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WO2001081591A1 - Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee - Google Patents

Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee Download PDF

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WO2001081591A1
WO2001081591A1 PCT/FR2001/001266 FR0101266W WO0181591A1 WO 2001081591 A1 WO2001081591 A1 WO 2001081591A1 FR 0101266 W FR0101266 W FR 0101266W WO 0181591 A1 WO0181591 A1 WO 0181591A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
plant
transformed
glucosidase
gene
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/001266
Other languages
English (en)
Inventor
Murielle Boisson
Véronique GOMORD
Patrice Lerouge
Loïc FAYE
Michel Caboche
Loïc LEPINIEC
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique (Inra), Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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Priority to AU2001256404A priority patent/AU2001256404A1/en
Priority to CA002409706A priority patent/CA2409706A1/fr
Priority to EP01929701A priority patent/EP1278872A1/fr
Publication of WO2001081591A1 publication Critical patent/WO2001081591A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01106—Mannosyl-oligosaccharide glucosidase (3.2.1.106), i.e. glucosidase I

Definitions

  • the present invention relates to a novel plant glucosidase I and to nucleic acids coding for this enzyme participating in the N-glycosylation of proteins during translation. It also relates to means for detecting this protein and these nucleic acids, such as
  • the invention also relates to recombinant vectors comprising a nucleic acid encoding the new plant glucosidase I, to host cells transformed with a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention, as well as to transgenic plants 10 of which part or all of the cells are transformed with a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention.
  • the invention also relates to means intended to increase or on the contrary to inhibit the expression of a nucleic acid coding for the new glucosidase I in plants, with the aim of producing
  • N-glycosylation consists of the covalent attachment of a more or less complex oligosaccharide to a protein, at a glycosylation site consisting of the amino acid sequence NXS / T , X representing any of the amino acids, except proline (P) and aspartic acid (D).
  • the N-glycosylation process begins in the endoplasmic reticulum with the transfer of a type 25 precursor oligosaccharide (Glc 3 Mang Glc ⁇ Ac 2 ) to the N residue of a glycosylation site of the protein being translated.
  • a type 25 precursor oligosaccharide Glc 3 Mang Glc ⁇ Ac 2
  • glucosidase I cuts glucose and glucosidase II cuts the following two glucoses, the oligosaccharide attached to the glycosylation site then having the form (Man 9 GlcNAc 2 ).
  • the protein is transferred into the apparatus of
  • residues ⁇ -1, 3 fucose and ⁇ -1, 2 xylose can be added.
  • the residues ⁇ -1, 3 fucose and ⁇ -1, 2 xylose are
  • Glycans attached to protein glycosylation sites play an important role in many mechanisms. They allow in particular the maintenance of the structure of the protein in a biologically active conformation, they ensure a protection of the peptide chain against the attack of the proteolytic enzymes and can intervene in the phenomena of cellular recognition (Weil et al ., 1989).
  • Glucosidase I is also designated mannosyl-oligosaccharide glucosidase, the international classification of which is EC: 3.2.1.106.
  • Glucosidase I is a type 11 endoplasmic reticulum membrane enzyme, the C-terminus of which is found in the lumen of the endoplasmic reticulum.
  • This enzyme catalyzes the first stage of N-glycosylation, by hydrolyzing the terminal glucose residue of the precursor oligosaccharide.
  • This protein has been purified and characterized in several species.
  • glucosidase I has a size of 95 kDa (Bause et al., 1986). Glucosidase I has also been isolated and characterized from pig liver (Bause et al., 1989), from the bovine mammary gland where it appears to be present in the form of a tetramer (Schailubhai et al., 1987) and from the liver veal (Hettkamp et al., 1984). In these three species, glucosidase I has a size of 85 kDa and the similarities in their respective amino acid sequences show that this protein is fairly well conserved during evolution (Pukkazhenti et al., 1993).
  • a human AD ⁇ c of 2881 bp encoding a glucosidase I has also been isolated (Kalz-Fuller et al., 1995).
  • the amino acid sequence analysis deduced from the AD séquencec sequence revealed a potential glycosylation site on the amino acid at position 655, the presence of a very hydrophobic zone corresponding to the putative transmembrane region ranging from amino acid at position 38 to amino acid at position 58 towards the ⁇ -terminal end and in the presence of a cytosolic region of 37 amino acids at the ⁇ -terminal end as well as a region C- terminal terminal located in the lumen of the endoplasmic reticulum. It is a type 11 membrane protein.
  • glucosidase I was isolated from bean seedlings (Mung Bean) by (Szumilo et al. 1986), this enzyme having been studied in detail by Zeng et al. in 1998.
  • This glucosidase I has a size of 97 kDa and is distinguished from animal glucosidases I by a different sensitivity to agents modifying amino acids.
  • a histidine modifying agent inactivates bean glucosidase I but not that of pig liver, while a cysteine modifying agent inactivates only glucosidase I of pig liver.
  • known glucosidases 1 Whether they originate from a yeast, a mammal or a plant, known glucosidases 1 have certain characteristics in common: it is an ⁇ -1,2-glucosidase whose catalytic activity does not not require the presence of a metal ion, which is N-glycosylated at a single site.
  • castanospermine which is a glucosidase I inhibiting agent, in particular in cultures of plant cells in a fermenter, so as to synthesize proteins carrying an N-glycan with a structure close to the precursor common to all eukaryotes.
  • the invention made it possible to isolate and characterize for the first time the transcription product of a gene coding for a plant glucosidase I catalyzing the cleavage of the first external glucose residue of the precursor oligosaccharide (Glc 3 Man 9 Glc NAc 2 ) and thus to make accessible to those skilled in the art means making it possible to modulate the expression of the corresponding gene in a plant and in particular to inhibit or block the translation of glucosidase I in a plant, so as to produce in this plant glycosylated proteins containing no allergenic and / or immunogenic osidic residues, such as fucose and xylose residues.
  • the applicant has thus isolated and characterized a complementary DNA corresponding to the messenger RNA coding for a glucosidase I in Arabidopsis thaliana, the corresponding gene being designated AtGCSI.
  • the applicant has also shown that the interruption of the genomic sequence of the AtGCSI gene in a plant leads to the production of proteins whose glycosylation is modified. More particularly, it has been shown that blocking the expression of the AtGCSI gene according to the invention provokes the production of proteins whose glycosylation sites were occupied by precursor oligosaccharides and not by mature N-glycans. Analysis of proteins produced by plants in which the expression of the AtGCSI gene has been blocked has made it possible to determine a total absence of allergenic xylose and fucose residues. Blocking the expression of the plant glucosidase I gene AtGCSI causes the development of the seed to stop.
  • T-DNA insertion mutant affected in protein N-glycosylation was isolated.
  • T-DNA is inserted into a gene located on BAC T1 F15 from the DNA bank of Arabidopsis thaliana TAMU of the ecotype
  • the sequence listed in the aforementioned database is annotated as being similar to human glucosidase I.
  • the genome sequence of the AtGCSI gene also has a strong similarity (66% identity in nucleic acids) with a sequence from BAC F316 of the IGF database listed in the GenBank database under the access number AC002396.
  • the sequence contained in BAC F3I6 is also annotated as being similar to human glucosidase I.
  • Homologies between the coding sequence of the AtGCSI gene have been found, for example with mouse, rat and human glucosidase 1 (38% identity in nucleic acids) of a putative protein of C. elegans (36 % identity in nucleic acids) or Schizzo. pombe (31% identity in nucleic acids) or yeast (28% identity in nucleic acids).
  • the gene sequence described in the GenBank database under access number AC004353 would include 20 exons and 19 introns. According to such an analysis, the gene sequence contained in BAC T1 F15 would be transcribed into a messenger RNA coding for a putative protein with a length of 864 amino acids.
  • the AtGCSI gene according to the invention which comprises 22 exons and 21 introns, allows the synthesis of a messenger RNA coding for a glucosidase I with a length of 852 amino acids.
  • a first subject of the invention consists of a nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide coding for a glucosidase I having the amino acid sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a nucleic acid according to the invention is in an isolated and / or purified form.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located). For example, a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated. The same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be “isolated”.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and remain nevertheless in the isolated state of the fact that the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide is in the "purified" state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA sequences or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single chain form or in duplex form.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1) an analogue of a purine, (2) an analogue of 'a pyrimidine, or (3) a similar sugar, examples of such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04 064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of the cDNA of nucleotide sequence SEQ ID No. 2 coding for the plant glucosidase l according to the invention or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention relates to a nucleic acid comprising the nucleic sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with one of the following nucleic acids: a) a nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide coding for a glucosidase I having the amino acid sequence SEQ ID No. 1, or a nucleic acid of complementary sequence; b) a nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence; c) a nucleic acid comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a first nucleic acid having at least 80% identity with a second reference nucleic acid will have at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5 % or 99.8% of identity in nucleotides with this second reference polynucleotide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the software tool of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE
  • the percentage of identity between two sequences is carried out using BLAST software (BLAST version 2.06 of
  • Each of the nucleic acids according to the invention which comprises all or part of the mRNA or of the cDNA corresponding to the transcription products of the AtGCSI gene coding for a plant glucosidase I can be easily obtained by a person skilled in the art who knows its nucleotide sequence disclosed in the present description.
  • nucleic acids according to the invention can also reproduce any of the nucleic acids according to the invention by constructing, on the basis of the sequences disclosed in the present description, oligonucleotide primers capable of amplifying all or part of these nucleic acids, for example by extracting the total RNAs from different plant tissues, then synthesizing the complementary DNAs using a reverse transcriptase enzyme before carrying out several amplification cycles of the cDNAs obtained using one or more primers hybridizing specifically with the target sequences whose obtaining is sought.
  • oligonucleotide primers capable of amplifying all or part of these nucleic acids, for example by extracting the total RNAs from different plant tissues, then synthesizing the complementary DNAs using a reverse transcriptase enzyme before carrying out several amplification cycles of the cDNAs obtained using one or more primers hybridizing specifically with the target sequences whose obtaining is sought.
  • Such a mode of reproduction of nucleic acids according to the invention is for example described in Example 1.
  • the different amplified nucleic acids can then be subjected to a ligation step in a vector according to techniques well known to those skilled in the art.
  • a nucleic acid having at least 20 consecutive nucleotides of a sequence according to the invention advantageously has at least 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 , 1000, 2000 or 2500 consecutive nucleotides of the sequence of reference, the length of consecutive nucleotides being naturally limited by the length of the reference sequence.
  • nucleic acid according to the invention can also reproduce a nucleic acid according to the invention by direct chemical synthesis, such as the phosphodiester method described by Narang et al. (1979), the phosphodiester method described by Brown et al. (1979), the diethylphosphoramidite method described by Beaucage et al. (1981), as well as the solid support method described in European patent application No. EP 0 707 792, the content of these documents being incorporated here by reference.
  • a nucleic acid according to the invention can also be synthesized, from the reference polynucleotide sequence information SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 5, using the techniques described by Wheeler et al. (1996, Gene, Vol. 10. 251-255), by Wade et al. (1996, Biomedical Peptides, Proteins and nucleic acids, Vol. 2: 27-32), by Martinez et al. (1996, Taxicon, Vol. 34 (11): 1413-1419), by Prapunwattana et al. (1996, Molecular and Biochemical Parasitoly, vol. 83: 93-106) and by Skopek et al. (1996, Mutation Research, vol. 349: 163-172).
  • the applicant has also isolated and characterized, in an Arabidopsis thaliana ecotype, the Wassilevskja ecotype, a plant in the genome of which the AtGCSI gene coding for glucosidase I according to the invention has been artificially interrupted, by inserting a construct containing T-DNA from Agrobacterium tumefaciens.
  • exogenous T-DNA further created a 30 bp deletion of genomic DNA as well as an insertion of two nucleotide fragments with a length of 26 and 22 bp respectively, on either side T-DNA.
  • Atgcsl gene comprising, relative to the sequence of the ArGCS gene) found naturally, several additions and deletions of nucleotides in the coding sequence.
  • plants carrying a mutated Atgcsl gene could be characterized in particular by the phenotype of their seeds which, for a quarter of them, are wrinkled and unable to germinate.
  • AtGCSI gene when present in the homozygous state in the genome, is lethal to the plant.
  • the genomic sequence of the Atgcsl gene as well as the nucleotide sequence SEQ ID No. 2 according to the invention are useful in particular for the development of various means intended to inhibit or block the synthesis of glucosidase I encoded by the AtGCSI gene. .
  • Atgcsl gene or of its transcription product is also useful for the development of various means of specific detection of the Atgcsl gene or of its transcription product, such means of detection allowing the person skilled in the art to determine if a plant of interest contains in its genome a functional AtGCSI gene or on the contrary a mutated Atgcsl gene, it being understood that the detection of the presence of at least one copy of the mutated Atgcsl gene in the genome of a plant makes it possible to select this plant for the production of non-allergenic proteins for humans.
  • a nucleic acid as defined above codes for at least part of the glucosidase I according to the invention and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this recombinant vector.
  • nucleic acid can also be used for the synthesis of nucleotide probes and primers intended for the detection or the amplification of nucleotide sequences included in genomic DNA, messenger RNA or even the cDNA of the AtGCSI gene in a sample.
  • nucleic acids of sequence complementary to those defined above it is also possible to use nucleic acids of sequence complementary to those defined above.
  • nucleic acid probes and primers hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of nucleotide sequence SEQ ID No. 2.
  • hybridization conditions within the meaning of the invention means the following hybridization conditions:
  • the DNA test is immobilized on type membranes GenScreenPlus ® TM NEN Life Science Product according to the manufacturer's instructions in the presence of 0.4 M NaOH; a night.
  • the membranes are washed with a 2 x SSC buffer (1 x SSC ... idem) then are prehybridized at least 30 min at 65 ° C in a hybridization buffer (Buffer: 7% SDS, 0.25M Na 2 HP0 4 , pH 7.4, 2 mM EDTA, 20 mg / l heparin, 0.1 mg / l single-stranded DNA from calf thymus).
  • a hybridization buffer Buffer: 7% SDS, 0.25M Na 2 HP0 4 , pH 7.4, 2 mM EDTA, 20 mg / l heparin, 0.1 mg / l single-stranded DNA from calf thymus.
  • the membranes are washed in a 2 x SSC buffer, 0.5% sarcosyl, 0.2% sodium pyrophosphate for 30 min at 65 ° C -
  • a second washing is carried out in a tapon 0 , 2 x SSC, 0.5% sarcosyl, 0.2% sodium pyrophosphate for 10 min at 65 ° C.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under high stringency conditions of a nucleic acid molecule with a length of 300 to 400 nucleotides. It goes without saying that the hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. .
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or even in the work of AUSUBEL et al; (1989).
  • the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 15 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, in particular of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2 or of its complementary sequence, of an acid nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the sequence SEQ ID No. 2 or of its complementary sequence or of a nucleic acid hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with the sequence SEQ ID No. 2 or its complementary sequence.
  • nucleotide probes or primers according to the invention have a length of at least 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 consecutive nuciéotides of a nucleic acid according to the invention, in particular nucleic acid of nucleotide sequence SEQ ID No 2, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 , 400 or 500 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, more particularly of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • primers and primer pairs are, for example, the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4, which make it possible to amplify the entire open reading frame of the messenger RNA of the Atgcsl gene.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques, such as phosphodiester methods of Narang et al. (1979) or Brown et al. (1979) cited above.
  • nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a label detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P, 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or even ligands such as biotin.
  • radioactive isotopes 32 P, 3 H, 35 S
  • fluorescent molecules 5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin
  • ligands such as biotin.
  • the labeling of a nucleic acid is preferably carried out by incorporating labeled molecules within these nucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the probes according to the invention can have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by URDEA et al;
  • oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern hybridizations with genomic DNA, or in hybridizations with messenger RNA of the gene
  • Atgcsl when a visualization of the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the microtiter plate wells, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips or even microparticles such as latex particles.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid of the AtGCSI gene in a sample, said method comprising the steps consisting in:
  • - contacting a probe or a plurality of nucleotide probes according to the invention with the sample to be tested, capable of containing a nucleic acid of the AtGCSI gene; - detect the hybrid possibly formed between the probe (s) and the nucleic acid present in the sample.
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid of the AfGCS 7 gene (gDNA, cDNA, mRNA) in a sample, said kit comprising:
  • nucleotide probes as described above;
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest of the AtGCSI gene or even to detect mutations in the coding regions of the AtGCSI gene, more particularly in the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2 where a nucleic acid of complementary sequence.
  • the nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any nucleotide fragment (gDNA, cDNA, mRNA) of AtGCSI, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2.
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid of the AtGCSI gene, and more particularly a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2 or a fragment or also a nucleic acid of sequence complementary to the latter, contained in a sample, said method comprising the steps consisting in:
  • At least one amplification cycle of the nucleic acid contained in the sample is carried out before the detection of the optionally amplified nucleic acid, preferably at least 10, and so quite preferred at least 20, amplification cycles.
  • the optionally amplified nucleic acid preferably at least 10, and so quite preferred at least 20, amplification cycles.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid of the AtGCSI gene (gDNA, cDNA or mRNA) according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2, said kit or kit comprising:
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as previously described, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid of the AtGCSI gene, of which amplification is sought.
  • primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from nucleotide sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4.
  • the invention also relates to methods for inhibiting or blocking the expression of the AtGCSI gene in plant tissue cells, for the production of glycosylated proteins by non-allergenic glycans, by suitable techniques well known in the art. skilled in the art.
  • AtGCSI gene In order to inhibit or block the expression of the AtGCSI gene in a plant, a person skilled in the art may in particular have recourse to the use of antisense polynucleotides, or even to co-suppression techniques.
  • the invention also relates to an antisense polynucleotide capable of specifically targeting a determined region of the AtGCSI gene and more particularly to a determined region of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, capable of inhibiting or blocking its transcription and / or its translation.
  • an antisense polynucleotide capable of specifically targeting a determined region of the AtGCSI gene and more particularly to a determined region of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, capable of inhibiting or blocking its transcription and / or its translation.
  • Such a polynucleotide meets the general definition of probes and primers according to the invention.
  • an antisense polynucleotide according to the invention hybrid with a sequence corresponding to a sequence localized in a region of the 5 ′ end of the messenger RNA of the AtGCSI gene, and very preferably close to the codon translation initiation
  • an antisense polynucleotide a person skilled in the art may advantageously refer to the cDNA sequence of the AtGCSI gene referenced as the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.
  • an antisense polynucleotide according to the invention comprises a sequence corresponding to one of the sequences located at the exon / intron junctions of the AtGCSI gene and preferably to the sequences corresponding to a splicing site, which can be determined according to techniques well known to man of the trade, on the basis of the description of the sequences of the invention, very particularly of the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 2.
  • an antisense polynucleotide according to the invention comprises all of the cDNA corresponding to the transcript of the AtGCSI gene. Most preferably, an antisense polynucleotide according to the invention comprises the nucleotide sequence SEQ ID No 2, or consists of the sequence SEQ ID No 2.
  • the antisense polynucleotides must have a sufficient length and melting temperature to allow the formation of an intracellular duplex hybrid having sufficient stability to inhibit the expression of the mRNA of AtGCSI.
  • an antisense polynucleotide according to the invention has a length of 15 to 4000 nucleotides.
  • An antisense polynucleotide of the invention preferably has a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 to 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 or 4000 nucleotides.
  • antisense polynucleotides those having a length of approximately 300 nucleotides or a length of approximately 4000 nucleotides are preferred respectively.
  • each of the antisense polynucleotides hybridizing with a distinct region of the AtGCSI gene or of its messenger RNA .
  • Other methods of implementing the antisense polynucleotides are for example those described by SCZAKIEL et al. (1995).
  • the subject of the invention is also any process well known to those skilled in the art making it possible to create modifications, for example one or more additions, deletions or substitutions of at least one nucleotide in the sequence of the AtGCSI gene, such modifications having as a consequence either an inhibition or a blocking of the transcription of the AtGCSI gene, or a defect in the splicing of the messenger pre-RNA, or an inhibition or a blocking of the translation of the mature messenger RNA, in glucosidase I according to l invention, either in the production of a mutated glucosidase 1 having reduced or zero catalytic activity.
  • a plant whose genome has been modified as described above is capable of synthesizing non-allergenic and / or non-immunogenic glycosylated modified proteins, in particular all of the proteins produced naturally by the plant and intended for human consumption or animals, such as those described by Zeng et al. (1997).
  • a plant affected in the expression of the catalytic activity of glucosidase I according to the invention can be used in order to produce specific recombinant proteins which are non-allergenic and / or non-immunogenic and intended for use in humans. or the animal.
  • the plants made deficient in the catalytic activity of glucosidase I according to the invention are used for the production of immunogenic proteins and non-allergenic antigenic proteins intended for the preparation of vaccines for human immunization or animal.
  • Any type of recombinant immunogenic or antigenic peptide or protein can thus be produced by a plant whose AtGCSI gene has undergone at least one addition, deletion or substitution of one or more consecutive nucleotides.
  • the N-glycans having undergone a partial maturation process due to the absence, or at a reduced level, of catalytically active glucosidase 1 in plants in which the A.GCS7 gene has been modified as described above. above, and which basically include the structure (Glc 3 Man 7 GlcNAc 2 ) can be used, after separation and purification, as vectors of compounds of therapeutic interest towards specific target cells in mammals and in particular in humans.
  • these partially modified glycans have a particular affinity for lectins expressed specifically on the membrane surface of certain cell categories and have already enabled the targeting of antiviral agents to hepatocytes and macrophages (Murray et al., 1987).
  • an overexpression of the AtGCSI gene or of its transcription product, or of the protein glucosidase I according to the invention will be sought.
  • AtGCSI gene in a plant can be achieved either by overexpression of the AtGCSI gene, or by the insertion of multiple copies of a polynucleotide coding for glucosidase I according to the invention in the plant, or even by a combination of these two strategies.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention.
  • such a recombinant vector comprises a nucleic acid chosen from the following nucleic acids:
  • nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide encoding a glucosidase I having the amino acid sequence SEQ ID No. 1; or a nucleic acid of complementary sequence;
  • nucleic acid comprising at least 20 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence; c) a nucleic acid comprising a sequence having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or a nucleic acid of complementary sequence;
  • vector in the sense of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • a recombinant vector according to the invention is either a cloning vector, an expression vector, or more specifically an insertion vector, a transformation vector or an integration vector. It can be a vector of bacterial or viral origin.
  • a recombinant vector according to the invention is used for the purpose of amplifying the nucleic acid which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host.
  • it is an expression vector comprising, in addition to a nucleic acid coding for a polypeptide in accordance with the invention, in particular the polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 1, regulatory sequences for directing transcription and / or translation.
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought as well as selection markers.
  • a recombinant vector according to the invention comprises an antisense polynucleotide or a homopurine or homopyridine polynucleotide, as defined above, if necessary placed under the control of appropriate regulatory sequences making it possible to ensure expression thereof. in a selected host cell or plant.
  • Such a recombinant vector is preferably used to inhibit the expression of the Atgcsl gene in the cell or in the plant.
  • a recombinant vector according to the invention comprises a polynucleotide coding for the ATGCS1 polypeptide or a polypeptide having at least 80% amino acid identity with the latter and retaining the biological activity of ATGCS1, placed under the control of regulatory sequence (s) allowing high level expression of ATGCS1 or its homolog in a host cell or in a chosen plant.
  • regulatory sequence s
  • Such a recombinant vector is useful for allowing a high level of expression of ATGCS1 in a plant.
  • such a recombinant vector is an integrative vector allowing the insertion of multiple copies of the coding sequence of ATGCS1 in the genome of a plant.
  • the bacterial promoters could be the Lacl, LacZ promoters, the RNA polymerase promoters of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for the expression of a nucleic acid encoding a glucosidase I according to the invention in plants are the CaMV 35 S promoter of the cauliflower mosaic virus (Odell et al., 1985) or also the promoter of the actin 1 gene from rice (McEIroy et al. 1990).
  • promoters useful for the expression of a polynucleotide of interest in plants are described in patents No. US 5,750,866 and US No. 5,633,363, incorporated herein by reference.
  • those skilled in the art can advantageously refer to the work by Sambrook et al. (1989) cited above or to the techniques described by Fuller et al. (1996), and Ausubel et al. (1989).
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR 322 (ATCC No. 37017) or also vectors such as pAA223- 3 (Pharmacia Uppsala, Sweden) and pGEMI, pBSSK and pGEM-T (Promega Biotech, Madison, WU, USA) and pUC19 (marketed by Boehringer Mannheim, Germany).
  • vectors pQE70, pQE60, pQE9 Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
  • baculovirus type vectors such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugidera.
  • vectors specially adapted for the expression of sequences of interest in plant cells such as the following vectors:
  • these vectors must be introduced into a host cell.
  • the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art for transform or transfect cells, either in primary culture or in the form of cell lines.
  • the invention further relates to a host cell transformed with a nucleic acid or with a recombinant vector according to the invention.
  • a transformed host cell is preferably of prokaryotic or eukaryotic origin, in particular bacterial, fungal or vegetable origin.
  • bacterial cells of different strains of E. coli or of Agrobacterium tumefaciens can be used.
  • the transformed host cell is a plant cell or also a plant protoplast.
  • it is a cell or a protoplast of rapeseed, tobacco, corn, barley, wheat, alfalfa, tomato, potato, banana or of Arabidopsis thaliana.
  • the invention also relates to a transformed plant multicellular organism, characterized in that it comprises a transformed host cell or a plurality of host cells transformed with a nucleic acid according to the invention or with a recombinant vector according to the invention.
  • the plant multicellular organism is transformed with one or more antisense nucleotides and / or one or more homopurine or homopyrimidine polynucleotides in order to inhibit or block the expression of the AtGCSI gene in this organism.
  • the plant multicellular organism is transformed with one or more copies of a polynucleotide coding for glucosidase I according to the invention or for a polypeptide having at least 80% amino acid identity with glucosidase I and retaining the biological activity allowing the normal maturation of the glycans attached to the glycosylation sites of the proteins being synthesized.
  • the subject of the invention is also a transgenic plant, that is to say a transformed plant comprising, preferably in a form integrated into its genome, a nucleic acid of the Atgcsl gene and preferably an antisense polynucleotide or also a nucleic acid coding for the ATGCS1 polypeptide or a homologous polypeptide, said nucleic acid having been inserted into the genome of the plant by transformation with a nucleic acid of AtGCSI or a recombinant vector according to the invention.
  • a plant transformed according to the invention is rapeseed, tobacco, corn, soybeans, wheat, barley, alfalfa, tomato, potato, a fruit plant such as banana or Arabidopsis thaliana.
  • the transgenic plants as defined above exhibit reduced expression, undetectable expression or absence of expression of the AtGCSI gene and are thus capable of allowing the production of proteins with modified glycosylation and non-allergens and / or not immunogenic for humans or animals.
  • such plants synthesize a protein of interest whose coding sequence has been introduced artificially, this coding sequence possibly being in a form not integrated into the genome of the plant, or on the contrary in a form integrated into the plant genome.
  • the protein of interest can be of any kind, preferably a protein intended for food or for human or animal therapy, in particular immunotherapy or vaccination.
  • the invention thus also relates to a modified glycosylation protein, characterized in that it is produced by a plant transformed according to the invention, or also by a host cell transformed according to the invention, in which the expression of the AtGCSI gene is inhibited or blocked, or characterized in that it is contained in a seed of a plant transformed according to the invention.
  • the modified glycosylation protein is a recombinant protein. It may be a recombinant protein intended for food or for human or animal therapy. Such a recombinant protein can be an antigen or an immunogen useful in a vaccine composition.
  • the invention also relates to the addition of one or more N-glycosylation site (s) in a recombinant protein of interest in order to modify its targeting and / or its stability, in plant cells, plant tissue or a plant transformed according to the invention.
  • N-glycosylation site s
  • the transgenic plants as defined above have the property of strongly expressing a glucosidase I according to the invention.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a transgenic plant transformed with a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • step c) selection of the plants obtained in step b) having integrated the nucleic acid of interest.
  • the invention also relates to a process for obtaining a transgenic plant, transformed with a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the steps consisting in:
  • step b) regenerating an entire plant from transformed plant cells obtained in step a);
  • the invention also relates to a process for obtaining a transformed plant, characterized in that it comprises the following steps:
  • Any of the methods for obtaining a transgenic plant described above can also comprise the following additional steps:
  • step c) crossing between them of the two transformed plants as obtained in step c);
  • any of the methods described above may further comprise the following steps:
  • step d) crossing a transformed plant obtained in step c) with a plant of the same species;
  • step d) selection of the plants resulting from the crossing of step d) having conserved the transgene.
  • a person skilled in the art is capable of implementing numerous methods of the state of the art in order to obtain plants transformed with a nucleic acid of the AtGCSI gene according to the invention.
  • Those skilled in the art may advantageously refer to the technique described by BECHTOLD et al. (1993) in order to transform a plant using the bacterium Agrobacterium tumefaciens.
  • the invention further relates to a transformed plant as obtained according to any one of the production methods described above.
  • the invention also relates to a plant seed, part or all of the constituent cells of which comprise a nucleic acid of the AtGCSI gene according to the invention which has been artificially inserted into their genome.
  • the invention also relates to a seed of a transgenic plant as defined above.
  • the invention also relates to a plant cell comprising a nucleic acid of the AtGCSI gene.
  • the nucleic acid of the AtGC1 gene is in a form integrated into the genome of said plant cell.
  • the invention also relates to a plant tissue consisting of a set of transformed plant cells as defined above.
  • Another subject of the invention consists in the use of a nucleic acid of the AtGCSt gene according to the invention for the expression in vitro or in vivo, preferably in planta, of glucosidase I according to the invention or of a peptide fragment thereof.
  • the invention also relates to the use of an antisense nucleic acid according to the invention for inhibiting or blocking the expression of the gene coding for glucosidase I according to the invention.
  • an antisense nucleic acid according to the invention for inhibiting or blocking the expression of the gene coding for glucosidase I according to the invention.
  • the above uses are characterized in that it is an expression in vivo in a plant transformed with such a nucleic acid.
  • the invention also relates to the use of an antisense nucleic acid according to the invention for inhibiting or blocking the expression in vitro or in vivo of the gene coding for glucosidase I according to the invention, and very particularly glucosidase I having the amino acid sequence SEQ
  • the antisense nucleic acid or the homopurine or homopyrimidine nucleic acid is preferably used to inhibit or block the expression of the AtGCSI gene in vivo, in the plant transformed with such a nucleic acid.
  • the glucosidase I according to the invention having the amino acid sequence SEQ ID No. 1 has a length of 852 amino acids.
  • This protein has a calculated molecular weight of 97.5 kDa.
  • the Applicant After analyzing the sequence, the Applicant has identified a hydrophilic region containing several arginines including the N-terminal part of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 1, this hydrophilic region containing the consensus signal for retention in the endoplasmic reticulum of type II membrane proteins, the C end of which -terminal is in the lumen.
  • This hydrophilic region consists of the region ranging from the amino acid in position I to the amino acid in position 38 of the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the glucosidase 1 according to the invention also comprises a hydrophobic region corresponding to a transmembrane domain, this hydrophobic region ranging from the amino acid in position 38 to the amino acid in position 17 of the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the glucosidase I comprises a unique site for attachment to the localized glycan from the amino acid in position 598 to the amino acid in position 606 of the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • a unique glycosylation site has also been identified, which extends from the amino acid at position 662 to the amino acid at position 664 of the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the glucosidase I comprises a large hydrophilic region, probably localized in the lumen of the endoplasmic reticulum, extending from the amino acid at position 68 to the C-terminal amino acid at position 852 of the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to a polypeptide encoded by a nucleic acid of the AtGCSI gene, and preferably a polypeptide comprising at least 7 consecutive amino acids of glucosidase I of amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • such a polypeptide comprises at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, or 800 consecutive amino acids of the ATGCS1 polypeptide of amino acid sequence SEQ ID N ° 1
  • the invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequences having at least 80% amino acid identity with the sequence of the ATGCS1 SEQ ID No. 1 polypeptide, or to a peptide fragment of the latter.
  • part of the invention is a polypeptide having at least 60%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% of amino acid identity with the sequence of the ATGCS1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1, or a peptide fragment thereof.
  • polypeptides according to the invention are in an isolated or purified form.
  • the invention also relates to a process for the production of the ATGCS1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1, or a peptide fragment of the latter.
  • step b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a);
  • step c) separating and purifying from the culture medium or from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide;
  • the peptides according to the invention can be characterized by fixation on an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against these polypeptides in which a fragment or a variant thereof has been immobilized beforehand.
  • a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through a chromatography column according to the methods known to those skilled in the art and described for example by AUSUBEL F. et al. (1989) cited above.
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or in solid phase.
  • a polypeptide according to the invention could be prepared by the technique in homogeneous solution described in HOUBEN WEYL (1974) or also the technique of synthesis in solid phase described by MERRIFIELD (1965a, 1965b).
  • polypeptides called “homologous” to ATGCS1 polypeptides, or their fragments are also part of the invention.
  • Such homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptide.
  • the equivalent amino acids according to the present invention will be understood, for example the replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or else the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two acid amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
  • a polypeptide comprising amino acid modifications of 1, 2, 3, 4, 5, 10 to 20 substitutions, additions or deletions of an amino acid with respect to the amino acid sequence of the ATGCS1 polypeptide according to the invention.
  • the polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid retain their ability to catalyze the cleavage of the first glucose residue of the structure precursor ⁇ / -glycan (Glc 3 Man g GlcNAc 2 ), which can be easily determined by a person skilled in the art, for example using the techniques described by Sambrook and al., (1989).
  • the polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid retain their ability to be recognized by antibodies directed against the ATGCS1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for a polypeptide as defined above.
  • a polypeptide derived from the ATGCS1 protein is useful in particular for the preparation of antibodies intended for the detection of the presence of this polypeptide or of a peptide fragment of the latter in a sample.
  • antibodies directed against these polypeptides are used to quantify the synthesis of glucosidase I, for example in the cells of a plant, and thus determining the capacity of this plant to synthesize mature glycans at the glycosylation sites produced by the cells of said plant.
  • Preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the amino acid sequence ranging from the amino acid in position 1 to the amino acid in position 38 (N-terminal hydrophilic region) of the sequence of the ATGCS1 polypeptide with sequence SEQ ID N ° 1.
  • a second class of preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the amino acid sequence ranging from the amino acid at position 39 to the amino acid at position 67 (transmembrane domain) of the sequence of the ATGCS1 polypeptide of SEQ ID N ° 1.
  • a third class of preferred antibodies according to the invention are antibodies which specifically recognize the amino acid sequence ranging from the amino acid at position 68 to the amino acid at position 852 (region hydrophilic comprising the catalytic site) of the ATGCS1 polypeptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • a fourth class of preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the glycan binding site of the ATGCS1 protein, and more particularly those recognizing a peptide of sequence "ERHVDLRCW”.
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and MILSTEIN (1975).
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the triome technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,768 or by MARTINEAU et al. (1998).
  • ScFv single chain Fv antibody
  • the antibodies according to the invention also include fragments of antibodies obtained using phage libraries (RIDDER et al., 1995), REINMANN K.A. et al., 1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended for the identification of the presence and / or of the amount of glucosidase I according to the invention or of a peptide fragment of this protein, present in a sample.
  • An antibody according to the invention may also comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example fluorescent, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • an isotopic or non-isotopic detectable marker for example fluorescent
  • a molecule such as biotin
  • the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a plant glucosidase I or also of a peptide fragment of one of these polypeptides according to the invention, in a sample, said method comprising the stages consisting of: a) bringing the test sample into contact with an antibody as defined above;
  • the invention also relates to a diagnostic kit or kit for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising:
  • FIG. 1 illustrates gel electrophoresis of proteins extracted from Arabidopsis thaliana seed cells of wild type (wild Ws ecotype) and of ecotype seed cells in which the AtGCSI gene has been interrupted by the insertion of a sequence T-DNA from
  • Agrobacterium tumefaciens also from the Ws ecotype.
  • Gel No. 1 on the left is an SDS-PAGE electrophoresis gel on which the proteins which have migrated have been stained using silver nitrate.
  • Gel No. 2 was incubated in the presence of an anti-xylose antibody.
  • Gel No. 3 was incubated in the presence of an anti-fucose antibody.
  • FIG. 3 MALDI-TOF mass spectra of N-glycans isolated from wild seeds (Fig. 3A) and from seeds carrying the mutated AtGCSI gene (Fig 3B). On the abscissa, value m / z representing the mass / load ratio.
  • EXAMPLE 1 Isolation of the cDNA Encoding Glucosidase I from Arabidopsis thaliana
  • RNA of 8-day-old seedlings is extracted using the RNeasy Plant Minikit kit from QUIAGEN (Germany), according to the protocol provided by the manufacturer.
  • a DNA degradation step was systematically carried out on the extraction column (RNase free DNase, QIAGEN, Germany), according to the manufacturer's instructions. All the manipulations are carried out with Rnase-free material and DEPC water is used (0.1% of diethyl pyrocarbonate autoclave after stirring for 12 hours).
  • the following steps are exactly those described in the kit manual provided by QUIAGEN.
  • the lysate placed in a column and its 2 ml collecting tube, is centrifuged for 2 min. The filtrate is collected and washed with 0.5 volume of 96-100% ethanol.
  • RNAs are retained by the column. 350 ⁇ l of RW1 washing buffer are added to this column to wash the RNAs by centrifugation for 15 sec at 10,000 rpm. A DNase treatment is then carried out (10 ⁇ l of Dnase and 70 ⁇ l of buffer, QIAGEN) for 15 min at room temperature. Wash buffer RW1 (350 ⁇ l) is again applied to complete the wash. The column is then installed in a new 2ml collecting tube and two successive washes are carried out with 500 ⁇ l of the RPE washing buffer added with ethanol. Finally, the RNAs are eluted from the column with 30 to 50 ⁇ l of water treated with DEPC after a centrifugation for 1 min at 10,000 rpm. The RNAs are stored at -80 ° C.
  • the cDNAs, single strands, as well as the amplification products are obtained with the "Enhanced avian RT-PCR kit” system (SIGMA, USA).
  • SIGMA "Enhanced avian RT-PCR kit” system
  • the reverse transcription takes place under the following conditions: - 10 ⁇ l of the RNA extraction
  • the mixture is incubated for 15 min at 25 ° C. to allow the hybridization of the oligonucleotide dT, and then the retrotranscription is carried out for 50 min at 42 ° C.
  • the synthesized cDNAs are then amplified by PCR.
  • thermocycler MJ Research PTC100 -96, Prolabo, France
  • 0.2 ml tubes Prolabo, France
  • Oligonucleotides specific for AtGCSI were chosen to amplify the coding sequence. This is "ATG"
  • the identification of the interrupted atgcsl gene was carried out by isolating the genomic borders of the T-DNA originating from the A. thalmiana atgcsl ecotype (insertion mutant), by the “walking by PCR” technique ( walk-PCT) described by Devic et al. (1997).
  • sequences of the DNA fragments thus cloned were compared with those contained in the databases. These sequences have a very strong similarity with the T1F15 bac sequence from the DNA library of Arabidopsis thaliana TAMU and listed in the database.
  • the DNA insert of Arabidopsis thaliana contained in the T1 F15 tray is a portion of chromosome 1 and has been mapped as being between the positions cM98 and cM99 of chromosome 1, that is to say on a region of the chromosome 1 at the opposite end of the centromere.
  • the exact intron / exon structure of the Atgcsl gene could be established by aligning the cDNA sequence with that of the genomic clone listed in the Gen Bank database under the reference AC004393. Differences should be noted compared to the predicted coding sequence of the T1 F15.4 gene in the databases.
  • the Atgcsl gene actually has 22 exons and 21 introns. Exons n ° 4 and 16 have been added and exons n ° 5, 6, 15 and 17 shortened compared to the base predictions.
  • the AG splice sites at the end of the intron and GT at the start are found each time, except for the ninth intron which begins with GC. There are also some point differences. They may be due to the difference in ecotypes used to make the BAC bank (Columbia) and or to amplify the cDNA (Wassilevskija).
  • Example 3 Analysis of the structure of the glucosidase I of Arabidopsis thaliana encoded by the AtGCSI gene.
  • the AtGCSI protein has a size of 852 amino acids and an estimated molecular mass of 97.5 kDa. This corresponds well to the data in the bibliography, the glucosidases I purified up to now having a molecular mass of between 85 and 95 kDa. (Pukazhenthi et al., 1993) Based on this new protein sequence, research on databases has been deepened. The table below shows the similarity between the AtGCSI proteins and the already characterized glucosidases I.
  • the percentages of identity (38%) and similarity (54%) obtained between the sequence of AtGCSI and the human protein are insufficient to conclude that the glucosidase I activity of AtGCSI.
  • the percentages of identity and similarity were obtained using DNA STRIDER T'M 1.3 software.
  • Glucosidase I from bean seedlings (Vigna radiata, Zeng and
  • Albein, 1998) was purified and the sequencing of four peptides was carried out. The sequences of these four peptides align with the protein sequence of ATGCS1 and human glucosidase I.
  • T1 F15.4 codes for the functional homolog of bean glucosidase I. This data is of the same level as the indications of the databases on T1 F15.4 (putative gene), which moreover do not make it possible to obtain the true coding sequence.
  • Glucosidase I is a type II membrane protein (the C-terminal end is in the lumen), and should have, like the proteins located in the lumen, a consensus signal of retention in the RE of the type: two arginines in the first AA in N-Term (Sh ⁇ tze ef al., 1994).
  • the N-terminal protein sequence (MTGASRR), has two arginines in the first amino acids, (for humans, the sequence begins with: MARGER).
  • a hydrophilic zone extends from residues 1 to 38, which could correspond to the cytoplasmic domain of the human protein (1 to 39). Then a hydrohobe domain extends to AA 67, which corresponds to the transmembrane domain of the human protein (39 to 5). The rest of the protein is quite hydrophilic, the part that is probably in the lumen.
  • the glucosidases I characterized at the biochemical level all present a unique site of N-glycosylation, which is found in an equivalent position in the human protein (NHT 657-659), and in the Arabidopsis protein (NHT 662-664).
  • ERHLDLRCW The glycan binding site has been described in the human protein as the peptide ERHLDLRCW (Romaniouk and Vijay, 1997). This peptide is located in position 594. In the ATGCS1 protein, there is a similar peptide (ERHVDLRCW) in position 598.
  • EXAMPLE 4 Analysis of the tissues and seeds of Arabidopsis thaliana plants, the AtGCSI gene of which is interrupted by the T-DNA of Airobacterium tumefaciens,
  • a transmission electron microscopy approach made it possible to better visualize the disorganization of the cells of the homozygous mutant. Observations were made in the cotyledons and in the protodermis. Protein bodies in the wild, non-mutated plant have organized, circular structures with sparse areas. We can visualize 2 to 5 per cell. Lipid bodies fill the entire cell, a nucleus can be observed in each cell. In the mutant plant, the lipid bodies are not altered, they are present in large numbers and fill almost the entire cell. Protein bodies, on the other hand, are altered. They are not present in all cells, and when one can be observed, it is not circular and usually surrounds a vacuole.
  • the extraction and transfer of proteins from the electrophoresis gel onto a nitrocellulose membrane is carried out according to the technique described by Towbin et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354).
  • the material used for the transfer (nitrocellulose membrane, Whatmann 3 MM paper, scotch brite) is balanced 15 to 30 min in the transfer buffer (Tris 25 mM; glycine 120 mM; methanol 10%).
  • the transfer cassette is placed in a transfer tank containing 600 ml of the buffer described above.
  • a satisfactory transfer of the proteins from the electrophoresis gel to the nitrocellulose membrane is obtained in 2 h under an electrophoretic field of 10 V.cm ⁇ 1 .
  • a control of the efficiency of the transfer is carried out by reversible staining of the nitrocellulose membrane with Ponceau S red (1% (w / v) in TCA 3%) Discoloration of the nitrocellulose membrane after treatment with Ponceau S red is obtained after rinsing with a TBS buffer (500 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl , pH 7.4) All these steps for treating the nitrocellulose membrane, called the imprint after transfer, are carried out with gentle stirring at room temperature.
  • the nitrocellulose coupling sites still available after the transfer of the proteins are saturated by an incubation of one hour in a saturation solution. (3% gelatin dissolved in TBS buffer). After saturation of the membrane, the proteins are immunodetected. The impression is incubated for 90 min in the presence of a polyclonal rabbit immunum diluted to 1/1000 th in a solution of gelatin at 1% (w / v) in TBS buffer. After this incubation, the unbound antibodies are removed by a series of 4 washes of 15 min in TTBS buffer (TBS buffer + 0.1% Tween 20).
  • the impression is then subjected to an incubation in the presence of a second antibody coupled to horseradish peroxidase (goat IgG, anti-rabbit IgG, coupled to horseradish peroxidase, Bio-Rad).
  • This second antibody is diluted 1/3000 ee in a 1% (w / v) gelatin solution in TBS buffer for 90 min.
  • the excess of second conjugated antibody is removed by 4 washes of 15 min in TTBS buffer.
  • Tween 20 is removed at the end of the treatment by washing the impression in the TBS buffer for 15 min.
  • the proteins recognized by the rabbit IgG immunoglobulins are revealed by incubating the membrane in a mixture containing 30 mg of 4-chloro-1-naphthol (HRP color reagent, Bio-Rad) dissolved in 10 ml of methanol and added with 50 ml. of TBS buffer containing 30 ⁇ L of H 2 O 2 30%.
  • HRP color reagent Bio-Rad
  • Concanavalin A is a lectin from the legume seed Canavalia ensiformis which specifically recognizes ⁇ -linked mannose residues of oligomannosidic glycans associated with proteins and also peroxidase.
  • the membrane is washed by 4 baths of 15 min in TTBS supplemented with salts, in order to remove the ConA which is not fixed or fixed at non-specific sites
  • the membrane is then incubated for 60 min in TTBS supplemented with salts in the presence of 50 ⁇ g.mL "1 of horseradish peroxidase.
  • the excess peroxidase is removed by 4 successive washes of 15 min in TTBS supplemented with salts. Washing the imprint in TBS buffer supplemented with salts allows the elimination of Tween 20.
  • the revelation of the peroxidase activity is carried out as described for the immunoetection.
  • N-glycosylation of proteins in homozygous seeds was carried out and the results obtained are presented in FIG. 1.
  • the detection of complex oligosaccharides is carried out using anti-xylose and anti-fucose antibodies; all the bands disappear in the mutant, there is no complex N-glycan. The mutated plant is therefore clearly affected in the maturation of N-glycans, at the level of glucosidase 1.
  • Atgcsl mutant is incapable of catalyzing the addition reaction of a xylose residue in position ⁇ 1-2 or a fucose residue in position ⁇ 1-3 on the glycans of the glycoproteins that he produces.
  • the profile of the glycoproteins presenting the oligomannosidic type glycans is strongly modified in the mutant.
  • Example 6 Analysis of glycans attached to proteins synthesized in plants mutated on the AtGCSI gene.
  • Crude protein extracts were obtained by grinding 100 mg of A. seeds. thaliana in 10 mL of 50 mM Hepes buffer, pH 7.5 containing 2 mM sodium bisulfite and 0.1% SDS. The insoluble material was removed by centrifugation and then the proteins were precipitated by the addition of two volumes of ethanol at -20 ° C. The base has then heated for 3 min in 2 mL of 50 mM Tris HCl buffer pH 7.5 containing 0.1% SDS. After the solution had cooled, 0.1 U of Endo H was added and the solution was incubated for 18 h at 37 ° C. The N-glycans were then purified by successive elutions on columns C18 (Bond Elut), of AG 50W-X2 and of carbograph as described previously in the literature (Bardor et al., 1999).
  • Dionex DX500 equipped with a GP50 pumping system, an ED40 detector and a Carbopac PA1 column (4.6x250 mm).
  • the N-glycans were eluted by means of a linear gradient of 60 min ranging from 0 to 200 mM of sodium acetate in 100 mM sodium hydroxide.
  • the MALDI-TOF mass spectrum were recorded on a Micromass Tof spec E device.
  • the spectra were performed in positive and reflectron mode with an acceleration voltage of 20 kV, a pressure of 10 "7 mbar in the source and 10 "6 mbar in the analyzer.
  • the nitrogen laser was set to 337 nm with a pulse duration of 4 ns.
  • the device was calibrated with substance P (1347.7 Da) and human adrenocorticotropic hormone (2465.2 Da).
  • the solution containing the sample was prepared at an approximate concentration of 10 pmole. ⁇ L "1 in water.
  • N-glycans were released from the protein extracts of seeds by treatment with Endo H.
  • This endoglycosidase specifically cleaves the glycosidic bond between the two GIcNAc of the chitobiose unit of the oligomannosidic N-glycans.
  • the HPAE-PAD chromatographic profile of N-glycans released from wild seeds shows six major peaks. These peaks were attributed to the Man 5 GlcNAc to MangGlcNAc structures (see Table I) by comparison of their retention times with standard structures as previously described in the literature (Rayon et al., 1996). These oligomannosidic structures were previously characterized from wild Arabidopsis plants by Rayon et al.
  • the N-glycans associated with the proteins of the mutant seeds were analyzed according to the same principle from the mixture of homozygous and heterozygous seeds.
  • the HPAE-PAD profile ( Figure 2B) shows a set of peaks between 16 and 22 min, similar to those detected from wild seeds ( Figure 2A). These peaks were attributed to the oligomannosidic N-glycans Man 5 GlcNAc to MangGlcNAc. In addition to these structures, a peak at 29 min was detected. The nature of the oligosaccharide (s) contained in this peak was first studied by comparison of its retention time in HPAE-PAD with compounds of known structures.
  • the first structure was previously characterized from sycamore cells after treatment with castanospermine (Lerouge et al., 1996), the second structure carries an additional mannose residue probably resulting from the partial action of ⁇ -mannosidase I at level of the Golgi apparatus.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle glucosidase I végétale et des acides nucléiques codant pour cette enzyme participant à la N-glycosylation des protéines en cours de traduction. Elle concerne aussi des moyens de détection de cette protéine et de ces acides nucléiques, tels que des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques.

Description

Titre : NOUVELLE GLUCOSIDASE I DE PLANTE ET SON APPLICAΗON A LA PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES A GLYCOSYLATION MODIFIEE
La présente invention concerne une nouvelle glucosidase I végétale et des acides nucléiques codant pour cette enzyme participant à la N- glycosylation des protéines en cours de traduction. Elle concerne aussi des moyens de détection de cette protéine et de ces acides nucléiques, tels que
5 des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques.
L'invention est également relative à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant pour la nouvelle glucosidase I de plante, à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, ainsi qu'à des plantes transgéniques 10 dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention a également trait à des moyens destinés à augmenter ou au contraire à inhiber l'expression d'un acide nucléique codant pour la nouvelle glucosidase I dans des plantes, dans le but de produire des
15 protéines, tout particulièrement des protéines recombinantes, dont la glycosylation est modifiée.
Chez les plantes, comme chez tous les eucaryotes, la N- glycosylation consiste en la fixation covalente d'un oligosaccharide plus ou moins complexe sur une protéine, au niveau d'un site de glycosylation 20 constitué de la séquence en acides aminés NXS/T, X représentant n'importe lequel des acides aminés, à l'exception de la proline (P) et de l'acide aspartique (D).
Le processus de N-glycosylation débute dans le réticulum endoplasmique avec le transfert d'un oligosaccharide précurseur du type 25 (Glc3 Mang GlcΝAc2) sur le résidu N d'un site de glycosylation de la protéine en cours de traduction.
Cet oligosaccharide précurseur subit des modifications dans le réticulum endoplasmique. En premier lieu, la glucosidase I coupe un glucose et la glucosidase II coupe les deux glucoses suivants, l'oligosaccharide fixé 30 sur le site de glycosylation ayant alors la forme (Man9 GlcNAc2).
Dans un second temps, la protéine est transférée dans l'appareil de
Golgi au sein duquel l'oligosaccharide va subir de nombreuses modifications additionnelles. En particulier, des résidus α-1 ,3 fucose et β-1 ,2 xylose peuvent être ajoutés. Les résidus α-1 ,3 fucose et β-1 ,2 xylose sont
35 spécifiques des plantes et semblent être présents chez les mollusques, les insectes et les nématodes; ils n'ont jamais été identifiés chez les mammifères.
Les glycannes fixés sur les sites de glycosylation des protéines jouent un rôle important dans de nombreux mécanismes. Ils permettent notamment le maintien de la structure de la protéine dans une conformation biologiquement active, ils assurent une protection de la chaîne peptidique vis-à-vis de l'attaque des enzymes protéolytiques et peuvent intervenir dans les phénomènes de reconnaissance cellulaire (Weil et al., 1989).
La glucosidase I est aussi désignée mannosyl-oligosaccharide glucosidase, dont le classement international est EC : 3.2.1.106.
La glucosidase I est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique de type 11, dont l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen du réticulum endoplasmique.
Cette enzyme catalyse la première étape de la N-glycosylation, en hydrolysant le résidu glucose terminal de l'oligosaccharide précurseur. Cette protéine a été purifiée et caractérisée chez plusieurs espèces.
Chez la levure, la glucosidase I a une taille de 95 kDa (Bause et al., 1986). La glucosidase I a également été isolée et caractérisée à partir du foie de porc (Bause et al., 1989), de la glande mammaire de bovin où elle semble être présente sous forme de tétramere (Schailubhai et al., 1987) et du foie de veau (Hettkamp et al., 1984). Dans ces trois espèces, la glucosidase I a une taille de 85 kDa et les similarités dans leurs séquences d'acides aminés respectives montrent que cette protéine est assez bien conservée au cours de l'évolution (Pukkazhenti et al., 1993). Un ADΝc humain de 2881 pb codant pour une glucosidase I a également été isolé (Kalz-Fuller et al., 1995). L'analyse de la séquence en acides aminés déduite de la séquence de l'ADΝc a mis en évidence un site potentiel de glycosylation sur l'acide aminé en position 655, la présence d'une zone très hydrophobe correspondant à la région transmembranaire putative allant de l'acide aminé en position 38 à l'acide aminé en position 58 vers l'extrémité Ν-terminale et en présence d'une région cytosolique de 37 acides aminés à l'extrémité Ν-terminale ainsi que d'une région C-terminale étendue située dans le lumen du réticulum endoplasmique. Il s'agit d'une protéine membranaire de type 11. Chez les végétaux, la glucosidase I a été isolée à partir de plantules de haricot (Mung Bean) par (Szumilo et al. 1986), cette enzyme ayant été étudiée en détail par Zeng et al. en 1998. Cette glucosidase I a une taille de 97 kDa et se distingue des glucosidases I animales par une sensibilité différente à des agents modifiant les acides aminés.
Par exemple, un agent modifiant des histidines inactive la glucosidase I de haricot mais pas celle de foie de porc, alors qu'un agent modifiant des cystéines n'inactive que la glucosidase I de foie de porc.
Qu'elles soient originaires d'une levure, d'un mammifère ou d'une plante, les glucosidases 1 connues possèdent en commun certains caractéristiques: il s'agit d'une α-1 ,2-glucosidase dont l'activité catalytique ne nécessite pas la présence d'un ion métallique, et qui est N-glycosylée sur un seul site .
A ce jour, aucun ADN génomique ou ARN messager codant pour une glucosidase I végétale n'a encore été isolé et caractérisé.
Or, il existe actuellement un besoin très important de moyens permettant de produire des polypeptides d'intérêt industriel dans les plantes, notamment de protéines recombinantes, et dont la glycosylation est modifiée. En particulier, il existe un besoin accru de protéines produites dans les plantes, ne possédant pas des caractéristiques allergisantes conférées par les résidus fucose et xylose contenus dans les oligosaccharides complexes fixés au niveau des sites de glycosylation des protéines d'origine végétale. II existe aussi un besoin accru en protéines provenant de céréales dépourvues d'effet allergisant ou encore de protéines recombinantes d'intérêt alimentaire ou thérapeutique ne provoquant pas de phénomène d'allergie chez le consommateur ou le patient.
Afin de modifier la nature de la N-glycosylation chez les plantes, il a été envisagé de stopper la cascade des réactions enzymatiques de glycosylation, avant les étapes de maturation des glycannes, ou encore de faire produire aux plantes, par transgénèse, des oligosaccharides complexes de type animal (Chrispeels et Faye, 1998).
Il a également été envisagé d'utiliser de la castanospermine, qui est un agent inhibiteur de la glucosidase I, notamment dans des cultures de cellules végétales en fermenteur, de manière à synthétiser des protéines portant un N-glycanne de structure proche du précurseur commun à tous les eucaryotes.
L'invention a permis d'isoler et de caractériser pour la première fois le produit de transcription d'un gène codant pour une glucosidase I végétale catalysant le clivage du premier résidu glucose externe de l'oligosaccharide précurseur (Glc3 Man9 Glc NAc2) et ainsi de rendre accessibles à l'homme du métier des moyens permettant de moduler l'expression du gène correspondant chez une plante et en particulier d'inhiber ou de bloquer la traduction de la glucosidase I chez une plante, de manière à produire chez cette plante des protéines glycosylées ne comportant pas de résidus osidiques allergéniques et/ou immunogènes, tels que les résidus fucose et xylose.
Le demandeur a ainsi isolé et caractérisé un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager codant pour une glucosidase I chez Arabidopsis thaliana, le gène correspondant étant désigné AtGCSI.
Le demandeur a également montré que l'interruption de la séquence génomique du gène AtGCSI chez une plante conduisait à la production de protéines dont la glycosylation est modifiée. Plus particulièrement, il a été montré que le blocage de l'expression du gène AtGCSI selon l'invention provoquait la production de protéines dont les sites de glycosylation étaient occupés par des oligosaccharides précurseurs et non des N-glycannes matures. L'analyse des protéines produites par les plantes dans lesquelles l'expression du gène AtGCSI a été bloquée a permis de déterminer une absence totale de résidus xylose et fucose allergènes. Le blocage de l'expression du gène de la glucosidase I végétale AtGCSI entraîne l'arrêt du développement de la graine.
Un mutant d'insertion d'ADN-T affecté dans la N-glycosylation des protéines a été isolé. L'ADN-T est inséré dans un gène localisé sur le BAC T1 F15 issu de la banque d'ADN de Arabidopsis thaliana TAMU de l'écotype
Columbia qui est répertoriée dans la base de données Gen Bank sous le numéro d'accès AC004393.
La séquence répertoriée dans la base de données précitée est annotée comme étant similaire à la glucosidase I humaine. La séquence génomique du gène AtGCSI possède également une forte similarité (66% d'identité en acides nucléiques) avec une séquence du BAC F316 de la banque de données IGF répertoriée dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AC002396. La séquence contenue dans le BAC F3I6 est également annotée comme étant similaire à la glucosidase I humaine. Des homologies entre la séquence codante du gène AtGCSI ont été retrouvées, par exemple avec la glucosidase 1 de souris, de rat et de l'homme (38% d'identité en acides nucléiques) d'une protéine putative de C. elegans (36% d'identité en acides nucléiques) ou de Schizzo. pombe (31 % d'identité en acides nucléiques) ou encore de levure (28 % d'identité en acides nucléiques).
La séquence du gène décrit dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AC004353 comprendrait 20 exons et 19 introns. Selon une telle analyse, la séquence du gène contenu dans le BAC T1 F15 serait transcrite en un ARN messager codant pour une protéine putative d'une longueur de 864 acides aminés.
Le gène AtGCSI selon l'invention, qui comprend 22 exons et 21 introns, permet la synthèse d'un ARN messager codant pour une glucosidase I d'une longueur de 852 acides aminés. Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase I ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière préférée, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée et/ou purifiée.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention, désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou de l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présence invention, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN , d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
L'invention concerne également un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc de séquence nucléotidique SEQ ID N°2 codant pour la glucosidase l végétale selon l'invention ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
En particulier, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant la séquence nucléique SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention a encore pour objet un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'un des acides nucléiques suivants: a) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase I ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotide SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; c) un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,8% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-après.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps") par rapport à la séquence de référence
(qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans l'outil logiciel de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE
PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité entre deux séquences est effectué à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de
Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F.
ALTSCHUL et al., 1990); SF ALTSCHUL et al.,1997). Chacun des acides nucléiques selon l'invention qui comprend tout ou partie de l'ARNm ou de l'ADNc correspondant aux produits de transcription du gène AtGCSI codant pour une glucosidase I végétale peut être aisément obtenu par l'homme du métier qui en connaît sa séquence nucléotidique divulguée dans la présente description. L'homme du métier peut également reproduire l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention en construisant, sur la base des séquences divulguées dans la présente description, des amorces oligonucléotidiques capables d'amplifier tout ou partie de ces acides nucléiques, par exemple en extrayant les ARN totaux à partir de différents tissus végétaux, puis en synthétisant les ADN complémentaires à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse avant de réaliser plusieurs cycles d'amplification des ADNc obtenus à l'aide d'une ou plusieurs amorces hybridant spécifiquement avec les séquences cibles dont l'obtention est recherchée. Un tel mode de reproduction des acides nucléiques selon l'invention est par exemple décrit dans l'exemple 1.
Après amplification spécifique d'un acide nucléique selon l'invention à l'aide des amorces appropriées, les différents acides nucléiques amplifiés peuvent alors être soumis à une étape de ligation dans un vecteur selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
D'une manière générale, un acide nucléique ayant au moins 20 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'invention possède avantageusement au moins 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 2500 nucléotides consécutifs de la séquence de référence, la longueur de nucléotides consécutifs étant naturellement limitée par la longueur de la séquence de référence.
L'homme du métier peut aussi reproduire un acide nucléique selon l'invention par synthèse chimique directe, telle que la méthode au phosphodiester décrite par Narang et al. (1979), la méthode au phosphodiester décrite par Brown et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidite décrite par Beaucage et al. (1981), ainsi que la méthode sur support solide décrite dans la demande de brevet européen n°EP 0 707 792, le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
Un acide nucléique selon l'invention peut également être synthétisé, à partir de l'information de séquence polynucléotidique de référence SEQ ID N°2 et SEQ ID N°5, à l'aide des techniques décrites par Wheeler et al. (1996, Gène, Vol.10 .251-255), par Wade et al .( 1996, Biomédical Peptides, Proteins and nucleic acids,Vol.2 :27-32), par Martinez et al. (1996, Taxicon, Vol. 34 (11) :1413-1419), par Prapunwattana et al. (1996, Molecular and Biochemical Parasitoly, vol.83: 93-106) et par Skopek et al. (1996, Mutation Research, vol.349: 163-172).
Comme déjà mentionné, le demandeur a également isolé et caractérisé, chez un écotype d'Arabidopsis thaliana, l'écotype Wassilevskja, une plante dans le génome de laquelle le gène AtGCSI codant pour la glucosidase I selon l'invention a été artificiellement interrompu, par l'insertion d'une construction contenant un ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
Après séquençage du gène AtGCSI au niveau de l'ADN-T, il a été établi que l'ADN exogène a été inséré au début du huitième intron
L'insertion de l'ADN-T exogène a en outre créé une délétion de 30 pb de l'ADN génomique ainsi qu'une insertion de deux fragments nucléotidiques d'une longueur respective de 26 et 22 pb, de part et d'autre de l'ADN-T.
Ainsi, le demandeur a isolé et caractérisé un gène Atgcsl comportant, par rapport à la séquence du gène ArGCS) retrouvée naturellement, plusieurs additions et délétions de nucléotides dans la séquence codante.
11 a été montré selon l'invention que les plantes portant un gène Atgcsl muté pouvaient être notamment caractérisées par le phénotype de leurs graines qui sont, pour un quart d'entre elles , ridées et incapables de germer.
Il a en outre été montré qu'une mutation du gène AtGCSI, lorsqu'elle est présente à l'état homozygote dans le génome, est létale pour la plante.
De plus, il a été montré selon l'invention que la glycosylation des protéines exprimées dans des plantes dans lesquelles l'expression du gène Atgcsl est fortement altérée, voire complètement bloquée ou inexistante était profondément modifiée et qu'en particulier les glycannes présents au niveau des sites de glycosylation de ces protéines étaient complètement dépourvus de résidus oligosaccharidiques allergènes tels que le fucose et le xylose.
En conséquence, la séquence génomique du gène Atgcsl ainsi que la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 selon l'invention sont utiles notamment pour la mise au point de divers moyens destinés à inhiber ou bloquer la synthèse de la glucosidase I codée par le gène AtGCSI. La séquence nucléotidique SEQ ID N°2 selon l'invention est également utile pour la mise au point de divers moyens de détection spécifiques du gène Atgcsl ou de son produit de transcription, de tels moyens de détection permettant à l'homme du métier de déterminer si une plante d'intérêt contient dans son génome un gène AtGCSI fonctionnel ou au contraire un gène Atgcsl muté, étant entendu que la détection de la présence d'au moins une copie du gène Atgcsl muté dans le génome d'une plante permet de sélectionner cette plante en vue de la production de protéines non allergènes pour l'homme.
Un acide nucléique tel que défini ci-dessus code pour au moins une partie de la glucosidase I selon l'invention et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Une tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans l'ADN génomique, l'ARN messager ou encore l'ADNc du gène AtGCSI dans un échantillon. Aux fins de la détection, on peut également uiliser des acides nucléiques de séquence complémentaire à ceux définis ci-dessus.
Font également partie de l'invention les sondes et les amorces nucléiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID N°2.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
- L'ADN à tester est immobilisé sur des membranes de type GenScreenPlus®NEN™Life Science Product selon les instructions du fabriquant, en présence de 0,4 M NaOH ; une nuit.
- Les membranes sont lavées avec un tampon 2 x SSC (1 x SSC ... idem) puis sont préhybridées au moins 30 min à 65 °C dans un tampon d'hybridation (Tampon : 7% SDS, 0.25M Na2HP04, pH 7,4, 2 mM EDTA, 20 mg/l d'héparine, 0,1 mg/l d'ADN simple brin de thymus de veau). - Les sondes. sont ajoutées aux membranes et incubées à 65°C pendant une nuit;
- Après l'étape d'hybridation, les membranes sont lavées dans un tampon 2 x SSC, 0,5 % sarcosyl, 0,2 % pyrophosphate de sodium pendant 30 min à 65 °C - Un second lavage est opéré dans un tapon 0,2 x SSC, 0,5 % sarcosyl, 0,2 % pyrophosphate de sodium pendant 10 min à 65 °C.
Les conditions d'hybridation décrites ci-dessus sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 300 à 400 nucléotides. II va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al; (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N°2 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence SEQ ID N°2 ou sa séquence complémentaire. De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention ont une longueur d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nuciéotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier de l'acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon un autre aspect, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra des fragments d'une longueur de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces sont par exemple les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4, qui permettent d'amplifier la totalité du cadre de lecture ouvert de l'ARN messager du gène Atgcsl.
Il peut s'agir également des amorces de séquences SEQ ID N°5 à SEQ ID N°15 selon l'invention.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon les techniques, telles que les méthodes de phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979) précitées.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention ainsi que les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marqués , si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P,3H,35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigènine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage d'un acide nucléique est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein de ces nucléotides par extension d'amorces, ou bien par ajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet FR 78 19 175 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988), ou SANCHEZ-PESCADOR et al.
(1988). De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al;
(1991) ou encore dans le brevet européen n° EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique, ou encore dans des hybridations à l'ARN messager du gène
Atgcsl , lorsqu'une visualisation de l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaque de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène AtGCSI dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
- mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester, susceptible de contenir un acide nucléique du gène AtGCSI; - détecter l'hybride éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique du gène AfGCS 7 (ADNg, ADNc, ARNm) dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques, telles que décrites ci- dessus;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotides comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci- dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène AtGCSI ou encore détecter des mutations dans les régions codantes du gène AtGCSI, plus particulièrement dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 où un acide nucléique de séquence complémentaire. Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) de AtGCSI, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique du gène AtGCSI, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou un fragment ou encore un acide nucléique de séquence complémentaire à ce dernier, contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec un couple d'amorces nucléotidiques selon l'invention;
b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon;
c) détecter de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Selon le procédé d'amplification ci-dessus, on réalise au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon préalablement à la détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 20, cycles d'amplification. Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques précédemment décrites dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible de AtGCSI dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification .
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique du gène AtGCSI (ADNg, ADNc ou ARNm) selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2, ledit nécessaire ou kit comprenant:
a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification. Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que précédemment décrites dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du coté 3' de l'acide nucléique cible du gène AtGCSI dont l'amplification est recherchée.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi des séquences nucléotidiques SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4.
L'invention a également trait à des procédés destinés à inhiber ou bloquer l'expression du gène AtGCSI dans les cellules de tissus de plantes, en vue de la production de protéines glycosylées par des glycannes non allergènes, par des techniques appropriées bien connues de l'homme du métier.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCSI chez une plante, l'homme du métier pourra notamment recourir à l'utilisation de polynucléotides antisens, ou encore à des techniques de co-suppression.
Ainsi, l'invention concerne aussi un polynucléotide antisens capable de cibler spécifiquement une région déterminée du gène AtGCSI et plus particulièrement à une région déterminée de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction. Un tel polynucléotide répond à la définition générale des sondes et des amorces selon l'invention.
Selon un premier aspect, un polynucléotide antisens selon l'invention hybride avec une séquence correspondant à une séquence localisée dans une région de l'extrémité 5' de l'ARN messager du gène AtGCSI, et de manière tout à fait préférée à proximité du codon d'initiation de la traduction
(ATG) du gène AfGCS7\
Pour construire un tel polynucléotide antisens, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la séquence de l'ADNc du gène AtGCSI référencée comme la séquence nucléotidique SEQ ID N° 2.
Selon un second aspect, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène AtGCSI et de manière préférée aux séquences correspondant à un site d'épissage, qui peuvent être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier, sur la base de la description des séquences de l'invention, tout particulièrement des séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°2.
Selon un troisième aspect, un polynucléotide antisens conforme à l'invention comprend la totalité de l'ADNc correspondant au produit de transcription du gène AtGCSI. De manière tout à fait préférée, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou consiste en la séquence SEQ ID N°2.
Pour synthétiser des polynucléotides antisens tels que définis ci- dessus, l'homme du métier pourra se référer aux positions des différents exons et introns du gène AtGCSI dans la séquence nucléotidique SEQ ID N°5.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisantes pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de AtGCSI.
Des stratégies pour construire des polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAUB (1984), le contenu de ces deux articles étant ici incorporé par référence.
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSl et al. (1991) ainsi que dans les demandes
PCT n°WO 94/23 026, WO 95/04141 , WO 92/18522 et dans la demande de brevet européen n° EP 0 572 287, le contenu de ces documents étant incorporé par référence.
Avantageusement, un polynucléotide antisens selon l'invention a une longueur de 15 à 4000 nucléotides. Un polynucléotide antisens de l'invention a préférentiellement une longueur de 15 , 20, 25, 30, 35, 4O, 45 ou 5O à 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 ou 4000 nucléotides.
Parmi les polynucléotides antisens selon l'invention, sont préférés ceux ayant respectivement une longueur d'environ 300 nucléotides ou une longueur d'environ 4000 nucléotides.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCSI, on peut aussi avoir recours simultanément à une pluralité de polynucléotides antisens tels que définis ci-dessus, chacun des polynucléotides antisens hybridant avec une région distincte du gène AtGCSI ou de son ARN messager. D'autres méthodes de mise en oeuvre des polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995).
L'invention a encore pour objet tout procédé bien connu de l'homme du métier permettant de créer des modifications, par exemple une ou plusieurs additions, délétions ou substitutions d'au moins un nucléotide dans la séquence du gène AtGCSI, de telles modifications ayant pour conséquence soit une inhibition ou un blocage de la transcription du gène AtGCSI, soit un défaut dans l'épissage du pré-ARN messager, soit une inhibition ou un blocage de la traduction de l'ARN messager mature, dans la glucosidase I selon l'invention, soit encore dans la production d'une glucosidase 1 mutée ayant une activité catalytique réduite ou nulle.
Des techniques de mutagénèse de la séquence génomique du gène AtGCSI appropriées sont par exemple décrites par Hohn et Puchta (1999). Une plante dont le génome a été modifié comme décrit ci-dessus est capable de synthétiser des protéines à glycosylation modifiée non allergènes et/ou non immunogènes, en particulier l'ensemble des protéines produites naturellement par la plante et destinées à l'alimentation humaine ou animale, telles que celles décrites par Zeng et al. (1997). En outre, une telle plante affectée dans l'expression de l'activité catalytique de la glucosidase I selon l'invention, peut être utilisée afin de produire des protéines recombinantes déterminées non allergènes et/ou non immunogènes destinées à une utilisation chez l'homme ou l'animal.
De préférence, les plantes rendues déficientes dans l'activité catalytique de la glucosidase I selon l'invention sont utilisées en vue de la production de protéines immunogènes et de protéines antigéniques non allergéniques destinées à la préparation de vaccins pour l'immunisation de l'homme ou de l'animal. Tout type de peptide ou protéine immunogène ou antigénique recombinant peut ainsi être produit par une plante dont le gène AtGCSI a subi au moins une addition, déletion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs.
Selon un autre aspect, les N-glycannes ayant subi un processus partiel de maturation dû à l'absence, ou à un taux réduit, de glucosidase 1 catalytiquement active dans des plantes dans lesquelles le gène A.GCS7 a été modifié comme décrit ci-dessus, et qui comprennent essentiellement la structure (Glc3 Man7 GlcNAc2) peuvent être utilisés, après séparation et purification, comme vecteurs de composés d'intérêt thérapeutique vers des cellules cibles déterminées chez les mammifères et en particulier chez l'homme. En effet, ces glycannes partiellement modifiés ont une affinité particulière pour des lectines exprimées spécifiquement à la surface membranaire de certaines catégories cellulaires et ont déjà permis l'adressage d'agents antiviraux vers les hépatocytes et les macrophages (Murray et al., 1987).
Selon un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, une surexpression du gène AtGCSI ou de son produit de transcription, ou encore de la protéine glucosidase I selon l'invention sera recherchée.
Une forte expression du gène AtGCSI chez une plante peut être atteinte soit par la surexpression du gène AtGCSI, soit par l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase I selon l'invention dans la plante, soit encore par une combinaison de ces deux stratégies.
Pour l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase I selon l'invention dans le génome d'une plante, on aura avantageusement recours à un vecteur recombinant selon l'invention. L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprend un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants:
a) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase I ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ; ou un acide nucléique de séquence complémentaire ;
b) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; c) un acide nucléique comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire;
d) un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tel que défini plus haut, utile pour inhiber l'expression du gène Atgcsl.
Par " vecteur " au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration. II peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé dans le but d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou tranεfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un vecteur d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant pour un polypeptide conforme à l'invention, en particulier le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 , des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée ainsi que des marqueurs de sélection.
Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyridine, tel que défini précédemment, le cas échéant placé sous le contrôle des séquences de régulation appropriées permettant d'en assurer l'expression dans une cellule hôte ou une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utilisé de préférence pour inhiber l'expression du gène Atgcsl dans la cellule ou dans la plante. Selon un autre mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec ce dernier et conservant l'activité biologique de ATGCS1 , placé sous le contrôle de séquence(s) de régulation permettant une expression à haut niveau de ATGCS1 ou de son homologue dans une cellule hôte ou dans une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utile pour permettre un haut niveau d'expression de ATGCS1 chez une plante .
Selon un aspect avantageux, un tel vecteur recombinant est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence codante de ATGCS1 dans le génome d'une plante.
A titre d'exemple, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda. Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique codant pour une glucosidase I selon l'invention dans les plantes sont le promoteur CaMV 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (Odell et al., 1985) ou encore le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (McEIroy et al. 1990).
On peut aussi utiliser le promoteur de la FAH (Brevet numéro : Fn°9907362) qui permet d'exprimer un gène de façon forte et constitutive dans toutes les parties de la plantes sauf dans les graines, utilisable pour les stratégies sens et antisens, ou encore des promoteurs inductibles du système à deux composantes (ref McNellis T.W. et al. 1998, " Glucocorticoid-inducible expression of bacterial avirulence gène in transgenic arabidopsis induces hypersensitive cell death. " Plant Journal, 14 (2) : 247-257
D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets n°US 5,750,866 et US n°5,633,363, incorporés ici par référence. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996), et Ausubel et al. (1989).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR 322 (ATCC N°37017) ou encore des vecteurs tels pAA223- 3 (Pharmacia Uppsala, Suède) et pGEMI , pBSSK et pGEM-T (Promega Biotech, Madison, WU, USA) et pUC19 (commercialisé par Boehringer Mannheim, Germany).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATC N°CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugidera.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêts dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
• vecteur pBIN19 (Bevan et al., Nucleic Acids Research,
Vol.12:8711-8721 , commercialisé par la Société Clontech , Palo Alto, Californie, USA);
• vecteur pB101 (Jefferson 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5: 387-405, commercialisé par la Société Clotench);
• vecteur pBH21 (Jefferson et al. 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5:387:405, commercialisé par la Société Clotench);
• vecteur pEGFP (Cormack BP et al. , 1996, commercialisé par la
Société Clotench);
• vecteurs pAOV, pOV2, pSOV, pSOV2, pkMB et pSMB (Mylne et al., 1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces vecteurs doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée avec un acide nucléique ou par un vecteur recombinant selon l'invention. Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine procaryote ou eucaryote, notamment bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste de colza, de tabac, de maïs, d'orge, de blé, de luzerne, de tomate, de pomme de terre, de bananier ou d'Arabidopsis thaliana.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées avec un acide nucléique selon l'invention ou avec un vecteur recombinant selon l'invention.
Selon un premier aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec un ou plusieurs nucléotides antisens et/ou un plusieurs polynucléotides homopurine ou homopyrimidine afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCSI chez cet organisme.
Selon un second aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase I selon l'invention ou pour un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la glucosidase I et conservant l'activité biologique permettant la maturation normale des glycannes fixés sur les sites de glycosylation des protéines en cours de synthèse..
L'invention a encore pour objet une plante transgénique, c'est-à- dire une plante transformée comprenant, préférentiellement sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique du gène Atgcsl et préférentiellement un polynucléotide antisens ou encore un acide nucléique codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un polypeptide homologue, ledit acide nucléique ayant été inséré dans le génome de la plante par transformation avec un acide nucléique de AtGCSI ou un vecteur recombinant selon l'invention. Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est un colza, un tabac, un maïs, un soja, un blé, une orge, une luzerne, une tomate, une pomme de terre, une plante à fruits telle le bananier ou Arabidopsis thaliana. Selon un premier aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus présentent une expression réduite, une expression indétectable ou une absence d'expression du gène AtGCSI et sont ainsi susceptibles de permettre la production de protéines à glycosylation modifiée et non allergènes et/ou non immunogènes pour l'homme ou l'animal. Selon un mode de réalisation particulier, de telles plantes synthétisent une protéine d'intérêt dont la séquence codante a été introduite artificiellement, cette séquence codante pouvant être sous une forme non intégrée au génome de la plante, ou au contraire sous une forme intégrée dans le génome de la plante. La protéine d'intérêt peut être de toute nature, préférentiellement une protéine destinée à l'alimentation ou à la thérapie de l'homme ou l'animal, en particulier l'immunothérapie ou la vaccination.
L'invention concerne ainsi également une protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est produite par une plante transformée selon l'invention, ou encore par une cellule hôte transformée selon l'invention, dans laquelle l'expression du gène AtGCSI est inhibée ou bloquée, ou caractérisée en ce qu'elle est contenue dans une semence d'une plante transformée selon l'invention. De préférence, la protéine à glycosylation modifiée est une protéine recombinante. Il peut s'agir d'une protéine recombinante destinée à l'alimentation ou à la thérapie humaine ou animale. Une telle protéine recombinante peut être un antigène ou un immunogène utile dans une composition de vaccin.
L'invention concerne aussi l'addition d'un ou de plusieurs site(s) de N-glycosylation dans une protéine recombinante d'intérêt afin de modifier son ciblage et/ou sa stabilité, dans des cellules végétales, un tissu végétal ou une plante transformée selon l'invention.
Selon un second aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont la propriété d'exprimer fortement une glucosidase I selon l'invention. L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) obtention d'une cellule hôte transformée végétale telle que définie ci-dessus;
b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a);
c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique d'intérêt.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique du gène AtGCSI ou avec un vecteur recombinant selon l'invention;
b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a);
c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique du gène AtGCSI d'intérêt.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention;
b) transformation de la plante choisie par infection avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens obtenues à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrit peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes:
d) croisement entre elles des deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c);
e) sélection des plantes hétérozygotes pour le transgène.
Selon un autre aspect, l'un quelconque des procédés ci-dessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes:
d) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce;
e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées avec un acide nucléique du gène AtGCSI selon l'invention. L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens.
Les techniques utilisées dans d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1984).
L'homme du métier peut encore se référer à la technique décrite par Gomord et al. (1998).
L'invention a en outre pour objet une plante transformée telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention décrits ci- dessus. L'invention concerne également une semence de plante dont une partie ou la totalité des cellules constitutives comprennent un acide nucléique du gène AtGCSI selon l'invention qui a été artificiellement inséré dans leur génome. L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant.
L'invention concerne aussi une cellule végétale comprenant un acide nucléique du gène AtGCSI. De préférence, l'acide nucléique du gène AtGC1 se présente sous une forme intégrée au génome de ladite cellule végétale.
L'invention concerne également un tissu végétal constitué d'un ensemble de cellules végétales transformées telles que définies ci-dessus.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique du gène AtGCSt selon l'invention pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, de la glucosidase I selon l'invention ou d'un fragment peptidique de celle-ci.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique antisens, selon l'invention pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la glucosidase I selon l'invention. De manière préférée, les utilisations ci-dessus sont caractérisées en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique antisens selon l'invention pour inhiber ou pour bloquer l'expression in vitro ou in vivo du gène codant pour la glucosidase I selon l'invention, et tout particulièrement la glucosidase I ayant la séquence en acides aminés SEQ
ID N°1.
L'acide nucléique antisens ou l'acide nucléique homopurine ou homopyrimidine est préférentiellement utilisé pour inhiber ou bloquer l'expression du gène AtGCSI in vivo, dans la plante transformée avec un tel acide nucléique.
La glucosidase I selon l'invention ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°1 a une longueur de 852 acides aminés. Cette protéine a un poids moléculaire calculé de 97,5 kDa. Après analyse de la séquence, le demandeur a identifié une région hydrophile contenant plusieurs arginines dont la partie N-terminale du polypeptide de séquence SEQ ID N°1 , cette région hydrophile contenant le signal consensus de rétention dans le réticulum endoplasmique des protéines membranaires de type II, dont l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen.
Cette région hydrophile est constituée de la région allant de l'acide aminé en position I à l'acide aminé en position 38 de la séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
La glucosidase l selon l'invention comprend aussi une région hydrophobe correspondant à un domaine transmembranaire, cette région hydrophobe allant de l'acide aminé en position 38 jusqu'à l'acide aminé en position 17 de la séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
La glucosidase I selon l'invention comprend un site unique de fixation au glycanne localisé de l'acide aminé en position 598 à l'acide aminé en position 606 de la séquence en acides aminés SEQ ID N°1. Un site unique de glycosylation a également été identifié, qui s'étend de l'acide aminé en position 662 à l'acide aminé en position 664 de la séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
De plus, la glucosidase I selon l'invention comprend une large région hydrophile, probablement localisée dans le lumen du réticulum endoplasmique, s'étendant de l'acide aminé en position 68 jusqu'à l'acide aminé C-terminal en position 852 de la séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
Comme déjà rappelé, le demandeur a montré que des mutations dans la séquence du gène AtGCSI codant pour la glucosidase I de séquence SEQ ID N°1 selon l'invention conduisent à l'absence d'activité glucosidase I dans la plante ainsi mutée et simultanément à l'expression d'un phénotype de glycosylation modifiée dans les protéines produites par cette plante mutée. Selon un autre aspect l'invention concerne également un polypeptide codé par un acide nucléique du gène AtGCSI, et de préférence un polypeptide comprenant au moins 7 acides aminés consécutifs de la glucosidase I de séquence en acides aminés SEQ ID N°1.
De préférence, un tel polypeptide comprend au moins 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ou 800 acides aminés consécutifs du polypeptide ATGCS1 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant les séquences en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide ATGCS1 SEQ ID N°1 , ou à un fragment peptidique de ce dernier.
Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1 , ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
L'invention est également relative à un procédé pour la production du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1 , ou d'un fragment peptidique de ce dernier.
Un procédé préféré pour la production du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1 les étapes suivantes consistant à :
a) insérer un acide nucléique codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un fragment peptidique de ces derniers, dans un vecteur approprié;
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur recombinant de l'étape a);
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lysé la cellule hôte transformée, par exemple par sonication ou par choc osmotique;
d) séparer et purifier à partir du milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ces polypeptides où un fragment ou un variant de ces derniers ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une colonne de chromatographie selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple par AUSUBEL F. et al. (1989) précité.
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou en phase solide. A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite dans HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a, 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " aux polypeptides ATGCS1 , ou de leurs fragments.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport au polypeptide de référence.
On entendra par acides aminés équivalents selon la présente invention, par exemple le remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
A titre illustratif, la synthèse de peptides contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH et al. (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acides, basiques, non polaires ou encore polaires non chargés. Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1 , 2, 3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide ATGCS1 selon l'invention.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conservent leur capacité à catalyser la coupure du premier résidu glucose du Λ/-glycanne précurseur de structure (Glc3MangGlcNAc2), qui peut être aisément déterminée par l'homme du métier, par exemple en utilisant les techniques décrites par Sambrook et al., (1989). Selon un autre mode préférentiel de réalisation, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre le polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1. L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus.
Un polypeptide dérivé de la protéine ATGCS1 est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence de ce polypeptide ou encore d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence du polypeptide ATGCS1 ou encore d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse de glucosidase I, par exemple dans les cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à synthétiser des glycannes mâtures au niveau des sites de glycosylation produits par les cellules de ladite plante.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 38 ( région hydrophile N- terminale) de la séquence du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1.
Une seconde classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 39 à l'acide aminé en position 67 (domaine transmembranaire) de la séquence du polypeptide ATGCS1 de SEQ ID N°1.
Une troisième classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 68 à l'acide aminé en position 852 (région hydrophile comprenant le site catalytique) du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N°1.
Une quatrième classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement le site de fixation au glycanne de la protéine ATGCS1 , et plus particulièrement ceux reconnaissant un peptide de séquence « ERHVDLRCW ».
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments
(par exemple des fragments F(ab)'2, F(ab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975).
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du triome ou encore la technique d'hybridome décrit par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,768 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages (RIDDER et al., 1995), REINMANN K.A. ét al., 1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité de la glucosidase I selon l'invention ou encore d'un fragment peptidique de cette protéine, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'une glucosidase I végétale ou encore d'un fragment peptidique de l'un de ces polypeptides conformes à l'invention, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que défini ci-dessus;
b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un réactif néessaire à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et exemples suivants.
La figure 1 illustre des gels d'électrophorèse des protéines extraites des cellules de graines d'Arabidopsis thaliana de type sauvage (écotype sauvage Ws) et de cellules de graines écotype dans lesquelles le gène AtGCSI a été interrompu par l'insertion d'une séquence de l'ADN-T de
Agrobacterium tumefaciens (M), provenant aussi de l'écotype Ws..
Le gel N°1 de gauche est un gel d'électrophorèse SDS-PAGE sur lequel les protéines ayant migré ont été colorées à l'aide du nitrate d'argent. Le gel n°2 a été incubé en présence d'un anticorps anti-xylose. Le gel n°3 a été incubé en présence d'un anticorps anti-fucose.
Le gel n°4 a été incubé en présence de concanavaline A. Figure 2. Chromatogrammes HPAEC-PAD des N-glycannes libérés des graines sauvages (A) et du mutant atgcsl (B) par traitement à l'Endo H. Les nombres 5 à 9 réfèrent aux structures des N-glycans oligomannosidiques Man5GlcNAc à MangGlcNAc représentées dans le Tableau 1.
Figure 3: Spectres de masse MALDI-TOF des N-glycannes isolés des graines sauvages (Fig.3A) et des graines portant le gène AtGCSI muté (Fig 3B). En abscisse, valeur m/z représentant le rapport masse/charge. Exemple 1 : Isolement de l'ADNc codant pour la glucosidase I de Arabidopsis thaliana
1. Extraction d'ARN de différents tissus végétaux
Les ARN totaux de plantules âgées de 8 jours sont extraits grâce au kit RNeasy Plant Minikit de QUIAGEN (Allemagne), selon le protocole fourni par le fabricant. Une étape de dégradation de l'ADN a été réalisée systématiquement sur la colonne d'extraction (RNase free DNase, QIAGEN, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Toutes les manipulations sont effectuées avec du matériel exempt de Rnase et de l'eau DEPC est utilisée (0,1 % de diéthyl pyrocarbonate autoclave après une agitation de 12 heures).
Des plantules âgées de 8 jours cultivées in vitro sont prélevées et directement mises dans de l'azote liquide et conservés à -80°C, jusqu'à l'extraction. Les pipettes et le matériel utilisé pour l'extraction des ARNs sont préalablement traités à la soude 0,4M pour détruire les éventuelles RNases. L'eau est traitée au DEPC (1 ml de DEPC dans 11 d'eau, homogénéisation toute la nuit sous une Sorbonne), puis autoclavée pour éliminer cet agent. Les centrifugations en colonne plus tube collecteur s'effectuent en centrifugeuse de type " Micro Centaure " (MSE, UK). Le matériel végétal est broyé dans l'azote liquide, dans des
Eppendorfs stériles à l'aide d'un broyeur électrique. Le broyât est immédiatement plongé dans l'azote liquide après broyage. L'extraction proprement dite s'effectue avec le kit " RNAeasy Plant Mini Extraction Kit ", (QIAGEN, Allemagne). Brièvement, 450μl du tampon de lyse " RLT " additionné de β-mercaptoéthanol (10μl/1 ml) sont vortexés avec 100 mg de tissus broyé.
Les étapes suivantes sont exactement celles décrites dans le manuel du kit fournit par QUIAGEN. Le lysat, placé dans une colonne et son tube collecteur de 2 ml, est centrifugé 2 min. Le filtrat est récupéré et lavé avec 0,5 volume d'éthanol 96-100%.
L'échantillon est ensuite déposé sur une colonne et son tube collecteur de 2 ml pour être centrifugé 15 sec à 10.000 rpm, les ARNs sont retenus par la colonne. 350μl de tampon de lavage RW1 sont ajoutés sur cette colonne pour laver les ARNs par une centrifugation de 15sec à 10.000 rpm. Un traitement à la DNase est ensuite effectué (10μl de Dnase et 70μl de tampon, QIAGEN) pendant 15min à température ambiante. Du tampon de lavage RW1 (350μl) est de nouveau appliqué pour terminer le lavage. La colonne est ensuite installée dans un nouveau tube collecteur de 2ml et deux lavages successifs sont effectués avec 500μl du tampon de lavage RPE additionné d'éthanol. Pour finir, les ARNs sont élues de la colonne par 30 à 50μl d'eau traitée au DEPC après une centrifugation 1 min à 10.000rpm. Les ARNs sont conservé à -80°C.
2. PCR inverse (Reverse Transcriptase-PCR)
Les ADNc, simples brins, ainsi que les produits d'amplifications sont obtenus avec le système " Enhanced avian RT-PCR kit " (SIGMA, USA). La rétrotranscription a lieu dans les conditions suivantes : - 10μl de l'extraction d'ARN
- 1 μl d'un mélange de déoxynucléotides
- 1 μl d'oligonucléotide dT - 4,5μl H2O (qsp16,5μl) pendant 10min à 70°C, pour dénaturer les ARNs, y sont ensuite ajoutés :
- 2μl de tampon 10X AMV-RT
- 1 μl de l'enzyme Enhancer avian RT
- 0,5μl d'inhibiteur de Rnase
Le mélange est incubé 15min à 25°C pour permettre l'hybridation de l'oligonucléotide dT, et ensuite la rétrotranscription se fait pendant 50min à 42°C. Les ADNc synthétisés sont ensuite amplifiés par PCR.
La réaction de PCR a été menée sur un thermocycleur (MJ Research PTC100 -96, Prolabo, France), dans des tubes de 0,2 ml (Prolabo, France) contenant le mélange suivant :
- 2μl /20μl du produit de la RT
- 5U d'enzyme PfuTurbo™AD Polymérase (Stratagène, USA)
- 10μl tampon 10x de la Pfu
- 4μl dNTP 5mM (GIBCO BRL, Ecosse) - 2μl de chaque oligonucléotide 10μM (GENSET, France). qsp 100 μl H2O
Des oligonucléotides spécifiques de AtGCSI ont été choisi pour amplifier la séquence codante. Il s'agit de " ATG "
(5'ATGACCGGAGCTAGCCGTCG) et " F0 " (5'AAGTTTCGTTCCCGAAGAGG), se situant respectivement sur l'ATG putatif et à 30 pb en aval du stop putatif de T1F15.4.
La réaction a été effectuée dans les conditions suivantes :
1 étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min puis 35 cycles, chaque cycles étant composé des étapes suivantes :
- 94°C : 30 sec
- 60°C : 1 min
- 72°C : 3 min - une étape élongation à 72°C pendant 10 min
EXEMPLE 2: Identification du gène AtGCSI
L'identification du gène interrompu atgcsl a été réalisée par l'isolement des bordures génomiques de l'ADN-T provenant de l'écotype de A. thalmiana atgcsl (mutant d'insertion), par la technique de « marche par PCR » (walk-PCT) décrite par Devic et al. (1997).
Les séquences des fragments d'ADN ainsi clones ont été comparés à celles contenues dans les bases de données. Ces séquences présentent une similarité très forte avec la séquence du bac T1F15 issue de la banque d'ADN d'Arabidopsis thaliana TAMU et répertoriée dans la base de données
Gen Bank sous la référence AC004393.
L'insert d'ADN d'Arabidopsis thaliana contenu dans le bac T1 F15 est une portion du chromosome 1 et a été cartographie comme se situant entre les positions cM98 et cM99 du chromosome 1, c'est-à-dire sur une région du chromosome 1 à l'extrémité opposée du centromère.
Une seconde similarité assez forte d'environ 66% d'identité en nucléotides a également été identifiée avec l'insert d'ADN d'Arabidopsis thaliana contenu dans le BAC F3I6 de la banque IGF. L'insert du bac F316 a également été cartographie sur le chromosome 1 , entre les positions cM30 et cM40.
La structure exacte introns/exons du gène Atgcsl a pu être établie par alignement de la séquence de l'ADNc avec celle du clone génomique répertorié dans la base de données Gen Bank sous la référence AC004393. Des différences sont à noter par rapport à la séquence codante prédite du gène T1 F15.4 dans les bases de données. Le gène Atgcsl présente en fait 22 exons et 21 introns. Les exons n°4 et 16 ont été ajoutés et les exons n°5, 6, 15 et 17 raccourcis par rapport aux prédictions de la base. Les sites d'épissages AG en fin d'intron et GT au début sont à chaque fois retrouvés, sauf pour le neuvième intron qui commence par GC. Il existe également quelques différences ponctuelles. Elles peuvent être dues à la différence d'écotypes utilisés pour réaliser la banque BAC (Columbia) et ou pour amplifier l'ADNc (Wassilevskija).
Exemple 3 : Analyse de la structure de la glucosidase I de Arabidopsis thaliana codée par le gène AtGCSI.
1. Similarités de séquences avec d'autres glucosidases réelles ou putatives. La protéine AtGCSI a une taille de 852 acides aminés et une masse moléculaire estimée de 97,5 kDa. Ceci correspond bien aux données de la bibliographie, les glucosidases I purifiées jusqu'à maintenant ayant une masse moléculaire comprise entre 85 et 95 kDa. (Pukazhenthi et al., 1993) A partir de cette nouvelle séquence protéique, les recherches sur les bases de données ont été approfondies. Le tableau ci-dessous présente la similarité entre les protéines AtGCSI et les glucosidases I déjà caractérisées.
Figure imgf000039_0001
Les pourcentages d'identité (38 %) et de similarité (54 %) obtenus entre la séquence d' AtGCSI et la protéine humaine sont insuffisants pour conclure à l'activité glucosidase I de AtGCSI . Les pourcentages d'identité et de similarité ont été obtenus à l'aide du logiciel DNA STRIDER T'M 1.3.
2. Comparaison avec des fragments peptidiques d'une glucosidase I végétale purifiée
La glucosidase I de plantules de haricot (Vigna radiata, Zeng et
Albein, 1998), a été purifiée et le sequençage de quatre peptides a été effectué. Les séquences de ces quatre peptides s'alignent sur la séquence protéique de ATGCS1 et de la glucosidase I de l'homme.
peptide 1 NYQQSGFLWEQYDQIK
ATGCS1 810 NYYETGYIWEQYDQVK peptide3 DFG.QVLVDIGM
HOMME 800 QYQATGFLWEQYSDRD ATGCS1 168 DYGRQELVEND
HOMME 155 SFGRQHIQDGAL peptide 2 SLLWTNYGLR peptide4 EDIGDWQLRFK
ATGCS1 741 SILWSDYGLV ATGCS1 253 EDVGDWQIHLK
HOMME 719 RHLWSPFGLR HOMME 178 QHGGDWSWRVT Le peptide 1 identifié chez le haricot permet de retrouver dans les banques de données la séquence homologue chez Arabidopsis. Cependant ces données seules ne suffisent pas pour démontrer que le gène ainsi identifié (T1 F15.4) code pour l'homologue fonctionnel de la glucosidase I de haricot. Cette donnée est du même niveau que les indications des bases de données sur T1 F15.4 (gène putatif), qui par ailleurs ne permettent pas d'obtenir la séquence codante vraie.
3. Motif de rétention dans le réticulum endoplasmique
La glucosidase I est une protéine membranaire de type II (l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen), et devrait posséder, comme les protéines situées dans le lumen, un signal consensus de rétention dans le RE du type : deux arginines dans les premiers AA en N- Term (Shϋtze ef al., 1994). La séquence protéique N-terminale (MTGASRR), présente deux arginines dans les premiers acides aminés, (pour l'homme, la séquence commence par : MARGER).
4. Profil d'hydrophobicité
Une zone hydrophile s'étend des résidus 1 à 38, ce qui pourrait correspondre au domaine cytoplasmique de la protéine humaine (1 à 39). Ensuite un domaine hydrohobe s'étend jusqu'à l'aa 67, ce qui correspond au domaine transmembranaire de la protéine humaine (39 à 5). Le reste de la protéine est plutôt hydrophile, c'est la partie se trouvant probablement dans le lumen.
5. Site de N-glycosylation
Les glucosidases I caractérisées au niveau biochimique présentent toutes un site unique de N-glycosylation, que l'on retrouve en position équivalente dans la protéine humaine (NHT 657-659), et dans la protéine d'Arabidopsis (NHT 662-664).
6. Site de fixation au substrat
Le site de fixation au glycanne a été décrit dans la protéine humaine comme étant le peptide ERHLDLRCW (Romaniouk et Vijay, 1997). Ce peptide se situe en position 594. Dans la protéine ATGCS1 , on trouve un peptide similaire (ERHVDLRCW) en position 598. EXEMPLE 4: Analyse cvtologique sur les tissus et les graines des plantes d'Arabidopsis thaliana dont le gène AtGCSI est interrompu par l'ADN-T de Açirobacterium tumefaciens,
Des observations préliminaires ont montré que, jusqu'au stade coeur de l'embryon, on ne peut pas observer de différences phénotypiques entre les graines. Puis les embryons sauvages et hétérozygotes (qui sont identiques) se différencient et continuent leur développement, alors que la plante homozygote pour la mutation sur le gène Atgcsl reste au stade coeur et augmente de volume. La plante mutée ne se différencie absolument pas, son hypocotyle est très réduit, ses cotylédons et sa racine ne sont pas allongés. Les coupes réalisées au cours du développement de l'embryon chez la plante mutante montrent que l'albumen se cellularise normalement. Les cellules paraissent plus grosses et moins nombreuses que celles de la plante sauvage d'un âge identique, surtout au niveau de la couche la plus externe, le protoderme. Chez l'embryon homozygote mature, on peut distinguer des faisceaux vasculaires dans l'hypocotyle réduit et un petit méristème apical. L'épiderme est très altéré, les cellules sont énormes et présentent des espaces " vides ". La radicule semble très peu développée, elle n'est absolument pas différenciée.
Une approche en microscopie électronique à transmission a permis de mieux visualiser la désorganisation des cellules du mutant homozygote. Les observations ont été effectuées dans les cotylédons et dans le protoderme. Les corps protéiques, chez la plante sauvage, non mutée ont des structures organisées, circulaires et présentant des zones peu denses. On peut en visualiser de 2 à 5 par cellules. Les corps lipidiques remplissent toute la cellule, un noyau peut être observé dans chaque cellule. Chez la plante mutante, les corps lipidiques ne sont pas altérés, ils sont présents en grand nombre et remplissent la quasi-totalité de la cellule. Les corps protéiques, par contre, sont altérés. Ils ne sont pas présents dans toutes les cellules, et lorsqu'on peut en observer un, il n'est pas circulaire et entoure généralement une vacuole. Dans chaque cellule se trouvent une ou plusieurs vacuoles, au contenu plus ou moins dense, ce qui ne s'observe jamais chez la plante non mutée sauvage. EXEMPLE 5: Analyse biochimique: mise en évidence de l'absence d'activité glucosidase 1 dans les graines de la plante mutée sur le gène Atgcsl. 5.1. Matériels et Méthodes.
Les méthodes utilisées sont décrites dans Fichette-Lainé et al., (1998) Methods in Biotechnology 3 :271-290.
Electrophorèse des protéines
L'extraction et le transfert des protéines du gel d'électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85, 0,45 μm) est effectué selon la technique décrite par Towbin et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Pendant l'électrophorese, le matériel utilisé pour le transfert (membrane de nitrocellulose, papier Whatmann 3 MM, scotch brite) est équilibré 15 à 30 min dans le tampon de transfert (Tris 25 mM; glycine 120 mM ; méthanol 10%). A la fin de l'électrophorese, la cassette de transfert est disposée dans une cuve de transfert contenant 600 ml du tampon décrit ci-dessus. Un transfert satisfaisant des protéines du gel d'électrophorèse sur la membrane de nitrocellulose est obtenu en 2 h sous un champ électrophorétique de 10 V.cm"1. Un contrôle d'efficacité du transfert est réalisé par une coloration réversible de la membrane de nitrocellulose au rouge Ponceau S (1 % (p/v) dans TCA 3%). La décoloration de la membrane de nitrocellulose après le traitement au rouge Ponceau S est obtenue après rinçage avec un tampon TBS (NaCI 500 mM; Tris-HCl 20 mM, pH 7,4). Toutes ces étapes de traitement de la membrane de nitrocellulose, appelée empreinte après le transfert, sont effectuées sous agitation douce à température ambiante.
Immunodetection
Une fois la membrane équilibrée dans le TBS, les sites de couplage de la nitrocellulose encore disponibles après le transfert des protéines sont saturés par une incubation d'une heure dans une solution de saturation (gélatine 3% dissoute dans le tampon TBS). Après saturation de la membrane, l'immunodétection des protéines est réalisée. L'empreinte est incubée pendant 90 min en présence d'un immunserum polyclonal de lapin dilué au 1/1000eme dans une solution de gélatine à 1% (p/v) dans le tampon TBS. Après cette incubation, les anticorps non fixés sont éliminés par une série de 4 lavages de 15 min dans du tampon TTBS (Tampon TBS + 0.1 % Tween 20). L'empreinte est ensuite soumise à une incubation en présence d'un second anticorps couplé à la peroxydase de raifort (IgG de chèvre, anti- IgG de lapin, couplée à la peroxydase de raifort, Bio-Rad). Ce second anticorps est dilué au 1/3000e e dans une solution de gélatine à 1% (p/v) dans le tampon TBS pendant 90 min. L'excès de second anticorps conjugué est éliminé par 4 lavages de 15 min dans du tampon TTBS. Le Tween 20 est éliminé à la fin du traitement par un lavage de 15 min de l'empreinte dans le tampon TBS. Les protéines reconnues par les immunoglobulines IgG de lapin sont révélées par incubation de la membrane dans un mélange contenant 30 mg de 4-chloro-1-naphtol (HRP color reagent, Bio-Rad) dissous dans 10 mL de méthanol et additionné de 50 ml de tampon TBS contenant 30 μL de H2O2 30%.
Affinodétection des protéines sur membrane par la concanavaline A.
La concanavaline A (ConA) est une lectine de graine de légumineuse Canavalia ensiformis qui reconnaît spécifiquement les résidus mannoses β- liés des glycannes oligomannosidiques associés aux protéines et également la peroxidase. Une fois la membrane équilibrée dans le TBS, les sites de couplage de la nitrocellulose encore disponibles après le transfert sont saturés par une incubation d'une heure minimum dans du tampon TTBS. La membrane est alors incubée pendant 90 min dans du tampon TTBS additionné de sels (CaCI2 1 mM; MgCI2 1 mM) permettant l'activation de la lectine et contenant 25 μg.mL"1 de ConA (Sigma). Après cette incubation, la membrane est lavée par 4 bains de 15 min dans du TTBS complémenté en sels, afin d'éliminer la ConA non fixée ou fixée sur des sites non spécifiques. La membrane est ensuite incubée pendant 60 min dans du TTBS complémenté en sels en présence de 50 μg.mL"1 de peroxydase de raifort. L'excès de peroxydase est éliminé par 4 lavages successifs de 15 min dans du TTBS complémenté en sels. Un lavage de l'empreinte dans du tampon TBS additionné de sels permet l'élimination du Tween 20. La révélation de l'activité peroxidase est réalisée comme décrit pour l'immunoétection.
5.2. Résultats
L'analyse de la N-glycosylation des protéines des graines homozygotes a été réalisée et les résultats obtenus sont présentés à la figure 1. La détection des précurseurs: les N-glycannes, a été réalisée par la concanavaline A: c'est une lectine qui se lie spécifiquement aux glycannes non matures. De nombreuses bandes supplémentaires apparaissent chez le mutant, il y a donc une forte accumulation des précurseurs. La détection des oligosaccharides complexes est réalisée à l'aide d'anticorps anti-xylose et anti-fucose; toutes les bandes disparaissent chez le mutant, il n'y a aucun N- glycanne complexe. La plantée mutée est donc bien affectée dans la maturation des N-glycannes, au niveau de la glucosidase 1.
Les résultats ci-dessus illustrent bien que le mutant Atgcsl est incapable de catalyser la réaction d'addition d'un résidu xylose en position β 1-2 ou d'un résidu fucose en position α 1-3 sur les glycannes des glycoprotéines qu'il produit.
De plus, le profil des glycoprotéines présentant les glycannes de type oligomannosidique (empreinte 4) est fortement modifié chez le mutant.
Exemple 6 : Analyse des glycannes fixés sur les protéines synthétisées chez des plantes mutées sur le gène AtGCSI.
6.1 Matériels et Méthodes
Préparation des N-glycannes à partir des graines d'Arabidopsis thaliana :
Des extraits protéiques bruts ont été obtenus par broyage de 100mg de graines d'A. thaliana dans 10 mL de tampon 50 mM Hepes, pH 7,5 contenant 2 mM de bisulfite de sodium et 0,1 % de SDS. Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation puis les protéines ont été précipitées par addition de deux volumes d'éthanol à -20°C. Le culot a ensuite été chauffé pendant 3 min dans 2 mL de tampon Tris HCI 50 mM pH 7,5 contenant 0,1 % de SDS. Après refroidissement de la solution, 0,1 U d'Endo H a été ajouté et la solution a été incubée pendant 18 h à 37°C. Les N-glycannes ont été ensuite purifiés par élutions successives sur colonnes C18 (Bond Elut), d'AG 50W-X2 et de carbograph comme décrit précédemment dans la littérature (Bardor et al., 1999).
Chromatographie HPAE-PAD
Les chromatographies HPAE-PAD ont été réalisées sur un appareil
Dionex DX500 équipé d'un système de pompage GP50, d'un détecteur ED40 et d'une colonne Carbopac PA1 (4,6x250 mm). Les N-glycannes ont été élues au moyen d'un gradient linéaire de 60 min allant de 0 à 200 mM d'acétate de sodium dans de la soude 100 mM.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF Les spectre de masse MALDI-TOF ont été enregistrés sur un appareil Micromass Tof spec E. Les spectres ont été réalisés en mode positif et réflectron avec un voltage d'accélération de 20 kV, une pression de 10"7 mbars dans la source et de 10"6 mbars dans l'analyseur. Le laser à azote a été réglé à 337 nm avec une durée d'impulsion de 4 ns. L'appareil a été calibré avec la substance P (1347,7 Da) et l'hormone adrenocorticotropique humaine (2465,2 Da). La solution contenant l'échantillon a été préparée à une concentration approximative de 10 pmole.μL"1 dans l'eau. Deux μL de cette solution ont été dissous dans le même volume d'une solution de matrice obtenue par dissolution de 2 mg d'acide 5, 5-dihydroxybenzoïque dans 200 μL d'acétonitrile à 70% contenant 0,1 % de TFA. Le mélange échantillon matrice a ensuite été homogénéisé puis déposé sur la cible et séché sous vide.
Abréviations : Endo H, endoglycosidase F/ HPAEC-PAD, High pH Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Détection/ MALDI- TOF, Matrix-Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight/ 6.2 Résultats
Les N-glycannes ont été libérés des extraits protéiques de graines par traitement à l'Endo H. Cette endoglycosidase clive spécifiquement la liaison glycosidique entre les deux GIcNAc de l'unité chitobiose des N- glycannes oligomannosidiques. Le profil chromatographique HPAE-PAD des N-glycannes libérés des graines sauvages (Figure 2A) présente six pics majeurs. Ces pics ont été attribués aux structures Man5GlcNAc à MangGlcNAc (voir Tableau I) par comparaison de leurs temps de rétention avec des structures standards comme précédemment décrit dans la littérature (Rayon et al., 1996). Ces structures oligomannosidiques ont été précédemment caractérisées à partir de plantes d'Arabidopsis sauvages par Rayon et al. (1999). Les structures de ces composés ont pu être confirmées par analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 3A). Le spectre présente cinq ions (M+Na+) à m/z= 1054, 1216, 1378, 1540 et 1702 correspondant aux masses attendues pour les adduits sodiques des oligosaccharides Man5GlcNAc to MangGlcNAc.
Les N-glycannes associés aux protéines des graines mutantes ont été analysés selon le même principe à partir du mélange de graines homozygotes et hétérozygotes. Le profil HPAE-PAD (Figure 2B) montre un ensemble de pics entre 16 et 22 min, analogues à ceux détectés à partir des graines sauvages (Figure 2A). Ces pics ont été attribués aux N-glycannes oligomannosidiques Man5GlcNAc à MangGlcNAc. En addition des ces structures, un pic à 29 min a été détecté. La nature du ou des oligosaccharide(s) contenu(s) dans ce pic a d'abord été étudiée par comparaison de son temps de rétention en HPAE-PAD avec des composés de structures connues. Il a été établi (non illustré) que le pic élue à 29 min présente le même temps de rétention que la structure Glc3Man GlcNAc (Tableau I) isolée au laboratoire lors d'une précédente étude sur l'effet de la castanospermine, inhibiteur de l'α-glucosidase I, sur la maturation des N- glycannes dans des cultures cellulaires de sycomore (Lerouge et al., 1996). Le spectre MALDI-TOF des N-glycannes isolés des graines mutantes (Figure 3B) montre également la présence de structures supplémentaires à celles identifiées à partir des graines sauvages. En addition des ions (M+Na+) à m/z= 1054, 1216, 1378, 1540 et 1702 correspondant aux espèces Man5GlcNAc à MangGlcNAc, deux ions à m/z= 1864 et 2026 ont été détectés. Ces ions moléculaires correspondent à des structures ayant un et deux hexoses supplémentaires. Afin de confirmer que ces deux ions sont attribuables au pic supplémentaire observé dans le profil présenté dans la figure 2B, ce pic a été collecté, désallé sur colonne carbograph (Parker et al., 1998) puis analysé en spectrométrie MALDI-TOF. Seuls les ions à m/z= 1864 et 2026 ont été détectés confirmant ainsi que le pic chromatographique à 29 min (Figure 2B) résulte de la coélution de deux oligosaccharides constitués d'un résidu N-acétylglucosamine et de respectivement dix et onze résidus hexose. Ces données nous permettent de proposer que chez les graines mutantes, deux oligosaccharides, non observés dans les graines sauvages, soient accumulés et présentent les structures Glc3Man GlcNAc et Glc3Man8GlcNAc (Tableau I). La première structure a précédemment été caractérisée à partir de cellules de sycomore après traitement par la castanospermine (Lerouge et al., 1996), la seconde structure porte un résidu mannose supplémentaire résultant probablement de l'action partielle de l'α- mannosidase I au niveau de l'appareil de Golgi.
(Manαl-2)Manαl^
Man αl \
(Manα1.2)Maπ l/3 Man βl_ 4GkNAc
(Man αl-2Man αl-2)Man αl ?
Man5GlcNAc to MangGlcNAc
Man αl \ 6
Manαl /3 g
Ma"αi Manβl-4GlcNAc
3
Glcαl-2Glc αl-3Glc αl-3Man αl-2Man αl-2Man αl
Glc3Man7GlcNAc
Manαl-2Manαl \
Manαl
Man α1 ^ D
ManPl-4GlcNAc
3
Glcαl-2Glc l-3Glc αl-3Man l-2Man αl-2Man αl
Glc3Man8GlcNAc
Tableau I: Structures et désignations des oligosaccharides Références Bibliographiques
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase de type I de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
6. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une sonde oligonucléotidique.
7. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une amorce oligonucléotidique.
8. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID
N°15.
9. Séquence nucléotidique antisens comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.
1 1. Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est un vecteur d'expression fonctionnel dans une cellule hôte végétale.
12. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce qu'il est un vecteur d'origine fongique, bactérienne ou virale.
13. Cellule hôte transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
14. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'origine procaryote ou eucaryote.
15. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'Agrobacterium tumefaciens.
16. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale.
17. Organisme multicellulaire végétal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 13 à 16.
18. Plante transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
19. Plante transformée comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
20. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte transformée végétale selon l'une des revendications 13 ou 16; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte transformée obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 et 9.
21. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée selon la revendication 15; b) transformation de la plante par infection avec des cellules d'Agrobactium tumefaciens obtenues à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 et 9.
22. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 7 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plantes recombinantes obtenues à l'étape a); c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou le vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
23. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c); e) sélection des plantes hétérozygotes pour l'acide nucléique d'intérêt.
24. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes de : d) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé l'acide nucléique d'intérêt.
25. Plante transformée telle qu'obtenue selon l'une quelconque des revendications 20 à 24.
26. Semence d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 18, 19 et 25.
27. Semence de plante dont une partie ou la totalité des cellules constitutives comprennent un acide nucléique selon l'une des revendications
1 à 5 et 9.
28. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 pour l'expression in vitro ou in vivo d'une glucosidase I végétale.
29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle implique une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
30. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9, ou d'un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 9, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la glucosidase I d'Arabidopsis thaliana.
31. Procédé de détection d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à: a) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 6 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon; b) détecter l'hybride éventuellement formé entre l'acide nucléique de l'échantillon et la ou les sondes.
32. Kit ou nécessaire de détection d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant: a) une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 6; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
33. Procédé pour amplifier un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 et 8 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon; b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon; c) détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.
34. Kit ou nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant: a) un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 ou 8; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification.
35. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°1 , ou un fragment peptidique de ce polypeptide.
37. Polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de
1 , 2 , 3, 4 , 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36.
38. Polypeptide comprenant au moins 7 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 37.
39. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
40. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
41 . Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 40; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
42. Kit ou nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un anticorps selon la revendication 40; b) le cas échéant, un réactif nécessaire à la détection du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
43. Kit ou nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un anticorps selon la revendication 40; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes antigène/anticorps éventuellement formés.
44. Protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est produite par une plante transformée selon l'une des revendications 18, 19 et 25, ou par une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 13 zr 16.
45. Protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est contenue dans une semence de plante transformée selon l'une des revendications 26 ou 27.
46. Protéine à glycosylation modifiée selon l'une des revendications
44 et 45, caractérisée en ce qu'elle est une protéine recombinante.
47. Protéine à glycosylation modifiée selon la revendication 46, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un antigène ou d'un immunogène.
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