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WO2002042493A1 - Procede d'essai de la sensibilite aux agents anticancereux de cellules tumorales - Google Patents

Procede d'essai de la sensibilite aux agents anticancereux de cellules tumorales Download PDF

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WO2002042493A1
WO2002042493A1 PCT/JP2001/010282 JP0110282W WO0242493A1 WO 2002042493 A1 WO2002042493 A1 WO 2002042493A1 JP 0110282 W JP0110282 W JP 0110282W WO 0242493 A1 WO0242493 A1 WO 0242493A1
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WO
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gene
tumor cells
ring
protein
expression level
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/010282
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Owa
Akira Yokoi
Junro Kuromitsu
Takatoshi Kawai
Hiroyuki Kato
Takeshi Nagasu
Original Assignee
Eisai C0. Ltd.
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Filing date
Publication date
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Priority to AU2002224096A priority patent/AU2002224096B2/en
Priority to KR1020037006971A priority patent/KR100858644B1/ko
Priority to EP01997200A priority patent/EP1336660A4/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying whether a tumor cell is sensitive to an anticancer agent.
  • a toxicity profile and maximum recommended dose are determined in a phase I study, and then a response rate (response rate) is used in a phase II study, based on tumor shrinkage. Evaluation as a drug has been made.
  • drugs with new mechanisms of action that inhibit intracellular signal transduction and angiogenesis are being actively researched and developed. It is possible that it may not be necessary to administer the maximum recommended dose close to the toxic dose for these new anticancer drugs.
  • the effect of a drug can be more appropriately judged by using the improvement of QOL (Quality of Life) and prolongation of life associated with tumor growth suppression rather than tumor shrinkage as an index.
  • QOL Quality of Life
  • the reactivity of a living organism when an anticancer drug is administered largely depends on the sensitivity of a tumor cell targeted by the drug to the drug.
  • the sensitivity of the tumor cells to the drug varies greatly from one tumor cell to another.
  • Such a difference in sensitivity results from a quantitative or qualitative difference in the target molecule of the drug or a factor related thereto, or acquisition of drug resistance.
  • tumor cells are separated from tumor tissue obtained by biopsy or the like according to a conventional method, and then treated with a drug.
  • the above-mentioned proxy marker is used to determine whether or not the tumor cells are drug-sensitive. Measuring by changing the car makes it possible to predict in advance whether or not the treatment with the drug will be effective, which is extremely useful clinically. It is important that the surrogate marker is specific for its antitumor effect and that it can be measured with high sensitivity. Specifically, quantification of changes in gene expression specific to the antitumor effect of a drug, analysis of quantitative changes in protein due to changes in gene expression, and analysis of changes in function associated with the changes, etc. Either can be this surrogate marker.
  • E7070 N- (3-chloro-7-indolyl) -1,4-benzenedisulfonamide
  • E7070 is a compound with an antitumor effect targeting the G1 phase of the cell cycle, and is currently under clinical development (Takas i O a, Hiroshi Yoshmo, Tatsuo Okauchi, Kentaro Yoshimatsu, Yoic i Ozawa, Naoko Hata Sugi, Takeshi Nagasu, Nozomu Koyanagi and Kyosuke Kitoh, J. Med. Chem, 1999, 42, 3789-3799).
  • DLBCL diffuse large B-ceU lymphoma
  • the present inventors have made E7070 and its related compounds sensitive to these anticancer drugs.
  • the present invention provides the following.
  • a method for assaying sensitivity of said tumor cells to said anticancer agent comprising the steps of:
  • a ring may have a substituent, a monocyclic or bicyclic aromatic ring,
  • Ring B may have a substituent, a 6-membered cyclic unsaturated hydrocarbon or an unsaturated 6-membered heterocyclic ring containing one nitrogen atom as a hetero atom,
  • Ring C is an optionally substituted 5-membered heterocyclic ring containing one or two nitrogen atoms
  • W is a single bond or 1 C H 2 C H—
  • X represents — N (R) — or an oxygen atom
  • Y represents a carbon atom or a nitrogen atom
  • Z represents — N (R 2 ) — or a nitrogen atom
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represent a hydrogen atom or a lower alkyl group.
  • An anticancer agent represented by the following general formula (I) is allowed to act on tumor cells removed from a cancer patient,
  • a method for assaying sensitivity of said tumor cells to said anticancer agent comprising the steps of:
  • a ring may have a substituent, a monocyclic or bicyclic aromatic ring,
  • Ring B may have a substituent, a 6-membered cyclic unsaturated hydrocarbon or an unsaturated 6-membered heterocyclic ring containing one nitrogen atom as a hetero atom,
  • Ring C is an optionally substituted 5-membered heterocyclic ring containing one or two nitrogen atoms
  • X represents —N (R) — or an oxygen atom
  • Y represents a carbon atom or a nitrogen atom
  • Z represents one N (R) one or nitrogen atom
  • RR and RR are the same or different and represent a hydrogen atom or a lower alkyl group.
  • RNA quantification reagent for use in the method according to 4, which comprises an oligonucleotide complementary to the RNA as a component.
  • Ring A may have a substituent, benzene or pyridine
  • ring B may be a benzene optionally having a substituent
  • ring C may have a substituent. 3.
  • the method according to 1 or 2 wherein the method is pyrrole, W is a single bond, and both X and Z are —NH—.
  • Figure 1 shows the cell growth inhibition curves that by the E7070 cell lines HCT116-C9, HCT116-C9- C1 N LX-1, LX-1-E2.
  • FIG. 2 shows the results of quantitative PCR analysis of gene expression fluctuations in the E7070-sensitive strain HCT116-C9.
  • FIG. 3 shows the results of quantitative PCR analysis of gene expression fluctuations in the E7070-sensitive strain LX-1.
  • FIG. 4 shows the results of quantitative PCR analysis of gene expression fluctuations in the E7070 resistant strain HCT116-C9-C1.
  • Fig. 5 shows the results of quantitative PCR of gene expression variation in E7070 resistant strain LX-1-E2. The result of the analysis is shown.
  • the assay method of the present invention is based on the point that a change in the expression level of a specific gene in a tumor cell when the tumor cell is exposed to an anticancer drug in vivo or in vitro is used as an indicator of the sensitivity of the tumor cell to the anticancer drug. Has features.
  • Tables 3 and 4 show the tumor cells extracted from a cancer patient to which the anticancer agent represented by the following general formula (I) was administered. Measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of
  • the assay method of the second aspect of the present invention comprises: 1) reacting an anticancer agent represented by the following general formula (I) on a tumor cell extracted from a cancer patient;
  • the anticancer agent in the present invention is a sulfonamide derivative and a sulfonate derivative represented by the above general formula (I).
  • the “optionally substituted monocyclic or bicyclic aromatic ring” represented by ring A is an aromatic hydrocarbon or a nitrogen atom, an oxygen atom and An aromatic hetero ring containing at least one sulfur atom, which may have 1 to 3 substituents on the ring.
  • Examples of the main aromatic rings contained in the ring A include pyrrole, pyrazole, imidazole, thiophene, furan, thiazole, Oxazolyl, benzene, pyridine, pyrimidine, virazine, pyridazine, naphthylene, quinoline, isoquinoline, phthalazine, naphthyridine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, indole, isoindole, indolizine, indazole, benzofuran, benzothiophene, benzothioxene, benzothioxene , Benzimidazole, benzopyrazole, benzothiazole and the like.
  • the aromatic ring may have 1 to 3 substituents, and when there are a plurality of substituents, they may be the same or different.
  • substituents include an amino group, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a hydroxyl group, a nitro group, a mercapto group, a cyano group, a lower alkylthio group, and a halogen group which may be substituted with a lower alkyl group or a lower cycloalkyl group.
  • Formula — a— b [where a is a single bond, one (CH 2 ) k one, -0- (CH 2 ) k —, — S—
  • R 6 N (R 6 ) -gi wherein a and g have the same meanings as above, R is a hydrogen atom or a lower alkyl group, i is a hydrogen atom, a lower alkoxy group or f (f is the same as above.
  • these alkyl groups may combine to form a 5- or 6-membered ring.
  • the ring A is a nitrogen-containing hetero ring having a hydroxyl group or a mercapto group, these groups may take the form of an oxo group or a thioxo group by forming a resonance structure.
  • ring B is partially hydrogenated Benzene or pyridine, which may have one or two substituents on the ring, and when there are two substituents, they may be the same or different .
  • ring C is a part of which may be hydrogenated, pyrrole, pyrazolyl, Imidazole, which may have one or two substituents on the ring, and when there are two substituents, they may be the same or different.
  • Examples of the substituent which the ring B and the ring C may have include, for example, a halogen group, a cyano group, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a hydroxyl group, an oxo group, a formula —C ( ⁇ ) -r (formula Wherein r represents a hydrogen atom, an amino group optionally substituted with a lower alkyl group, a lower alkyl group, a lower alkoxy group or a hydroxyl group), an amino group optionally substituted with a lower alkyl group, trifluoro Examples include a methyl group.
  • R and the lower alkyl group in the definition of the substituent which the ring A, the ring B and the ring C may have are linear or branched having 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl (amyl), isopentyl, neopentyl Group, tert-pentyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 1,2-dimethylpropyl group, n-hexyl , Isohexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group, 2,3
  • preferred groups include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group and an isoptyl group.
  • the most preferred group is a methyl group Group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group.
  • the lower cycloalkyl group in the definition of the substituent which the ring A may have means a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, such as a cyclopropyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group. be able to.
  • the lower alkoxy group in the definition of the substituent which ring A, ring B and ring C may have is a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group And an alkoxy group derived from the above lower alkyl group such as a tert-butoxy group.
  • the most preferred groups include a methoxy group and an ethoxy group.
  • the lower alkylthio group means an alkylthio group derived from the above lower alkyl group.
  • the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom.
  • the sulfonamide derivative or sulfonate derivative represented by the above general formula (I) may form a salt with an acid or a base in some cases.
  • the anticancer agent in the present invention also includes a salt of the compound represented by the general formula (I).
  • the salt with an acid include inorganic salts such as hydrochloric acid salt, hydrobromide salt, and sulfate salt, acetic acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, citric acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, p — Salts with organic acids such as toluenesulfonic acid.
  • Examples of the salt with a base include inorganic salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, and salts with organic bases such as triethylamine, arginine and lysine.
  • the anticancer agent of the present invention exhibits a strong antitumor activity, but also includes a compound which exhibits antitumor activity by undergoing metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis and conjugation in a living body. Furthermore, the anticancer agent of the present invention also includes a compound that undergoes metabolism such as oxidation, reduction, or hydrolysis in vivo to produce a compound represented by the general formula (I).
  • the tumor cells to be tested for sensitivity are not particularly limited as long as they exhibit sensitivity to the anticancer agent represented by the general formula (I).
  • tumor cells derived from colon cancer, lung cancer, breast cancer, leukemia, knee cancer, kidney cancer, melanoma, malignant lymphoma, head and neck cancer, gastric cancer, and the like are not particularly limited as long as they exhibit sensitivity to the anticancer agent represented by the general formula (I).
  • Tumor cells removed from a cancer patient include tumor cells contained in cancer tissue removed from a cancer patient.
  • the tumor cell from which the cancer patient has been removed is a cancer patient to which an anticancer agent represented by the general formula (I) has been administered in an amount capable of measuring the sensitivity of the tumor cell.
  • the tumor cells may be tumor cells removed from a cancer patient, which is usually administered in a dose of 100 to 500 mg L for 1 to 14 days.
  • the conditions under which the anticancer agent represented by the general formula (I) is allowed to act on the tumor cells removed from the cancer patient are those which allow the sensitivity of the tumor cells to be measured.
  • the conditions include culturing for 6 to 72 hours at an anticancer agent concentration of 0.01 to 10 ⁇ M in the medium.
  • the expression level of a gene can be measured by quantifying UNA, which is a gene transcription product, or protein, which is a gene product. Quantification of RNA or protein can usually be performed by extracting KNA or protein from tumor cells and quantifying RNA or protein in the extract. Hereinafter, examples thereof will be described in detail in the order of 1. RNA or protein extraction, 2. RNA quantification, and 3. Protein quantification. 1. Extraction of UNA
  • RNA or protein is extracted from a cancer tissue isolated by biopsy or the like from a patient to whom the anticancer agent represented by the general formula (e) has been administered, by the method described below.
  • RNA may be extracted according to a general RNA extraction method. For example, it may be performed using TRIZOL reagent (Life Tech Oriental) or the like according to the attached operation method. The details are as follows. Cancer tissue 50-; Add 1 ml of TRIZOL reagent to 100 mg and homogenize using Teflon homogenizer. This is centrifuged (12,000 X g, 10 minutes, ° C), and the obtained supernatant is left at room temperature for 5 minutes.
  • 0.2 ml of chloroform is added to 1 ml of the used TRIZOL reagent. This solution is shaken vigorously for 15 seconds, stirred, left at room temperature for 2-3 minutes, and then centrifuged (12,000 X g, 15 minutes, 4 ° C). After centrifugation, transfer the aqueous layer to a new tube, add 0.5 ml of isopropyl alcohol to 1 ml of the used TRIZOL reagent, leave at room temperature for 10 minutes, and centrifuge (12,000 X g, 10 minutes) , 4 ° C). The obtained precipitate is washed with 75% ethanol, air-dried, and subjected to the subsequent operation as total RNA.
  • Cancer cells are separated from cancer tissues obtained from patients by biopsy or the like according to a standard method. For example, according to Hamburger et al. (Hamburger A "Salmon SE, Kim MB, Trent JM, Soehnlen BJ, Alberts DS, and Schmidt H., Cancer Res., 38, 3438-3443, 1978), the obtained tissue is aseptically refined. Then, a cell suspension is prepared using a stainless steel mesh, a syringe needle, or a nipple mesh, etc. The cells thus obtained are placed in a suitable medium (eg, RPMI containing 10 to 15% FCS).
  • a suitable medium eg, RPMI containing 10 to 15% FCS.
  • the obtained cancer cells are incubated for an appropriate period in the presence of the anticancer agent represented by the general formula (I), preferably for 3 hours, 6 hours, 12 hours or 24 hours. More preferably, the cells are cultured for 12 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 , and RNA or protein is extracted by the following method: A soft agar culture method from a tissue obtained with a biopsy or the like to be used (Hamburger A., and Salmon SE, Science, 197, 461-463, 1977 Hamburger A., and Salmon SE, J. Clin. Invest. , 60, 846-854, 1977, Von Hoff DD, and Johnson, G.. ⁇ , Pxoc. Am. Assoc. Cancer Res., 20, 51, 1979), and it is also possible to specifically separate and use only cancer cells.
  • the anticancer agent represented by the general formula (I) preferably for 3 hours, 6 hours, 12 hours or 24 hours. More preferably, the cells are cultured for 12 hours at 37 ° C. under 5% CO 2
  • the extraction of ENA from cancer cells may be performed according to a general RNA extraction method, similarly to the extraction of RNA from cancer tissue.
  • a general RNA extraction method similarly to the extraction of RNA from cancer tissue.
  • TRIZOL reagent Life Tech Oriental
  • it may be performed according to the attached operation method. Specifically, 1 ml of TRIZOL reagent is added to 5 to 10 ⁇ 10 6 cancer cells, and the same operation as in the extraction of RNA from cancer tissue may be performed.
  • the extraction of the protein from the cancer cells may be performed according to the method described in the specification, similarly to the extraction from the cancer tissue.
  • RNA can be quantified by techniques such as Northern blot analysis, DNA microarray, RT-PCR, and quantitative PCR. Preferably, it is a DNA microarray ⁇ quantitative PCR. Each of these will be described below, but the present invention is not limited thereto.
  • single-stranded DNA is synthesized from the obtained RNA using T7-d (T) 24 primer, and then dTP.DNA ligase, DNA polymerase I, and RNase H are added. After the reaction, add T4 DNA polymerase I to synthesize double-stranded cDNA. After purifying the obtained cDNA, lamination reaction is performed by adding biotinylated UTP and CTP using RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics). After purifying the reaction product, the fragmented cRNA is obtained by heating at 94 ° C for 35 minutes in 200 mM Tris acetate pH 8.1, 150 mM magnesium acetate, and 50 mM potassium acetate.
  • the fragmented cRNA is hybridized to GeneChip (Affymetrix) Hu6800 or equivalent product in, for example, 100 mM MES, 1 M sodium salt, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20 at 45 ° C for 16 hours.
  • GeneChip Wash and stain according to the protocol attached to Affymetrix fluidics station EukGE_WS2.
  • streptavidin-phycoerythrin and a biotinylated anti-streptavidin goat antibody For staining, use streptavidin-phycoerythrin and a biotinylated anti-streptavidin goat antibody.
  • the stained GeneChip is scanned using an HP argon ion laser-confocal microscope (Hewlett Packard) to measure the fluorescence intensity.
  • the fluorescence is measured at 570 nm using excitation light at 488 nm.
  • Quantitative data analysis is preferably performed using GeneChip software (Affymetrix). To perform RNA quantification, the average of “difference ([perfect match hybridization signal] — mismatcn signal) for each probe family was calculated. average ctuference), and if this value is 50 or more and the quantitative value of RNA is dissociated between the two conditions, the expression of the gene is significant for the dissociation of 1.8 times or more, preferably Is judged to have increased or decreased.
  • the tumor cells are sensitive to the anticancer agent. It is determined that there is.
  • the operation is performed in two steps, a reverse transcription reaction and a PCR reaction.
  • the first step, the reverse transcription reaction was performed by adding dNTP oHgo d (T) 16 primers and Rnase inhibitor 'ultiscribe Reverse Transcriptase (Perkin-Elmer Applied Biosystems) to the obtained RNA at 25 ° C. After heating for 10 minutes, heat at 48 ° C for 30 minutes. The reaction is stopped by heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • the obtained cDNA is subjected to the second stage PCR reaction.
  • PCR reactions for example, 4 ng cDNA, IxSYBR PCR buffer one, 3 mM MgCl 2, each 200 ⁇ M dATP, dCTP, dGTP ⁇ 400 juM dUTP, 200 nM primer pair, 0.01 U / 1 AmpEi'ase UNG, 0.025 U / Perform the reaction with ⁇ AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
  • the reaction conditions are, for example, 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, and then 40 cycles of 95 ° C for 20 seconds, '55 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • Primers and probes are set, for example, using Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosvstems). Measure.
  • the comparison of a plurality of samples is performed by correcting the quantified value with the mRNA level of a housekeeping gene, preferably GAPDH, which has a small variation in the transcription amount of each sample.
  • the tumor cells are sensitive to the anticancer agent. It is determined that there is.
  • the present invention also provides an RNA quantification assay for use in the assay method of the present invention, which comprises, as a component, an oligonucleotide complementary to RNA that is a transcript of a symmetric gene whose expression level is to be measured. I do.
  • the constituent oligonucleotides are the primers and / or probes used for quantitative PGR and can be designed as described above.
  • the reagent for quantifying RNA of the present invention may contain, in addition to the above-described oligonucleotides, components commonly used in general quantification reagents.
  • Proteins are quantified based on their activity or antigenicity, but preferably quantification based on antigenicity, which is generally applicable to proteins, ie, immunochemical quantification.
  • Antibodies against proteins can be obtained from the amino acid sequence of Parker et al. (Parker TMR, Guo D “Hodges RS, Biochemistry, 25, 5425, 1986) or Karplus et al. 212, 1985) to predict antigenic determinants, synthesize peptides, or express fusion proteins such as glutathione synthase (GST) and purify them on glutathione columns to A rabbit, a mouse or the like is immunized with a polyclonal or, preferably, a monoclonal antibody (Harlow II, Lane D., Antibodies- "A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). If a commercially available antibody is available, it may be used after confirming its specificity.
  • the present invention also provides an immunoassay reagent containing an antibody against the protein as a component for use in the assay method of the present invention.
  • the antibody serving as a component can be obtained as described above.
  • the immunoassay reagent of the present invention may contain components commonly used in general immunoassay reagents in addition to the above antibodies.
  • All cells are cultured in HPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin at 37 ° C under 5% CO 2 did.
  • E7070 or ER-35748 or ER-68487 having the following structural formula was added to the culture medium of the E7070-sensitive strain HCT116-C9 and the E7070-resistant strain HCT116-C9-C1 at a concentration of 8 zM, and cultured. , 3, 6, and 12 hours later, the cells were collected. In addition, cells cultured for 12 hours without the addition of drugs were collected in the same manner.
  • HCT116-C9 is a substrain isolated from human colorectal cancer-derived HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) .HCT116-C9 is cultured in the presence of E7070, and the concentration of E7070 is gradually increased. The E7070 resistant substrain obtained by the above is HCT116-C9-C1.
  • E7070 was added to the medium of the E7070-sensitive strain LX-1 and the E7070-resistant strain LX-1-E2 at a concentration of 8 M and cultured, and cells 0, 3, 6, and 12 hours later were collected. Total RNA was extracted from these cells and used for subsequent analysis.
  • LX-1 Cancer Chemotherapy Center, Japan foundation for Cancer Research, Tokyo, Ja an
  • LX-1 was cultured in the presence of E7070, and the concentration of E7070 was gradually increased.
  • the E7070 resistant substrain obtained by raising is LX-1-E2.
  • FIG. 1 shows the cell growth inhibition curve measured by the above method. The actual operation was performed using Cell iter 96 Non-Radioactive Cell Proliteration Assay (Promega, Madison, WI) according to the attached operation method.
  • RNA from the recovered cells was performed using TRIZOL reagent (Lifetech Oriental) according to the attached procedure.
  • Example 1 cDNA synthesis and biotin labeling Obtained in Example 1: NA was dissolved in sterilized water treated with 100% getyl pyrocarbonate (DEPC), and further purified using RNeasy column (QIAGEN) to obtain Superscript Choice System (Lifetech Oriental). ) and T7-d (T) were synthesized double-stranded cDNA using 2 4 Purai Ma scratch.
  • NA was dissolved in sterilized water treated with 100% getyl pyrocarbonate (DEPC), and further purified using RNeasy column (QIAGEN) to obtain Superscript Choice System (Lifetech Oriental).
  • QIAGEN RNeasy column
  • T7-d (T) were synthesized double-stranded cDNA using 2 4 Purai Ma scratch.
  • RNA, 5 zM T7_d (T) 24 primer, lx First strand bufferTP 10 mM DTT, 500 M dNTP mix, 20 units / il Superscript II Reverse Transcriptase are added at 42 ° C. The reaction was allowed to proceed for one hour to synthesize single-stranded DNA. Then add lx Second strand buffer, 200 M dNTP mix, 67 U / ml DNA ligase, 270 U / ml DNA polymerase I, 13 U / ml KNase H, and react at 16 ° C for 2 hours to form a double strand cDNA was synthesized. Further, 67 U / ml T4 DNA polymerase I was added and reacted at 16 ° C. for 5 minutes. Then, 101 0.5 M EDTA was added to stop the reaction.
  • the obtained cDNA was purified with phenol / chloroform, and labeling reaction was performed using Piotinidani UTP and CTP using UNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics) according to the attached operation method. After purifying the reaction product with an Uneasy column, the cRNA was fragmented by heating at 94 ° C for 35 minutes in 200 mM Tris acetic acid pH 8.1, 150 mM magnesium acetate, and 50 mM acetic acid rim.
  • the fragmented cRNA was hybridized to GeneChip (Affymetrix) Hu6800 in 100 mM MES, 1 M sodium salt, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20 at 45 ° C for 16 hours. After hybridization, the GeneChip was washed and stained according to the protocol EukGE-WS2 attached to the Affymetrix fluidics station. For staining, streptavidin-phycoerythrin and a biotinylated anti-streptavidin goat antibody were used. The stained GeneChip was scanned using an HP argon ion laser confocal microscope (Hewlett Packard), and the fluorescence intensity was measured. The measurement was performed using excitation light of 488 nm and fluorescence of 570 nm.
  • RNA quantification the average difference ([perfect match hybridization signal]-[small signal ⁇ mismatch signal])) for each probe family was determined. ) When this value is 50 or more, and the quantitative value of RNA is dissociated between the two conditions, preferably when the dissociation is 1.8 times or more, the expression of the gene is significantly increased or decreased. Decreased ”.
  • E7070 or ER-35748 or ER-68487 were added to the HCT116-C9 medium at a concentration of 8 M and cultured.After 12 hours, RNA extracted from cells was analyzed by GeneChip without adding any drug. The results were compared with the results of RNA analysis of HCT116-C9 cells obtained by the above procedure. As a result, a list of genes whose expression was commonly increased by treatment with the three drugs E7070, ER-35748, and ER-68487 (GenBank registration numbers are also shown (the same applies to the following table)) Table 1 shows a list of genes whose expression was similarly reduced by treatment of the three drugs.
  • NPC1 AF002020 Niemann-Pick C disease protein
  • M87338 Replication Tactor C 40-kDa subunit (A1) M87339 Replication factor C, 37-kDa subunit (RFC4) M88163 Global transcription activator (hSNF2 / SWI2) M91432 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) M92439 Leucine-rich protein
  • BTF2 Basic transcription factor 62kD subunit
  • genes that fluctuate in common due to the treatment of these three anticancer drugs can be used as a proxy for the antitumor effect of E7070 and its enantiomers by measuring the changes alone or in combination. It's clear what you can do.
  • Example 2 In order to confirm that the variation in gene expression obtained in Example 2 reflects the sensitivity of tumor cells to E7070, E7070-sensitive cells and resistant cells were The changes in the expression of these genes were examined by quantitative PCR using SYBR Green and ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
  • the operation was performed in two stages, a reverse transcription reaction and a PCR reaction.
  • the first step, the reverse transcription reaction consists of l ⁇ g total RNA in lx TaqMan RT buffer, 5.5 mM MgCl 2 , 500 2M dNTP mix, 2.5 ⁇ oligo d (T) is primer, 0.4
  • cDNA was subjected to a second-stage PCR reaction.
  • PCR reaction was 4 ng cDNA, lxSYBR PC buffer, 3 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M dATP, dCTP, dGTP, 400 jM dUTP, 200 nM primer pair, 0.01 U / ⁇ l AmpErase UNG, 0.025 V / jl AmpliTaq Gold
  • the reaction was performed in the reaction system of DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems). The reaction conditions were 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, and then 40 cycles of 95 ° C for 20 seconds, 55 ° C for 20 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • GAPDH is SEQ ID Nos. 1 and 2
  • S80343 is SEQ ID Nos. 3 and 4
  • U07919 is SEQ ID Nos. 5 and 6
  • U11791 is SEQ ID Nos. 7 and 8
  • M95809 is SEQ ID Nos. 9 and 10
  • U18291 is SEQ ID No. 1
  • U63743 oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 14, and for M61764, oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 16 were used.
  • FIGS. 2 to 5 show the relationship between the time of drug treatment and the amount of each mRNA, using the quantitative value at 0 hour of drug treatment as a control (100%).
  • Each gene showed the largest variation in expression in the most sensitive HCT116-C9 (Fig. 2). ( Figure 3).
  • the resistant strain HCT116-C9-C1 no change in expression was observed at all (Fig. 4), and the resistant strain LX-1-, which showed a slight growth inhibitory effect at the drug concentration of 8M used in the experiment, was observed.
  • E2 U11791 showed fluctuations in expression
  • M95809 and U18291 showed slight fluctuations in expression (Fig. 5).
  • Example 2 The change in the expression of the gene shown in Example 2 correlates with the sensitivity to E7070, and the gene shown in Example 2 is used alone or in combination to measure the antitumor activity of E7070 and its related compounds. It was confirmed that it can be used as a surrogate marker for effects.
  • HCT116-C9 human colon cancer cell line
  • MDA-MB-435 human breast cancer cell line
  • MOLT-4 human T lymphoblastic leukemia cell line
  • Table 3 shows a list of genes whose expression is enhanced by at least 1.8 cultures in all three cancer types.
  • Table 4 shows a list of genes whose expression is suppressed by more than 1.8 cultures in all three cancer types. Genes whose expression fluctuates (increases or decreases) in these three types of cancers, which are established from patients with completely different genetic backgrounds, are more closely related to the E7070 anti-tumor mechanistic mechanism common to tumor cells. It is likely that this will be an effective tool for assaying the sensitivity of tumor cells to E7070 and its related compounds.
  • M91432 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) M92439 Leucine-rich protein
  • BTF2 Basic transcription factor 62kD subunit
  • the present invention by measuring the expression levels of the genes described in Tables 3 and 4 of the tumor cells extracted from the cancer patient to which the anticancer agent represented by the general formula (I) is administered, Investigating the sensitivity of the tumor cells to the anticancer drug by allowing the obtained tumor cells to act on the anticancer drug represented by the general formula (I) and measuring the expression levels of the genes described in Tables 3 and 4. Becomes possible.

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Description

明細書
腫瘍細胞の抗癌剤に対する感受性を検定する方法 技術分野
本発明は、 抗癌剤に対し腫瘍細胞が感受性か否かを検定する方法に関する。 背景技術
従来の抗癌剤の臨床治験においては、 まず、 第一相試験で毒性のプロフィール と最大推奨用量が決められ、 次いで第二相試験で腫瘍縮小率を効果判定基準とす るレスポンスレート (response rate)により薬剤としての評価が成されてきた。一 方、 近年の癌生物学の進展に伴い、 細胞内情報伝達系や血管新生などを阻害する 新しい作用機序の薬剤が、 活発な研究開発の途にある。 これら新規抗癌剤におい ては必ずしも毒性用量に近い最大推奨用量が投与される必要性がない可能性が考 えられる。さらに、腫瘍の縮小よりもむしろ腫瘍の増殖抑制に伴う QOL (Quality of Life) の改善や延命を指標にした方が薬剤の効果を適正に判定できるものと推 測される。 この場合、 より論理的かつ具体的に薬剤の効果を確かめるためには、 腫瘍の増殖抑制メカニズムに密接に関連する生物学的マーカーの変化を、 代理 ( surro gate ) マーカーとして利用することが望まれる。
一般的に、 抗癌療法において、 抗癌剤を投与した際の生体の反応性は、 薬剤の 標的となる腫瘍細胞の、 その薬剤に対する感受性に大きく依存する。 この腫瘍細 胞の薬剤に対する感受性は、 腫瘍細胞毎に大きく異なるものである。 このような 感受性の差は、 その薬剤の標的分子もしくはそれに関連する因子の量的もしくは 質的な差異、 あるいは薬剤耐性の獲得等に起因する。 このような背景を踏まえる と、 標的となる腫瘍細胞が、 薬剤に対して感受性を示す際に特異的に引き起こさ れる腫瘍細胞の変化を、 バイオプシ等により取得した腫瘍組織等を用いて測定す ることができれば、 これを代理マーカ一として、 早期に薬剤の効果判定、 治療法 の確立、 新たな治療法の選択等が可能となり、 非常に有益である。 また、 治療に 先立ってバイオプシ等により取得した腫瘍組織より、 常法に従い腫瘍細胞を分離 した後薬剤処理を行い、 この腫瘍細胞が薬剤感受性であるか否かを上記代理マー カーの変化により測定すれば、 予めその薬剤による治療が奏効するか否かを予測 することが可能となり、 臨床上極めて有用である。 この代理マ一カーは、 その変 化が抗腫瘍効果に特異的であることが重要であり、 かつ高感度に測定可能であれ ばよい。 具体的には、 薬剤の抗腫瘍効果に特異的な遺伝子発現変動の定量、 それ ら遺伝子発現の変化に伴う夕ンパク質の量的変動の解析、 さらにはその変化に伴 う機能変化の解析等何れもこの代理マーカーと成り得る。
E7070 ( N- (3-chloro- 7-indolyl)- 1 ,4-benzenedisulfonamide ) は細胞周期の G1 期を夕ーゲットとした抗腫瘍効果を有する化合物であり、 現在臨床開発中である ( Takas i O a, Hiroshi Yoshmo, Tatsuo Okauchi, Kentaro Yoshimatsu, Yoic i Ozawa, Naoko Hata Sugi, Takeshi Nagasu, Nozomu Koyanagi and Kyosuke Kitoh, J. Med. Chem, 1999， 42, 3789-3799) 。
この化合物の種々の腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制作用の強さのスぺクトルは、 既存の抗癌剤の何れとも異なり、 新たな作用機序を有する抗癌剤としてその効果 が期待される。 この薬剤の臨床開発を速やかに進行させ臨床治療法を早期に確立 するために、 さらには確立された治療法に基づき効率よく治療を進め、 患者の QOL向上に貢献するために、本薬剤投与時に特異的に使用できる代理マーカーを 発見し、 応用することが望まれる。
近年、 種々の DNAマイクロアレイを用い、 多数の遺伝子の発現量を同時に検 出する方法が確立され、 幅広い目的に応用されている （Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO, Science 1995， 270, 467-70, Lockhart, D.J., Dong, H.， Byrne, M.C., FoHettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M.， Wang C, Kobayashi, M., Horton, H. Brown, E.L., Nature Biotechnology, 1996， 14, 1675-1680 ) o
癌研究の分野においてもこの DNAマイクロアレイを用いた研究は盛んに行わ れている。 例えば DNAマイクロアレイを用いた発現解析によりびまん性大 B細 胞リンパ腫 (diffuse large B-ceU lymphoma; DLBCL)を解析した研究においては、 DLBCLが遺伝子発現プロファイルの違いにより 2つの異なるタイプに分類され、 この分類が予後の予測にも繋がることが示された （Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldxick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T， Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R， Staudt LM， et al, Nature, 2000, 403, 503-11 ) 。 また米国 National Cancer Instituteの 60種類の癌細胞株パネルについて遺伝子発現プロ ファイルを解析することにより、 これら細胞株を再分類し、 その特性を検討した 報告 （Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, SpeUman P, Iyer V， Jeffrey SS, Van de Rijn M, Walth-am M， Pergamenschikov A, Lee JC, Lashkari D, Shalon D, Myers TG, Weinstein JN, Botstein D, Brown PO, Nat Genet, 2000, 24, 227-35 ) 、 さらにこの 60種類の癌細胞株パネルの遺伝子発現 プロファイルと、 各細胞株の各種抗癌剤に対する感受性との間の関連について考 察した報告 （Scherf U, Ross DT, Waltham M， Smith LH, Lee JK, Tanabe L， Kohn KW, Reinhold WC, Myers TG, Andrews DT, Scudiero DA, Eisen MB, Sausville EA, Pommier Y, Botstein D, Brown PO, Weinstein JN, Nat Genet, 2000, 24, 236-44 ) 等がなされている。
また、 同様に DNAマイクロアレイ （一部メンブランフィルターを用いたマク ロアレイ） を用いて、 腫瘍細胞に抗癌剤を作用させた際に起こる遺伝子発現変化 を検討した報告もいくつか成されている （Miee CH, Ruan S, Chen S, Chenchik A, Levin VA, Yung AW, Fuller GN, Zhang W , Oncol Rep, 1999, 6， 393-401. Zimmermann J, Erdmann D, Lalande I, Grossenbacher R, Noorani M, Furst P, Oncogene, 2000, 19， 2913-20. Kudoh K, Ramanna M, Ravatn R, Elka loun AG, Bittner ML, Meltzer PS, Trent JM, Dalton WS, Chin KV, Cancer Res, 2000, 4161-6 ) 。 これらの報告は、 遺伝子発現の変動解析が、 複数の細胞集団の 特性比較や、 薬剤の処理等により細胞に引き起こされる生物学的な変化を、 分子 レベルで包括的に研究する目的で極めて有用であることを示している。 発明の開示
本発明の課題は、 腫瘍細胞に、 E7070及びその関連ィヒ合物を作用させた際の、 該化合物の抗腫瘍効果の代理マーカ一を提供することにある。
本発明者らは、 E7070及びその関連化合物を、 これら抗癌剤に対し感受性であ る腫瘍細胞に作用させた際に引き起こされる遺伝子発現の変化を、 DNAマイクロ アレイ法により解析し、 これら抗癌剤により共通に現れる、 遺伝子発現の変化を 見出した。
更に、 それら遺伝子の中には 3癌種に共通した発現の変化を示すものがあるこ とを見出し、 これらの遺伝子の発現変化が、 E7070及びその関連化合物の抗腫瘍 効果の代理マーカーとして使用できることを見出して、 本発明を完成させた。 すなわち本発明は、 以下のものを提供する。
1 . 1).下記一般式 （I ) で表される抗癌剤を投与した癌患者より取り出され た腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子からなる群から選択される 1個また は複数の遺伝子の発現量を測定し、
2).該癌患者から抗癌剤投与前に取り出された腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の 遺伝子の発現量が増加し、または表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性であると判定する、
工程を含んで成る、 該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。
Figure imgf000006_0001
(式中、
A環は、 置換基を有していてもよい、 単環式または二環式芳香環を、
B環は、 置換基を有していてもよい、 6員環式不飽和炭化水素またはへテロ原子 として窒素原子を 1個含む不飽和 6員へテロ環を、
C環は、 置換基を有していてもよい、 窒素原子を 1または 2個含む 5員へテロ環 を、
Wは単結合または一 C H二 C H—を、
Xは— N (R ) —または酸素原子を、
Yは炭素原子または窒素原子を、 Zは— N ( R 2 ) —または窒素原子を、
R 1および R 2は同一または異なって水素原子または低級アルキル基を、 意味する。 ）
2 . 1).癌患者より取り出された腫瘍細胞に、 下記一般式 （I ) で表される抗 癌剤を作用させ、
2) .該腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子からなる群から選択される 1個ま たは複数の遺伝子の発現量を測定し、
3) .無処理の腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の遺伝子の発現量が増加し、 または 表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して 感受性であると判定する、
工程を含んで成る、 該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。
Figure imgf000007_0001
(式中、
A環は、 置換基を有していてもよい、 単環式または二環式芳香環を、
B環は、 置換基を有していてもよい、 6員環式不飽和炭化水素またはへテロ原子 として窒素原子を 1個含む不飽和 6員へテロ環を、
C環は、 置換基を有していてもよい、 窒素原子を 1または 2個含む 5員へテロ環 を、
Wは単結合または一 C H = C H—を、
Xは—N ( R ) —または酸素原子を、
Yは炭素原子または窒素原子を、
Zは一 N ( R ) 一または窒素原子を、
RR おおよよびび RR は同一または異なって水素原子または低級アルキル基を、 意味する。 ） 3 . 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物である RNAを DNAマイ クロアレイにより定量することにより行う、 1または に記載の方法。
4 . 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物である RNAを定量的 PCR により定量することにより行う、 1または 2に記載の方法。
5 . 4に記載の方法において使用するための、 該 RNAに相補的なオリゴヌ クレオチドを構成要素として含む、 RNAの定量試薬。
6 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化 学的方法により定量することにより行う、 1または 2に記載の方法。
7 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を ELISA により定量することにより行う、 6に記載の方法。
8 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウェス 夕ンブロットにより定量することにより行う、 6に記載の方法。
9 . 6に記載の方法において使用するための、 該蛋白質に対する抗体を構成 要素として含む免疫測定試薬。
1 0 . A環が置換基を有していてもよい、 ベンゼンまたはピリジンであり、 B環が置換基を有していてもよいベンゼンであり、 C環が置換基を有していても よいピロールであり、 Wが単結合であり、 かつ Xおよび Zがいずれも—N H—で ある、 1または 2に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 細胞株 HCT116-C9、 HCT116-C9-C1N LX-1、 LX-1-E2の E7070によ る細胞増殖抑制曲線を示す。
図 2は、 E7070感受性株 HCT116-C9 における遺伝子発現変動の定量的 PCR による解析の結果を示す。
図 3は、 E7070感受性株 LX-1における遺伝子発現変動の定量的 PCRによる解 祈の結果を示す。
図 4は、 E7070耐性株 HCT116-C9-C1における遺伝子発現変動の定量的 PCR による解析の結果を示す。
図 5は、 E7070耐性株 LX-1-E2における遺伝子発現変動の定量的 PCRによる 解析の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について、 詳細に説明する。
本発明の検定方法は、腫瘍細胞が in vivoまたは in vitroで抗癌剤に暴露された ときの、 腫瘍細胞における特定の遺伝子の発現量の変化を、 腫瘍細胞の抗癌剤に 対する感受性の指標とする点に特徴を有する。
従って、 本発明の第 1の態様の検定方法は、 1).下記一般式 （I ) で表される抗 癌剤を投与した癌患者より取り出された腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝 子からなる群から選択される 1個または複数の遺伝子の発現量を測定し、
2).該癌患者から抗癌剤投与前に取り出された腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の 遺伝子の発現量が増加し、または表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性であると判定する、
工程を含んで成る。
また、 本発明の第 2の態様の検定方法は、 1).癌患者より取り出された腫瘍細胞 に、 下記一般式 （I ) で表される抗癌剤を作用させ、
2) .該腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子からなる群から選択される 1個ま たは複数の遺伝子の発現量を測定し、
3) .無処理の腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の遺伝子の発現量が増加し、 または 表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して 感受性であると判定する、
工程を含んで成る。
本発明における抗癌剤は、 上記一般式 （I ) で表されるスルホンアミ ド誘導体 及びスルホン酸エステル誘導体である。
上記一般式 （I ) において、 A環の意味する 「置換基を有していてもよい、 単 環式または二環式芳香環」 とは、 芳香族炭化水素、 または窒素原子、 酸素原子お よび硫黄原子のうち少なくとも 1個を含む芳香族へテロ環であり、 当該環上には 置換基 1 ~ 3個があってもよいものを示す。 A環に含まれる主な芳香環を例示す ると、 ピロール、 ピラゾール、 イミダゾ一ル、 チォフェン、 フラン、 チアゾ一ル、 ォキサゾ一ル、 ベンゼン、 ピリジン、 ピリミジン、 ビラジン、 ピリダジン、 ナフ 夕レン、 キノリン、 イソキノリン、 フタラジン、 ナフチリジン、 キノキサリン、 キナゾリン、 シンノリン、 インドール、 イソインドール、 インドリジン、 インダ ゾール、 ベンゾフラン、 ベンゾチォフェン、 ベンズォキサゾ一ル、 ベンズイミダ ゾ一ル、 ベンゾピラゾール、 ベンゾチアゾ一ルなどがある。 上記芳香環は置換基 1〜3個を有していてもよく、 置換基が複数個ある場合には、 同一または異なつ ていてもよい。 置換基としては、 例えば、 低級アルキル基または低級シクロアル キル基で置換されていてもよいアミノ基、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 水酸基、 ニトロ基、 メルカプト基、 シァノ基、低級アルキルチオ基、 ハロゲン基、 式— a— b [式中、 aは単結合、 一 (CH2) k一、 -0- (CH2) k―、 — S—
(CH2) k—または— N (R3) ― (CH2) k—を、 kは 1〜5の整数を、 R は水素原子または低級アルキル基を、 bは—CH2— d (式中、 dは低級アルキル 基で置換されていてもよいアミノ基、ハロゲン基、水酸基、低級アルキルチオ基、 シァノ基または低級アルコキシ基を意味する） を意味する] で示される基、 式— a-e-f [式中、 aは前記と同じ意味を、 eは一 S (0) 一または一 S (0) 2 —を、 fは低級アルキル基または低級アルコキシ基で置換されていてもよいアミ ノ基、低級アルキル基、 トリフルォロメチル基、 — （CH2) m— bまたは—N (R
) - (CH2) m-b (式中、 bは前記と同じ意味を示し、 R は水素原子または 低級アルキル基を、 mは 1〜5の整数を意味する） を意味する] で示される基、 式— a— g— h [式中、 aは前記と同じ意味を示し、 gは一C (0) —または— C (S) 一を、 hは低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、 水酸基、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 一 (CH2) n— bまたは—N (R ) - (C H2) n-b (式中、 bは前記と同じ意味を示し、 ： R は水素原子または低級アル キル基を、 nは 1〜 5の整数を意味する） を意味する] で示される基、 式一 a—
N (R6) -g-i [式中、 aおよび gは前記と同じ意味を示し、 R は水素原子 または低級アルキル基を、 iは水素原子、 低級アルコキシ基または f (fは前記 と同じ意味を示す） を意味する] で示される基、 式一 a— N ( ) -e-f (式 中、 a、 eおよび fは前記と同じ意味を示し、 ： R は水素原子または低級アルキル 基を意味する） で示される基、 または式— （CH2) p- j - (CH2) q-b (式 中、 ： iは酸素原子または硫黄原子を意味し、 bは前記と同じ意味を示し、 pおよ び qは同一または異なって 1〜 5の整数を意味する） で示される基などを挙げる ことができる。
上記置換基例において、 ァミノ基が 2個のアルキル基で置換されている場合に は、これらのアルキル基が結合して 5または 6員環を形成していてもよい。また、 A環が水酸基またはメルカプト基を有する含窒素へテロ環である場合には、 これ らの基が共鳴構造をとることにより、 ォキソ基またはチォキソ基の形になってい てもよい。
B環の意味する 「置換基を有していてもよい、 6員環式不飽和炭化水素または ヘテロ原子として窒素原子を 1個含む不飽和 6員へテロ環」 とは、 一部が水素化 されていてもよい、 ベンゼンまたはピリジンであり、 当該環上に置換基 1または 2個を有していてもよく、 置換基が 2個ある場合には同一または異なつていても よいものを示す。
C環の意味する 「置換基を有していてもよい、 窒素原子を 1または 2個含む 5 員へテロ環」 とは、 一部が水素化されていてもよい、 ピロール、 ピラゾ一ル、 ィ ミダゾ一ルであり、 当該環上に置換基 1または 2個を有していてもよく、 置換基 が 2個ある場合には同一または異なっていてもよいものを示す。
B環および C環が有していてもよい置換基としては、 例えば、 ハロゲン基、 シ ァノ基、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 水酸基、 ォキソ基、 式—C (〇） - r (式中、 rは水素原子、 低級アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基または水酸基を意味する） 、 低級アルキル基 で置換されていてもよいアミノ基、 トリフルォロメチル基などを挙げることがで きる。
上記一般式 （I ) において、 R 、 ならびに A環、 B環および C環が有して いてもよい置換基の定義中の低級アルキル基は、 炭素数 1〜 6の直鎖もしくは分 枝状のアルキル基、 例えばメチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル 基、 n—ブチル基、 イソブチル基、 sec—ブチル基、 tert—ブチル基、 n—ペンチ ル基 （ァミル基） 、 イソペンチル基、 ネオペンチル基、 tert—ペンチル基、 1ーメ チルブチル基、 2—メチルブチル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 n—へキシ ル基、 イソへキシル基、 1—メチルペンチル基、 2—メチルペンチル基、 3—メ チルペンチル基、 1 , 1ージメチルプチル基、 1 , 2—ジメチルプチル基、 2 , 2—ジメチルブチル基、 1 , 3—ジメチルブチル基、 2 , 3—ジメチルブチル基、 3， 3—ジメチルブチル基、 1 一ェチルブチル基、 2 —ェチルブチル基、 1 , 1 , 2—トリメチルプロピル基、 1 , 2， 2—トリメチルプロピル基、 1ーェチルー 1一メチルプロピル基、 1—ェチルー 2—メチルプロピル基などを意味する。 こ れらのうち好ましい基としては、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプ 口ピル基、 n—ブチル基、イソプチル基などを挙げることができ、 これらのうち、 最も好ましい基としてはメチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基 を挙げることができる。
A環が有していてもよい置換基の定義中の低級シクロアルキル基は、 炭素数 3 ~ 8のシクロアルキル基を意味し、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、 シク口へキシル基などを挙げることができる。
A環、 B環および C環が有していてもよい置換基の定義中の低級アルコキシ基 とは、 メトキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブ トキシ基、ィソブトキシ基、 tert—ブトキシ基など上記の低級アルキル基から誘導 されるアルコキシ基を意味するが、 これらのうち最も好ましい基としてはメ トキ シ基、 エトキシ基を挙げることができる。 低級アルキルチオ基は、 上記の低級ァ ルキル基から誘導されるアルキルチオ基を意味する。 またハロゲン原子としては フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子などが挙げられる。
上記一般式 （I ) で示されるスルホンアミ ド誘導体またはスルホン酸エステル 誘導体は酸または塩基と塩を形成する場合もある。 本発明における抗癌剤は一般 式 （I ) で示される化合物の塩をも包含する。 酸との塩としては、 たとえば塩酸 塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩等の無機酸塩や酢酸、 乳酸、 コハク酸、 フマル酸、 マ レイン酸、 クェン酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸な どの有機酸との塩を挙げることができる。 また、 塩基との塩としては、 ナトリウ ム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩などの無機塩、 トリェチルァミン、 アルギニン、 リジン等の有機塩基との塩を挙げることができる。
また、 これら化合物の水和物はもちろんのこと光学異性体が存在する場合はそ れらすべてが含まれることはいうまでもない。 また、 本発明における抗癌剤は強 ぃ抗腫瘍活性を示す'が、 生体内で酸化、 還元、 加水分解、 抱合などの代謝を受け て抗腫瘍活性を示す化合物をも包含する。 またさらに、 本発明における抗癌剤は 生体内で酸化、 還元、 加水分解などの代謝を受けて一般式 （I ) で示される化合 物を生成する化合物をも包含する。
感受性を検定する腫瘍細胞は、 一般式 （I ) で表される抗癌剤に対して感受性 を示すものであれば、 特に限定されない。例えば、大腸癌、肺癌、 乳癌、 白血病、 膝臓癌、 腎臓癌、 メラノ一マ、 悪性リンパ腫、 頭頸部癌、 胃癌などに由来する腫 瘍細胞が挙げられる。
癌患者から取り出された腫瘍細胞は、 癌患者から摘出された癌組織に含まれる 腫瘍細胞も包含される。
第 1の態様の検定方法の場合には、 癌患者が取り出された腫瘍細胞は、 一般式 ( I ) で表される抗癌剤が、 腫瘍細胞の感受性が測定可能となる量投与されてい る癌患者から取り出された腫瘍細胞であればよく、 通常には 100〜； L500 mgの用 量で 1〜1 4日間投与された癌患者から取り出された腫瘍細胞である。
第 2の態様の検定方法の場合には、 癌患者から取り出された腫瘍細胞に、 一般 式 （I ) で表される抗癌剤を作用させる条件は、 腫瘍細胞の感受性が測定可能と なるものであればよく、 通常には、 培地中 0.01〜： 10 〃Mの抗癌剤濃度で、 6〜 7 2時間の培養という条件が挙げられる。
遺伝子の発現量の測定は、 遺伝子の転写産物である UNAまたは遺伝子産物で ある蛋白質を定量することにより行うことができる。 RNAまたは蛋白質の定量は、 通常には、腫瘍細胞から KNAまたは蛋白質を抽出し、抽出物中の RNAまたは蛋 白質を定量することによって行うことができる。以下、 1 . RNAまたは蛋白質の 抽出、 2 . RNAの定量、 3 .蛋白質の定量の順に、それらの例を詳細に説明する。 1 . UNAの抽出
1).一般式（I )で表される抗癌剤を投与された患者の癌組織からの、 RNAまたは 蛋白質の抽出
一般式 （ェ） で表される抗癌剤を投与された患者より、 バイオプシ等で摘出さ れた癌組織から以下に述べる方法で、 RNAまたは蛋白質を抽出する。 RNAの抽出は、一般的な RNA抽出法に従って行えばよい。例えば TRIZOL試 薬（ライフテックオリエンタル）等を用いて、添付の操作法に従って行えばよい。 具体的には以下のとおりである。 癌組織 50〜； 100 mgに対して 1 mlの TRIZOL 試薬を加え、 テフロンホモジヱナイザ一を用いて均一化する。 これを遠心し ( 12,000 X g、 10分間、 °C) 、 得られた上清を室温で 5分間放置後、 使用した TRIZOL試薬 1 mlに対して 0.2 mlの割合でクロロフオルムを添加する。 この溶 液を 15秒閭激しく振盪、攪拌し室温で 2〜3分間放置後遠心を行う（12,000 X g、 15分間、 4°C) 。 遠心後、 水層を新しいチューブに移し、 使用した TRIZOL試薬 1 mlに対して 0.5 mlの割合でィソプロピルアルコールを加え、 室温で 10分間放 置後、 遠心を行う （12,000 X g、 10分間、 4°C) 。 得られた沈殿を 75%ェタノ一 ルにて洗浄した後、 風乾し、 全 RNAとして以降の操作に供する。
癌組織からの蛋白質の抽出は、 Bollag， D. M, Rozycki M. D., Edelstein S. J.， Protein Methods, 1996， Wiley-Liss, Inc., New York, U.S.A. Walker, J. Μ.' The protein handbook, 1996, Humana Press, New Jersey, U.S.A.等に言己載の方 法に従って行えばよい。
2).—般式（I )で表される抗癌剤の存在下で培養した癌細胞からの、 RNAまたは 蛋白質の抽出
患者よりバイオプシ等で得られた癌組織から、 定法に従い癌細胞（腫瘍細胞） を分離する。例えば Hamburgerら （Hamburger A" Salmon S. E.， Kim M. B.， Trent J. M., Soehnlen B. J., Alberts D. S., and Schmidt H. , Cancer Res., 38， 3438-3443, 1978) に従い、得られた組織を無菌的に細切し、 その後ステンレスメ ヅシュ、注射針、さらにはナイ口ンメッシュ等を用いて細胞の懸濁液を調製する。 こうして得られた細胞を適当 ¾培地（例えば、 10〜15%FCSを含む RPMI-1640、 MEM、 McCoy培地等） に培養する。 得られた癌細胞を一般式 （I ) で表される 抗癌剤の存在下に適当な期間、 好ましくは 3時間 · 6時間 · 12時間あるいは 24 時間、更に好ましくは 12時間 5%C02条件下 37°Cにて培養し、以下に述べる方法 で、 RNAまたは蛋白質を抽出する。 なお、 使用するバイオプシ等で得られた組織 中から軟寒天培養法 （Hamburger A., and Salmon S. E.， Science, 197, 461-463, 1977 Hamburger A., and Salmon S. E., J. Clin. Invest., 60, 846-854, 1977、 Von Hoff D. D., and Johnson, G. Ε·, Pxoc. Am. Assoc. Cancer Res., 20， 51, 1979) を用いて、 癌細胞のみを特異的に分離して用いることも可能である。
癌細胞からの ENAの抽出は、癌組織からの RNAの抽出と同様、一般的な RNA 抽出法に従って行えばよい。 例えば TRIZOL試薬 （ライフテックオリエンタル） を用いた場合、添付の操作法に従って行えばよい。具体的には癌細胞 5〜； 10 X 106 に対して 1 mlの TRIZOL試薬を加え、以下癌組織からの RNAの抽出と同様の操 作を行えばよい。
癌細胞からの蛋白質の抽出についても、 癌組織からの抽出と同様、 成書に記載 の方法に従えばよい。
2 . RNAの定量
RNAはノ一ザンプロヅト解析 · DNAマイクロアレイ · RT-PCR ·定量的 PCR 等の技術により定量できる。好ましくは DNAマイクロアレイ ·定量的 PCRであ ることが好ましい。 以下にそれそれについて説明するが、 本発明はこれにより限 定されない。
DNAマイクロアレイによる定量は次のように行う。 最初に得られた RNAを錶 型として Superscript Choice System (ライフテックオリエンタル）及び T7_d(T)24 ブラィマ一を用いて 2本鎖の cDNAを合成し、続いてその cDNAを铸型としてビ ォチン化した cRNAを合成する。
具体的には、 先ず得られた RNA より T7-d(T)24プライマーを用いて 1本鎖の DNAを合成し、 次いで d TP . DNAリガーゼ · DNAポリメラ一ゼ I · RNase H を添加して反応後、更に T4 DNAポリメラーゼ Iを添加して 2本鎖 cDNAを合成 する。 得られた cDNA を精製後、 RNA Transcript Labeling Kit ( Enzo Diagnostics) を用い、 ビォチン化 UTPならびに CTPを加えてラペル化反応を行 う。 反応生成物を精製後、 200 mM トリス酢酸 pH8.1、 150 mM酢酸マグネシ ゥム、 50 mM酢酸力リウム中で 94°Cにて 35分間加熱して、 断片化した cRNA を得る。
断片化した cRNAを、例えば 100 mM MES、 1 M ナトリウム塩、 20 mM EDTA、 0.01% Tween 20中、 45°Cにて 16時間、 GeneChip (Affymetrix) Hu6800ある いは同等の製品にハイブリダイズさせる。 ハイプリダイズ後、 GeneChip は Affymetrix fluidics stationに添付のプロトコ一ル EukGE_WS2に従い洗浄 ·染 色する。染色にはストレブトアビジン-フィコエリ トリンとピオチン化抗ストレプ トァビジン山羊抗体を用いる。染色後の GeneChipを HP アルゴンイオンレ一ザ —共焦点顕微鏡 (Hewlett Packard)を用いてスキャンし、蛍光強度を測定する。 この蛍光色素の場合、測定は 488 nmの励起光を用い 570 nmの蛍光を測定する。 定量的データ解析を、 好ましくは GeneChip software (Affymetrix) を用いて 行う。 RNAの定量を行うために、 それそれのプローブフアミリー毎に 「差 （[完 全マッチノヽィフリダイでーションシグナル (perfect match hybridization signal)] — Lミスマツチシクナノレmismatcn signal)] ) 」 の平均 、 average ctuference) を求 め、 この値が 50以上であり、 かつ 2つの条件間で RNAの定量値が乖離している 場合、 好ましくは 1.8倍以上解離している場合につき、 その遺伝子の発現が有意 に 「増加」 あるいは 「減少」 したと判断する。
表 3に記載の 1個または複数の遺伝子の RNA量が増加し、 または表 4に記載 の 1個または複数の遺伝子の RNA量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤 に対して感受性であると判定する。
また、 定量的 PCRは SYBR Greenと ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems) を用レ、、 次のよつに了つ。
操作は逆転写反応及び PCR反応の 2段階で行う。最初の段階である逆転写反応 は、 得られた RNA に dNTP · oHgo d(T)16プライマ一 · Rnase インヒビ夕一 ' ultiscribe Reverse Transcriptase (Perkin -Elmer Applied Biosystems) ¾カロえ、 25°Cにて 10分間保温後、 48°Cにて 30分間加熱することにより行う。反応を 95°C 5分間加熱することにより停止させる。
得られた cDNAを第 2段階の PCR反応に供する。 PCR反応は、 例えば 4 ng cDNA、 IxSYBR PCR バッファ一、 3 mM MgCl2、各 200〃M dATP, dCTP, dGTPヽ 400 juM dUTP, 200 nM プライマ一対、 0.01 U/ 1 AmpEi'ase UNG、 0.025 U/ μλ AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems)の反 応系で行う。 反応条件は、 例えば 50°C 2分間、 95°C 10分間に次いで 95°C 20 秒間 ' 55°C 20秒間 ' 72°C 30秒間を 40サイクルで行う。 プライマーとプローブ は、 例えば Primer Expression (Perkin-Elmer Applied Biosvstems) を用いて設 計する。 複数検体の比較は、 定量値を各検体の転写量に変動の少ないハウスキー ピング (house keeping)遺伝子、 好ましくは GAPDHの mRNAレベルにより補正 して行う。
表 3に記載の 1個または複数の遺伝子の RNA量が増加し、 または表 4に記載 の 1個または複数の遺伝子の UNA量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤 に対して感受性であると判定する。
本発明は、 本発明の検定方法において使用するための、 発現量を測定する対称 の遺伝子の転写産物である RNA に相補的なォリゴヌクレオチドを構成要素とし て含む、 RNAの定量試桀も提供する。構成成分となるオリゴヌクレオチドは、 定 量的 PGRに使用されるブラィマ一及び/またはプロ一ブであり、上述のようにし て設計することができる。 本発明の RNAの定量試薬は、 上記オリゴヌクレオチ ドに加えて、 一般の定量試薬において慣用的な成分を含んでいてもよい。
3 . 蛋白質の定量
蛋白質は、 その活性あるいは抗原性を基に定量するが、 好ましくは蛋白質一般 に適用しやすい抗原性を基にした定量、 即ち免疫化学的定量が好ましい。
蛋白質に対する抗体は、 そのアミノ酸配列より Parkerらの報告（Parker T. M. R., Guo D" Hodges R. S., Biochemistry, 25,5425， 1986) あるいは Karplusらの 報告（Karplus P. A -， Schulz G. E.， Naturwissenschaften, 72, 212, 1985) に基づ いて抗原決定基を予測し、 ペプチドを合成し、 あるいは融合蛋白例えばグル夕チ オン合成酵素（GST)との融合蛋白を発現させてグル夕チオンカラムで精製して、 抗原を作製し、 得られた抗原を家兎 ·マウス等に免疫してポリクロ一ナル、 好ま しくはモノクロ一ナル抗体 (Harlow Ε·， Lane D., Antibodies-" A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を作製するこ とができる。 また、 市販の抗体が利用可能な場合は、 特異性を確かめた上で使う ことも許される。
得られた抗体を用い、 例えば酵素免疫測定法 （石川栄治他、 医学書院、 1982) または Enzyme Immunoassay (Ishikawa E., Kawai Τ·, iyai, K., Igak -Snom, Tokyo New York, 1981)に記載の方法により ELISAあるいは RIAを行い蛋白質 を定量する。 蛋白質が腫瘍細胞外に分泌されるものである場合には、 腫瘍細胞か ら蛋白質を抽出をすることなく培地中の蛋白質を定量することが可能である。 表 3に記載の 1個または複数の遺伝子の蛋白質量が増加し、 あるいは表 4に記 載の 1個または複数の遺伝子の蛋白質量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌 剤に対して感受性であると判定する。
本発明は、 本発明の検定方法において使用するための、 該蛋白質に対する抗体 を構成要素として含む免疫測定試薬も提供する。 構成成分となる抗体は、 上述の ようにして得ることができる。 本発明の免疫測定試薬は、 上記抗体に加えて、 一 般の免疫測定試薬において慣用的な成分を含んでいてもよい。 実施例
以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。
[実施例 1 ] E7070感受性株及び耐性株の培養と RNAの抽出
全ての細胞は 10%の胎児牛血清、 100 units/mlのぺニシリン、 100 mg/mlのス トレプトマイシンを添加した HPMI-1640培地を用いて 5%CO2条件下 37°Cにて 培養した。
E7070 または下記に構造式を示す ER-35748もしくは ER-68487を E7070感 受性株 HCT116-C9及び E7070耐性株 HCT116-C9-C1の培地に 8 zMの濃度で 添カ卩して培養し、 0, 3, 6， 12時間後の細胞を回収した。 また、 薬剤を加えずに 12 時間培養した細胞も同様に回収した。
Figure imgf000018_0001
ER-35748
Figure imgf000019_0001
これらの細胞より全 R Aを抽出しその後の解析に供した。薬剤添加 12時間後 の細胞から抽出した： NAならびに薬剤を添加せずに 12時間培養した細胞から抽 出した RNAを実施例 2に示す DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析に用い た。 なお、 HCT116-C9 はヒト大腸癌由来 HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.) から分離した亜株であり、 この HCT116-C9 を E7070存在下培養、 E7070濃度を漸次的に上昇させることにより得た E7070 耐性亜株が HCT116-C9-C1である。
同様に E7070を E7070感受性株 LX-1及び E7070耐性株 LX-1-E2の培地に 8 Mの濃度で添加して培養し、 0, 3, 6, 12時間後の細胞を回収した。 これらの細 胞より全 RNA を抽出しその後の解析に供した。 なお、 LX-1 ( Cancer Chemotherapy Center, Japan foundation for Cancer Research, Tokyo, Ja an) はヒト小細胞性肺癌由来の細胞株であり、この LX-1を E7070存在下培養、 E7070 濃度を漸次的に上昇させることにより得た E7070耐性亜株が LX-1-E2である。 使用した細胞株 HCT116-C9、 HCT116-C9-C1, LX_1、 LX-1-E2に E7070を添 加し 72時間培養し、 MTT法（Mosmann Τ·， J. Immunol. Methods, 65, 55， 1983) により測定した細胞増殖抑制曲線を図 1に示す。 実際の操作は Cell iter 96 Non-Radioactive Cell Proliteration Assay (Promega, Madison, WI) を用いて、 添付の操作法に従って行った。
回収した細胞からの全: RNAの抽出は、 TRIZOL試薬 (ライフテックオリエン タル） を用いて添付の操作法に従って行った。
[実施例 2 ] DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析
l).cDNA合成とビォチン標識 実施例 1で得られた: NAを 100〃1のジェチルピロカーボネート （DEPC) 処 理をした滅菌水に溶解し、 さらに RNeasy カラム （QIAGEN) を用いて精製し、 Superscript Choice System (ライフテヅクオリエンタル） 及び T7-d(T)24プラィ マ一を用いて 2本鎖の cDNAを合成した。
まず 10 gの RNAに 5 zMの T7_d(T)24プラィマ一、 lx First strand bufferヽ 10 mM DTT、 500 Mの dNTP mix、 20 units/ ilの Superscript II Reverse Transcriptaseを加え、 42°Cにて 1時間反応させ 1本鎖 DNAを合成した。続いて lx Second strand buffer, 200 Mの dNTP mix, 67 U/ml DNA ligase、 270 U/ml DNAポリメラーゼ I、 13 U/ml KNase Hを添加して 16°Cにて 2時間反応させ 2 本鎖 cDNAを合成した。さらに 67 U/ml T4 DNAポリメラ一ゼ Iを添加して 16°C にて 5分間反応させたのち、 10 1の 0.5 M EDTAを加え反応を停止した。
得られた cDNA をフエノール/クロロフオルムにて精製し、 UNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics) を用い、 添付の操作法に従って、 ピオチンィ匕 UTPならびに CTPによるラベル化反応を行った。 反応生成物を Uneasyカラム にて精製後、 200 mM トリス酢酸 pH8.1、 150 mM酢酸マグネシゥム、 50 mM酢 酸力リゥム中で 94°Cにて 35分間加熱して cRNAを断片化した。
2).DNAマイクロアレイ （GeneChip) へのハイブリダイズと測定
断片化した cRNAを、 100 mM MES、 1 Mナトリウム塩、 20 mM EDTA、 0.01% Tween 20中、 45°Cにて 16時間、 GeneChip (Affymetrix) Hu6800にハイブリ ダイズさせた。ハイブリダイズ後、 GeneChipは Affymetrix fluidics stationに添 付のプロトコール EukGE-WS2に従い洗浄.染色した。染色にはストレブトアビ ジン-フィコエリ トリンとピオチン化抗ストレブトアビジン山羊抗体を用いた。 染 色後の GeneChip を HP アルゴンイオンレーザー共焦点顕微鏡 （Hewlett Packard) を用いてスキャンし、 蛍光強度を測定した。 測定は、 488 nmの励起光 を用い 570 nmの蛍光で行った。
定量的デ一夕解析は全て GeneChip software (Affymetrix) を用いて行った。 RNAの定量を行うために、 それそれのプローブフアミリー毎に 「差 （[完全マツ ナノヽィブリダイで一ションシグナル (perfect match hybridization signal)] —[ スマツチシグナ ^mismatch signal)]) 」 の平均 (average difference) を求め、 この値が 50以上であり、かつ 2つの条件間で RNAの定量値が乖離している場合、 好ましくは 1.8倍以上解離している場合につき、 その遺伝子の発現が有意に 「增 加」 あるいは 「減少」 したと判断した。
E7070 または ER-35748、 ER-68487を HCT116-C9の培地に 8〃Mの濃度で 添加して培養し、 12時間後に細胞から抽出した RNAの GeneChipによる解析結 果を、 薬剤を加えないで同様の操作により得た HCT116-C9細胞の RNA解析結 果と比較した。 この結果、 E7070、 ER-35748, ER-68487の 3種の薬剤の処理 により、共通してその発現が上昇した遺伝子のリスト （GenBankの登録番号もあ わせて示す (以下の表において同じ)）を表 1に、同様に 3種の薬剤の処理により共 通してその発現が減少した遺伝子のリストを表 2に示す。
登録番号 遺伝子名
D59253 NCBP interacting protein 1
D78514 Ubiquitin-conjugating enzyme
D83767 Rep-8
HG1 139-HT4910 Fk506-Binding protein
HG3484-HT3678 Cdc-like kinase 1 (Clk1)
J04152 Tumor-associated antigen GA733-1 , M1S1
M21 154 S-adenosylmethionine decarboxylase
M60724 p70 Ribosomal S6 kinase alpha- 1
M84349 Transmembrane protein CD59
S61953 c-ErbB3 receptor tyrosine kinase
U52960 RNA polymerase II complex component SRB7
U84720 Export protein RAE1
U92014 Defective mariner transposon Hsmar2
Z18951 Caveolin
表 2
遺伝子名
AB000409 Serine/threonine protein kinase NKi
AB000450 Putative serine/threonine protein kinase VRK2
AB002380 Leukemia-associated Rho GEF
AB003102 Proteasome 26S subunit p44.5
AC002045 CIT987SK-A-589H1
AF002020 Niemann-Pick C disease protein (NPC1)
AF008445 Phospholipid scramblase
D00723 Hydrogen carrier protein, glycine synthase
D 14659 K1AA0103
D21852 KIAA0029
D26535 Dihydrolipoamide succinyltransferase
D28364 Annexin II
D29677 KIAA0054
D29810 Unknown product
D29956 Ubiquitin specific protease 8
D30756 KIAA0049
D31883 Actin-binding LIM protein
D32002 Nuclear cap binding protein
D38521 KIAA0077
D38552 KIAA0073
D38553 KIAA0074
D43947 KIAA0100
D43948 ch-TOG
D50645 SDF2
D50663 Dynein (TCTEL1)
D50912 RNA-binding motif protein 10
D50916 Ubiquitination factor E4A
D61391 PAP39
D63480 KIAA0146
D63506 Syntaxin-binding protein 3
D63875 TPR-containing/SH2-binding protein
D63880 KIAA0159
D78586 Multifunctional protein CAD
D79983 KIAA0161
D79987 KIAA0165
D79988 KIAA0166
D79991 KIAA0169
D83776 KIAA0191
D83781 KIAA0197
D84307 Phosphoethanolamine cytidylyltransferase
D86981 Amyloid precursor protein-binding protein 2
D87435 KIAA0248 表 2 (続き)
遺伝子名
D87446 KIAA0257
D87448 DNA topoisomerase ll-binding protein
D87743 Solute carrier family 9
HG1869-HT1904 Male enhanced antigen
HG2379-HT3996 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic
HG4094-HT4364 Transcription factor Lsf-ld
J04088 DNA topoisomerase II (top2)
J04501 Muscle glycogen synthase
J04543 Synexin
L06845 Cysteinyl-tRNA synthetase
L07033 Hydroxymethylglutaryl-CoA lyase
L07540 Replication factor C, 36-kDa subunit
L07597 Ribosomal protein S6 kinase 2
L07758 IEF SSP 9502
L21936 Succinate dehydrogenase flavoprotein subunit
L25444 TAFII70-alpha
L25931 Lamin B receptor
L33075 Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1
L33881 Protein kinase C iota isoform
L38810 Proteasome 26S subunit p45
し 40395 Eukaryotic initiation factor 2B-beta
し 41870 Retinoblastoma susceptibility protein (RB1) し 47276 Alpha topoisomerase truncated-form
M15796 PCNA
19267 Tropomyosin
M22632 Mitochondrial aspartate aminotransferase
M23379 GTPase-activating protein ras p21
M24486 Prolyl 4-hydroxylase alpha subunit
M29204 DNA-binding factor
M29550 Calcineurin A1
30496 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase
33518 HLA-B-associated transcript 2 (BAT2)
M34309 Epidermal growth factor receptor HER3
M37400 Cytosolic aspartate aminotransferase
M55905 Mitochondrial NAD(P)+ dependent malic enzyme
M58525 Catechol-O-methyltransferase
M5991 1 Integrin alpha-3
M61764 Gamma-tubulin
M62994 Filamin B
74089 丁 B1
M85085 Cleavage stimulation factor
M86707 Myristoyl CoA:protein N-myristoyl transferase . 表 2 (続き）
登録番号 遺伝子名
M87338 Replication Tactor C, 40-kDa subunit (A1) M87339 Replication factor C, 37-kDa subunit (RFC4) M88163 Global transcription activator (hSNF2/SWI2) M91432 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) M92439 Leucine-rich protein
M93056 Monocyte/neutrophil elastase inhibitor
M95809 Basic transcription factor 62kD subunit (BTF2) M95929 Homeobox protein PHOX1
M97935 Transcription factor ISGF-3
S58544 75k Da infertility-related sperm protein
S59184 RYK=related to receptor tyrosine kinase
S72904 APK1 antigen=MAb Kl recognized
S78085 PDCD2, Rp8 homolog
S80343 Arginyl-tRNA synthetase (ArgRS)
U01062 Inositol 1 ,4,5-triphosphate receptor type 3 U02566 Receptor tyrosine kinase tif
U04285 Lysosomal acid lipase
U06631 H326
U07231 G-rich sequence facto r-1
U07681 Isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha U07919 Aldehyde dehydrogenase 6 (Aし DH6)
U08815 Splicesomal protein SAP61
U 10324 Nuclear factor NF90
U1 1791 Cyclin H
U15174 Nip3
U 15306 DNA-binding protein NFX1
U18291 CDC16HS
U 18934 Receptor tyrosine kinase DTK
U20979 Chromatin assembly factor-l p150 subunit U22233 Methylthioadenosine phosphorylase
U23028 Eukaryotic initiation factor 2B-epsilon
U23946 LUCA15
U26648 Syntaxin 5A
U27459 Origin recognition complex protein 2 homolog U27460 Uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase U28413 Cockayne syndrome complementation group A U2881 1 Cystein-rich fibroblast growth factor receptor U28831 Immuno-reactive with anti-PTH Ab
U28963 Gps2
U30313 Diadenosine tetraphosphatase
U30521 P31 1 HUM -3.1
U30827 Splicing factor SRp40-3 (SRp40) 表 2 (続き）
遺伝子名
U30828 Splicing factor SRp55-2 (SRp55)
U34252 Gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase U34683 Glutathione synthetase
U36341 SLC6A8
U40282 Integrin-linked kinase
U46006 Smooth muscle LIM protein (h-SmLIM)
U49844 FRAP-related protein (FRP1/ATR)
U50078 Guanine nucleotide exchange factor p532 U50939 Amyloid precursor protein-binding protein 1 U53468 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B13 U57629 Retinitis pigmentosa GTPase regulator
U60808 CDP-diacylglycerol synthase
U61 145 Enhancer of zeste homolog 2
U61263 Aceto lactate synthase homolog
U63743 Mitotic centromere-associated kinesin (MCAK) U65785 Oxygen-regulated protein ORP150
U72514 C2f
U72515 C3f
U76764 CD97
U77413 O-linked GlcNAc transferase
U77949 Cdc6-related protein (HsCDC6)
U79241 Clone 23759
U80034 Mitochondrial intermediate peptidase precursor U81554 CaM kinase II isoform
U8561 1 DNA-PK interaction protein (KIP)
U89606 Pyridoxal kinase
U90426 Nuclear RNA helicase
U94319 Transcription coactivator p75 (DFS70)
U95740 362G6.1
U97188 Putative RNA binding protein KOC
X06745 DNA polymerase alpha subunit
X13482 U2 snRNP-specific A protein
X51956 Neuron specific (gamma) enolase
X53587 Integrin beta-4
X54199 GARS-AIRS-GART
X54867 NKG2-A
X59871 T cell factor 1
X61100 75 kDa subunit NADH dehydrogenase precursor X66364 Serine/threonine protein kinase PSSALRE X68836 S-adenosylmethionine synthetase
X70476 Subunit of coatomer complex
X75535 PxF 表 2 (続き）
遺伝子名
X81003 HCG V
X84740 DNA ligase III
X94754 Yeast methionyl-tRNA synthetase homologue
X98248 Sortilin
X99209 Arginine methyltransferase
Y08612 Nup88
Y08682 Carnitine palmitoyltransferase ) type I
Y13115 Serine/threonine protein kinase SAK
Z11518 Histidyl-tRNA synthetase
Z17227 Transmenbrane receptor protein CRF2-4
Z46629 SOX9
Z68747 Imoqen 38 一 一 表 1及び表 2に示した遺伝子に関し、 E7070耐性株 2株 （C9-C1及び C9-C1 と同様の方法により得られた別の耐性株 (C9-C4)) を用い、 上記と同様に、 8 μΜ の Ε7070で 12時間処理した後に、 遺伝子の変動を GeneChipにより解析した。 この結果、 1 . 8倍以上発現が増加または減少する遺伝子は両株において認めら れなかった。
以上の結果から、 これら 3種の抗癌剤の処理により共通に変動する遺伝子は、 単独または組み合わせでその変化を測定することにより E7070及びその閧連化合 物の抗腫瘍効果の代理マ一力一として使用できることが明らかである。
[実施例 3 ]定量的 PCRによる遺伝子発現解析
実施例 2で得られた遺伝子の発現変動が、腫瘍細胞の E7070に対する感受性を 反映したものであることを確認する目的で、 実施例 1に示した RNAを用いて、 E 7070感受性細胞と耐性細胞におけるこれら遺伝子発現の変化を SYBR Greenと ABI Prism 7700 Sequence Detection System ( Perkin-Elmer Applied Biosystems) を用いた定量的 PCRにより検討した。
操作は逆転写反応及び PCR反応の 2段階で行った。最初の段階である逆転写反 応は、 l〃gの全 RNAに lx TaqMan RT buffer, 5.5 mM MgCl2、 500〃Mの dNTP mix, 2.5 μΜ oligo d(T)isプライマ一、 0.4
Figure imgf000026_0001
Multiscribe Reverse Transcriptase (Perkin-Elmer Applied Biosystems)をカロえ、 25°Cにて 10分間保温後、 48°Cにて 30分間加熱することにより行った。反応を 95°C 5分間加熱することにより停止させた。
得られた cDNAを第 2段階の PCR反応に供した。 PCR反応は 4 ng cDNA、 lxSYBR PC バッファー、 3 mM MgCl2、 各 200〃M dATP, dCTP, dGTP、 400 j M dUTP, 200 nM プライマー対、 0.01 U/〃l AmpErase UNG、 0.025 V/j l AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin -Elmer Applied Biosystems) の反応 系で行った。反応条件は 50°C 2分間、 95°C 10分間に次いで 95°C 20秒間 ' 55°C 20秒間 · 72°C 30秒間を 40サイクルで行った。 ブラィマ一は GAPDHは配列番 号 1及び 2、 S80343は配列番号 3及び 4、 U07919は配列番号 5及び 6、 U11791 は配列番号 7及び 8、 M95809は配列番号 9及び 1 0、 U18291は配列番号 1 1 及び 1 2、 U63743は配列番号 1 3及び 1 4、 M61764は配列番号 1 5及び 1 6 に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
各検体中の mRNA量は蛍光強度を測定することにより定量した。なお、複数検 体の比較においては、 定量値を各検体の GAPDHの mRNA量により補正して行 つた。薬剤処理 0時間における定量値をコントロール （100%) として、 薬剤処理 時間と各 mRNA量の関係を示したものが図 2〜図 5である。各遺伝子は感受性が 最も高い HCT116-C9 で最大の発現変動を示し （図 2 ) 、 感受性株 LX-1 では HCT116-C9よりは変動の幅は小さいものの、 S80343を除く全ての遺伝子で発現 変動を示した （図 3 ) 。 これに対し耐性株 HCT116-C9-C1では、 全く発現変動が 認められず （図 4 ) 、 実験に用いた 8〃Mの薬剤濃度で多少の増殖抑制の効果が 認められる耐性株 LX-1-E2 では、 U11791 が発現変動を示し M95809 および U18291に僅かな発現変動が認められた （図 5 ) 。
実施例 2で示された遺伝子の発現変動は E7070に対する感受性と相関しており、 実施例 2で示された遺伝子は、 単独または組み合わせでその変化を測定すること により E7070及びその関連化合物の抗腫瘍効果の代理マーカーとして使用できる ことが確認された。
[実施例 4 ] ELISAによる解析
実施例 2の表 2に示した遺伝子のうち、 細胞外に分泌されることが報告されて いる X51956 (Human EN02 gene for neuron specific (gamma) enolase)につい て既に報告されている ELISA法 （Duncan M. E" McAleese S. M.， Booth N. A" Melvin W. T" and Fothergill J. Ε·， J. of Immunol. Methods, 151, 227-236， 1992、 Yamaguchi K., Aoyagi K， Urakami K., Fukutani Τ·, Maki N.， Yamamoto S., Otsubo K" Miyake Y" and Kodama T" Jpn. J. Cancer Res., 86, 698-705, 1995) によりその発現レベルを検討した。 実際の測定には栄研化学 （東 京） の NSE ELISA kitを用い、 操作は添付の資料に従った。
[実施例 5 ] 3癌種における遺伝子発現解析
HCT116-C9 (ヒト大腸癌細胞株） 、 MDA-MB-435 (ヒト乳癌細胞株） 及び MOLT-4 (ヒト Tリンパ芽球系白血病細胞株） の三癌種について、 実施例 2と同 様にして、 E7070 (8 〃Mで 12 h処理） による遺伝子発現変化を Gene Chipを 用いて調べた。
三癌種で共通して 1.8培以上発現が亢進される遺伝子のリストを表 3に示す。 また、 三癌種で共通して 1.8培以上発現が抑制される遺伝子のリストを表 4に示 す。 遺伝的背景の全く異なる癌患者から樹立されたこれら三癌種で共通して発現 が変動 （亢進または減少） する遺伝子は、 腫瘍細胞に共通する E7070の抗腫瘍作 用メ力ニズムにより深く関係している可能性が高いので、腫瘍細胞の E7070及び その関連化合物に対する感受性を検定する際に有効なマ一力一になり得ると考え られる。
表 3
遺伝子名
D78514 Ubiquitin-conjugating enzyme
D83767 Rep-8
HG1 139-HT4910 Fk506-Bindina protein
HG3484-HT3678 Cdc-like kinase 1 (Clk1)
M21 154 S-adenosylmethionine decarboxylase
M60724 p70 Ribosomal S6 kinase alpha-1
S61953 c-ErbB3 receptor tyrosine kinase
U52960 RNA polymerase II complex component SRB7
U84720 Export protein RAE1
U92014 Defective mariner transposon Hsmar2
p, Rli factDa SUecatioor 4kCTU C0.- g Cl timreaeulattovain faco
Gambulinmatu- py() Miril NndnztochndaADeenta-i eo+ die lc:P pp Eidrwtct -al aoh reeor HmFS一-e: facto-
Figure imgf000030_0001
表 4 (続き）
登録番号 遺伝子名
M91432 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) M92439 Leucine-rich protein
M93056 Monocyte/neutrophil elastase inhibitor
M95809 Basic transcription factor 62kD subunit (BTF2) M97935 Transcription factor ISGF-3
S72904 APK1 antigen=MAb Kl recognized
S78085 PDCD2, Rp8 homolog
U01062 Inositol 1 ,4,5-triphosphate receptor type 3 U07231 G-rich sequence factor- 1
U08815 Splicesomal protein SAP61
U1 1791 Cyclin H
U15306 DNA-binding protein NFX1
U18291 CDC16HS
U 18934 Receptor tyrosine kinase DTK
U20979 Chromatin assembly factor-l p150 subunit U22233 Methylthioadenosine phosphorylase
U23028 Eukaryotic initiation factor 2B-epsilon
U23946 LUCA15
U28831 Immuno-reactive with anti-PTH Ab
U28963 Gps2
U30828 Splicing factor SRp55-2 (SRp55)
U34683 Glutathione synthetase
U40282 Integrin-linked kinase
U49844 FRAP-related protein (FRP1/ATR)
U50939 Amyloid precursor protein-binding protein 1 U57629 Retinitis pigmentosa GTPase regulator
U61 145 Enhancer of zeste homolog 2
U72514 C2f
U77413 O-linked GlcNAc transferase
U77949 Cdc6-related protein (HsCDC6)
U79241 Clone 23759
U80034 Mitochondrial intermediate peptidase precursor U81554 CaM kinase II isoform
U89606 Pyridoxal kinase
U94319 Transcription coactivator p75 (DFS70)
X06745 DNA polymerase alpha subunit
X13482 U2 snRNP-specific A protein
X51956 Neuron specific (gamma) enolase
X54199 GARS-AIRS-GART
X61 100 75 kDa subunit NADH dehydrogenase precursor X68836 S-adenosylmethionine synthetase
X70476 Subunit of coatomer complex 表 4 (続き）
遺伝子名
X75535 PxF
X99209 Arginine methyltransferase
Y08612 Nup88
Y08682 Carnitine palmitoyltransferase I type I
Z17227 Transmembrane receptor orotein CRF2-4
産業上の利用の可能性
本発明により、 一般式 （I ) で表される抗癌剤を投与した癌患者より取り出さ れた腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子の発現量を測定することにより、 あるいは癌患者より取り出された腫瘍細胞に一般式 （I ) で表される抗癌剤を作 用させ、 表 3及び表 4に記載の遺伝子の発現量を測定することにより、 該腫瘍細 胞の該抗癌剤に対する感受性を調べることが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 1).下記一般式 （I ) で表される抗癌剤を投与した癌患者より取り出され た腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子からなる群から選択される 1個また は複数の遺伝子の発現量を測定し、
2).該癌患者から抗癌剤投与前に取り出された腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の 遺伝子の発現量が増加し、または表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して感受性であると判定する、
工程を含んで成る、 該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。
Figure imgf000033_0001
(式中、
A環は、 置換基を有していてもよい、 単環式または二環式芳香環を、
B環は、 置換基を有していてもよい、 6員環式不飽和炭化水素またはへテロ原子 として窒素原子を 1個含む不飽和 6員へテロ環を、
C環は、 置換基を有していてもよい、 窒素原子を 1または 2個含む 5員へテロ環 を、
Wは単結合または一 C H = C H—を、
Xは— N (R ) 一または酸素原子を、
Yは炭素原子または窒素原子を、
Zは一 N (R ) —または窒素原子を、
R および R は同一または異なって水素原子または低級アルキル基を、 意味する。 ）
2 . 1).癌患者より取り出された腫瘍細胞に、 下記一般式 （ I ) で表される抗 癌剤を作用させ、
2)·該腫瘍細胞の、 表 3及び表 4に記載の遺伝子からなる群から選択される 1個ま たは複数の遺伝子の発現量を測定し、
3).無処理の腫瘍細胞と比較して、 表 3に記載の遺伝子の発現量が増加し、 または 表 4に記載の遺伝子の発現量が減少する場合に、 該腫瘍細胞が該抗癌剤に対して 感受性であると判定する、
工程を含んで成る、 該腫瘍細胞の該抗癌剤に対する感受性を検定する方法。
Figure imgf000034_0001
(式中、
A環は、 置換基を有していてもよい、 単璟式または二環式芳香環を、
B環は、 置換基を有していてもよい、 6員環式不飽和炭化水素またはへテロ原子 として窒素原子を 1個含む不飽和 6員へテロ環を、
C環は、 置換基を有していてもよい、 窒素原子を 1または 2個含む 5員へテロ環 を、
Wは単結合または一 C H = C H—を、
Xは一N (R ) —または酸素原子を、
Yは炭素原子または窒素原子を、
Zは一 N (R " ) —または窒素原子を、
R および R は同一または異なって水素原子または低級アルキル基を、 意味する。 ）
3 . 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物である RNAを DNAマイ クロアレイにより定量することにより行う、 請求項 1または請求項 2に記載の方 法。
4 . 遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物である RNAを定量的 PCR により定量することにより行う、 請求項 1または請求項 2に記載の方法。
5 . 請求項 4に記載の方法において使用するための、 該 RNAに相補的なォ リゴヌクレオチドを構成要素として含む、 RNAの定量試薬。
6 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化 学的方法により定量することにより行う、請求項 1または請求項 2に記載の方法。
7 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を ELISA により定量することにより行う、 請求項 6に記載の方法。
8 . 遺伝子の発現量の測定を、 該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウェス タンブロツトにより定量することにより行う、 請求項 6に記載の方法。
9 . 請求項 6に記載の方法において使用するための、 該蛋白質に対する抗体 を構成要素として含む免疫測定試薬。
1 0 . A環が置換基を有していてもよい、 ベンゼンまたはビリジンであり、 B環が置換基を有していてもよいベンゼンであり、 C環が置換基を有していても よいピロ一ルであり、 Wが単結合であり、 かつ Xおよび Zがいずれも— N H—で ある、 請求項 1または請求項 2に記載の方法。
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