明細書 Specification
新規膜貫通型レセプタ一様夕ンパク質およびその D N A 技術分野 New Transmembrane Receptor Uniform Protein and its DNA Technology
本発明は、 ヒト白血球由来の新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質またはその 塩およびそれをコードする D NAに関する。 背景技術 The present invention relates to a novel transmembrane receptor uniform protein derived from human leukocytes or a salt thereof and a DNA encoding the same. Background art
多くの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一タンパク質を通 じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ夕一タンパク質は生理活性物質 との結合を介して細胞内へのシグナル伝達を行い、 ま 膜貫通型の構造を有して いる。 膜貫通型レセプター様タンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に 存在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えば、 生理活性物質等の標 的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕一は生理活性物質との結合 を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグナルにより細胞の賦活ゃ抑制とい つた種々の反応が惹起される。 Many biologically active substances regulate the functions of living organisms through specific receptor proteins present in cell membranes. These receptor proteins transduce signals into cells through binding to physiologically active substances, and have a transmembrane structure. Transmembrane receptor-like proteins are present on the surface of functional cells in living cells and organs, and play a physiologically important role as targets for molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as bioactive substances. ing. The receptor transmits a signal into the cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ 夕一タンパク質との関係を明らかにすることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を 解明し、 それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供する こととなる。 To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various living organisms and their specific receptors, Yuichi Protein, elucidating the functions of cells and organs in various living organisms, It will provide a very important tool for closely related drug development.
例えば、 生体の種々の器官では、 多くの生理活性物質による調節のもとで生理 的な機能の調節が行なわれている。 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し 、 それぞれに対応するレセプタータンパク質を通してその生理機能の調節を行つ ている。 生体内には未知の生理活性物質も多く、 それらのレセプタータンパク質 の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知のレセ プ夕一タンパク質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かって いないものが多い。 For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many physiologically active substances. Physiologically active substances are present in various parts of the body and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins. There are many unknown biologically active substances in living organisms, and many of their receptor proteins have not been reported. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプタータンパク質 との関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、
レセプタ一タンパク質に対するァゴニスト、 アンタゴニストを効率よくスクリー ニングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプタータンパ ク質の遺伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要で あった。 Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in living organisms and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development. Also, In order to efficiently screen agonists and antagonists for receptor proteins and to develop pharmaceuticals, we will elucidate the functions of receptor protein genes expressed in vivo and express them in an appropriate expression system. It was necessary.
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D NAの配列を ランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D NAの断片配列が Expressed Se uence Tag (E S T) としてデータベースに登録 され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能 を推定することは困難である。 In recent years, as a means of analyzing genes expressed in vivo, studies on the random analysis of the cDNA sequence have been actively conducted. Registered in the database as a security tag (EST) and published. However, most ESTs contain only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
従来、 膜貫通型レセプ夕一タンパク質と生理活性物質 (すなわち、 リガンド) との結合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 (リガンド) と同様なシグナ ル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプ夕一の特異的なアン夕ゴニストまたは ァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従って、 このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開発の 標的ともなりうる膜貫通 レセプ夕一タンパク質を新規に見出し、 その遺伝子 ( 例えば c D NA) をクローニングすることは、 該タンパク質の特異的リガンドゃ 、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出す際に、 非常に重要な手段となる。 Conventionally, substances that inhibit the binding between a transmembrane receptor protein and a physiologically active substance (that is, a ligand), or substances that bind and cause signal transmission similar to that of a physiologically active substance (a ligand), have been used for these receptors. It has been used as a specific angios gonist or agonist as a drug that regulates biological functions. Therefore, it is important to find a new transmembrane receptor protein that is not only important in physiological expression in vivo but also a target for drug development, and to clone its gene (for example, cDNA). This is a very important means for finding specific ligands, agonists, and angelists of the protein.
しかし、 膜貫通型レセプタータンパク質はその全てが見出されているわけでは なく、 現時点でもなお、 未知の膜貫通型レセプタータンパク質、 また対応するリ ガンドが同定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており 、 新たな膜貫通型レセプ夕一タンパク質の探索および機能解明が切望されている 膜貫通型レセプ夕一タンパク質は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新た な生理活性物質 (リガンド) の探索、 また、 該レセプ夕一に対するァゴニストま たはアン夕ゴニストの探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見出されな くても、 該レセプ夕一の不活化実験 (ノックアウト動物) から該レセプ夕一の生 理作用を解析することにより、 該レセプ夕一に対するァゴニストまたはアンタゴ 二ストを作製することも可能である。 これら該レセプターに対するリガンド、 ァ ゴニストまたはアン夕ゴニストなどは、 該レセプ夕一の機能不全に関連する疾患
の予防/治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 However, not all transmembrane receptor proteins have been found, and at present, there are many unknown transmembrane receptor proteins and so-called orphan receptors, for which no corresponding ligand has been identified. There is a keen need to search for new transmembrane receptor protein and to elucidate its function. Transmembrane receptor protein is a new bioactive substance (ligand) that uses signal transduction as an index. It is useful for searching and searching for an agonist or an evening gonist for the reception. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, the physiological effect of the receptor is analyzed from the inactivation experiment (knockout animal) of the receptor, and an agonist or an antagonist against the receptor is analyzed. It is also possible to make a second strike. These ligands for the receptor, agonists, or antagonists, etc. may be used for diseases associated with dysfunction of the receptor. It can be expected to be used as a prophylactic / therapeutic agent and diagnostic agent.
さらにまた、 膜貫通型レセプ夕一タンパク質の遺伝子変異に基づく、 生体での 該レセプ夕一の機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合 も多い。 この場合には、 該レセプターに対するアンタゴニストやァゴニストの投 与だけでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 (またはある特定の臓器) への導入 や、 該レセプ夕ー遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に 応用することもできる。 この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失 や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプタ一の遺伝子は 、 該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防 治療薬や診断薬に応用するこ ともできる。 発明の開示 Furthermore, a decrease or increase in the function of the receptor in vivo due to a gene mutation of the transmembrane receptor protein often causes some disease. In this case, not only administration of an antagonist or agonist to the receptor, but also introduction of the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor gene, It can also be applied to treatment. In this case, the nucleotide sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the receptor gene is used to prevent or treat a disease associated with dysfunction of the receptor. And diagnostics. Disclosure of the invention
本発明は、 上記のように有用な新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質を提供す るものである。 すなわち、 新規膜貫通型レセプター様タンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチド (D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体) を含有するポリヌクレ ォチド (D NA、 R NAおよびそれらの誘導体) 、 該ポリヌクレオチドを含有す る組換えベクター、 該組換えベクターを保持する形質転換体、 該タンパク質また はその塩の製造法、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対す る抗体、 該タンパク質の発現量を変化させる化合物、 該タンパク質に対するリガ ンドの決定方法、 リガンドと該タンパク質との結合性を変化させる化合物 (アン 夕ゴニスト、 ァゴニスト) またはその塩のスクリーニング方法、 該スクリーニン グ用キット、 該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得ら れぅるリガンドと該夕ンパク質との結合性を変化させる化合物 (アンタゴニスト 、 ァゴニスト) またはその塩、 およびリガンドと該タンパク質との結合性を変化 させる化合物 (アン夕ゴニスト、 ァゴニスト) もしくは該タンパク質の発現量を 変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。 The present invention provides a novel transmembrane receptor uniform protein useful as described above. That is, a polynucleotide (DNA, R) containing a novel transmembrane receptor-like protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, and a polynucleotide (DNA, RNA and a derivative thereof) encoding the protein or a partial peptide thereof. NA and derivatives thereof), a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant carrying the recombinant vector, a method for producing the protein or a salt thereof, the protein or a partial peptide or a partial peptide thereof. Antibodies to salts, compounds that alter the expression level of the protein, methods for determining the ligand for the protein, methods for screening compounds that alter the binding of ligand to the protein (antagonists, agonists) or salts thereof The screening kit, the screening (Antagonists, agonists) or salts thereof that change the binding between the ligand and the protein obtained using the screening method or screening kit, and compounds that change the binding between the ligand and the protein ( (Antagonist, agonist) or a compound containing a compound capable of changing the expression level of the protein or a salt thereof.
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト末梢血白血球由来の新規な膜貫通 型レセプ夕一様タンパク質をコードする c D N Aを単離し、 その全塩基配列を解
析することに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ 、 第 1〜第 5膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNAにコ ードされるタンパク質が 5回膜貫通型のレセプター様タンパク質であることを確 認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本 発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors isolated a cDNA encoding a novel transmembrane receptor uniform protein derived from human peripheral blood leukocytes and analyzed its entire nucleotide sequence. Successfully analyzed. Then, when this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to fifth transmembrane regions were confirmed on a hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was a five-transmembrane receptor-like protein. Was confirmed. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
すなわち、 本発明は、 That is, the present invention
(1) 配列番号: 1もしくは配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする膜貫通型レセプ夕一 様タンパク質またはその塩; (1) a transmembrane receptor-like protein or a salt thereof, which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3;
(2) 配列番号: 1で表わされるアミノ酸配列を含有する上記 (1) 記載のタン パク質; (2) the protein according to (1), which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(3) 配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列を含有する上記 (1) 記載のタン パク質; (3) the protein according to (1), which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(4) 上記 (1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩; (4) a partial peptide of the protein according to (1) or a salt thereof;
(5) 上記 (1) 記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポ リヌクレオチド; (5) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein of (1) above;
(6) DNAである上記 (5) 記載のポリヌクレオチド; (6) the polynucleotide according to (5), which is a DNA;
(7) 配列番号: 2または配列番号: 4で表される塩基配列を含有する上記 (6 ) 記載の DNA; (7) The DNA according to the above (6), comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4;
(8) 上記 (5) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター; (8) a recombinant vector containing the polynucleotide according to (5);
(9) 上記 (8) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体; (9) a transformant transformed with the recombinant vector according to (8);
(10) 上記 (9) 記載の形質転換体を培養し、 上記 (1) 記載のタンパク質を 生成せしめることを特徴とする上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩の製造 法; (10) The method for producing the protein or the salt thereof according to the above (1), wherein the transformant according to the above (9) is cultured to produce the protein according to the above (1);
(11) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドま たはその塩に対する抗体; (11) an antibody against the protein according to (1) or the partial peptide or salt thereof according to (4);
(12) 上記 (1) 記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体で ある上記 (1 1) 記載の抗体; (12) the antibody according to (11), which is a neutralizing antibody that inactivates the signal transduction of the protein according to (1);
(13) 上記 (1 1) 記載の抗体を含有してなる診断薬;
(14) 上記 (11) 記載の抗体を含有してなる医薬; (13) a diagnostic agent comprising the antibody of (11) above; (14) a pharmaceutical comprising the antibody of (11) above;
(15) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (3) 記載の部分ペプチドま たはその塩を用いることにより得られうる上記 (1) 記載のタンパク質またはそ の塩に対するリガンド; (15) a ligand for the protein of (1) or a salt thereof obtainable by using the protein of (1) or the partial peptide of (3) or a salt thereof;
(16) 上記 (15) 記載のリガンド'を含有してなる医薬; (16) a medicament comprising the ligand 'according to (15);
(17) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドま たはその塩を用いることを特徴とする上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩 に対するリガンドの決定方法; (17) A method for determining a ligand for the protein or the salt thereof according to the above (1), wherein the protein according to the above (1) or the partial peptide or the salt thereof according to the above (4) is used;
(18) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドま たはその塩を用いることを特徴とする、 リガンドと上記 (1) 記載のタンパク質 またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法 (18) The use of the protein described in (1) or the partial peptide described in (4) or a salt thereof, wherein the ligand has an altered binding property to the protein described in (1) or a salt thereof. For screening compounds or salts thereof
(19) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドま たはその塩を含有することを特徴とする、 リガンドと上記 (1) 記載のタンパク 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用 キット; (19) The binding property between the ligand and the protein according to (1) or a salt thereof, which comprises the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof. A kit for screening for a compound or a salt thereof that alters
(20) 上記 (18) 記載のスクリーニング方法または上記 (19) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 (1) 記載のタンパク質 またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩; (20) A compound capable of changing the binding property between the ligand obtainable by using the screening method according to (18) or the screening kit according to (19) and the protein or salt thereof according to (1) or a compound thereof. salt;
(21) 上記 (18) 記載のスクリーニング方法または上記 (19) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 (1) 記載のタンパク質 またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬; (21) A compound or a compound thereof that alters the binding property between the ligand obtainable using the screening method according to (18) or the screening kit according to (19) and the protein or salt thereof according to (1). A medicament comprising a salt;
(22) 上記 (5) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下で 八イブリダィズするポリヌクレオチド; (22) a polynucleotide that hybridizes under high stringent conditions with the polynucleotide of (5);
(23) 上記 (5) 記載のポリヌクレオチドと相補的または実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド; (23) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide of (5) or a part thereof;
(24) 上記 (23) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする上記 ( 1) 記載のタンパク質の mRNAの定量方法; (24) A method for quantifying the mRNA of the protein according to (1), which comprises using the polynucleotide according to (23);
(25) 上記 (11) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 (1) 記載の夕
ンパク質の定量方法; (25) The antibody according to (1), wherein the antibody according to (11) is used. Protein quantification method;
(26) 上記 (24) または上記 (25) 記載の定量方法を用いることを特徴と する上記 (1) 記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法; (26) A method for diagnosing a disease associated with the function of the protein according to (1), characterized by using the quantification method according to (24) or (25);
(27) 上記 (24) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 (1) 記載 のタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法; (27) A method for screening a compound or a salt thereof, which alters the expression level of the protein according to (1), wherein the method comprises using the quantification method according to (24);
(28) 上記 (25) 記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における 上記 (1) 記載のタンパク質量を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法; (28) A method for screening a compound or a salt thereof, which alters the amount of the protein described in (1) above in a cell membrane, using the quantification method described in (25) above;
(29) 上記 (27) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 (1) 記載のタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩; (29) A compound capable of changing the expression level of the protein of (1) or a salt thereof, which can be obtained by using the screening method of (27);
(30) 上記 (28) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜にお ける上記 (1) 記載のタンパク質量を変化させる化合物またはその塩 (30) A compound or a salt thereof that alters the amount of the protein according to (1) above in a cell membrane obtainable by using the screening method according to (28).
(31) 上記 (29) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬 (31) A pharmaceutical comprising the compound or salt thereof according to (29) above
(32) 上記 (30) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬 (32) A medicament comprising the compound according to (30) or a salt thereof.
(33) 感染症、 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 心疾患、 呼吸器系疾患 、 消化器系疾患または免疫系疾患の予防 ·治療剤である上記 (21) 、 (31) または (32) 記載の医薬; (33) The above (21), (31) or (31) which is a preventive or therapeutic agent for infectious diseases, central diseases, endocrine diseases, metabolic diseases, cancer, heart diseases, respiratory diseases, digestive diseases or immune system diseases. 32) the medicament described above;
(34) 哺乳動物に対して、 上記 (20) 、 (29) または (30) 記載の化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする感染症、 中枢疾患、 内分泌 疾患、 代謝疾患、 癌、 心疾患、 呼吸器系疾患、 消化器系疾患または免疫系疾患の 予防 ·治療方法; (34) an infectious disease, a central disease, an endocrine disease, or a metabolic disease, which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (20), (29) or (30) or a salt thereof. Prophylaxis and treatment of cancer, heart disease, respiratory disease, digestive disease or immune system disease;
(35) 感染症、 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 心疾患、 呼吸器系疾患 、 消化器系疾患または免疫系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 (20) 、 (29) または (30) 記載の化合物またはその塩の使用等に関する。 (35) The above (20), (29) for producing a preventive or therapeutic agent for infectious disease, central disease, endocrine disease, metabolic disease, cancer, heart disease, respiratory disease, digestive system disease or immune system disease. ) Or the use of the compound or a salt thereof according to (30).
さらには、 Moreover,
(36) タンパク質が、 ①配列番号: 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さら に好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番 号: 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個
程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) の アミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号: 1で表わされるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個 程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ れたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタン パク質である上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩; (36) The protein is: (1) one or two or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and further preferably several (1) 2) amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably 1 to 30) Amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids are added, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids; or 3 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably Is an amino acid sequence in which about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5) amino acids have been substituted with other amino acids, or amino acids combining them The protein or a salt thereof according to the above (1), which is a protein containing a sequence;
(37) タンパク質が、 ①配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さら に好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番 号: 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個 程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) の アミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個 程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ れたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタン パク質である上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩; (37) The protein is (1) one or two or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1) Amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, More preferably, an amino acid sequence to which several (1 to 5) amino acids have been added; ③ One or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 A protein containing an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid, or an amino acid sequence combining them; 1) described protein Other salts thereof;
(38) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上記 (4) 記載の部 分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする上記 (17) 記載のリガンドの決定方法; (38) The method for determining a ligand according to (17), wherein the protein or the salt thereof according to the above (1) or the partial peptide or the salt thereof according to the above (4) is brought into contact with a test compound;
(39) (i) 上記 (1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上記 (4) 記 載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と、 (ii) 上 記 (1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上記 (4) 記載の部分ペプチド もしくはその塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行 なうことを特徴とする上記 (18) 記載のスクリーニング方法; (39) (i) a case where the ligand described above is brought into contact with the protein described in (1) or a salt thereof or the partial peptide described in (4) or a salt thereof, and (ii) a method described in (1) above. The screening method according to (18), wherein the protein or its salt or the partial peptide or its salt according to (4) is compared with a ligand and a test compound;
(40) (i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載のタンパク質もしくはその塩 または上記 (4) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合と、 (ii ) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記載のタンパク質もしくはそ の塩または上記 (4) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの上記 (1) 記載のタンパク質もしくはその塩または上
記 (4) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較する ことを特徴とするリガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法; (40) (i) the case where the labeled ligand is brought into contact with the protein or a salt thereof described in the above (1) or the partial peptide or the salt thereof as described in the above (4); The labeled ligand described in (1) above, or a salt thereof, upon contact with the protein described in (1) or a salt thereof or the partial peptide described in (4) or a salt thereof. Screening of a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof described in (1) above, wherein the amount of binding to the partial peptide or the salt thereof described in (4) is measured and compared. Method;
(41) ( i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞 に接触させた場合と、 (ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記 載のタンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの 該細胞に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 (1 ) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法; (41) (i) the case where the labeled ligand is brought into contact with the cell containing the protein described in (1) above; and (ii) the case where the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the cell containing the protein described in (1) above. Measuring the amount of binding of the labeled ligand to the cell when contacting with the compound, and comparing the ligand with the protein or the salt thereof according to the above (1) or a salt thereof. Screening method;
(42) (i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞 の膜画分に接触させた場合と、 (ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標 識したリガンドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするリガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法; (42) (i) when the labeled ligand is brought into contact with the membrane fraction of the cell containing the protein described in (1) above, and (ii) when the labeled ligand and the test compound are converted into the protein described in (1) above. The amount of binding of the labeled ligand to the membrane fraction of the cell when brought into contact with the membrane fraction of the cell containing the ligand, and comparing the ligand with the protein or the protein according to (1) above, A method of screening for a compound that changes the binding property to a salt or a salt thereof;
(43) (i) 標識したリガンドを上記 (9) 記載の形質転換体を培養すること によって該形質転換体の細胞膜に発現した膜貫通型レセプ夕一様タンパク質に接 触させた場合と、 (ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (9) 記載の 形質転換体を培養することによつて該形質転換体の細胞膜に発現した膜貫通型レ セプ夕一様タンパク質に接触させた場合における、 標識したリガンドの該膜貫通 型レセプ夕一様タンパク質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング方法; (43) (i) When the labeled ligand is brought into contact with the transmembrane receptor expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to (9) above, ii) When the labeled ligand and test compound are brought into contact with the transmembrane receptor expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to (9) above, The amount of binding of the labeled ligand to the transmembrane receptor protein is measured and compared, and the compound which changes the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof according to (1) above or A method for screening the salt;
(44) (i) 上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩を活性化する化合物を 上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 (ii) 上記 ( 1 ) 記載のタンパク質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、 膜貫通型レ セプタ一様タンパク質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法; (44) (i) a case where a compound that activates the protein according to (1) or a salt thereof is brought into contact with cells containing the protein according to (1); and (ii) a protein according to (1) above. Alternatively, when a compound that activates a salt thereof and a test compound are brought into contact with a cell containing the protein described in (1) above, the cell stimulating activities via a uniform transmembrane receptor protein are measured and compared. Alters the binding between the ligand described in (1) above and the protein described in (1) or a salt thereof. A method for screening a compound or a salt thereof;
(45) 上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩を活性化する化合物を上記 ( 9 ) 記載の形質転換体を培養することによつて該形質転換体の細胞膜に発現した 膜貫通型レセプ夕一様タンパク質に接触させた場合と、 上記 (1) 記載のタンパ ク質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 (9) 記載の形質 転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した膜貫通型レセプ 夕一様タンパク質に接触させた場合における、 膜貫通型レセプ夕一様タンパク質 を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 (1 ) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法; (45) A transmembrane receptor expressed in the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to (9) with a compound that activates the protein or salt thereof according to (1). When the transformant described in (9) above is cultured with the compound described in (1) above or a compound that activates the protein described in (1) or a salt thereof and a test compound, the cell membrane of the transformant is cultured. (1) measuring and comparing the cell stimulating activity mediated by the transmembrane receptor in contact with the transmembrane receptor expressed in A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property to a protein or a salt thereof;
(46) 上記 (39) 〜 (45) 記載のスクリーニング方法で得られうるリガン ドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩; (46) A compound or a salt thereof that alters the binding between the ligand obtainable by the screening method according to (39) to (45) and the protein or salt thereof according to (1);
(47) 上記 (39) 〜上記 (45) 記載のスクリーニング方法で得られうるリ ガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩を含有することを特徴とする医薬; (47) A compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand obtainable by the screening method according to (39) to (45) and the protein or salt thereof according to (1). Characteristic pharmaceuticals;
(48) 上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞を含有することを特徴とす る上記 (19) 記載のスタ 一二ング用キット; (48) The staging kit according to the above (19), which comprises a cell containing the protein according to the above (1);
(49) 上記 (1) 記載のタンパク質を含有する細胞の膜画分を含有することを 特徴とする上記 (19) 記載のスクリーニング用キッ卜; (49) The screening kit according to (19), which comprises a membrane fraction of a cell containing the protein according to (1);
(50) 上記 (9) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細 胞膜に発現した膜貫通型レセプター様タンパク質を含有することを特徴とする上 記 (19) 記載のスクリーニング用キット; (50) The screening according to the above (19), which comprises a transmembrane receptor-like protein expressed in a cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to the above (9). Kit;
(51) 上記 (48) 〜 (50) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られ うる、 リガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩; (51) A compound or a salt thereof, which can be obtained by using the screening kit according to any of (48) to (50), which changes the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1);
(52) 上記 (48) 〜 (50) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られ うる、 リガンドと上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬;
(53) 上記 (1 1) 記載の抗体と、 上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させることを特徴とする上記 ( 1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定 (54) 上記 (11) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 (1) 記載 のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 (1) 記載のタンパク質もしくは 上記 (4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする 被検液中の上記 (1) 記載のタンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチド またはその塩の定量法;および (52) Contains a compound or a salt thereof, which can be obtained by using the screening kit according to any one of (48) to (50), which changes the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1). A medicament characterized in that: (53) The protein according to (1) or the above (1), wherein the antibody according to (11) is contacted with the protein according to (1) or the partial peptide according to (4) or a salt thereof. (4) Determination of the partial peptide or the salt thereof described in (4) (54) The antibody of (11) described above, a test solution and a labeled protein of (1) or a partial peptide of (4) or a labeled thereof. A test solution characterized by measuring the ratio of the labeled protein of the above (1) or the partial peptide of the above (4) or a salt thereof bound to the antibody in a competitive reaction with a salt. Method for quantifying the protein according to the above (1) or the partial peptide according to the above (4) or a salt thereof; and
(55) 被検液と担体上に不溶化した上記 (11) 記載の抗体および標識化され た上記 (11) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担 体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 (1) 記載の夕 ンパク質もしくは上記 (4) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法等を提供 する。 図面の簡単な説明 (55) After reacting the test solution with the antibody of (11) insolubilized on the carrier and the labeled antibody of (11) simultaneously or continuously, the labeling agent on the insolubilized carrier is reacted. And a method for quantifying the protein described in (1) above, the partial peptide described in (4) above, or a salt thereof in a test solution, wherein the activity of the protein is measured. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は pTB 2184の疎水性プロット図である。 FIG. 1 is a hydrophobicity plot of pTB 2184.
図 2は pTB 2185の疎水性プロット図である。 FIG. 2 is a hydrophobicity plot of pTB 2185.
図 3は一文字表記による pTB 2184のアミノ酸配列を示す図である。 FIG. 3 is a diagram showing the amino acid sequence of pTB 2184 in one-letter code.
図 4は一文字表記による pTB 2185のアミノ酸配列を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 FIG. 4 is a diagram showing the amino acid sequence of pTB 2185 in one-letter code. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明の膜貫通型レセプター様タンパク質 (以下、 本発明のレセプ夕一タンパ ク質と略記する場合がある) は、 配列番号: 1もしくは配列番号: 3で表わされ るアミノ酸配列 (図 3, 図 4) と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するレセプ夕一様タンパク質である。 The transmembrane receptor-like protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 (FIG. 3, This receptor protein has the same or substantially the same amino acid sequence as in Fig. 4).
本発明のレセプ夕一タンパク質は、 例えば、 ヒ卜やその他の哺乳動物 (例えば 、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど) のあ
らゆる細胞 (例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 j3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維 芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂 細胞、 免疫細胞 (例、 マクロファージ、 T細胞 、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球 ) 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝 細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など) や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床 下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質) 、 脊髄、 下垂体、 胃、 腌臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄 、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 (例、 大腸、 小腸) 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓 、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関 節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク質であ つてもよい。 The receptor protein of the present invention can be used, for example, in humans and other mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, porpies, pigs, pigs, higgies, puppies, monkeys, etc.). All cells (eg spleen cells, nerve cells, glial cells, knee j3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells , Immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells , Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells), blood cells, or any tissue in which these cells are present, Brain, various parts of the brain (e.g., olfactory bulb, squamous nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, capsular Shell, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra, spinal cord, pituitary, stomach, kidney, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, colon, Small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joints, skeletal muscle, etc. Alternatively, it may be a synthetic protein.
配列番号: 1または配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号: 1または配列番号: 3で表わされる アミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最 も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列など力挙げられる。 本発明の配列番号: 1または配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号: 1ま たは配列番号: 3表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し 、 配列番号: 1または配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の. 活性を有するタンパク質などが好ましい。 Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include, for example, about 50% or more, preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence having a homology of about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. Such as power. Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 of the present invention include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 A protein having substantially the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is preferable.
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 (例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5 ~ 2倍) であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク
質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, and more preferably about 0.5 to 20 times. 2 times), but the degree of activity and protein Quantitative factors such as the molecular weight of the quality may be different.
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法ゃスク リーニング方法に従って測定することができる。 The measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction action can be performed according to a known method. For example, the activity can be measured according to a ligand determination method リ ガ ン ド screening method described later.
また、 本発明のレセプタータンパク質としては、 ①配列番号: 1または配列番 号: 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜3 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号: 1または配列番号: 3で表わ されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が付 加したアミノ酸配列、 ③配列番号: 1または配列番号: 3で表わされるアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸が他のアミノ酸で 置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有す るタンパク質なども用いられる。 The receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 1); An amino acid sequence in which about 0, more preferably several (1 to 5) amino acids have been deleted; (2) 1 or 2 or more (preferably) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Is an amino acid sequence having about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids; ③ SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: : 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence represented by 3 An amino acid sequence substituted with another amino acid, or ④ Such as protein you containing the amino acid sequence which is a combination of these is also used.
本発明のレセプ夕一タンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左端が N末 端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 本発明のレセプ 夕一タンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 (一 C O O H) 、 カルポキシレート (― C O O— ) 、 アミド (一 C〇N H 2 ) またはエステル (一 C O O R ) の何れ であってもよい。 According to the convention of peptide labeling, the receptor protein of the present invention has an N-terminal (an amino terminal) at the left end and a C-terminal (a lipoxyl terminal) at the right end. The C-terminal of the receptor protein of the present invention may be any of a hydroxyl group (one COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (one C〇NH 2 ) or an ester (one COOR). .
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロべ 'ンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α 一ナフチルなどの ( 6 _ 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル— C ! _ 2アルキル基などの C 7一 i 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用 されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。 Here, as R in the ester, e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe 'pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, (6 _ 1 2 Ariru group such as α one naphthyl, for example, benzyl, full Eniru alkyl or α- naphthylmethyl etc. α- naphthyl such as phenethyl - C 7 one i 4, such as C _ 2 alkyl group! In addition to the aralkyl group, a bivaloyloxymethyl group commonly used as an ester for oral use is used.
本発明のレセプ夕一タンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 (または力ルポ キシレート) を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化さ
れているものも本発明のレセプタータンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した 末端のエステルなどが用いられる。 When the receptor protein of the present invention has a lipoxyl group (or lipoxylate) other than the C-terminus, the carboxyl group is amidated or esterified. Such proteins are also included in the receptor protein of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned terminal ester and the like are used.
さらに、 本発明のレセプタータンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、 ホルミル基、 ァセチルな どの C 2_6アルカノィル基などの 6ァシル基など) で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したもの 、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 一 OH、 一 S H、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など) が適当な保護基 (例えば、 ホ ルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アルカノィル基などの ァシル基など) で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合 タンパク質なども含まれる。 Furthermore, the receptor protein of the present invention is a protein as described above, with Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. 6 Ashiru groups such as any C 2 _ 6 Arukanoiru group of Asechiru) Protected, N-terminally cleaved in vivo, and daryumin group formed by pidal dimamine oxidation, Substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, OH, SH, amino group, I imidazole group, indole group, etc. Guanijino group) suitable protecting group (e.g., ho mill group, C 2 such Asechiru - those protected by such Ashiru group such as 6 Arukanoiru group), or a sugar It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins with linked chains.
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号: 1で表 わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一様タンパク質、 または配列番号: 3 で表わされるァミノ酸配列を含有するレセプ夕一様夕ンパク質などが用いられる 本発明のレセプタ一タンパク質の部分ペプチド (以下、 部分ペプチドと略記す る場合がある) としては、 上記した本発明のレセプ夕一タンパク質の部分べプチ ドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一夕ンパク 質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 実質的に同一の活性 ( 例、 リガンド結合活性など) を有するものなどが用いられる。 Specific examples of the receptor protein of the present invention include, for example, a receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Examples of the partial peptide of the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated to partial peptide) in which the same protein is used include the above-mentioned partial peptides of the receptor protein of the present invention. For example, the receptor protein molecule of the present invention is a site that is exposed outside the cell membrane and has substantially the same activity (eg, ligand binding activity). Etc.) are used.
具体的には、 配列番号: 1または配列番号: 3で表わされるアミノ酸配列を有 するレセプ夕一タンパク質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析におい て細胞外領域 (親水性 (Hydrophil ic) 部位) であると分析された部分を含むぺ プチドである。 また、 疎水性 (Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様 に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複 数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでもよい。 Specifically, as a partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis is used. Is a peptide containing a part analyzed to be Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 上記した本発明のレセプタータンパ ク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列を示す。 The number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention. Are preferred. A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably Represents an amino acid sequence having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。 Here, “substantially the same activity” has the same meaning as described above. The “substantially equivalent activity” can be measured in the same manner as described above.
また、 本発明の部分ペプチドは、 ①上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 ( 好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のアミノ酸 が欠失し、 ②上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜2 0個程 度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1〜5個) ) のァ ミノ酸が付加し、 または③上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは 、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度) のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 (- C O O H) 、 力ルポキシレ一卜 (- C O O -) 、 ァ ミド (― C O NH 2) またはエステル (—C O O R) であってもよい。 また、 本 発明の部分ペプチドが C末端以外に力ルポキシル基 (またはカルポキシレート) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているもの も本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記 した C末端のエステルなどが用いられる。 Further, the partial peptide of the present invention has the following features: 1) deletion of one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence; (2) One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the above amino acid sequence. Or ③ one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the above amino acid sequence are replaced with other amino acids It may be. In the partial peptide of the present invention, the C-terminus force Rupokishiru group (- COOH), the force Rupokishire one Bok (- COO -) - may be (CO NH 2) or an ester (-COOR), § bromide. When the partial peptide of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the partial peptide of the present invention includes amidation or esterification of the lipoxyl group. . As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明のレセプ夕一タンパク質 と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子 内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。 Further, similar to the above-mentioned receptor protein of the present invention, the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and the N-terminal side of which is cleaved in vivo. The resulting G 1 n is pyroglutamine-oxidized, the one in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, or the compound peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound. included.
本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸また は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸) との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚
酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸) との塩などが用いられ る。 Examples of the salt of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid Acids, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、 上記したヒトやその他の哺乳 動物の細胞または組織から公知のレセプ夕一タンパク質の精製方法によって製造 することもできるし、 後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードする D NA'を含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトやその他の 哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 得ら れた抽出液を逆相クロマトグラフィー、 ィォン交換クロマトグラフィーなどのク 口マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 The receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the aforementioned human or other mammalian cells or tissues by a known method for purifying a receptor protein, or can encode the receptor protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA ′. In addition, when the protein is produced from human or other mammalian tissues or cells, it can be produced according to the protein synthesis method described later or according to the method. The resulting extract can be purified and isolated by a combination of reverse chromatography, ion exchange chromatography, and other similar chromatographies.
本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または そのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ る。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹 脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジ ルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 脂、 4一 (2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フエノキシ樹 脂、 4 - ( 2 ' , 4, ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル) フエノキ シ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖 官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知 の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質 を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフ イド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' — (3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる。
これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 (例えば、 HO B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性化を行なった後に樹脂に添加することができる。 For the synthesis of the receptor protein of the present invention, its partial peptide, its salt or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Such resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4' dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4, dimethoxyphenyl) Rumoc aminoethyl) phenoxy resin. Using such a resin, amino acids whose hamino group and side chain functional group are appropriately protected are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof. For the condensation of the protected amino acids described above, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Examples of the carpimides include DCC, N, N'-diisopropyl carpimide, N-ethyl N '-(3-dimethylaminoprolyl) carpimide. For these activations, the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt) or pre-protected as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. The amino acid can be added to the resin after activation.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド, N, N—ジメチルァセトアミド, N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン, クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン, ジォキサン, テトラヒドロフランなどのェ一テ ル類、 ァセトニトリル, プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル, 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することができる。 The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylvinylidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol. , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. Used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。 Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 Z, Br—Z, Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステ ル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口
ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 夕一シャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。 The lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, Benzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, Yukari Sharybutoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また 、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル 基、 t-ブチル基などである。 The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for the esterification, for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z l、 C 12- Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 夕ーシャリーブチルなどが用いられる ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。 The protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine, for example, B zl, C 1 2 - Bz l, as 2-nitrobenzyl, B r- Z, protecting group of the imidazole of histidine such as evening over tert-butyl is used, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2 , 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N ーヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。 Examples of activated raw oxypoxyl groups include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, esters with N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t)]. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
保護基の除去 (脱離) 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0° (:〜 40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、
フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1, 2—エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2, 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され 、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2—エタンジチオール、 1, 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。 Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Is also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° (: 4040 ° C.) In the acid treatment, for example, anisol, It is effective to add a force-thione scavenger such as phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, and the like. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-1 In addition to deprotection by acid treatment in the presence of butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。 The protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポキシ末 端アミノ酸の Q!—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド (タンパク質) 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し 、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製 手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ ド体を得ることができる。 As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, first, after amidating and protecting the Q! -Lipoxyl group of the lipoxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired amino acid. After extending the length of the peptide chain, a protein in which only the protecting group for the N-terminal amino group of the peptide chain was removed and a protein in which only the protecting group for the C-terminal hepoxyl group were removed were prepared. The condensation is carried out in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の a— 力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで きる。 In order to obtain an ester of a protein, for example, after condensing the carboxy-terminal amino acid a-hydroxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein can be obtained in the same manner as the protein amide. You can get your body.
本発明のレセプ夕一タンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のぺプチ ドの合成法に従つて、 あるいは本発明のレセプ夕一夕ンパク質を適当なぺプチダ —ゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチドの合成法としては 、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明
のレセプ夕一タンパク質を構成し得る部分ペプチドもしく アミノ酸と残余部分 とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的 のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。 The partial peptide of the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the receptor protein of the present invention with an appropriate peptide. can do. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the present invention The target peptide can be produced by condensing a partial peptide or an amino acid that can constitute the protein of the present invention with the remaining portion, and removing the protecting group when the product has a protecting group. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following ① to ⑤.
ΦΜ. Bodanszkyおよび Μ, A. Ondet t i, ペプチド シンセシス (Pept ide Synth es is) , Interscience Publ ishers, New York (1966年) ΦΜ. Bodanszky and Μ, A. Ondet ti, Peptide Syntheses is, Interscience Publ ishers, New York (1966)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド(The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年) ② Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株) (1975年) (3) Nobuo Izumiya et al. Basics and experiments on peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 (1977年) 治 Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory for Biochemical Experiments 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成 広川書店 治 Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 After the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and the like. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記 した本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする塩基配列 (D NAまたは R NA 、 好ましくは D NA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該 ポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NA 、 mR NA等の R NAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本 鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 二本鎖 R NAまたは D NA: R NAのハイブリッド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 (すなわち、 コード鎖) であっても、 アン チセンス鎖 (すなわち、 非コード鎖) であってもよい。 As the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention, any polynucleotide may be used as long as it contains the nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. You may. The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA. If single stranded, it may be the sense strand (ie, the coding strand) or the antisense strand (ie, the non-coding strand).
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例え ば、 公知の実験医学増刊 「新 P C Rとその応用」 15 (7)、 1997記載の方法または それに準じた方法により、 本発明のレセプタータンパク質の mRNAを定量する ことができる。
本発明のレセプタータンパク質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来の cDNA、 上記した細胞 •組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラリ 一に使用するベクターは、 バクテリオファ一ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファ一 ジミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より t o t a 1 R NAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase P olymerase Chain Reaction (以下、 RT— P CR法と略称する) によって増幅す ることもできる。 Using the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention, for example, the known experimental medicine extra edition “New PCR and its Applications” 15 (7), the method described in 1997, or a method analogous thereto, is used to obtain the receptor protein of the present invention. MRNA can be quantified. The DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, the DNA can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of tota1 RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
具体的には、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコ一ドする DNAとしては、 例 えば、 (1) 配列番号: 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 (2) 配列 番号: 2で表わされる塩基配列を有する D N Aとハイストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする DNAを含有し、 配列番号: 1で表されるアミノ酸配列を 含有するレセプ夕一様タンパク質と実質的に同質の活性 (例、 リガンド結合活性 、 シグナル情報伝達作用など) を有するタンパク質をコードする DNA、 (3) 配列番号: 4で表わされる塩基配列を含有する DNA、 (4) 配列番号: 4で表 わされる塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする DNAを含有し、 配列番号: 3で表されるアミノ酸配列を含有するレセ プタ一様タンパク質と実質的に同質の活性 (例、 リガンド結合活性、 シグナル情 報伝達作用など) を有するタンパク質をコードする D N Aであれば何れのもので もよい。 Specifically, the DNA encoding the receptor protein of the present invention includes, for example, (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (2) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Activity that is substantially the same as the receptor homologous protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the base sequence to be expressed (eg, ligand) DNA encoding a protein having binding activity, signal transduction action, etc.), (3) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, (4) having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 An activity substantially the same as that of a receptor uniform protein containing DNA that hybridizes with DNA under high stringent conditions and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (eg, Ligand binding activity, may be of any if D N A that encodes a protein having a signal information transduction activity, etc.).
配列番号: 2または配列番号: 4で表わされる塩基配列を含有する DNAとハ イストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配 列番号: 2または配列番号: 4で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましく は約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95%以上 の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 And a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more.
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al ., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこ とができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜 な条件に従って行なうことができる。 Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When using a commercially-available library, specify it in the attached instruction manual. It can be performed according to the method described above. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
該ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °C の場合が最も好ましい。 The high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 100 ° C. The conditions at ~ 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
より具体的には、 配列番号: 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタ —様タンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号: 2で表わされる塩基配 列を含有する D NAなどが用いられ、 また、 配列番号: 3で表わされるアミノ酸 配列を含有するレセプ夕一様タンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号 : 4で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 More specifically, as the DNA encoding the receptor-like protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used. As the DNA encoding the receptor homologous protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the like are used.
本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D N Aの塩基配列の一部、 または 該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記 の本発明の部分べプチドをコ一ドする D NAを包含するだけではなく、 R NAを も包含する意味で用いられる。 A part of the nucleotide sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a polynucleotide containing a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA is a partial peptide of the present invention described below. The term is used to mean not only that the DNA is included but also that it contains RNA.
本発明に従えば、 本発明のレセプ夕一タンパク質遺伝子の複製または発現を阻 害することのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化し た、 あるいは決定された本発明のレセプタータンパク質をコードする D NAの塩 基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド (核酸) は 、 本発明のレセプ夕一タンパク質遺伝子の R NAとハイブリダィズすることがで き、 該 R NAの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは本発明のレ セプ夕一タンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発明のレセプタータンパ ク質の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のレセプタータンパク質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明のレセプ夕 —夕ンパク質関連 RN Aと特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレ ォチドは、 生体内および生体外で本発明のレセプ夕一タンパク質遺伝子の発現を 調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特 定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド
、 塩基配列または核酸とペプチド (タンパク質) との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド (核酸) の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド (タンパク質) のアミノ酸を通常指している。 本発明のレセプ夕一タンパク質遺 伝子の 5, 端ヘアピンループ、 5, 端 6—ベースペア ' リピート、 5, 端非翻訳 領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コ ドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンル 一プは好ましい対象領域として選択しうるが、 本発明のレセプ夕一タンパク質遺 伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the receptor protein of the present invention is cloned or determined and encodes the receptor protein of the present invention. It can be designed and synthesized based on DNA base sequence information. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the receptor protein gene of the present invention and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the synthesis or function of the receptor gene of the present invention. The expression of the receptor protein of the present invention can be regulated and controlled through the interaction with protein-related RNA. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the receptor protein-related RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the receptor-protein-associated RNA of the present invention, are in vivo and in vivo. It is useful for regulating and controlling the expression of the receptor protein protein of the present invention outside, and also for treating or diagnosing diseases. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a particular sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes. nucleotide The "correspondence" between a nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the direction derived from the sequence of the nucleotide (nucleic acid) or its complement. . 5, end hairpin loop, 5, end 6—base pair 'repeat of the receptor Yuichi protein gene of the present invention, 5, end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, The 3′-end untranslated region, the 3′-end palindrome region, and the 3′-end hairpin map may be selected as preferred regions of interest, but any region within the receptor protein gene of the present invention may be selected. sell.
目的核酸と対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、 すなわち対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は 、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオ チド骨格を有するその他のポリマー (例えば、 市販のタンパク質核酸および合成 配列特異的な核酸ポリマー) または特殊な結合を含有するその他のポリマー (伹 し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基 の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する) などが挙げられる。 それ らは、 二本鎖 D N A、 一本鎖 D NA、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さらに D N A: R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド (ま たは非修飾オリゴヌクレオチド) 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例え ば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化された もの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオ チド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 (例えば、 メチルホスホネ一卜、 ホス ホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど) を持つもの、 電荷を 有する結合または硫黄含有結合 (例えば、 ホスホロチォエー卜、 ホスホロジチォ ェ一トなど) を持つもの、 例えばタンパク質 (ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ,ィ ンヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど) や糖 (例えば、 モノサッカライドなど) などの側鎖基を有しているもの、 インター力
レート化合物 (例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど) を持つもの、 キレート化合 物 (例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など) を含有す るもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの (例えば、 α ァノマー型の核酸など) であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオ チド j および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく 、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうし た修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンお よびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾された ヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく 、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンと力、 脂肪族基などで置換されていたりThe relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region, that is, the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target can be said to be “antisense”. Antisense polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-deoxy D-report, polynucleotides containing D-report, and other types of N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Polynucleotides or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (such as DNA or RNA (Including nucleotides having a configuration permitting the attachment of bases). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). Nucleotides), as well as those with known modifications, eg, those with labels known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides as analogs. Substituted, modified with an intramolecular nucleotide, for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (Eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), such as proteins (nucleases, nucleases, inhibitors) , Which has toxins, antibodies, signal peptides, poly-such as a single L one-lysine) or a sugar (e.g., side groups, such as monosaccharides, etc.), inter-force With chelating compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), alkylating agents, It may have a modified bond (for example, α-anomeric nucleic acid). Here, “nucleoside”, “nucleotide j” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with a halogen, a force, an aliphatic group, or the like.
、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。 Alternatively, it may be converted to a functional group such as ether or amine.
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド (核酸) は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 (R NA、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。 The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , P arm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Cro oke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993 な どに開示がある。 Many such modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Parm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. ed., Ant isense Research and Applicat ions, CRC Press, 1993.
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を
高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 (例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど) といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 (例えば、 コレステリルクロ口ホルメ —ト、 コール酸など) が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌ クレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。 The antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form. In this way, the addition forms include polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate backbone, and interaction with cell membranes. Hydrophobic substances such as lipids that increase or increase the uptake of nucleic acids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.). Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. . Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のレセプタータンパク質の生体内や生体外の 翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用で きる。 The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor protein of the present invention. . The nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
本発明の部分ペプチドをコードする D N Aとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム D NA、 ゲノム D N Aライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来 の c D NA、 上記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのい ずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する) によって増幅 することもできる。 The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. The DNA may be any of rally, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 ( 1 ) 配列番号: 2または配列番号: 4で表わされる塩基配列を含有する D NAの 部分塩基配列を有する D NA、 または (2 ) 配列番号: 2または配列番号: 4で 表わされる D NAとハイストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする D N A を有し、 配列番号: 1または配列番号: 3で表されるアミノ酸配列を含有するレ
セプ夕一様タンパク質と実質的に同質の活性 (例、 リガンド結合活性、 シグナル 情報伝達作用など) を有するタンパク質をコードする DNAの部分塩基配列を含 有する D N Aなどが用いられる。 Specifically, examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include: (1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Or (2) an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, which has DNA that hybridizes with DNA represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringent conditions. The sequence containing the sequence A DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal signal transduction action, etc.) as the Sepuform protein is used.
配列番号: 2または配列番号: 4で表わされる DNAとハイストリンジェント な条件でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号: 2または配列 番号: 4で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より 好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。 Examples of the DNA that hybridizes with the DNA represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably, about 70% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド (以下、 本発明のレセ プタータンパク質と略記する場合がある) を完全にコードする DNAのクロー二 ングの手段としては、 本発明のペプチドをコードする D N Aの塩基配列の部分塩 基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 ま たは適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明のレセプタータンパク質の一部 あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したも のとのハイブリダィゼーシヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼ —シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング (Molecular Cloning ) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記 載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用す る場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 Cloning of the DNA completely encoding the receptor protein of the present invention or its partial peptide (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) may be performed by cloning the base of the DNA encoding the peptide of the present invention. Amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the sequence, or a DNA incorporated into an appropriate vector is a DNA encoding a partial or entire region of the receptor protein of the present invention. Selection can be carried out by hybridization with fragments or those labeled with synthetic DNA. The hybridization-screening method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mu t anTM -s up e r Ex r e s s Km (宝酒造) 、 Mu t an™-K (宝酒造) 等を用いて、 ODA— LA PCR法、 Gapp e d du 1 e x法、 Kunk e 1法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる クローン化されたレセプタータンパク質をコードする DNAは目的によりその まま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5, 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG を有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合
成 DNAアダプタ一を用いて付加することもできる。 The DNA base sequence can be replaced by the ODA-LA PCR method using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -supper Exress Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), etc. Can be performed according to known methods such as the Gapped du 1 ex method and the Kunk e method, or a method analogous thereto.The DNA encoding the cloned receptor protein may be used as it is depending on the purpose, or may be digested with restriction enzymes if desired. Or can be used with a linker added. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation start codons and translation stop codons It can also be added using a DNA adapter.
本発明のレセプ夕一タンパク質の発現ベクターは、 例えば、 (ィ) 本発明のレ セプタータンパク質をコードする DNAを含有する DNA (例えば、 cDNA) から目的とする DNA断片を切り出し、 (口) 該 DNA断片を適当な発現べクタ —中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 The expression vector for the receptor protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA (for example, cDNA) containing DNA encoding the receptor protein of the present invention; It can be prepared by ligating the fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド (例、 pCR4、 pCR 2. 1、 pBR 322, pBR325、 pUC12、 pUC13) 、 枯草菌由来のプラス ミド (例、 pUB 110、 pTP 5、 pC 194) 、 酵母由来プラスミド (例、 pSH19、 p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイ ルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρ A1— 11、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA I /N e oなどが用いられる。 Examples of vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (Eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., ρA1-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, p cDNA I / Neo is used.
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRひプロモータ一、 SV40プロモータ一、 LTRプ ロモ—ター、 CMVプロモータ一、 HSV— TKプロモーターなどが挙げられる これらのうち、 CMVプロモータ一、 SRひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t rpプロモータ一、 l acプ 口モー夕一、 r e cAプロモーター、 APLプロモーター、 l ppプロモータ一 などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プ 口モーター、 p e n pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プ 口モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー夕一、 P1 0プロモー夕一などが好ましい。 The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as host, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc. are listed. Among them, CMV promoter, SR promoter, etc. It is preferable to use. When the host is Eshierihia genus bacterium, t rp promoter one, l ac flop port mode evening one, re cA promoter, AP L promoter, and l pp promoter of all, when the host is Bacillus, spol promoter , SP02 flop port motors, such as p en p promoter, if the host is a yeast, PH05 flop port motor, PGK promoter, GAP promoter Isseki one, etc. ADH promoter are preferred. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, and the like are preferable.
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一力一、 SV40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある) などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 (以下、 dh f r
と略称する場合がある) 遺伝子 〔メソトレキセート (MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 (以下、 Amp rと略称する場合がある) 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 (以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性) 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マ一カーとして 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプ夕一夕ン パク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA •シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場 合は、 一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿 主が酵母である場合は、 MFo! ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフ エロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明のレセプタータンパク質をコードする DN A を含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。 The expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Can be used. As a selection marker, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, dh fr And sometimes abbreviated) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r And G418 resistance). In particular, when the dh fr gene is used as a selection marker using CHO (dh fr-) cells, the target gene can be selected by using a thymidine-free medium. If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA • signal sequence, an OmpA • signal sequence, etc., and when the host is a Bacillus genus, an amylase • signal sequence, a subtilisin • signal sequence, etc. Signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. for yeast, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. for host animal cells. Available. Using the vector containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention thus constructed, a transformant can be produced.
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 曰 Hosts include, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells,
比虫、 動物細胞などが用いられる Worms, animal cells, etc. are used
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア .コリ (Escherichia col i ) K 12♦ DH1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー♦ォ ブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻, 160 (1968) 〕 , J Ml 03 〔ヌクイレック 'ァシッズ' リサ一 チ, (Nucleic Acids Research) , 9巻, 309 (1981)〕 , JA221 〔ジ ヤーナゾレ ·ォブ ·モレキュラー ·バイォロジ一 (Journal of Molecular Biology ) 〕 , 120巻, 517 (1978)〕 , HB 101 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキ ユラ— .バイオロジー, 41卷, 459 (1969) 〕 , C 600 〔ジエネティッ クス (Genetics) ,. 39巻, 440 (1954)〕 , DH 5 a CInoue, H. , Noj ima, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (1990) ) , DH10B 〔プロシ一ジングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 87巻, 4645— 4649 (199 0)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズプチルス (Bacillus subtilis ) M I 1 14 〔ジーン, 24巻, 255 (1983)〕 , 207 - 21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリー (Journal of Biochemistry) , 95巻, 87 (1 984)] などが用いられる。 Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 ♦ DH1 [Processings of the national academy] Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JMl 03 [Nuirec 'Acid's Risaichi, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA221 [Janazore Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Molecular Biology, Biology, 41, 459 (1969)], C 600 [Genetics, 39, 440 (1954)], DH5a CInoue, H., Nojima, H. and Okayama, H., Gene, 96, 23-28 (1990)), DH10B [PROCESSINGS 'OB · THE · NATIONAL ACADEMY · OB · SCIENCES · OB · THE · YOU Sue (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 87, 4645-4649 (1990)]. Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95] , 87 (1 984)].
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレピシェ (Sacclmromyces cere visiae) AH22, AH22R— , ΝΑ87 - 1 1 A, DKD— 5D、 20 B- 12、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ (Scliizosacclmromyces pombe) NCYC 1 913, NCYC 2036, ピキア 'パストリス (Picliia pastoris) などが 用いられる。 Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, A87-11 A, DKD—5D, 20B-12, and Schizosaccaromyces pombe (Scliizosacclmromyces pombe) NCYC1 913, NCYC 2036 , Pichia pastoris, etc. are used.
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ; S f細胞) 、 Tridioplusia ni© 中腸由来の MGl細胞、 Tridioplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestr a brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 カイコ由来株化細胞 (Bombyx mori N; BmN細 胞) などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL17 11) 、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ (In Vivo) , 13, 21 3-217, (1977)) などが用いられる。 Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from the larva of Spodoptera (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), Tridioplusia ni © MGl cell derived from the midgut, High Five ™ derived from the egg of Tridioplusia ni Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. Examples of the Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) Is used.
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) , 31 5巻, 592 (1 985)〕 。 As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve r o、 チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記) 、 dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズ八ムス夕一細胞 CHO (以下、 CHO (dh i r— ) 細胞と略記) 、 マウス L細胞, マウス At T— 20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL 細胞などが用いられる。 Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese Hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese muscular cells, and CHO cells (hereinafter CHO (dhir) —) Cells), mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル ·ァカデミ一 .ォブ ·サイェンジィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻, 21 1 0 (1 972)やジーン (Gene) , 1 7巻, 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド ·ジエネラ
ル ·ジエネティックス (Molecular & General Genetics) , 168巻, 111 ( 1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 For transformation of Escherichia sp., For example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. The method can be carried out according to the method described in 69, 2110 (1972) or Gene, 17: 107 (1982). To transform Bacillus species, for example, Molecular 'and Dienella Le Genetics (Molecular & General Genetics), Vol. 168, 111 (1979).
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモ口ジ一 (Me th ods in Enzymology) , 194巻, 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻, 1929 (1978) などに記載の方法に従つて行なうことができる。 In order to transform yeast, for example, Mesods in Enzymology, 194, 182–187 (1991), Processing of the National Academy The method can be carried out according to the method described in Prob. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, 1929 (1978).
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジ一 (Bi o/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことができ る。 Transformation of insect cells or insects can be carried out according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行) 、 ヴイロロジ一 (Virology ) , 52巻, 456 (1973 )に記載の方法に従って行なうことができる。 Transformation of animal cells is described, for example, in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). Can be performed according to the method described in
このようにして、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする DNAを含有す る発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。 Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention is obtained.
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。 When culturing a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein. , Nitrogen sources, inorganic substances and others. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like. Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 (Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン 'モレキュラー ·ジェネティックス (Journal of Experiments in Mo 1 ecu lar Genetics) , 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、 例えば、 3 _インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。 As a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experimen 'in', Molecular Genetics (Journal of Experiments in Mo 1 ecu lar Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. Here, if necessary, to make the promoter work efficiently For example, an agent such as 3-indolylacrylic acid can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。 When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一 (Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一ェ スエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻, 4505 (1980)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻, 5330 (1984) 〕 が挙 げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C 〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Processings of the National Academy." Proto. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)], "Procedings of the National Academy of Sciences of the USA." The pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8. Culture is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace's Insect Medium (Grace, T. C. C.,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962) ) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium used was 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス (Science) , 122巻, 501 (1952)〕 , DMEM培地 〔ヴイロロジー (Virology) , 8巻, 396 (1959)3 , RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン · メアイカル-アソシエーション (The Journal of the American Medical Associ at ion) 199巻, 519 (1967)〕 , 199培地 〔プロシージング ·ォブ' ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻, 1 (1950)〕 などが 用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30° (:〜 40°C で約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のレセ プ夕一タンパク質を生成せしめることができる。 When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959) 3, RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association at ion, 199, 519 (1967) And 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]. Preferably, the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° (: ~ 40 ° C) for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary. As described above, the receptor protein of the present invention can be produced inside the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
上記培養物から本発明のレセプタータンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。 The receptor protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
本発明のレセプタータンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して は、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁 し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞 を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得る 方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの夕ンパク 質変性剤や、 トリ卜ン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方 法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 When extracting the receptor protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and Z or freezing. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein by centrifugation or filtration is appropriately used. Evening as urea or hydrochloric guanidine in the buffers and protein denaturing agent may contain a surfactant such as tri Bokun X- 1 0 0 TM. When the receptor protein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプ夕一夕 ンパク質の精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。 Purification of the receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity mouth chromatography, reverse phase high-performance liquid mouth chromatography, etc. A method utilizing a difference in hydrophobicity, a method utilizing an isoelectric point difference such as an isoelectric focusing method, and the like are used.
このようにして得られるレセプタータンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩 で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または 他の塩に変換することができる。 When the receptor protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto. It can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
なお、 組換え体が産生するレセプタータンパク質を、 精製前または精製後に適 当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリ ペプチドを部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例え ば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドぺプチダ一ゼ、 プロテイン
キナ一ゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。 In addition, the receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. Protein-modifying enzymes include, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein Kinase, glycosidase and the like are used.
このようにして生成する本発明のレセプタ一タンパク質またはその塩の活性は 、 標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツ セィなどにより測定することができる。 · The activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof produced in this manner can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody. ·
本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体は、 本発明のレセプタ一夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその 塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れ であってもよい。 An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be a polyclonal antibody, as long as it can recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt. Any of monoclonal antibodies may be used.
本発明のレセプ夕一夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 (以下 、 本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある) に対する抗体は、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製 造法に従って製造することができる。 An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) may be obtained by using the receptor protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
〔モノクローナル抗体の作製〕 [Preparation of monoclonal antibody]
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製 (a) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
本発明のレセプタータンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が 可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイン卜アジュバントゃ不完全フロイン卜アジ ュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程 度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラット が好ましく用いられる。 The receptor protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier or a diluent. Upon administration, complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and mice and rats are preferably used.
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブリド一マを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプタータンパク質 等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することに より行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタ インの方法 〔ネイチヤー (Nature) , 2 5 6巻、 4 9 5頁 (1 9 7 5年) 〕 に従
い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ一 ル (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用い られる。 When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein or the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is performed according to known methods, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Can be implemented. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 SP2Z0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 (脾臓細胞) 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 : 1〜20 : 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。 Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%. By incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
モノクローナル抗体産生ハイプリド一マのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプ夕一タンパク質等の抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 (例、 マイクロプレート) にハイプリドーマ培養上清を添加し 、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 (細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる) または プロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 Various methods can be used to screen the monoclonal antibody-producing hybridoma. For example, hybridoma culture on a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier is used. The supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A labeled with a radioactive substance or an enzyme is added to the solid phase. A method for detecting bound monoclonal antibodies, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immune glopurin antibody or protein A has been adsorbed, adding a receptor protein or the like labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc. A method for detecting the bound monoclonal antibody is exemplified.
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従つて行なう ことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培地と しては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い 。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 (和光純薬工業 (株) ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 (SFM— 101、 日水製薬 (株) ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40° (:、 好ましくは約 37 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の 抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製 The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or a hybridoma culture medium Serum medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° (:, preferably, about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture is usually 5% carbon dioxide. The antibody titer of the culture supernatant of the hybridoma can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. (b) Purification of monoclonal antibody
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 (例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。 Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies. [Examples: salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the bond to obtain the antibody. Purification method].
〔ポリクローナル抗体の作製〕 (Preparation of polyclonal antibody)
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 (本発明のタンパク質等の抗原) とキ ャリァ一夕ンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクロ一ナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプ夕一タンパク質 等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造でき る。 The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. The antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the receptor protein of the present invention and separating and purifying the antibody.
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一タンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロプリン、 キ一ホール .リンぺット .へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プル させる方法が用いられる。 Regarding the complex of the immunizing antigen used for immunizing mammals and the carrier-protein, the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking with the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.For example, the weight ratio of peroxyserum albumin, pericyroglobulin, keyhole lysine, hemocyanin, etc. A method of pulling the hapten 1 at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイン卜アジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、
好ましくは血液から採取することができる。 In addition, various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier. For example, daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used. The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times. Polyclonal antibodies can be obtained from the blood, ascites, etc. of a mammal immunized by the above method. Preferably, it can be collected from blood.
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。 The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
本発明のレセプ夕一タンパク質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩 、 および本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAは、 (1 ) 本発明のレセプタータンパク質に対するリガンド (ァゴ二スト) の決定、 (2 ) 本発明のレセプタ一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防 および/または治療剤、 (3 ) 遺伝子診断剤、 (4 ) 本発明のレセプ夕一タンパ ク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法 、 ( 5 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化 させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤、 (6 ) 本発明の レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法、 (7 ) 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 (ァゴ二スト、 アンタゴニス 卜など) のスクリーニング方法、 (8 ) 本発明のレセプタータンパク質とリガン ドとの結合性を変化させる化合物 (ァゴニス卜、 アン夕ゴニス卜) を含有する各 種疾病の予防および/または治療剤、 (9 ) 本発明のレセプタ一タンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 (1 0 ) 細胞膜における本発明のレ セプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリ一 ニング方法、 (1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその 部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは 治療剤、 (1 2 ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩に対する抗体による中和、 (1 3 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質をコ —ドする D NAを有する非ヒト動物の作製などに用いることができる。 The receptor protein of the present invention or its salt, its partial peptide or its salt, and the DNA encoding the receptor protein of the present invention or its partial peptide are: (1) a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention; ), (2) a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, (3) a genetic diagnostic agent, (4) a receptor protein of the present invention or a portion thereof. (5) A method for screening a compound that changes the expression level of a peptide, (5) an agent for preventing and / or treating various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention; (7) a method for quantifying a ligand for the receptor protein of the present invention; Screening method for compounds that alter the affinity (eg, agonist, antagonist); (8) contains compounds that alter the binding between the receptor protein of the present invention and the ligand (agonist, antagonist) (9) quantification of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, (10) the receptor protein of the present invention in a cell membrane or a portion thereof A method for screening a compound that changes the amount of a peptide, (11) a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane, (12) Neutralization by an antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, (13) The receptions evening one protein of the invention co - can be used in such production of non-human animal having a sul D NA.
特に、 本発明の組換え型レセプタータンパク質の発現系を用いたレセプ夕一結 合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な本発明のレセプ タータンパク質に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 (例、 ァゴニスト 、 アンタゴニストなど) をスクリーニングすることができ、 該ァゴニス卜または
アンタゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。 本発明のレセプタータンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 (以下、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等と略記する場合がある) 、 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと 略記する場合がある) および本発明のレセプ夕一タンパク質等に対する抗体 (以 下、 本発明の抗体と略記する場合がある) の用途について、 以下に具体的に説明 する。 In particular, the use of the receptor binding assay system using the recombinant receptor protein expression system of the present invention alters the binding of a ligand to the receptor protein of the present invention, which is specific to humans and mammals. Compounds (eg, agonists, antagonists, etc.) can be screened, Antagonists can be used as preventive and therapeutic agents for various diseases. A receptor protein or a partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as a receptor protein of the present invention, etc.), a DNA encoding a receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, referred to as a peptide). The use of an antibody against the receptor protein of the present invention or the like (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) is specifically described below. .
( 1 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質に対するリガンド (ァゴ二スト) の決定 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドも しくはその塩は、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質またはその塩に対するリガンド (1) Determination of ligand (agonist) for receptor protein of the present invention The receptor protein of the present invention or a salt thereof, or a partial peptide or a salt thereof of the present invention is used for the receptor of the present invention. Ligand for protein or salt thereof
(ァゴ二スト) を探索し、 または決定するための試薬として有用である。 It is useful as a reagent for searching or determining (argonist).
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本 発明の部分べプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴と する本発明のレセプ夕一タンパク質に対するリガンドの決定方法を提供する。 試験化合物としては、 公知のリガンドの他に、 例えば、 ヒトまたはその他の哺 乳動物 (例えば、 マウス、 ラット、 プ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど) の組織抽出 物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清など を本発明のレセプタータンパク質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分 画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。 That is, the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound. provide. Examples of the test compound include, in addition to known ligands, for example, tissue extracts of humans or other mammals (eg, mice, rats, mice, rats, mice, etc.), cell culture supernatants, and the like. Used. For example, the tissue extract, cell culture supernatant, or the like is added to the receptor protein of the present invention, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, whereby a single ligand can be finally obtained.
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプタータンパク質も しくはその部分べプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプタ一 タンパク質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用 いることによって、 本発明のレセプ夕一タンパク質に結合して細胞刺激活性 (例 えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化 などを促進または抑制する活性) を有する化合物 (例えば、 ペプチド、 タンパク 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など) またはその塩を決定す る方法である。 Specifically, the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and By using the receptor binding assay system used, the receptor binding protein of the present invention can be bound to the cell stimulating activity (for example, production of intracellular cAMP, production of intracellular cGMP, This is a method for determining a compound (for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.) having a phosphorylation promoting or suppressing activity, or a salt thereof.
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプタ一タンパク質または その部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプ夕一夕
ンパク質または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性な どを測定することを特徴とする。 In the ligand determination method of the present invention, when the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the receptor It is characterized by measuring the binding amount of the test compound to the protein or the partial peptide, the cell stimulating activity, and the like.
より具体的には、 本発明は、 More specifically, the present invention provides
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩また は本発明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試 験化合物の該夕ンパク質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩 に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一タンパク質また はその塩に対するリガンドの決定方法、 (1) When the labeled test compound is brought into contact with the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof, the protein or the salt of the labeled test compound or the salt thereof is obtained. A method for determining a ligand for a receptor protein or a salt thereof according to the present invention, which comprises measuring a binding amount to a peptide or a salt thereof;
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞また は該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一タン パク質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 (2) When a labeled test compound is brought into contact with a cell containing the receptor protein of the present invention or a membrane fraction of the cell, the amount of the labeled test compound bound to the cell or the membrane fraction is measured. A method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof according to the present invention,
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NA を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した該レセプター タンパク質に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプ夕ータン パク質またはその塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ タータンパク質に対するリガンドの決定方法、 (3) When the labeled test compound is brought into contact with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention, the receptor of the labeled test compound is expressed. A method for determining a ligand for a receptor protein of the present invention, which comprises measuring the amount of binding to a protein or a salt thereof;
④試験化合物を、 本発明のレセプタ一タンパク質を含有する細胞に接触させた 場合における、 レセプタータンパク質を介した細胞刺激活性 (例えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進また は抑制する活性など) を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一タンパク 質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 および 細胞 Receptor protein-mediated cell stimulating activity (eg, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein) when a test compound is brought into contact with cells containing the receptor protein of the present invention. A method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention, which comprises measuring the activity of promoting or suppressing the phosphorylation of the protein.
⑤試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NAを含有す る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した該レセプ夕一タンパク 質に接触させた場合における、 レセプ夕一タンパク質を介する細胞刺激活性 (例 えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化 などを促進または抑制する活性など) を測定することを特徴とする本発明のレセ プ夕一夕ンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方法を提供する。 を When the test compound is brought into contact with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention, the receptor protein is Of the present invention characterized by measuring cell-mediated cell stimulating activity (eg, activity of promoting or suppressing intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein phosphorylation, etc.). Provided is a method for determining a ligand for protein or a salt thereof overnight.
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一夕ンパク
質に結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプ夕一タンパク質としては、 上記した本 発明のレセプ夕一タンパク質または本発明の部分べプチドを含有するものであれ ば何れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプター夕 ンパク質が適している。 In particular, conduct the tests of ① to ③ above, and confirm that the test compound is the receptor of the present invention. It is preferable to carry out the above-mentioned tests ① to 後 に after confirming the binding to the substance. First, the receptor protein used in the ligand determination method may be any protein as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Receptor proteins expressed in large amounts using are suitable.
本発明のレセプ夕一タンパク質を製造するには、 上記の発現方法が用いられる が、 該レセプ夕ータンパク質をコードする D NAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発 現することにより行なうことが好ましい。 目的とするタンパク質部分をコードす る D NA断片には、 通常、 c D NAが用いられるが、 必ずしもこれに制約される ものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用いてもよい。 本発明のレセ プ夕一タンパク質をコードする D NA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効 率よく発現させるためには、 該 D N A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルス に属する核多角体病ウィルス (nuclear polyhedrosis virus; N P V) のポリへ ドリンプロモ一夕一、 S V 4 0由来のプロモーター、 レ十ロウィルスのプロモ一 夕一、 メタ口チォネインプロモータ一、 ヒトヒ一卜ショックプロモーター、 サイ トメガロウィルスプロモーター、 S Rひプロモー夕一などの下流に組み込むのが 好ましい。 発現したレセプ夕一の量と質の検査は公知の方法で行うことができる 。 例えば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミ ストリー (J. Biol. Chem. ) , 2 6 7巻, 1 9 5 5 5〜 1 9 5 5 9頁, 1 9 9 2 年〕 に記載の方法に従って行うことができる。 To produce the receptor protein of the present invention, the above-described expression method is used. It is preferable that the DNA encoding the receptor protein is expressed in mammalian cells or insect cells. As the DNA fragment encoding the protein portion of interest, cDNA is usually used, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a baculovirus belonging to a baculovirus using an insect as a host. Virus (nuclear polyhedrosis virus; NPV) polyhedrosis promoter, SV40-derived promoter, rejuvenous virus promoter, metamouth thionine promoter, human human shock promoter, cytomegalovirus promoter It is preferable to incorporate it in the downstream such as SR Hipro Yuichi. Examination of the amount and quality of the expressed receptor can be performed by a known method. For example, the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 1955.55-19555, pp. 1 992 years].
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一タンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 公知の方 法に従って精製したレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩であってもよいし、 該レセプタータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜 画分を用いてもよい。 Therefore, in the ligand determination method of the present invention, the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof purified according to a known method. Or a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプタ一タンパク質を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。 When cells containing the receptor protein of the present invention are used in the ligand determination method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
本発明のレセプ夕一タンパク質を含有する細胞としては、 本発明のレセプ夕一
タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌 、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 Cells containing the receptor protein of the present invention include the receptor protein of the present invention. This refers to a host cell that has expressed a protein. Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 P 0 t t e r _ E 1 V e h j e m型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン (K i n e m a t i c a社製) による破砕、 超音波による破砕、 フレンチ プレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕など が挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの 遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 (5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 (通常、 約 1分〜 1 0分) 遠心し、 上清をさ らに高速 (1 5 0 0 0 r pm〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し 、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一タンパク 質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。 The cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after cell disruption. The cells can be crushed by crushing the cells with a P0 tter _E1 Vehjem homogenizer, crushing with a Warinda blender ゃ polytron (Kinematica), crushing by ultrasonic waves, pressurizing with a French press, etc. Crushing by ejecting cells from thin nozzles. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (typically about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (150 rpm The suspension is usually centrifuged at pm to 300 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
該レセプ夕ータンパク質を含有する細胞やその膜画分中のレセプタータンパク 質の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7 分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結 合活性 (比活性) が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるば かりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。 The amount of the receptor protein of the cells or during the membrane fraction containing the receptions evening over protein is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, is 1 0 5-1 0 7 molecules Is preferred. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a screening system with high sensitivity, but also enables the measurement of a large number of samples in the same lot. Become like
本発明のレセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンドを決定する上記 の①〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプタータンパク質画分と、 標識 した試験化合物が必要である。 In order to carry out the above methods (1) to (3) for determining the ligand for the receptor protein or its salt of the present invention, an appropriate receptor protein fraction and a labeled test compound are required.
レセプタータンパク質画分としては、 天然型のレセプ夕一タンパク質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここ で、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示 す。 The receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction activity and the like.
試験化合物の標識には、 例えば [3 H] 、 [1 2 5 I ] 、 [1 4 C] 、 [3 5 S ] な どの放射性同位元素が好ましく用いられる。 For the labeling of the test compound, for example, radioactive isotopes such as [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C] and [ 35 S] are preferably used.
具体的には、 本発明のレセプタ一タンパク質またはその塩に対するリガンドの 決定方法を行なうには、 まず本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞また
は細胞の膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプ夕 一標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) の リン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドとレセプ夕一夕ンパ ク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的 結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80TM (花王一アトラス 社) 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンや ゼラチンなどの各種タンパク質をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プ 口テアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイべ プチン、 E—64 (ペプチド研究所製) 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害 剤を添加してもよい。 0.0 lml〜l Om 1の該レセプター溶液に、 一定量 ( 5000 c pm~500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔 35S〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 (NSB) を 知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応 は約 0° (:〜 50° (:、 望ましくは約 4°C〜37°Cで、 約 20分〜 24時間、 望まし くは約 30分〜 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バ ッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一シ ヨンカウンターあるいは T一カウン夕一で計測する。 全結合量 (B) から非特異 的結合量 (NSB) を引いたカウント (B— NSB) が O c pmを越える試験化 合物を本発明のレセプ夕一夕ンパク質またはその塩に対するリガンド (ァゴニス 卜) として選択することができる。 Specifically, to carry out the method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention or a salt thereof, first, a cell or a cell containing the receptor protein of the present invention is used. Prepare an overnight receptor preparation by suspending the membrane fraction of the cells in a buffer appropriate for the method of determination. The buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-hydrochloric acid buffer, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, surfactants such as CHAPS, Tween-80 ™ (Kao Ichi Atlas), digitonin, dexcholate, etc. Various proteins such as serum albumin and gelatin are added to the buffer. You can also. Further, a protease inhibitor such as PMS F, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), pepstatin and the like may be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor or ligand by the protease. A fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of a test compound labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], etc., is added to the receptor solution of 0.0 lml to 1 Om1. Coexist. Prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled test compound to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at about 0 ° (: to 50 ° (:, preferably at about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the glass fiber filter paper After washing with an appropriate amount of the same buffer, the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or T-counter. Non-specific from the total binding amount (B) A test compound having a count (B-NSB) less than the binding amount (NSB) exceeding Ocpm can be selected as a ligand (agonist) for the receptor protein or its salt of the present invention.
本発明のレセプタ一タンパク質またはその塩に対するリガンドを決定する上記 の④〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプ夕ータンパク質を介する細胞刺激 活性 (例えば、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 細胞内タンパク質の リン酸化などを促進または抑制する活性など) を公知の方法または市販の測定用 キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明のレセプター タンパク質を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 リガンド決定 を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な バッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィンキュベ一トした後 、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従つ
て定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質の生成 (例えば、 細胞内 c AMP生 成など) が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に 対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制な どの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させてお いた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。 In order to carry out the above-mentioned methods (1) to (4) for determining the ligand for the receptor protein or its salt of the present invention, the receptor protein-mediated cell stimulating activity (for example, intracellular cAMP production, intracellular cGMP Production, phosphorylation or the like of an intracellular protein, etc.) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the receptor protein of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like. Before determining the ligand, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells, or collect the supernatant. , According to each method And quantify. If the production of a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity (for example, the production of intracellular cAMP) is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. You may. In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に結合するリガンド決定用キット は、 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもし くはその塩、 本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞、 または本発明のレ セプタータンパク質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。 The kit for determining a ligand that binds to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes the receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide or a salt thereof of the present invention, a cell containing the receptor protein of the present invention, or It contains the membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
本発明のリガンド決定用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 Examples of the kit for determining a ligand of the present invention include the following.
1. リガンド決定用試薬 1. Reagent for ligand determination
①測定用緩衝 ί夜および洗浄用緩衝液 ①Measurement buffer 緩衝 Night and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製) に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン (シグマ社製) を加えたもの。 Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) plus 0.05% serum serum albumin (manufactured by Sigma).
孔径 0.45 のフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 Sterilize by filtration through a 0.45 pore filter and store at 4 ° C, or prepare at use.
②本発明のレセプ夕一タンパク質標品 ②Recept Yuichi protein preparation of the present invention
本発明のレセプ夕一タンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養し たもの。 That the receptions evening CHO cells expressing an protein of the present invention, passaged 5 X 10 5 cells / well in 12-well plates, and cultured for 2 days at 37 ° C, 5% C0 2 , 95% air .
③標識試験化合物 ③ Labeled test compound
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの Commercially available [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] labeled compounds or the like, was or those labeled by an appropriate method
水溶液の状態のものを 4 °Cあるいは一 20 °Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 /iMに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホル ムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。 Store the solution in an aqueous solution at 4 ° C or 120 ° C, and dilute to 1 / iM with the measurement buffer before use. Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethylformamide, DMSO, methanol, etc.
④非標識試験化合物 ④Unlabeled test compound
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。 The same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
2. 測定法
① 1 2穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタータンパク質発現 C HO細胞を、 測定用緩衝液 1 m lで 2回洗浄した後、 4 9 0 lの測定用緩衝 液を各穴に加える。 2. Measurement method ① After washing the receptor protein-expressing CHO cells of the present invention cultured in a 12-well tissue culture plate twice with 1 ml of the measurement buffer, add 490 l of the measurement buffer to each well. .
②標識試験化合物を 5 a 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 n 1加えておく。 (2) Add 5a1 of the labeled test compound and react at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, add 5 n 1 of unlabeled test compound.
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0 . 2 N N a OH - 1 % S D Sで溶解し、 4 m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製) と混合する。 3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeling test compound bound to the cells is dissolved in 0.2 N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
④液体シンチレ一シヨンカウンタ一 (ベックマン社製) を用いて放射活性を測 定する。 放射 Measure radioactivity using a liquid scintillation counter (Beckman).
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に結合することができるリガンド としては、 例えば、 肺、 白血球、 精巣、 脾臓などに特異的に存在する物質などが 挙げられる。 Examples of the ligand capable of binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof include substances specifically present in lung, leukocyte, testis, spleen and the like.
( 2 ) 本発明のレセプ夕一夕ンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤 (2) A preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with protein dysfunction of the receptor protein of the present invention
上記 (1 ) の方法において、 本発明のレセプ夕一タンパク質に対するリガンド が明らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプ夕一夕 ンパク質または②該レセプタータンパク質をコードする D NAを、 本発明のレセ プ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの 医薬として使用することができる。 In the above method (1), if the ligand for the receptor protein of the present invention is identified, the receptor protein of the present invention or (2) encodes the receptor protein according to the action of the ligand. The DNA can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
例えば、 生体内において本発明のレセプ夕一タンパク質が減少しているために リガンドの生理作用が期待できない (該レセプ夕一タンパク質の欠乏症) 患者が いる場合に、 ①本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レセプ夕一夕 ンパク質の量を補充したり、 ② (ィ) 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードす る D NAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは (口) 対象となる 細胞に本発明のレセプタータンパク質をコードする D N Aを揷入し発現させた後 に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕 —タンパク質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる 。 すなわち、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NAは、 安全で低毒
性な本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および zま たは治療剤として有用である。 For example, if there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand because the receptor protein of the present invention is reduced in the living body (deficiency of the receptor protein protein), (1) using the receptor protein of the present invention in the patient (B) by administering to the patient and expressing the DNA encoding the receptor protein of the present invention in the patient; or (b) After the DNA encoding the receptor protein of the present invention is introduced and expressed in a cell, the amount of the receptor protein in the patient's body is increased by transplanting the cell into the patient, and the like. The effect of can be fully exhibited. That is, DNA encoding the receptor protein of the present invention is safe and low toxic. Of the present invention is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
本発明のレセプ夕一タンパク質は、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 であるひ l a—アドレノセプ夕ー i s o m e r 3 〔ブリティッシュ 'ジャー ナル ·ォブ ·ファーマコロジ一 (Br. J. Pharmacol. ) , 1 2 9 ( 8 ) , 1 5 6 9 - 1 5 7 6 ( 2 0 0 0 ) 〕 にアミノ酸配列レベルで、 約 3 0 %の相同性が認め られる新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質である。 The receptor protein of the present invention is a G protein-coupled receptor protein, which is a la-adrenocept protein isomer 3 [British 'Journal of Pharmacol. (Br. J. Pharmacol.), 129 (8), 1569-15776 (2000)], a novel transmembrane receptor homologous protein having about 30% homology at the amino acid sequence level.
本発明のレセプター夕ンパク質または該レセプ夕一夕ンパク質をコードする D ΝΑは、 例えば、 感染症 (例えば、 免疫機能不全、 肺炎、 インフルエンザなど) 、 中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂食障害など)、 内分泌疾患 (例 えば、 高血圧症、 性腺機能異常、 甲状腺機能異常、 下垂体機能異常など)、 代謝 疾患 (例えば、 糖尿病、 脂質代謝異常、 高脂血症など)、 癌 (例えば、 非小細胞肺 癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌など ) 、 心疾患 (例えば、 狭心症、 心筋梗塞など) 、 呼吸器系疾患 (例えば、 気道閉 塞性疾患、 感染性肺疾患など) 、 消化器系疾患 (例えば、 潰瘍、 ポリポーシスな ど) 、 免疫系疾患 (例えば、 全身性エリテマトーデス、 リウマチ性疾患など) な どの予防および Ζまたは治療に有用である。 The DΝΑ encoding the receptor protein or the receptor protein of the present invention may be, for example, an infectious disease (eg, immune dysfunction, pneumonia, influenza, etc.), a central disease (eg, Alzheimer's disease, dementia, Food disorders), endocrine disorders (eg, hypertension, gonadal dysfunction, thyroid dysfunction, pituitary dysfunction, etc.), metabolic disorders (eg, diabetes, lipid metabolism, hyperlipidemia, etc.), cancer (eg, , Non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), heart disease (eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), respiratory system Diseases (eg, airway obstructive disease, infectious lung disease, etc.), Gastrointestinal diseases (eg, ulcer, polyposis, etc.), Immune system diseases (eg, systemic lupus erythematosus, rheumatism) Useful sexual disorders, etc.) of any prevention and Ζ or treatment.
本発明のレセプ夕一タンパク質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常 套手段に従つて製剤化することができる。 When the receptor protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
一方、 本発明のレセプタ一タンパク質をコードする D N Α (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある) を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明 の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 ァ デノウィルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入し た後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで 、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲル力テ一テ ルのようなカテーテルによって投与できる。 On the other hand, when DNΑ encoding the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as DNA of the present invention) may be used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or as a retrovirus. After insertion into a suitable vector such as a vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector, it can be carried out according to a conventional method. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as Hydrate gel gel.
例えば、 ①本発明のレセプ夕一タンパク質または②該レセプタータンパク質を コードする D NAは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル 剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬
学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口 的に使用できる。 例えば、 ①本発明のレセプタータンパク質または②該レセプ夕 一タンパク質をコードする D NAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤 実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるように するものである。 For example, (1) the DNA encoding the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein may be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, or water or Other drugs It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with physiologically acceptable liquids or suspensions. For example, (1) the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein together with known carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., which are physiologically recognized. It can be manufactured by admixing it in the unit dosage form required for accepted practice. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ぺパ一ミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど) などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール) 、 非イオン性界面活性剤 (例、 ポリソルべ一ト 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。 Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat. Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can. Examples of the aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like. such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene Dali call), a nonionic surfactant (eg, polysorbate one preparative 8 0 TM, HCO- 5 0), such as a combination You may. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液) 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど) 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 (例えば、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 Examples of the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, such as, for example, humans and other mammals (eg, rats, mice, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). ) Can be administered.
本発明のレセプ夕一タンパク質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 ( 60 k gとして) においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ましく は約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に 投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに よっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (60 kg として) においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投 与することができる。 The dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day. When administered parenterally, the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. For example, in the case of injection, it is usually used, for example, for infectious disease patients (60 kg) In this case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. For other animals, the dose can be given in terms of 6 O kg.
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (6 O kgとして ) においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg, より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は 、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なる が、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O kgとして) におい ては、 一日につき約 0, 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程 度、 より好ましくは約 0. 1~1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都 合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することがで きる。 The dosage of the DNA of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. For example, in the case of injection, it is usually, for example, an infectious disease patient (as 6 O kg) In this case, it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
(3) 遺伝子診断剤 (3) Gene diagnostic agent
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたはその他の 哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ 、 サルなど) における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドを コードする DNAまたは mRNAの異常 (遺伝子異常) を検出することができる ので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、
該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用 である。 The DNA of the present invention can be used as a probe to produce the receptor of the present invention in humans or other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.). Abnormality (genetic abnormality) of DNA or mRNA encoding one protein or a partial peptide thereof can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, The DNA or mRNA is useful as a diagnostic agent for a gene such as increase or overexpression.
本発明の D NAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザン八イブ リダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 (ゲノミックス (Genomics) , 第 5巻, 8 7 4〜8 7 9頁 (1 9 8 9年) 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー (Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America) , 第 8 6 巻, 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 (1 9 8 9年) ) などにより実施することができる。 The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the well-known Northern Eighth hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989). ), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, Vol. 27, Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 6-2770 pages (1989)).
( 4 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化 させる化合物のスクリーニング方法 (4) A method for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention
本発明の D NAは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング に用いることができる。 By using the DNA of the present invention as a probe, it can be used for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
すなわち、 本発明は、 例えば、 (i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器 、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または (U) 形質転換体等に含まれる 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチドの m R N A量を測定する ことによる、 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を 変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。 That is, the present invention relates to, for example, (i) a non-human mammal's (1) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (U) a transformant of the present invention contained in a transformant or the like. Provided is a method for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention by measuring the mRNA level of one protein or its partial peptide.
本発明のレセプ夕一夕ンパク質またはその部分べプチドの m R N A量の測定は 具体的には以下のようにして行なう。 The measurement of the amount of mRNA of the receptor protein or its partial peptide of the present invention is specifically carried out as follows.
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど) に対して、 薬剤 (例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など) あるいは物理的ストレス (例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など) などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 (例えば、 肺、 精巣、 脾臓、 脳、 肺、 大腸な ど) 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 (i) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerosisを Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) After a given period of time, blood or a specific organ (eg, lung, testis, spleen, brain, lung, large intestine, etc.), or tissue or cells isolated from the organ is obtained.
得られた細胞に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドの mRNAは、 例えば、 通常の方法により細胞等から mRNAを抽出し、 例え
ば、 T a q M a n P C Rなどの手法を用いることにより定量することができ、 公 知の手段によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。 The mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the obtained cells can be obtained, for example, by extracting mRNA from cells or the like by a usual method, for example, For example, it can be quantified by using a technique such as TaqMan PCR, and can also be analyzed by performing Northern blot by a known means.
(i i) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形 質転換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプタ —タンパク質またはその部分ペプチドの mR NAを同様にして定量、 解析するこ とができる。 (ii) A transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof contained in the transformant is prepared. It can be quantified and analyzed in the same way.
本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニングは、 Screening for a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention comprises:
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 (3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前) もしくは一定時間後 (3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後) 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 (3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後) 、 細胞に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質 またはその部分ペプチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことが でき、 (i) A given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical The test compound is administered at the same time as the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cells The amount of mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the present invention can be determined and analyzed,
( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 (1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後) 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質ま たはその部分べプチドの m R N A量を定量、 解析することにより行なうことがで さる。 (ii) When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). A day after), the amount can be determined by quantifying and analyzing the amount of mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant.
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有 する化合物であり、 具体的には、 (ィ) 本発明のレセプ夕一タンパク質またはそ の部分べプチドの発現量を増加させることにより、 本発明のレセプ夕一夕ンパク 質を介する細胞刺激活性 (例えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進または抑制する活性など) を増強させる 化合物、 (口) 本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量
を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。 The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention. By increasing the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide, the cell stimulating activity through the receptor protein of the present invention (for example, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP) (Enhancement of the production, phosphorylation of intracellular proteins, etc.), (a) Expression of the receptor protein of the present invention or its partial peptide Is a compound that attenuates the cell stimulating activity by reducing
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds
、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 And fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプ夕一タンパク質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁 ί夜剤などとするこ とができる。 When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and night formulations can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば、 感染症患者 (60 k gとして) においては、 一日につき約 0. 1〜; L 00mg、 好ましくは約 1. 0 〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 Okgとして) に おいては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与すること ができる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (60 kg), About 0.1- per day; L 00 mg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
(5) 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化 させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤 (5) A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention
本発明のレセプタ一タンパク質は上記のとおり、 例えば、 免疫機能など生体内
で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 本発明のレセ プタ一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発 明のレセプター夕ンパク質の機能不全に関連する疾患の予防およぴ,または治療 剤として用いることができる。 The receptor protein of the present invention is, as described above, Is considered to play some important role. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. it can.
該化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化すること力 S できる。 When the compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。 For example, the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like as needed, orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally or in the form of injections such as suspensions. For example, the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど) などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール) 、 非イオン性界面活性剤 (例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0
) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。 Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat. Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can. Examples of the aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like. such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene Dali call), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO - 5 0 ) May be used together. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液) 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど) 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 Examples of the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (60 kg として) においては、 一日につき約 0. 1〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O kgとして) にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することが できる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, and more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. is there. For other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
(6) 本発明のレセプタ一夕ンパク質に対するリガンドの定量法 (6) Method for quantifying ligand for receptor protein of the present invention
本発明のレセプ夕一タンパク質等は、 リガンドに対して結合性を有しているの で、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。 Since the receptor protein and the like of the present invention have a binding property to a ligand, the ligand concentration in a living body can be quantified with high sensitivity.
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプタ一タンパク質等と接触させること によって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば 、 以下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いる ことができる。
①入江寛編 (講談社、 昭和 4 9年発行) The quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the subject can be measured by bringing the subject into contact with the receptor protein of the present invention. Specifically, for example, it can be used according to the method described in the following (1) or (2) or a method analogous thereto. (1) Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1949)
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 (講談社、 昭和 5 4年発行) ②Hiroshi Irie “Radio Imnoatsushi” (Kodansha, published in 1954)
( 7 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合 物 (ァゴ二スト、 アンタゴニストなど) のスクリーニング方法 (7) A method for screening a compound (eg, agonist, antagonist, etc.) that changes the binding property between the receptor protein of the present invention and a ligand.
本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、 または組換え型レセプ夕一タン パク質等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用い ることによって、 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化 させる化合物 (例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物など) またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる このような化合物には、 (ィ) 本発明のレセプタータンパク質を介して細胞刺 激活性 (例えば、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質 のリン酸化などを促進または抑制する活性など) を有する化合物 (いわゆるァゴ 二スト) 、 (口) 該細胞刺激活性を有しない化合物 (いわゆるアン夕ゴニスト) 、 ひ、) リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質との結合力を増強する化合物 、 あるいは (二) リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質との結合力を減少さ せる化合物などが含まれる (なお、 上記 (ィ) の化合物は、 上記したリガンド決 定方法によってスクリーニングすることが好ましい) 。 By using the receptor protein or the like of the present invention or constructing an expression system for a recombinant receptor protein and the like, and using the receptor-binding Atsushi system using the expression system, the ligand and the present invention can be used. (Eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof that can efficiently screen for a compound that changes the binding property of the protein to a receptor protein or the like (A) Cell stimulating activity via the receptor protein of the present invention (for example, activity to promote or suppress intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein phosphorylation, etc.) (So-called agonist), (mouth) Compound having no cell stimulating activity (so-called gonist), hi,) Compounds that enhance the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention, or (2) compounds that reduce the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention, etc. ) Is preferably screened by the ligand determination method described above).
すなわち、 本発明は、 (i ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と (i i ) 本発明のレセ プタ一タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試 験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発 明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 That is, the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof. A compound that changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, or a compound thereof, which is compared with the case where the ligand and the test compound are brought into contact with each other. A method for screening a salt is provided.
本発明のスクリーニング方法においては、 (i ) と ( i i ) の場合における、 例えば、 該レセプ夕一タンパク質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性な どを測定して、 比較することを特徴とする。 The screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein or the like, the cell stimulating activity, etc. are measured and compared. .
より具体的には、 本発明は、 More specifically, the present invention provides
①標識したリガンドを、 本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と
、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質等に接触 させた場合における、 標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結 合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一タンパ ク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 ②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本 発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させ た場合における、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一夕ンパク質等と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (1) When the labeled ligand is brought into contact with the receptor protein of the present invention, etc. And a method of measuring and comparing the amount of the labeled ligand bound to the receptor protein or the like when the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the receptor protein or the like of the present invention. A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property to the receptor protein, etc. of the present invention; (2) applying the labeled ligand to a cell containing the receptor protein, etc. of the present invention or a membrane fraction of the cell; The cell or the membrane fraction of the labeled ligand when contacted and when the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the cell containing the receptor protein of the present invention or the membrane fraction of the cell. The amount of binding to the ligand is measured and compared, and the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention is changed. A method for screening a compound or a salt thereof,
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場合と、 標識 したリガンドおよび試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養す ることによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一タンパク質等に接触させ た場合における、 標識したリガンドの該レセプ夕一タンパク質等に対する結合量 を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター夕ンパク質 等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (3) When the labeled ligand is brought into contact with a receptor protein or the like expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, and when the labeled ligand and the test compound contain the DNA of the present invention. When the transformant to be cultured is brought into contact with the receptor protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing, the amount of the labeled ligand bound to the receptor protein is measured and compared. A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand characterized by the following and the receptor protein of the present invention,
④本発明のレセプ夕一タンパク質等を活性化する化合物 (例えば、 本発明のレ セプタ一タンパク質等に対するリガンドなど) を本発明のレセプタータンパク質 等を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を活性 化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細 胞に接触させた場合における、 レセプターを介した細胞刺激活性 (例えば、 細胞 内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進 または抑制する活性など) を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発 明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク リーニング方法、 および 化合物 A compound that activates the receptor protein or the like of the present invention (eg, a ligand for the receptor protein or the like of the present invention) is brought into contact with a cell containing the receptor protein or the like of the present invention. Receptor-mediated cell stimulating activity (eg, intracellular CAMP production, cell proliferation) when a compound that activates receptor protein or the like and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor protein or the like of the present invention. C GMP production, activity of promoting or suppressing intracellular protein phosphorylation, etc.), and comparing the ligand with the receptor protein of the present invention, A method for screening the salt, and
⑤本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 (例えば、 本発明のレ セプタータンパク質等に対するリガンドなど) を本発明の D N Aを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一タンパク
質等に接触させた場合と、 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 および試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養することによつ て細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ る、 レセプターを介する細胞剌激活性 (例えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進または抑制する活性など) を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質 等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する 本発明のレセプ夕一タンパク質等が得られる以前は、 膜貫通型レセプ夕一タン パク質ァゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、 まずラット などの膜貫通型レセプ夕一タンパク質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を 用いて候補化合物を得て (一次スクリーニング) 、 その後に該候補化合物が実際 にヒ卜の膜貫通型レセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合を阻害するか否かを 確認する試験 (二次スクリーニング) が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜 画分をそのまま用いれば他のレセプ夕一タンパク質も混在するために、 目的とす るレセプタータンパク質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際にスク リーニングすることは困難であった。 の A compound of the present invention in which a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention (eg, a ligand for the receptor protein or the like of the present invention) is expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Reception Yuichi Protein The present invention expresses on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention and a test compound when they are brought into contact with the DNA of the present invention. Receptor-mediated cell stimulating activity (for example, activity to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein phosphorylation, etc.) And a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and the receptor protein or the like of the present invention, which is characterized by measuring and comparing When screening for a transmembrane receptor protein antagonist or antagonist, a transmembrane receptor A candidate compound is obtained using a cell, tissue or its cell membrane fraction containing Yuichi protein (primary screening), and then the candidate compound actually binds to human transmembrane receptor Yuichi protein and its ligand. A test (secondary screening) to confirm whether or not to inhibit was required. If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, and it has been difficult to actually screen an agonist or an antagonist for the target receptor protein.
しかしながら、 例えば、 本発明のレセプ夕一タンパク質を用いることによって 、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと該レセプタータンパク質と の結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニス卜かアン夕ゴニストかを簡便に評価する ことができる。 However, for example, by using the receptor protein of the present invention, primary screening is not required, and a compound that inhibits binding between a ligand and the receptor protein can be efficiently screened. Furthermore, it is possible to easily evaluate whether the screened compound is an agonist or an engonist.
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。 The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプタータンパク質等 としては、 上記した本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有するものであれば何 れのものであってもよいが、 本発明のレセプタ一タンパク質等を含有する哺乳動 物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極め て困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用い て大量発現させたヒ卜由来のレセプ夕一タンパク質等などが適している。
本発明のレセプ夕一タンパク質等を製造するには、 上記の方法が用いられるが 、 本発明の D NAを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ま しい。 目的とするタンパク質部分をコードする D NA断片には c D NAが用いら れるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NA断片を 宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス (nuclear poly hedros is virus; N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来のプロモ 一夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモータ一、 ヒト ヒートショックプロモ一夕一、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R Q;プロ モータ一などの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検 査は公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ,ジャー ナル ·ォブ ·パィォロジカル ·ケミストリ一 (J. Biol. Chem. ) , 267巻, 19555 〜19559頁, 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。 First, the receptor protein or the like of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-mentioned receptor of the present invention. Cell membrane fractions of mammalian organs containing one protein or the like are preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, it is suitable to use human-derived receptor protein expressed in large amounts using recombinants, etc., for screening. The method described above is used to produce the receptor protein of the present invention and the like, but it is preferable to express the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells. As the DNA fragment encoding the protein portion of interest, cDNA is used, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce the DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment should be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using an insect as a host. (Nuclear poly hedros is virus; NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter overnight, retrovirus promoter, meta-mouth thionein promoter, human heat shock promoter overnight, cytomegalovirus promoter, It is preferably incorporated downstream of the SRQ; promoter. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a known method. For example, it can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. it can.
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一タン パク質等を含有するものとしては、 公知の方法に従って精製したレセプ夕一タン パク質等であってもよいし、 該レセプ夕一タンパク質等を含有する細胞を用いて もよく、 また該レセプ夕ータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含 有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定 化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。 Therefore, in the screening method of the present invention, the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein or the like purified according to a known method, or may be a receptor protein or the like. A cell containing a protein or the like may be used, or a membrane fraction of a cell containing the receptor protein or the like may be used. In the screening method of the present invention, the screening method of the present invention contains the receptor protein of the present invention or the like. When cells are used, the cells may be fixed with dartartaldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞としては、 該レセプタータン パク質等を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが好ましい。 The cell containing the receptor protein or the like of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 P o t t e r— Ε 1 v e h j e m型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリングブレンダーゃポリ トロン (K i n e m a t i c a社製) のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチ
プレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕など が挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの 遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 (500 r pm〜3000 r pm) で短時間 (通常、 約 1分〜 10分) 遠心し、 上清をさ らに高速 (15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し 、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプタ一タンパク 質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。 The cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method. Cell crushing methods include crushing cells with a Potter-Ε1 vehjem homogenizer, crushing using a Waring blender ゃ polytron (Kinematica), crushing by ultrasonic waves, French Examples include crushing by ejecting cells from a fine nozzle while applying pressure with a press or the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 rpm to 30000 rpm). After centrifugation for 30 minutes to 2 hours, the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質 の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分 子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合 活性 (比活性) が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。 The amount of the receptor protein in the cell or membrane fraction containing the receptor protein or the like is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same lot. become.
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプ夕 一タンパク質画分と、 標識したリガンドが必要である。 In order to carry out the above steps (1) to (3) for screening for a compound that changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention, for example, an appropriate receptor protein fraction and a labeled ligand are required. .
レセプ夕一タンパク質画分としては、 天然型のレセプ夕一タンパク質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一タンパク質画分などが望ま しい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用などを示す。 As the receptor protein fraction, a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is desirable. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔12S I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 など で標識されたリガンドなどが用いられる。 As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example, ligands labeled with [ 3 H], [ 12S I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
具体的には、 リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプタータンパク質 等を含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに 懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。 バッファーには、 p H4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリスー塩酸バッフ ァーなどのリガンドとレセプ夕一タンパク質との結合を阻害しないバッファーで あればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、
Twe e n - 80™ (花王一アトラス社) 、 ジギトニン、 デォキシコレートな どの界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによ るレセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 6 4 (ペプチド研究所製) 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加するこ ともできる。 0.0 lm 1〜: L 0m 1の該レセプ夕一溶液に、 一定量 (5000 c pm〜500000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10— 4M 〜10— 1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 (NSB) を知るため に大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 °Cか ら 50°C、 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは 約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッフ ァ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーション カウン夕一または T一カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウン ト (B 0) から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント (B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 (B— NSB) が、 例えば、 50%以下になる 試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 Specifically, to screen for a compound that alters the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention, a cell containing the receptor protein of the present invention or a membrane fraction of the cell is first screened. Prepare the receptor protein preparation by suspending it in a suitable buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding of the ligand to the receptor protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer. In addition, CHAPS, Surfactants such as Tween-80 ™ (Kaoichi Atlas), digitonin, dexcholate, etc. can also be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-644 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases. 0.0 lm. 1 to: to the receptions evening first solution of L 0 m 1, coexist a certain amount (5000 c pm~500000 c pm) of were added labeled ligand concurrently 10- 4 M to 10-1Q test compound M Let it. Prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at about 0 ° C to 50 ° C, preferably about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or a T-counter. When the count (B. One NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B 0) when there is no antagonist is 100%, the specific binding amount (B—NSB) is For example, a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕 一タンパク質を介する細胞刺激活性 (例えば、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cG MP生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進または抑制する活性など) を 公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 In order to carry out the above-mentioned methods (1) to (4) for screening for a compound that changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (for example, cell Intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, activity of promoting or inhibiting intracellular protein phosphorylation, etc.) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
具体的には、 まず、 本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新 鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物 などを添加して一定時間インキュべ一卜した後、 細胞を抽出あるいは上清液を回 収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標 とする物質の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分 解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 cAMP産 生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大 させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプタータン パク質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプタータンパク質等を発現し た細胞としては、 天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、 上 記の組換え型レセプ夕一タンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。 Specifically, first, cells containing the receptor protein or the like of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like. Before performing screening, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the generated product is quantified according to each method. If the production of a substance as an indicator of the cell stimulating activity is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like. For screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing an appropriate receptor protein are required. As a cell expressing the receptor protein of the present invention, a cell line having the natural receptor protein of the present invention, a cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein or the like is desirable.
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。 As test compounds, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプタータンパク質等、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一タン パク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。 A screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding between a ligand and the receptor protein of the present invention or the like includes cells containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the like, or And those containing a membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention and the like.
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. スクリーニング用試薬 1. Screening reagent
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 ①Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製) に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン (シグマ社製) を加えたもの。 Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) with 0.05% serum albumin (manufactured by Sigma).
孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 Sterilize by filtration with a 0.45 m pore size filter, and store at 4 ° C or prepare as needed.
②本発明のレセプタータンパク質標品 ②Receptor protein preparation of the present invention
本発明のレセプタータンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 Z穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養し たもの。 CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 × 10 5 Z-wells, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
③標識リガンド ③ Labeled ligand
市販の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 に希釈する。 Commercially available [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] those states of labeled ligand solution and stored at 4 ° C or single 20 ° C, etc., measurement buffer at use Dilute to 1 with the solution.
④リガンド標準液 ④Ligand standard solution
リガンドを 0.1 %ゥシ血清アルブミン (シグマ社製) を含む PBSで ImM
となるように溶解し、 一 20°Cで保存する。 Immobilize the ligand with PBS containing 0.1% serum albumin (Sigma) Dissolve and store at 20 ° C.
2. 測定法 2. Measurement method
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター夕ンパク質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1mlで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝 液を各穴に加える。 (1) Wash the CHO cells expressing the receptor protein of the present invention cultured in a 12-well tissue culture plate twice with 1 ml of the measurement buffer, and add 4901 measurement buffer to each well.
② 10— 3〜10_1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 l加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合 物の代わりに 10一3 Mのリガンドを 5 1加えておく。 ② After adding 10- 3 ~10_ 1Q test compound solution 5 1 M, the labeled ligand 5 l was added and reacted at room temperature for 1 hour. A supplementary 5 1 10 one 3 M of ligand in place of the test compound to determine the amount of non-specific binding.
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一ター A (和光純薬製) と混合する。 3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (Wako Pure Chemical Industries).
④液体シンチレーシヨンカウン夕一 (ベックマン社製) を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。 放射 Measure radioactivity using liquid scintillation counter Yuichi (manufactured by Beckman) and determine Percent Maximum Binding (PMB) by the following formula.
PMB= [ (B-NS B) / (B。― NSB) ] X 100 PMB = [(B-NS B) / (B.- NSB)] X 100
PMB: Percent Maximum Binding PMB: Percent Maximum Binding
B :検体を加えた時の値 B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific Binding (非特異的結合量) NSB: Non-specific Binding
B 0 :最大結合量 B 0: maximum binding amount
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性 を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 (ィ) 本発明のレセプタ 一タンパク質を介して細胞刺激活性 (例えば、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cG MP生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進または抑制する活性など) を 有する化合物 (いわゆるァゴニスト) 、 (口) 該細胞刺激活性を有しない化合物 (いわゆるアン夕ゴニスト) 、 (ハ) リガンドと本発明のレセプタータンパク質 との結合力を増強する化合物、 あるいは (二) リガンドと本発明のレセプ夕一夕 ンパク質との結合力を減少させる化合物である。 The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention and the like. (Ii) A compound having a cell stimulating activity (eg, an activity of promoting or suppressing intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein phosphorylation, etc.) via the receptor protein of the present invention (so-called “ Agonist), (mouth) a compound that does not have the cell stimulating activity (so-called angelic gonist), (c) a compound that enhances the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention, or (2) a ligand and the receptor of the present invention. It is a compound that reduces the binding force with protein.
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、
公知の化合物であってもよい。 Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds, Known compounds may be used.
本発明のレセプタータンパク質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプター タンパク質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので 、 該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。 Since the agonist against the receptor protein or the like of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug depending on the ligand activity.
本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタゴニストは、 本発明のレセプ 夕一タンパク質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるの で、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。 Since the antagonist to the receptor protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand to the receptor protein or the like of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity.
リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質との結合力を増強する化合物は、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等に対するリガンドが有する生理活性を増強するた めの安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that enhances the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like.
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物は、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質等に対するリガンドが有する生理活性を減少させ るための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that decreases the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein and the like of the present invention.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプタータンパク質を含有 する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤 、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。 When the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-described medicine containing the receptor protein of the present invention.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜やその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 ゥサギ、. ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど) に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and other mammals (eg, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (6 0 k g として) においては、 一日につき約 0. 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m gである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O k gとして) にお いては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g 程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することが できる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (as 60 kg), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day is administered by intravenous injection. Is good It is convenient. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
( 8 ) 本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合 物 (例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニスト) を含有する各種疾病の予防および/また は治療剤 (8) A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (eg, agonist, angonist) that changes the binding property between the receptor protein and the ligand of the present invention.
本発明のレセプ夕一タンパク質は上記のとおり、 例えば免疫機能、 中枢機能、 循環機能、 消化機能、 心機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると 考えられる。 従って、 本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変 化させる化合物 (例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニスト) や本発明のレセプタータン パク質に対するリガンドは、 本発明のレセプタ一タンパク質の機能不全に関連す る疾患の予防およびノまたは治療剤として用いることができる。 As described above, the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo, for example, immune function, central function, circulatory function, digestive function, and cardiac function. Therefore, a compound (eg, agonist, angonist) that alters the binding property between the receptor protein of the present invention and the ligand and the ligand for the receptor protein of the present invention are dysfunctional of the receptor protein of the present invention. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with the disease.
該化合物やリガンドを本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾 患の予防および Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化 することができる。 When the compound or ligand is used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
例えば、 該化合物やリガンドは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤 の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の 担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造する ことができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。 For example, the compound or ligand can be sterilized with tablets or capsules, elixirs, microcapsules, etc., as required, or sugar-coated, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions. For example, the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by this. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物
は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど) などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール) 、 非イオン性界面活性剤 (例、 ポリソルベー卜 80TM、 HC〇一 50 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。 Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat. Sterile composition for injection Can be formulated according to the usual practice of dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil. Examples of the aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like. Agents, for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 ™ , HC-150) . As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝:液) 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど) 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 さらに、 上記予防'治療剤は適当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプ タータンパク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲットとした DDS 製剤として使用することもできる。 Examples of the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer: solution), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. Further, the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent can be used in combination with an appropriate drug, for example, as a DDS preparation specifically targeting an organ or tissue in which the receptor protein of the present invention is highly expressed.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, puppies, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (60 kg として) においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O kgとして) にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することが できる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (as 60 kg), one day is required. About 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is preferable to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. It is convenient. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
( 9 ) 本発明のレセプ夕一夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 の定量 (9) Determination of the receptor protein of the present invention overnight or its partial peptide or its salt
本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を特異的に認識することが できるので、 被検液中の本発明のレセプ夕一タンパク質等の定量、 特にサンドィ ツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 Since the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention and the like, quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly quantification by a sandwich immunoassay, etc. Can be used for That is, the present invention provides, for example,
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプタータンパク質等とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化レセプ夕一タンパク質等の割合を測定す ることを特徴とする被検液中の本発明のレセプ夕一タンパク質等の定量法、 (i) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled receptor protein in a competitive manner, and measuring the ratio of the labeled receptor protein bound to the antibody; A method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution,
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプ夕一夕ンパク質等の定量 法を提供する。 (ii) Simultaneously or continuously reacting the test solution with the antibody of the present invention and the labeled antibody of the present invention insolubilized on the carrier, and then measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. The present invention provides a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution.
上記 (i i ) においては、 一方の抗体が本発明のレセプ夕一タンパク質等の N 端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等の C端部 に反応する抗体であることが好ましい。 In the above (ii), one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor protein of the present invention or the like, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein or the like of the present invention. Is preferred.
本発明のレセプタ一タンパク質等に対するモノクローナル抗体 (以下、 本発明 のモノクローナル抗体と称する場合がある) を用いて本発明のレセプタータンパ ク質等の測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 こ れらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプタータンパ ク質等に対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測 定液中の抗原量 (例えば、 レセプ夕一タンパク質量) に対応した抗体、 抗原もし くは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知 量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ卜リー、 競合法、 ィムノメト リック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後
に記載するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。 The receptor protein of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining or the like can be performed. Can also. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody or an antigen corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of receptor protein) in the test solution. Any method can be used to detect the amount of antibody-antigen complex by chemical or physical means and calculate this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. May be used. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, It is particularly preferable to use the sandwich method described in (1).
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ ーゼ、 ]3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リ ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力 ミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては 、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系 を用いることもできる。 As a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used. As the above-mentioned enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, / 3-galactosidase,] 3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, and lignoic acid dehydrogenase are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein, fluorescein isothiosinate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セル口一 スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成 樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。 For the insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing a protein or enzyme may be used. As the carrier, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, cell mouth, and the like, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ (1次反応) 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ (2次反応) た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明のレセプ夕一タンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次 反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行 なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができ る。 In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the agent, the amount of the receptor protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be based on those described above.
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく'、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一タンパク質等の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプタ一タン パク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次
反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が 、 レセプ夕一タンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は 、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。 In the method for measuring the receptor protein and the like by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site such as a receptor protein. Can be That is, primary The antibody used in the reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably other than the C-terminal For example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原と(F) と抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し ( B ZF分離) 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B ZF分離をポリエチレンダリ コール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。 The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry. In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. (BZF separation) The amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, BZF separation is carried out using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the above antibody, or an immobilized antibody is used as the first antibody. An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。 In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。 In nephelometry, the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタータンパク質ま たはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細につい ては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィ ムノアツセィ」 (講談社、 昭和 4 9年発行) 、 入江 寛編 「続ラジオイムノアツ セィ」 (講談社.、 昭和 5 4年発行) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (医学書 院、 昭和 5 3年発行) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 2版) (医学書院
、 昭和 5 7年発行) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 3版) (医学書院、 昭和 6 2年発行) 、 「メソッズ ·イン ·ェンジモノジ一 (Methods in ENZYMOLOG Y) J Vol. 70 (Immunochemical Techniaues (Part A) )、 同書 Vol. 73 (I匪 noche mical Techniaues (Part B) )、 同書 Vol. 74 (I讓腦 chemical Techniaues (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassay s) )、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoc lonal Ant ibodie s and General Immunoassay Methods) ) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techn i ues (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカ デミックプレス社発行)など参照〕 。 In applying these individual immunological measurement methods to the measurement method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. What is necessary is just to construct the measuring system of the receptor protein of the present invention or the salt thereof by adding the usual conditions and the operation method to the usual technical considerations of those skilled in the art in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews and compendiums. [For example, Hiroshi Irie, edited by "Radio Munoatsushi" (Kodansha, published in Showa 49), Hiroshi Irie, edited by Hiroshi Irie, continued radio "Immunoatsu Sei" (Kodansha., Published in Showa 54), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical College, published in 1953), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. Edition) (Medical Shoin , Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Publishing, published in 1962), "Methods in ENZYMOLOG Y) J Vol. 70 (Immunochemical Techniaues (Part A)), ibid.Vol. 73 (I married nochemical Techniaues (Part B)), ibid.Vol. 74 (Isubject chemical chemicalnia (Part C)), ibid.Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part A)) Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Ant ibodie s and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Ant) ibodies)) (See above, published by Akademic Press).
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプタータン パク質またはその塩を感度良く定量することができる。 As described above, the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプタータンパク質ま たその塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に 関連する各種疾患の診断をすることができる。 Furthermore, by quantifying the receptor protein of the present invention or a salt thereof in a living body using the antibody of the present invention, it is possible to diagnose various diseases related to dysfunction of the receptor protein of the present invention. it can.
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ 夕一タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発 明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製 時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、 被検細胞内における本 発明のレセプ夕一タンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。 Further, the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and receptor protein of the present invention in test cells It can be used for the analysis of the behavior of an object.
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチ ドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法 (10) A method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in a cell membrane
本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセ プタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリー二 ングに用いることができる。 Since the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, it changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. It can be used for screening of compounds.
すなわち本発明は、 例えば、 That is, the present invention, for example,
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壌した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の レセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜に
おける本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる 化合物のスクリーニング方法、 (i) After rupture of (1) blood, (2) specific organ, or (3) tissue or cells isolated from the non-human mammal, the cell membrane fraction is isolated, and the cell membrane fraction of the present invention contained in the cell membrane fraction is isolated. By quantifying the receptor protein or its partial peptide, A method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein or its partial peptide of the present invention in the present invention,
( i i ) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明 のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る化合物のスクリーニング方法、 (ii) After transformants expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide are disrupted, the cell membrane fraction is isolated, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is quantified. A method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane,
( i i i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織 もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での 該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タ ンパク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質 またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供す る。 (iii) The degree of staining of the receptor protein on the cell surface by using immunostaining after sectioning (1) blood, (2) specific organs, (3) tissues or cells isolated from the organs of non-human mammals The present invention provides a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the protein.
( i ) 本発明のレセプタ一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 レセプ夕一夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タン パク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質ま たはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタ一タンパク質またはその部分ペプチド の定量は具体的には以下のようにして行なう。 (i) Transformants expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof were sectioned, and then immunostaining was used to quantify the degree of staining of the receptor protein at the cell surface layer. To provide a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane by confirming the protein on the cell membrane. The quantification of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is specifically performed as follows.
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど) に対して、 薬剤 (例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など) あるいは物理的ストレス (例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など) などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 (例えば、 肺、 白血球、 精巣、 脾臓など) 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または 細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 (例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、
へぺス緩衝液など) 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面活性剤(i) Normal or disease model non-human mammals (for example, mice, rats, rabbits, puppies, higgies, bushus, puppies, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, demented rats, obese mice, Drugs (eg, anti-dementia drugs, anti-hypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) After a certain period of time, blood or a specific organ (eg, lung, leukocyte, testis, spleen, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organs, tissues or cells are transferred to an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Suspension, etc.) to destroy organs, tissues or cells,
(例えば、 トリトン X100TM、 ツイーン 20TMなど) などを用い、 さらに遠 心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。 (For example, Triton X100 ™ , Tween 20 ™, etc.) and the like, and a cell membrane fraction is obtained by techniques such as centrifugal separation, filtration, and column fractionation.
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 P o t t e r— E l v e h j em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダーゃポリ トロン (K i n ema t i c a社製) のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチ プレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕など が挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの 遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 (500 r pm〜3000 r pm) で短時間 (通常、 約 1分〜 10分) 遠心し、 上清をさ らに高速 (15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し 、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一タンパク 質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。 The cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after cell disruption. Methods for crushing cells include crushing cells with a Potter-E lvehj em-type homogenizer, crushing with a single ring blender polytron (Kinema tica), crushing with ultrasonic waves, French press, etc. Crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically, about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 rpm to 30000 rpm). After centrifugation for 30 minutes to 2 hours, the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed receptor protein and the like and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチド は、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウェスタンブロッ ト解析などにより定量することができる。 The receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
このようなサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことがで き、 ウェスタンプロットは公知の手段により行なうことができる。 Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by known means.
( i i) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体を上記の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕 一タンパク質またはその部分べプチドを定量することができる。 (ii) preparing a transformant expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide according to the above-mentioned method, and quantifying the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction; Can be.
細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を 変化させる化合物のスクリーニングは、 Screening for a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane is performed by:
( i) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 (30分前〜 24時間前、 好ましくは 30分前 〜 12時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前) もしくは一定時間後 (30 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 24時 間後) 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与
後一定時間経過後 (3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後) 、 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質 またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができ、 (i) A given time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, more preferably 1 hour to 12 hours before Hours to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or simultaneously with drug or physical stress. Administer test compound and administer After a lapse of a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane By quantifying
( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 (1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後) 、 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその 部分べプチドの量を定量することにより行なうことができる。 (ii) When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). After a day), it can be performed by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチド の確認は具体的には以下のようにして行なう。 The confirmation of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
( i i i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラット 、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど) に対して、 薬剤 (例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など) あるいは物理的ストレス (例 えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など) などを与え、 一定時間経 過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 (例えば、 肺、 白血球、 精巣、 脾臓など ) 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織ま たは細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う 。 細胞表層での該レセプ夕一タンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチドの量を確認する ことができる。 (iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, egrets, sheep, higgs, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, obese mice, arteries, etc.). Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) After a certain period of time, blood or a specific organ (eg, lung, leukocyte, testis, spleen, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained using the antibody of the present invention. By confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, it is possible to quantitatively or qualitatively determine the receptor protein of the present invention or a portion thereof on the cell membrane. The amount of peptide can be confirmed.
( i V ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 (ィ) 細胞膜における本発明のレセ プ夕ータンパク質またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、 本発明 のレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性 (例えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸化などを促進または抑制する活
性など) を増強させる化合物、 (口) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパ ク質またはその部分べプチドの量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減 弱させる化合物である。 (i V) It can also be confirmed by using a transformant or the like that expresses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof and performing the same procedure. The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of the receptor protein or its partial peptide of the present invention in a cell membrane. By increasing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane, the cell stimulating activity mediated by the receptor protein of the present invention (for example, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, Activity to promote or suppress phosphorylation of internal proteins (Mouth) is a compound that reduces the cell stimulating activity by reducing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound that reduces the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとするこ とができる。 When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-described pharmaceuticals containing the receptor protein of the present invention.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜やその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (60 kg として) においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜 50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O kgとして) にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (as 60 kg), one day About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
(11) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチ
ドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤 本発明のレセプタ一タンパク質は上記のとおり、 例えば、 肺または免疫機能な ど生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 細胞 膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化さ せる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防 および/または治療剤として用いることができる。 (11) The receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane As described above, the receptor protein of the present invention is thought to play some important role in vivo, for example, in the lungs or immune function, as described above. Can be Therefore, the compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つて製剤化することが できる。 When the compound is used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。 For example, the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like as needed, orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally or in the form of injections such as suspensions. For example, the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど) などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、
エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール) 、 非イオン性界面活性剤 (例、 ポリソルベート 80TM、 HCO— 50 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。 Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat. Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can. As an aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. Agent, for example, alcohol (eg, It may be used in combination with ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液) 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど) 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜やその 他の哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 Examples of the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 感染症患者 (60 kg として) においては、 一日につき約 0. 1〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜 50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 感染症患者 (6 O kgとして) にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。 The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for example, in an infectious disease patient (as 60 kg), one day About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
(12) 本発明のレセプタータンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 に対する抗体による中和 (12) Neutralization by an antibody against the receptor protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体の、 それらレセプタータンパク質などに対する中和活性とは、 すなわち、 該レセプ夕ータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味 する。 従って、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕ータンパク質の関
与するシグナル伝達、 例えば、 該レセプ夕ータンパク質を介する細胞刺激活性 ( 例えば、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 細胞内タンパク質のリン酸 化などを促進または抑制する活性など) を不活性化することができる。 したがつ て、 該レセプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予防および/また は治療に用いることができる。 The neutralizing activity of an antibody against the receptor protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof against the receptor protein or the like means an activity of inactivating a signal transduction function involving the receptor protein. I do. Therefore, when the antibody has neutralizing activity, the receptor protein Signal transduction, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (for example, activity to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, intracellular protein phosphorylation, etc.) Can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and / or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein and the like.
( 1 3 ) 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NAを有する動物の作 出 (13) Creation of animal having DNA encoding the receptor protein of the present invention
本発明の D N Aを用いて、 本発明のレセプタータンパク質等を発現するトラン スジエニック動物を作出することができる。 動物としては、 非ヒト哺乳動物 (例 えば、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) など (以下、 動物と略記する場合がある) が挙げられるが、 特に、 マウス、 ゥサ ギなどが好適である。 Using the DNA of the present invention, transgenic animals expressing the receptor protein and the like of the present invention can be produced. Examples of animals include non-human mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigeons, pigs, cats, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals). Particularly preferred are mice, egrets, and the like.
本発明の D NAを対象動物に導入するにあたっては、 該 D NAを動物細胞で発 現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラク卜として用いるの が一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを導入する場合、 こ れと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させうる各種プロ モーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へマ イク口インジェクションすることによって本発明のレセプタ一タンパク質等を高 産生する D NA導入動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ゥ ィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモー夕一 も使用しうるが、 好ましくは白血球で特異的に発現する遺伝子のプロモーターが 用いられる。 When introducing the DNA of the present invention into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of expressing in animal cells. For example, when introducing the DNA of the present invention derived from a egret, a DNA construct of the present invention derived from an animal having a high homology to the DNA is linked to a gene construct linked downstream of various promoters capable of expressing the DNA in animal cells. (4) A DNA-introduced animal that highly produces the receptor protein of the present invention or the like can be produced by injecting the fertilized egg into a fertilized egg. As the promoter, for example, a virus-derived promoter or a ubiquitous expression promoter such as metamouth thionein may be used, but a promoter of a gene specifically expressed in leukocytes is preferably used.
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの導入は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A導入後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプ夕一タンパク質等が存在することは、 作出動物の子孫が 全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ夕一タンパク質等を有す ることを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞およ び体細胞の全てに本発明のレセプタ一タンパク質等を有する。 Introduction of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal. The presence of the receptor protein of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA introduction indicates that all the offspring of the produced animal have the receptor protein of the present invention in all of the germ cells and somatic cells Means that The progeny of this kind of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
本発明の D NA導入動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し
て、 該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが導入された動物は、 本発明のレセプタータンパク質等が高発 現させられているので、 本発明のレセプ夕一タンパク質等に対するァゴニストま たはアン夕ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。 The DNA-introduced animal of the present invention was confirmed to stably maintain the gene by mating. Thus, breeding can be carried out in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. In addition, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring can obtain the DNA. Breeding to have Since the animal into which the DNA of the present invention has been introduced expresses the receptor protein or the like of the present invention at a high level, it may be used as an animal for screening an agonist or an anthony gonist against the receptor protein of the present invention or the like. Useful.
本発明の D N A導入動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D N A導入マウスの組織中の D N Aもしくは R N Aを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータンパク質 が存在する組織を分析することにより、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質等につい て分析することができる。 本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細胞 を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由 来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 ま た、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬 の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプ タータンパク質等を単離精製することも可能である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IU PAC-IUB Commiss ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分 野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。 The DNA-introduced animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture. For example, by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-introduced mouse of the present invention, or by analyzing the tissue in which the receptor protein of the present invention expressed by a gene is present, the receptor of the present invention can be analyzed overnight. It can analyze protein, etc. The cells of a tissue having the receptor protein of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from a generally difficult tissue such as brain or peripheral tissue. be able to. In addition, by using the cells, for example, a drug that enhances the function of various tissues can be selected. In addition, if there is a high expression cell line, the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom. In the present specification and the drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IU PAC-IUB Communication on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and examples thereof are described below. When there is an optical isomer of an amino acid, the L-form is indicated unless otherwise specified.
D NA デォキシリボ核酸 D NA Deoxyribonucleic acid
c D NA 相補的デォキシリポ核酸 c DNA Complementary Deoxylipo Nucleic Acid
A アデニン A adenine
T チミン T thymine
G グァニン G Guanin
C
RNA リポ核酸 C RNA liponucleic acid
mRNA ーリボ核酸 dATP リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸 mRNA-ribonucleic acid dATP phosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid SDS Sodium dodecyl sulfate G 1 y
A 1 a ァラニン A 1 a Alanin
Va 1 バリン Va 1 Valine
Le u Le u
I 1 e I 1 e
S e r セリン S e r serine
Th r スレオニン Th r threonine
Cy s Cy s
Me t メチォニン Me t Methionin
G 1 u ダル夕ミン酸 G 1 u Dalminic acid
As p ァスパラギン酸 As p Aspartic acid
L y s リジン Lys lysine
A r g アルギニン A r g Arginine
H i s ヒスチジン H is histidine
Ph e フエ二ルァラニン Ph e feniralanin
Ty r チロシン Ty r tyrosine
T r p トリプ卜ファン T r p Triple fan
P r o プロリン Pro proline
A s n ァスパラギン A s n asparagine
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸 G 1 n Glutamine p G 1 u pyroglutamic acid
終止コドンに対応する Corresponds to the stop codon
Me メチル基 Me methyl group
E t . ェチル基 E t. Ethyl group
B u プチル基 B u butyl group
Ph フエニル基 Ph phenyl group
TC チアゾリジン一 4 (R) 一力ルポキサミド基 また、 本明細 :中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。 TC thiazolidine one 4 (R) also Ichiriki Rupokisamido group, this specification: referred substituents frequently used medium, the protecting groups and reagents the following symbols.
T o s p—トルエンスルフォニル T os p—toluenesulfonyl
CHO ホルミル CHO Holmill
B z 1 B z 1
C12B z 1 2, 6—ジクロ口べンジル C1 2 B z 1 2, 6—Dichloro-opening benzyl
B om ベンジルォキシメチル Bom benzyloxymethyl
Z ベンジルォキシカルポニル Z benzyloxycarponyl
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル C 1-z 2-cyclobenzenebenzyloxycarbonyl
B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルポニル B r -Z 2 bromobenzyloxycarponyl
B o c t一ブトキシカルボニル B oc t-butoxycarbonyl
DNP ジニトロフエノ一ル DNP dinitrophenol
T r t 卜リチル T r t Trityl
B um t一ブトキシメチル Bum t-butoxymethyl
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル Fmo c N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリァゾール HOB t 1-Hydroxybenztriazole
HOOB t 3, 4ージヒドロー 3—ヒドロキシー 4一ォキソ一 HOOB t 3,4 dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1
1, 2, 3—べンゾ卜リアジン 1, 2, 3-benzotriazine
HONB : 1ーヒドロキシ— 5—ノルポルネン— 2, 3—ジカルボ キシイミド HONB: 1-hydroxy-5-norpolene-2,3-dicarboxyimide
DCC : N, N' ージシクロへキシルカルポジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。 DCC: N, N 'dicyclohexyl carposimide The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
配列番号: 1 SEQ ID NO: 1
本発明のヒト由来新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質 PTB 2184のアミ ノ酸配列を示す。 1 shows the amino acid sequence of the human-derived novel transmembrane receptor uniform protein PTB 2184 of the present invention.
配列番号: 2 SEQ ID NO: 2
本発明のヒ卜由来新規膜貫通型レセプター様タンパク質 pTB 2184をコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human transmembrane receptor-like protein pTB2184 of the present invention.
配列番号: 3 SEQ ID NO: 3
本発明のヒト由来新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質 pTB 2185のアミ ノ酸配列を示す。 1 shows the amino acid sequence of the novel human transmembrane receptor uniform protein pTB2185 of the present invention.
配列番号: 4 SEQ ID NO: 4
本発明のヒト由来新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質 pTB 2185をコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human transmembrane receptor uniform protein pTB2185 of the present invention.
配列番号: 5 SEQ ID NO: 5
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す 配列番号: 6 This shows the base sequence of primer 1 used in the PCR reaction in Example 1 below. SEQ ID NO: 6
以下の実施例 1における P C R反応で使用した 一 2の塩基配列を示す The following shows the nucleotide sequence of 12 used in the PCR reaction in Example 1.
後述の実施例 1で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i D H5 α/ρΤΒ 2184は、 2000年 12月 14日から大阪府大阪市淀川区十 三本町 2丁目 17番 85号 (郵便番号 532 - 8686) の財団法人 ·発酵研究 所に寄託番号 I FO 16514として、 平成 12年 12月 25日から茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (旧 通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 (ΝΙ ΒΗ) ) に寄託番号 FERM BP— 7415として 寄託されている。
後述の実施例 1で得られた形質転換体 E s che r i ch i a c o 1 i D H5 a/pTB 2185は、 2000年 12月 14日から大阪府大阪市淀川区十 三本町 2丁目 17番 85号 (郵便番号 532 - 8686) の財団法人 ·発酵研究 所に寄託番号 I FO 16515として、 平成 12年 12月 25日から茨城県つ くば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (旧 通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所 (NIBH) ) に寄託番号 FERM BP— 7416として 寄託されている。 実施例 The transformant E scherichiacoli D H5 α / ρΤΒ 2184 obtained in Example 1 described below has been used since December 14, 2000, 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (postal code 532-8686).・ Deposited with the Fermentation Research Institute as IFO 16514, 1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref. Since December 25, 2000 1 Independent administrative agent of Chuo No. 6 (zip code 305-8566) Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology (ΝΙ ΒΗ)) as deposit number FERM BP-7415 The transformant Escherichiacoa 1 iD H5a / pTB 2185 obtained in Example 1 described below has been used since December 14, 2000, No. 2-17-17 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan. (Postal code 532-8686) Deposited with Fermentation Research Institute as IFO 16515 1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture since December 25, 2000 (Postal code 305-8566) It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (formerly National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) under the deposit number FERM BP-7416. Example
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子は、 モレキュラー ' クロ一ニング(Molecular cloning)に記載されている方法に従った。 実施例 1 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the gene using Escherichia coli followed the method described in Molecular'cloning (Molecular cloning). Example 1
ヒト末梢血白血球由来膜貫通型レセプ夕一様夕ンパク質をコードする c D N A のクローニングと塩基配列の決定 Cloning and Nucleotide Determination of cDNA Encoding a Transmembrane Receptor from Human Peripheral Blood Leukocytes.
ヒト末梢血白血球 cDNA (CLONTECH社) を铸型とし、 2個のプライ マ一、 プライマ一 1 (配列番号: 5) およびプライマー 2 (配列番号: 6) を用 いて PC R反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 cDNA 5 1を 铸型として使用し、 P f u Turbo DNA Po l yme r as e (ST RATAGENE社) 1 /i 1量、 プライマ一 1 (配列番号: 5) およびプライマ 一 2 (配列番号: 6) を各 0. 5 M、 dNTP sを 200 M、 および酵素に 添付のバッファ一を 10 1加え、 I O O Iの液量とした。 PCR反応は、 9 6で · 1分の後、 96°C · 15秒、 72°C · 1分 30秒のサイクルを 5回、 次に 96°C' 15秒、 65 · 30秒、 72 °C · 1分のサイクルを 30回繰り返し、 最後に 72°C · 7分の伸長反応を行った。 次に該 PC R反応産物の 3 ' 末端への アデニン付加反応を行った。 まずァガロースゲル電気泳動にて 912塩基対の該 PCR反応産物を精製した後、 これを該反応における铸型として使用した。 該反
応における反応液の組成は、 上記精製済み該 PCR反応産物 1/10量、 ExT a q DNA P o l yme r a s e (宝酒造) 0. 1 1、 dNTP sを 50 μΜ および酵素に添付のバッファ一を 5 1加え、 30 1の液量とした。 ァ デニン付加反応は、 72°C · 15分で行った。 該 3' 末端アデニン付加済み PC R反応産物を DNA L i g a t i on K i t V e r . 2 (宝酒造) の処方 に従い、 プラスミドベクタ一 P CR 2. 1 ( I n V i t r o g e n社) へサブク ローニングした。 これを大腸菌 DH 5 αに導入し、 cDNAを持つクロ一ンをァ ンピシリンを含む L B寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した 結果、 新規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質をコードする 2種類の cDN Aの塩 基配列 (配列番号: 2および配列番号: 4) を得た。 配列番号: 2で表される D NAの塩基配列がコードするアミノ酸配列 (配列番号: 1) を含有する新規膜貫 通型レセプ夕一様タンパク質を pTB 2184と命名した。 配列番号: 4で表さ れる DNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列 (配列番号: 3) を含有する新 規膜貫通型レセプ夕一様タンパク質を pTB 2185と命名した。 さらに、 それ らの形質転換体を、 大腸菌 (E s c he r i c h i a c o l i) DH 5 αΖρ ΤΒ 2184および大腸菌 (E s c he r i c h i a c o l i) DH 5 «/p TB 2185とそれぞれ命名した。 A human peripheral blood leukocyte cDNA (CLONTECH) was used as type II, and a PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6). The composition of the reaction solution in the reaction was as follows: cDNA 51 was used as type III, Pfu Turbo DNA Polymerase (ST RATAGENE) 1 / i 1 amount, Primer 1 (SEQ ID NO: 5) and Primer 1 (SEQ ID NO: 6) was added to each of 0.5 M, dNTPs was added to 200 M, and the buffer attached to the enzyme was added to 101, thereby obtaining the IOOI liquid volume. The PCR reaction was performed at 96 for 1 minute, followed by 5 cycles of 96 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, then 96 ° C for 15 seconds, 6530 seconds, and 72 ° C. The cycle of C · 1 minute was repeated 30 times, and finally, extension reaction at 72 ° C · 7 minutes was performed. Next, an adenine addition reaction was performed on the 3 ′ end of the PCR reaction product. First, the PCR reaction product of 912 base pairs was purified by agarose gel electrophoresis, and this was used as type 铸 in the reaction. The anti The composition of the reaction mixture in the reaction was 1/10 of the purified PCR reaction product described above, ExTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo) 0.11, dNTPs 50 μΜ, and buffer attached to the enzyme 5 1 In addition, the liquid volume was set at 301. The adenine addition reaction was performed at 72 ° C. for 15 minutes. The PCR reaction product to which the 3′-terminal adenine had been added was subcloned into a plasmid vector PCR 2.1 (In Vitrogen) according to the protocol of DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). This was introduced into Escherichia coli DH5α, and clones having cDNA were selected in LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, two nucleotide sequences (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) of two kinds of cDNAs encoding a novel transmembrane receptor uniform protein were obtained. The novel transmembrane receptor uniform protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence of DNA represented by SEQ ID NO: 2 was named pTB2184. The novel transmembrane receptor uniform protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) encoded by the nucleotide sequence of the DNA represented by SEQ ID NO: 4 was named pTB2185. The transformants were named Escherichia coli DH5αΖρΤΒ2184 and Escherichia coli DH5 «/ pTB2185, respectively.
pTB 2185のアミノ酸配列では、 pTB 2184のアミノ酸配列の 9番目 の Th rが Me tに、 140番目の L e uが A r gにそれぞれ置換されている。 また、 pTB 2185をコードする DNAの塩基配列では、 pTB2184をコ ードする DNAの塩基配列の 26番目の Cが Tに、 419番目の Tが Gにそれぞ れ置換されている。 In the amino acid sequence of pTB2185, the ninth Thr in the amino acid sequence of pTB2184 is replaced with Met, and the 140th Leu is replaced with Arg. In the nucleotide sequence of the DNA encoding pTB2185, the C at the 26th position in the nucleotide sequence of the DNA encoding pTB2184 is substituted with T, and the T at the 419th position is substituted with G.
pTB 2184の疎水性プロッ卜図を 〔図 1〕 に、 PTB2185の疎水性プ ロット図を 〔図 2〕 にそれぞれ示す。 産業上の利用可能性 The hydrophobic plot of pTB2184 is shown in [Fig. 1], and the hydrophobic plot of PTB2185 is shown in [Fig. 2]. Industrial applicability
本発明の膜貫通型レセプ夕一様タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩、 該レセプ夕一タンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチド (例えば、 DNA、 RN Aおよびそれらの誘導体) は、 ①リガンド (ァゴ
二スト) の決定、 ②抗体および抗血清の入手、 ③組換え型レセプタータンパク質 の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系の開発と医薬品 候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド ·レセプターとの比 較にもとづいたドラッグデザィンの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプロ一ブゃ P C Rプライマ一の作成のための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺 伝子治療剤等の医薬等として用いることができる。
The transmembrane receptor uniform protein or its partial peptide or a salt thereof of the present invention, the polynucleotide encoding the receptor protein or its partial peptide (for example, DNA, RNA and their derivatives) are as follows: Ligand (ago 2) Acquisition of antibodies and antisera, 3) Construction of a recombinant receptor protein expression system, 4) Development of a receptor binding Atsushi system using the same expression system and screening of drug candidate compounds, 4) Structure Implementation of drug design based on comparison with chemically similar ligands / receptors, に お け る probes in genetic diagnosis ゃ reagents for the preparation of PCR primers, ⑦production of transgenic animals or 治療 gene therapy It can be used as a drug such as a drug.