞれ 11、 1、 0. 85 (デフォルト値） に設定して検索を行い、 同一性 （identity) の 値 （％) を得ることができる （Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 87 : 2264 - 68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873—7) 。
本発明は、これらのポリヌクレオチドのタンパク質生産以外の用途も提供するも のである。すなわち本発明は、本発明によって提供されるシノビォリンをコードす るポリヌクレオチド、あるいはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチドを 含む。 アンチセンスは、 遺伝子の転写を有効に阻害するために、 15- 20ヌクレオチ ド程度の鎖長とすることが好ましレ、。シノビオリンが滑膜細胞の異常な増殖を支え ているとすれば、 RAの治療においてシノビオリンのアンチセンスが果たす役割は大 きい。遺伝子発現の制御という観点から見ると、ァンチセンスのみならずリボザィ ムの設計も可能である。 すなわち、 配列番号： 1で示す DNAのコード領域から転写 された RNAを認識し、 これを切断するリボザィムを設計することができる。
本発明はまた、これら本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と相補的な少 なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチドに関する。これらのポリ ヌクレオチドは、好ましくは上記の本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と 相補的な 20ヌクレオチド以上、 より好ましくは 25ヌクレオチド以上、 さらに好まし くは 30ヌクレオチド以上の鎖長を持つポリヌクレオチドである。 ここで 「相補鎖」 とは、 A: T (ただし RNAの場合は U) 、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖核酸の一方の鎖に 対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15個の連続したヌクレ ォチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70%、好ましくは 少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の 相同性を有する塩基配列を含む。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書 に記載したものを使用することができる。 これらには、例えば上記の本発明のポリ ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも 1 5ヌ クレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチドが含まれる。
ハイブリダイゼーションは、本発明のポリヌクレオチドに対して特異的であるこ とが好ましい。特異的とは、 ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下 で、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとのクロスハイブリダィゼーシ ョンが有意に生じないことを意味する。
これらのポリヌクレオチドは、シノビオリン遺伝子の検出や増幅を可能とするプ ローブやプライマーとして有用である。本発明によるプローブやプライマーは、与 えられたストリンジエンシーの基で特異的なハイブリダイズが可能と.なるように 少なくとも 15mer程度の鎖長を備え、 配列番号： 1に示した塩基配列の中でも、 シ ノビオリンに特異的な配列に対してハイブリダィズできる塩基配列を持つものが 好ましい。与えられた塩基配列に基づいて、プローブやプライマーに有用な塩基配 列を設定することは当業者にとって自明である。本発明に基づいて提供されるシノ ピオリン遺伝子特異プローブやプライマーを利用すれば、滑膜細胞標本のィンサイ チュにおけるハイブリダィゼーションゃ PCRが可能となる。 シノピオリンは RA患者 の滑膜組織に強発現していることから、 その細胞内における発現状態の把握は、 R A関節炎症状を把握するための重要な情報を与えるものと考えられる。
本発明による新規なタンパク質であるシノピオリンは、 RA患者滑膜組織から得る ことができる。滑膜細胞はィンビトロで培養することができるので、 この培養物か らシノビォリンを回収することが可能である。 具体的には、 RA患者から滑膜切除術
(synovectomy) により外科的に切除された滑膜組織等をもとにこの組織から滑膜 細胞を分離する。 分離した細胞を培養すれば、滑膜細胞を付着性細胞として回収す ることができる (J. Clin. Invest. 92： 186-193, 1993) 。 回収した細胞からは、 公知のタンパク質精製技術を組み合わせてシノビォリンを抽出 ·精製する。
本発明は、 滑 B莫細胞から抽出されるヒ ト ·シノピオリンのみならず、 シノビオリ ンと機能的に同等なタンパク質をも含むものである。すなわち、本発明のタンパク 質としては、 人工的か自然に生じたものかを問わず、 ヒト 'シノビォリンのアミノ 酸配列 （配列番号： 2 ) において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加お よび/または揷入などにより変異したタンパク質であって、ヒトシノビオリンと機 能的に同等なタンパク質が含まれる。これらタンパク質におけるァミノ酸の変異数 や変異部位は、 シノビオリンの機能が保持される限り制限はない。
シノビォリンの断片は、 プロテアーゼを使った消化により得ることができる。 ま た、 配列番号： 1に示したシノビオリンをコードする DNAをランダムに切断し、 そ れをファージベクターに挿入してドメインぺプチドを提示したファ一ジライブラ 'リーを作成することによつても得ることができる。 これらのライブラリーを、 シノ ピオリンを認識する抗体でィムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性なドメイ ンを決定することができる。免疫学的に活性なドメィンを特定するための手法は、 そのままリガンドとの結合活性を持つドメインを特定するための手法としても利 用することができる。 クローニングしたファージについて、挿入断片の塩基配列を 決定すれば、 活十生ドメインのアミノ酸配列も明らかにすることができる。
本発明によるタンパク質、 またはその機能的に同等なタンパク質は、糠鎖等の生 理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、 あるいは他のタンパク質との融合と レヽつた各種の修飾を加えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝 子組み換え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる 可能性がある。 しかしたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示 されたシノビオリンタンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも本発明 によるシノビオリン、 または機能的に同等なタンパク質である。 ピオリンは、生体材料のみならず、 これをコードする遺伝子を適当な発現系 に組み込んで遺伝子組み換え体 （recombinant) として得ることもできる。 シノビ オリンを遺伝子工学的な手法によって得るためには、先に述べたシノビオリンをコ 一ドするポリヌクレオチドを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。本発明 に応用可能なホスト/ベクター系としては、 発現ベクター pGEX- 5X - 3と大腸菌を示 すことができる。 pGEX - 5X-3は外来遺伝子をダルタチオン S-トランスフェラーゼ（G ST) との融合タンパク質として発現させることができる （Gene, 67 : 31 - 40， 1988) ので、 シノビォリンをコードする遺伝子を組み込んだ pGEX- 5X- 3をヒートショック で BL21のような大腸菌株に導入し、 適当な培養時間の後に isoPropylthio_ i3 - D - g alactoside (IPTG) を添加して GST融合シノビォリンの発現を誘導する。 シノピオ リンをコ一ドする遺伝子は、 滑膜細胞の cDNAライブラリ一等を錶型として PCR等で 増幅することにより得ることができる。 本発明による GSTはダルタチオンセファロ ース 4Bに吸着するため、発現生成物はァフィ二ティクロマトグラフィーによって容 易 分離 ·精製することが可能である。
シノビォリンの recombinant を得るためのホス ト Zベクタ—系としては、 この 他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合 には、 ヒスチジンタグ、 HAタグ、 Flagタグ等を利用した融合タンパクの発現用べク ターが市販されている。酵母では、尸 属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現 に有効なことが公知である。 糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするノく キュロウィルスベクターを利用した発現系も有用である （Bio/Technology, 6 : 47- 55， 1988) 。 更に、 哺乳動物の細胞を利用して、 CMV、 RSV、 あるいは SV40等のプロ モーターを利用したベクターのトランスフエクションが行われており、これらのホ スト /ベクタ一系は、いずれもシノビォリンの発現系として利用することができる。 また、 レトロウイルスベクター、 アデノウィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスべ クタ一等のウィルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできる。
本発明によって提供される新規なタンパク質シノビオリン、またはその免疫学的 に同等なタンパク質は、その免疫学的な特 1·生を利用して RAの診断において有用であ る。 RA患者の血中にはシノビオリンを認識する抗体が高い頻度で検出され、正常者 の血中には実質的に検出されない。 したがって、本発明によるシノビオリンを抗原 として被検者が有する抗体を免疫学的に分析すれば、 RAの診断において有用な情報 を与える。すなわち、被検者の体液中にシノビオリンに反応する抗体が検出された ときには、 被検者が RAであると診断することができる。
抗体の免疫学的分析方法には多くの方法が一般に普及している。抗原感作プレー トをサンプル中の抗体と反応させ、プレート表面に捕捉される検出対象となる抗体 を、抗体特異的な標識抗体で検出する方法は、抗体の免疫学的分析方法としてはも つともポピュラーな方法である （Immunochemistry, 8 : 871-879, 1971) 。 標識に酵 素を用いた方法は ELISA法と呼ばれ、 広く普及している。 また抗原を吸着させたラ テックス粒子をサンプルと混合し、免疫学的な凝集反応として抗体を検出する方法 も公知である （Am. J. Med. , 21： 888-892, 1956) 。 免疫学的粒子凝集反応は 1試 薬で迅速な分析が可能な方法であり、大規模なスクリ一ニングには好適な方法であ る。
更に、最近ではィムノクロマトグラフ法が簡易分析方法として一般化している。 この方法を抗体の免疫学的分析方法に応用するには、標識シノビォリンと抗シノビ オリン抗体との反応をサンプル中の抗体が阻害するような反応系を構成する。具体 的には、たとえば標識シノビォリンとサンプルを最初に接触させ、 クロマトグラフ 的な展開によって試薬成分である抗シノビオリン抗体と接触するように配置する。 サンプル中にシノピオリン抗体が存在する場合には、既に標識シノビオリンが反応 してしまっているので、試薬成分である抗シノビオリン抗体とはもはや反応するこ とができない。抗シノビオリン抗体を固定しておいて、その領域における標識シノ ピオリンの反応状態を観察すれば、サンプルの滴下のみでィムノアツセィを行うこ とができる。
、て、抗体をクラス別に分析することが可能である。 特定のクラスの抗体に関する情報が必要な場合には、 IgGや IgMといったィムノグロ プリンのクラスを識別しうる抗体を組み合わせれば良い。 感染症では、通常、感染 初期の IgM抗体測定値の上昇、 その後に続く IgM抗体測定値の低下と IgG抗体測定値 の上昇という遷移が観察される。 このようなクラス別の抗体測定値が、本発明にお いても RAの臨床的な症状と関連性を持つ可能性がある。 より具体的には、抗体のク ラス別測定により、 薬効の判定や、 RA発症の予知に結びつく可能性がある。
抗体の検出においては、抗原分子そのもののみならず、化学的に合成したオリゴ ペプチドを抗原として用いる方法が採用されることも多い。 これは、特に優勢なェ ピトープ、あるいは臨床的になんらかの意味を持つェピトープに特異的な分析系と したほうが非特異的な反応の影響を受けにくくなるためである。シノピオリンにつ いても、 このようなアプローチは有効である。 具体的には、 先に述べた免疫学的に 活性なドメィンぺプチドを得る方法に基づいて、ェピトープとして機能するドメィ ンを決定することができる。 ェピトープは少なくとも 3ァミノ酸 基で構成できる 場合のある事が知られている。 また他のタンパク質との免疫学的な識別は、少なく とも 8アミノ酸残基で可能となるといわれている。 したがって、 シノビオリンのァ ミノ酸配列から選択された少なくとも連続した 8ァミノ酸残基、 通常 9アミノ酸残 基、好ましくは 1 0アミノ酸残基、 より好ましくは 1 1アミノ酸残基からなり、 患 者血清中の抗体と反応する断片は、本発明における抗体検出用の抗原として望まし い。 更に、 ェピトープを構成するオリゴペプチドに対して、様々な修飾を加えて免 疫学的な反応性を向上させる方法も当業者には公知である。 たとえば、 ヒ ト血清ァ ルブミンのような不活性タンパク質、あるいは無意味なアミノ酸配列の付加といつ た修飾が免疫学的な反応性の向上に寄与する。
本発明に基づく RAの検出方法に有用なシノビオリン、またはその機能的に同等な タンパク質、 あるいはそれらの部分ペプチドは、 これらの分子を認識する抗体を分 折するための免疫学的分析用試薬とすることができる。本発明による免疫学的分析 用試薬は、 RAの診断や治療効果の判定に有用である。 本発明によるシノビオリンは、 RAの治療や予防を目的としたワクチンの開発をも 可能とする。シノビオリンがそのリガンドとの結合によって滑膜細胞の増殖をもた らしていると考えられるため、シノビオリンとリガンドとの結合をブロックする抗 体を与えるワクチンが提供されれば、 RAの治療や予防が実現する。 シノピオリンの ワクチンを得るには、シノビオリンのェピトープとなるドメインペプチドを中心に、 もともとヒトのタンパクであるシノビォリンのドメインべプチドによる免疫刺激 をもたらすアジュバントやキャリアタンパク質との組み合わせにより製剤化する 方法が一般的である。
更に本発明は、 シノビオリンを認識する抗体を提供する。本発明によるシノピオ リン、 または免疫学的に同等のタンパク質、 あるいはその断片を免疫原として、公 知の方法によりシノビォリンの抗体を得ることができる。通常の免疫操作によって ポリクローナル抗体を得ることもできるし（Harlow, E. & Lane, D.； Antibodies ; A Laboratry manual. Cold Spring Harbor, New York, 1988) 、 f几'体産生細胞を クローニングすることによりモノクローナル抗体を得ることもできる（Kohler, G. & Milstein, ， Nature 256 : 495-7, 1975) 。 モノクローナル抗体はィムノアツ セィにおいて高い感度と特異性を達成するための重要なツールである。
免疫には、本発明に基づくシノビオリン（もしくはそれと免疫学的に同等なタン パク質、またはそれらの断片） を適当なアジュバントとともに免疫動物に免疫する。 免疫原として有用なシノビオリンの断片として、以下のアミノ酸配列を含むぺプチ ドを示すことができる。
Syno- P3 (SLALTGAVVAHAYYCZ配列番号： 3 ) 、
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS/配列番号： 4 ) 、 および
Syno-Pl (GAATTTAAGTSATACZ配列番号： 5 )
これらのぺプチドを担体蛋白質と結合させて調製された免疫原は、シノビォリン に対して特異的で、 かつ十分な結合親和性を有する抗体を与える。免疫原を得るた めの担体蛋白質には、 スカシガイへモシァニン (KLH)、 あるいはゥシ血清アルプミ ン (BSA)等を用いることができる。 免疫動物には、 ゥサギ、 マウス、 ラット、 ャギ、 あるいはヒッジなどが一般に利用される。 アジュバントとしては、 フロイントのコ ンプリートアジュバント （FCA) 等が一般に用いられる （Adv. Tubercl. Res. , 1 : 130-148, 1956) 。 適当な間隔で免疫を追加し、 抗体価の上昇を確認したところで 採血し抗血清を得ることができる。 更にその抗体画分を精製すれば、精製抗体とす ることもできる。
あるいはまた、抗体産生細胞を採取して細胞融合法などによりクローニングすれ ば、 モノクローナル抗体を得ることもできる。 このときの抗体産生細胞とは、免疫 動物に由来するものの他、シノビオリンに対する自己抗体を産生する RA患者から採 取した抗体産生細胞を利用することもできる。更に、 こうして得られた免疫動物に 由来するモノクローナル抗体産生細胞の抗体遺伝子をもとに、キメラ抗体やヒト化 抗体の構築が可能である。抗体をヒ トに投与する場合、動物の抗体は異物として排 除されるため望ましくない。そこで抗原性の強い抗体の定常領域をヒ トの抗体で置 換したキメラ抗体や、あるいは定常領域のみならず可変領域のフレームワークまで ヒ トの遺伝子で置換したヒ ト化抗体が必要になる。 その点、 RA患者の抗体産生細胞 に由来する抗体の可変領域を利用すれば、 ヒ ト型の抗体を再構成できるので、 より 容易に安全性の高い抗体の構築が可能である。
本発明に基づいて提供されるシノピオリンを認識するキメラ抗体、あるいはヒ ト 化抗体は、 RA患者の滑膜細胞を標的とした薬物移送システム （Drug Delivery Sys tem; DDS) に有用である。 本発明によるシノビオリンを認識する抗体を使った DDS において、 抗体とリンクさせることにより有用性が期待できる物質としては、 Fas リガンドゃ、 抗 SL抗体などを示すことができる。
あるいは本発明の抗体は、 シノビォリンの検出に有用である。 シノビオリンは R A患者の滑膜組織において強発現している。 したがって、 滑膜細胞、 滑膜組織、 あ るいは体液中におけるシノビオリンの検出は、 RAの診断において有用な情報を与え る。 具体的には、 滑膜組織や血液中にシノビォリンが検出されるときには、 RAが進 行していると考えられる。本発明の抗体は、 シノビォリンの免疫学的検出用試薬と することができる。組織や血中に存在するタンパク質を、抗体を用いて免疫学的に 検出する方法は公知である。本発明の抗体を含む免疫学的分析用試薬は、 RAの診断 や治療効果の判定に有用である。
また本発明の抗体は、シノビオリンを発現する細胞の分離あるいは検出に利用す ることができる。 本発明のシノビオリンタンパク質は、 発生においては AERで発現 が見られる他、 滑膜、 骨 ·軟骨および肢の原基となる未分化間葉系細胞において強 く発現していた。 従ってシノビオリンは、 AERおよび未分化間葉系細胞のマーカー として使用されうる。 すなわちシノビオリンの発現を指標に、 AERおよび未分化間 葉系細胞を検出したり分離したりすることができる。抗体は適宜蛍光等により標識 される。 例えば、 シノビォリンに対する抗体を用い、 セルソーティング等によりシ ノピオリンを発現する細胞を分離することができる。分離された未分化間葉系細胞 は、 試験管内における骨 ·軟骨の形成、 あるいは関節の再構築に有用である。
未分化間葉系細胞からは、 試験管内 （in vitro) または生体内 （in vivo) にお いて、 骨、 軟骨、 筋、 腱、 脂肪、 および骨髄等の間質 （stroma) が形成される （S.
Kuznetsov et al. , J. Bone Miner. Res. 12， 1335 - 47, 1997； D. J. Procko p Science 276, 71-4, 1997； C. M. Thompson and R. A. Young, Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 92， 4587—90， 1995； A. I. Caplan, J. Orthop. Res. 9, 641—50, 1991； A. J. Friedenstein, Int. Rev. Cytol. 47, 327 - 59， 1976； M. Owen and A. J. Friedenstein, in "Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Ti ssues , D. Evered and S. Harnett, Eds.， Wiley, Chichester, UK, 1988, pp.
42-60； A. J. Friedenstein et al. , Cell Tissue Kinet. 20, 263-72, 1987； B.
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例えば、 未分化間葉系細胞を試験管内において分化させ、 脂肪細胞系列 （adipo cytic lineage) 、 軟骨細胞 (chondrocytic lineage) 、 および骨細胞系列 (oste ocytic lineage) の細胞を开成させることができる （M. F. Pittenger et al. , S cience 284, 143—7, 1999) 。
脂肪細胞への分化は、 例えば、 1 -メチル -3 -イソプチルキサンチン、 デキサメタ ゾン、 インシュリン、 およびインドメタシン処理により誘導することができる （M.
F. Pittenger, 米国特許第 5827740号, 1998) 。 軟骨細胞への分化は、 例えば、 遠 心等により細胞を微小塊にした後、 血清を含まない培地中で transforming growt h factor (TGF) - ^ 3 で刺激することにより分化させることができる （A. M. Mack ay et al. , Tissue Eng. 4, 415—28, 1998； J. U. Yoo et al. , J. Bone Joint Surg. Am. 80A, 1745-57, 1998) 。 骨細胞への分化は、 例えば 10%ゥシ胎児血清 の存在下、 デキサメタゾン、 jS -グリセロールリン酸、 およぴァスコルビン酸で誘 導することができる （S. A. Kuznetsov et al. , J. Bone Miner. Res. 12, 1335 - 47, 1997； D. J. Prockop Science 276, 71-4, 1997； C. M. Thompson and R. A.
Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4587 - 90, 1995； A. I. Caplan, J. Or thop. Res. 9， 641-50, 1991； A. J. Friedenstein, Int. Rev. Cytol. 47, 327 - 59, 1976； M. Owen and A. J. Friedenstein, in "Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues" ， D. Evered and S. Harnett, Eds. , Wiley, Chi Chester, UK, 1988, pp. 42—60 ; S. P. Bruder et al. , J. Cell. Biochem. 64， 278-94, 1997； N. Jaiswal et al. , J. Cel l. Biochem. 64, 295-312, 1997； S. P. Bruder et. al. , J. Bone Miner. Res. 13, 655-63 1998) 。
また、 生体内においても、 例えば未分化間葉系細胞の子官内 （in utero) への移 植により、 軟骨細胞、 脂肪細胞、 筋細胞、 心筋細胞、 骨髄間質細胞、 胸腺間質細胞 へ分化させることができる （K. W. Liechty et al. , Nature Medicine 6, 1282-1 286, 2000) 。 これらの方法により、 分離された未分化間葉系細胞から、 試験管内 または生体内において組織を再構築させることができる。再構築された組織や器官 は、 再生医学的応用が期待される。
また、 シノビオリンは、 リウマチ滑膜細胞で強発現していることから、 リウマチ 滑膜細胞に対する細胞マーカーとしても用いられ得る。本発明の抗体を細胞の分離 または検出用試薬として用いる場合には、抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組 成物とすることができる。 例えば、 蒸留水、 pH緩衝試薬、 塩、 タンパク質、 界面活 性剤などを組み合わせることができる。
シノビオリンは RA患者の滑膜組織において強発現している。 また、 RA患者の血中 においては、 シノビオリンを認識する抗体 （自己抗体） が高い頻度で検出される。 他方健常者の血中では、シノビオリンの抗体は実質的に検出することができない。 更にシノビオリンは、ィンビト口において培養滑膜細胞の増殖を抑制する。 これは、 滑膜細胞の増殖を促進するリガンドに対して、シノビオリンが競合するためである と考えられる。 これらの情報を基に、 次のような機序が予想できる。 すなわち、 シ ノビオリンの滑膜細胞における強発現力 S、滑膜細胞に対 Lて増殖促進作用を持つシ ノビォリンのリガンドとの結合を促し、結果として滑膜細胞の増殖が促進される。 そしてこの滑膜細胞の異常増殖こそが RAの病態に他ならない。
以上の知見に基づいて、本発明は次の工程を含む、慢性関節リゥマチの検出方法、 あるいは診断方法を提供する。
i) 被検者の生体試料中に存在する RAのマーカーを検出する工程、 および
ϋ) ϋ) 工程 i)の検出結果を、 RAと関連付ける工程
本発明における RAの検出方法、 あるいは診断方法におけるマーカーは、 以下に示 すいずれかのマーカーを用いることができる。 これらのマーカーの測定方法は、既 に述べたとおりである。
ビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なボリヌクレオチド、 ビオリンまたはシノビォリンと機能的に同等なタンパク質、
シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なぺプチド、 ビオリンまたはシノピオリンと機能的に同等なタンパク質に結合する抗 体、 および
•シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なぺプチドに結合する抗体 たとえば、患者から採取された血液試料中に、 シノビオリンまたはシノビオリン と機能的に同等なタンパク質もしくはべプチドと反応する抗体が見出されれば、そ の患者は RAである可能性が高い。 あるいは、患者から採取された滑膜組織における シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質の発現は、 RAに起因 する滑膜組織の增成を示している。蛋白質の発現は、蛋白質や mR Aの存在を指標と して検出することができる。
また上記のような機序に基づいて、本発明のシノビォリンとその遺伝子の提供に より、 RAの治療薬開発の新たなアプローチがもたらされる。 まず本発明のシノビォ リンにより、シノビオリンに対する結合活性を指標としてシノビオリンのリガンド を検出することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含むシノビオリンに対 する結合活性の検出方法に関する。
a )被験化合物を、 シノビオリンもしくはシノビオリンと機能的に同等なタンパク 質、 またはペプチドと接触させる工程、 および
) 被験化合物と前記タンパク質またはぺプチドとの結合を観察する工程 更に上記検出方法に基づいて、シノビオリンに対するリガンドのスクリ一-ング が可能となる。 本発明のスクリーニング方法は、 具体的には次の工程を含む。 a )上記のシノビオリンに対する結合活性の検出方法によって、被験化合物のシノ ビオリンもしくはシノビオリンと機能的に同等な蛋白質に対する結合活性を 検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記結合活性が高い被験化合物を選択する工程
リガンドの候補化合物は、天然の物質やその変異体のみならず、低分子の有機化 合物であっても良い。 前記タンパク質と候捕化合物の結合については、候捕化合物 を標識しておけば直接検出することができる。あるいは既知の SLとの結合阻害を指 標として確認することも可能である。すなわち、 S1 - 5のような本発明の蛋白質との 結合活性を有することが明らかな分子の共存下で、候補化合物と本発明の蛋白質を 接触させるのである。 あるいは、 候補ィ匕合物と本発明の蛋白質の接触後に、 更に S Lを接触させることによって、 候f化合物の結合活性を評価することもできる。 結 合阻害を指標とする場合には、標識の必要なのはこの既知の SLのみとなるので、簡 便なスクリーニング法となる。
対照としては、被験化合物の不存在下で工程 a ) と同じ操作を行うことが好適で ある。 あるいは、 工程 a ) に比べ、 被験化合物をより低い濃度で含む場合であって もよい。 また、例えば被験化合物の代わりにシノビオリンに結合することが分かつ ている分子を用いて工程 a ) と同じ操作を行レ、、その分子よりもより高い結合活性 を持つ化合物を選択することもできる。
この他実施例に示した遺伝子に基づくリガンドのスクリ一二ング法が可能であ る。 例えば市販の Two- hybrid system を利用し、 候補リガンドをコードする遺伝 子を含むライブラリーからシノビオリンに結合するタンパク質をコードする遺伝 子をスクリーユングすることができる。 この方法は、天然のリガンドをスクリー二 ングするときに有用な方法である。 あるいは、 cDNAを組み込んだファージライブラ リーと標識シノビオリンを用いた発現スクリーニングによりリガンドをクロー二 ングすることも可能である。 本発明者らは、 このスクリーニング方法によって、 シ ノビオリンの天然リガンドである SLを発見した。 SLは、滑膜細胞表面にあるシノビ ォリンに結合して細胞増殖を刺激している可能性が有るので、 SLの血中レベルの測 定が RAの病態と関連する可能性がある。 SLは、 シノビォリンとの結合活性に基づい て、測定することができる。 もちろん抗 SL抗体によりィムノアツセィを行うことも 可能であるし、両者を組み合わせたサンドィツチ法によって SLを測定することもで さる。
本発明者らは、 シノビオリンを培養滑膜細胞に添加すると、細胞増殖に対して抑 制的に作用することを確認した。 これを、培地中の SLの中和で説明すると、 シノビ オリンとそのリガンドとの結合を阻害することが滑膜細胞の異常増殖抑制につな がり、結果として RAの治療効果をもたらすものと考えられる。本発明のスクリー二 ング方法によつて得ることができるリガンドは、シノピオリンとその天然リガンド との結合を競合的に阻害するので、 RAの滑膜細胞の増殖を効果的に抑制する活性 (アンタゴニスト） を期待できる。
また本発明のスクリーユング方法によって得ることができるシオノビオリンの リガンドには、 上記 SLと同様にシノビォリンの活性を刺激する活性 （ァゴ二スト） が期待できる。 シノビオリンを刺激するリガンドは、 シノビオリン刺激剤、 あるい は骨形成促進剤として有用である。 より具体的には、 シノビオリンを刺激するリガ ンドは、骨粗鬆症、 骨折、 あるいはスポーツ外傷等の治療薬として利用することが できる。
これらの結合活性の検出方法、並びにスクリーニング方法を発展させ、更に本発 明はシノピオリン、またはその機能的に同等なタンパク質とシノビオリンリガンド との結合を阻害する活性の検出方法、および化合物のスクリ一二ング方法を提供す る。 本発明に基づく、 シノビォリンとシノピオリンリガンドとの結合を阻害する活 性の検出方法は以下の工程を含む。
a )被験化合物存在下で、 シノビオリンもしくはシノビオリンと機能的に同等な蛋 白質またはペプチドとそのリガンドとを接触させる工程、 および
b ) 前記タンパク質またはぺプチドに結合するリガンド、および zまたは被験化合 物を検出する工程
そして上記検出方法に基づいて、 シノビオリン、 またはその機能的に同等なタン パク質とシノビォリンリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーユング方法 が提供される。 すなわち本発明は、 以下のスクリーニング方法に関する。
a ) 上記検出方法に基づいて、被験化合物のシノビオリンもしくはシノビオリンと 機能的に同等な蛋白質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を検出するェ 程、 および ) 対照と比較して前記阻害活性が高い被験化合物を選択する工程 対照としては、被験化合物の不存在下で工程 a ) と同じ操作を行うことが好適で ある。 あるいは、 工程 a ) に比べ、 被験化合物をより低い濃度で含む場合であって もよレ、。 また、例えば被験化合物の代わりに、 シノビォリンとそのリガンドとの結 合を阻害することが分かっている分子を用いて工程 a ) と同じ操作を行い、その分 子よりもより高い結合活性を持つ化合物を選択することもできる。
このスクリーニングにより、シノビオリンまたはその機能的に同等なタンパク質 に対するアンタゴニストとして作用する化合物を得ることもできる。シノビオリン のリガンドとしては、 例えば実施例に記載の SL (S1-5) を用いることができる。 具 体的には accession number AAA65590、 138449、 NP_061489、 NP— 004096、 または Q12805 に特定される SI 5タンパク質や、 シノビオリンタンパク質に結合する活性 を有する限り、 それらに類似したタンパク質を用いることができる （Lecka-Czern ik, B. et al. , Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995； Heon, E. et al. , Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996； Ikegawa, S. et al. , Genomics 35, 590-592, 1996； Katsanis, N. et al. , Hum. Genet. 106, 66-72, 2000 ; Giltay, R. et a 1.， Matrix Biol. 18, 469-480, 1999； Stone, E. M. et al. , at. Genet. 22, 199-202, 1999) 。 シノビォリンとシノビォリンリガンドとの接触は、 候補化合物 を適用する前もしくは後、 または同時に行うことができる。
ここでスクリ一二ングすべき化合物としては、シノビオリン側に結合してリガン ドとの結合をブロックするものと、リガンド側をブロックするものが考えられる。 シノビオリン側に結合する化合物をスクリ一エングするには、リガンドを標識して おき候補化合物と競合させると良い。リガンド側に結合する化合物が候補となって いれば、 その逆となる。 いずれのスクリーニングにおいても、標識に当たっては放 射性同位元素を用いるのが、活性に対する影響が小さいため望ましい。 こうして得 ることができるシノビオリンのアンタゴュストについても、滑膜細胞の増殖を抑制 する作用を持つものと推測され、 RAの治療効果を期待できる。 また、 シノビオリンリガンドである Sl-5は、 Malattia Leventinese (ML) および Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD) の原因遺伝子であることが示唆され ている （Stone, E. M. et al.， Nature Genetics 22, 199-202， 1999)。 これらの 疾患は、 結晶腔 （drusen) と呼ばれる沈着物を生じ、 加齢黄斑変性症 (age-relat ed macular degeneration; AMD) と類似した症状を示す。 これらのこと力ゝら、 シノ ビォリンもまた、 MLおよび DHRDに関与している可能性がある。 シノビオリンの変異 や多型の検査により、 MLおよび DHRDの診断を行うことが考えられる。 また、本発明 のスクリーニングによって得られる、シノビオリンのリガンドとして作用する化合 物や、 シノビォリンと S1 - 5との相互作用を阻害する化合物等は、 これらの疾患の予 防や治療に貢献する医薬としての利用が期待される。
また、本発明のシノビオリンを用いて、化合物のシノビオリンによるシグナル伝 達を調節する活性を評価したり、あるいはシノビォリンによるシグナル伝達を調節 する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には本発明は、次の工程を 含む、被験化合物のシノビオリンによるシグナル伝達を調節する活性を検出する方 法を提供する。
a ) シノビオリンリガンドの存在下または不存在下で、被験化合物とシノピオリン を接触させる工程、 および
b ) シノピオリンを介するシグナル伝達を検出する工程
また本発明は、次の工程を含む、 シノビオリンによるシグナル伝達を調節する活 性を有する化合物のスクリ一二ング方法に関する。
a )前記の方法によって、被験化合物のシノビオリンによるシグナル伝達を調節す る活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記調節の活性が高レ、被験化合物を選択する工程
対照としては、被験化合物の不存在下で工程 a ) と同じ操作を行うことが好適で ある。 あるいは、 工程 a ) に比べ、 被験化合物をより低い濃度で含む場合であって もよレ、。 また、例えば被験化合物の代わりに、 シノビオリンによるシグナル伝達を 促進または阻害する活性を有することが分かつている分子を用いて工程 a )と同じ 操作を行い、その分子よりもより高い調節活性を持つ化合物を選択することもでき る。
本発明において、 シノピオリンによるシグナル伝達とは、 シノビオリンに与えら れた刺激が、 異なる分子に伝えられることを言う。 刺激の種類は限定されない。 生 体におけるシグナル伝達には、多くの様式が存在することが知られている。代表的 なシグナル伝達は、 蛋白質の修飾による活性の調節である。 たとえば、 ある種の蛋 白質は、 リン酸化ゃァセチル化によって、 その蛋白質の活性が調節されている。 ま た蛋白質の切断によって、その活性が制御されるものも知られている。蛋白質の切 断をより特異的に行うために、ュビキチンのような分子の存在が重要である。 シグ ナル伝達は、シグナルの伝達によつて生じるシグナル伝達を構成する分子の活性や 構造の変化を指標として検出することができる。 あるいは、 シグナル伝達のための 複合体の形成を指標として、 シグナル伝達を検出することもできる。
シグナル伝達としては、特にリン酸化または脱リン酸ィヒシグナルが挙げられる。 細胞増殖シグナルの多くは蛋白質リン酸化または脱リン酸化による蛋白質修飾を 介して下流のシグナル分子に伝達されることが知られている。本発明のシノビオリ ンも細胞増殖作用を有することから、シノピオリンを介したシグナル伝達もまた蛋 白質のリン酸化により伝達されることが示唆される。 実際、本発明者らは、 シノビ オリン発現によるリン酸化作用を見出した。従って、 シノビオリンを介するシグナ ル伝達を、 蛋白質のリン酸化の検出により測定することができる。
細胞増殖または分化に関わる受容体は、その酵素活性部位として次のようなドメ インを有している （実験医学別冊、 Bioscience用語ライプラリー、 改訂版サイ トカ ィン ·増殖因子、 羊土社、 1998年発行） 。
チロシンキナーゼドメイン （VEGF受容体、 PDGF受容体、 HGF受容体、 EGF受容体 など） 、
チロシンホスファターゼドメイン （RPTPなど） 、 または セリン /スレオニンキナーゼドメィン (TGF β受容体など）
ピオリンもこれらの酵素活性を直接または間接的に保持していると予想さ れる。酵素活性を間接的に有するとは、 シノビオリン分子内に酵素活性サイトは持 たないが、 シノビォリンに会合する分子が酵素活性を持つことを言う。 このような 分子としては例えば TNF受容体や GM- CSF受容体などが知られている。 したがって、 例えばチロシン、 セリン、 および/またはスレオユンのリン酸化活 1生を検出するこ とにより、 シノピオリンによるシグナル伝達を評価することができる。 このとき、 シノビオリンリガンドの存在下で、被験化合物の作用を評価することにより、 シノ ピオリンリガンドによってトリガーされるシノピオリンのシグナル伝達に与える 被験化合物の影響を評価することができる。具体的には、 シノビオリンリガンドに よるシオノピオリンに対するシグナル伝達を阻害、または抑制する活性を検出する ことができる。 シノビオリンリガンドとしては、本明細書において述べられたシノ ビオリンリガンド S1 - 5を用いることができる。あるいはシノビオリンリガンドの不 存在下で被験化合物の作用を評価することにより、被験化合物によるシノピオリン に対する刺激活性を評価することもできる。
蛋白質のリン酸化を検出するには、シノビォリンリガンドの存在下または不存在 下で、 例えば被験化合物および [32Ρ]正リン酸とともにシノピオリン発現細胞をィ ンキュベートする。次いでこの細胞の溶解物から免疫沈降によりリン酸化された蛋 白質を回収する。 回収した蛋白質は SDS- PAGEで展開後、オートラジオグラフィ一に より、 リン酸化を検出することができる。 リン酸化ァミノ酸は、 TLCやその他の公 知のぺプチド分析により同定することができる。
あるいは、 リン酸ィ匕チ口シン抗体など、 リン酸ィヒ蛋白質に対する特異的抗体を用 いて特定のアミノ酸のリン酸化を検出することもできる。
一般に、細胞内におけるシグナル伝達因子のリン酸化は、 次々に複数の分子に伝 達される。 つまり一連の伝達経路は、 カスケードを構成している。 そのため、 細胞 内の蛋白質全体のリン酸化レベルの変化を評価することによって、その細胞に起き たリン酸ィ匕シグナルの大きさを比較することができる。細胞内の全蛋白質を対象に リン酸化レベルを評価する方法は公知である。たとえば、細胞をシノビォリンリガ ンド等で刺激後、 タンパク質を SDS - APGEで展開し、 フィルターにプロットした後、 抗リン酸化チロシン抗体などを用いたウェスタンブロットによって蛋白質全体の リン酸化レベルを評価することができる。また、例えば [32P]正リン酸で細胞を標識 し、細胞をシノビォリンリガンド等で刺激後、細胞タンパク質を二次元電気泳動で 展開する。 タンパク質をクマシ一ブルーで染色し、オートラジオグラフィーを行う。 リン酸化されたスポットを検出することにより、リン酸化レベルを評価することが できる。
あるいは、シノビオリンの基質となるリン酸ィ匕蛋白質におけるリン酸化のレベル の変化を特異的に測定することもできる。シノビォリンの基質となるリン酸化蛋白 質は、たとえば上記の二次元電気泳動においてリン酸ィヒされたスポットを回収し、 マイクロシークェンスやマススぺク トロメ トリーによって同定することができる。 同定された基質蛋白質のリン酸化レベルの変化は、例えば基質蛋白質に対する特異 抗体を用いて免疫沈降を行い、 SDS- APGEで展開後、 [32P]の取り込みをオートラジオ グラフィ一で測定したり、あるいは抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブ ロッティングなどによつて評価することができる（バイォマニュアルシリーズ 分 子生物学研究のためのタンパク実験法 竹縛忠臣 稲垣昌樹 編） 。
上記方法に用いる細胞としては、 滑膜細胞 （例えば RTF) や外来的にシノビオリ ン遺伝子を導入した細胞などが挙げられる。被験化合物によりシノビオリンによる リン酸化または脱リン酸ィヒのレベルが低下すれば、この化合物はシノピオリンによ るシグナル伝達を阻害する化合物と判断される。また被験化合物によりシノビオリ ンによるリン酸ィヒまたは脱リン酸化のレベルが上昇すれば、この化合物はシノビォ リンによるシグナル伝達を促進する化合物と判断される。
例えばシノビオリンが受容体型チロシンキナーゼとして機能し、チロシンリン酸 化を介して下流の分子を活性化しシグナルを伝達する場合、被験化合物によりチロ シンリン酸化が抑制されれば、この化合物はシノビオリンによるシグナル伝達を阻 害する化合物と判断される。 また本発明は、 例えばチロシンキナーゼ、 チロシンホ スファターゼ、 またはセリン /スレオニンキナーゼなどの蛋白質キナーゼまたはホ スファターゼの阻害剤を用いて、シノビォリンによるシグナル伝達を阻害する方法 にも関する。
また、 シノビォリンによるシグナル伝達の好適な他の一例としては、 ュビキチン 化シグナルが挙げられる。 蛋白質構造予測システム （SMART : Simple Modular Arc hitecture Research Too丄 (ウェブサ トも参'照 http : / / smart, embl-heidelberg. de/) Schultz et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, 1998； Schu ltz et al. , ucleic Acids Res. 28， 231-234, 2000) により、 シノビオリンに Ring finger モチーフ（Joazeiro, C. A. et al.， Secience 286, 309-312, 1999) の存在が示された。 このモチーフは蛋白質の分解に関わる E3ュビキチン-蛋白質リ ガーゼに存在することが知られている。 また Ring finger モチーフは、 E2ュビキチ ン結合酵素の結合部位と考えられている。
従って、 シノビォリンによるュビキチン化シグナルを検出することにより、 シノ ビオリンによるシグナル伝達を評価することができる。ュビキチン化シグナルは、 例えば抗ュビキチン抗体を用いて基質蛋白質のュビキチン化を検出することによ り、評価される。 また、 シノビォリンと E2ュビキチン結合酵素または基質蛋白質と の結合、あるいはシノビオリンを含むュビキチンリガーゼ複合体などを検出しても よレ、。 具体的には、例えばタグを付けたシノビオリンを発現するベクターをトラン スフヱクシヨンした細胞を破砕し、 [32P]標識ュビキチンを添加し反応後、抗タグ抗 体により免疫沈降する。 SDS- PAGEにより展開し、オートラジオグラフィーを行うこ とによりシノピオリンのュビキチンリガーゼ活性を検出することができる （Hashi zurae, R. et al. , J. Biol. Chem. 276, 14537 - 14540， 2001) 。
シノビオリンの基質蛋白質におけるュビキチン化のレベルの変化を特異的に測 定することもできる。 シノビォリンの基質蛋白質は、 たとえばシノビオリンをべィ トとした酵母 two-hybridスクリーニングなどによって同定することができる。同定 された基質蛋白質のュビキチン化レベルの変化は、 タグつき基質を精製し、そこに、 精製した El、 E2、 E3およぴュビキチンを添カ卩し、 反応後、 抗タグ抗体で免疫沈降し、 抗ュビキチン抗体による染色によって評価することができる （Yokouchi, M. et a 1.， J. Biol. Chem. 274, 31707-31712， 1999) 。
被験化合物によりシノビオリンによるュビキチン化シグナルの活性化が低下す れば、この化合物はシノビオリンによるシグナル伝達を阻害する化合物と判定され る。また被験化合物によりシノピオリンによるュビキチン化シグナルの活性ィ匕が上 昇すれば、この化合物はシノビォリンによるシグナル伝達を促進する化合物と判定 される。例えばシノビオリンと E2ュビキチン活性化酵素との相互作用を阻害する化 合物は、シノビォリンによるュビキチン化シグナルを有効に阻害することができる。 また本発明は、ュビキチン化シグナルに関与する酵素の阻害剤を用いて、 シノビォ リンによるシグナル伝達を遮断する方法を提供する。例えば E2ュビキチン結合酵素、 あるいは E3ュビキチンリガーゼの阻害剤を細胞に適用することにより、シノビオリ ンによるシグナル伝達を阻害することも可能である。
以上のような方法によりシノビオリンを介するシグナル伝達を調節する活性を 有する化合物を選択することができる。シノビオリンによるシグナル伝達を阻害す る化合物は、 シノビオリンの活性化に起因する疾患の治療剤として有用である。例 えばシノビオリンによるシグナル伝達を阻害する化合物は、滑膜増生阻害として有 用である。 この化合物を投与することにより滑膜增生を抑制することができ、 これ により RAなどの滑膜増生を伴う疾患の予防および治療を行うことが可能となる。ま た、 これらの化合物は MLおよび DHRDに対する医薬としても用いられ得る。 あるいは、 このシグナル伝達を促進する化合物は、 シノビオリン刺激剤、 あるいは骨形成促進 剤などに用いることができる。 例えば、 骨粗鬆症、 骨折、 あるいはスポーツ外傷等 の治療薬として利用され得る。
シノビオリン遺伝子の発見に基づいて、たとえば次のような RAおよびシノビオリ ンが関与するその他の疾患に関する新たな研究が可能となる。 まず、 シノビオリン の発現を制御しているプロモーターゃェンハンサ一の構造決定が可能となる。すな わち、配列番号： 1に示したシノビオリン遺伝子の塩基配列をもとにゲノムのクロ 一二ングを進め、発現制御領域の配列を分析することができる。その結果得られる シノビオリンの転写調節領域は、シノビオリンの転写調節因子の探索に利用するこ とができる。
また、本発明のシノビオリンノックァゥト動物において、マーカー遺伝子をノッ クインし、シノビオリン遺伝子の内因性プロモーターの制御下にマーカー遺伝子を 発現させれば、 この動物またはこの動物由来の細胞を用いて、マーカー遺伝子の発 現を指標にシノビオリン遺伝子の発現を制御する薬剤をスクリ一二ングすること ができる。例えば転写調節因子の認識配列を 2本鎖として与えれば、デコイ核酸医 薬として機能する。
また、本発明のポリヌクレオチドを用いて、動物における本発明の蛋白質の生物 学的な役割を調べることが可能である。 このためには、 例えば本発明の DNAを導入 して、 本発明の蛋白質を過剰発現または異所発現 （または異時発現） させ、 その効 果を検証することによつてその役割を調べることができる。遺伝子を全身に導入す るには、 本発明の DNAのトランスジエニック動物を作製すればよい。 あるいは、 ジ ーンターゲティングやアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザィム等の投与によ り本発明の DNAの発現や機能を抑制する loss- of- function (機能喪失）実験も有効 である。 すなわち本発明は、 本発明の DNAの発現が改変されている力 \ または該改 変を誘導することができるトランスジヱニック非ヒ ト脊椎動物を提供する。発現の 改変は、野生型と比較して改変されていてもよく、改変を誘導する場合においては、 誘導前と比較して 変していてもよい。
本発明においてトランスジエニック動物とは、外来的に核酸がゲノムに導入され た動物が含まれる。 また、 「DNAの発現」 とは、 DNAの転写レベルであってもよく、 その転写産物の翻訳レベルであってもよい。 また 「改変を誘導する」 とは、 例えば 外的な刺激や時期特異的に発現の改変が誘導されたり、掛け合わせによる後代にお いて発現が改変されることを含む。 また、一部の細胞または組織における発現の改 変も含まれる。本発明のトランスジヱニック非ヒ ト脊椎動物としては、哺乳動物（例 えばマウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ、 プタ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥマ、 ならびに ゥシ等） が好ましく、 特にげつ歯類、例えばマウスまたはラットなどを用いること が好適である。
本発明のトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物には、本発明の蛋白質をコードする DNAが外来的に導入されているトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物が含まれる。 こ のようなトランスジエニック動物は、 例えば本発明の蛋白質をコードする DNAを発 現するベクターを、 受精卵に導入することにより製造することができる。
ベクターの導入は、ベクターと卵を混合後リン酸カルシウムによる処理、エレク トロポレーション、または倒立顕微鏡下におけるマイクロインジェクション法等に より行うことができる。 または、 胚性幹細胞 （ES細胞） に本発明のベクターを導入 し、選別した ES細胞を受精卵 （肺盤胞） にマイクロインジェクションにより導入し てもよい。
得られた受精卵は、輸精管結紮雄個体との交配により偽妊娠させたレシピエント の卵管内に移植し、 産仔を得ることができる。 産仔の尾などから DNAを調製し、 PC Rにより導入 DNAの保持を確認する （Brigid Hogan et al. eds. , "Manipulating the Mouse Embryo ： A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1994, Gordon, J. W. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77： 7380 - 7384, 198 0 ; Jaenisch, R. and B. Mintz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71： 1250-1254, 1 974) 。 生殖系列に遺伝子が導入されたキメラ動物からは、 正常動物と交配するこ とによりへテロ接合体が得られる。ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体を得 ることができる。本発明のトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物には、 これらの子孫 も含む。
本発明の DNAを生体内で発現させるために用いるプロモーターとしては、 例えば 全身発現性のプロモーターや、その他の組織特異的、時期特異的プロモーターを用 いることができる。
全身性プ口モーターとしては、例えば ]3ァクチンプロモーター等が挙げられる。 例えば、 pCAGGS等に含まれている、 ヒ トサイトメガロウィルスェンハンサ一が連結 された-ヮトリ ]3ァクチンプロモーターを用いることができる。部位特異的または 時期特異的に本発明の DNAを発現するトランスジヱニック動物を作製する場合、 Cr e - ΙοχΡの系などを利用することが可能である。例えば、部位特異的または時期特異 的なプロモーターの下流に Creリコンビナーゼ遺伝子を有するトランスジェニック 動物を作製し、別に汎用プロモーターの下流に本発明のポリペプチドをコードする DNAを連結させたベクターを保持するトランスジヱニック動物を作製する。この時、 プロモーターと本発明のポリぺプチドをコードする DNAとの間に一対の ΙοχΡに挟ま れたストップコドンまたは転写終結シグナル等を揷入しておく。 2つの個体を掛け 合わせることにより、 Creの発現に伴なつて本発明のポリペプチドを発現させるこ とができる。
また、本発明のトランスジヱニック非ヒ ト脊椎動物には、 内因性の本発明の蛋白 質をコードする DNAの発現が抑制されているトランスジエニック非ヒト脊椎動物が 含まれる。 このようなトランスジェエック動物は、 例えば、 ジーンターゲテイング により製造することができる。このようなトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物を作 製するには、 例えば本発明の DNAの一部または全部を置換、 欠失、 付加および/ま たは挿入等により欠損させたターゲティングベクターを胚 1"生幹 (ES)細胞に導入し、 染色体 DNAと相同組み換えを起した細胞を選択する。 相同組み換え体の選択のため には公知のポジテイブ ·ネガティプ選択を行うことができる。 ポジティプ選択用マ 一力一としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ネガティブ選択 用マーカーとしては、 ジフテリァ毒素 (DT) - A遺伝子や HSV-tk遺伝子などが挙げら れる。 サザンプロッティングゃ PCR等により、 正しく組み換えられた細胞を選択す ることができる。 得られた細胞は、 8細胞期程度の受精卵または胚盤胞の胚盤胞腔 などに注入し、輸精管結紮雄と交配させて作製した偽妊娠メス個体の子宫内に移植 する。 産仔のゲノム DNA解析は上記と同様に行い、 ヘテロ接合体およびホモ個体を 得ることができる。 目的の遺伝子をノックァゥトするだけでなく、他の遺伝子をノ ックインすることもできる。 ノックインする遺伝子に特に制限はない。 例えば lac Z遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
また、 内因性の本発明の蛋白質をコードする DNAの発現が抑制されているトラン スジヱニック非ヒ ト脊椎動物は、ァンチセンス法またはリボザィム法を利用して作 製することもできる。 アンチセンス法においては、 本発明の蛋白質をコードする D NAの転写産物に相補的な RNAをコードする DNAを含むベクターを、 また、 リボザィム 法においては、 例えば本発明の蛋白質をコードする DNAの転写産物を切断する RNA をコードする DNAを含むベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、 これを哺乳動物の胚に注入し、 該胚から個体を得ればよい。
シノビォリンが RAの滑膜細胞増殖症状をもたらしていることから、 トランスジェ ニック動物には次のような用途が考えられる。 すなわち、 シノビオリン遺伝子、 あ るいは SLの遺伝子を、適当な動物に組み込んでトランスジエニック動物とし、 これ を強発現させれば RAのモデルとすることができる。このトランスジエニック動物に おいて、滑膜増殖機構を制御する薬剤のスクリ一ユングを進めることが可能となる。 あるいは、 ヒトのシノビオリン ZSLで RA症状を起こさない動物においては、 これら の遺伝子を強発現させることで、シノビオリンゃ SLの供給源として活用することも 可能である。
シノピオリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、滑膜增生を伴う関節 炎など、 RAと共通する症状を起す。すなわちこの動物は慢性関節リゥマチモデル動 物となる。 この動物を用いて、. RAに対する医薬候補化合物を含む、種々の化合物の 試験またはスクリーユングを行うことができる。被験化合物をトランスジエニック 動物に投与し、症状の寛解または増悪を観察して化合物の効果を検証したり、 ある いはスクリーニングを行うことができる。本発明のトランスジエニック動物を利用 した試験またはスクリーニングの方法としては、 以下の方法が挙げられる。
関節異常を寛解または増悪させる化合物を試験またはスクリーニングする方法 であって、 （a ) 本発明の DNAが外来的に導入されているトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物に被験化合物を投与する工程、 および （b ) 投与された動物の関節異常 を評価する工程、 を含む方法。
またシノビォリン遺伝子のノックァゥト動物は、シノビオリンの作用の抑制によ る副作用を調べたり、その副作用を低減する薬剤のアツセィゃスクリーニングに禾 IJ 用することができる。 またノックァゥト動物に局所的、または一過的にシノビオリ ンを発現させ、 シノビォリンの効果を特異的に検証することもできる。 また、 SL
(S1 - 5) と ML/DHRDとの関連より、 シノビオリンが SLの細胞内シグナル伝達に関与 する可能性があることにより、 シノビオリンノックアウト動物は、 MLおよび DHRD のモデルとなり得る。 例えば組織特異的、 Bき期特異的にシノビオリン遺伝子を （ホ モまたはへテロに) ノックァゥトすることが考えられる。
シノピオリン遺伝子のノックァゥト時にマーカー遺伝子等を導入したノックイ ン動物を用い、化合物のシノビオリン遺伝子の発現を上昇または下降させる活性を 検出することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む被験化合物のシノビ ォリン遺伝子の発現を調節する活性の検出方法に関する。
a )被験化合物を前記ノックイン動物またはノックイン細胞に適用する工程、およ び
b ) マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程、
この検出方法は、シノピオリン遺伝子の発現を調節する化合物のスクリ一ユング に利用することができる。 この方法は、 シノビオリン遺伝子の発現を調節する化合 物のスクリーニング方法であり、 a )上記ノックイン動物またはノックイン細胞に、 被験化合物を適用する工程、 b ) マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程、 お よび c )ノックインされた遺伝子の発現を上昇または低下させる化合物を選択する 工程、 を含む方法である。 すなわち、被験化合物を適用した動物または細胞において、マーカー遺伝子の発 現を検出し、 マーカー遺伝子の発現を上昇または低下させる化合物を選択する。 L acZをマーカーに用いた場合のマーカー遺伝子の発現の検出は、 実施例に記載の方 法により行うことができる。 この方法により、個体を用いた試験やスクリ一二ング に加え、例えば器官や組織を単離して用いたり、 トランスジエニック動物から得ら れた細胞を用いて同様の試験ゃスクリーユングを行うことも可能である。
個体を用いたスクリーニングにおいては、被験化合物は、適当なルートを介して 投与される。 被験化合物は、 例えば静脈注射、 皮下注射、 筋肉内注射、 腹腔内注入、 経口投与、 経腸投与、 経鼻投与などの公知の投与方法により投与され得る。 試験管 培養系を用いてスクリ一ユングを行う場合は、被験化合物は例えば培地中に添加さ れる。 または、 マイクロインジヱクシヨン等により細胞内に注入されてもよい。 被 験化合物が遺伝子である場合は、 naked DNAとして、 所望のトランスフエクシヨン 試薬と組み合わせて、あるいは公知の発現ベクターに組み込んで細胞に遺伝子を導 入することができる。シノビオリン遺伝子のプロモータ一領域の配列を含む核酸は、 デコイとして作用し、 シノピオリンの発現を抑制することが期待される。
シノビオリン遺伝子の発現を調節する活性は、たとえば以下の工程によって検出 することができる。
a )シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なポリヌクレオチドの内因性 プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を発現することができる発現系に、 被験化合物を接触させる工程、 および
b ) レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
そしてこの検出方法に基づいて、シノビォリン遺伝子の発現を調節する化合物を スクリーニングすることができる。 すなわち本発明は、 以下の工程を含む、 シノビ オリンまたはシノビォリンと機能的に同等なポリヌクレオチドの内因性プロキー ターの活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
a ) 前記活性の検出方法に基づいて、被験化合物のシノビオリンまたはシノピオ リンと機能的に同等なポリヌクレオチドの内因性プロモーターの活性を調節 する活性を測定する工程、 および
b ) 対照と比較して、 前記活性に差がある被験化合物を選択する工程
対照としては、被験化合物の不存在下で工程 a ) と同じ操作を行った場合、 ある いは工程 a ) に比べ被験化合物をより低い濃度で含む場合などが挙げられる。 また、 例えば別の化合物を用いて工程 a ) と同じ操作を行い、その化合物よりもより高い 作用を持つ化合物を選択することもできる。遺伝子の発現には、転写レベルの発現、 および翻訳レベルの発現が含まれる。シノビオリン遺伝子の内因性プロモーターの 下流に結合されている遺伝子は、天然のシノビオリン遺伝子自体であってもよく、 人工的に連結されたレポーター遺伝子であってもよい。シノビオリン遺伝子の内因 性プロモーター活性は、例えば下流に連結されている遺伝子の cDNA断片をプローブ としたノーザンハイブリダィゼーション、 RT - PCR、該遺伝子がコードする蛋白質に 対する抗体を用いたウェスタンブロッテイング、 免疫沈降、 ELISA等により、 該遺 伝子の転写産物または翻訳残物を検出することにより行うことができる。
また、シノビオリン遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を結合した 構築物を作製すれば、これを細胞にトランスフエクションして得られた形質転換細 胞を用いて、レポーター遺伝子の発現を指標にスクリーエングを行うこともできる。 このような構築物は、シノビオリン遺伝子のプロモーターを含むシノビオリン遺伝 子の上流領域のゲノム DNAの下流に、 所望のレポータ一遺伝子を連結させることに より作製することができる。 レポーター遺伝子に特に制限はなく、 LacZ、 クロラム フエ二コールァセチノレトランスフェラーゼ (CAT) 、 ルシフェラーゼ、 GFP (green fluorescent protein)等を挙げることができる。 シノビオリン遺伝子の発現を低 下させる化合物は、 Mの治療薬の候捕となる。
本発明の試験またはスクリーニングに用いる被験化合物としては特に制限はな く、 無機化合物、 有機化合物、 ペプチド、 蛋白質、 天然または合成低分子化合物、 天然または合成高分子化合物、 組織または細胞抽出液、微生物の培養上清や、植物、 海洋生物由来の天然成分などが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子ライブ ラリ一の発現産物または発現 cDNAライブラリ一などを用いることもできる。また、 上述した、 シノビォリンに結合する化合物のスクリーニングや、 シノビ才リンと S Lとの結合を阻害する化合物のスクリーニングにより得られた化合物を被験化合物 として投与することもできる。
化合物の投与方法は特に制限はなく、 in vitroであれば、培養液への添加を含む 細胞への接触、マイクロインジェクターやトランスフエクション試薬を用いた細胞 への導入などにより実施することができる。 in vivoであれば、 動脈内注射、 静脈 内注射、 皮下注射、 腹腔内投与、 経口投与、 経腸投与、 筋肉内投与、 点眼、 経鼻投 与、 関節等への局所注入など当業者に公知の方法により行いうる。 化合物は、適宜 組成物として投与される。 例えば水、 生理食塩水、 緩衝液、 塩、 安定剤、 保存剤、 懸濁剤などと混合され得る。 .
また、 シノビオリン遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニングは、 トラン スジ ニック動物ではなく通常の動物またはその動物に由来する細胞等を用いて 行うことも可能である。 たとえば本発明は、以下の工程を含むシノビオリンまたは シノビオリンと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現を調節する活性の検出方 法に関する。
a )被験化合物の存在下で、 シノビオリンまたはシノビォリンと機能的に同等なポ リヌクレオチドを発現する細胞を培養する工程、 および
b ) 前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
そしてこの検出方法に基づいて、シノピオリン遺伝子の発現を調節する化合物を スクリーニングすることができる。 すなわち本発明は、 以下の工程を含む、 シノビ ォリンまたはシノピオリンと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現を調節する 化合物のスクリーニング方法に関する。
a ) 前記活性の検出方法に基づいて、被験化合物のシノビオリンまたはシノビオリ ンと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現を調節する活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記活性に差を有する被験化合物を選択する工程
シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現レ ベルは、先に述べたような方法によって測定することができる。 またこのスクリー ユング方法には、先に述ぺたようなその他のスクリ一二ング方法において被験化合 物として用いることができるあらゆる化合物を被験化合物とすることができる。対 照としては上記と同様、被験化合物の不存在下で工程 a ) と同じ操作を行う場合な どが挙げられる。
本発明の試験またはスクリ一二ング方法により同定された化合物は、 RAゃシノビ ォリンが関与するその他の疾患に対する医薬の候補となり、 RA等の疾患の予防また は治療に利用することができる。 これらの化合物は、有効成分以外に適宜他の溶質 や溶媒と組み合わせて医薬組成物とすることができる。本発明のスクリーニング方 法により単離される化合物を医薬品として用いる場合には、単離された化合物自体 を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物と して投与を行うことも可能である。
例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、滅菌水や生理食塩 水、植物油、 乳化剤、 懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考 えられる。 本発明の医薬組成物は、 水溶液、 錠剤、 カプセル、 トローチ、 パッカル 錠、 エリキシル、 懸濁液、 シロップ、 点鼻液、 または吸入液などの形態であり得る。 化合物の含有率は適宜決定すればよい。 患者への投与は、 一般的には、 例えば、 動 脈内注射、 静脈'内注射、 皮下注射、 経口投与、 関節内注入、 その他の当業者に公知 の方法により行いうる。
投与量は、 患者の体重や午齢、 投与方法、 症状などにより変動するが、 当業者で あれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の 有効血中濃度や代謝時間により異なるが、 1日の維持量として約 0. lmg/kg〜約 1. 0 g/kg、 好ましくは約 0. lmg/kg〜約 10mg/kg、 より好ましくは約 0. lmg/kg〜約 1. Omg/ kgであると考えられる。 投与は 1回から数回に分けて行うことができる。 また、 該 化合物がポリヌクレオチドによりコードされうるものであれば、該ポリヌクレオチ ドを遺伝子治療用ベクターに糸且み込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、抗滑膜細胞抗血清によるィムノスクリーニングにおける陽性コロニーの 写真である。
図 2は、大腸菌でのシノビオリン組み換えタンパク質の発現を示す写真である。 図 3は、試験管内でのシノビオリン cDNAから翻訳されるシノビオリンタンパク質 発現を示すオートラジオグラフの写真である。
図 4は、シノビオリンの cDNAをプローブとするノーザンブロッティング法による シノビオリン遺伝子発現の分析結果を示すオートラジオグラフの写真である。 図 5は、各種細胞破碎液の抗滑膜細胞抗血清によるウェスタンブロッテイング法 の結果と、 GST-部分シノビオリンによる抗体吸収実験の結果を示す写真である。矢 印は吸収されたバンドを示す。 各パンドの分子量は上から順に、 約 220、 185、 およ び 140kDaであった。
図 6は、滑膜細胞破碎液に対する滑膜細胞抗血清を用いたウェスタンプロッティ ング法の結果を示すオートラジオグラフの写真である。左のレーン（プレイミュー ン） は滑膜細胞免疫前のゥサギ抗血清、 右のレーン （免疫後） は滑膜細胞抗血清を 用いた。
図 7は、 滑膜細胞の.抗滑膜細胞抗血清 （A) および精製抗滑膜細胞抗体 （B) によ る蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
図 8は、滑膜組織の抗滑 B莫細胞抗血清による免疫染色と、 GST-部分シノビオリン による抗体吸収実験を示す顕微鏡写真である。 図 9は、滑膜組織の精製抗滑膜細胞抗体による免疫染色の結果を示す顕微鏡写真 である。 GSTァフィ二ティーカラムにより精製した抗血清 （上パネル） および GST - 部分シノビオリンァフィニティーカラムにより精製した抗血清（下パネル） を用い た結果を示す。
図 1 0は、各種ヒト血清中の抗シノビオリン抗体のウェスタンブロッテイング法 による検出結果を示すオートラジオグラムの写真である。
図 1 1は、 SLの cDNAをプローブとするノーザンプロッティング法による滑膜細胞 における SL遺伝子の発現を分析した結果を示すオートラジオグラフの写真である。 図 1 2は、 [3¾]ラベルした HA-シノピオリン -HAHAと GST - SL融合タンパク質との結 合を示すオートラジオグラフの写真である。
図 1 3は、 滑膜細胞の増殖に対するシノビオリンの影響を MTTアツセィで分析し た結果を示す図である。 GST-部分シノビオリンを用いた。
図 1 4は、 シノピオリン遺伝子導入用ベクターの構造を示す図である。 CMVェン ハンサーを有する -ァクチンプロモーターによりシノビオリンは全身的に発現す る。 抗 Flagタグ （Flag - tag) 抗体により、 Flagタグ融合シノビオリン蛋白質の発現 が確認できる。
図 1 5は、シノビオリン遺伝子のトランスジエニックマウスの関節炎を呈する指 関節を示す写真である。シノビオリン強制発現マウスの指の外見および軟 X線像を 示す。右端に正常マウスの指の軟 X線像を比較として示した。 シノビオリン強制発 現マウスは顕著な指の膨脹を示した。
図 1 6は、シノビォリン遺伝子トランスジエニックマウスの関節炎を呈する指関 節の組織学的所見を示す写真である。顕著な膨脹を示した指の関節部分において著 しい滑膜増生に伴う骨破壊と異常な骨新生が認められた。
図 1 7は、遺伝子導入マウスの正常な指関節の組織学的所見を示す写真である。 関節軟骨の異常、 骨破壊および滑膜の増生は認められない。 右下パネルは抗 Flag 抗体による免疫染色の結果を示す。 陽 1"生シグナルは観察されない。 図 1 8は、シノビオリン遺伝子トランスジエニックマウスの関節炎を呈する指関 節におけるシノビオリンの発現を示す写真である。抗 Flag抗体により免疫染色を行 つた。顕著な S彭脹を示した指の関節部位において増生した滑膜組織および軟骨細胞 にシノビオリンの発現が認められた。
図 1 9は、シノビオリン遺伝子を欠損させるターゲティングベクターの構造を示 す図である。 マウスシノビオリン遺伝子断片の翻訳開始点（第一メチォニンを翻訳 する ATGコドン； で示す） に lacZ遺伝子を導入し、 ポジティブセレクションマ 一力一遺伝子としてネオマイシン耐性 (neo) 遺伝子を導入した。 またジフテリア 毒素 A (DT - A) 遺伝子も結合させネガティブセレクションマーカーとした。 相同組 み換えを起した個体はシノビオリン遺伝子の発現が欠損する代わりに; 3 -ガラクト シダーゼが発現し、 その酵素活性を利用た LacZ染色により、 シノビオリン遺伝子の プロモーターからの発現を検出できる （図 2 2参照）。 遺伝子型確認のためのサザ ンブロット解析 （図 2 0参照） に用いたプローブの位置も図示した。
図 2 0は、シノビオリン遺伝子欠損マウスの遺伝子型の解析の結果を示す写真で ある。 生後約 2週齢のマウス尾 （野生型およびへテロ欠損マウス） または胎生 14. 5日月台仔 （ホモ欠損マウス） より DNAを抽出し、 Pstlで消化後に、 図 1 9に示したプ ローブを用いたサザンプロッティングを行った。
図 2 1は、シノピオリン遺伝子欠損マウスのノーザンプロット解析の結果を示す 写真である。 野生型 (+/+) 、 シノビォリン遺伝子へテ口ノックアウトマウス （+/ -) 、 およびホモノックアウトマウス （-/-） より mRNAを抽出し、 シノビオリン遺伝 子断片をプローブにノーザンブロッテイングを行った （上パネル） 。 下パネルにァ ガロースゲルの EtBr染色を示した。
図 2 2は、 LacZ染色によりシノビオリン発現部位を検討した結果を示す写真であ る。胎生 12. 5日齢または胎生 13. 5日齢の野生型およびへテ口欠損マゥスを LacZによ り染色した。 シノビォリンの胎生期における発現は、 頭頂骨、 四肢、 耳などの、 骨 および軟骨が形成される部位に強く認められた。 図 2 3は、四肢形成期におけるシノビオリンの発現を示す写真である。 四肢形成 期におけるシノビォリンの発現は、 FGF4、 BMP2、 BMP4 の発現と同様、 Apical Ect ode皿 1 Ridge (AER; 外胚葉頂堤） に強く認められた。
図 2 4は、 ヘテロ欠損マウスの胎生 13日齢の肢芽 (limb bud) の凍結切片の Lac Z染色を示す写真である。 4時間染色を行った。 LacZの青色が未分化間葉系の細胞 (骨 ·軟骨の原基） に濃染されている。 オリジナル倍率 X 40。
図 2 5は、 ヘテロ欠損マウスの胎生 13日齢の肢芽 （limb bud) の凍結切片の Lac Z染色を示す写真である。 4時間染色を行った。 LacZの青色が未分化間葉系の細胞 (骨 ·軟骨の原基） に濃染されている。 オリジナル倍率 X 200。 A, B,および C は、 図 2 4に対応する。
図 2 6は、胎生 12. 5日齢および胎生 13日齢におけるシノビオリン遺伝子ホモ欠損 マウスの表現型を示す写真である。胎生 12. 5日齢および胎生 13日齢におけるシノビ ォリン遺伝子ホモ欠損マウスは、ヘテロ欠損マウスと比較し、頭頂部から臀部まで の長さが短く、頭蓋や四肢の形成が未熟である傾向が認められた。胎生 13日齢のへ テロ欠損マウスと野生型マウスの表現型には、 顕著な差は認められなかつた。 図 2 7は、胎生 14. 5日齢におけるシノビオリン遺伝子欠損マウスの表現型を示す 写真である。胎生 14. 5日齢のシノビォリン遺伝子ホモ欠損マウスに肢芽異常が認め られた。
図 2 8は、 胎生 14. 5日齢のシノビオリン遺伝子ホモ欠損マウスの後肢における L acZの発現 （シノビォリンの発現を反映） を示す写真である。 ホモ欠損マウスの異 常な後肢において LacZは、 AERおよび未分化間葉系細胞の濃縮部位に発現が認めら れた。
図 2 9は、胎生 15. 5日齢のシノビオリン遺伝子欠損マウスの表現型を示す写真で ある。 ホモ欠損マウスは、 肢芽異常、 上顎、 下顎骨の異常、 耳の形態異常が認めら れた。 心臓の拍動は認められず、 生存していなかった。
図 3 0は、胎生 I5. 5日齢におけるシノピオリン遺伝子欠損マウスの骨格を示す写 真である。 アルシャンブルー、 ァリザリンレツド染色を示す。 アルシャンブルーに よって染色される軟骨おょぴァリザリンレツドによって染色される石灰化した骨 は、 シノビオリンホモ欠損マウスに認められなかった。
図 3 1は、 シノビオリンノックァゥトマウスにおける、抗コラーゲン抗体カクテ ルを用いたマウス関節炎モデルを示す写真である。 野生型マウス [373 (+/+) ] また はシノピオリンへテ口ノックアウトマウス [372 (-/+) ]に抗コラーゲン抗体力クテ ルを投与して関節炎を惹起させた （図中 +) 。 非投与の野生型マウス （-） も観察 した [371 (+/+) ] 。 その結果、 前肢および後肢共に、 関節の膨脹および発赤ともに 野生型に比べシノピオリンへテロノックァゥトマウスでは軽度であった。すなわち、 野生型マゥスで誘発される関節炎に比べ、シノビォリンへテ口ノックアウトマウス では関節炎の惹起が弱いことが判明した。
図 3 2は、 シノビオリン遺伝子ホモ欠損マウス （13dpc胎仔） の肤芽より得られ た初代培養細胞の LacZ染色おょぴアルシャンブルー染色を示す写真である。 LacZ 陽性のコロニー（すなわちシノピオリン発現細胞） とアルシャンブルー染色陽性の コロニーは一致している。 この結果は、 骨 ·軟骨分化にシノビォリンが関与してい ることを示唆する。 継代数 1 (pi) 。 .
図 3 3は、 13dpcマウス胎仔の肢芽より得られた初代培養細胞の LacZ染色を示す 写真である。 野生型 （+/+) 、 シノビオリン遺伝子へテロ （+/- ) またはホモ 、-卜、 欠損マウス由来の細胞が示されている。 シノビオリン遺伝子欠損マウス （lacZ遺伝 子のノックイン） でのみ LacZの発現が見られる。 継代数 1 (pi) 。
図 3 4は、 シノピオリン遺伝子へテ口欠損マゥス （13dpc胎仔） の肢芽より得ら れた初代培養細胞の LacZ染色およびァ シャンブルー染色を示す写真である。 Lac Z陽性のコロニー （すなわちシノビォリン発現細胞） とアルシャンブルー染色陽性 のコロニーは一致している。 継代数 1 (pi) 。
図 3 5は、 野生型マウス （13dpc胎仔） の胺芽より得られた初代培養細胞の LacZ 染色およびアルシャンブルー染色を示す写真である。 LacZによる染色は観察されな レヽ。 継代数 1 (pl) 。 ·
図 3 6は、 シノビオリン遺伝子へテロ欠損マウス （13dpc胎仔） の肢芽より得ら れた初代培養細胞の LacZ染色を示す写真である。 2核の典型的な軟骨細胞において も、 LacZ染色 （シノビォリンの発現） が認められる （200倍の像を参照） 。
図 3 7は、マウス胎仔の肢芽より得られた初代培養細胞の von Kossa染色を示す 写真である。 野生型 （WT) 、 シノビオリン遺伝子へテロ （Hetero) またはホモ （H omo) 欠損マウス由来の細胞が示されている。 シノビオリン遺伝子欠損マウス （Ho mo) において骨形成能の低下が認められる。 継代数 1 (pl) 。
図 3 8は、 シノビォリンホモ欠損マウス胎仔の肢芽より得られた初代培養細胞 (継代数 3 ; p3) の LacZ染色を示す写真である。 サブコンフルェントになるまで培 養した。 LacZ染色 (overnight) を行った後、 へマトキシリンェォシン （HE) 染色 を行った。
図 3 9は、 シノビオリン遺伝子へテロノックアウトマウス （lacZ遺伝子ノックィ ン） の初代細胞の -galアツセィの結果を示す図である。試料は 3連で測定し、 そ の平均と標準偏差を示した。
図 4 0は、 シノピオリン遺伝子へテ口ノックアウトマウス （lacZ遺伝子ノックイ ン） の初代細胞の ]3 - galァッセィにより、 シノビオリンプロモーター活性に対する 各種薬剤の影響を調べた結果を示す図である。試料は 3連で測定し、その平均と標 準偏差を示した。
図 4 1は、 Syno - P3を免疫したマウス血清の ELISAの結果を示す図である。 3個体 (No. 1~3) から得た血清を図示した倍率で希釈して ELISAを行った。非免疫マウス の血清 （図中、 正常） を対照に用いた。
図 4 2は、 Syno-P2を免疫したマウス血清の ELISAの結果を示す図である。 3個体 (No. 1〜3) 力 ら得た血清を図示した倍率で希釈して ELISAを行った。非免疫マウス の血清 （図中、 正常） を対照に用いた。
図 4 3は、 Syno-Plを免疫したマウス血清の ELISAの結果を示す図である。 3個体 (Νο· 1〜3) 力 ら得た血清を図示した倍率で希釈して ELISAを行った。非免疫マウス の血清 （図中、 正常） を対照に用いた。
図 4 4は、抗シノピオリンモノクローナル抗体による RAおよび OA患者由来滑膜細 胞のウェスタンブロッテイング （A) および蛍光免疫染色 （B) の結果を示す写真で ある。
図 4 5は、抗シノビオリンモノクローナル抗体による RA患者由来滑膜組織の免疫 染色の結果を示す写真である。 へマトキシリン 'ェォシン (HE) 染色像も示した。 図 4 6は、 シノビオリンの自己ュビキチン化活性を示す写真である。 FLAG -シノ ピオリンを、 GST-HA-ュビキチン、 ATP、 El、 および E2の存在下で反応させ、 抗 FLA G抗体および抗 HA抗体によりシノビォリンのュビキチン化を検出した。 CE : 細胞抽 出液。 IP : 免疫沈降物。 発明を実施するための最良の形態
[実施例 1 ] 抗滑膜細胞抗血清の作製
抗滑膜細胞抗血清は、以下のような操作で調製した滑膜細胞を免疫原として用い て得た。 1 0人の慢性関節リゥマチ (RA)患者の滑膜除去手術により摘出された関節 滑膜組織を、 無菌的な状態で phosphate buffered saline (PBS) で洗浄した。 洗浄 した,袓織を約 5匪立方の大きさに細断し、 37°C、 20分 0. 25%トリプシン/ PBS消化を 行った。 消化された滑膜組織より余分な組織片を取り除き、 得られた細胞を 10%牛 胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地 （Virology, 8， 396, 1959) (10%FC S-DMEM) を用いて懸濁し、 細胞培養用の滅菌シャーレ上で、 5°/。C02、 37°C、 24時間 培養した。 培養上清を捨て、 10%FCS- DMEMを用いて洗浄し非接着細胞を取り除き、 シャーレに付着した細胞としてリゥマチ患者由来滑膜細胞を取得した （The Journ al of Clinical Investigation, 92, 186, 1993)。培養された細胞をプールして、 RA患者由来の以下の滑膜細胞として実験に用いた。
1 X 105個の患者由来滑膜細胞を、 10%FCS-DMEM 20mLに懸濁して 76cm2 の培養フラ スコ中で培養した。 3日ごとに培地を交換し、 2適間後に培養面を細胞が満たした 状態になったところで培地を除き、 0. 05%EDTA/PBSと 0· 1%トリプシン/ PBSを 7mLづっ 加えて細胞を剥がして回収した。回収した細胞を PBSで洗浄して培地成分を除去し、 lmLの PBSに懸濁して免疫原とした。
この免疫原を、 作成後 2時間以内にゥサギ （1羽） の耳に静脈注射することによ り免疫した。 免疫は 1週間間隔で合計 6回行った。 6回目の免疫のときに、 ゥサギの 耳から数 mL採血して抗血清を試験したところ、蛍光抗体法によってリゥマチ患者の 滑膜細胞と反応することが確認できた。 6回目の免疫操作の更に 1週間後に力テーテ ルを使つて心臓から可能な限りの血液を採取した。 この血液を 4°Cでー晚放置して 凝固させ血清を分離した。血清には保存剤として 0. 1%のアジ化ナトリゥムを加え、 抗滑膜細胞抗血清として 4°Cで保存した。
[実施例 2 ] 抗滑膜細胞抗血清が認識する抗原（シノピオリン） の遺伝子クロー 実施例 1で得た RA患者 10名分の滑膜細胞から Acid guani dine/phenol chlorofor m法にて total RNAを抽出し、 poly Tビーズを用い mRNAを精製した （Analytical Bi ochemistry, 162, 159, 1987) 。 ； L ZAPベクター （STRATAGENE社） を用いて RA患者 滑膜細胞の cDNAライプラリーを常法に従い作製した。 picoBlue immunoscreening kit (STRATAGENE社） により、 上記実施例 1の抗滑膜細胞抗血清による i腿 unoscre eningを行った （図 1 ) 。 得られた陽性クローン （ファージ） をヘルパーファージ によりプラスミ pBluescript II S,K (+)へと変換した。 Bluescripte II SK (+)に 揷入された DNAの塩基配列は M13PrimerM4及び M13PrimerRV (Takara) を用いダイタ ーミネーター法 （proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 74, 5463, 1977) に基づき ABI PRISM 377 DNA Sequencer (PERKIN ELMER) により決定した。 前述の抗滑膜細胞抗 血清が認識する抗原をコードする遺伝子 （ 「シノビオリン」 と名付けた） の 3 '末 端から塩基配列を決定し、 poly (A)+鎮を含む 2990bpの塩基配列を明らかにした（配 列番号： 1の 42 - 3031番目） 。 この塩基配列を用い、 滑膜細胞 cDNAライプラリーか ら 5， -RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法 （Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. , 85:8998 - 9002， 1988)により全長シノビォリンの翻訳領域と 5' -非翻訳領域の —部及び poly (A)+鎖を含む 3031bpの塩基配列を決定した （配列番号： 1 ) 。 この 塩基配列を GenBank によりホモロジ一サーチした結果、 類似の配列は報告されて おらず新規な遺伝子であった。
[実施例 3 ] 大腸菌での部分シノビオリン組み換えタンパク質の発現
抗滑膜細胞抗血清を用いたィムノスクリーニングで得られた cDNAクローンから、 シノビオリンの一部をコードする cDNA (1799bp ; 配列番号： 1の 1233-3031番） を 制限酵素 EcoRI及び Xhol処理し抽出した。 EcoRI/XhoIの認識配列を末端に持つ cDNA を、 ダルタチオン S-トランスフェラーゼ （GST) 融合タンパク質発現ベクター pGE X- 5X- 3に挿入してサブクローエングした。 シノビオリン cDNAの一部を揷入した pGE X- 5X- 3を BL21大腸菌株に 42°C、 45秒ヒートショックにより導入し、 BL21/synoviol in- GST gene/pGEX- 5X-3を得た。 この BL21を 0. lmg/mLアンピシリンを含む LB培地で 培養し、 0. ImM isopropylthio- jS -D-galactoside (IPTG) を添加して 37°Cで更に 2 時間培養し前記融合タンパク質の発現を誘導した。 遠心分離法で回収した BL21を P BSで洗浄後、 lmg/mLリゾチーム消化し 0. 1°/。 TritonX- 100により可溶化した。可溶化 された GST融合タンパク質を含む BL21由来タンパク質懸濁液をダルタチオンセフ了 ロース 4B (GS4B) に適用後 PBSで洗浄し、 50raM還元型グルタチオン/ PBSにより目的 とする GST -部分シノビオリン融合タンパク質を精製した。
[実施例 4 ] 大腸菌での全長シノビオリン組み換えタンパク質の発現
実施例 2で得られたシノビオリンをコードする cDNA (1851bp ; 配列番号： 1の 6 0-1910番） の 3' -末端に、 2分子のインフルエンザ赤血球凝集素 （hemagglutinin ; HA) -tagを付加したシノビオリン cDNA (syno-HAHA) を、 グルタチオン S-トランス フエラーゼ（GST)融合タンパク質発現べクタ一 pGEX - 5X - 1に挿入してサブクロー二 ングした。 syno- HAHA遺伝子を挿入した pGEX- 5X - 1を BL21大腸菌株に 42°C、 45秒ヒー トショックにより導入し、 BL21/syno-HAHA/pGEX-5X-lを得た。 この BL21を 0. lmg/ra 1アンピシリンを含む LB培地で培養し、 0. ImM isopropylthio- β -D-galactoside (I PTG) を添カ卩して 30°Cで更に 3時間培養し N末端に GST、 C末端に HAを融合したシノビ ォリン （GST -シノビオリン- HAHA) タンパク質の発現を誘導した。 遠心分離法で回 収した BL21を PBSで洗浄した後、 lmg/mlリゾチーム消化し 0. 1% TritonX-100により 可溶化した。 可溶化した GST-シノビォリン- HAHAタンパク質を含む BL21由来タンパ ク質懸濁液をダルタチオンセファロース 4B (GS4B) に適用後 PBSで洗浄し、 50raM還 元型グルタチオン/ Tris - HC1 (pH8. 0) により目的とする GST-シノビオリン- HAHAタ ンパク質を精製した。
発現の確認は、 50mM還元型グルタチオン溶出画分を PBSで 200倍、 2000倍希釈し、 25mM Tris-HCl (pH6. 8) 、 0. 25% sodium dodecyl sulfate (SDS) 、 0. 05%メルカプ トエタノール、 0. 1%グリセロールで処理した後、 8% SDS polyacrylamide電気泳動
(SDS-PAGE) に適用した。 SDS- PAGE後、 GST-シノビオリン- HAHAタンパク質は、 ェ レクトロブロッティング法によりナイ口ン膜に転写した。 このナイ口ン膜は、 5% スキンミルクを含む PBSで室温、 60分ブロッキングを行い、 0. 5%スキムミルクを含 む PBSで 400倍に希釈した抗 HAモノクローナル抗体 （Boehringer mannheira社） で室 温、 60分免疫反応させた。 反応後、 0. 1% Tween20/PBSで洗浄し、 horse radi sh pe roxidase (HRP) 標識マウス IgG抗体を 2次抗体として室温で 60分免疫反応させ、 0. 1% Tween20/PBSで洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HR P活性の検出には ECLキット （Amersham社） を用いた （Cl inical Chemistry. 25, p 1531, 1979) 。 結果を図 2に示した。 上記 GST-シノビオリン- HAHA融合タンパク質 の分子量サイズから、 シノビオリンタンパク質の分子量は約 80kDaと推測された。
[実施例 5 ] in vitroにおける全長シノビオリン組み換えタンパク質の発現 シノビオリン遺伝子 (配列番号： 1 ) の末端を制限酵素 EcoRI修飾し、 pBluescr ipt II KSベクターに挿人し 7こ syno/pBluescript) 。 その後、 syno/pBluescript
(1 μ g) と TNT-coupled Translation System (Promegafi) ¾ "用い in vitro trans lation法により、シノビォリンタンパク質を試験管内で [35S]ラベル体として発現さ せた。 [3¾]ラベルしたシノピオリンタンパク質は、 10% SDS- PAGEに適用しィメージ アナライザー （BAS2000, Fujix) により放射活性を検出した。 結果を図 3に示した。 シノビォリン遺伝子から試験管内で翻訳されるシノビオリンタンパク質の SDS - PAG Eによる分子量は、 約 80kDaであることが認められた。
[実施例 6 ] ノ一ザンブロッティング法によるシノピオリン遺伝子の発現確認 実施例 1で得られた RA患者由来の滑膜細胞、 A549細胞株、 Jurkat細胞株そして H eLa細胞株より常法に従い mRNAを採取した。この mRNA 1 gを 1%ァガロースゲル電気 泳動で分離し、ナイ口ン膜にコンタクトブロッティング法で転写した。ナイ口ン膜 を 80°C、 2時間処理し、 デンハルト液中で 42°C、 2時間のプレハイブリダィゼイショ ンを行った。 次いで32 P放射ラベルしたシノビォリンの cDNA (1799bp; 配列番号： 1 の 1233 - 3031番） をプローブとして 42°C、 12時間ハイブリダィズさせた。 反応後の ナイロン膜を 300mM NaCl、 30mM sodium citrateで洗浄後、 15mM NaCl、 1. 5m sod ium citrateを使って 50°Cで再度洗浄を行った。目的の niRNAは X線フィルムを感光さ せることにより検出した。この結果得られたオートラジオグラフを図 4に示した。 シノピオリン遺伝子が、 RA患者由来滑膜細胞に強く発現していることを認めた。
[実施例 7 ] ウェスタンプロッティング去による各種細胞におけるシノビォリン 以下の細胞を試料として、シノビォリンの発現状態をウェスタンプロ
法で確認した。
•実施例 1で調製した RA患者由来の滑膜細胞
• ヒ ト臍帯血管内皮細胞 （HUVEC)
• HEK (human embryonic kidney) -293T
•実施例 3で調 した GST-部分シノピオリン融合タンパク質 （陽 ¾コントロール） まず試料とする各種細胞から、 1 P - 40で可溶化した細胞溶解液を調製した。 各 細胞溶解液は 25mM Tris-HCl (PH6. 8)、 0. 25% sodium dodecyl sulfate (SDS)、 0. 05%メルカプトェタノール、 0. 1%グリセ口ールで処理し、 8% SDS polyacrylaraide 電気泳動 （SDS - PAGE) により分離した。 SDS-PAGE後各種細胞由来タンパク質は、 ェ レクトロブロッテイング法により-トロセルロース （NC) 膜に転写した。 この NC 膜に対し、抗滑膜細胞抗血清を、 2. 0mg/raLの GST -部分シノビオリン融合タンパク質 と 5%スキムミルクを加えた Tris buffered sal ine (TBS) で 1000倍に希釈して室温 で 60分免疫反応させた。 また、陰性コントロールとして同じ抗体溶液を NC膜と反応 させる実験、 あるいは抗体溶液中の GST -部分シノビオリン融合タンパク質を GSTの みに代えた実験を同時に行った。 反応後の NC膜を 0. 1% Tween20/TBSで洗浄し、 ho rse radish peroxidase (HRP) 標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として室温で 60分 免疫反応させ、 0. 1% TWeen20/TBSで洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗 原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット （Amersham社） を用いた （Clinical Chemistry, 25， pl531, 1979) 。 結果を図 5に示した。
コントロール実験 （図 5 ; +GST) において RA患者由来滑膜細胞に検出され、 HUVE Cおよび HEK- 293T細胞に検出されない 220kDaタンパク質に対する抗滑膜細胞抗血清 の免疫反応を GST -部分シノビオリンは阻害し、 約 140kDaタンパク質、 ならびに 185 kDaタンパク質に対する免疫反応も一部阻害した （図 5；+GST -部分シノビオリン）。
220kDa以外のバンドで観察された反応性は、他の抗体との反応性をもとにフイブ ロネクチン （分子量約 240kDa) 、 あるいはラミニンのサブユニット （分子量約 200 kDa) 等と推測され、 この実験の結果に基づけばシノビォリンの分子量は約 220kDa であることが推測された。 しかしながら、実施例 5で確認したシノビオリンの分子 量は約 80kDaである。 両者の差から、シノビオリンが SDSでは解離しない多量体構造 をとっている可能 ^feが考えられた。
[実施例 8 ] ウェスタンプロッティング法による RA患者由来滑膜細胞におけるシ ノビオリンタンパク質の発現確認
実施例 1で調製した RA患者由来の滑膜細胞を 1°/。 NP- 40で可溶化した細胞破砕画 分を調製した。 この滑膜細胞破碎液は、 25mM Tris - HC1 (pH6. 8) 、 0. 25°/osodium d odecyl sulfate (SDS) 、 0. 05%メルカプトエタノール、 0. 1%グリセロールで処理し、 8% SDS polyacrylamide電気泳動 (SDS-PAGE) により分離した。 SDS- PAGE後、 滑膜 細胞由来タンパク質は、 エレクトロブロッテイング法により-トロセルロース （N C) 膜に転写した。 この NC膜に対し、 5%スキンミルクを加えた Tris buffered sal ine (TBS) で室温、 1時間ブロッキングした後、 RA患者由来滑膜細胞を免疫し得ら れた抗滑膜細胞抗血清 （図中の免疫後） を 5%スキンミルクを加えた TBSで 1000倍希 釈して室温、 1時間免疫反応させた。 同時に、 ゥサギに滑膜細胞を免疫する前に採 取した血清 （プレイミューン） を陰性コントロールとして用いた。 反応後の NC膜を 0. 1% Tween20/TBSで洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP) 標識抗ゥサギ IgG抗 体を 2次抗体として室温、 1時間免疫反応させ、 0. 1% Tween20/TBSで洗浄し、 HRP活 性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット （Ame rsham社) を用いた (Clinical Chemistry. 25, pl531, 1979) 。 結果を図 6に示し た。
[実施例 9 ] 免疫染色法による各種細胞や滑膜組織におけるシノビォリンの発現 免疫染色法は、滑膜細胞を常法に従いスライ ドガラス上に固定し、実施例 1の抗 滑膜細胞抗血清を用いた免疫染色を行った。 1%牛血清アルブミン （BSA) で 30分ブ ロッキングを行つた標本に、 1°/。BSAで 100倍希釈した抗滑膜細胞抗血清を室温で 60 分免疫反応させた。 また抗血清による観察とともに、 この抗血清から精製した精製 抗滑膜細胞抗体を用いた実験も行った。精製抗滑膜細胞抗体は、 GST-部分シノピオ リン融合タンパク質をリガンドとしてィムノアフィニティ精製することにより調 製した。 リガンドには、 配列番号： 1の 1233-3031番までのシノビオリン遺伝子 17 99bp揷入した GST -融合タンパク質発現ベクター pGEX_5X - 3を BL21に導入後発現させ た融合タンパク質を用レ、、グルタチオンセファロースカラムをフアルマシア社の方 法により作製して GST-部分 Syno- GSカラムとした。 精製抗滑膜細胞抗体を用いる場 合のコントロールには、 GSTをリガンドとして同じように抗血清をィムノアフィニ ティ精製して得た抗 GST抗体を用いた。 反応後の標本を PBSで洗浄後、 fluorescein isothiocyanate標識抗ゥサギ IgG抗体 を 2次抗体として免疫反応させた。抗滑膜細胞抗血清に免疫反応する抗原の確認は、 共焦点レーザー顕微鏡で行った。結果を図 7に示した。本抗血清は RA患者由来滑膜 細胞に強く免疫反応することが認められ、 この免疫反応は実施例 3で作製した GST -部分シノビオリン融合タンパク質によって阻害されることが確認できた （図 7上 段） 。 更にこの抗血清から精製した精製抗滑膜細胞抗体では、免疫反応が更に強ま り強陽性となることも確認できた （図 7下） 。
RA患者由来滑膜組織の染色は、常法に従い滑膜組織をスライドガラス上に固定し て行った。 1% BSAで 30分ブロッキングした標本に対して、 1% BSAで 100倍希釈した 抗滑膜細胞抗血清を室温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 H RP標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として免疫反応させた。 抗滑膜細胞抗血清に免 疫反応する抗原は、 HRP活 14に基づく 3, 3' -ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色に より確認した。前述のウェスタンプロッティング法と同様にして、 GST -部分シノビ ォリン融合タンパク質を用レ、た抗滑膜細胞抗血清吸収試験を滑膜組織染色に対し て行った。 GST -部分シノビオリン融合タンパク質を 2. 0mg/mLあるいは GST (2. Orag/ mL) を抗滑膜細胞抗血清に加え組織染色を行った。 結果は図 8に示した。 コント口 ールで認められた抗滑膜細胞抗血清の滑膜組織に対する染色性は、 GST-部分シノビ ォリン融合タンパク質により弱められることが認められた （図 8 ) 。 加えて上記 G ST -部分 Syno GSからの精製抗体を使った滑膜組織に対する免疫染色は、 GST-GSから 得られた抗体と比較し、 強陽性に反応することが認められた （図 9 ) 。
ウェスタンブロッテイング法 （実施例 8 ) および免疫染色法の結果より、 抗滑膜 細胞抗血清が認識するシノビオリンタンパク質は RA患者由来滑膜細胞及び滑膜組 織に発現していることが確認された。
[実施例 1 0 ] RA患者血清中抗シノビォリン抗体の存在
GST-部分シノビオリン融合タンパク質を抗原として、ウェスタンプロッティング 法によって M患者血清中の抗シノビオリン抗体の検出を試みた。実施例 Ίと同様の 操作により、 まず GST-部分シノビオリン融合タンパク質 （lOOng/lane) を SDS- PAG Eにより泳動し、 NC膜に転写した。 1次抗体として RA患者血清 （5例） を Tris bu ffered saline (TBS) で 1000倍希釈し、 GST -部分シノビオリン融合タンパク質を転 写した NC膜に対して室温で 60分免疫反応させた。 0. 1% Tween20/TBSで NC膜を洗浄し た後 HRP標識抗ヒ ト IgG抗体を 2次抗体として室温で 60分免疫反応させ、 0. 1% Twee n20/TBSで洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原と反応したヒ ト IgGを検 出した。 HRP活性の検出は実施例 7と同様に行った。 結果を図 1 0に示した。 RA患 者の血清中 （ 5例中 5例） には GST-部分シノピオリン融合タンパク質に対する抗 I gG抗体が存在することが認められた （図 1 0 ) 。 一方、 変形性関節症 （OA) 患者由 来血清及び正常ヒ ト血清中には GST -部分シノピオリンを認識する抗体は認められ なかった。
[実施例 1 1 ] 発現ライブラリーのスクリーニングによるシノビオリンリガンド の同定
実施例 2で作製した RA患者滑膜細胞由来の cDNA発現ライブラリ一を用いて、シノ ビォリンリガンドのスクリーニングを行った （竹縛忠臣、 渡邊俊樹編、 バイオマ二 ュアル UPシリーズ "タンパク質の分子間相互作用実験法" 、 pp. 66-67、 羊土社； Kaelin, W. G. et al. , Cell 70, 351—364, 1992 ; Skolnik, E. Y. et al. , Cell
65， 83 - 90， 1991； Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning, a laboratory ma nual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 12. 16-12. 20, 198 9) 。 ライブラリーファージを大腸菌 （XLl-Blue MRF' ) に 37°C20分間インキュベー トして感染させ、 Topァガロースと混和後プレートに広げた。 42°Cで 3. 5時間培養後、 lOmM IPTG に浸漬した後乾燥させたニトロセルロースメンブレンをプレートに载 せ、 さらに 37°Cで 3. 5時間培養を行った。 メンブレンを回収後、 洗浄バッファー [1 OmM Tris-HCl (pH8. 0) , 0. 5% Skim milk, 0. 1% TritonX-100, 150mM NaCl, ImM E DTA, 5mM MgCl2, ImM DTT, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim 社） ] で 5分間の洗浄を 5回行った後、 ブロッキングバッファー [10mM Tris-HCl (p H8. 0)， 5% Skim milk, 0. 1% Triton X- 100, 150mM NaCl, ImM EDTA, 5raM MgCl2, ImM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim 社） ] に 1時間浸漬した。 洗浄バッファーで 5分間の洗浄を 5回行った後、 プロティ ンキナーゼ Aで 32pラベルした GST-シノビオリン（実施例 3で精製した GST-部分シ ノビオリン融合タンパク質） をプローブとして加え （約 106 cpm/ral) 、 インキュべ 一トした。メンブレン 1枚のカウントが約 lkcpmになるまで洗浄バッファーを変えな がら洗浄を繰り返し、オートラジオグラフィ一によりシグナルを検出した。その結 果、 シノビォリンに結合するクローンが得られた。 このクローンをシノビオリンリ ガンド （SL) と名付けた。
SLの cDNAについて、その 5'末端付近の 100bp、 ならびに 3'末端付近の 100bpについ て塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報を基にデータベースの検索を行つた ところ、 末端部分の 100bpにおいては S1- 5 [Lecka-Czernik, B. et al. , Molecula r and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995； accession number U03877 (cDNA) ,
AAA65590 (protein)、 "EFEMP1" とも呼ばれる: Stone, E. M. et al. , Nature Genetics 22, 199—202, 1999； accession number Q12805 (protein) ] と呼ば; flる 公知の遺伝子と共通の配列であることが明らかとなった。両者の遺伝子とその翻訳 産物の大きさはほぼ同じであり、 同一のタンパク質であることが示唆された。
[実施例 1 2〕 ノ一ザンブロッティング法による SL遺伝子の発現
実施例 6と同様に各種細胞より mRNAを揉取し、 実施例 1 1で得られた SLの cDNA をプローブとしてノーザンブロッティング法を行った。用いた細胞は以下のとおり である。 RA患者由来滑膜細胞は、 SL遺伝子を強発現していることが認められた （図 1 1 )
HEK-293T
実施例 1で調製した RA患者由来の滑膜細胞
A549
HeLa [実施例 1 3 ] シノビ才リンと SLの結合
SL cDNAを実施例 3と同様に pGEXベクターに揷入し、 GST- SL融合タンパク質を作 製し、 10% SDS - PAGEに GST - SL (500ng) 、 コントロールとして GST (1 μ g) を適用し た。 SDS- PAGE後、 エレクトロブロッテイング法によりナイロン膜に転写した。 この ナイロン膜 、 6M guanidine hydrochrolide^ 5mM 2- Mercaptoethanolを含む 50mM
Tris-HCl (pH8. 0) で 1時間、 室温で変性させ、 5mM 2- Mercaptoethanol、 0. 05% T ween20を含む 50mM Tris - HC1 (pH8. 0) で 4。C、 ー晚再生した。 再生されたナイロン 月莫は、 Blocking buffer [lOmM Tris-HCl (pH8. 0) , 5% Skim milk, 0. 1% Triton X 一 100, 150mM NaCl, ImM EDTA, 5mM MgCl2， ImM DTT, 5% glycerol, protease inh ibitor (complete, Boehringer Mannheim社) ] で処理し、 Blocking buffer (0. 5% skim milk以外は上記と同じ組成）で洗浄した。 その後、 TNT - coupled Translatio n System (Promega社） 及び pcDNA3 - HA-シノビオリン- HAHA (配列番号： 1のシノビ オリン cDNA 1851bp ;60 - 1910に HA- tagを付加したシノビオリン cDNAを発現ベクター pcDNA3に揷入した） を用い、 in vitro translationを行い [35S]ラベルした HA -シノ ビォリン- HAHA融合タンパク質 （[35S]HA-シノビオリン- HAHA) をプローブとして用 レヽナイ口ン膜上の GST - SL及び GSTと室温で 2時間反応させた。 そのナイ口ン膜は、 1 OmM Tris-HCl (pH8. 0) , 0. 5% Skim milk, 0. 1% TritonX-100, 150mM NaCl, ImM E DTA, 5raM MgCl2, ImM DTT, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim 社） で洗浄し、 イメージアナライザー （BAS2000, Fujix) で放射活性を検出した。 ナイ口ン膜に転写された GST- SL融合タンパク質と [3¾]HA -シノピオリン -HAHAは、両 者の結合が観察された。 またコントロールである GSTと [35S]HA-シノビオリン- HAHA との結合は認められなかった （図 1 2 ) 。 この結果から、 シノビォリンと SLは、 タ ンパク質の相互作用により結合することが推測された。
また実施例 1 4では、シノビォリンによる培養物中のシノビォリンリガンドの中 和を通じて滑膜細胞の増殖が阻害されることを示唆する結果が得られている。これ らの結果に基づいて、 SLのシノビオリン結合部位に相当する構造を持った SLの変異 体は、 シノビオリン- SL間の結合に対する拮抗阻害作用によって滑膜細胞の増殖を 抑制する作用を持つ可能性が考えられる。更に、シノビォリンの SL結合部位に相当 する構造を持ったシノビオリン変異体についても、 SL変異体と同様の拮抗阻害作用 を期待できる可能性が有る。
[実施例 1 4 ] MTTアツセィ
実施例 1で調製した RA患者由来滑膜細胞を 5 X 103 cell/wellとなるように 96 w ell plateを用い調製し、 GSTまたは GST-部分シノビオリンを最終濃度 0. 01〜1 μ M となるように細胞上清に添加した。培養 3日後 3 - (4, 5 - dimethyl - 2- thiazolyl) - 2, 5 - diphenyl- 2H- tetrazolium bromide (MTT) /PBSを細胞上清に添加し、 37°C、 5% C 02 の条件で 3時間培養を行った。 培養後細胞上清を取り除き dimethyl sulfoxide により MTT formazanの結晶を溶解し吸光度測定を行った （Journal of I匪 unologi cal Methods, 65, 55, 1983) 。 10%- FCS/DMEM、 37°C、 5% C02 の条件下での RA患者 由来滑膜細胞增殖は GST -部分シノビオリン （1 M) によって有意に抑制された （図 1 3 ) 。
[実施例 1 5 ] シノビオリン遺伝子導入マウスの作製
シノビオリン蛋白質をコードする DNAの N末に Flagタグを連結させ、3'側下流にポ リ A シグナルを結合させたシノビオリン遺伝子導入用ベクターを構築した。ベクタ 一は pCAGGS (Niwa, H. et al. , Gene 108： 193-9， 1991) を基にして構築し、 プロ モーターには、 3ァクチンプロモーター、 ェンハンサ一には、 ヒ トサイトメガロウ ノレス目 ij期ェンノヽンサ一 (human cytomegalovirus immediate early enhancer) を 用いた （図 1 4 ) 。
シノビオリン遺伝子導入用ベクターは、顕微鏡下でマニピュレーターに接続した 微小ガラスピぺットを用いマイクロインジェクション法によりマウスの卵細胞に 導入した。 受精卵の雄性前核に DNAを注入し、 注入した操作卵は、 精管結紮雄マウ スとの交配により偽妊娠を誘起した雌マウス （レシピエントマウス）の卵管内に移 植した。移植 19日後に自然分娩または帝王切開により仔マウスを得た。帝王切開の 場合は、別に準備しておいた雌マウスを里親として仔マウスを哺育させた。各出産 仔の尾から DNAを採取し、 PCR法を用いて導入遺伝子が保持されていることを確認し その結果、 シノビオリン強発現マウスには顕著な関節の腫脹が認められた。 シノ ビォリン遺伝子導入マウスにおける関節症発症率は 33% (10匹/ 30匹）であったこ と力 ら、 関節の腫脹は自然発症的なマウスの奇形 （C57B6マウスの水頭症発症率は 1 %未満） ではなく、 シノピオリン分子の関与によるものと考えられる。 シノビォ リン強発現マウスの左後肢を軟 X線撮影した写真を示す （図 1 5 )
[実施例 1 6 ] 関節の組識学的検討 '
シノビオリン遺伝子導入マウス （1匹） の指関節の組織学的な検討を行った。 指 関節部分の組識切片をへマトキシリンェォジン （HE)染色した。 へマトキシリンェ ォジン染色は、 公知の方法により実施した。
HE染色の結果、関節症を呈した部分においては著しい滑膜増生に伴う骨破壊と異 常な骨新生が認められた （図 1 6 )。 一方、対照とした遺伝子導入マウスの正常な 指関節においては、 上記所見は観察されなかった （図 1 7上） 。
また、指関節における抗 Flag抗体による免疫染色を行った結果、 シノビオリン遺 伝子導入マウスにおいては、増生を示した滑膜組織および軟骨細胞にシノビオリン の発現が認められた （図 1 8 ) 、遺伝子導入マウスの正常な指関節においては上 記所見は観察されなかった （図 1 7下） 。
[実施例 1 7 ] ノックァゥトマウスの作成
マウスシノビオリン遺伝子断片の翻訳開始点 （第一メチォニンを翻訳する ATGコ ドン） に lacZ遺伝子を導入し、 ターゲテイングベクターを構築した。 マーカ一遺伝 子としてネオマイシン耐性 （neo) 遺伝子を導入し、 またジフテリア毒素 A (DT-A) 遺伝子も結合させ非相同的な組換えを起こした細胞株を排除できるようにした（図 1 9 )
このターゲティングべクタ をマウスの ES細胞 ΪΤ-2 にエレク ト口ポレーショ ンにより導入し相同組み換えを生じた細胞株を選抜した。得られた細胞をマウスの 胚胎盤胞または 8細胞期胚に注入し直接仮親の卵管に移植する力 一日培養して胚 盤胞まで発生したものを仮親の子官に移植した。 その後は、 トランスジエニック動 物の作製と同様の手法により、 ノックァゥトマウスを作製した。得られたヘテロ変 異マウス （F1) 同士を交配させ、 ヘテロ及びホモ変異マウスを得た。 こうして得ら れた変異マウスにおいては、本来シノビオリンが発現すべき組織で、 シノビオリン に代わって LacZタンパク質 -ガラクトシダーゼ） が発現する。
遺伝子型はサザンブロット解析により確認した。 野生型マウス （1 4匹） および シノビォリンへテロノックアウトマウス （3 2匹） に関しては、 生後 2週齢ほどの マウスの尾先端 3腿程度から DNAを抽出した。シノビオリンホモノックアウトマウス では、胎生 14. 5日の胎仔から実体顕微鏡下に尾部および上、下肢の一部を採取し、 DNAを抽出した。 得られた DNAを制限酵素 Pstlで DNAを消化したものを用いた。 解析 結果を図 2 0に示す。 野生型では 6. 5kbp、 ホモ変異マウスでは 8. 5kbp、 ヘテロ変異 マウスでは両方の位置にパンドが検出された。
シノピオリン遺伝子の発現をノーザンプロッティングにより確認した。野生型、 ヘテロノックァゥトマウス、およぴホモノックァゥトマゥス（胎生 12. 5日の胚全体) から mR Aを抽出し、 1. 2%ァガロースゲルの各レーンに 20 /z gずつ電気泳動した。 そ の結果、 ホモノックアウトマウス （-/-） ではシノビオリン mRNAは検出されず、 へ テロノックアウトマウス （+/- ) では、 野生型 (+/+) に比べ弱い mRNAの発現が見ら れた （図 2 1 ) 。
[実施例 1 8 ] シノピオリン発現部位の検討
実施例 1 7で得た変異マゥスにおけるシノビォリン発現部位を LacZ染色により 検討した。 すなわち、 5-bromo- 4-chloro_3— indolyl— ]3 - D- galactoside (X-Gal) を 用いて胚全体を発色させ、 LacZ ( -ガラクトシダーゼ活性として） の発現分布を 調べた。 観察した胚の数は、 3 2個である。
その結果、胎生 12. 5日齢では、頭頂骨および四肤に、 13. 5日齢では耳および四肢 に LacZの強い発現が認められた（図 2 2 )。 いずれも骨おょぴ軟骨が形成される部 位であつた。更に四肢形成期における四肢組識切片の LacZ染色および HE染色を行つ た結果、 Apical Ectodermal Ridge (AER;外胚葉頂堤） および軟骨 ·骨原基 （また は軟骨 ·骨） に強い発現が観察された （図 2 3 ) 。
さらに、 胎生 13日齢の肤芽 （limb bud) を取りだし、 凍結切片を作製後、 へマト キシリン .ェォジン （HE) 染色また LacZ染色を行った。 具体的には、 凍結切片を P BS (-）で 5分、 3回洗浄し、 X- gal染色液 [X- gal (20mg/ral) 1. 25ml, HEPES (1M) 2. 2ml, フェリシアン化カリウム溶液 （lOOmM) 1. 5ml, NaCl (5M) 150 ^ 1, MgCl2 (1 M) 65 μ ΐ, 10 X PBS (-) 5ml をミリ Q水 （ミリポア） で 50mlとしたもの] に切片をの せたスライドグラスを浸し、 37°Cで反応を開始させた。 染色後、 エタノールシリー ズおよびキシレンで脱水し、 封入した。 その結果、 LacZの青色の染色が、 未分化間 葉系の細胞 （骨 ·軟骨の原基） に濃染されていた （図 2 4および 2 5 ) 。
[実施例 1 9 ] 表現型の検討
更にシノビオリン遺伝子ノックァゥトマウスの表現型について検討を行った。 胎生 12. 5日齢では、ホモはへテロと比較し、頭頂部から臀部までの長さが短く、 頭蓋や四肢の形成が未熟である傾向が認められたが、胎生 13日齢ではへテ口と野生 型の表現型の間に顕著な差は認められなかつだ （図 2 6 )。 なお、 ホモマウスでは 出生が認められず、さらに少なくとも胎生 17日以降のホモの胎仔の生存が確認でき なかったことにより、 胎生致死と考えられた （表 1 ) 。
Figure imgf000072_0001
胎生 14. 5日齢では、ヘテロとホモの間において、頭頂部から臀部までの長さに顕 著な差は認められなかった。 し力、し、ヘテロでは指及び関節が形成されているのに 対し、 ホモでは形成されず、 肢芽異常が認められた （図 2 7 ) 。
更に、 ホモで異常を示した後肢に対し LacZおよび HE染色を行った結果、 AER及び 未分化間葉系細胞の濃縮部位（将来指骨を形成する部位） にシノビオリンの発現を 反映する LacZの発現が認められた （図 2 8 ) 。
胎生 15. 5日齢では、 ホモは胺芽、 上下顎骨および耳に形態異常を示し、 死亡して いた （図 2 9 ) 。 更にアルシャンプル一により軟骨組織、 ァリザリンレッドにより 骨 （石灰化） 組識の染色を行った。 すなわち、 マウスの表皮 '真皮 '内容物を取り 除き、 固定液 （エタノール：過酸化水素水 = 9 ： 1 ) に漬け、 その後アルコールシ リーズで脱水後、 ァリザリンレツドおよびアルシャンブルーにより染色し、アル力 リ溶液により組識を透明化した。透明化終了後、 グリセリン溶液中に保存し染色を 観察した。 結果、 ホモでは軟骨組識 （青く染色） 、 及び骨 （石灰化） 組識 （赤く染 色） のいずれも形成が認められなかった （図 3 0 ) 。
以上の結果より、 シノビオリン遺伝子ホモノックアウトマウスは、胎生期におい て肢芽の発生異常が認められ、 また、軟骨及び骨への形成が認められず、 肢芽と軟 骨、骨の発生部位にシノビオリンの発現が認められたことから、 シノビオリン分子 の骨格形成への関与が強く考えられた。
[実施例 2 0 ] シノピオリン遺伝子ノックァゥトマウスにおける関節炎用カクテ ル投与
マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎 （CIA) は、 ヒト慢性関節リウマチの関節 炎モデルとして広く利用されている。実施例 1 7で作製したシノビオリン遺伝子ノ ックァゥトマウス (ヘテロ接合体) または野生型マウスに抗コラーゲン抗体カクテ ルを投与し、 惹起される関節炎を観察した。 その結果、 シノビォリンのヘテロノッ クアウトマウスでは、 野生型に比べ関節炎の惹起が弱いことが判明した （図 3 1 ) 。 この結果からも、シノビオリンが RAにおける関節炎誘発に貢献していることが支持 される。
[実施例 2 1 ] シノビオリン遺伝子ノックアウトマウスの胎仔肢芽細胞の初代培 養の解析
ノックアウト （K0) マウスより得られた （explant法） 細胞のうち、 軟骨 ·骨お よぴ肢の原基となると考えられる未分化間葉系細胞にのみ LacZ染色、すなわちシノ ピオリンの発現が認められた。 また、 胎仔肢芽細胞の初代培養において、 LacZ陽性 のコロニー（すなわちシノビォリン発現細胞） とアルシャンブルー染色陽 14のコ口 ニーは一致しており、 さらに双核の典型的な軟骨細胞においても LacZ β -ガラク トシダーゼ活十生として） の染色 （シノビォリンの発現） が見られることから、 骨 ' 軟骨分化にシノビオリンが関与していることが支持された。さらにアル力リフォス ファターゼ染色、 Kossaの染色などにより、 骨 ·軟骨形成能がホモノックアウト由 来の細胞では遅延していることが確認された （図 3 2〜3 8 ) 。
Kossa染色は、 細胞を洗浄後、 硝酸銀溶液 （5% w/v) で置換し、 蒸留水で軽く洗 浄後、 チォ硫酸ナトリウム溶液 （5% w/v) で還元 ·定着を行い、 洗浄後、 ケルンェ ヒ トロート液 （0. 1% w/v ケルンェヒ トロート （ヌクレア ' ファストレッ ド） ， 5% w/v 硫酸アルミニウム） で対比染色を行った （関 正次， 「組織検査法一組織構造 と局所化学一」 ， 257-258， 杏林書院， 1961 ; リゾン， L. , 今泉 正訳， 「組織化学 および細胞化学一理論と方法」， 625-636, 白水社， 1962 ; 佐野 豊， 「組織化学研 究法一理論と術式」 ， 616-621, 南山堂， 1965) 。 アルカリフォスファタ一ゼ活十生 の検出は、 アルカリフォスファターゼ組織染色キット （Sigma, Diagnostic Kits and reagents, alkaline phosphatase (AP) , leukocyte, し at. No. 86 - R) により 行った。
[実施例 2 2 ] シノピオリン遺伝子ノックァゥトマウス由来の細胞を用いた被験 化合物のアツセィ
シノピオリン遺伝子へテ口ノックアウトマウス （lacZ遺伝子ノックイン） の初代 培養細胞を用いて、 被験試料がシノビオリン遺伝子の発現に及ぼす効果を J3 -gal アツセィにより評価した。 3回継代したシノピオリン遺伝子へテ口ノックアウトマ ウスの初代培養細胞を 24ゥエルプレートに 1ゥエル当たり 0、 1 X 103、 3 X 103、 1 X 1 0 3X104、 および 1X105細胞播き、 10%ゥシ胎仔血清を含むダルベッコ改変ィ ーグル培地 （DMEM) 中で一晚培養した。 まず、 無刺激条件のまま細胞培養に細胞溶 解液 （プロメガ社製） を細胞層が完全に覆われるのに十分な量 （100 I/well) 加 え、培養プレートを振とう機に移し、細胞層が溶解液に常に浸されるように室温で 15分ゆつく りと振とうした。
細胞の j3 -ガラクトシダーゼ活性は、 次のようにして測定した。 得られた細胞抽 出液 20 il に、 Mg溶液 （0. lM MgCl2, 4.5M 3 -メルカプトエタノール） を 1μ1、 0NPG溶液（o— nitrophenyl— — D— galactopyranoside) (0.1M リン酸緩衝液 (pH7.5) 中に ½g/ml の濃度） を 22μ1、 および 0.1M リン酸緩衝液 (ρΗ7.5) 57^1 を加 え、 全量 を ΙΟΟμΙ とした。 乾燥しないように注意して、 37°Cで 6時間インキュべ ートした。 150 の 1M炭酸ナトリゥム （Na2C03 21.2g を H20 に溶かして 200 ml にメスアップし、 0. フィルターで濾過したもの） を加えて反応を停止さ せ、 420nmの吸光度を測定して (3-ガラクトシダーゼ活性を定量した。実験は 3連で 行った。 その結果、 lacZ遺伝子ノックインマウス細胞において細胞数に依存した 3 -ガラク トシダーゼ活性が検出された （図 3 9) 。 β-ガラクトシダーゼ活性を指標 としてプロモーター活 1"生を評価 （/3- galアツセィ） できることが確認された。 次に初代培養細胞に各種薬剤を添カ卩して同様の -galァッセィを行い、シノピオ リンプロモーター活性に対する各種薬剤の影響を評価した。 陰性対照として、培地 のみを添加して同様の測定を行った。 被験薬剤としては、 プレドニソロン （Predn isolone) (0.01-1 μΜ)、 およぴ 12 - 0 - tetradec細 ylphorbol 13-acetate (TPA; 0. 001 - 0.1 μΜ)を用いた。 プレドニソロンはステロイ ド性抗炎症剤、 ΤΡΑはプロティ ンキナーゼ Cの活' [·生化剤である。
ゥエル当たり 5X10'1 の初代培養細胞を撒き、 一晩培養後に上記濃度の各薬剤を 添カ卩した。 薬剤添加後に 72時間培養して、 各ゥエルの -ガラクトシダーゼ活性 を測定しプロモーター活性を評価した。 その結果、 これらの薬剤により、 濃度依存 的にシノビオリンプロモーター活性が影響を受けることが判明した （図 40) 。 す なわち、本発明に基づくアツセィ系によって、薬剤のシノビオリンプロモーターに 与える活性を評価しうることが裏付けられた。以上の結果から、 このようなアツセ ィにより、各種の薬剤がシノピオリンプロモーター活性に及ぼす効果を評価するこ とが可能となり、シノピオリンプロモーター活性を促進または抑制する化合物をス クリ一二ングすることができる。
[実施例 2 3 ] 抗シノビオリンモノクローナル抗体の作製
シノビォリンに対するモノクローナル抗体を以下のように調製した。免疫用のぺ プチドとして、以下に示すヒ トシノビオリンの部分アミノ酸配列を含む 3種類のぺ プチドを合成した。 これらのアミノ酸配歹 IJは、抗原性を有すると推測された領域か' ら選択した。
Syno- P3 (SLALTGAVVAHAYYCZ配列番号： 3 ) 、
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQSノ配列番号： 4 ) 、 および
Syno-Pl (GAATTTAAGTSATACZ配列番号： 5 )
各合成ペプチドに、 アミノ酸配列中の Cysを介して、 スカシガイへモシァニン （K LH) を結合させた。 KLHを結合した各合成ペプチドの 50 / gを 0. 1ml 生理食塩水に 溶角早し、 フロイントの完全アジュバント （FCA) 0. lmlを加えて免疫原を作製した。 各免疫原をそれぞれ 8匹のマウス （BALB/Cメス、 5週齢） 背部皮下に 0. 2ml注射し免 疫した。免疫は 2週間毎に計 4回行レ、、 その 1週間後にさらに 1回免疫した。 最終免疫 の 8日後に、心臓から採血し血清 200 μ 1以上を分取した。 ELISAによって抗体価の上 昇を確認できた個体から脾細胞を採取し、 細胞融合を行つた。
各免疫原につき 3個体のマウス血清について、 ELISAによる抗体価の測定結果を 図 4 1〜図 4 3に示した。各血清試料は 3連でアツセィを行い、その平均値をダラ フに示した。 いずれの免疫原を用いた場合にも、抗体価が上昇した個体が確認され た。これらの免疫原がいずれもシノビオリンの免疫原として有用であることが確認 された。
ミエローマ細胞株 （P3U1) とマウス脾細胞を 1 : 10で混和し、 5 0 %の PEG (和光 純薬社 PEG1540) 存在下で細胞融合させた。 融合後、 脾細胞数が 5 X 105個/ mlとな るように 96ゥエルプレートに播いた。 HAT培地中で 10〜14日培養した後、 細胞の増 殖を確認し、 培養上清の検定した。 培養上清の検定には、 各合成ペプチドを固相化 した ELISAプレートを用いた。検定の操作は次のとおりである。 ELISAプレートに培 養上清を反応させた後、 抗マウス IgGャギ- poxを用いて陽性ゥエルを選択した。 ク 口一二ングに供するゥエルを選択し、他の陽性ゥエルの細胞については凍結保存し た。
数日後、 一株につき 96ゥヱルプレート 1枚、 100細胞/プレート （20細胞/ ml) と なるように撒き、 10〜14日間培養した。 コロニーを判定し、培養上清の検定を行つ た。培養上清の検定は、上清 50 1を上記スクリーニング用抗原固相化 ELISAプレー トに適用して行った。 第二抗体は、 抗マウス IgGャギ- poxを使用した。 選択したコ ロニーは、培養後、 リクローニングし、 10〜14日間培養してコロニー判定および培 養上清の検定を上記と同様に実施した。親株別にゥヱルを選択し、 24ゥエルプレー トで培養し、上清を回収してクローンのチェックを行い、抗体のサブクラスおよび 抗体産生を検定した。 クローニングの結果、 シノビオリンに対する高い親和性を有 するモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマとして、 Syno-P2 (配列番号： 4 ) を免疫原として得られた 2つのクローン 10Dbおよび 7Bcが選択された。
[実施例 2 4 ] 抗シノピオリンモノクローナル抗体を用いた患者試料のシノビォ リンの検出
( 1 )抗シノピオリンモノクローナル抗体による患者由来滑膜細胞のウェスタンプ ロッティング
実施例 2 3で得られた Syno_P2を認識する 2種の抗シノピオリンモノクローナル 抗体 （10Dbおよび 7Bc) を用いて、 慢性関節リウマチ患者 (RA) 由来滑膜細胞の蛋 白質を SDS- PAGEで分離し、 ウェスタンブロッテイング法を行った。 ウェスタンプロ ッティング法の操作は、 抗体として実施例 2 3のモノクローナル抗体 10Dbおよび 7 Beを、 そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ- HRPを用いる他は実施例 8に記載 のとおりである。 対照として、 変形性関節症患者 （OA) 由来の滑膜細胞も解析した。 その結果、 RA患者由来の滑膜細胞で特異的なシグナルが検出された （図 4 4 A) 。 実施例 2 3で得られたモノクローナル抗体は、 RA患者の滑膜細胞を特異的に認識す ることが確認された。 これらのモノクローナル抗体は、 RAの検出に有用である。
〈 2〉抗シノピオリンモノクローナル抗体による RA患者由来滑膜細胞の蛍光免疫染 色
モノクローナル抗体 10Dbを用いて、 RA患者由来滑膜細胞の蛍光免疫細胞化学解析 を行った。 免疫染色の操作は、 抗体として実施例 2 3のモノクローナル抗体 10Db を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -FITCを用いる他は実施例 9に記載の とおりである。 シノビオリン蛋白質のシグナルは、 RA患者由来滑膜細胞で強く検出 されたが、 二次抗体のみを反応させた対照では検出されなかった （図 4 4 B) 。 ( 3 ) 抗シノピオリンモノクローナル抗体による RA患者由来滑膜組織の免疫染色 モノクローナル抗体 10Dbおよび 7Bcを用いて、 RA患者から採取した滑膜組織切片 の免疫染色を行った。免疫染色の操作は、抗体として実施例 2 3のモノクローナル 抗体 10Dbおよび 7Bcを、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は 実施例 9に記載のとおりである。 シノビォリン蛋白質のシグナルは、 RA患者由来滑 膜組織で強く検出された （図 4 5 ) 。 同時に行った HE染色により、 滑膜細胞の増殖 層が観察され、その部分がモノクローナル抗体で染色されていることが確認された。 これらの結果から、本発明のモノクローナル抗体は、 RA患者の滑膜組織を特異的に 認識することが確認された。以上のように、 シノビオリン抗体を用いて患者試料中 のシノビオリンを検出することにより、 RAの検查および診断を実施することができ る。
[実施例 2 5 ] シノビオリンのュビキチンリガーゼ活性の検出
E3ュビキチン -蛋白質リガーゼは、 自己ュビキチン化をすることが知られている (Hashizume R et al. , J. Biol. Chem. 276, 14537 - 14540， 2001)。そこで、 シノ ビオリンについて自己ュビキチン化活性があるかどうか検討した。 pCAGGSベクター に FLAG -シノピオリン遺伝子を揷入したプラスミ ドを、 HEK - 293細胞にトランスフエ クシヨンし、 36時間後細胞を回収した。 Buffer A [15 mM Tris - HC1 pH 7. 5、 0. 5 M NaCl、 0. 35% NP- 40、 1 mM PMSF、 2 μ g/ml aprotinin, 2 μ g/ml leupeptin] にて 細胞破碎液を得た。 細胞破碎液を高速遠心器にて遠心分離し、 その上清 0. 6 mlに、 3 μ gの抗 FLAG抗体および 7. 5 μ 1のプロティン Αビーズを添加し、 ー晚免疫沈降を行 つた。 Buffer Aもしくは 0. 1% SDS を添加した Buffer Aにて 3回、 Buffer B [25 ra M Tris-HCl pH 7. 5, 50 mM NaCl, 0. 01% Nonidet P_40， 10% glycerol, 1 mM EDT A] にて 2回ビーズを洗浄し、 30 i lのュビキチンリガーゼ反応液 [50 mM Tri s- HC1 pH 7. 4, 5 mM MgCl2, 2 mM NaF, 10 nM okadaic acid, 2 mM ATP, 0. 6 mM DTT, 1 . 5 GST - HA-ュビキチン， 40 ng酵母由来 El, 0. 3 μ g UbcH5c (E2) ] を添力 Qし、 3 7°Cで 30分反応させた。 0. 1 M DTTを含む 2 X Laemml i SDS- loading bufferを 30 μ 1 加え、 ボイルした後、 SDS- PAGEにて展開し、 ニトロセルロース膜にトランスファー した。 一次抗体には抗 FLAG抗体 （SIGMA) および抗 HA抗体 （ロシュ 'ダイァグノス ティックス社) を用いた。 HRP活性の検出は実施例 7と同様に行った。 なお、 コン トローノレとして FLAG -シノピオリン遺伝子をトランスフエクションした細胞の破 砕液のみ （免疫沈降前）、 または、 細胞破碎液を免疫沈降操作して得た溶液 （すな わち FLAG -シノビオリンタンパク質とその免疫複合体のみ） を用いた。 さらに、 GS T-HA-ュビキチン、 ATP、 Elまたは E2のいずれかを添加しない反応も行った （GST-H A-ュビキチン非添加の場合は GSTを用いて反応を行った）。 0. 1% SDS添加 Buffer A 洗浄により imraunopurificationしたシノビォリンを用いた結果を図 4 6に示した。 抗 HA抗体によるプロットにおいて、 シノビオリンの分子量 （図 4 6 *印） より約 3 5 kDa大きなサイズのパンドが検出された （図 4 6 矢印）。 このバンドは抗 FLAG抗 体によるプロットにも見られ、 GST - HA-ュビキチンがシノピオリンに付力 []したもの と考えられた。 さらに、 ATP、 Elまたは E2のいずれかを欠損した反応系では、 シノ ビオリンの自己ュビキチン化が起こらないことが示された。 Buffer Aのみでビーズ を洗浄した場合にも同様の結果となった。 これらの結果より、 1 ) シノビオリンを 含む免疫複合体に E1およひ Έ2依存的なュビキチンリガーゼ活^ ¾が存在し、 かつ、 i 脆 unopurificationの結果より、 2 ) シノビオリンは E3ュビキチン-蛋白質リガーゼ 活性を有することが明らかとなつた。 産業上の利用の可能性
本発明は、 滑膜の発達、 ならびに骨 ·軟骨おょぴ四肢の発達に関与する新規な蛋 白質をコードする遺伝子「シノビオリン」 を提供した。 本発明の遺伝子は RAに関与 しており、 RA患者では、 この遺伝子産物に対する抗体が産生されている。 本発明の 遺伝子およびタンパク質は、 RAの診断に有用な新規なマーカーとなる。本発明の「シ ノビォリン」 は、 RA患者の関節滑膜細胞に強発現しており、 インサイチュハイプリ ダイゼーションゃィンサイチュ PCRにより、 RA疾患の診断や治療効果の判定に貢献 する。更に、 RA患者の血中にはシノビオリンに対する抗体を高頻度で見出すことが できる。 これをマーカーとすることで RAの特異的な診断を可能とする。本発明によ つて提供されるシノビオリン蛋白質、またはその部分ぺプチドは患者血清中のシノ ビオリンに対する抗体の検出に有用である。
また、 シノビオリンは未分化間葉系細胞において発現している。 シノビオリンを 細胞マーカーとして利用すれば、胚の細胞などから未分化間葉系細胞を回収するこ とができる。 未分化間葉系細胞は骨、 軟骨に分化する細胞であり、 再生医学的応用 が期待されている。すなわち、 シノビォリンを細胞マーカーとして回収した未分化 間葉系細胞を試験管内または生体内で分化させ、骨 ·軟骨の形成や関節の再構築を 行えば、 傷害を受けた骨 ·軟骨組織や関節を新たに再生させることも可能になる。 本発明のシノビオリン、並びにそのリガンドは、 RAの主要な病態である関節滑膜 細胞の増殖に密接に関連していることが明らかにされた。 したがって、本発明によ つて提供されるシノビオリン、 あるいはそのリガンドは、 RAの治療方法の開発に当 たって重要な知見を与える。 より具体的には、 シノビォリンとそのリガンドとの結 合に関与する化合物をスクリーニングすることにより、これまでとはまったく異な つたアプローチで RA治療技術の開発を進めることができるのである。さらにシノビ オリンのトランスジエニックマウスは、高い頻度で関節の滑膜が増生し、 関節炎を 伴う指関節の膨脹を起した。本発明により提供されるシノビォリンのトランスジェ ニック動物は、 RAのモデルとして、その治療技術や医薬品の開発に極めて有用であ る。

Claims

求の範囲
1. 下記 （a) から （e) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌ クレオチド、
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオ チド、
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、欠失、揷入、および Zまたは付カ卩したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードす るポリヌクレオチド。
' ( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジ ヱントな条件下でハイブリダイズし、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列から なる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
(e) 配列番号： 1に記載の塩基配列と少なくとも 70%以上の相同性を有す る塩基配列からなり、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質と機 能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
2. 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質の部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチド。
3. 請求項 1、または請求項 2に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白 質またはべプチド。
4. 次の （1) 一 （3) 力 らなる群から選択される少なくとも 1つの活性を有する 請求項 3に言己載の蛋白質またはぺプチド。
(1) 慢性関節リウマチ患者の血液中に見出される抗体と結合する
(2) シノビオリンリガンド S1-5と結合する
(3) 滑膜増生を促進する 請求項 1、 または請求項 2に記載のポリヌクレオチドが揷入されたベクター。 求項 1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項 5に記載のベタターを保持す る形質転換細胞。
求項 6に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清 力、ら発現させた蛋白質またはべプチドを回収する工程を含む、請求項 3に記載 の蛋白質またはぺプチドの製造方法。
請求項 3に記載の蛋白質またはべプチドに結合する抗体。
求項 3に記載のタンパク質またはべプチドを含む、請求項 3に記載のタンパ ク質またはぺプチドを認識する抗体を分析するための免疫学的分析用試薬。.慢性関節リゥマチの診断、または治療効果の判定を目的とするものである請 求項 9の免疫学的分析用試薬。
.請求項 3に記載のタンパク質またはペプチドと反応する抗体を含む、請求項 3に記載のタンパク質を分析するための免疫学的分析用試薬。
. 慢+生関節リゥマチの診断、または治療効果の判定を目的とするものである請 求項 1 1に記載の免疫学的分析用試薬。
.分析すべき請求項 3に記載のタンパク質が滑膜細胞に存在するものである請 求項 1 2の免疫学的分析用試薬。
. 次の工程を含む、生体試料中の請求項 3に記載の蛋白質、 および/またはそ の部分ぺプチドに結合する抗体の測定方法。
(1)生体試料を請求項 3に記載の蛋白質、 および/またはその部分ぺプチドと 接触させる工程、 および
(2) 請求項 3に記載の蛋白質、および Zまたはその部分べプチドに結合する抗 体を検出する工程
. 次の工程を含む、生体試料中の請求項 3に記載の蛋白質、および Zまたはそ の部分ぺプチドの測定方法。
(1)生体試料を請求項 8に記載の抗体と接触させる工程、 および (2)請求項 3に記載の蛋白質、 および/またはその部分べプチドに結合する、 請求項 8に記載の抗体を検出する工程
.配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖 に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
. 次の工程を含む、生体試料中の請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレ ォチドの測定方法。
(1)生体試料を請求項 1 6に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、 およ ぴ
(2)請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、 請求項 1 6に記載のポリヌクレオチドを検出する工程
.請求項 1 6に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項 1または請求項 2に記 載のポリヌ レオチドの測定用キット。
.請求項 3に記載のタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子の発現 を指標に、 該タンパク質を発現する細胞を検出または分離する方法。
. 細胞がリゥマチ滑膜細胞である、 請求項 1 9に記載の方法。
. 細胞が未分化間葉系細胞である、 請求項 1 9に記載の方法。
. 請求項 8に記載の抗体を含む、請求項 3に記載のタンパク質を発現する細胞 の検出または分離用試薬。
. 次の工程を含む、慢性関節リゥマチの検出方法であって、慢性関節リゥマチ のマーカーが、請求項 1に記載のポリヌクレオチド、請求項 3に記載のタンパ ク質、請求項 3に記載のペプチド、請求項 3に記載のタンパク質に結合する抗 体、および請求項 3に記載のぺプチドに結合する抗体からなる群から選択され た少なくともひとつのマーカーである方法。
i) 被検者の生体試料中に存在する慢性関節リゥマチのマーカーを検出する 工程、 および
ii) 工程 i)の検出結果を、 慢性関節リウマチと関連付ける工程
. 生体試料が被検者の血液であり、慢性関節リゥマチのマーカーが請求項 3に 記載のタンパク質に結合する抗体、および Zまたは請求項 3に記載のペプチド に結合する抗体である請求項 2 3に記載の方法。
. 生体試料が被検者の滑膜組織または滑膜細胞であり、慢性関節リウマチのマ 一力一が請求項 1に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項 3に記載 のタンパク質である請求項 2 3に記載の方法。
. 次の工程を含む、被験化合物の請求項 3に記載のタンパク質またはぺプチド と結合する活性の検出方法。
a )被験化合物を請求項 3に記載のタンパク質またはぺプチドと接触させるェ 程、 および
b ) 被験化合物と前記タンパク質またはべプチドとの結合を観察する工程. 次の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質またはペプチドと結合する活 性を有する化合物のスクリーニング方法。
a )請求項 2 6に記載の方法によって被験化合物の請求項 3に記載の蛋白質ま たはべプチドに対する結合活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記結合活性が高い被験化合物を選択する工程
. 次の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質とそのリガンドとの結合を阻 害する活性の検出方法。
a )被験化合物存在下で請求項 3に記載のタンパク質またはべプチドとそのリ ガンドとを接触させる工程、 および
b ) 前記タンパク質またはべプチドに結合するリガンド、 および/または被験 化合物を検出する工程
. リガンドがシノピオリンリガンド S1 - 5である請求項 2 8に記載の方法。. 次の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質とそのリガンドとの結合を阻 害する化合物のスクリーニング方法。
a ) 請求項 2 8に記載の方法によって、 被験化合物の請求項 3に記載のタンパ ク質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を検出する工程、 および b ) 対照と比較して前記阻害活性が高レ、被験化合物を選択する工程
. 次の工程を含む、被験化合物の請求項 3に記載のタンパク質によるシグナル 伝達を調節する活性を検出する方法。
a ) 前記タンパク質のリガンドの存在下または不存在下で、被験化合物と前記 タンパク質を接触させる工程、 および
b ) 前記タンパク質を介するシグナル伝達を検出する工程
. 次の工程を含む、請求項 3に記載のタンパク質によるシグナル伝達を調節す る活性を有する化合物のスクリーニング方法。
a ) 請求項 3 1に記載の方法によって、被験化合物の前記タンパク質によるシ グナル伝達を調節する活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記調節の活性が高い被験化合物を選択する工程
. 次の工程を含む、請求項 1に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性 の検出方法であって、
a )被験化合物の存在下で請求項 1に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞 を培養する工程、 および
b ) 前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
. 次の工程を含む、請求項 1に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する化合 物のスクリーニング方法。
a ) 請求項 3 3に記載の方法によって、被験化合物の請求項 1に記載のポリヌ クレオチドの発現を調節する活性を検出する工程、 および
b ) 対照と比較して前記活性に差を有する被験化合物を選択する工程
.請求項 2 7に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を 有効成分として含む、 シノビオリン刺激剤。
.請求項 3 0に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を 有効成分として含む、 シノピオリンとシノビ才リンリガンドとの結合阻害剤。
7 .請求項 3 0または請求項 3 2のスクリーユング方法によって得ることができ る化合物を有効成分として含む、 滑膜増生阻害剤。
8 . 請求項 1若しくは請求項 2に記載のポリヌクレオチド、請求項 3に記載の蛋 白質若しくはペプチド、および請求項 5に記載のベクターからなる群から選択 されるレ、ずれかの成分を有効成分として含有する医薬組成物。
9 .請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレオチドの発現が改変されている か、または該改変を誘導することができるトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物。 0 . 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドが外来的に導入されている、請 求項 3 9に記載のトランスジヱニック非ヒ ト脊椎動物。
1 . 慢十生関節リゥマチモデル動物である、請求項 4 0に記載のトランスジェニッ ク非ヒ ト脊椎動物。
2 .内因性に持つ請求項 1または請求項 2のいずれかに記載のポリヌクレオチド の発現が抑制されているトランスジエニック非ヒ ト脊椎動物。
3 . 他の遺伝子がノックインされている、請求項 4 2に記載のトランスジェエツ ク非ヒ ト脊椎動物。
4 .請求項 4 0または請求項 4 2に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物に 由来する細胞。
5 . 次の工程を含む、請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレオチドの内因 性プロモーターの活性を調節する活性の検出方法。
a )請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレオチドの内因性プロモーターの 制御下にレポーター遺伝子を発現することができる発現系に、被験化合物を接 触させる工程、 および
b ) レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
6 . 前記発現系が、請求項 4 3に記載のトランスジ-ニック非ヒト脊椎動物また はこの動物に由来する細胞である請求項 4 5に記載の方法。
7 . 次の工程を含む、請求項 1または請求項 2に記載のポリヌクレオチドの内因 性プロモーターの活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
a )請求項 4 5に記載の方法によって、被験化合物の請求項 1または請求項 2に 記載のポリヌクレオチドの内因性プロモーターの活性を調節する活性を測定 する工程、 および
b ) 対照と比較して、 前記活性に差がある被験化合物を選択する工程
8 . 請求項 3 4、 または請求項 4 7に記載のスクリーユング方法によって得るこ とができる化合物を有効成分として含む、請求項 1に記載のポリヌクレオチド の発現を調節するための医薬組成物。
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