+

WO2002046427A1 - Nouvelle formate deshydrogenase et son procede de production - Google Patents

Nouvelle formate deshydrogenase et son procede de production Download PDF

Info

Publication number
WO2002046427A1
WO2002046427A1 PCT/JP2001/010569 JP0110569W WO0246427A1 WO 2002046427 A1 WO2002046427 A1 WO 2002046427A1 JP 0110569 W JP0110569 W JP 0110569W WO 0246427 A1 WO0246427 A1 WO 0246427A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formate dehydrogenase
genus
dna
polypeptide
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/010569
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuko Takaoka
Hirokazu Nanba
Original Assignee
Kaneka Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corporation filed Critical Kaneka Corporation
Priority to AU2002224136A priority Critical patent/AU2002224136A1/en
Priority to JP2002548144A priority patent/JP4287144B2/ja
Publication of WO2002046427A1 publication Critical patent/WO2002046427A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)

Definitions

  • Formic acid dehydrogenase (enzyme number [EC 1.2.1.2]) is composed of carbon dioxide and reduced nicotine adenine dinucleotide (NADH) from formic acid and oxidized nicotine adenine dinucleotide (NAD). It can be used for coenzyme regeneration in NADH-dependent enzymatic reactions because it catalyzes the reaction that produces methane.In this case, inexpensive formic acid can be used, and by-products are carbon dioxide and do not accumulate in the system. It is a useful enzyme with a point. Furthermore, enzymes with small Km values for formic acid and NAD are effective industrially at low substrate concentrations, and can be used for specific microquantification of formic acid, and are industrially useful enzymes.
  • the present invention is a polypeptide having the following physicochemical properties:
  • the present invention also relates to any one of the following polypeptides (a) to (c): (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing: (b) SEQ ID NO in the sequence listing Polypeptide having one or more amino acids substituted, inserted, deleted and / or or added in the amino acid sequence shown in 1 and having formate dehydrogenase activity:
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing and having formate dehydrogenase activity.
  • the present invention is also a DNA encoding the above polypeptide.
  • the present invention is also a recombinant plasmid containing the above-mentioned DNA.
  • the present invention also relates to a transformant obtained by transforming a host microorganism with the above DNA or recombinant plasmid.
  • FIG. 1 shows a restriction map of a recombinant plasmid pFAO01 containing a formate dehydrogenase gene according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the Km value for formate of formate dehydrogenase which is one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows the range of the action temperature and the optimum temperature of the formate dehydrogenase of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the range of the action pH and the optimum pH of the formate dehydrogenase of one embodiment of the present invention.
  • H FIG. 6 is a graph showing the temperature stability of formate dehydrogenase which is one embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the pH stability of formate dehydrogenase which is one embodiment of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having formate dehydrogenase activity, and is characterized by having the following physicochemical properties.
  • NAD is used as a coenzyme to oxidize formic acid to produce carbon dioxide
  • the formate dehydrogenase activity of the polypeptide is determined by the NADH at 30 ° C or 4 ° C in 0.1 M phosphate buffer (I) H7) containing 50 OmM of sodium formate and 5 mM of NAD. This is done by measuring the increase in absorbance at 340 nm with production.
  • the action temperature and the action pH are determined by measuring the activity while changing the temperature or pH under the above-mentioned activity measurement conditions.
  • the temperature stability was determined by measuring the residual activity after treating the polypeptide at each temperature for 10 minutes, and the pH stability was determined by treating the polypeptide at 6 ° C for 20 hours at each pH. It is determined by measuring the residual activity.
  • the molecular weight is determined by gel filtration chromatography.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained from a microorganism having formate dehydrogenase activity. Therefore, the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention is methanol-assimilating A bacterium or a formic acid assimilating bacterium is suitable, and is not particularly limited. Examples thereof include microorganisms belonging to the genus Ancylo obacte 1-, and among them, Ancylobacter aquaticus Preferred, more preferably, Ancylobacteraquaticus KNK 607 strain.
  • the aforementioned Ancylobacteraquaticus KNK 607M strain is a strain isolated and obtained by the present inventors in the present invention, and became independent on October 20, 2012 under the accession number FERM BP-7335. It has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (Zip code 305-8566, Tsukuba East 1-chome, Ibaraki Pref., Japan 1-6-1 Chuo No. 6) under the Budapest Treaty. The bacteriological properties of Ansilobacter aquaticus (Ancylobabacteraquaticus) KNK607M are shown below. 1. Form
  • Adipic acid one
  • an aqueous medium containing nutrients such as a methanol and nitrogen source as main carbon sources and inorganic salts is used.
  • nutrients such as a methanol and nitrogen source as main carbon sources and inorganic salts
  • organic micronutrients such as vitamins and amino acids often produces favorable results.
  • a nitrogen source ammonia salt, aqueous ammonia, ammonia gas, urea, yeast extract, peptone, Corn's tip liquor and the like are used.
  • the inorganic salts phosphates, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, calcium salts, iron salts, sulfates, chlorine and the like are used.
  • the cultivation can usually be performed in the temperature range of 20 ° C to 40 ° C, but preferably 25 ° C to 37 ° C. Further, pH can be cultured at 5.5 to 9.5, but 7 to 9 is preferable. In addition, any of a batch method and a continuous method may be used.
  • the cells are collected from the culture medium by centrifugation or the like after completion of the culture, and the cells are disrupted by means such as ultrasonic disruption to obtain a crude enzyme solution.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by purifying the crude enzyme solution by a salting out method, a column chromatography method, or the like.
  • the polypeptide of the present invention may be a natural enzyme obtained from a microorganism as described above, or may be a recombinant enzyme produced using a gene recombination technique.
  • Examples of the natural enzyme include polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • polypeptide of the present invention is characterized in that one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be a polypeptide comprising an acid sequence and having formate dehydrogenase activity. Further, the polypeptide of the present invention may be a polypeptide having an amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having formate dehydrogenase activity. Les ,.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, inserted, deleted and / or added is obtained by substituting or inserting an amino acid by a method well known to those skilled in the art such as a partially specific mutagenesis method. Can be obtained by deletion and / or addition. Specifically, it is described in documents such as Nucl e i c A C i d R e s. 10, 6487 (1 982) and Me t od d s in En zymo 1 og y 100, 448 (1 983).
  • a polypeptide having a formate dehydrogenase activity refers to 10% or more, preferably 40%, of the case where a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used in the above-mentioned activity measurement conditions. It refers to a polypeptide having an activity of 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably.
  • the DNA of the present invention may be a DNA encoding the above polypeptide. It may be the DNA represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or one or several bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 may be substituted, inserted, deleted, or deleted.
  • the DNA may be a DNA having an added nucleotide sequence. Alternatively, it may be DNA having a nucleotide sequence showing 90% or more, preferably 95% or more homology with the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the “base sequence in which one or several bases have been substituted, inserted, deleted and / or added” refers to a protein nucleic acid enzyme extra gene amplification PCR method TAKKAJ 35 (17), 295 1 -3 1 78 (1 990) or Henry A. Er 1 ic li, edited by Ikuyuki Kato, translation, insertion, deletion and Z or addition by methods well known to those skilled in the art as described in PCR Technology 1 (1 990). It means a nucleotide sequence in which a possible number of bases are substituted, inserted, deleted and / or added.
  • the homology between the amino acid sequence and the base sequence is determined by the software Cement (S oft wa re D evelo pme nt) manufactured by softwares der Ru Jieneteikusu (GENETYX) DNA (formate dehydrogenase gene) of the c the present invention that can be calculated by comparing the sequences using the previously described It can be obtained from a microorganism having such a formate dehydrogenase activity. To obtain the target DNA, for example, the following method can be used.
  • the amino acid sequence at the amino terminus of formate dehydrogenase purified from a microorganism having formate dehydrogenase activity is determined using a gas-phase protein sequencer or the like.
  • a DNA primer designed based on this amino acid sequence and a DNA primer designed based on the sequence of a highly homologous portion in the base sequence of a known formate dehydrogenase gene are synthesized.
  • the chromosomal DNA is isolated from the microorganism that is the source of formate dehydrogenase.
  • the chromosomal DNA is obtained by dissolving the cultured cells with lysozyme or a surfactant, depositing the extracted DNA with ethanol, attaching it to a glass rod, and dissolving it in an appropriate buffer. It can be obtained by purification several times repeatedly (for example, see the Marmur method described in Mo. Bio1, 3, 208 (1961)).
  • a part of the target gene can be obtained by performing PCR using this chromosomal DNA as a type III using the above primers.
  • the chromosomal DNA obtained previously with appropriate restriction enzymes such as BamHI and PstI was digested with agarose gel electrophoresis, followed by PCR.
  • Southern hybridization is performed using the obtained DNA fragment of the formate dehydrogenase gene as a probe, and a DNA fragment that contains the formate dehydrogenase gene and is not cleaved by the restriction enzyme in the formate dehydrogenase gene Is detected on the gel.
  • the DNA obtained by cyclization using T4 DNA ligase or the like is converted into type II, and the N-terminal side of the enzyme of the partial formate dehydrogenase gene obtained previously by PCR.
  • a DNA primer is synthesized in the outward direction of the enzyme gene, and PCR is performed using these primers. A DNA fragment encoding the terminal side and the C-terminal side can be obtained.
  • a DNA fragment containing the full length of the formate dehydrogenase gene can be obtained.
  • the obtained DNA fragment is confirmed to contain the full length of the target formate dehydrogenase gene by molecular weight measurement and partial base sequence analysis.
  • a recombinant plasmid can be obtained by ligating the obtained DNA fragment containing the formate dehydrogenase gene with vector DNA using T4 DNA ligase or the like.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the formate dehydrogenase gene inserted into the vector was analyzed to confirm that there was a base encoding the N-terminal amino acid sequence of formate dehydrogenase.
  • the translation initiation site is determined from this, and the base sequence is homologous to the known formate dehydrogenase gene, and the encoded protein matches the protein molecular weight by electrophoresis, using the open codon until the stop codon as an open reading frame. Make sure that it is the target gene.
  • a transformant By using the thus obtained DNA or a recombinant plasmid obtained by incorporating the DNA into a vector, a transformant can be obtained by transforming a host microorganism.
  • hosts include the genus Escherichia, the genus Pseudomonas, the genus Flavobacterium, the genus Bacillus, and Ser1-atia.
  • a microorganism belonging to the genus can be used, and as a vector, a plasmid, phage or a derivative thereof derived from a microorganism capable of autonomous replication in the above host can be used.
  • Escherichiacoli it is preferable to use Escherichiacoli as a host microorganism and a vector capable of autonomous replication in the microorganism as a vector.
  • Escherichiacoli HB101 was transformed using the recombinant plasmid pFAO01 in which the DNA obtained as described above was integrated into the pUC19 vector, Transformant Escherichia coli HB101 (pFA01) can be obtained.
  • the transformant Escherichiacoli HB101 (pFA001) obtained by the present invention was obtained on October 20, 2012 (20Q0) under the accession number F ERM BP-7334. It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (Postal code 305-8566, Tsukuba East 1-chome, Ibaraki, Japan 1-6-1 Central No. 6) under the Budapest Treaty.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • a vector modified to have a strong structural promoter to increase the production of the enzyme can be used.
  • Production of formate dehydrogenase by the transformant obtained in the present invention may be carried out by culturing using a normal medium.
  • the medium used for the culture may be a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source and nutrients such as inorganic salts. Addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids to this often results in favorable results.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose and sucrose; organic acids such as acetic acid; Alcohols and the like are appropriately used.
  • As the nitrogen source ammonia salt, ammonia water, ammonia gas, urea, yeast extract, peptone, corn 'tea liquor and the like are used.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, calcium salts, iron salts, sulfates, chlorine and the like are used.
  • the cultivation can be performed in a temperature range of 25 ° C to 40 ° C, but a temperature of 25 ° C to 37 ° C is particularly preferred.
  • the pH can be cultured at 4 to 8, but is preferably at 5 to 7.5.
  • any of a batch culture method and a continuous culture method may be used.
  • Example 1 Acquisition of Ansilobacter aquaticus KNK607M strain Ancylobacteraquaticus KNK607M strain which produces formate dehydrogenase at a high level of the present invention is isolated as follows. did. Suspension of soil samples collected from various places is suspended in 0.9% saline solution, and the supernatant is inoculated into 10 ml of a liquid medium with the composition shown in Table 1 using methanol as a single carbon source, and inoculated at 1% to 30 °. C. The cells were cultured aerobically with shaking.
  • the cells obtained by centrifuging 7 ml of the culture solution of the selected bacteria were suspended in 0.7 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7), sonicated, and centrifuged.
  • the supernatant was obtained as a crude enzyme solution.
  • Measurement of formate dehydrogenase activity of the crude enzyme solution was performed using sodium formate 500 mM, NAD The measurement was carried out by measuring the increase in absorbance at 340 nm at 30 ° C. in a 0.1 M phosphate buffer (pH 7) containing the following.
  • the protein was quantified by the Bradford method using BSA as a standard protein (see Anal. Biochem., Vol. 72, 248, 1976).
  • the formate dehydrogenase-active strain was purified from the culture solution by the monocolony method, and the resulting purified strain was cultured in the same manner as described above to prepare a crude enzyme solution. Thereafter, formate dehydrogenase activity and protein concentration were measured. Then, the specific activity of the crude enzyme solution of each strain was compared, and as a high specific activity strain, Ancylobacteraquaticus KNK 607M strain (FERM BP-7334) was obtained.
  • Ancillobacter aquaticus (Ancylobaccteraquaticus) A colony of the KNK 607M strain was inoculated into 10 ml of a medium having a composition excluding formic acid from the composition shown in Table 2, and aerobically shaken at 30 ° C for 3 days. This culture solution was inoculated at 1% of the medium volume into 100 ml of the main culture medium in Table 2 per flask and cultured aerobically with shaking at 30 ° C for 4 days.
  • This fraction was dissolved in a 1 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 1 DTT and EDTA, dialyzed with the same buffer, and subjected to DEA ES epharose (Pharmacia) column chromatography. After washing with, elution was performed with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.2) containing 1 mM DTT and EDTA, and the active fraction was collected. Ammonium sulfate was added to the mixture to 25% saturation, then applied to TSKgel Phenyl Toyopearl 650M (manufactured by Tosoichi Co., Ltd.), and subjected to column chromatography.
  • the Km values for formic acid and NAD were examined under the conditions for measuring the specific activity (30 ° C.).
  • the Km value of formic acid was measured by changing the concentration of sodium formate under the conditions of NAD 5 mM.
  • the activity was measured under a condition of 500 mM PAD while changing the NAD concentration. From the results shown in FIG. 2, the Km value for formic acid was 2.42 mM, and the Km value for NAD was 0.057 from FIG.
  • the range of action pH and the optimum pH were examined under the conditions for measuring the specific activity (3 CTC).
  • the relative activity at each pH assuming that the activity at pH 6.3 is 100%, is shown in FIG.
  • This enzyme showed a relative activity of 3% or more in the range of pH 5 to 11, and particularly a relative activity of 80% or more in the range of pH 5.5 to 9.5. From this, the action pH was set to 5 to 11, and the optimum pH was set to 5.5 to 9.5.
  • the temperature stability of the enzyme was examined by measuring the residual activity of the enzyme in 0.1 M phosphate buffer (pH 7) after holding at each temperature for 10 minutes. As a result, as shown in FIG. 6, the residual activity was 80% or more at a temperature of 50 ° C. or less, which was stable.
  • the molecular weight was determined by gel filtration chromatography method to be about 1.0 X 10
  • a DNA primer having the sequence (Primer-6) the DNA between the sequences is amplified by PCR to obtain a DNA fragment (SEQ ID NO: 2) containing the entire length of the formate dehydrogenase gene. I got it. From the analysis of the molecular weight and a part of the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment, it was confirmed that the full length of the formate dehydrogenase gene (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing) was included.
  • the DNA fragment containing the formate dehydrogenase gene obtained in Example 4 was cleaved with restriction enzymes SphI and EcoRI, and vector plasmid pUC19 and T4DNA ligase cut with the same enzymes were used.
  • a plasmid pFAO01 represented by the restriction map shown in FIG. 1 and containing the formate dehydrogenase gene was obtained.
  • the FDH gene in the figure represents the formate dehydrogenase gene of the present invention.
  • nucleotide sequence of the DNA fragment containing the full length of the formate dehydrogenase gene obtained in this manner is deduced from the nucleotide sequence in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing and the nucleotide sequence of the open reading frame in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
  • SEQ ID NO: 1 Pointing out toungue
  • Transformation was performed by mixing the plasmid pFA001 obtained in Example 5 with competent cells of Escherichiacoli HB101 strain, and plating was performed on an agar medium shown in Table 3. Then, a transformant containing the recombinant DNA containing the formate dehydrogenase gene was obtained as a colony. (Table 3)
  • Phosphorus was added after sterilization.
  • the cells are collected from the resulting culture by centrifugation, suspended in 0.1 M phosphate buffer (PH 7), disrupted by ultrasonication, and centrifuged to remove insoluble matter from the cells.
  • 0.1 ml of the obtained enzyme solution was added to 11 ⁇ 4 formic acid 1 ⁇ & (0.1 M phosphate buffer, pH7) 1.5 ml, 0.1 M AD 0.15 ml, 0.1 M phosphoric acid.
  • the present invention Since the present invention has the above-mentioned constitution, it has a high specific activity, a small Km value for formic acid and NAD, a wide range of temperature stability and pH stability, and a wide range of action pH and temperature.
  • a formate dehydrogenase suitable for industrial use and a method for producing the same can be provided.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明細書 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 技術分野
本発明は、 ギ酸脱水素酵素活性を有する新規なポリペプチド、 その遺伝子、 及 び、 当該ポリべプチドを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用い たギ酸脱水素酵素の製造方法に関するものである。 背景技術
ギ酸脱水素酵素 （酵素番号 [EC 1. 2. 1. 2] ) は、 ギ酸と酸化型ニコチ ンァデニンジヌクレオチド （以下、 NAD) より、 二酸化炭素と還元型ニコチン アデニンジヌクレオチド （以下、 NADH) を生成する反応を触媒することから、 NADH依存型の酵素反応における補酵素再生に利用でき、 この場合、 安価なギ 酸を利用できること、 副産物が二酸化炭素であり系内に蓄積しないことなどの利 点をもつ有用な酵素である。 さらに、 ギ酸、 NADに対する Km値が小さい酵素 は低基質濃度で有効に作用し、 また、 ギ酸の特異的な微量定量へも利用可能であ る等、 産業上有用な酵素である。
ギ酸脱水素酵素は、 高等植物、 メタノール資化性酵母、 細菌等においてその存 在が知られている p 酵素が精製され性質が調べられているものとしては、 高等植 物であるェンドゥ豆由来の酵素 （ P i s u m s a t i v u m： J . B i o c h e m. , v o l . 77, 845, 1 9 75) や、 メタノール資化性酵母であるキ ャンディダ ·ボイディ二 （C a n d i d a b o i d i n i i : E u r . J . B i o c h em. , v o l . 6 2， 1 5 1 , 1 976) 、 キヤンディダ · メチリカ (C a n d i d a me t h y l i c a : E u r . J . B i o c h em. , ν ο 1. 1 52, 65 7, 1 98 5) 、 キヤンディダ ' メタノリ力 （C a n d i d a me t h a n o l i c a : FEMS M i c r o b i o l . L e t t. , v o 1. 48, 1 39, 1 98 7 ) 、 クロイツケラ ' スピーシ一ズ （K 1 o e c k e r a s p . ： A g r i c . B i o l . C h em. , v o l . 38, 1 1 1 , 1 974) 、 ピキア ·パス トリス （P i c h i a p a s t o r i s : v o l . 4 ■7, 2547, 1 983) 、 リポマイセス · メタノシルビエンシス （L i p o m y c e s me t h a n o s i l v i e n s i s :特開昭 60— 24 1 88 7号 公報） などに由来す 酵素を挙げることができるが、 これらの酵素はいずれも、 比活性が低い、 ギ酸あるいは NADに対する Km値が大きい、 あるいは作用 pH 域が狭いなどから工業的な利用には問題を有していた。
細菌由来で精製されて性質が明らかにされている酵素もいくつか存在するが、 それぞれ工業上の利用には問題点を有している。 例えば、 シユードモナス ' スピ ーシ'一ズ 1 0 1 (P s e u d omo n a s s p . 1 0 1 ： E u r . J . B i o c h em. , v o l . 99, 569, 1 9 79参照） 、 及び、 シュ一ドモナス * ォキサフティカス (P s e u d om o n a s o x a 1 a t i c u s ： Eu r . J. B i o c h e m. , v o l . 83, 485, 1 978) 由来の酵素は、 比活 性は比較的高いが、 安定剤非存在下では不安定である。 モラキセラ .スピーシ一 ス (M 0 r a e 1 l a s p . ： J . B a c t e r i o l . , v o l . 1 70, 3 1 89, 1 988, 特開昭 63— 3 1 3580号公報） 由来の酵素は、 比活性 が低くギ酸に対する Km値が大きレ、。 ハイホマイクロビゥム 'スピーシーズ （H y p h om i c r o b i um s p . ：特開 2000— 78970号公報、 1 9 99年農芸化学会大会発表、 1 9 99年農芸化学会大会講演要旨 234ページ） 由来の酵素は、 比活性が低く作用 pH域が狭い。 また、 パラコッカス ' スピーシ ーズ （P a r a c o c c u s s p . ：特開平 3— 6 148 1号公報参照） はギ 酸に対する Km値が大きい。
なお、 細菌由来のギ酸脱水素酵素としては、 NADを電子受容体としないもの (酵素番号 [EC 1. 2. 2. 1 ] ) 、 例えば、 ェシエリ ヒア ' コリ （E s c h e r i c h i a c o 1 i ： J . B i o l . C h e m . , v o l . 250, 66 93, 1 9 75) 、 クロス トリジゥム 'パスツーリアナム （C 1 0 s t r i d i u m p a s t e u r i a n um : J . B a c t e r i o l . , v o l . 1 59, 3 7 5, 1 984) 、 クロス トリジゥム ' サーモアセティカム （C 1 0 s t r i d i um t h e r mo a c e t i c um : J . B i o l . C h e rn . , v o l . 25 9, 1 8 26, 1 98 3) などに由来する酵素も知られているが、 これらは 補酵素 NAD Hの再生目的には利用できない。
細菌由来の N A D依存型ギ酸脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関して ( 、 シュ一ドモナス · スヒ一、ンース'、 1 0 1 (P s e u d omo n a s s p . 10 1 : B i o t e c h n o l . Ap p l . B i o c h em. , v o l . 1 8, 20 1, 1 9 93) 、 マイコバクテリゥム 'ノ ッカェ （My c o b a c t e r i u m v a c c a e ： Ap p l . i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , v o l . 44, 479, 1 995, 特開平 1 0— 23896号公報） 、 パイ口コ ッカス KOD 1 (P y r o c o c c u s K O D 1 ：特開 2000— 699 7 1 号公報） 、 ハイホマイクロビゥム 'スピーシーズ （H y p h o m i c r o b i u m s p. ：特開 2000— 78 970号公報， 1 999年農芸化学会大会発表、 1 999年農芸化学会大会講演要旨 234ページ） 由来の遺伝子について知られ ているが、 アンシロバクタ一 （An c y l o b a c t e r) 属由来のギ酸脱水素 酵素遺伝子については知られていない。
アンシロバクタ一 （An c y l o b a c t e r) 属の細菌に関しては、 完全菌 体の状態でギ酸脱水素酵素活性があることは知られているものの （J. Ge n. A p l . M i c r o b i o l . , 27, 38 1 (1 98 1) ) 、 酵素を精製、 単離した報告や性質を明らかにした報告はこれまでになく、 また、 遺伝子の単離 についても知られていない。 発明の要約
本発明は、 上記のような従来知られているギ酸脱水素酵素の問題点、 即ち、 酵 素の生産性が低い、 比活性が低い、 ギ酸及び NADに対する Km値が大きい、 温 度安定性や p H安定性の範囲が狭い、 作用 p Hの範囲が狭い等の問題を解決し、 工業的に利用可能な優れた性質をあわせもつギ酸脱水素酵素及びその製造方法を 提供するものである。
本発明者らは上記課題に鑑み、 広く土壌よりギ酸脱水素酵素活性を有する微生 物を探索した結果、 優れた性質を有するギ酸脱水素酵素を高生産するアンシロバ クタ一 （An c y 1 o b a c t e r ) 属細菌を新たに分離した。 当該微生物から ギ酸脱水素酵素を単離、 精製し、 さらにギ酸脱水素酵素遺伝子の単離、 ならびに 宿主微生物での発現を達成し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は以下の理化学的性質を有するポリペプチドである ：
(1) 作用 ： NADを補酵素として、 ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
(2) 分子量：約 1. 0 X 1 06、
(3) ギ酸に対する Km値： 2. 4mM、
(4) NADに対する Km値： 0. 0 57 mM、
(5) 作用温度の範囲： 20° (：〜 60°CN 至適温度 45。C〜55°C、
(6) 作用 p Hの範囲： 5. 0〜 1 1. 0、 至適 p H 5. 5〜 9. 5、
(7) 温度安定性： 50°C以下、
(8) p H安定性： 4. 5〜9. 5。
本発明の提供する上記酵素は、 高い比活性を有し、 ギ酸及び NADに対する K m値が小さく、 温度安定性や pH安定性の範囲が広く、 作用 pH、 温度の範囲が 広い工業的利用に適した性質をあわせ持つ酵素である。
また、 本発明は、 以下の （a) から （c) のいずれかのポリペプチドである ： ( a ) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチド： ( b ) 配列表配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 挿入、 欠失および/ 'または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ ギ酸脱水素酵素活性を有するポリべプチド：
(c) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列と 95%以上の相同性を有する ァミノ酸配列からなり、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリぺプチド。 本発明はまた、 上記のポリぺプチドをコ一ドする DNAである。
本発明はまた、 以下の （d) から （f ) のいずれかの DNAである ：
(d) 配列表配列番号 2に示される塩基配列からなる DNA：
(e) 配列表配列番号 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置 換、 挿入、 欠失および または付加された塩基配列を有し、 かつギ酸脱水素酵素 活性を有するポリペプチドをコードする DNA ：
( f ) 配列表配列番号 2に示される塩基配列と 90 %以上の相同性を示す塩基配 列を有し、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAC 本発明はまた、 以下の （g) から （ i ) のいずれかの DNAである ：
(g) 配列表配列番号 3に示される塩基配列からなる DNA ：
( h ) 配列表配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置 換、 挿入、 欠失および/または付加された塩基配列を有し、 かつギ酸脱水素酵素 活性を有するポリペプチドをコードする DNA ：
( i ) 配列表配列番号 3に示される塩基配列と 90%以上の相同性を示す塩基配 列を有し、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA。 また、 本発明は、 上記の DN Aを含む組換えプラスミ ドである。
また、 本発明は上記の DNAまたは組換えプラスミ ドで宿主微生物を形質転換 して得られる形質転換体である。
さらに本発明は、 上記のポリべプチドを生産する能力を有する微生物、 または 上記形質転換体を培養し、 培養物中に該ポリペプチドを蓄積せしめ、 これを採取 することからなるギ酸脱水素酵素の製造方法でもある。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミ ド p F AO 01の制限酵素地図を示す。
図 2は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素のギ酸に対する Km値を示すグ ラフである。
図 3は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素の N A Dに対する K m値を示す グラフである。
図 4は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素の作用温度の範囲と至適温度を 図 5は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素の作用 p Hの範囲と至適 p Hを 図 6は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであ る。
図 7は、 本発明の 1態様であるギ酸脱水素酵素の pH安定性を示すグラフであ る。 発明の詳細な開示
まず、 本発明のポリペプチドについて説明する。 本発明のポリペプチドは、 ギ 酸脱水素酵素活性を有するボリべプチドであって、 以下のような理化学的性質を 有することを特徴とする。
(1) 作用 ： NADを補酵素として、 ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
(2) 分子量：約 1. 0 X 1 06、
(3) ギ酸に対する Km値： 2. 4mM、
(4) NADに対する Km値： 0. 05 7 mM、
(5) 作用温度の範囲： 20°C〜60°C、 至適温度 45°C〜55°C,
(6) 作用 pHの範囲： 5. 0〜1 1. ◦、 至適 pH5. 5〜9. 5、
(7) 温度安定性： 50°C以下、
(8) pH安定性： 4. 5〜9. 5。
本発明において、 ポリぺプチドのギ酸脱水素酵素活性は、 ギ酸ナトリウム 50 OmM、 NAD 5mMを含む 0. 1Mリン酸バッファー （I〕H7) 中で、 30 °Cあるいは 4◦°CでのNADHの生成にともなう 340 nmの吸光度の増加を測 定することにより行う。
作用温度、 作用 p Hは、 上記の活性測定条件の温度または p Hを変えて活性を 測定することにより決定する。 また、 温度安定性は、 該ポリペプチドを各温度で 10分間処理した後の残活性を測定することによって、 p H安定性は、 該ポリぺ プチドを 6°Cで 20時間、 各 pHで処理した後の残活性を測定することによって 決定する。 また、 分子量はゲルろ過クロマトグラフィー法により決定する。
本発明のポリべプチドは、 ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。 従って、 本発明のポリペプチドの起源となる微生物としては、 メタノール資化性 菌あるいはギ酸資化性菌等が好適であり、 特に限定されないが、 例えばアンシロ パクター （An c y 1 o b a c t e 1- ) 属に属する微生物が挙げられ、 なかでも アンシロノくクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) が好ましく、 より好ましくはアンシロバクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) KNK 607 株ゝである。
上記のアンシロバクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) KNK 607M株は、 本発明において発明者らが分離、 取得し た菌株であり、 平成 1 2年 10月 20日に受託番号 FERM BP— 7335と して独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （郵便番号 305 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) にブタペスト 条約に基づき寄託されている。 以下に、 アンシロバクタ一 アクアティカス （A n c y l o b a c t e r a q u a t i c u s) KNK 607 M株の菌学的性質 を示す。 1. 形態
1 ) 直径 1 μ m X 3 m程度の湾曲桿菌
2) グラム染色：陰性。
運動性： なし。
4 ) 胞子の有無： なし。
5) 肉汁寒天平板培地培養でのコ ロニー形態： 円形、 全円なめらか、 凸状、 光 沢、 淡黄色
2. 培養的性質
1) 肉汁液体培養：懸濁
2) リ トマスミノレク ：一
3. 生理学的性質
1) カタラーゼ： +
2) ォキシダ一ゼ： +
3) オル二チンデカルボキシラーセ ： + 4) アルギニンジヒ ドロラーゼ ： ―
5) ゥレアーゼ ： +
6) β—ガラク トシダーゼ ： 士
7 ) 澱粉加水分解： ―
8) ェクスリ ン加水分解： +
9) ゼラチン加水分解： 一
10) O.ZF試験： 一
1 1 ) 硝酸塩還元： 一
1 2) インドール産生： 一
1 3) ブドウ糖酸性化： 一
1 4 ) 脱窒反応： +
1 5 ) MRテス ト ： 一
1 6) VPテス ト ： 一
1 7) 硫化水素の生成： +
1 8) 無機窒素源の利用 ： +
1 9) 生育性 p H6 ： +
20 ) 嫌気培養： ―
2 1 ) 基質資化能
ブドウ糖： 一
Lーァラピノース ： +
D—マンノース ： 一
D—マ /二ト一ノレ ： +
N—ァセチノレー D―グルコサミン ： 一 マノレ トース ： 一
ダルコン酸カリ ウム ： 一
n—力プリン酸： 一
アジピン酸： 一
d 1 —リンゴ酸： 一 クェン酸ナトリウム ： 一
酢酸フユニル： 一
2 2 ) 酸産生
グリセリン ： +
マンニ トーノレ： +
リボース ： +
' ソルビトーノレ： + 本発明のポリぺプチドを生産する微生物を培養する培地としては、 主炭素源と してのメタノールと窒素源、 無機塩類などの栄養素を含む水性媒体が用いられる。 さらに、 ビタミン'、 アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、 好ましい結果 が得られる場合が多い。 窒素源としては、 アンモニゥム塩、 アンモニア水、 アン モニァガス、 尿素、 酵母エキス、 ペプトン、 コーンス 'ティープ . リカーなどが 用いられる。 無機塩類としてはリン酸塩、 マグネシウム塩、 カリウム塩、 ナトリ ゥム塩、 カルシウム塩、 鉄塩、 硫酸塩、 塩素などが用いられる。
培養は、 通常温度範囲 2 0 °Cから 4 0 °Cで行えるが、 2 5 °Cから 3 7 °Cが好ま しい。 また、 p Hは 5 . 5から 9 . 5で培養できるが 7から 9が好ましい。 また、 回分式、 連続式のいずれの培養方法でもよい。
培養物からの分離精製は、 培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を 集め、 超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。 この粗酵素 液を、 塩析法、 カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、 本発明 のポリぺプチドを得ることができる。
本発明のポリぺプチドは、 上記のように微生物から取得される天然酵素であつ てもよいし、 遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。 天然酵素としては、 配列表の配列番号 1に示されるボリべプチドをあげることが できる。
また、 本発明のポリぺプチドは、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 挿入、 欠失および./または付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリぺプチドであってもよい。 また、 本発明のポリペプチドは、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列と 95% 以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有す るポリぺプチドであってもよレ、。
「 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 挿入、 欠失および/または付加されたァ ミノ酸配列」 は、 部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、 ァ ミノ酸を置換、 挿入、 欠失および/または付加することにより取得可能である。 具体的には、 Nu c l e i c A c i d R e s . 1 0, 6487 (1 982) 、 Me t h o d s i n En z ymo 1 o g y 1 00, 448 (1 983) 等 の文献に記載されている。
また、 「ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」 とは、 上記の活性測定条 件において、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドを用いた 場合の 10 %以上、 好ましくは 40 %以上、 より好ましくは 60 %以上、 さらに 好ましくは 80 %以上の活性を示すポリぺプチドのことをいう。
次に、 本発明の DN Aについて説明する。 本発明の DN Aは上記のポリべプチ ドをコ一ドする DN Aであればよい。 配列表の配列番号 2または配列番号 3で示 される DNAであっても良いし、 配列番号 2または配列番号 3で示される塩基配 列において 1若しくは数個の塩基が置換、 挿入、 欠失および/または付加された 塩基配列を有する DN Aであっても良い。 また、 配列番号 2または配列番号 3で 示される塩基配列と 90 %以上、 好ましくは 9 5 %以上の相同性を示す塩基配列 を有する DN Aであってもよい。
ここで、 「1若しくは数個の塩基が置換、 挿入、 欠失および,/または付加され た塩基配列」 とは、 蛋白核酸酵素 増刊 遺伝子増幅 PCR法 TAKKAJ 35 (1 7) , 295 1 -3 1 78 (1 990) 又は H e n r y A. E r 1 i c li編 加藤郁之進鑑訳 PCRテクノロジ一 （1 990) 等に記載の当業者に 周知の方法により置換、 挿入、 欠失および Zまたは付加できる程度の数の塩基が 置換、 挿入、 欠失および/または付加されてなる塩基配列を意味する。
なお、 ァミノ酸配列及び塩基配列の相同性は、 ソフ トゥ ア一ディべ口ップメ ント （S o f t wa r e D e v e l o pme n t) 社製のソフトウエアーであ るジエネテイクス （GENETYX) を用いて配列を比較することで計算できる c 本発明の DNA (ギ酸脱水素酵素遺伝子） は、 前述したようなギ酸脱水素酵素 活性を有する微生物から取得することができる。 目的の DNAを取得するには、 例えば以下の方法によることができる。
まず、 ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたギ酸脱水素酵素のァ ミノ末端のァミノ酸配列を、 気相プロテイン · シークェンサ一などで決定する。 このアミノ酸配列にもとづいて設計した D N Aプライマーと、 既知のギ酸脱水素 酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列にもとづいて設計した D N A プライマーを合成する。
次に、 ギ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、 染色体 DN Aを単離する。 染 色体の DNAは、 培養された細胞をリゾチーム， 界面活性剤等で溶解後、 抽出さ れた DN Aをエタノールで析出し、 ガラス棒へ付着させ、 適当な緩衝液へ溶解さ せることを数回繰り返して精製することで得られる （例えば】 . Mo 1. B i o 1. , 3, 208 (1 96 1) 記載の M a r mu r法を参照） 。
この染色体 DNAを鍀型に、 上記のプライマーを用いて P CRを行うことで、 目的の遺伝子の一部を取得できる。 次に、 目的遺伝子の全長を取得するために、 B a mH I、 P s t Iなどの適当な制限酵素で先に得た染色体 D N Aを分解した ものをァガ口ースゲル電気泳動して、 P C Rで得たギ酸脱水素酵素遺伝子の一部 の D N A断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、 ギ酸脱水 素酵素遺伝子が含まれ、 かつ、 ギ酸脱水素酵素遺伝子内で上記制限酵素により切 断されない DN A断片をゲル上で検出する。
この DNA.断片をゲルより取得した後、 T4 DNAリガーゼなどを用いて環 化させて得た DNAを鎢型に、 前に P CRで得た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵 素の N末端側、 C末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、 かつ、 酵素遺伝子の外側方向へ向けた D N Aプライマ一を合成し、 これらプライマーを 用いて P C Rを行うことで既に取得した部分遺伝子のさらに N末側と C末側をコ ードする DNA断片が取得できる。 この DNA断片の塩基配列を決定後、 酵素の N末端をコードする DN Aよりも上流、 C末端をコードする DNAより下流と推 定される DN Aの塩基配列にもとづき DN Aプライマーを作成して、 この配列の 間の DNAを PCRにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含む D NA断片を取得できる。 取得した DNA断片は、 分子量測定と一部の塩基配列の 解析により、 目的のギ酸脱水素酵素遺伝子の全長が含まれていることを確認する。 次いで、 得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片をベクター DNAと T4 DNAリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミ ドを得 ることができる。 このプラスミ ドを用いて、 ベクターに挿入したギ酸脱水素酵素 遺伝子を含む DN A断片部分の塩基配列を解析し、 ギ酸脱水素酵素の N末端アミ ノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、 また、 これより翻訳開始部位を 決定し、 終止コ ドンまでをオープンリーディングフレームとして、 この塩基配列 が既知ギ酸脱水素酵素遺伝子と相同であること、 コードされるタンパク質が電気 泳動によるタンパク質分子量と一致することなどから目的遺伝子であることを確 認する。
このようにして取得した DNA、 または該 DNAをベクターに組み込んで得ら れる組換えプラスミ ドを用いることにより、 宿主微生物を形質転換し形質転換体 を得ることができる。
宿主、 ベクターとしては、 「組換え DNA実験指針」 （科学技術庁研究開発局 ライフサイエンス課編：平成 8年 3月 22 S改定） に記載の宿主一べクタ一系を 用いることができる。 例えば、 宿主としては、 ェシエリ ヒア （E s c h e r i c h i a) 属、 シュゥドモナス （P s e u d omo n a s) 属、 フラボバクテリゥ ム (F l a v o b a c t e r i um) 属、 ノ チノレス （B a c i l l u s) 属、 セ ラチア （S e r 1- a t i a) 属、 コリネバクテリ ゥム （C o r y n e b a c t e r i um) 属、 ブレビバタテリ ゥム （B r e V i b a c t e r i urn) 属、 ァグ ロバクテリウム （A g r o b a c t e r i um) 属、 ァセトバクタ一 （A c e t o b a c t e r) 属、 クノレコノノ クタ一 (G l u c o n o b a c t e r) 属、 ラ ク トバチルス （L a c t o b a c i l l u s) 属、 ストレプトコッカス （S t r e p t o c o c c u s) 属またはストレフ。トマィセス (S t r e p t omy c e s) 属に属する微生物を用いることができ、 ベクターは上記の宿主内で自律複製 できる微生物由来のプラスミ ド、 ファージまたはその誘導体が使用できる。 なか でも、 宿主微生物としてェシエリヒア · コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) 、 ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ま しい。
—例として、 上記のようにして取得した DNAを p UC 1 9ベクターに組み込 んだ組換えプラスミ ド p F AO 0 1を用いてェシエリヒア コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 1 0 1を形質転換し、 形質転換体エシュリヒア . コ リ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 1 0 1 (p F AO 01 ) を得るこ とができる。
本発明で得られた形質転換体ェシェリ ヒア ' コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 10 1 (p F A 00 1 ) は平成 1 2年 （20 Q 0) 10月 20日 に受託番号 F ERM B P— 73 34として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一 （郵便番号 305— 8 566 日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6) にブタペスト条約に基づき寄託されている。
また、 酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように 改質したベクターを使用することもできる。
なお、 本発明で用いた組換え DNA技術は当該分野において周知であり、 例え は、 Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n (C o l d s p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, 1 989 ) Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (G r e e n e P u b l i s h i n g A s s o c i a t e s a n d W i l e y - I n t e r s c i e n c e) に記章 さ 3 てレヽる。
本発明で得られた形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産は、 通常の培地を用 いて培養を行えば良い。 培養に使用する培地としては、 炭素源、 窒素源および無 機塩類などの栄養素を含む通常の培地でよい。 これに、 ビタミン、 アミノ酸など の有機微量栄養素を添加すると、 好ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源と しては、 グルコースゃシユークロースのような炭水化物、 酢酸のような有機酸、 アルコール類などが適宜使用される。 窒素源としては、 アンモニゥム塩、 アンモ ユア水、 アンモニアガス、 尿素、 酵母エキス、 ペプトン、 コーンス ' ティープ リカーなどが用いられる。 無機塩類としてはリン酸塩、 マグネシウム塩、 力リウ ム塩、 ナトリ ウム塩、 カルシウム塩、 鉄塩、 硫酸塩、 塩素などが用いられる。 培養は温度範囲 2 5°Cから 4 0°Cで行えるが、 2 5°Cから 3 7 °Cが特に好まし い。 また、 p Hは 4から 8で培養できるが 5から 7. 5が好ましい。 また、 回分 式、 連続式のいずれの培養方法でもよい。
必要に応じてメタノール、 ギ酸、 イソプロピル一 1—チォ一 3— D—ガラク ト サイ ド （I P TG) 、 ラタ トースなどの添加などの酵素誘導のための処理を行う こともできる。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の具体的な実施例を示す。 しかし、 本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。
(実施例 1 ) アンシロバクタ一 アクアティカス KNK 6 0 7M株の取得 本発明の、 ギ酸脱水素酵素を高生産するアンシロバクタ一 アクアティカス （ An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) K N K 6 0 7 M株は以下のよ うにして分離した。 各地より採取した土壌サンプルを 0. 9 %食塩水に懸濁し、 その上清を、 メタノールを単一炭素源とする表 1の組成の液体培地 1 0 m lに 1 %植菌して 3 0 °Cで好気的に振とう培養した。
(表 1 )
メタノール 3 g
(NH4) 2 S O 5 g
KH2 P 04 2 g
K2H P 04 2 g
M g S 04 0. 5 g
N a C 1 0. 1 g C a C 1 2 0. 1 g
肉ヱキス 0. 1 g
ィース トェキス 0. 1 g
ボリぺプトン 0. 1 g
ビォチン 2 0 μ g
パントテン酸カルシゥム 2 m g
葉酸 2 μ, g
ィノシト一ノレ 1 0 m g
ナイァシン 4 0 0 yu g
pーァミノ安息香酸 2 0 0 g
ピリ ドキシン塩酸塩 4 0 0 μ g
リボフラビン 2 0 0 g
チアミン塩酸塩 4 0 0 μ g
ホウ酸 5 0 0 / g
C u S 04 4 0 g
K I 1 0 0 /i g
F e C 1 3 2 0 0 μ g
M n S O 4 4 0 0 μ g
N a 2M o O 4 2 0 0 /ュ g
Z n S O 4 4 0 0 μ g
水を加えて 1 Lとして p H 7に調整、 ォ トクレープ殺菌して使用。 ただし、 メ タノ一ルは殺菌後に添加した。 菌の生育が認められた培養液について、 6 0 0 nmの吸光度で菌濃度を測定し た。' この培養液 1. 5 m lを遠心分離して得た菌体を、 基質溶液 0. 5 m l ( 0. 1 M リ ン酸バッファー、 0. 5M ギ酸ナトリ ウム、 I mM NAD, 1 % T r i t o n X— 1 0 0、 p H 7) に懸濁し、 3 0でで 2 0時間振とうして菌 体反応を行った後、 遠心して得た上清の NADHの生成量を 3 4 0 n iTiで測定し た。 この値を菌濃度で割った値が高いものを、 ギ酸脱水素酵素高活性菌として選 択した。 次に、 選択した菌の培養液 7 m 1を遠心分離して得た菌体を 0. 7m l の 0. 1 M リン酸バッファー （ p H 7 ) に懸濁、 超音波破砕、 遠心分離して上 清を粗酵素液として得た。 粗酵素液のギ酸脱水素酵素活性の測定は、 ギ酸ナトリ ゥム 500mM、 NAD
Figure imgf000018_0001
を含む0. 1Mリン酸バッファ一 （pH7) 中で、 30°Cでの NADHの生成にともなう 340 n mの吸光度の増加を測定す ることにより行った。 また、 タンパク質の定量は B S Aを標準タンパク質として B r a d f o r d法 （An a l . B i o c h em. , v o l . 72, 248, 1 9 76参照） により行った。 次に、 粗酵素液の比活性が高いものについて培養液 よりモノコロニー法でギ酸脱水素酵素活性菌株を純化し、 得られた純化菌株を用 いて上述と同様に培養して粗酵素液を調製後、 ギ酸脱水素酵素活性、 タンパク質 濃度を測定した。 そして、 各菌株の粗酵素液比活性を比較し、 高比活性菌株とし てアンシロノくクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s) K N K 607 M株 （FERM B P— 7334) を得た。
(実施例 2) ギ酸脱水素酵素の単離 ·精製
アンシロバクタ一 アクアティカス (An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s) KNK 607M株のコロニーを、 表 2の組成からギ酸を除いた組成の 培地 10m lに植菌して 30 °Cで 3日間、 好気的に振とう培養した。 この培養液 をフラスコあたり 1 00 m lの表 2の本培養培地に培地液量の 1 %植菌して 30 °Cで 4日間、 好気的に振とう培養した。
(表 2)
メタノール 20 g
ギ酸ナトリウム 1 g
(NH4) 2S04 5 g
KH PO 2. 85 g
K 9 H P O 2. 1 5 g M g S O 4 0 5 g
N a C 1 0 1 g
C a C 12 0 1
肉エキス 0 1
ィース トエキス 0 1
ポリぺプトン 0 1 g
ピオチン 20 M g
トテン酸カルシウム 2m g
2 g
ィノシトール 10 m g
400 /i g
p ーァミノ安息香酸 200 g
ピリ ドキシン塩酸塩 400 i g
リボフラビン 200 μ g
チアミン塩酸塩 400 g
ホウ酸 500 g
C u S 04 40 μ g
K I 100 μ g
Figure imgf000019_0001
Mn SO. 400 μ g
N a 2 o O 200 / g
Z n S 04 400 /.i g
水を加えて 1 Lとして p H 7に調整、 ォートクレーブ殺菌して使用。 ただし、 メ タノ一ルとギ酸は殺菌後に添加した。 培養終了後、 遠心分離で菌体を集菌して、 I mMのジチオスレイ ト一ル （DT T) と EDTAを含む 0. 1Mリン酸バッファ一 （pH6. 2) に菌体を懸濁後、 超音波により菌体を破砕し、 これを遠心した。 上清に硫安 30〜60%飽和で塩 析する沈殿を遠心で取得した。 この画分を 1 の DTTと EDTAを含む 0. 0 1Mリン酸バッファー （pH6. 5) に溶解、 同バッファーで透析後、 DEA E-S e p h a r o s e (フアル'マシア社製） カラムクロマトグラフィーを行い、 同バッファーで洗浄後、 1 mMの DTTと EDT Aを含む 0. 1Mリン酸バッフ ァー （pH6. 2) で溶出して、 活性のあるフラクションを集めた。 これに 25 %飽和となるように硫安を加えた後、 TSKg e l Ph e n y l トヨパール 6 50M (東ソ一社製） にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、 lmA4 の DTTと EDT Aを含む 0. 1Mリン酸バッファ一 （pH6. 2) で 25〜0 %飽和の硫安のグラジェントをかけて溶出した。 得られた活性画分に 60 %飽和 となるように硫安を添加して、 遠心により得た沈殿を ImMの DTTと EDTA を含む 0. 1Mリン酸バッファー （pH6. 2) に溶解して、 同バッファーで透 析を行った。 これを、 SD S—ポリアクリルアミ ド電気泳動によって分析したと ころ、 ギ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、 酵素の純粋性が確認できた。 (実施例 3) 酵素の性質
実施例 2で得られた精製ギ酸脱水素酵素の性質を以下のように調べた。
[比活性]
得られたギ酸脱水素酵素の活性測定はギ酸ナトリ ウム 500 mM、 NAD 5 mMを含む 0. 1Mリン酸バッファー （pH7) 中で、 30。Cあるレ、は 40 °Cで の NADHの生成にともなう 340 n mの吸光度の増加を測定することにより行 つた。 このとき 1分間に 1 m 0 1の NADHを生成する酵素量を 1 u n i と 定義した。 また、 タンパク質の定量は、 B S Aを標準タンパク質として L o w r y法で行った。 精製したギ酸脱水素酵素の比活性は 9. 5 u/rngタンパク質 （ 30 °C) 、 1 7. 5 uノ m gタンパク質 （ 40 °C) であつた。
[Km値の測定]
ギ酸及び NADに対する Km値を上記比活性の測定条件下 （30°C) で調べた。 なお、 ギ酸の Km値測定にあたっては NAD 5mMの条件下、 ギ酸ナトリウム 濃度を変化させて活性を測定した。 NADの Km値測定にあたってはギ酸ナトリ ]9
ゥム 500mMの条件下、 NAD濃度を変化させて活性を測定した。 図 2に示す 結果から、 ギ酸に対する Km値は 2. 42mM, 図 3から NADに対する Km値 は 0. 05 7 であった。
[作用温度の範囲 ·至適温度]
作用温度の範囲と至適温度を上記比活性の測定条件下で調べた。 30°Cでの活 性を 1 00%とした場合の各温度での相対活性を図 4に示した。 本酵素は検討し た 20〜 60 °Cの範囲で 50。/。以上の相対活性を示し、 特に 45〜 55 °Cの範囲 で 200 %以上の相対活性を示した。 このことから、 作用温度を 20〜 60 °C、 至適温度を 45〜 55 °Cとした。
[作用 pHの範囲]
作用 pHの範囲と至適 pHを上記比活性の測定条件下 （3 CTC) で調べた。 p H 6. 3での活性を 100 %とした場合の各 p Hでの相対活性を図 5に示した。 本酵素は p H 5〜 1 1の範囲で 3 %以上の相対活性を示し、 特に p H 5. 5〜 9. 5の範囲で 80%以上の相対活性を示した。 このことから、 作用 pHを 5〜 1 1、 至適 pHは 5. 5〜9. 5とした。
[温度安定性]
本酵素の温度安定性を、 本酵素を 0. 1 Mリン酸バッファー （ p H 7 ) 中、 各 温度で 10分間保持した後の残活性を測定することで調べた。 この結果、 図 6に 示すように 50°C以下で 80%以上の残活性を示し、 安定であった。
[pH安定性]
p H安定性については以下の方法で調べた。 本酵素を、 pH4. 0-5. 5は 0. 05M酢酸バッファー、 pH5. 1〜7. 9は 0. 1Mリン酸バッファー、 p H 7. 5〜9. 5は 0. 1Mトリス HC 1ノくッファー、 pH9. 7— 1 1. 1 は 0. 1 M炭酸バッファー中で 6 °C、 20時間保持した後の残活性を測定した。 処理前の活性と比べ活性低下のない p H 6. 5での残活性を 1 00%として pH 安定性を示したのが図 7である。 本酵素は p H 4. 5〜 9. 5の間で 70 %以上 の残活性を示し、 比較的安定であった。
[分子量の測定] ゲルろ過クロマトグラフィ一法により分子量を決定したところ約 1. 0 X 1 0
6であった。
(実施例 4) ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離
まず、 実施例 1と同様の方法でアンシロバクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) K N K 607 M株を培養して得た菌体 を Ma r mu r法に従い、 リゾチーム， 界面活性剤等で溶解後、 抽出された DN Aをエタノールで析出し、 ガラス棒へ付着させ、 適当な緩衝液へ溶解させること を数回繰り返して精製して、 染色体 DN Aを調製した。 目的のギ酸脱水素酵素遺 伝子を取得するには、 まず、 精製されたギ酸脱水素酵素のァミノ末端のアミノ酸 配列を気相プロテイン . シークェンサ一などで決定して、 このアミノ酸配列にも とづいて設計した配列表の配列番号 4に示す DNAプライマー （P r i me r— 1 ) と、 既知のギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列に もとづいて設計した配列表の配列番号 5に示す DNAプライマー （P r i me r - 2) を用いて、 先に得た染色体 DNAを銬型に P CRを行った。 この結果、 目 的のギ酸脱水素酵素遺伝子の一部を取得した。
次に、 目的遺伝子の全長を取得するために、 制限酵素 S a c I、 Xb a I、 H i n d I I I、 C 1 a I N B a mH I、 P s t l、 E c oR Iで先に得た染色体 D N Aを分解したものをァガロースゲル電気泳動して、 P C Rで得たギ酸脱水素 酵素遺伝子の一部の DNA断片をプローブとしてサザンハイブリダィゼーション を行った。 この結果、 用いた制限酵素でギ酸脱水素酵素遺伝子が切断されず、 か つ、 ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片が小さいのは、 B amH I、 P s t Iで分解した場合に検出されたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むバンドであった。 こ れらの DNA断片をゲルより取得した後、 T4 DNAリガーゼを用いて環化さ せて得た、 B amH I、 P s t I分解物由来の D N Aを铸型に、 前に PC Rで得 た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵素の N末端側、 C末端側それぞれの部分に相当 する塩基配列にもとづき、 酵素遺伝子の外側方向へ向けた配列表の配列番号 6及 び 7に示す DN Aプライマー （P r i me r— 3、 P r i me r— 4) を合成し、 インバース P CRを行った。 これにより、 既に取得した酵素の部分遺伝子にはな かったさらに外側の遺伝子部分を含む DN A断片を取得した。 この DN A断片の 塩基配列を決定後、 配列表配列番号 8に示す酵素の N末端をコードする DNAよ りも上流と推定される塩基配列に制限酵素 S p h Iの切断部位を結合させた配列 をもつ DNAプライマ一 （P r i me r— 5) と、 配列表配列番号 9に示す C末 端をコードする DNAより下流と推定される塩基配列に制限酵素 E c oR I切断 部位を結合させた配列をもつ DNAプライマー （P r i me r— 6) を用いて、 この配列の間の D N Aを P C Rにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全 長を含む DNA断片 （配列表配列番号 2) を取得した。 得られた DNA断片の分 子量と一部の塩基配列の解析から、 ギ酸脱水素酵素遺伝子の全長 （配列表配列番 号 3) が含まれていることを確認した。
(実施例 5) ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミ ドの作成と遺伝子の解 析
実施例 4で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片を制限酵素 S p h I と E c o R Iで切断し、 同酵素で切断したベクタープラスミ ド p UC 1 9と T 4 DN Aリガーゼを用いて結合することで、 図 1の制限酵素地図で表され、 ギ 酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミ ド p F AO 0 1を取得した。 なお、 図中の F D H遺伝子とは、 本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。
取得したプラスミ ド p F A 00 1を用いて、 S p h I と E c o R Iの切断部位 にはさまれた DNA断片の塩基配列を解析した。 この結果、 精製したギ酸脱水素 酵素を用いて決定した N末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、 また、 これより翻訳開始部位を決定し、 終止コドンまでをオープンリーディング フレームとして、 この塩基配列が既知ギ酸脱水素酵素遺伝子と相同であること、 コードされるタンパク質が電気泳動によるタンパク質分子量と一致することを確 認した。 このようにして得られた、 ギ酸脱水素酵素遺伝子全長を含む D N A断片 の塩基配列を配列表配列番号 2に、 オープンリ一ディングフレームの塩基配列を 配列表配列番号 3に、 塩基配列より推定されるァミノ酸配列を配列表配列番号 1 に示した
(実施例 6 ) ギ酸脱水素酵素の遺伝子を含む組換え体 D N Aを用いた形質転換体 の作成
実施例 5で得られたプラスミ ド p F A 0 0 1とェシエリヒア · コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 1 0 1株のコンピテントセルを混合することで 形質転換を行い、 表 3に示す寒天培地にプレーティングして、 ギ酸脱水素酵素の 遺伝子を含む組換え体 DN Aを含有する形質転換体をコロニーとして取得した。 (表 3 )
トリプトン 1 0 g
ィース トエキス 5 g
N a C 1 1 0 g
寒天 1 5 g
アンピシリン 1 0 0 m g
脱ィオン水を加えて 1 Lとして p H 7に調製、 ォートクレーブして殺菌。 ただし.
リンは殺菌後に添加した。 得られた形質転換体のコロニーを、 表 4に示す液体培地 1 0m lに植菌後、 3 7 °Cで 20時間、 振とうして好気的に培養した。
(表 4)
トリフ。トン 1 6 g
ィース トェキス 1 0 g
N a C 1 5 g
アンピシリン 1 0 0 rn g
脱ィォン水を加えて 1 Lとして pH 7に調製。 ォートクレーブして殺菌。 ただし .
リンは殺菌後に添加した。 得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 0. 1 Mリン酸バッファー ( P H 7 ) に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、 遠心分離により菌体由来 の不溶物を除去して、 形質転換体の FDH酵素液を取得した。 得られた酵素液 0. lm lを、 11\4ギ酸1^ & (0. 1Mリン酸バッファ一中で pH7) 1. 5m 1、 0. 1 M AD 0. 1 5m l , 0. 1Mリン酸バッファー （pH7) 1. 2 5m l と混合して， 30°Cで 340 nmの吸光度変化をみたところ、 NADHの 生成による吸光度の増加が認められ、 形質転換体にギ酸脱水素酵素活性があるこ とが確認された。 産業上の利用の可能性
本発明は、 上述の構成よりなるので、 高い比活性を有し、 ギ酸及ぴ NADに対 する Km値が小さく、 温度安定性や pH安定性の範囲が広く、 作用 pH、 温度の 範囲が広い工業的利用に適したギ酸脱水素酵素とその製造方法を提供することが できる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の理化学的性質を有することを特徴とするポリぺプチド：
(1) 作用 ： NADを補酵素として、 ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
(2) 分子量：約 1. 0 X 1 06、
(3) ギ酸に対する Km値： 2. 4mM、
(4) NADに対する Km値： 0. 057 mM、
(5) 作用温度の範囲： 20°C〜60°C、 至適温度 45° (：〜 55°C、
(6) 作用 p Hの範囲： 5. 0〜 1 1. 0、 至適 p H 5. 5〜 9. 5、
(7) 温度安定性： 50°C以下、
(8) pH安定性： 4. 5〜9. 5。
2. 以下の （a) から （c) のいずれかのポリペプチド：
( a ) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチド：
(b) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 挿入、 欠失および,'"または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ ギ酸脱水素酵素活性を有するポリぺプチド：
( c ) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列と 95 %以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
3. アンシロバクタ一 （An c y 1 o b a c t e r ) 属に属する微生物に由来 する請求項 1または 2に記載のポリぺプチド。
4. 微生物が、 アンシロバクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s) KNK607 M株 （FERM B P— 7335) であ る請求項 3に記載のポリぺプチド。
5. 請求項 1から 4のいずれかに記載のポリぺプチドをコ一ドする D N A。
6. 以下の （d) から （f ) のいずれかの DNA :
(d) 配列表配列番号 2に示される塩基配列からなる DNA：
( e ) 配列表配列番号 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置 換、 挿入、 欠失および/''または付加された塩基配列を有し、 かつギ酸脱水素酵素 活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA：
( f ) 配列表配列番号 2に示される塩基配列と 90 %以上の相同性を示す塩基配 列を有し、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAC 7. 以下の （g) から （ i ) のいずれかの DNA ：
( g ) 配列表配列番号 3に示される塩基配列からなる D N A：
( h ) 配列表配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置 換、 挿入、 欠失およびノまたは付加された塩基配列を有し、 かつギ酸脱水素酵素 活性を有するポリぺプチドをコードする D N A：
( i ) 配列表配列番号 3に示される塩基配列と 90%以上の相同性を示す塩基配 列を有し、 かつ、 ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
8. 請求項 5の DNAを含む組換えプラスミ ド。
9. 請求項 6の DNAを含む組換えプラスミ ド。
10. 請求項 7の DN Aを含む組換えプラスミ ド。
1 1 p F A 00 1である請求項 8〜1 0のいずれかに記載の組換えプラス ド。
1 2. 請求項 8〜 1 1のいずれかに記載の組換えプラスミ ドで宿主微生物を形 質転換して得られる形質転換体。
1 3. 宿主微生物がェシェリ ヒア （E s c h e r i c h i a ) 属、 シュウドモ ナス （P s e u d omo n a s) 属、 フラボノ クテリ ゥム （F l a v o b a c t e r i um) 属、 バチルス （B a c i 1 1 u s ) 属、 セラチア （S e r r a t i a ) 属、 コリネバクテリゥム （C o r y n e b a c t e r i u m) 属、 ブレビバ クテリ ゥム （B r e v i b a c t e r i um) 属、 ァグロパクテリ ゥム （A g r o b a c t e r i um) 属、 ァセトノくクタ一 (Ac e t o b a c t e r) 属、 グ ノレコノパクター （G 1 u c o n o b a c t e r ) 属、 ラタ トバチルス （L a c t o b a c i 1 1 u s ) j禺、 ス トレフ トコッカス (S t r e p t o c o c c u s) 属及びス トレプトマイセス （S t r e p t omy c e s ) 属に属する微生物から 選ばれた微生物である請求項 1 2記載の形質転換体。
1 4. 宿主微生物がェシェリヒア ' コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 1 0 1である請求項 1 2又は 1 3記載の形質転換体。
1 5. 形質転換体がエシ リ ヒア . コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 1 0 1 (p FAO O l) (FERM B P— 73 34) である請求項 1 2 〜 14のいずれかに記載の形質転換体。 1 6. 請求項 1記載のポリぺプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、 培養物中に該ポリぺプチドを蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とするギ酸 脱水素酵素の製造方法。
1 7. 微生物がアンシロバクタ一 （An c y l o b a c t e r) 属に属する微 生物である請求項 1 6記載の製造方法。
1 8. 微生物がアンシロバクタ一 アクアティカス （An c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) KNK 607 M株 （FERM BP— 7 335) であ る請求項 1 7記載の製造方法。
1 9 . 請求項 1 2〜 1 5のいずれかに記載の形質転換体を培養し、 培養物中に ギ酸脱水素酵素を蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素 の製造方法。
PCT/JP2001/010569 2000-12-04 2001-12-04 Nouvelle formate deshydrogenase et son procede de production WO2002046427A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002224136A AU2002224136A1 (en) 2000-12-04 2001-12-04 Novel formate dehydrogenase and process for producing the same
JP2002548144A JP4287144B2 (ja) 2000-12-04 2001-12-04 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-368838 2000-12-04
JP2000368838 2000-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002046427A1 true WO2002046427A1 (fr) 2002-06-13

Family

ID=18838980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/010569 WO2002046427A1 (fr) 2000-12-04 2001-12-04 Nouvelle formate deshydrogenase et son procede de production

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP4287144B2 (ja)
AU (1) AU2002224136A1 (ja)
WO (1) WO2002046427A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031626A1 (fr) * 2001-10-09 2003-04-17 Kaneka Corporation Nouvelle formiate deshydrogenase tolerante aux composes halogenes et son procede de production
JP2004303601A (ja) * 2003-03-31 2004-10-28 Sharp Corp エネルギー回収システム
WO2007015511A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Kaneka Corporation Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。
WO2010067578A1 (ja) 2008-12-09 2010-06-17 株式会社カネカ 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法
US8481294B2 (en) 2009-08-03 2013-07-09 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Mutant formate dehydrogenase, gene encoding the same, and method for producing NADH
CN115672365A (zh) * 2022-08-29 2023-02-03 福州大学 一种高效温和合成氨催化剂及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOGINOVA, N.V.: "Autotrophic metabolism of methanol in microcyclus aquaticus", MIKROBIOLOGIYA, vol. 47, no. 1, 1978, pages 168 - 170, XP002909473 *
POPOV, V.O.: "NAD(+)-dependent formate dehydrogenase", BIOCHEM. J., vol. 301, no. PART 3, 1994, pages 625 - 643, XP002909477 *
POPOV, V.O.: "NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacteria pseudomonas sp. 101.1 amino acid sequence", BIOORG. KHIM., vol. 16, no. 3, 1990, pages 324 - 335, XP002909475 *
TISHKOV, V.I.: "Catarytic properties and stability of a pseudomonas sp. 101 formate dehydrogenase mutants containing Cys-255-Ser and Cys-255-Met replacement", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 192, no. 3, 1993, pages 976 - 981, XP002909476 *
URAKAMI, T.: "Electrophoretic comparison of enzymes in the gram negative methanol-utilizing bacteria", J. GEN. APPL. MICROBIOL., vol. 27, no. 5, 1981, pages 381 - 403, XP002909474 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031626A1 (fr) * 2001-10-09 2003-04-17 Kaneka Corporation Nouvelle formiate deshydrogenase tolerante aux composes halogenes et son procede de production
US7432095B2 (en) 2001-10-09 2008-10-07 Kaneka Corporation Formate dehydrogenase tolerant to halogen compounds and process for producing the same
JP2004303601A (ja) * 2003-03-31 2004-10-28 Sharp Corp エネルギー回収システム
WO2007015511A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Kaneka Corporation Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。
WO2010067578A1 (ja) 2008-12-09 2010-06-17 株式会社カネカ 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法
US8481294B2 (en) 2009-08-03 2013-07-09 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Mutant formate dehydrogenase, gene encoding the same, and method for producing NADH
CN115672365A (zh) * 2022-08-29 2023-02-03 福州大学 一种高效温和合成氨催化剂及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002224136A1 (en) 2002-06-18
JP4287144B2 (ja) 2009-07-01
JPWO2002046427A1 (ja) 2004-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPWO2002068659A1 (ja) アガラーゼおよびその遺伝子
JP3408737B2 (ja) ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子
Nanba et al. Purification and characterization of formate dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus strain KNK607M, and cloning of the gene
Yamamoto et al. Characterization of theanine-forming enzyme from Methylovorus mays no. 9 in respect to utilization of theanine production
EP1449923B1 (en) Novel formate dehydrogenase tolerant to halogen compounds and process for producing the same
JP4287144B2 (ja) 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法
JP4146095B2 (ja) 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法
JP2971218B2 (ja) ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法
JP4880859B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JPS63157986A (ja) 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法
JP2007053994A (ja) ストレプトマイセス属微生物における遺伝子高発現系
JP4245229B2 (ja) 安定なヘキソキナーゼおよびその製造法
JP5183265B2 (ja) 遺伝子高発現系
JP4415247B2 (ja) 新規なグリセロールキナーゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロールキナーゼの製造法
JP4627039B2 (ja) アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子
JP4161236B2 (ja) 新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼおよびその製造方法
US20050227325A1 (en) Recombinant polynucleotide
JP2005102511A (ja) 新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子
JP3829950B2 (ja) 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ
JP2004089052A (ja) グルコース脱水素酵素の製造方法
JP4066203B2 (ja) 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ
JP2002065270A (ja) 耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法
JP2003125784A (ja) 新規チロシン脱炭酸酵素
JPH04325086A (ja) セラチア属に属する形質転換微生物及びそれを用いるビオチンの製造方法
JP2006051034A (ja) 新規なアミダーゼ遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2002 548144

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载