WO2001076580A1

WO2001076580A1 - Remedies

Info

Publication number: WO2001076580A1
Application number: PCT/JP2001/003075
Authority: WO
Inventors: Hiromu Ohnogi; Eiji Kobayashi; Kaori Nishimura; Masahiro Shiraga; Tuo-Ping Li; Hiroaki Sagawa; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2001-10-18
Also published as: EP1283037A1; TWI233353B; AU2001246877A1; KR20020089440A; CN1436074A; US20030203857A1; EP1283037A4

Description

明細書治療剤技術分野

本発明は、ポリフエノール類、その誘導体およびまたはそれらの塩を有効成分とする医薬、食品、飲料、または飼料に関する。 n景: 技術

ポリフエノール類は分子内に数個以上のフノ一ル性水酸基をもつ物質の総称であり、植物由来のものが多く知られている。広義にはフラボノィド類ゃクロ口ゲン酸、コーヒー酸、ジカフヱオイルキナ酸、ガリックアシッド、プロアントシァニン、ガロタンニン等が含まれる。また、フラボノイド類は基本骨格によってさらに分類されており、フラボン、フラボノール類、フラバノン、アントシァニジン、カルコン、イソフラボン、フラバノール、フラバノノール等、いくつかに分類することができ、フラポノール類としては、例えばミリセチン、ケルセチン等が挙げられる。フラバノールとしてはカテキン類、例えばェピガロカテキンガレート等が挙げられる。フラバノンとしてはイソキサントフモール等が挙げられる。カルコンとしてはキサントフモール B、キサントフモール D等が挙げられる ο

ポリフノール類の生理活性としては主に抗酸化活性が知られているが、成長因子産生増強活性については知られていない。

ヒトの知的機能、記憶、感情、行動などの精神活動の維持には神経細胞が主要な役割を担っている。これら精神活動の基になっている神経細胞の分化、生存、機能発現には、それぞれの神経細胞に特異的な神経栄養因子が必要であると考えられている。神経栄養因子のうち最初にその存在および機能が明らかにされたのが神経成長因子（Ne rve Gr owth Fa c t o r, 以下 NGFと略する）であり、現在では脳由来神経栄養因子（Br a i n— de r i ve d— n e ur o t r oph i c Fa c t or)、ニューロトロフィン（Neur o t r o p h i n) — 3、ニューロトロフィンー 4 5などが見出されている。

NGFは前脳基底部の大細胞性コリン作動性神経細胞の神経栄養因子であることから、アルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている〔フアルマシア、 V 01. 22、 No. 2、 147〜15 1 ( 1 986 ) 、老年精神医学、 Vo 1. 3、 No. 6、 75 1〜758 ( 1 986 ) 〕。アルツハイマー型痴呆症とは発育障害、巣症状、下肢の強直拘攣、てんかん様発作などの臨床を伴い、老人性プラ一ク、アルツハイマー原線維変化などの病理学的所見を見る疾患であり、老人性痴呆の一病型である。近年の高齢化社会で増加の傾向が見られ、重大な社会的関心が払われているが、これといった症状の改善法、治療法が見つかつていないアルツハイマー型痴呆症患者脳には、マイネルト基底核を中心とする前脳基底部に顕著な変性、コリンァセチル基転位酵素（CAT)活性の著しい低下が認められている〔Annu. Rev. Neur o s c i. ， Vo l. 3, 77 (1 9 80) 〕。 1 985年にラット脳を用いた研究で、 NGFが脳のこの部位での神経栄養因子であることが明らかにされ CEMBO J. , Vo l. 4， 1 389

( 1 985 ) 〕、 NGFと本疾患との関連が注目された。またハンチントン舞踏疾患者の脳の線条体では、 GAB A作動性神経細胞の脱落と共にコリン作動性神経細胞の脱落が著しく、 NG Fが線条体の内在性コリン作動性神経細胞にも作用することが明らかにされ（Sc i enc e, Vo l. 234， 134 1 (1 98

6) 〕、本疾患が NGFと関連している可能性が指摘されている。各種の神経疾患のモデルとなり得るラットなどの動物で NGFの効果が研究され、ラットでは神経細胞の変性が顕著になる以前に NGFを脳内投与すれば、変性を食い止めることができ、 CAT活性の低下も防げることが報告されている〔J. Neur 0 s c i. , Vo l. 6, 2155 (1986) 、 Bra i n Re s. , Vo l . 293, 305 (1985) 、 Sc i enc e, Vo l. 235, 214 (1 986) 、 Pr oc. Na t l. Acad. Sc i. USA, Vo l. 83, 9 231 ( 1986 ) 〕。末梢の交感神経支配組織および脳で NGFが生合成されていること、この NGFの生合成に末梢組織あるいは脳組織の間質細胞である線維芽細胞あるいはァストログリァ細胞が各々重要な役割を担っていることも証明されている〔J. B i o l. Chem. , Vo l. 259, 1259 ( 1984 ) 、 B i ochem. B i op h y s . Re s. C ommu n. , Vo l. 13 6, 57 ( 1 986 ) 〕。また、この線維芽細胞ゃァストログリア細胞の産生する NGFの抗原性、分子量、等電点、生物活性は、従来よく研究されていた顎下腺 NGFと同一であることが明らかにされるとともに、線維芽細胞（L一 M細胞 ) およびァストログリア細胞の培養液に種々の神経伝達物質を加える実験によつて、カテコールアミン類（ノルェピネフリン、ェピネフリン、ド一パミン）が N GF産生増強作用を示すことが見出されている〔J. B i o l. Chem. , V ο 1. 201, 6039 (1986) 〕。

Ν G Fは、 NGFが神経栄養因子として作用する部位が変性する神経疾患において、変性を食い止める治療薬として用いることができるのではないかと期待される。また、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒など脳神経細胞が一旦変性に陥れば、生涯回復することがなく、その結果、知的機能低下、記憶障害のみならず、感情障害、行動異常など様々な障害を引き起こすが、神経線維には可塑性があり、損傷を受けると、その付近の健常な線維から発芽が起こり、障害されたシナプスに変わって新しいシナプスが形成されるので、この時 N G Fが神経機能の修復再生を促す治療剤として用いることができるのではないかと期待される。

しかしながら、 NGFを各種神経疾患の治療に応用しょうとした場合、 NGF は NGFを必要とする神経細胞の極く近傍に達していなければならないし、中枢神経疾患の場合も脳細胞の患部に N G Fを送り届けなければならないが、血管系を通して NGFを脳内に送り込むことはできない。なぜならば、脳内の血管内皮細胞は、互いに密着結合で結合しており（脳血液関門という）、水、ガス、脂溶性物質以外の物質の血液から脳組織への移行は制限を受けているからであり、高分子物質であるタンパク質（NGFも含む）はまったく脳血液関門を通ることが出来ないからである。この NGFを直接脳内に外科的手法を用いて投入することは、現在の技術をもってしても危険が大き過ぎる。

—方、直接、 NGFを投与するのではなく、 NGFの産生を増強する物質の開発も行われているが、その多くは、強い毒性を有するか、毒性が出る濃度と有効な濃度が非常に接近した物質、または神経興奮作用など神経系に対して重大な副作用を生じる物質であるなど、多くの問題点を抱えており、未だ実用化には至つていない。

部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長年不明であつたが、劇症肝炎患者の血漿中に肝細胞増殖因子 (Hepatocyte growth factor： HG F) が見出され、その患者血漿から、単離、精製された（Gohda , E . et al. ： J. Clin. Invest. , 88 414—419 , 1988)。さらに、ヒト HGFの cDNAもクロ一ニングされ、 HGFの 1 次構造も明らカヽにされた (Miyakawa, K . et al. ： Biochem . Biophys . Res . Co讓 un. , 163 967-973, 1989)。また、細胞の運動性を亢進させる scatter facto r (SF) および、腫瘍細胞障害因子である tumor cytotoxic factor (TCF ) と HGFが同一物質であることも明らかになった（Weidner , K . . et al. ： Proc. Natl. Acad. Sci . USA 88 7001-7005, 1991, Shima , N . et al. ： Biochem . Biophys . Res . Commun. , 180 1151-1158, 1991)。

HGFは肝細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導し、 HGFは極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。つまり、 HGFは様々な臓器において、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖促進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を行う。

HGFは肝細胞増殖作用、タンパク質合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。 HGFの mRNAは脳、腎臓、肺等でも合成されている。 HGFは、胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる中胚葉性細胞成長因子であり、障害を修復する際の上皮細胞の増殖促進や、運動性の亢進、血管新生などの形態形成の誘導など極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。さらに、 HGF は神経細胞の保護、増殖促進、障害修復作用なども持ち合わせている。従って、 HGFの產生を増強することにより、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝内胆汁うっ滞等の肝障害、薬剤等による腎障害、胃腸障害、血管障害、慢性腎炎、肺炎、創傷、糖尿病、がん等の治療又は予防を行うことができると期待されている。

HGFは前記各種作用を示すことから、 HGF自身が、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝内胆汁うっ滞等の肝障害、薬剤等による腎障害、胃腸障害、血管障害、慢性腎炎、肺炎、創傷、糖尿病、がん等の治療薬として期待されているが、 HGFそのものを治療薬として実用化するには至っていない。さらに、遺伝子治療で HGFの遺伝子を導入する方法も試みられているが、不必要な時期、場所で作用することによる副作用により、これも実用化には遠い。このように、 H GFを外から投与するのではなく、任意に増強できるのであれば、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝内胆汁うっ滞等の肝障害、薬剤等による腎障害、胃腸障害、血管障害、慢性腎炎、肺炎、創傷、糖尿病、がん等の HGF産生増強を必要とする疾患の治療及び予防に有効であると考えられているが、未だ実用化には至っていない。

このように、成長因子を増強することで当該成長因子に関連する種々の疾患の治療または予防が可能になると考えられるが、毒性や副作用を示さず、所望により適切に成長因子の産生増強を行い得る物質、手段等は未だ知られていない。発明の開示

本発明者らは鋭意検討した結果、ポリフエノール類、その誘導体またはそれらの塩が、成長因子産生増強作用を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

〔1〕 ( i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種、あるいは

( i i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、

(A) 金属、金属塩および金属イオンからなる群より選択される少なくとも 1 種との混合処理、または

( B) 酸化処理

により得られる組成物、

を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤、

〔2〕ポリフエノール類がフラポノイド類、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コーヒー酸おょぴジカフヱオイルキナ酸からなる群より選択される少なくとも 1種である前記〔1〕記載の治療剤または予防剤、

〔3〕フラポノイド類がフラボノール類、フラバノン、カルコンおよぴフラバノールからなる群より選択される少なくとも 1種である前記〔2〕記載の治療剤または予防剤、

〔4〕フラボノール類がミリセチンおよび Zまたはケルセチンであり、フラバノンがイソキサントフモールであり、カルコンがキサントフモール Bおよびノまたはキサントフモール Dであり、フラバノールがェピガロカテキンガレ一トである前記〔3〕記載の治療剤または予防剤、

〔5〕ポリフエノール類の誘導体がポリフエノール類のカルボン酸エステルおょぴまたは配糖体である前記〔1〕〜〔4〕いずれか記載の治療剤または予防剤、

〔6〕ポリフヱノール類のカルボン酸エステルがコーヒー酸メチルエステルおよびまたはコーヒー酸ェチルエステルであり、ポリフエノール類の配糖体がィソオリエンチンである前記〔5〕記載の治療剤または予防剤、

〔7〕金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニウム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のイオンである前記〔1〕〜〔6〕いずれか記載の治療剤または予防剤、

〔 8〕成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である前記〔 1〕〜〔 7 〕いずれか記載の治療剤または予防剤、

〔9〕（ i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種、あるいは

( i i ) ポリフユノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、

( B) 酸化処理

により得られる組成物、

を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生増強用の食品、飲料または飼料、

〔1 0〕ポリフヱノール類がフラボノイド類、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コーヒー酸およびジカフェオイルキナ酸からなる群より選択される少なくとも 1種である前記〔9〕記載の食 α πρ

、飲料または飼料、

〔1 1〕フラボノイド類がフラボノール類、フラバノン、カルコンおよびフラバノールからなる群より選択される少なくとも 1種である前記〔1 0〕記載の食品、飲料または飼料、

〔1 2〕フラボノール類がミリセチンおょぴノまたはケルセチンであり、フラバノンがイソキサントフモールであり、カルコンがキサントフモール Βおよびまたはキサントフモール Dであり、フラバノールがェピガロカテキンガレ一トである前記〔1 1〕記載の食品、飲料または飼料、

〔1 3〕ポリフヱノール類の誘導体がポリフヱノール類のカルボン酸エステルおよび/または配糖体である前記〔9〕〜〔1 2〕いずれか記載の食品、飲料または飼料、

〔1 4〕ポリフエノール類のカルボン酸エステルがコーヒー酸メチルエステルおよび/またはコ一ヒ一酸ェチルエステルであり、ポリフエノール類の配糖体がイソオリエンチンである前記〔1 3〕記載の食品、飲料または飼料、

〔1 5〕金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニゥム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のィォンである前記〔9〕〜〔1 4〕いずれか記載の食品、飲料または飼料、

〔1 6〕成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である前記〔9〕〜〔

1 5〕いずれか記載の食品、飲料または飼料、

〔1 7〕ポリフヱノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なぐとも 1種の、

(Α) 金属、金属塩および金属イオンからなる群より選択される少なくとも 1 種との混合処理、または

( Β ) 酸化処理により得られる組成物、

〔1 8〕ポリフエノール類がクロロゲン酸およびまたはコーヒー酸であり、誘導体が前記ポリフノール類のカルボン酸エステルおよびまたは配糖体である前記〔1 7〕記載の組成物、

〔1 9〕金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニゥム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のィォンである前記〔 1 7〕または〔1 8〕記載の組成物、

〔2 0〕成長因子産生増強作用を有する前記〔1 7〕〜（： 1 9〕いずれか記載の組成物、

〔2 1〕成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である前記〔2 0〕記載の組成物、

に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、ァシタバ根部由来フラクション 1 8— 3の M Sスぺクトルである。第 2図は、ァシタバ根部由来フラクション 1 8— 3の¹ H— NMRスぺクトルである。

第 3図は、ァシタバ根部由来フラクション 2 8の M Sスぺクトルである。第 4図は、ァシタバ根部由来フラクション 2 8の¹ H— NMRスペクトルである。

第 5図は、キサントフモールフラクション由来のフラクション A— 5の M Sスぺクトルである。

第 6図は、キサントフモールフラクション由来のフラクション A— 5の¹ H— NMRスぺクトルである。発明を実施するための最良の形態

本発明における有効成分は、（ i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種（以下、ポリフエノール類等という場合がある）、あるいは（i i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、（A) 金属、金属塩および金属イオンからなる群より選択される少なくとも 1種との混合処理、または（B ) 酸化処理により得られる組成物である。当該有効成分の成長因子産生増強作用は、ポリフヱノール類、その誘導体またはそれらの塩により奏されるものであり、それらは簡便に製造でき、その種々の生理機能により医薬、食品等の広い分野において極めて有用である。また、当該ポリフノール類等は前記（A) または ( B) の処理を行うことにより、その成長因子産生増強作用が増強される。従つて、前記組成物は、本発明の有効成分としてより好ましいものである。前記ポリフエノール類等の成長因子産生増強作用ならびに当該ポリフエノール類等の前記処理による前記作用の増強は本発明において初めて見出されたものである。なお、本明細書において、「成長因子産生増強作用」および「成長因子産生増強活性」はそれぞれ成長因子産生増強をもたらすことおよぴ成長因子産生を増強する機能をいうが、その意味において特に厳密に区別するものではない。「増強 J には、本発明に係る有効成分の作用前に比し、作用後において目的物質の量が増加するという態様と共に、本発明に係る有効成分を作用させることにより目的物質を生起せしめるという態様（誘導）を含む。また、本明細書において、有効成分として挙げるいずれの物質も単独でもしくは 2種以上混合して本発明において用いることができる。

本発明で使用するポリフ Xノ一ル類は成長因子産生増強作用を有するものであれば特に限定はない。たとえば、フラボノール類、カルコン、イソフラボン、ァントシァニン、フラバノール、フラバノン、フラボン、オーロン、フラバノノ一ル等のフラボノイド系に分類されるもの、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コーヒー酸、エラグ酸、ジカフェオイルキナ酸等の非フラボノィド系に分類されるもののいずれもが使用できる。また、プロアントシァニン等の縮合型、ガロタンニン、ェラグタンニン等の加水分解型のポリマ一ポリフエノールも本発明のポリフヱノールに包含される。本発明の所望の効果の発現の観点から、ポリフヱノール類としては、好ましくはフラポノイド類、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、ネオクロ口ゲン酸、コーヒー酸おょぴジカフェオイルキナ酸からなる群より選択される少なくとも 1種である。ジカフヱオイルキナ酸としては特に好適には 3 , 5—ジカフェオイルキナ酸である。また、前記フラボノイド類としては、好ましくはフラボノール類、フラバノン、カルコンおよびフラバノールからなる群より選択ざれる少なくとも 1種である。前記フラボノール類としては、ケンフヱロール、ミリセチン、ケルセチン等があり、好ましくはミリセチンおよびまたはケルセチンである。前記フラバノンとしては、好ましくはイソキサントフモールである。前記カルコンとしては、好ましくはキサントフモール Bおよび/またはキサントフモ —ル Dである。前記フラバノールとしては、カテキン類等があり、好ましくはェピガロカテキンガレートである。また、成長因子産生増強作用を有する限り、光学異性体、ケト-エノール互変異性体、幾何異性体等の各種異性体も本発明において使用することができ、各異性体の単離されたものであっても、その混合物であってもよい。本発明で使用するポリフエノ一ル類は公知の方法で製造することができ、たとえば植物（たとえば、ョモギ、ァシ夕バ、タケ、プラム、コメ、ダィズ、キク、シユンギク、ホップ、モロヘイヤ、紫ゥコン、ゥコン等）の果実、種子、種皮、花、葉、茎、根または根茎から分離、精製することができる。また、市販のポリフヱノール類を使用することもできる。また、ポリフヱノール類の含有されている植物の抽出物をそのまま使用することもできる。

本発明におけるポリフエノ一ル類の誘導体としては特に限定はないが、たとえば、ポリフエノール類のカルボン酸エステル、配糖体、硫酸化体等が例示され、成長因子産生増強作用を有していれば、いずれも本発明に使用することができる。当該誘導体としてはポリフエノール類のカルボン酸エステルおよびまたは配糖体が好ましい。前記ポリフヱノール類のカルボン酸エステルとしては、たとえば、脂肪族基、芳香族基または芳香脂肪族基を有するカルボン酸とのエステルが例示される。当該カルボン酸は不飽和の炭化水素を有するもの、水素原子がハロゲンや官能基、たとえば、水酸基、アミノ基、ォキソ基等に置換されたものであつてもよレ、。ポリフヱノール類に存在するフヱノ一ル性水酸基の全部に力ルポン酸とのエステルが形成されたものであつても、当該水酸基が一部残存するものであってもよい。ポリフヱノール類のカルボン酸エステルとしては、ポリフエノール類として前記例示した、有効成分として好適な化合物のカルボン酸エステルが好ましく、より好適にはコーヒー酸のカルボン酸エステルであるコーヒー酸メチルエステルおよび/またはコーヒー酸ェチルエステルである。また、フラボノィド類である、ゲンフエロール、ミリセチン、ケルセチン、イソキサントフモール

、キサントフモール B、キサントフモール Dまたはェピガロカテキンガレートのカルボン酸エステルはいずれも好ましい。

また、ポリフヱノール類の配糖体としては、たとえば、グルコース、スレオ一ス、リポース、ァピオース、ァロース、ラムノース、ァラビノピラノース、リブロース、キシロース、ガラクトース、マンノース、夕ロース、フコース、フルクトース、グルクロン酸、ガラクッロン酸等の単糖、ネオヘスペリドース、ルチノース、ァガロビオース、イソマルト一ス、スクロース、キシロビオース、ニゲロ —ス、マルト一ス、ラクト一ス等の二糖、およびァガロース、フコィダン等の多糖等の配糖体が挙げられる。また、配糖体としては、当該ポリフエノール類と糖とが 0—、 N—、 S―、または C—グリコシド結合した化合物の他に、糖の還元末端以外の炭素と C - C結合により結合した化合物をも含む。ポリフノ一ル類の配糖体としては、フラボンの 1種であるルテオリンの配糖体であるイソオリエンチンが好ましい。また、ポリフエノール類の配糖体としては、ポリフエノール類として前記例示した、有効成分として好適な化合物の配糖体が好ましい。また、フラボノイド類である、ケンフヱロール、ミリセチン、ケルセチン、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール Dまたはェピガロカテキンガレートの配糖体はいずれも好ましい。

さらに、ポリフヱノ一ル類の誘導体には、たとえば、生体内での加水分解反応により成長因子産生増強作用を発揮し得るようになる、いわゆるプロドラッグとして機能するような化合物も包含される。

以上のポリフエノ一ル類の誘導体は、公知の方法により適宜製造することができ。

本発明に係るポリフエノール類または誘導体の塩としては、たとえば、アル力リ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩等が例示される。たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニゥム、またはジエタノールァミン、エチレンジァミンとの塩等が挙げられる。これらの塩は、たとえば、ポリフエノ一ル類のフノール性水酸基等を公知の方法により塩に変換することで得られる。かかる塩としては薬理学的に許容され得る塩が好ましい。

また、本発明の有効成分としては前記組成物、すなわち、

ポリフノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、

( B) 酸化処理

により得られる組成物が好適に用いられる。前記（A) または（B) の処理により、前記ポリフノール類等の成長因子産生増強作用が増強される。従って、当該組成物は、前記ポリフノール類等に比し、有効成分としてより好適である。なお、ポリフエノール類等としては、ポリフエノール類として前記例示した、有効成分として好適な化合物、当該化合物の誘導体ならびにそれらの塩を挙げることができるが、中でもクロロゲン酸およびまたはコーヒー酸、それらの誘導体ならびにそれらの塩が好ましい。また、誘導体としては、クロロゲン酸および Z またはコーヒー酸のカルボン酸エステルおよびまたは配糖体が好ましい。かかる組成物自体も本発明に包含される。

本発明で使用される金属としては特に限定はないが、好ましくは鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニウム、カルシウム、ニッケル、およびコバルトからなる群より選択される少なくとも 1種の金属元素単体を挙げることができる。金属塩としては、好ましくは前記金属を含んでなる塩であり、たとえば、当該金属との硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、塩化物等を挙げることができる。また、錯イオンを含む錯塩を使用することもできる。金属イオンとは、これらの金属およびまたは金属塩を、たとえば、水性液中に溶解して生成する金属イオンをいい、好ましくは Fe²⁺、 Fe³⁺、 Mn²⁺、 Mn³⁺、 Mg²⁺、 Cu⁺、 Cu²⁺、 Cu³⁺、 Zn²⁺、 Ag⁺、 Ag²⁺、 Au⁺、 Au³⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Ni²⁺、 Co²⁺および Co ³⁺からなる群より選択される少なくとも 1種を使用する。

前記ポリフエノール類等の（A)金属、金属塩および金属イオンからなる群より選択される少なくとも 1種（以下、金属等という場合がある）との混合処理は、前記ポリフエノール類等と金属等を接触させることにより行う。たとえば、適当な溶媒中においてポリフエノール類と金属塩とを、モル比（ポリフエノール類 /金属塩）で好ましくは 0. 01〜10000、より好ましくは 1〜100となるように混合し、好ましくは 0〜100°C、より好ましくは室温（25°C) にて、好ましくは 5分〜 10日間、より好ましくは 30分〜 1日間放置することにより行う。当該溶媒としては、たとえば、水、クロ αホルム、エタノール、メタノ —ル、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルェチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸ェチル等の親水性もしくは親油性の溶媒を、単独で、もしくは混合液として用いることができ、好ましくは水を用いる。混合処理においては、処理対象のポリフ Xノール類等と金属等が共に溶媒に溶解しているのが好ましい。また、植物からポリフエノール類を抽出する工程において、上記混合処理を付すことにより、前記組成物を得ることもできる。たとえば、抽出溶媒中に前記金属等を添加しておき、抽出後、たとえば、数分〜数時間放置することによつても前記組成物を得ることができる。

混合処理により得られる組成物の構造は不明であるが、たとえば、ポリフエノ —ル類等と金属等が何らかの結合により、たとえば、錯体として生成していたり、また、結合はなく単に混合された状態で存在していること等が推測される。前記ポリフエノール類等の（B) 酸化処理は、たとえば、ポリフノール類を、酸素との接触による酸化、酸化剤による酸化、酸化酵素による酸化、電気的に酸化等の工程に供することにより行う。いずれも公知の方法に従つて行うことができる。たとえば、酸素との接触により酸化を行う場合、水溶液中に溶解させたポリフエノール類に対し、ポンプを通して空気を送りこむことにより行うことができる。酸化剤による酸化は、酸化剤として好適には過酸化水素、オゾン、銀、銅、鉄、ニッケル、マンガン、コバルト、クロム等を用いて行うことができる。酸化酵素による酸化は、酸化酵素として好適にはチロシナ一ゼ、ペルォキシダーゼ等を使用して行うことができる。なお、酸化酵素による酸化には、前記例示する酸化酵素を含む微生物による酸化も包含される。また、電気的に酸化を行う場合、たとえば、白金、酸化鉛、炭素、グラフアイト、酸化白金等を電極に用いる陽極酸化反応により酸化することができる。

酸化処理により得られる組成物の構造は不明であるが、ポリフエノール類等が単に酸化され、もしくは重合されてポリマ一として存在していること等が推測され

なお、有効成分として用いられる組成物は前記（A) または（B) の処理を経て得られたものであれば特に限定はなく、従って、前記（A) または（B) の処理工程を含む処理方法〔すなわち、前記（A) または（B) の処理工程以外のェ程を含む処理方法〕により得られたものも用いることができる。また、前記処理後の前記ポリフエノ一ル類等は処理後そのまま組成物として使用されるが、一方、所望の効果が得られる限り、公知の精製工程に従って所望により精製して使用してもょレ、₀

本発明に係る有効成分は、公知の成長因子産生増強作用を有する物質と組み合わせて使用することもでき、さらにポリフエノール類等の金属等との混合処理により得られる組成物とポリフノール類等の酸化処理により得られる組成物とを組み合わせて使用することもできる。

本発明に係る有効成分は、前記するように、いずれのものも成長因子産生増強作用を有するものである。当該作用の発現は、たとえば、後述の実施例 1および 1 7に示す方法により評価することができる。

本発明に係る有効成分には、後述するように特に毒性は認められない。また、副作用の発生の心配もない。それゆえ、安全かつ適切に成長因子の産生増強を行うことができる。従って、当該有効成分を含んでなる本発明の治療剤、予防剤、食品、飲料または飼料は、成長因子産生増強を必要とする疾患の治療または予防に有効である。

本発明において、成長因子とは細胞の成長を促進する活性を有していれば特に限定はないが、肝細胞増殖因子（H G F ) 、神経成長因子（N G F ) 、神経栄養因子、上皮成長因子、ミルク由来成長因子、線維芽細胞成長因子、脳由来線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板塩基性夕ンパク質、結合組織活性化ペプチド、インスリン様増殖因子、コロニー形成刺激因子、エリスロポエチン、スロンボポェチン、 T細胞成長因子、インタ一ロイキン類（たとえば、インタ一ロイキン 2、 3、 4、 5、 7、 9、 1 1、 1 5 )、 B 細胞成長因子、軟骨由来因子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、骨格成長因子、内皮細胞成長因子、内皮細胞由来成長因子、眼由来成長因子、精巣由来成長因子、セルトリ細胞由来成長因子、乳腺刺激因子、脊髄由来成長因子、マクロファージ由来成長因子、リサイクル間葉成長因子、形質転換増殖因子— ύ；、形質転換増殖因子ー/8、へパリン結合性 EG F様増殖因子、アンフィレグリン、 SDG F、ベータ一セルリン、ェピレグリン、ニューレグリン 1、 2、 3、血管内皮増殖因子、ニューロトロフィン、 BDNF、 NT— 3、 NT— 4、 NT- 5. NT 一 6、 NT- 7. グリア細胞株由来神経栄養因子、幹細胞因子、ミツドカイン、プレイオト口フィン、 Ephr i n、 An g i o p o i e t i n、ァクチビン、腫瘍壊死因子、インターフェロン類等が例示される。本発明によれば、特に神経成長因子（NGF) または肝細胞増殖因子（HGF)を好適に產生増強することができる。

HGFは肝細胞の再生因子であり、さらに細胞の運動を亢進させる因子、および腫瘍細胞障害因子でもある。 HGFは肝細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞等、多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、 HGF は、上皮細胞の運動性亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導する等、極めて多彩な生理活性を示す。従って、 HGFの産生を増強することにより、たとえば、肝炎、重症肝炎、劇症肝炎、肝硬変、肝内胆汁うつ滞等の肝障害、薬剤等による腎障害、胃腸障害、血管障害、慢性腎炎、肺炎、創傷、糖尿病、がん等の治療または予防を行うことができる。

一方、 NGFは神経細胞の生存や機能を維持したり、 NGFの濃度勾配に従つて神経細胞を伸長させたりする内因性の成長因子であり、 N G Fの産生を増強することにより、アルツハイマー病等の老人痴呆症や末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒等による神経機能の修復，再生を要する疾患の治療または予防を行うことができる。また、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、黄斑変性症等の治療または予防にも有用である。

本発明における成長因子の産生増強を必要とする疾患としては、前記有効成分を含有してなる治療剤、予防剤等により成長因子の産生増強を行うことで治療または予防が可能な疾患であれば特に限定されるものではないが、前記例示した H G Fまたは N G Fを產生増強することにより治療または予防することができる各種疾患に対し特に有効である。

本発明の成長因子の産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤としては、本発明に係る前記有効成分を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬学的に許容され得る塩を用いる。

本発明の治療剤または予防剤の製造は、通常、前記有効成分を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。

医薬用担体は、治療剤または予防剤の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。

一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ一ルなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。

以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。

本発明の治療剤および予防剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用剤では、たとえば、座剤をその適する投与方法により投与すればよい。

本発明の治療剤または予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該治療剤または予防剤の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、好ましくは成人 1日当り 0 . 1 z g〜2 0 O m g/k g体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数回に分けて行つてもよい。また、本発明の治療剤または予防剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

また、本発明の別の態様として、本発明に係る前記有効成分を含む成長因子産生増強剤を提供することもできる。当該増強剤としては、前記有効成分そのものであってもよく、また、前記有効成分を含む組成物であってもよい。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が好適である。成長因子産生増強剤は、たとえば、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分などと配合し、上記治療剤または予防剤の製造方法に準じて通常使用される試薬の形態に製造すればよい。かかる増強剤における前記有効成分の含有量は、当該増強剤の投与方法、使用目的などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。また、該増強剤の使用量も、本発明の所望の効果の発現が得られ得るようであれば特に限定されるものではない。特に、生体に投与して使用する場合には、好ましくは前記治療剤または予防剤における有効成分の投与量範囲内で有効成分を投与できるような量で使用すればよい。成長因子産生増強剤は、成長因子産生増強、特に H G Fまたは NG F産生増強を必要とする疾患における当該成長因子の増強に有用である。また、該増強剤は成長因子に関連する疾患に対する薬物のスクリーニングにも有用である。また、該増強剤は、上皮細胞活性化方法に使用することができ、該方法は上皮細胞機構に関する生化学的研究や、肝臓障害、腎臓障害、胃腸障害、血管障害の薬物スクリーニングに有用である。また、該増強剤は、成長因子の機能研究にも有用である。

さらに、本発明の別の態様として、本発明に係る前記有効成分を動物に投与する成長因子産生の増強方法を提供することもできる。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が好適である。かかる方法は、成長因子産生の増強が必要であると予想される、または、その必要のある動物に対し、前記有効成分を、好ましくは、前記成長因子産生増強剤として投与することにより行うことができ、かかる投与により、成長因子の産生を増強せしめる。有効成分の投与方法、投与量などは、前記成長因子産生増強剤の場合と同様とすればよい。なお、成長因子産生の増強方法では、本発明の治療剤または予防剤、後述の食品、飲料または飼料を用いることもできる。また、「動物」としては、たとえば、哺乳動物であるヒト、ィヌ、ネコ、ゥシ、ブタ、ゥマ等を挙げることができ、中でも、ヒトに対し好適に用いられる。かかる成長因子産生の増強方法は、たとえば、成長因子産生増強を必要とする疾患の治療または予防における成長因子産生増強に有用である。また、該増強方法は、成長因子に関連する疾患に対する薬物のスクリーニングに有用である。また、該増強方法は、成長因子の機能研究にも有用である。

また、本発明は、前記有効成分を含有してなる成長因子産生増強用の食品、飲料または飼料を提供する。本発明の態様においては、有効成分の塩としては、薬学的に許容される塩、またはそれと同等の安全性を有する塩が好適である。本発明の食品、飲料または飼料は、その成長因子産生増強作用により、成長因子産生増強を必要とする疾患の症状改善、予防に極めて有用である。

なお、本発明の態様において、「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、「含有」とは食品、飲料または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品、飲料または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈 J とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。

本発明の食品、飲料または飼料の製造法に特に限定はない。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品、飲料または飼料のものに従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた食品、飲料または飼料に成長因子産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分が含有されていれば良レ、。

本発明の食品または飲料としては特に限定はないが、たとえば、本発明に係る前記有効成分が含有されてなる、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビ一フン、はるさめ、包装餅など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など

) 、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産 |g品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜 ·果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコ —ル飲料、果実酒、リキュールなど）、嗜好飲料（綠茶、紅茶、ウーロン茶、コ —ヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりんなど）、缶詰 ·瓶詰め ·袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバ一ペースト、その他のスプレツド、そば ·うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麵類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体食品（スープなど）、香辛料類などの農産，林産加ェ品、畜産加工品、水産加工品などが挙げられる。

本発明の食品または飲料には前記有効成分が単独もしくは複数含有、添加およぴ/ /または希釈されており、その成長因子増強作用を発現するための必要量が含まれていれば特にその形状に限定はなく、夕ブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。

本発明の食品または飲料中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できるが、たとえば、食品 1 0 0重量部当たり好ましくは 0 . 0 0 0 1重量部以上、より好ましくは 0 . 0 0 1〜1 0重量部であり、たとえば、飲料 1 0 0重量部当たり好ましくは 0 . 0 0 0 1重量部以上、より好ましくは 0 . 0 0 1〜1 0重量部である。また、本発明の食品または飲料は、好ましくは、それらに含有される有効成分が、たとえば、成人 1日当たり 0 . 0 1 - 1 0 O m g Z k g体重摂取できるように摂取すればよい。

また、本発明は、前記有効成分を含有、添加およびまたは希釈してなる、成長因子産生増強作用を有する生物用の飼料を提供するものであり、さらに、別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法をも提供する。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。

これらの発明において、生物とはたとえば養殖動物、ぺット動物などであり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類または貝類が例示される。飼料としては体調の維持およびまたは改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。

これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明に使用される前記有効成分の成長因子産生増強作用に基づき、本発明の前記治療剤または予防剤と同様の効果の発現が期待できる。すなわち、これらの発明により、当該生物における成長因子産生増強作用を要する疾患の治療または予防効果を期待できる。

本発明に使用される前記有効成分は通常、対象生物の体重 1 k g、 1日当たり好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g投与される。投与は、たとえば、当該有効成分を、対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合することで行うことができる。また、前記有効成分の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、 0 . 0 0 1〜1 5重量％の割合が好適である。

人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油などの動物性油脂、大豆油、菜種油などの植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤などを原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチなどの魚類用飼料が挙げられる。

本発明の飼料の製造法に特に限定はなく、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中に成長因子産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分が含まれていればよ、。

また、成長因子産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分をプール、水槽、保持タンクまたは飼育領域の水、海水などに直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。水または海水中の成長因子産生増強作用を有する本発明に係る有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは 0 . 0 0 0 0 1〜1重量％の割合が適当である。

また、成長因子産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。該飲料中の成長因子産生増強作用を有する本発明に使用される有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、 0 . 0 0 0 1〜1重量％の割合が適当である。成長因子産生増強作用を有する本発明に係る前記有効成分を含んでなる生物飼育用剤、たとえば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の配合および製造法で製造すれば良い。該生物飼育用剤における有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られ得る限り特に限定されるものではない。

本発明が適用できる生物としては限定はないが、養殖動物としては、ゥマ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ゥサギなどの実験動物、ニヮトリ、ァヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽、マダィ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、ァュ、サケ .マス類、 +ラフグ、ゥナギ、ドジヨウ、ナマズなどの魚類、クルマェビ、ブラックタイガ一、タイショウェビ、ガザミなどの甲殻類など、ァヮビ、サザェ、ホタテ貝、カキなどの貝類、ペット動物としてはィヌ、ネコなどが挙げられ、陸上 ·水中動物に広く適用できる。

成長因子産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分を含んでなる飼料を摂取させること、または成長因子産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分の含有液に対象生物を浸潰させることにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ぺット動物などの体調を良好に維持し、または、改善させたりすることができる。

さらに、本発明の別の態様として、成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、成長因子産生増強剤、または成長因子産生増強用の食品、飲料もしくは飼料の製造における本発明に係る前記有効成分の使用を提供する。かかる使用の態様としては、本発明の前記治療剤もしくは予防剤、成長因子産生増強剤、または成長因子産生増強用の食品、飲料もしくは飼料の製造における前記有効成分の使用の態様を挙げることができる。たとえば、成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、または成長因子産生増強剤の製造における、前記有効成分の使用としては、前記のような錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤などの固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品の製造においての使用が例示さ 4しる

本発明で使用される前記有効成分は、その作用発現にとつての有効量の投与を行っても毒性は認められない。たとえば経口投与の場合、ゲンフエロール、ミリセチン、ケルセチン、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール D、ェピガロカテキンガレート、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリブトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コーヒー酸、ジカフェオイルキナ酸、ィソオリエンチン、コーヒー酸メチルエステル、コーヒー酸ェチルエステルもしくはこれらの光学活性体又はそれらの塩のいずれかを 1 gZk gでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、特段の事情がない限り実施例における％は重量を意味する。また，フラクションを画分という場合がある。実施例 1 ミリセチンおよびケルセチンの HGF産生増強活性

5 X 1 0⁴ c e l l s/cm² となるように 1 0 %牛胎仔血清を含んだ DM E 培地に懸濁した MRC- 5細胞（CCL 1 7 1 :大日本製薬社製、 c o d e. 02— 0 2 1) を 48穴の細胞培養プレートに入れ、 37°C、 5%C0₂ 存在下で 24時間培養後に培地交換した。その後、試料を添加し、さらに 24時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELIS A Kit (フナコシ社製、 Code. RS- 0 64 1 - 0 0 ) を用いて、培地中の HGF の量を測定した。試料として、ミリセチン（試料①）を最終濃度が 0、 1、 1 0 、 1 0 0 /Mになるように、ケルセチン（試料②）を 0、 1 0、 1 0 0〃Μになるように添加した。なお、試料の添加は、予め種々の濃度の試料水溶液を調製して培地に対し一定量添加し、前記最終濃度となるようにして行った。蒸留水のみを一定量添加したもの（試料の最終濃度が 0 ζΜ) を対照とし、当該細胞培養液中の HGF濃度を 1 0 0%として相対値（％) により HGF産生量を表した。その結果を表 1に示す。実験は全て 2連で行いその平均値を採用した。表 1に示したように、試料①、 ②は、 HGFの產生を増強した。さらに、フラボノールの Β 環の水酸基の数が多いミリセチンの方が H G F産生増強活性は強かった。

このことより、フラボノール類およびその誘導体には、 HGFの産生を増強する活性があることが示された。表 1

試料濃度（ M) HGF産生量（％) 試料① 0 1 00

1 1 87

1 0 543

100 454

試料② 0 1 00

1 0 1 39

1 00 304

(ただし、対照の HGF産生量は、 4. 8 OngZmlであった。）実施例 2 ェピガロカテキンガレートの HGF産生増強活性

実施例 1と同様の方法で、ェピガロカテキンガレートの HGF産生増強活性を測定した。ただし、ェピガロカテキンガレ一トは、最終濃度が、 0、 1、 1 0〃 Mになるように添加した。その結果を表 2に示す。表 2に示したように、ェピガロカテキンガレートは、 HGFの産生を増強した。表 2

濃度（《M) HGF産生量（）

0 1 00

1 1 75

1 0 1 60

(ただし、対照の HGF産生量は、 6. 78ng/mlであった。）実施例 3 ガリックアシッドの H G F産生増強活性

実施例 1と同様の方法で、ガリックアシッドの H G F産生増強活性を測定した。ただし、ガリックァシッドは、最終濃度が、 0、 1、 1 0、 100 Μになるように添加した。その結果を表 3に示す。表 3に示したように、ガリックァシッドは、 HGFの產生を増強した。表 3

濃度（ Μ) HGF産生量（％)

0 1 00

1 1 12

1 0 217

1 00 576

(ただし、対照の HGF産生量は、 6. 78ngZmlであった。）実施例 4 クロロゲン酸の H G F産生増強活性

実施例 1と同様の方法で、クロロゲン酸の HGF産生増強活性を測定した。クロロゲン酸（東京化成社製）は、最終濃度が、 0、 1、 1 0、 100、 500、 1 000〃Mになるように添加した。その結果を表 4に示す。表 4に示したように、クロロゲン酸は、 HGFの產生を増強した。

表 4

濃度（ zM) HGF産生量 (%)

0 100

1 105

10 122

1 00 302

500 479

1 000 624

(ただし、対照の HGF産生量は、 5. 1 6ngZmlであった。）実施例 5 コ―ヒ一酸の H G F産生増強活性

実施例 1と同様の方法で、コーヒー酸の HGF産生増強活性を測定した。ただし、コーヒー酸（シグマ社製）は、最終濃度が、 0、 1 0、 1 00 zMになるように添加した。その結果を表 5に示す。表 5に示したように、コーヒー酸は HG Fの産生を増強した。表 5

濃度（ Μ) HGF産生量（％)

0 1 00

10 1 1 7

1 00 1 96

(ただし、対照の HGF産生量は、 6. 27ng« mlであった。）実施例 6 ジカフェオイルキナ酸の調製と HGF産生増強活性

(1) ョモギ乾燥品（阪本漢方堂社製） 40 gを 50%アセトン 50 OmLで 3回抽出した後、約 1 5 mLに減圧濃縮した。濃縮液に 1 0%クェン酸水溶液を

2 Θ 35mL添加し、酢酸ェチル 10 OmLで 3回抽出した後、有機層を硫酸マグネシゥムで乾燥、減圧濃縮した。濃縮物をクロ口ホルム：メタノール：酢酸 =2 ： 1 ： 1 (体積比）を展開溶媒としたシリカクロマトグラフィーに供し、 8mLずつ分取した。得られたフラクション 7〜1 3を集め、減圧濃縮した後、クロロホルム：メタノール：酢酸 = 1 : 1 : 0. 05を展開溶媒としたシリカゲルプレート上で展開し、 Rf値 0. 5付近の UV 254 nmに吸収を示す物質 225 m gを回収した。この物質の構造を¹ H— NMRで解析したところ、ジカフヱオイルキナ酸 (3, 5-dicaffeoylquinic acid )であることが分かった。

(2)実施例 1と同様の方法で、実施例 6— （1) で調製したジカフェオイルキナ酸の HGF産生増強活性を測定した。ただし、ジカフェオイルキナ酸は、最終濃度が、 0、 1、 10、 1 00 CtMになるように添加した。その結果を表 6に示す。表 6に示したように、ジカフヱオイルキナ酸は、 HGFの產生を増強した

表 6

濃度 OM) HGF産生量（％)

0 1 00

1 142

1 0 206

1 00 290

(ただし、対照の HGF産生量は、 6. 27ngZmlであった。）実施例 7 ジカフェオイルキナ酸の調製と HG F産生増強活性

春菊約 900 gの植物サンプルを凍結乾燥し、 80%エタノール 2Lと共にミキサ一にかけて磨砕し、ガーゼを用いてろ過を行ない、得られた抽出液を 200mLに濃縮し、春菊粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液 100mL分を XAD-2樹脂（オルガノ社製） 200mL に供し、 0%、 30¾、 40%、 60¾ および 100%のメタノール、それぞれ 500mLで溶出した。それぞれの画分を 50mLにまで濃縮し、実施例 1と同様に各画分の HGF産生増強活性を確認したところ、表 7に示すように 60% メタノール溶出画分に HGF産生増強活性が見られた。 60% メタノール溶出画分を¹ H-NM R で解析したところ、この画分には高濃度の 3, 5- ジカフヱオイルキナ酸が含有されていることが分かった。なお、当該画分は最終濃度が、 0、 0. 1、 1 %になるように添加した。表 7

春菊粗抽出液 6 0 %メタノール画分 HGF産生量

0 1 0 0

0. 1 2 2 0

1 3 4 9

(ただし、対照の HGF産生量は、 8. 22 n g/m lであった。）実施例 8 イソオリエンチンの HGF産生増強活性

細かくした竹葉約 5 gを 50% アセトン 70mLと共に 15分以上撹拌し、得られた抽出液を吸引ろ過し、残渣を再び同量の溶媒で抽出した。得られたろ液 100mL のうち、 ImL を減圧乾固した後、 DMSO ImLに溶解し、 HGF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で調べたところ、表 8に示すように HGF産生増強活性が確認された。粗抽出液は最終濃度が、 0、 0. 1、 1 %となるように添加した。粗抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を水で 20倍に希釈し、その一部を 10mL分の XAD-2 (オルガノ社製）に供し、 30% 、 40¾、 50%；、 60¾ および 100%のメタノール、各 30mLで溶出した。各画分の HGF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で測定したところ、 40 % メタノール、 30% メタノール画分に活性が確認された。 30 、 40¾ メタノール画分を濃縮 '乾固し、クロ口ホルム：メタノール：酢酸 =3 : 1 : 0.025 を展開溶媒としたシリカカラムクロマトグラフィーに供し、 10mLずつ分取した。 ¹ H — NMR、 FAB- MSにより分析した結果、フラクション 1 9〜35本目に、フラボンの一種のルテオリンの配糖体であるイソオリエンチン（isoorientin ) を高濃度に含有する画分が得られ、この画分に表 9に示す様な HGF産生増強活性が確認された。なお、当該フラクションは最終濃度が、 0、 0. 1、 lmgZmlになるように添加した。

1 H-NMR

isoorientin ： al.57(1H, dd, J=8.0， 2.0Hz) , 7.55(1H, d, J=2.0Hz) , 7. 02C1H, d, J=8.0Hz) ,6.81(1H, s)， 6.63(1H, d, J=8.0Hz), 4.74(1H, d, J=10. 0Hz), 4.19(1H， t, J=4.5Hz)

FAB-MASS

449( +H)⁺

表 8

竹葉粗抽出液（％) HGF産生量（％)

0 1 00

0. 1 195

1 463

(ただし、対照の HGF産生量は、 9. 0 gngZmlであった。）表 9

イソオリエンチン高濃度画分 HGF産生量

(mg/m 1；

0 1 00

0. 1 1 31

1 318

(ただし、対照の HGF産生量は、 9. 6 SngZmlであった。）実施例 9 クロロゲン酸の異性体の HG F産生増強活性

乾燥プラム約 300 gを 100%メタノール 500mLと共にミキサーにかけて磨砕し、吸引ろ過によりろ液を得た。ろ液 lmL を濃縮乾固し、 lmL の DMS0に溶解した。このプラム粗抽出液の HGF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で調べたところ、表 1 0に示すように活性が確認された。粗抽出液は最終濃度が、 0、 0. 0 1、 0. 1、 1 %になるように添加した。

得られた粗抽出液を濃縮して抽出溶媒を除き水で 1 Lに希釈し、 200mL の XAD - 2 に供し、 500mL の水で洗浄後、 100 メタノールで吸着画分を溶出した。得られた溶出画分を濃縮後、少量の水に溶解した後、コスモシール 140C₁₈- 0PN( ナカラィテスク社製）に供し、 0%〜25% のァセトニトリル/水、合計 800mL のグラジェントで溶出し、約 10mLずつ分取した。得られたフラクションを、 ¹ H -NMR により分析した結果、 26本目〜32本目のフラクションと 41本目〜48本目のフラクションにそれぞれ、クロロゲン酸の異性体であるネオクロロゲン酸（5-caffeoyl-qui nic acid) 、クリプトクロロゲン酸 (4-caffeoyl-quinic acid) を高濃度に含む画分を得、それぞれ表 1 1、表 1 2に示すように HGF産生増強活性が確認された。なお、それらの画分は最終濃度が、 0、 0. 0 1、 0. lmgZmlになるように添加した。

1 H-NMR

5-caffeoyl-quinic acid ：び 7.63(1H， d, J=15.5Hz) ， 7.19(1H, s), 7.12( 1H, d， J=8.0Hz), 6.93C1H, d, J=8.0Hz), 5.40(1H, m),4.18(lH, m), 3.77(1H, dd， J=9.5, 4.5Hz), 2.2〜1.6(5H, m)

4-caffeoyl-quinic acid ：び 7.49(1H， d, J=15.5Hz) , 7.04(1H, d, J=4. OH z), 6.99 1H, dd, J=8.0, 4.0Hz), 6.73(1H, d, J=8.0Hz), 6.27(1H, d, 16Hz), 4.65 1H, dd, J=8.0, 3.0Hz), 4.08 (1H, m), 2.2〜1.6(5H, m) 表 10

プラム粗抽出液（％) HGF産生量（％)

0 100

0. 01 1 1 1

0. 1 214

1 306

(ただし、対照の HGF産生量は、 8. 02ngZmlであった。）表 1 1

ネオクロロゲン酸高濃度画分 H G F産生量

(mg/m 1 ) (¾)

0 100

0. 01 1 1 1

0. 1 321

(ただし、対照の HGF産生量は、 9. 9 SngZmlであった。）表 12

クリプトクロロゲン酸高濃度画分 H G F産生 i

(mg/m 1 ) (%)

0 100

0. 01 103

0. 1 142

(ただし、対照の HGF產生量は、 9. 9 SngZmlであった。）実施例 10 注射剤の製造

注射剤

(1)生理食塩水にミリセチン、ケルセチン、ケンフエロール、ェピガロカテキンガレ一ト、ガリックアシッド、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリブトクロロゲン酸、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール D、コーヒー酸またはジカフェオイルキナ酸を 1%濃度で加え、それぞれの注射剤を作製した。

(2)生理食塩水にミリセチン、ケルセチン、ケンフエロール、ェピガロカテキンガレ一ト、ガリックアシッド、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリブトクロロゲン酸、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール D、コーヒー酸またはジカフヱオイルキナ酸と、グリシルリチン酸をそれぞれ 0 . 5%及び0. 1 %濃度で加え、注射剤を作製した。実施例 1 1 錠剤の製造

錠剤

(1) ミリセチン、ケルセチン、ゲンフエロール、ェピガロカテキンガレ一ト、ガリックアシッド、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール D、コーヒー酸またはジカフェオイルキナ酸 1 0 Omgと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、各錠剤を作製した。

(2) ミリセチン、ケルセチン、ケンフエロール、ェピガロカテキンガレート、ガリックアシッド、クロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、イソキサントフモール、キサントフモール B、キサントフモール D、コーヒー酸またはジカフヱオイルキナ酸をそれぞれ 0. lmg、グリシルリチン酸ジカリゥム 1 Omg及び微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。実施例 1 2 鉄によるクロロゲン酸の HGF産生増強活性の増強

クロロゲン酸水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 10mM 塩化第二鉄（半井化学薬品社製）水溶液を調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し

、室温で 6 0分閭静置した。この鉄処理したクロロゲン酸の HGF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で測定した。鉄処理したクロロゲン酸はクロロゲン酸に換算して 0、 1 0、 1 0 0、 500 iMとなるように添加した。なお、試料の添加は、予め種々の濃度の鉄処理したクロロゲン酸の水溶液を調製して培地に対し一定量添加し、前記最終濃度となるようにして行った。鉄処理したクロロゲン酸の最終濃度 0 Mのものはクロロゲン酸非存在下に鉄処理して得られた水溶液を一定量添加したものである。また、比較として鉄処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。前記同様、蒸留水のみを一定量添加したもの（クロロゲン酸の最終濃度が 0 ίΜ) を対照とし、当該細胞培養液中の HGF 濃度を 1 0 0%として相対値（％) により HGF産生量を表した。その結果を表 1 3に示す。鉄処理によりクロロゲン酸の HGF産生増強活性は増強された。表 1 3

濃度 0 10 100 500 鉄処理なし HGF産生量（） 100 122 302 479 鉄処理 110 産生量（％) 77 399 508 635

(ただし、対照の HGF産生量は 5.16 ng/mlであった。）実施例 1 3 マンガンによるクロロゲン酸の HGF産生増強活性の増強

クロロゲン酸水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 1 OmM 塩化マンガン（Π) (ナカライテスク社製）水溶液を調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 60分間静置した。このマンガン処理したクロロゲン酸の H GF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で測定した。マンガン処理したクロ口ゲン酸は培地の 1 000分の 1量（クロロゲン酸の最終濃度： 50 fiM となるように添加した。また、比較としてマンガン処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 1 4に示す。マンガン処理によりクロロゲン酸の HGF産生増強活性は増強された。表 1 4

試料 HGF產生量（％)

クロロゲン酸 0〃 M 1 00

クロロゲン酸 50 1 48

マンガン処理したクロロゲン酸 50 nVi 3 64

(ただし、対照の HGF産生量は 7.02 ng/mlであった。）実施例 1 4 銅によるクロロゲン酸の HGF産生増強活性の増強

クロロゲン酸水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 1 OmM 硫酸銅 ( I I) (半井化学薬品社製）水溶液を調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 60分間静置した。この銅処理したクロロゲン酸の HGF産生増強活性を実施例 1と同様の方法で測定した。銅処理したクロロゲン酸は培地の 1 0 0 0分の 1量（クロロゲン酸の最終濃度： 5 0 zM) となるように添加した。また、比較として銅処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 1 5に示す。銅処理によりクロロゲン酸の HGF産生増強活性は増強された。表 1 5

試料 HGF産生量（％) クロロゲン酸 θ ζ M 1 00

クロロゲン酸 50 /M 1 48

銅処理したクロロゲン酸 50 Μ 293

(ただし、対照の HGF産生量は 7.02 ng/mlであった。）実施例 1 5 クロロゲン酸酸化処理物の HGF産生増強活性の増強

クロロゲン酸を 1 0 OmMの濃度になるように 1 0 OmM 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9) に溶解した。この溶液に 1 2時間、ペリスターポンプを通じて空気を送り込むことでクロロゲン酸の酸化処理物を調製した。この酸化処理したクロロゲン酸の HGF産生増強活性を実施例 1 と同様の方法で測定した。酸化処理したクロロゲン酸はクロロゲン酸に換算して 0、 1、 1 0、 1 00、 1 0 0 0〃 Mとなるように添加した。なお、酸化処理したクロロゲン酸の最終濃度 0 Mのものはクロロゲン酸非存在下に酸化処理して得られた水溶液を一定量添加したものである。また、比較として酸化処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 1 6に示す。酸化処理によりクロロゲン酸の HGF産生増強活性は増強された。表 1 6

濃度（ zM) 0 1 10 100 1000 酸化処理なし H G F產生量（％ ) 100 105 122 302 624 酸化処理 HGF産生量（％) 100 198 541 704 687

(ただし、対照の HGF産生量は 5.16 ng/mlであった。）実施例 1 6 コ―ヒ—酸酸化処理物の H G F産生増強活性の増強

コーヒー酸を 1 0 OmMの濃度になるように 1 0 OmM 炭酸ナトリウム緩衝液（PH9) に溶解した。この溶液に 1 2時間、ペリスターポンプを通じて空気を送り込むことでコーヒ一酸の酸化処理物を調製した。この酸化処理したコ一ヒ一酸の HGF產生増強活性を実施例 1と同様の方法で測定した。酸化処理したコ —ヒー酸はコーヒー酸に換算して 0、 1、 1 0、 1 0 0、 l O O O Mとなるように添加した。また、比較として酸化処理を行っていないコーヒー酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 1 7に示す。酸化処理によりコーヒー酸の H G F産生増強活性は増強された。表 1 7

濃度（ zM) 0 1 10 100 1000 酸化処理なし H G F産生量（％ ) 100 85 117 196 92 酸化処理 HGF産生量（％) 100 307 353 411 555

(ただし、対照の HGF産生量は 6.27 ng/mlであった。）実施例 1 7 鉄によるクロロゲン酸の NGF産生増強活性の増強（ 1 )

クロロゲン酸（東京化成社製）水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 1 OmM 塩化第二鉄（半井化学薬品社製）水溶液を調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 6 0分間静置し、鉄処理クロロゲン酸を調製した。この鉄処理クロロゲン酸の N G F産生に及ぼす影響を以下の方法で測定した。

マウス線維芽細胞 L—M細胞（ATCC CCL-1.2) を 0. 5%のパクトペプトン（ギブコ社製）を含む M199培地（ICN社製）で 1.5 X10⁵ 細胞 Zmlに懸濁し 9 6 穴プレートに 0. 1m lずつまき無菌的に培養した。 3日間培養後、培地を取り除き、 0. 5%のゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む M199培地に置き換えた。これに、上記鉄処理したクロロゲン酸を培地の 1 0 0分の 1量（クロロゲン酸の最終濃度： 5 00 ^M) となるように添加し、 20時間培養した。培養終了後、培養液中の NGFの濃度をェンザィムィムノアツセィ法（NGF Emax Immun o Assay System：プロメガ社製）にて測定した。なお、鉄処理したクロロゲン酸の最終濃度 0 Mのものはクロロゲン酸非存在下に鉄処理して得られた水溶液を一定量添加したものである。また、比較として鉄処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。前記同様、蒸留水のみを一定量添加したもの（鉄処理を行っていないクロロゲン酸の最終濃度が 0 を対照とし、当該細胞培養液中の NGF濃度を 1 00%として相対値（％) により NGF産生量を表した。その結果を表 1 8に示す。実験は 2連で行い、その平均値を採用した。鉄処理によりクロロゲン酸の N G F産生増強活性は増強された。表 1 8

濃度 0 500

鉄処理なし NGF産生量（） 100 351.1

鉄処理 NGF産生量（％) 98.8 476.7

(ただし、対照の NGF産生量は 0.174ng/mlであった。）実施例 1 8 鉄によるクロロゲン酸の NGF産生増強活性の増強（2)

クロロゲン酸水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 5、 1 0、 20m M 塩化第二鉄水溶液を各々調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 60分間静置した。この鉄処理したクロロゲン酸の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。鉄処理したクロロゲン酸は培地の 1 0 0分の 1 量（クロロゲン酸の最終濃度： 5 00 M) となるように添加した。また、比較として鉄処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 1 9に示す。鉄は濃度依存的にクロロゲン酸の NGF産生増強活性を増強した。表 1 9

濃度 (^M) 0 500 500 500 500 鉄濃度（ zM) 0 0 25 50 100

NGF産生量（％) 100 351.1 355.0 441.6 472.6

(ただし、対照の NGF産生量は 0.176ng/mlであった。）実施例 1 9 マンガンによるクロロゲン酸の NGF産生増強活性の増強（ 1) クロロゲン酸水溶液を 25、 5 0、 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 1 0 mM 塩化マンガン（Π) (ナカライテスク社製）水溶液を調製し等容量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 60分間静置した。このマンガン処理したクロロゲン酸の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。マンガン処理したクロロゲン酸は培地の 1 00分の 1量（クロロゲン酸の最終濃度： 1 2 5、 250、 5 00 j,M) となるように添加した。また、比較としてマンガン処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 20に示す。マンガン処理によりクロロゲン酸の NGF産生増強活性は増強された。表 20

濃度（ M) 0 125 250 500 マンガン処理なし NGF産生量（％) 100 124.6 308.5 382.2 マンガン処理 NGF產生量（％) 94.0 495.3 691.0 877.4

(ただし、対照の NGF産生量は 0.145ng/mlであった。）実施例 20 マンガンによるクロロゲン酸の NGF産生増強活性の増強（2) クロロゲン酸水溶液を 1 0 OmMの濃度に調製した。次に、 2. 5、 5、 1 0 mM 塩化マンガン（II) 水溶液を調製し等量のクロロゲン酸水溶液と混合し、室温で 60分間静置した。このマンガン処理したクロロゲン酸の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。マンガン処理したクロロゲン酸は培地の 1 00分の 1量（クロロゲン酸の最終濃度： 5 00 mM) となるように添加した。また、比較としてマンガン処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 2 1に示す。マンガンは濃度依存的にクロ口ゲン酸の N G F産生増強活性を増強した。表 2 1

濃度（ αΜ) 0 500 500 . 500 500 マンガン濃度（ zM) 0 0 12.5 25 50

NGF産生量（％) 100 328.5 567.5 647.6 661.6

(ただし、対照の NGF產生量は 0.186ng/mlであった。）実施例 2 1 マンガンによるコーヒー酸の NGF産生増強活性の増強

コーヒー酸（シグマ社製）水溶液を 1 2. 5、 25、 5 OmMの濃度に調製した。次に、 1 OmM 塩化マンガン（II) 水溶液を調製し等容量のコーヒー酸水溶液と混合し、室温で 6 0分間静置した。このマンガン処理したコーヒー酸の N GF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。マンガン処理したコーヒー酸は培地の 1 00分の 1量（コーヒー酸の最終濃度： 62. 5、 1 25、 2 50 U となるように添加した。また、比較としてマンガン処理を行っていないコーヒー酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 22に示す。マンガン処理によりコ一ヒ一酸の N G F産生増強活性は増強された。表 22

濃度（ ίΜ) 0 62.5 125 250 マンガン処理なし NGF産生量（） 100 97.8 199.5 221.2 マンガン処理 NGF産生量（％) 96.4 188.2 235.2 267.4

(ただし、対照の NGF産生量は 0.253ng/mlであった。）実施例 22 クロロゲン酸酸化処理物の NGF産生増強活性の増強

クロロゲン酸を 1 0 OmMの濃度になるように 1 0 OmM 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9) に溶解した。この溶液に 1 2時間、ペリスターポンプを通じて空気を送り込むことでクロロゲン酸の酸化処理物を調製した。この酸化処理したクロロゲン酸の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。酸化処理したクロロゲン酸はクロロゲン酸に換算して 0、 250、 500、 1 0 0 0 Mとなるように添加した。なお、酸化処理したクロロゲン酸の最終濃度 0 Mのものはクロロゲン酸非存在下に酸化処理して得られた水溶液を一定量添加したものである。また、比較として酸化処理を行っていないクロロゲン酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 23に示す。酸化処理によりクロロゲン酸の NGF産生増強活性は増強された。表 23

濃度（ αΜ) 0 250 500 1000 酸化処理なし NGF産生量（％) 100 192.8 231.9 256.2 酸化処理 NGF産生量（％) 100 211.0 368.7 642.7

(ただし、対照の NGF産生量は 0.166ng/mlであった。）実施例 23 コーヒ一酸酸化処理物の N G F産生増強活性の増強

コーヒー酸を 1 0 OmMの濃度になるように 1 0 OmM 炭酸ナトリウム緩衝液（PH9) に溶解した。この溶液に 1 2時間、ペリスターポンプを通じて空気を送り込むことでコーヒー酸の酸化処理物を調製した。この酸化処理したコーヒ —酸の NGF産生増強活性を実施例 22と同様の方法で測定した。酸化処理したコーヒー酸はコーヒー酸に換算して 0、 250、 50 0、 1 0 00〃Mとなるように添加した。また、比較として酸化処理を行っていないコーヒー酸についても同様に活性を測定した。その結果を表 24に示す。酸化処理によりコーヒー酸の N G F産生増強活性は増強された。表 24

濃度（ iM) 0 250 500 1000 酸化処理なし NGF産生量（） 100 227.8 287.9 269.3 酸化処理 NGF産生量（％) 100 275.3 449.5 655.2

(ただし、対照の NGF産生量は 0.218ng/mlであった。）実施例 24 コーヒー酸エステルの合成と NGF産生増強活性

(1) コーヒー酸メチルエステルの合成

0.1 g のコーヒー酸を 10%硫酸を含むメタノールに溶解し、無水硫酸ナトリウム存在下で、 100 。C、 1 時間加熱した。反応液から無水硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、口一タリーエバポレーターで濃縮乾固した。つぎに、反応物を逆相クロマトグラフィ一を用いて精製した。以下にその条件について示す。カラムは TSK gel 0DS-80TS (径 21.5國 x長 30 cm ：東ソ一社製）を用いた。溶媒 A ( 蒸留水とァセトニトリルを容量比 2対 3で混合したもので 0.1 トリフルォロ酢酸を含む）と溶媒 B (蒸留水とァセトニトリルを容量比 1対 4で混合したもので 0. 1%トリフルォロ酢酸を含む）の溶出比は 0分から 30分にかけて溶媒 B比を直線的に 25%から 45%に、続く 15分間は溶媒 B比を 45%に保持とした。溶出速度は 5 ml I分、検出は 215nraで行った。保持時間 19.8分のピークを含むフラクションを採取し濃縮乾固することにより 3.7 mgの化合物を得た。得られた化合物を NMRにより解析し、化合物がコーヒー酸メチルエステルであることを確認した。

NMRスぺクトル、質量スぺクトルの測定結果を以下に示す。

1 H-N R ： 53.67 (3 s, 0CH ₃₎ , 6.26(1H, d， J=16.0 Hz, 2'-H), 6.74(1H, d, J=8.0 Hz, 5-H), 6.99(1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz, 6—H)， 7.04(1H, d, J=2.0 Hz, 2— H)， 7.47(1H， d, J=16.0 Hz, 3' -H), 9.16(1H， s, 3-OH), 9.63(1H, s, 4 -OH)

但し、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を 2.49 ppraとして表した。

FAB-MS： ra/z 195CM+H) ⁺ (但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）

(2) コーヒー酸ェチルエステルの合成

0.1 g のコーヒー酸を 10%硫酸を含むエタノールに溶解し、実施例 24— ( 1 ) と同様に加熱反応、精製操作を行い、逆相クロマトグラフィー上で、保持時間 23.8分のピークを含むフラクションを採取し濃縮乾固することにより 2.7 mgの化合物を得た。得られた化合物を NMRにより解析し、化合物がコーヒー酸ェチルエステルであることを確認した。

NMRスぺクトル、質量スぺクトルの測定結果を以下に示す。

1 H-NMR ： (51.22C3H, t， J=7.0 Hz, 2''-H)， 4.14(2H, q， J=7.0 Hz, Γ ' - H) ， 6.24C1H, d, J=16.0 Hz, 2'-H)， 6.74(1H, d, J=8.0 Hz, 5— H), 6.99(1H， dd, J=2.0, 8.0 Hz, 6-H), 7.03(1H, d, J=2.0 Hz, 2— H), 7.45(1H, d, J=16.0 Hz, 3' - H), 9.15GH, s, 3-OH), 9.62(1H, s, 4-OH)

但し、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を 2.49 ppmとして表した。

FAB-MS： m/z 209CM+H) ⁺ (但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）

(3) コーヒー酸メチルエステルおよびコーヒー酸ェチルエステルの NGF産生増強活性

実施例 2 4— ( 1 ) と（2) で合成したコーヒー酸メチルエステルおよびコーヒー酸ェチルエステルの NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。

コ一ヒ一酸メチルエステルは最終濃度が 0、 0. 0 625、 0. 1 2 5mg m lになるように、一方、コーヒー酸ェチルエステルは最終濃度が 0、 0. 0 6 25mgZm 1になるように添加した。結果を表 2 5に示す。コーヒー酸メチルエステルおよびコーヒー酸ェチルエステルは L一 M細胞の NGF産生を増強した

表 25

料濃度 NGF產生』

mg/m 1 ) (%)

コーヒー酸メチルエステル 0 1 0 0

0. 0 625 824. 4

0. 1 25 88 9. 6

コ一ヒ一酸ェチルエステル 0 1 0 0

0. 0 625 1 279. 1

(ただし、対照の NGF産生量は、 0. 1 0 9 ng/m lであった。）

実施例 25 コーヒー酸メチルエステルの NGF産生増強活性

( 1 ) ァシタパ根部からの水抽出低分子画分 XAD-2処理物の調製

乾燥ァシタバ ( ngeUca keiskei koidz. ) 根部粉末 5.8 kgに 24Lの酢酸ェチルを加え室温で 3時間、抽出をおこなった。吸引ろ過後の残渣に 18Lのエタノールを加え室温で一晩抽出をおこなった。つぎに、吸引ろ過後の残渣に 52 Lの蒸留水を加え 60°Cで 3 時間抽出をおこなった。固形残渣を除いた液体部分をロータリーエバポレー夕一で濃縮したものに 2.5倍量のエタノールを加え、 4 °C でー晚静置した。その後、吸引ろ過で沈殿物と液体部分に分画した。液体部分を、ロータリ一エバポレーターで濃縮乾固しァシタノ根部水抽出低分子画分を得た

。つぎにァシ夕バ根部水抽出低分子画分をアンバーライト XAD- 2 (ォレガノ社製：樹脂量 2 L) に供し、蒸留水 30 Lで非吸着物を十分に洗いだし、次に、 16Lのメタノ一ルで吸着物を溶出した。メタノール溶出液を口一タリ一エバポレーターで濃縮乾固し、ァシタパ根部水抽出低分子 XAD-2画分処理物を得た。

(2) ァシタパ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物による NGF産生の増強実施例 25 - ( 1) で調製したァシタパ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。ァシタパ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物は 0、 0.85、 1.7、 3.4 mg/ml となるように添加した。ァシタバ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物は、表 26に示すように濃度依存的に L一 M細胞の NGF産生を増強した。表 2 6

ァシ夕バ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物 NGF産生量

mgZm 1 )

0 1 0 0

0. 8 5 6 5 5. 3 1. 7 8 5 8. 8 3. 4 1 1 27. 6

(ただし、対照の NGF產生量は、 0. 074 ngZmlであった。）

(3) ァシ夕バ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物のコスモシール 1 40クロマトグラフィ一による分画

実施例 25— （ 1 ) で調製したァシタパ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物の活性成分を逆相クロマトグラフィ一を用いて分画した。以下にその条件について示す。樹脂はコスモシール 140 C18-0PN (ナカライテスク社製：樹脂量 400 ml) を用いた。ァシタパ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物を供し、展開溶媒としてそれぞれ 1 Lの蒸留水、 20%ァセトニトリル水溶液、 25%ァセトニトリル水溶液、 40¾ ァセトニトリル水溶液、メタノールの順に溶出を行い、各溶出画分を減圧濃した。

(4) ァシ夕バ根部水抽出低分子画分 XAD-2処理物のコスモシール 1 40クロマトグラフィ一分画物による N G F産生の増強実施例 25 - (3) で調製したコスモシール 1 4 0クロマトグラフィー分画物の NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。その結果、 20%ァセトニトリル水溶液溶出画分、 25%ァセトニトリル水溶液溶出画分、 40% ァセト二トリル水溶液溶出画分に NGF産生増強活性があることが明らかになった。表 27にその結果を示す。

表 27

画分濃度 NGF産生量

(m g/m 1 ) (%)

20 セトニ -トリル水溶液溶出画分 4. 0 5 30 1. 0

8. 1 436. 7

1 6. 2 1 26 3. 3

25 セトニ -トリル水溶液溶出画分 0. 7 1 6 1. 7

1. 5 1 028. 8

2. 8 2 1 1 0. 4

40 セトニ -トリル水溶液溶出画分 0. 5 75 465. 3

1. 1 5 65 3. 1

2. 3 1 226. 2

(ただし、対照の NGF産生量は、 20%了セトリル溶出画分は 0.074ng/ml、

25%及び 40%了セトニトリル溶出画分は 0.087ng/mlであつた。）

(5) コスモシール 1 4 0の 25%ァセトニトリル水溶液溶出画分の ODS— 8 0 Tsクロマトグラフィーによる分画

実施例 25 - (3) で調製したコスモシール 1 4 0の 25%ァセトニトリル水溶液溶出画分の活性成分を逆相クロマトグラフィ一を用いて分画した。以下にその条件について示す。カラムは TSK gel 0DS-80TS (径 21.5隱 x長 30cm：東ソ一社製 ) を用いた。溶媒 A (蒸留水）と溶媒 B (蒸留水とァセトニトリルを容量比 1対 1で混合したもの）の溶出比は 0分から 120分にかけて溶媒 B比を直線的に 25% から 100 %に、続く 20分間は溶媒 B比を 100 %に保持、最後に溶媒 B比を 25%にし 20分間保持とした。溶出速度は 5ml/分、検出は 235nmで行った。紫外線吸収を指標にフラクションを採取した。

(6) コスモシール 1 40の 25%ァセトニトリル水溶液溶出画分の ODS— 8 0 Tsクロマトグラフィー分画物による NGF産生の増強

実施例 25— (5) で得られたコスモシール 25% ァセトニトリル水溶液溶出画分の ODS— 8 OTsクロマトグラフィー分画物の活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。その結果、多くのフラクションに、 NGF産生増強活性があることが明らかになった。表 28にその結果を示す。

2 8

画フラクション（検出ビーク：分）

(m g, ¾ 1 )

1 (46. 0.47.2,49.0) 2. 0 0 ^NGF 2 5 0. 8

2 (53.2) 2. 0 0 2 7 5. 2

3 (54.0) 2. 0 0 3 1 8. 7

4 (54.9.55.5.56.4) 2. 0 0 2 9 3. 0

5 (57. 6) 2. 0 0 3 2 0. 5

6 (58. 6) 2. 0 0 2 9 7. 8

7 (59. 3) 2. 0 0 3 2 4. 8

8 (60. 5) 2. 0 0 3 2 4. 8

9 (61.3) 2. 0 0 4 0 2. 8

1 0 (62.2) 2. 0 0 5 6 5. 5

1 1 (63.0) 2. 0 0 6 1 6. 9

1 2 (64. 1) 2. 0 0 5 7 5. 4

1 3 (66.9) 2. 0 0 8 0 5. 3

1 4 (68.4) 2. 0 0 8 1 9. 6

1 5 (69.2) 2. 0 0 5 1 0. 2

1 6 (70.3) 1 . 0 0 3 8 9. 2

1 7 (71.3.71.9 ) 1 . 0 0 6 0 9. 1

1 8 (73.0J3.8J4.9) 0. 5 0 1 0 0 2. 5

1 9 (75.4) 0. 5 0 8 5 1 . 3

2 0 (76.5) 1 . 0 0 8 3 8. 5

2 1 (77.7) 1 . 0 0 2 4 9. 4

2 2 (79. 6.80.5 ) 0. 5 0 2 3 4. 3

2 3 (82.4) 0. 2 5 3 5 9. 1

2 4 (8 1) 0. 2 5 2 8 5. 8

2 5 (85.5) 0. 0 6 2 5 3 5 9. 1

2 6 (86· 9、 87.5 ) 0. 1 0 4 1 1 . 6

2 7 (89. 1) 0. 5 0 4 4 3. 3

2 8 (91.4) 0. 0 5 1 0 5 8. 1

2 9 (92.8) 0. 2 0 6 7 2. 0

3 0 (93.8、 95.8、 97.5、 100.0、 100. 6) 0. 5 0 5 9 3. 6

(ただし,、，対照 pNGF¾¾は _Λフラクション 1 ~9 (i0.355ng/mL フラタ,シヨン 1Q^1 は.382ng/m フラクション 19〜27i lSiig;½、フラクション〜30 5.45 ng/mlであつ (7) フラクション 1 8の逆相クロマトグラフィーによる分画

実施例 25— (6) で強い活性が確認されたフラクション 1 8 (保持時間 73.0 、 73.8、 74.9分の検出のピークを含むフラクション）を逆相クロマトグラフィーを用いてさらに分画した。以下にその条件について示す。カラムは TSK gel 0DS- 80TsQA (径 4.6隨 X長 25cm:東ソ一社製）を用いた。溶媒 A (0.1%トリフルォロ酢酸を含む蒸留水）と溶媒 B (蒸留水とァセトニトリルを容量比 1対 1で混合したもので 0.1%トリフルォロ酢酸を含む）の溶出比は 20分間、溶媒 B比を 50%保持とした。溶出速度は 1 ml/分、検出は 235nmで行い、紫外線吸収を指標にフラクシヨンを採取した。

(8) フラクション 1 8の ODS— 8 OTs QAクロマトグラフィー分画物による NGF産生の増強

実施例 25— (7) において TSK gel 0DS-80TsQAクロマトグラフィ一で分画されたフラクションの活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。その結果、 9.3 、 10.1、 10.6、 10.9、 11.2、 12.0、 12.8、 13.3、 14.0、 15.2、 16.1、 18.6分の検出のピークを含むフラクションに、 NG F産生増強活性があることが明らかになつた。表 29にその結果を示す。

表 29

分画フラクション（検出ビ-ク：分）濃度（mgZm 1 ) NGF產生量（ )

1 8 1 (9.3 ) 0. 20 1 48 9. 6 1 8 2 (10.1) 0. 5 0 2222. 9 1 8 3 (10.6) 0. 25 3 03 9. 6 1 8 4 (10.9) 0. 0 375 25 1 0. 4 1 8 5 (11.2) 0. 1 25 6 1 0. 4 1 8 6 (12.0) 0. 5 0 560. 4 1 8 7 (12.8) 0. 5 0 68 1. 3 1 8 8 (13.3) 0. 4 0 339. 6 1 8 9 (14.0) 1. 0 0 4 1 0. 4 1 8 1 0 (15.2) 1. 0 0 25 1 0. 7 1 8 1 1 (16.1) 1. 0 0 3 360. 7 1 8 1 2 (18.6) 1. 0 0 1 1 8 9. 3

(ただし、対照の NGF産生量は、 18-1〜9 は 0.027ng/ml、 18-10〜： 12は 0.015η g/mlであった。）

実施例 25— (7) で調製し、実施例 25 - (8) で活性を確認したアジタパ根部由来フラクション 1 8— 3の質量スペクトル（MS) を質量分析計 (DX302：日本電子社製）により FAB— MSの手法で測定した。マトリックスにはグリセロールを用いた。その結果、 m/z 195(M+H)⁺ のピークを検出した。第 1図に、ァシタバ根部由来フラクション 1 8— 3の MSスぺクトルを示す。第 1図において、横軸は m/z 値、縦軸は相対強度を示す。

(9) フラクション 1 8— 3の¹ H-NMR解析

実施例 25— (7) で調製し、実施例 25 - (8) で活性を確認したァシ夕バ根部由来フラクシヨン 1 8— 3を核磁気共鳴 (NMR) スぺクトル装置 (JNM-A500 ：日本電子社製）を用い各種 NMRスペクトルを測定し構造解析した。以下に NM Rの帰属の信号を示した。

¹ H-NMR ： (53.68 (3H, s, 0CH ， 6.25(1H, d， J =16.0 Hz, 2' - H)， 6.75(1 H, d, J =8.0 Hz, 5-H), 6.98(1H， dd， J=2.0, 8.0 Hz, 6— H), 7.03(1H, d， J =2.0， 2 - H)， 7.46(1H， d, J=16.0 Hz, 3'- H), 9.10(1H, s, 3—OH), 9.56C1H ， s, 4-OH)

但し、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を 2.49 ppmとして表した。第 2図に、ァシ夕バ根部由来フラクション 1 8— 3の¹ H— NMRスペクトルを示す。第 2図において、横軸は化学シフト値 (ppm) 、縦軸はシグナルの強度を示す。

( 1 0) フラクション 1 8— 3の構造の確定

実施例 25 - (7) で調製し、実施例 25 - (8) で活性を確認したァシタパ根部由来フラクション 1 8— 3について行った質量スペクトル解析、 NMRスぺクトル解析の結果、活性成分がコーヒー酸メチルエステル（分子量 1 94) であることを確認した。実施例 26 コーヒー酸ェチルエステルの NGF産生増強活性

( 1) フラクション 28の MS解析

実施例 25 - (5) で調製し、実施例 25 - (6) で活性を確認したァシタパ根部由来フラクシヨン 28 (保持時間 91.4分の検出のピ一クを含むフラクシヨン ) の質量（MS) スぺクトルを質量分析計 (DX302 : 日本電子社製）により FAB — MSの手法で測定した。マトリックスにはグリセロールを用いた。その結果、 m/z 209(M+H)⁺ のピークを検出した。第 3図に、ァシ夕バ根部由来フラクション 28の MSスぺクトルを示す。第 3図において、横軸は m/z 値、縦軸は相対強度を示す。 (2) フラクション 28の¹ H- NMR解析

実施例 25- (5) で調製し、実施例 25 - (6) で活性を確認したァシ夕バ根部由来フラクシヨン 28を核磁気共鳴 (NMR) スぺクトル装置 (JM-A500 ：日本電子社製）を用い各種 NMRスペクトルを測定し構造解析した。以下に NMRの帰属の信号を示した。

^-NMR： <51.23(3H, t, J=7.0 Hz, 2''- H)， 4.14(2H, q, J=7.0 Hz, Γ'- H)， 6.24C1H, d, J=16.0 Hz, 2' - H)， 6.74(1H, d, J=8.0 Hz, 5—H), 6.98C1 dd, J= 2.0, 8.0 Hz, 6-H), 7.03(1H, d, J=2.0 Hz, 2—H)， 7.45(1H， d, J=16.0 Hz, 3' -H), 9.1K1H, s, 3- OH), 9.57(1H, s, 4 - OH)

但し、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を 2.49 ppraとして表した。第 4図に、ァシタパ根部由来フラクション 28の¹ H-NMRスぺクトルを示す。第 4図において、横軸は化学シフト値 (ppm) 、縦軸はシグナルの強度を示す。

(3) フラクション 28の構造の確定

実施例 25 - (5) で調製し、実施例 25 - (6) で活性を確認したァシタパ根部由来フラクション 28について行った質量スぺクトル解析、 NMRスぺクトル解析の結果、活性成分がコーヒー酸ェチルエステル（分子量 208)であることを確認しに。実施例 27 イソキサントフモールの NGF産生増強活性

(1) ホップ由来キサントフモールフラクション（ホップシュタイナー社製） 0. 4gをクロ口ホルム 3 mlで溶解しシリカクロマトに供した。クロ口ホルム（1000 in 1 ) 、クロ口ホルム：メタノール =50 ： 1 (1000 ml ) 、クロ口ホルム：メタノール =20 ： 1 (1000 ml ) の順に段階的に溶出し、 1フラクションに 8 mlずつ分取した。得られたフラクション 67〜100 を減圧濃縮し、ホップ由来キサントフモールフラクション一画分 Aを得た。さらに逆相クロマトグラフィ一を用いてホップ由来キサントフモールフラクション一画分 Aを精製した。以下にその条件について示す。カラムは TSK gel 0DS-80TS (径 21. 5 譲 x長 30 cm ：東ソ一社製）を用いた。溶媒 A (蒸留水とァセトニトリルを容量比 3対 2で混合したもので 0. 1% トリフルォロ酢酸を含む）と溶媒 B (蒸留水とァセトニトリルを容量比 1対 4で混合したもので 0. 1%トリフルォロ酢酸を含む）の溶出比は 0分から 60分にかけて溶媒 B比を直線的に 50%から 100 %に、続く 20分間は溶媒 B比を 100 %に保持、最後に溶媒 B比を 50%にし 20分間保持とした。溶出速度は 5 ml/分、検出は 370 nmで行い、 1分間ごとにフラクションを採取した。保持時間 42. 5分の検出のピークを含むフラクションを濃縮乾固することにより、高純度のキサントフモール（ Xanthohumol ) (19. 4 mg ) を調製した。

( 2 ) 実施例 2 7 - ( 1 ) で調製したキサントフモール 3. 5 mgをジメチルスルホキシド溶液 0 . 75 mlに溶解したものを、 200 mlの 10 mM酢酸ナトリウム緩衝液（ pH 5. 5、 10%のサッカロースを含む）に添加し、 1 0 0 °Cで 2時間加熱した。冷却後、反応液を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について示す。樹脂はコスモシール 140 C18-0PN (ナカライテスク社製：樹脂量 20 m 1 ) を用いた。反応液をカラムに供し、展開溶媒としてそれぞれ 50 ml の蒸留水、 20%、 30%、 40¾、 50¾、 60¾、 10% ァセトニトリル水溶液、メタノールの順に溶出を行った。その結果、 40% ァセトニトリル水溶液溶出画分を濃縮乾固することにより、高純度のイソキサントフモール（Isoxanthohumol) (2. 1 mg) を得た。得られた化合物を核磁気共鳴（NMR) スぺクトル装置 (JNM - A500 ：日本電子社製）を用い各種 NMRスぺクトルを測定し解析することにより構造を確認した。

NMRスぺクトル、質量スぺクトルの測定結果を以下に示す。 ¹ H-NMR ： (51.52C3H, s, 3' ' -CH₃ ), 1.57(3H, s， 3' ' - CH ₃ ), 2.54(1H, dd ' J=3.0, 16.5 Hz, 3-H), 2.92(1H, dd, J=12.5 16.5 Hz, 3-H), 3.09(2H, d， J =7.0 Hz， Γ'-Η), 3.68(3H， s, 5-0CH₃ ), 5.07(1H， t, J=7.0 Hz, 2，'- H), 5.3 0(1H, dd, J=3.0, 12.3 Hz, 2_H), 6.12(1H， s, 6— H), 6.76(2H, d, J=8.5 Hz, 3'-11ぉょび5'—10， 7.27(2H, d， J=8.5 Hz, 2' -H および 6'—H), 9.53(1H, s， 4' - OH), 10.43QH, brs, 7-OH)

FAB-MS： m/z 355 (M+H) + (但し、グリセロールをマトリックスに用いた。）

(3) 実施例 27— （2) で調製したイソキサントフモールの NGF産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。その結果を表 3 0に示す。イソキサントフモールは、 0、 50、 100、 200 zMとなるように添加した。イソキサントフモールは、濃度依存的にし— M細胞の N G F産生を増強した。表 30

濃度 NGF産生量

( M) (%)

0 1 00

5 0 1 1 0. 7

1 00 1 2 1. 4

20 0 1 9 8. 0

(ただし、対照の NGF産生量は、 0.181 ng/ml であった。）実施例 28

( 1) キサントフモールフラクション（ホップシュタイナー社製） 0.4gをクロ口ホルム 3 mlに溶解しシリカクロマトに供した。クロ口ホルム（1000 ml ) 、クロ口ホルム：メタノール =50 ： 1 (1000 ml ) 、クロ口ホルム：メタノール =20 ： 1 (1000 ml ) の順に段階的に溶出し、 1フラクションに 8 mlずつ分取した。得られたフラクション 67〜100 を減圧濃縮し、ホップ由来キサントフモールフラクシヨン一画分 Aを得た。

( 2 ) 上記キサントフモールフラクション一画分 Aをさらに逆相クロマトグラフィ一を用いて精製単離した。以下にその条件について示す。カラムは TSK gel 0D S-80TS (径 21. 5删 X長 30 cm ：東ソ一社製）を用いた。溶媒 A (蒸留水とァセトニトリルを容量比 3対 2で混合したもので 0. 1% トリフルォロ酢酸を含む）と溶媒 B (蒸留水とァセトニトリルを容量比 1対 4で混合したもので 0. 1% トリフルォロ酢酸を含む）の溶出比は 0分から 60分にかけて溶媒 B比を直線的に 50%から 100 %に、続く 20分閭は溶媒 B比を 100 %に保持、最後に溶媒 B比を 50%にし 20分間保持とした。溶出速度は 5 ml/分、検出は 370 rnnで行い、 1分間ごとにフラクシヨンを採取した。

( 3 ) 上記キサントフモールフラクション一画分 Aの逆相クロマトフラクションの N G F産生増強活性を実施例 1 7と同様の方法で測定した。その結果、 21. 1、 22. 2、 24.2、 25.7、 28. 6分の検出のピークを含むフラクションに N G F産生増強活性があることが明らかになった。表 3 1にその結果を示す。

表 3 1

フラクション（保持時間：分）濃度 (mg I ml) NGF產生量（）

A- 1 (21.1) 0.025 92.4

0.05 151.4

A - 2 (22.2) 05 109.5

1 136.2

2 208.6

A - 3 (24.2) 0125 134.3

025 151.4

0.05 202.9

0.1 298.1

A— 4 (25.7) 0.025 197.1

0.05 345.7

0.1 416.2

A— 5 (28.6) 0.0125 145.7

0.025 189.5

0.05 229.5

0.1 517.1

(ただし、対照の NGF産生量は、 0.093 ng/ral であった。）

(4) 上記フラクション A— 5 (保持時間 28.6分の検出のピークを含むフラクシヨン）の質量スぺクトル（MS) を質量分析計 (DX302：日本電子社製）により F AB— MSの手法で測定した。マトリックスにはグリセロールを用いた。その結果、 m/z 371(M+H)⁺ のピークを検出した。第 5図に、キサントフモールフラクシヨン由来のフラクション A— 5の MSスペクトルを示す。第 5図において、横軸は m/z 値、縦軸は相対強度を示す。

さらに、核磁気共鳴 (NMR) スペクトル装置 (JNM-A500 ：日本電子社製）を用い各種 NMRスぺクトルを測定し構造解析した結果、活性成分がキサントフモール B (分子量 370)とキサントフモール D (分子量 370)の混合物（混合比 1 : 1.65) であることを確認した。以下に NMRの帰属の信号を示す。

キサントフモール B

¹ H-NM ： <51.21(3H, s, 6—H), 1.27C3H, s, 6- H), 2.70(2H, m, 4-H), 3.65 ((IE m, 5-H), 3.87(3H， s, 6-0CH₃ ), 6.00(1H， s， 5-H), 6.80(2H, m， 3-Hおよび 5- H), 7.55 (2H, m, 2- Hおよび 6-H)， 7.70(1H， m, β-Yd, 7.75(1H， m, a - H)， 10. 12(1H, s， 4-OH), 14. 18(1H， s, 2- OH)

キサントフモール D

¹ H-NMR ： S 1.7K3H, s, 5_H), 2. 60 (2H, m， 1 - H), 3.85 (3H, s, 6-OCH ₃ ), 4.20(1H, m, 2-H), 4.58(1H, s, 4-H)， 4.6K1H, s, 4- H)， 6.04(1H, s, 5-H), 6.80C2H, m, 3 - Hおよび 5- H)， 7.55 (2H, m, 2-H および 6-H), 7.70 (1H, m, 8- H

), 7.75(1H, m， a-H), 10.09(1H, s, 4-OH), 10.58(1H， s, 4-OH), 14. 69(1H, s, 2- OH)

但し、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を 2.49 ppraとして表した。第 6図に、キサントフモールフラクション由来のフラクション A— 5の¹ H-NMR スペクトルを示す。第 6図において、横軸は化学シフト値 (ppm) 、縦軸はシグナルの強度を示す。産業上の利用可能性

本発明によれば、ポリフエノール類、その誘導体及び又はその塩、またはポリフエノール類、その誘導体及び Z又はその塩の（ i ) 金属、金属塩及び又は金属イオンとの混合処理もしくは（i i) 酸化処理により得られる組成物を有効成分とする、成長因子産生増強を必要とする疾患の治療または予防のための治療剤、予防剤、食品、飲料および飼料が提供される。前記有効成分は、特に肝細胞増殖因子および神経成長因子の産生増強作用に優れており、従って、本発明の好ましい態様によれば、特に肝細胞増殖因子および神経成長因子の産生増強を必要とする疾患の治療または予防のための治療剤、予防剤、食品、飲料および飼料が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . ( i ) ポリフヱノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種、あるいは

( B) 酸化処理

により得られる組成物、

を有効成分として含有することを特徵とする成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤。

2. ポリフエノール類がフラボノイド類、ガリックアシッド、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コ一ヒ一酸およびジカフェオイルキナ酸からなる群より選択される少なくとも 1種である請求項 1記載の治療剤または予防剤。

3 . フラボノイド類がフラボノール類、フラバノン、カルコンおよぴフラバノールからなる群より選択される少なくとも 1種である請求項 2記載の治療剤または予防剤。

4 . フラボノール類がミリセチンおよびまたはケルセチンであり、フラバノンがィソキサントフモールであり、カルコンがキサントフモール Bおよびまたはキサントフモール Dであり、フラバノールがェピガロカテキンガレ一トである請求項 3記載の治療剤または予防剤。

5 . ポリフヱノール類の誘導体がポリフヱノ一ル類のカルボン酸エステルおよびまたは配糖体である請求項 1〜4いずれか記載の治療剤または予防剤。

6 . ポリフエノール類のカルボン酸エステルがコーヒー酸メチルエステルおよび Zまたはコーヒー酸ェチルエステルであり、ポリフエノール類の配糖体がィソオリエンチンである請求項 5記載の治療剤または予防剤。

7. 金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニウム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のイオンである請求項 1〜 6レ、ずれか記載の治療剤または予防剤。

8 . 成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である請求項 1〜 7いずれか記載の治療剤または予防剤。

9 . ( i ) ポリフエノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種、あるいは

( i i ) ポリフヱノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、

( B) 酸化処理

により得られる組成物、

を有効成分として含有することを特徵とする成長因子産生増強用の食品、飲料または飼料。

1 0 . ポリフエノール類がフラボノイド類、ガリックアシッド、クロロゲン酸

、クリプトクロロゲン酸、ネオクロロゲン酸、コーヒー酸およびジカフヱオイルキナ酸からなる群より選択される少なくとも 1種である請求項 9記載の食品、飲料または飼料。

1 1 . フラポノイド類がフラボノール類、フラバノン、カルコンおよびフラバノールからなる群より選択される少なくとも 1種である請求項 1 0記載の食品、飲料または飼料。

1 2 . フラボノール類がミリセチンおよびまたはケルセチンであり、フラバノンがイソキサントフモールであり、カルコンがキサントフモール Bおよびまたはキサントフモール Dであり、フラバノールがェピガロカテキンガレ一トである請求項 1 1記載の食品、飲料または飼料。

1 3 . ポリフヱノール類の誘導体がポリフヱノール類のカルボン酸エステルおよびまたは配糖体である請求項 9〜1 2いずれか記載の食品、飲料または飼料

1 4 . ポリフエノール類のカルボン酸エステルがコーヒー酸メチルエステルおよび/またはコーヒー酸ェチルエステルであり、ポリフエノール類の配糖体がィソオリエンチンである請求項 1 3記載の食品、飲料または飼料。

1 5 . 金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニウム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のイオンである請求項 9〜1 4いずれか記載の食品、飲料または飼料。

1 6 . 成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である請求項 9〜1 5いずれか記載の食品、飲料または飼料。

1 7 . ポリフヱノール類、その誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも 1種の、

( B ) 酸化処理

により得られる組成物。

1 8 . ポリフヱノール類がクロロゲン酸おょぴまたはコーヒー酸であり、誘導体が前記ポリフヱノール類のカルボン酸エステルおよび Zまたは配糖体である請求項 1 7記載の組成物。

1 9 . 金属が鉄、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、銀、金、アルミニウム、カルシウム、ニッケル、コバルトからなる群より選択される少なくとも 1種であり、金属塩が前記金属を含んでなる塩であり、金属イオンが前記金属のイオンである請求項 1 7または 1 8記載の組成物。

2 0 . 成長因子產生増強作用を有する請求項 1 7〜 1 9いずれか記載の組成物

2 1 . 成長因子が肝細胞増殖因子または神経成長因子である請求項 2 0記載の組成物。