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WO2001072998A2 - Verfahren zur extraktion von nukleinsäuren - Google Patents

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WO2001072998A2
WO2001072998A2 PCT/EP2001/003669 EP0103669W WO0172998A2 WO 2001072998 A2 WO2001072998 A2 WO 2001072998A2 EP 0103669 W EP0103669 W EP 0103669W WO 0172998 A2 WO0172998 A2 WO 0172998A2
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oligonucleotide
nucleic acid
linker
anchor
linker oligonucleotide
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Andreas Bosio
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Memorec Stoffel Gmbh
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Priority to AU2001262152A priority patent/AU2001262152A1/en
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Publication of WO2001072998A3 publication Critical patent/WO2001072998A3/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid complex with an anchor oligonucleotide, any nucleic acid or any oligonucleotide and a linker oligonucleotide, a nucleic acid or oligonucleotide hybridization product and a method for producing and separating nucleic acids or oligonucleotides after their synthesis using the nucleic acid complex according to the invention.
  • the invention further relates to a device which makes it possible to extract, purify, rewrite, rewrite and re-purify RNA from homogenized tissue or cells in a combined and automatable one-tube reaction.
  • the analysis of gene expression requires the extraction, purification and labeling of the mRNA.
  • the labeling of the mRNA is often carried out via the step of cDNA synthesis, since labeled nucleotides can be inserted here.
  • the process of mRNA isolation includes the selective extraction of the RNA from the mixture of the materials present in a cell or in tissue (lipids, proteins, saccharides, DNA, RNA, low-molecular substances) and the subsequent enrichment of the mRNA from the mixture of tRNA, rRNA, snRNA and mRNA with the help of oligo (dT) nucleic acids, which are bound to a column (affinity chromatography) or to (magnetic) spherical particles (batch process).
  • oligo (dT) nucleic acids which are bound to a column (affinity chromatography) or to (magnetic) spherical particles (batch process).
  • the mRNA is then eluted from the oligo (dT) and subjected to further enzymatic reactions separately therefrom, or is still enzymatically converted to oligo (dT) (and a solid phase).
  • the RT reaction for the production of the cDNAs is an enzymatic reaction which can also be carried out in the presence of the oligo (dT) and a solid phase coupled to it.
  • the synthesized cDNA cannot easily be separated from the solid phase, since the oligo (dT) s serve as primers and the cDNA is thus ultimately covalently bound to the solid phase. Another It is therefore not possible to use the cDNA, which requires this to be separated from the solid phase.
  • WO-A-95/13368 relates to the isolation of a nucleic acid from a sample.
  • the sample is boiled and then cooled.
  • the nucleic acids are condensed on a solid support.
  • the method is used to prepare nucleic acids for subsequent amplification.
  • the method can be used in the isolation of nucleic acids from aged, fixed or otherwise treated samples.
  • the anchor oligonucleotide is immobilized on a support.
  • the linker oligonucleotide has a sequence which allows hybridization both with the anchor oligonucleotide and with a further nucleic acid or a further oligonucleotide.
  • the sequence of the linker oligonucleotide must therefore be chosen so that it matches the sequence of the further nucleic acid / the further oligonucleotide. If, for example, cDNA is to be obtained from mRNA (poly (A + ) RNA), the linker oligonucleotide has a poly (dT) part.
  • a carrier preferably a bead
  • a linker oligonucleotide is bound via an anchor oligonucleotide in such a way that a poly (dT) part is present.
  • MRNA is now attached to this poly (dT) part, and the linker oligonucleotide is lengthened by a polymerase reaction by means of a conventional RT reaction - if appropriate with the incorporation of labeled nucleotides.
  • the mRNA can then be destroyed, for example by RNaseH or NaOH, and the linker oligonucleotide extended by the cDNA can be cleaved off by increasing the temperature, if necessary by changing the buffer.
  • the method can also be used to synthesize any nucleic acid (with an at least partially known sequence). This is it required that the linker oligonucleotide again has a sequence that partially overlaps with the target molecule. Then a nucleic acid complementary to the target nucleic acid can be synthesized on the linker oligonucleotide, possibly with the incorporation of labeled nucleotides. The nucleic acid can then be split off as a double strand (with a single strand end) and processed further.
  • Such a method is useful, for example, for the direct, non-PCR-amplified production of cDNA libraries with selectively enriched cDNA molecules in accordance with the selected sequence of the linker oligonucleotide, by ligating the isolated and double-stranded cDNAs directly into a suitably prepared cloning vector ,
  • z. B a temperature of 35 ° C to 85 ° C, preferably 45 ° C to 65 ° C, for annealing of anchor oligonucleotide and linker oligonucleotide.
  • the hybridizing region of anchor and linker oligonucleotide in the nucleic acid complex according to the invention preferably has a ratio of the nucleotides GC: AT of 20:80 to 80:20.
  • annealing between anchor oligonucleotide and linker oligonucleotide is preferably carried out at a higher temperature than between linker oligonucleotide and any nucleic acid or oligonucleotide.
  • the nucleic acid complex according to the invention has the anchor oligonucleotide covalently bound or immobilized on the support via an affinity group.
  • the present invention also relates to a nucleic acid or oligonucleotide hybridization product comprising an anchor oligonucleotide and a linker oligonucleotide, the linker oligonucleotide being partially hybridized with the anchor oligonucleotide and the anchor oligonucleotide with the 3'- Term can be immobilized on a carrier.
  • the target nucleic acid is preferably mRNA.
  • the target nucleic acid can be degraded by RnaseH or NaOH, in particular before the extended linker oligonucleotide is split off.
  • the invention allows a temporary non-covalent binding of the cDNA to the solid phase, which can be split off by a simple heat step. This means that all reactions required for the isolation, purification, marking and renewed cleaning of the finished probe can be carried out on the solid phase (FIG. 2).
  • the implementation on the solid phase in turn enables simple automation of the complete process (FIG. 3).
  • the invention is illustrated by the following examples. The method according to the invention was used to produce fluorescence-labeled cDNA starting from total RNA. Dynabeads M-280 streptavidin (DYNAL) was used as the solid phase.
  • biotin anchor and linker were adjusted to a concentration of 350 ng / ⁇ l in RNase-free, double-distilled water.
  • a concentration of 350 ng / ⁇ l in RNase-free, double-distilled water In a 0.2 ml Eppendorf reaction vessel, 9.1 ⁇ l biotin anchor (400 pmol; 8000 pg / pmol), 15.6 ⁇ l linker (400 pmol; 13647 pg / pmol) and 25 ⁇ l of a solution of 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA and 2 M NaCI combined and incubated for 2 min at 95 ° C, 10 min at 65 ° C, 10 min at 37 ° C and 20 min at RT.
  • 0.2 mM EDTA and 50 ⁇ l of the anchor-linker hybrids obtained under a) were added and incubated for 15 min at RT with occasional shaking.
  • Using the magnetic stand provided for this purpose (DYNAL), twice with a solution of 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA and 2 M NaCl and then resuspended in 200 ⁇ l of a solution of 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M LiCI, 2 mM EDTA.
  • the isolated mRNA was washed once with a solution of 3 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.2 mM EDTA and 2 with 1 x RT buffer (GIBCO). 21 ⁇ l H 2 O, 8 ⁇ l 5 ⁇ First Strand Buffer (GIBCO), low C dNTPs (10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP; 4 mM dCTP) (GIBCO), 2 ⁇ l FluoroLink TM were placed in an Eppendorf reaction vessel Cy3 / 5-dCTP (Amersham Pharmacia), 4 ⁇ l 0.1 M DTT and 1 ⁇ l Rnasin (20-40 u) (PROMEGA) combined and shaken briefly.
  • the isolated mRNA was resuspended with this solution, incubated for 5 min at 42 ° C., provided with 1 ⁇ l (200 U) Superscript II (SSII, GIBCO), incubated for 30 min with constant shaking at 37 ° C., again with 1 ⁇ l SSII and shaken again at 37 ° C for 30 min.
  • 0.5 ul RNAseH (GIBCO) was added and incubated at 37 ° C for 20 min.
  • both the Cy3 and the Cy5-labeled probe are to be produced in the manner according to the invention, then both labeling reactions could now be given together and processed further together.
  • the two labeling approaches were worked up separately from one another.
  • the probe produced by the method according to the invention was washed twice with 400 ⁇ l 10 mM Tris-HCl pH 7.5, resuspended in 10 ⁇ l 10 mM Tris-HCl pH 7.5, incubated for 2 min at 65 ° C. and immediately placed in the magenta stand.
  • the supernatant was transferred to a new Eppendorf reaction vessel.
  • the beads were resuspended in 10 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl pH 7.5, incubated for 2 min at 65 ° C. and the The supernatant was again transferred to the new Eppendorf reaction vessel.
  • the combined supernatants were combined with the Cy3 probe labeled in a conventional manner, evaporated to 20 ⁇ l, provided with 5 ⁇ l of a hybridization solution and applied to a pre-hybridized cDNA array.
  • the cDNA array was hybridized overnight and then washed with suitable solutions, dried and read out with a laser scanning device.
  • the images (Cy3 and Cy5) obtained at different wavelengths are shown in FIG. 5.
  • the evaluation of the relative signal intensities showed that, starting from the same amount of total RNA, the probe labeled by the method according to the invention gave an average 2.2 times stronger signals than the conventionally labeled probe, FIG. 6.
  • the evaluation further showed that after Comparison of the absolute signal intensities with a constant normalization factor, which was calculated from the median of the signal quotients of all signal quotients, none of the array elements hybridized on the cDNA array gave a signal quotient of> ⁇ 2, FIG. 7.
  • the variance is not greater than at the comparison of two probes that were labeled differently from the same RNA using the conventional method using different fluorophores and hybridized on the same array.

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Abstract

Nukleinsäurekomplex mit einem Ankernukleotid, einer beliebigen Nukleinsäure oder einem beliebigen Oligonukleotid und einer Linkernukleinsäure, wobei der Linker partiell mit dem Ankernukleotid und partiell mit der beliebigen Nukleinsäure oder Oligonukleotid hybridisiert ist und das Ankernukleotid mit seinem 3,-Terminus an einem Träger immobilisiert ist.

Description

Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäurekomplex mit einem Ankeroligonukleotid, einer beliebigen Nukleinsäure oder einem beliebigen Oligonukleotid und einem Linkeroligonukleotid, ein Nukleinsäure- oder Oligonukleotidhybridisierungsprodukt sowie ein Verfahren zur Herstellung und Abtrennung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden nach deren Synthese unter Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekomplexes.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung, die es ermöglicht in einem kombinierten und automatisierbaren Ein-Gefäß-Verfahren (One tube reaction) RNA aus homogenisiertem Gewebe oder Zellen zu extrahieren, aufzureinigen, in cDNA umzuschreiben und erneut aufzureinigen.
Die Analyse der Genexpression bedingt die Extraktion und Aufreinigung und Markierung der mRNA. Die Markierung der mRNA wird oftmals über den Schritt der cDNA-Synthese durchgeführt, da hierbei markierte Nukleotide eingefügt werden können. Der Prozess der mRNA-Isolierung beinhaltet die selektive Extraktion der RNA aus dem Gemisch der in einer Zelle oder in Gewebe vorhandenen Materialien (Lipide, Proteine, Saccharide, DNA, RNA, niedermolekulare Substanzen) und die anschließende Anreicherung der mRNA aus dem Gemisch von tRNA, rRNA, snRNA und mRNA mit Hilfe von Oligo(dT) Nukleinsäuren, die an in an einer Säule (Affinitätschromatographie) oder an (magnetischen) sphärischen Partikeln (batch Verfahren) gebunden sind. Anschließend wird die mRNA von den oligo(dT) eluiert und getrennt hiervon weiteren enzymatischen Reaktionen ausgesetzt oder aber noch gebunden an Oligo(dT) (und einer Festphase) enzymatisch umgesetzt. Die RT-Reaktion zur Herstellung der cDNAs ist eine enzymatische Reaktion, die auch in Gegenwart der Oligo(dT) und einer daran gekoppelten Festphase durchgeführt werden kann. Die synthetisierte cDNA kann allerdings nicht ohne weiteres von der Festphase abgetrennt werde, da die Oligo(dT)s als Primer dienen und somit letztendlich die cDNA kovalent an der Festphase gebunden ist. Eine weitere Verwendung der cDNA, die die Abtrennung dieser von der Festphase bedingt, ist somit nicht möglich.
WO-A-98/31838 betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Genexpressionsmustern in mRNA-Populationen. Das Verfahren ist sinnvoll zur Bestimmung differenzieller Genexpressionen in verschiedenen Zellen oder Geweben inklusive Zellen oder Geweben von Zielorganismen. Es werden Verfahren offenbart zur Bestimmung der Häufigkeit einer Genexpression in mRNA-Populationen wodurch ein Verfahren zum Vergleich der Genexpressions- häufigkeit verschiedener Zellen oder Geweben verfügbar wird. Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Isolierung von Genen, die mit sogenannten tag-Sequenzen nach der dort beschriebenen Methode identifiziert wurden. Die Sequenzen können zur Diagnose bestimmter Erkrankungen eingesetzt werden.
WO-A-95/13368 betrifft die Isolierung einer Nukleinsäure aus einer Probe. Dabei wird die Probe gekocht und danach gekühlt. Die Nukleinsäuren werden auf einen festen Träger kondensiert. Die Methode findet Anwendung zur Präparation von Nukleinsäuren für nachfolgende Amplifizierung. Insbesondere kann die Methode angewendet werden bei der Isolierung von Nukleinsäuren von gealterten, fixierten oder in anderer Weise behandelten Proben.
Die WO-A-97/10363 betrifft die Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), eine Methode für die schnelle, quantitative und qualitative Analyse von Transkripten. Kurze, definierte Sequenzen, die zu exprimierten Genen korrespondieren, werden isoliert und analysiert. Die Sequenzierung von über 1000 definierten tags in kurzer Zeit ergibt ein Genexpressionsmuster, das charakteristisch ist für die Funktion einer Zelle oder eines Gewebes. Die SAGE- Methode ist nützlich als Hilfsmittel zur Identifizierung und Isolierung neuer tag- Sequenzen, die zu neuen Transkripten und Genen korrespondieren.
Das der Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht darin, ein einfaches und zuverlässiges Verfahren und Mittel zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen, um die oben geschilderten Nachteile zu vermeiden. Die Aufgabe wird gelöst durch einen Nukleinsäurekomplex mit einem Ankeroligonukleotid, einer beliebigen Nukleinsäure oder einem beliebigen Oligonukleotid sowie einem Linkeroligonukleotid, wobei das Linkeroligonukleotid partiell mit dem Ankeroligonukleotid und partiell mit der beliebigen Nukleinsäure oder dem beliebigen Oligonukleotid hybridisiert ist und das Ankeroligonukleotid mit seinem 3λ -Terminus an einem Träger immobilisiert ist.
Das Ankeroligonukleotid ist an einem Träger immobilisiert. Das Linkeroligonukleotid weist eine Sequenz auf, die es erlaubt sowohl mit dem Ankeroligonukleotid als auch mit einer weiteren Nukleinsäure oder einem weiteren Oligonukleotid zu hybridisieren. Die Sequenz des Linker- oligonukleotides muss also so gewählt werden, dass sie zu der Sequenz der weiteren Nukleinsäure/des weiteren Oligonukleotides passt. Soll also beispielsweise cDNA aus mRNA (poly(A+)RNA) erhalten werden, weist das Linkeroligonukleotid einen poly(dT)-Teil auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von cDNA wird anhand der Figur 2 näher erläutert:
Es wird ein Träger, vorzugsweise ein Bead eingesetzt, an den über ein Ankeroligonukleotid ein Linkeroligonukleotid so gebunden ist, dass ein poly(dT)-Teil vorhanden ist. An diesen poly(dT)-Teil wird nun mRNA angelagert, und durch eine übliche RT-Reaktion - gegebenenfalls unter Einbau von markierten Nukleotiden - das Linkeroligonukleotid durch eine Polymerasereaktion verlängert. Die mRNA kann dann beispielsweise durch RNaseH oder NaOH zerstört werden und das um die cDNA verlängerte Linkeroligonukleotid durch Temperaturerhöhung, gegebenenfalls durch Pufferänderung abgespalten werden.
Das Verfahren kann auch eingesetzt werden, um eine beliebige Nukleinsäure (mit zumindest teilweise bekannter Sequenz) zu synthetisieren. Hierzu ist es erforderlich, dass das Linkeroligonukleotid wiederum eine Sequenz aufweist, die mit dem Zielmolekül teilweise überlappt. Dann kann eine zur Zielnukleinsäure komplementäre Nukleinsäure - gegebenenfalls unter Einbau von markierten Nukleotiden - an das Linkeroligonukleotid synthetisiert werden. Die Nukleinsäure kann dann als Doppelstrang (mit Einzelstrang-Ende) abgespalten und weiterverarbeitet werden. Ein solches Verfahren ist z.B. sinnvoll zur direkten, nicht PCR-amplifizierten Herstellung von cDNA-Banken mit- entsprechend der ausgewählten Sequenz des Linkeroligonukleotids - selektiv angereicherten cDNA-Molekülen, indem die hergestellten und isolierten Doppelstrang cDNAs direkt in einen entsprechend vorbereiteten Klonierungs-Vektor ligiert werden.
Beim erfindungsgemäßen Nukleinsäurekomplex führt z. B. eine Temperatur von 35°C bis 85°C, vorzugsweise 45°C bis 65°C, zu einer Annelierung von Ankeroligonukleotid und Linkeroligonukleotid.
Vorzugsweise weist der hybridsierende Bereich von Anker- und Linkeroligonukleotid im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekomplex ein Verhältnis der Nukleotide GC:AT von 20:80 bis 80:20 auf.
Erfindungsgemäß erfolgt eine Annelierung zwischen Ankeroligonukleotid und Linkeroligonukleotid vorzugsweise bei einer höheren Temperatur als zwischen Linkeroligonukleotid und der beliebigen Nukleinsäure oder dem beliebigen Oligonukleotid.
Der erfindungsgemäße Nukleinsäurekomplex weist in einer bevorzugten Ausführungsform das Ankeroligonukleotid kovalent gebunden oder über eine Affinitätsgruppierung an den Träger immobilisiert auf.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Nukleinsäure- oder Oligonukleotidhybridisierungsprodukt aus einem Ankeroligonukleotid und einem Linkeroligonukleotid, wobei das Linkeroligonukleotid partiell mit dem Ankeroligonukleotid hybridisiert ist und das Ankeroligonukleotid mit dem 3'- Terminus an einem Träger immobilisierbar ist.
Das mit dem 3'-Terminus an einem Träger immobilisierbare Ankeroligonukleotid und das Linkeroligonukleotid können in Form eines Kits gegebenenfalls zusammen mit weiteren Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vertrieben werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Abtrennung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden nach deren Synthese unter Verwendung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekomplexes. Dabei werden die folgenden Schritte durchgeführt:
• Anlagerung einer beliebigen Zielnukleinsäure, deren 5-'-Terminus partiell mit dem Linkeroligonukleotid hybridisiert, wobei das Linkeroligonukleotid mit dem an einen Träger immobilisierten Ankeroligonukleotid hybridisiert ist,
• Verlängerung des Linkeroligonukleotides durch eine Polymerase und
• Ablösung des verlängerten Linkeroligonukleotides gegebenenfalls zusammen mit der Zielnukleinsäure.
Vorzugsweise ist die Zielnukleinsäure mRNA. Insbesondere vor der Abspaltung des verlängerten Linkeroligonukteotides kann die Zielnukleinsäure durch RnaseH oder NaOH abgebaut wird.
Die Erfindung erlaubt durch das in Figur 1 dargestellte bevorzugte Linker- und Ankemukleotid eine temporäre nicht kovalente Bindung der cDNA an die Festphase, welche durch einen einfache Hitzeschritt abgespalten werden kann. Damit lassen sich alle Reaktionen, die zur Isolierung, Aufreinigung, Markierung und erneuter Reinigung der fertigen Sonde benötigt werden an der Festphase durchführen (Figur 2). Die Durchführung an der Festphase ermöglicht wiederum eine einfache Automatisierung des vollständigen Ablaufes (Figur 3). Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die erfindungsgemäße Methode wurde zur Herstellung fluoreszenzmarkierter cDNA ausgehend von gesamt-RNA eingesetzt. Als feste Phase wurden Dynabeads M- 280 Streptavidin (DYNAL) verwendet. Um die mRNA-Ausbeute, Inkorporationseffizienz und Reinheit der Cy5-markierten cDNA zu überprüfen wurden unterschiedliche Qualitätskontrollen durchgeführt. Die markierte cDNA wurde anschließend gemeinsam mit einer auf konventionelle Art markierten cDNA (Cy3) mit einem cDNA-Array hybridisiert. Die konventionelle Markierung wurde wie folgt durchgeführt: Einbau fluoreszenzmarkierter Cy3-Nukleotide in Lösung während einer Reversen-Transkriptase Reaktion (Superscript II (GIBCO) ausgehend von aufgereinigter mRNA die aus der gleichen gesamt- RNA wie sie auch für die andere Sonde verwendet wurde isoliert wurde, anschließende Abspaltung der mRNA durch RnaseH-Behandlung und Aufreinigung der markierten cDNA über Silika-Membranen (Qiaquick, QIAGEN). Anhand des Cy3/Cy5 Signalverhältnisses der einzelnen auf dem Array immobilisierten cDNAs, konnte eine Aussage über die Güte des erfindungsgemäßen Markierungsverfahren im Vergleich zum konventionellen Markierungsverfahren gemacht werden. Hierbei wurde wie folgt vorgegangen:
a) Herstellung des Anker-Linker Hybrids:
Der Biotin-Anker und Linker wurden auf eine Konzentration von 350 ng/μl in RNase freiem, bidestilliertem Wasser eingestellt. In einem 0,2 ml Eppendorf- Reaktionsgefäß wurden 9.1 μl Biotin-Anker (400 pmol; 8000 pg/pmol), 15.6 μl Linker (400 pmol; 13647 pg/pmol) und 25 μl einer Lösung aus 10 mM Tris- HCI, pH 7.5; 1 mM EDTA und 2 M NaCI zusammengegeben und 2 min bei 95°C, 10 min bei 65°C, 10 min bei 37°C und 20 min bei RT inkubiert. Zur Kontrolle der erfolgten Hybrid-Bildung wurde 1 μl der Lösung abgenommen und 4 μl 6 x PAGE Loading Buffer und 19 μl H2O zusammengeben, über ein 12% PAGE-Gel (19: 1 Acrylamid: Bisacrylamid) aufgetrennt und mit einer 1 : 1000 verdünnten SybrGreen (Molecular Probes) angefärbt. Parallel hierzu wurde 1 μl des Biotin-Ankers und 1 μl des Linkers aufgetragen, siehe Figur 4. Während der Einzelstranglinker auf einer Höhe von 25 bp und der Einzelstrang-Biotin-Anker auf einer Höhe von 35 bp läuft (die Biotinylierung dieses Einzelstrang bedingt eine nicht ganz saubere Auftrennung), lässt sich deutlich erkennen, dass das Anker-LinkerHybrid auf einer Höhe von knapp 50 bp läuft.
b) Vorbehandlung der Dynabeads M-280 Straptavidin (nach Angaben des Herstellers):
200 μl (2mg) Dynabeads M-280 Straptavidin wurden einmal mit dem doppelten Volumen einer Lösung aus 0.1 M NaOH und 0.05 M NaCI, einmal mit dem doppelten Volumen einer 0.1M NaCI Lösung gewaschen und in 375 μl einer Lösung aus 10 mM Tris-HCI, pH 7.5; 1 mM EDTA und 2 M NaCI resuspendiert.
c) Immobilisierung des Anker-Linker Hybrids:
Zu der unter b) erhaltenen Lösung werden 375 μl einer Lösung aus 3 mM Tris- HCI (pH7.5)
0.2 mM EDTA und 50 μl der unter a) erhaltenen Anker-Linker Hybride zugegeben und 15 min bei RT unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Unter Verwendung des hierfür vorgesehenen Magnetständer (DYNAL) wird zweimal mit einer Lösung aus 10 mM Tris-HCI, pH 7.5; 1 mM EDTA und 2 M NaCI gewaschen und anschließend in 200 μl einer Lösung aus 20 mM Tris-HCI, pH 7.5, 1 M LiCI, 2 mM EDTA resuspendiert.
d) mRNA-Isolierung :
100 μg gesamt RNA wurden 2 min in 100 μl H2O auf 65°C erhitzt und anschließend zu den aus c) erhaltenen und von der Lösung befreiten derivatisierten Beads zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde 5 min bei RT geschüttelt, 5 min in den Magnet-Ständer gestellt und anschließend die Beads 2 mal mit 200 μl einer Lösung aus 10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0,15 M LiCI, 1 mM EDTA gewaschen.
e) Markierungsreaktion :
Die isolierte mRNA wurde einmal mit einer Lösung aus 3 mM Tris-HCI (pH7.5), 0.2 mM EDTA und 2 mit 1 x RT-Puffer (GIBCO) gewaschen. In einem Eppendorf Reaktionsgefäß wurden 21 μl H2O, 8 μl 5 x First Strand Buffer (GIBCO), low C dNTPs (10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP; 4 mM dCTP) (GIBCO), 2 μl FluoroLink™ Cy3/5-dCTP (Amersham Pharmacia), 4 μl 0,1 M DTT und 1 μl Rnasin (20-40 u) (PROMEGA) zusammengegeben und kurz geschüttelt. Mit dieser Lösung wurde die isolierte mRNA resuspendiert, 5 min bei 42°C inkubiert, mit 1 μl (200 U) Superscript II (SSII, GIBCO) versehen, 30 min unter ständigem Schütteln bei 37°C inkubiert, erneut mit 1 μl SSII versehen und nochmals 30 min bei 37°C geschüttelt. Es wurden 0,5 μl RNAseH (GIBCO) zugegeben und 20 min bei 37°C inkubiert.
f) Reinigung der markierten Sonde:
Sollen sowohl die Cy3 als auch die Cy5 markierte Sonde auf die erfindungsgemäße Art hergestellt werden, so könnten beide Markierungreaktionen nun zusammen gegeben und gemeinsam weiter verarbeitet werden. In dem hier beschriebenen speziellen Beispiel, bei dem die Cy5 markierte Sonde nach der erfindungsgemäßen Methode und zum Vergleich die Cy3 markierte Sonde nach der konventionellen Methode hergestellt wurde, wurden die beiden Markierungsansätze getrennt voneinander aufgearbeitet. Die nach der erfindungsgemäßen Methode hergestellten Sonde wurde zweimal mit 400 μl 10 mM Tris-HCI pH 7.5 gewaschen, in 10 μl 10 mM Tris-HCI pH 7.5 resuspendiert, 2 min bei 65°C inkubiert und sofort in den Magent-Ständer gestellt. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Beads wurden erneut in 10 μl 10 mM Tris-HCI pH 7.5 resuspendiert, 2 min bei 65°C inkubiert und der Überstand wiederum in das neue Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die vereinigten Überstände wurden mit der auf konventionelle Art markierten Cy3- Sonde vereinigt, auf 20 μl eingedampft, mit 5 μl einer Hybridisierungslösung versehen und auf einen vprhybridisierten cDNA-Array aufgetragen. Der cDNA- Array wurde über Nacht hybridisiert und anschließend mit geeigneten Lösungen gewaschen, getrocknet und mit einem Laser-Scanning Gerät ausgelesen. Die bei unterschiedlichen Wellenlängen hierbei erhaltenen Bilder (Cy3 und Cy5) sind in Figur 5 dargestellt. Die Auswertung der relativen Signalintensitäten ergab, dass ausgehend von der gleichen Menge an gesamt- RNA die nach der erfindungsgemäßen Methode markierte Sonde im Mittel 2,2- fach stärke Signale ergab als die konventionell markierte Sonde, Figur 6. Die Auswertung ergab weiter, dass nach Abgleich der absoluten Signalintensitäten mit einem konstanten Normierungsfaktor, der aus dem Mediän der Signalquotienten aller Signalquotienten berechnet wurde, keines der auf dem cDNA-Array hybridisierten Array-Elemente eine Signalquotienten von > ± 2 ergab, Figur 7. Somit ist die Varianz nicht größer als bei dem Vergleich zweier Sonden, die ausgehend von der selben RNA mit der konventionellen Methode unter Verwendung unterschiedlicher Fluorophore unterschiedlich markiert und auf dem gleichen Array hybridisiert wurden.

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäurekomplex mit einem Ankeroligonukleotid, einer beliebigen Nukleinsäure oder einem beliebigen Oligonukleotid sowie einem Linkeroligonukleotid, wobei das Linkeroligonukleotid partiell mit dem Ankeroligonukleotid und partiell mit der beliebigen Nukleinsäure oder dem beliebigen Oligonukleotid hybridisiert ist und das Ankeroligonukleotid mit seinem 3λ -Terminus an einem Träger immobilisiert ist.
2. Nukleinsäurekomplex nach Anspruch 1, wobei eine Temperatur von 35°C bis 85°C, vorzugsweise 45°C bis 65°C, zu einer Annelierung von Ankeroligonukleotid und Linkeroligonukleotid führt.
3. Nukleinsäurekomplex nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der hybridsierende Bereich von Anker- und Linkeroligonukleotid ein Verhältnis der Nukleotide GC:AT von 20:80 bis 80:20 aufweist.
4. Nukleinsäurekomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Annelierung zwischen Ankeroligonukleotid und Linkeroligonukleotid bei einer höheren Temperatur erfolgt als zwischen Linkeroligonukleotid und der beliebigen Nukleinsäure oder dem beliebigen Oligonukleotid.
5. Nukleinsäurekomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Ankeroligonukleotid kovalent oder über eine Affinitätsgruppierung an den Träger immobilisiert ist.
6. Nukleinsäure- oder Oligonukleotidhybridisierungsprodukt aus einem Ankeroligonukleotid und einem Linkeroligonukleotid, wobei das Linkeroligonukleotid partiell mit dem Ankeroligonukleotid hybridisiert ist und das Ankeroligonukleotid mit dem 3'-Terminus an einem Träger immobilisierbar ist.
7. Verfahren zur Herstellung und Abtrennung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden nach deren Synthese unter Verwendung eines Nukleinsäurekomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Hybridisierungsproduktes gemäß Anspruch 6, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:
• Anlagerung einer beliebigen Zielnukleinsäure, deren 5<'-Terminus partiell mit dem Linkeroligonukleotid hybridisiert, wobei das Linkeroligonukleotid mit dem an einen Träger immobilisierten Ankeroligonukleotid hybridisiert ist,
• Verlängerung des Linkeroligonukleotides durch eine Polymerase und
• Ablösung des verlängerten Linkeroligonukleotides, gegebenenfalls zusammen mit der Zielnukleinsäure.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zielnukleinsäure mRNA ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zielnukleinsäure vor der Abspaltung des verlängerten Linkeroligonukteotides durch RnaseH oder NaOH abgebaut wird.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 9 mit
- mindestens einem Ankeroligonukleotid, dass mit seinem 3'-Terminus an einem Träger immobilisiert ist sowie
- mindestens einem Linkeroligonukleotid.
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