WO2001060370A1

WO2001060370A1 - Remedes contre les maladies induites par l'endotheline

Info

Publication number: WO2001060370A1
Application number: PCT/JP2000/007573
Authority: WO
Inventors: Hironori Yuyama; Akira Fujimori; Masanao Sanagi; Hironori Harada; Akiko Koakutsu; Mikiko Mori; Nobuyuki Yamamoto
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2001-08-23
Also published as: ES2277856T3; HUP0204139A2; DE60032517D1; CN1434715A; ATE348617T1; JP3832229B2; BR0017120A; KR20020075797A; CA2395711A1; JP2001302514A; EP1256344B1; AR031679A1; AU2000279614A1; HUP0204139A3; RU2002124599A; EP1256344A1; JP2006176542A; US6774131B1; EP1256344A4; DE60032517T2

Description

明細書医薬組成物技術分野

本発明は、医薬、とりわけ前立腺癌等のエンドセリン誘発性疾患の疼痛緩和剤；造骨性病変の改善剤及び/又は造骨に伴う疼痛緩和剤；前立腺癌の骨転移による造骨性病変の改善剤及び Z又は前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和剤；前立腺癌の癌細胞増殖抑制剤；或いは、前立腺癌の進展抑制剤；に係るものである。背景技術

N- [6—メトキシ一 5— (2—メトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル） —4一ピリミジニル] — 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその塩は国際公開第 9 7 / 2 2 5 9 5号公報に記載されており、エンドセリン ET_A受容体に対する ET— 1の結合抑制作用、及び、 ET - 1誘発性の血管収縮 ·昇圧に対する抑制作用が開示され、心血管系疾患を初めとする、エンドセリンが関与する種々の疾患の処置に用いることができることが示唆されている。

本発明者は新規な治療薬の創製を目的として、 N— [6—メトキシ— 5— (2 ーメトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル）一4一ピリミジニル] 一 2 一フエニルェテンスルホンアミド又はその塩の更に具体的な疾患に対する治療可能性について鋭意検討を行った。発明の開示

その結果、本発明者は N— [6—メトキシー 5— (2—メトキシフエノキシ） - 2 - (2—ピリミジニル） — 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその塩が、癌（特に前立腺癌、乳癌、卵巣癌）、関節炎、前立腺炎、神経膠腫、末梢動脈閉塞症、月経困難症、片頭痛、狭心症、急性心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血、糖尿病性神経障害、リウマチ、緑内障、消化性潰瘍、出産時の陣痛等のェンドセリン誘発性疾患の疼痛の緩和に有効であることを見い出し、発明を完成させた。

ET— 1はヒトゃ実験動物において疼痛を誘発することが報告されている。例えばヒ卜の上腕動脈に E T— 1 を投与すると虚血性の筋肉痛が惹起される (J. Hypertension, 8, 811-817, 1990)。また、疼痛モデルとして汎用されているマウスホルマリン疼痛モデルにおいて、 ET— 1がホルマリンによる疼痛の first phase および second phase を有意に増強することが報告されている (Can. J. Physiol. Pharmacol. , 75, 596-600, 1997) ₀ 本モデルにおいて first phase は知覚神経の直接刺激による疼痛を、 second phaseは炎症性二次反応による疼痛を意味している（Pain, 38, 247-352, 1989)。

本発明の有効成分は、後記の試験例 1に示すようにマウスホルマリン疼痛モデルにおいて ET— 1による疼痛の増強に対して抑制作用を示した。また、本発明者は N— [6—メトキシ一 5— (2—メトキシフエノキシ）一 2 一 (2—ピリミジニル） —4—ピリミジニル] — 2—フエニルェテンスルホンァミドまたはその塩が、造骨性病変の改善及び/又は造骨に伴う疼痛の緩和に有効であることを見出して、発明を完成させた。

破骨細胞抑制作用を有し、骨代謝を改善させるビスホスホネート類は、乳癌の骨転移に伴う骨痛を改善する効果を有することから、長期的な骨病変の改善は骨痛の改善に結びつくと考えられる。前立腺癌患者においては、乳癌骨転移患者と異なり造骨性の骨転移病変が観察されるが（Semin. , Oncol. , 21, 630-656, 1996)、骨芽細胞に作用して骨代謝を改善させる薬剤は、前立腺癌の骨転移に伴う骨痛を改善する効果を有すると予想される。

ET- 1は、マウス骨芽細胞様細胞 MC3T3- E1及びラッ卜頭蓋骨から初代培養した骨芽細胞に対して、 ΕΤ_Α受容体を介して細胞内 C a ²⁺濃度の上昇や DNA合成増加、 AL P活性低下作用を示すことが報告されている

(Am. J. Physiol. 257, E797-E803, 1989 I Biochem. Biophys. Res. Com 170(3), 998-1005, 1990 I Bone, 21 (2), 143-146, 1997)。本発の有効成分は、後記の試験例 2に示すようにマウス骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1 の ET— 1誘発細胞応答反応に対して抑制作用を示した。また、本発明者は N— [6—メトキシー 5— （2—メトキシフエノキシ） — 2 一（2—ピリミジニル） — 4一ピリミジニル] — 2 _フエニルェテンスルホンァミドまたはその塩が、前立腺癌の骨転移に伴う疼痛の緩和、或いは、前立腺癌の骨転移による造骨性病変の改善に有効であることを見出して、発明を完成させたヒト前立腺癌細胞株が E T— 1産生能を有すること（Nat. Med.， 1 (9), 944- 949, 1995)及び E T_A受容体を介して増殖能を示すこと（Cancer Res, 56, 663- 668, 1996)、骨転移を有する前立腺癌患者では、骨転移を有さない前立腺癌患者に比べて血漿中 E T— 1濃度が上昇していること（Nat. Med. , 1 (9), 944-949, 1995)が報告されており、これら報告と試験例 1及び 2の結果を併せて考えると、本発明の有効成分は、とりわけ、前立腺癌患者の骨転移に伴う疼痛改善、或いは、前立腺癌の骨転移による造骨性病変の改善に有効であることが強く示唆される。更には、本発明の有効成分は後記の試験例 5に示すように、前立腺癌患者の疼痛スコァ及び鎮痛薬の使用量を低下させ、骨代謝マーカーを減少させた。また、本発明者は Ν— [ 6—メトキシ一 5— ( 2—メトキシフエノキシ） — 2 ― (2—ピリミジニル） — 4—ピリミジニル] — 2—フエニルェテンスルホンァミド又はその塩が、前立腺癌の癌細胞増殖抑制に有効であることを見い出し発明を完成させた。

本発明の有効成分は、後記の試験例 3と 4に示すように、ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞の ΕΤ— 1による細胞増殖に対し抑制効果を示した。また、本発明者は Ν— [ 6—メトキシー 5 _ (2—メトキシフエノキシ）一 2 - (2—ピリミジニル） — 4—ピリミジニル] — 2—フエニルェテンスルホンァミド又はその塩が、前立腺癌の進展抑制に有効であることを見い出し発明を完成させた。本発明の有効成分は、後記の試験例 5に示すように、前立腺癌患者の前立腺癌マ一カーの増大を抑制、或いは、低下させた。即ち、本発明は、 N— [ 6—メトキシ一 5— （2—メトキシフエノキシ） — 2 一（2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンァミドまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、癌（特に前立腺癌、乳癌、卵巣癌）、関節炎、前立腺炎、神経膠腫、末梢動脈閉塞症、月経困難症、片頭痛、狭心症、急性心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血、糖尿病性神経障害、リウマチ、緑内障、消化性潰瘍、出産時の陣痛等のエンドセリン誘発性疾患の疼痛緩和用医薬組成物；造骨性病変の改善用医薬組成物；及びノ又は造骨に伴う疼痛緩和用医薬組成物；とりわけ、前立腺癌の骨転移による造骨性病変改善用医薬組成物；及び Z又は前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和用医薬組成物；に関する。

また、本発明は、前立腺癌等のエンドセリン誘発性疾患の疼痛緩和剤；造骨性病変の改善剤；及び Z又は造骨に伴う疼痛緩和剤；とりわけ、前立腺癌の骨転移による造骨性病変改善剤；及び Z又は前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和剤；の製造の為の N— [ 6—メトキシ— 5— （2 —メトキシフエノキシ）一 2— （2—ピリミジニル） —4一ピリミジニル] — 2 —フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩の使用に関する。

また、本発明は、 N— [ 6—メトキシ一 5— （2—メトキシフエノキシ） — 2 - ( 2 —ピリミジニル） —4一ピリミジニル] 一 2 _フエニルェテンスルホンァミドまたはその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、前立腺癌等のエンドセリン誘発性疾患の疼痛；及び Z又は造骨に伴う疼痛；とりわけ、前立腺癌の骨転移に伴う疼痛の緩和方法に関する。また、本発明は、 N— [ 6—メトキシ一 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2— ( 2—ピリミジニル）一 4—ピリミジニル] — 2 —フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、造骨性病変；とりわけ、前立腺癌の骨転移による造骨性病変の改善方法に関する。更に、本発明は、 N— [6—メトキシ— 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2 一（2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンァミドまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺癌の癌細胞増殖抑制用医薬組成物及び Z又は前立腺癌の進展抑制用医薬組成物に関するまた、本発明は、前立腺癌の癌細胞増殖抑制剤及び/又は前立腺癌の進展抑制剤の製造の為の N— [6—メトキシー 5— （2—メトキシフエノキシ）ー 2— （2 一ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩の使用に関する。

また、本発明は、 N— [6—メトキシ一 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2 一（2—ピリミジニル） —4—ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンァミドまたはその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、前立腺癌の癌細胞の増殖及び Z又は前立腺癌の進展の抑制方法に関する。尚、本発明の有効成分は特に経口吸収性に優れる為、優れた経口治療薬となりうる。本発明の有効成分は、後記の試験例 6に示すように、ヒトに経口投与した時の血漿中濃度は公知 ET_A受容体拮抗薬である ABT- 627 〔 1一 (N, N—ジブチルカルバモイルメチル）一 2 (R) - (4ーメトキシフエ二ル）ー 4 (S) 一 (3, 4—メチレンジォキシフエニル）ピロリジン一 3 (R) 一力ルボン酸〕の 1/2量で AUCが約 1 8倍と顕著に優れている。以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の医薬の有効成分は、 N— [6—メトキシ— 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2— （2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩である。かかる塩とは、前記国際公開第 9 7 / 2 2 5 9 5号に記載された塩が挙げられ、具体的には塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、マイレン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クェン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ァスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニゥム等の無機塩基、メチルァミン、ェチルァミン、エタノールァミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニゥム塩等力挙げられる。特に好ましいものとして力リウム塩が挙げられる。

また、本発明の有効成分には各種異性体の混合物及びその単離されたもの、水和物、溶媒和物の全てが含まれる。また本発明有効成分中には結晶多形を有する化合物もあり、それら結晶形の全てを包含する。

これらの化合物は前記の国際公開第 9 7 / 2 2 5 9 5号に記載された製法により、或いはそれに準じて容易に入手可能である。

本発明の薬剤は、経口または非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口固形製剤、経口液状製剤または注射剤として調製することができる。本発明の医薬の有効成分は優れた経口吸収性を有することから、本発明の薬剤は経口製剤に適する。最も好ましいのは患者が自ら容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。

経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、デンプン、コーンスターチ、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（H P M C ) のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、スターチ、タルクのような潤滑剤；繊維素グリコール酸カルシウム、カルメロースカルシウムのような崩壊剤；ラクトースのような安定化剤；グルタミン酸又はァスパラギン酸のような溶解補助剤；ポリエチレングリコールのような可塑剤；酸化チタン、タルク、黄色酸化鉄のような着色剤；を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、寒天、ぺクチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで慠蜈しもよい経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、ェ夕ノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

静注、筋注、皮下注などの注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベー卜 8 0等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィル夕一を通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によつて無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。本発明の有効成分化合物の投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常経口投与の場合成人 1人当たり有効成分約 0 . 1乃至 5 0 0 m g /日、好ましくは 1乃至 2 5 O m g Z日であり、これを 1回〜 2回に分けて投与される。

尚、本発明の薬剤は他の疼痛緩和剤と同時にまたは時間をおいて併用することができる。例えば、前立腺癌、乳癌などの癌性疼痛に対しては、 WH O方式癌性疼痛治療法で使用されているモルヒネ等の強オビオイド鎮痛薬、ペンタゾシン、ブプレノルフィン等の弱ォピオイド鎮痛薬、インドメ夕シン、イブプロフェン等の非ステロイド性抗炎鎮痛薬が挙げられる。

更に、本発明の薬剤は、エンドセリン誘発性疾患の治療に用いられる他の薬剤と同時または時間をおいて併用することができる。例えば、本発明の薬剤と併用することが可能である前立腺癌の治療剤として、ィホスフアミド、テガフール ' ゥラシル等の杭悪性腫瘍剤、ェチニルエストラジオール等の卵胞ホルモン、ヒド口コルチゾン、プレドニゾロン、ベメタゾン等の副腎皮質ホルモン、ク uルマジノン等の黄体ホルモン、酢酸リュ一プロレリン等の LH— RH誘導体、酢酸ゴセレリン等の LH— RHァゴニスト、シスブラチン等の抗悪性腫瘍白金錯体化合物、フル夕ミド等の抗アンドロゲン剤、ホスフェストロール、リン酸エストラムスチンナトリゥム等の前立腺癌治療剤、硫酸べプロマイシン等の抗腫瘍性抗生物質が挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は、ホルマリン疼痛に対する ET-1 による増強作用（A. First Phase, B. Second Phase, C. 浮腫）を示す。

図 2は、ホルマリン疼痛の ET-1 による増強作用に対する化合物 1の抑制作用（A. First Phase, B. Second Phase, C. 浮腫）を示す。

図 3は、マウス骨芽細胞様細胞 MC3T3- E1 の ET- 1誘発細胞内 Ca"濃度上昇に対する化合物 1の抑制効果を示す。

図 4は、マウス骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1 の ET- 1 誘発細胞増殖（[¾]- thyamidine 取り込み）に対する化合物 1の抑制効果を示す。

図 5は、マウス骨芽細胞様細胞 MC3T3- E1 の ET-1誘発細胞増殖（細胞数）に対する化合物 1の抑制効果を示す。

図 6はホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞 PPC- 1の ET-1誘発細胞増殖に対する化合物 1の抑制効果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。尚、以下の実施例等において用いる化合物 1は N— [6—メトキシ— 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2— (2 一ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミド ' カリウム塩を意味する。

実施例 1 カプセル錠表 1

上記成分を混合し、カプセルに充填してカプセル剤を製造した。試験例 1 マウスホルマリン疼痛モデルの ET— 1による疼痛増強作用に対する化合物 1の抑制効果

(方法）

①使用動物

実験には、雄性 ICR系マウス（5週齢，日本 SLC)を用いた。

②疼痛反応測定

マウスを観察用ケージに入れ 5分間以上環境に慣らした後、マウスの左後肢足躕内に生理食塩水を、右後肢足躕内に 0.7%ホルマリン含有生理食塩水をそれぞれ 20 fi 1ずつ皮下投与した。その直後より出現する lickingおよび biting反応の持続時間を 5分ごとに 40分間計測した。計測終了後、両足首を切断して重量を測定した。ホルマリン投与直後から 5分間の反応時間を first phase、投与後 10分から 40分まで 30分間の反応時間の総計を second phaseとして疼痛の指標とした。また右足重量 - 左足重量（mg)により算出される浮腫を炎症性反応の指標としたまた Licking反応時間の計測はすべて 10:00から 18:00の間に行った。

③被検薬

ET-1 を含む 0.7% ホルマリン含有生理食塩水を 3, 10, 30pmol/pawの用量で右後肢足躕内に皮下投与し、ホルマリン疼痛および浮腫に対する ET- 1 の増強作用を検討した。

化合物 1 (0.3〜3mg/kg)を lml/100gの容量で経口投与し、投与後 60 分に ET- 1 (10pmol/paw)を含む 0.7 ホルマリン含有生理食塩水を右後肢足躕内に皮下投与し、ホルマリン疼痛および浮腫の ET-1誘発の増強作用に対する化合物 1の効果を検討した。 ④統計処理

結果は平均値土標準誤差で示した。二群間の有意差検定は、対応のない student の t検定により p値を算出した。多群間の有意差検定は一元配置分散分析で解析し、 Dunnett の多重比較により p値を算出した。 p値が 5 以下の場合を有意とした。

(結果）

①ホルマリン疼痛及び浮腫の ET— 1による増強作用

0.7%ホルマリン溶液をマウス後肢足踱内に皮下投与することにより 2相性の疼痛反応が認められた。投与直後から 5 分以内に出現する一過性の疼痛反応 (lickingおよび biting反応： first phase)と、ホルマリン溶液投与後 20分前後をピークとする持続性の疼痛反応（second phase)が認められた。（図 1 A、 1 B)。また、 0.7%ホルマリン溶液投与により後肢に浮腫が惹起された（図 1 C) 。

ホルマリン溶液と ET-1 (3, 10, 30 pmol/paw)を同時に投与すると、 first phase, second phase 及び浮腫が用量依存的にかつ有意に増強された（図 1 A， 1 B， 1 C)。

②ホルマリン疼痛の ET- 1 による増強作用に対する被検薬の作用

化合物 1 (0.3, 1, 3mg/kg, p.0. )は、 ET-1 (10pmol/paw)誘発のホルマリン疼痛 (first phase, second phase)及び浮腫の増強作用を有意に抑制した（図 2 A， 2 B, 2 C)。試験例 2 骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1の ET— 1誘発細胞増殖に対する抑制試験 (方法）

①使用細胞

実験には、マウス骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1 を用いた（Journal of Cell Biology, 96 (1), 191-198, 1983) 。

②細胞内 Ca²⁺濃度測定

細胞をセルデスク（径 13.5mm)上に培養し、コンフルェントに達した後、血清非存在下で約 12 時間以上培養後実験に用いた。細胞に Hank's balanced sail JP00/07573 solution(HBSS) (140mM aCl, 4mM KC1, ImM K_zHP0₄, ImM MgCl₂, ImM CaCl₂, lOmM glucose, 20mM Hepes, pH=7.4)中で Fura 2 -AM (4 a M)を添加して 37C 1時間ィンキュベーションした。 HBSSが入った石英セル中にセルデスクを固定し、細胞内 Ca" 測定装置（CAF-110)内に石英セルを装着して 37°C、スターラーによる攪拌条件下で定常状態になつてから実験を開始した。細胞内 Ca"濃度の測定は、 340/380mn 励起波長による 500nmの蛍光強度比を測定し、得られた蛍光強度比から計算式によって細胞内 Ca²⁺濃度を算出した（J. Biol. Chem. , 260, 3440-3450, 1985)。

③ DNA合成量測定

DNA合成量は、 [¾]ラベルした thymidineの取り込み量を測定した。細胞を 96 穴プレー卜に FCS 0.2 の培地を用いて 1.5X10⁴cells/wellの割合で蒔いて 2日間培養した。その後溶媒及び ET- 1 を加え 24時間培養した。続いて培養液中に [ - methyl]- thymidine, 0.5 Ci/well を添加し 6時間パルスラベルした。続いて最終濃度 0.2% となるように SDS溶液を添加し細胞を溶解させた後、 DNA合成に使用された [ -me t 1 ] - 1 hym i d i ne の放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンターで測定した。対照として溶媒を添加した測定値を 100%とし、 DNA合成増加率を算出した。

④細胞数測定

細胞数は、 Cell Counting Kit (D0HND0)の試薬溶液を用いて測定した。細胞を 24穴プレートに FCS 0.5 の培地を用いて 1.0X10⁴cel ls/ ell の割合で蒔いて 1 日間培養した。その後溶媒及び ET- 1 を加え 72時間培養した。続いて培養液中に試薬溶液を】 00 1/well添加し、 37°C 3時間インキュベーションした。反応後、 24穴プレートの各穴から 200 1ずつ 96穴プレートに移し、吸光度（波長 405 参照波長 650M1)をプレートリーダーで測定した。対照として溶媒を加えた測定値を 100%とし、細胞数増加率を算出した。

⑤被検薬

それぞれの実験において、最終濃度として ET- 1 10— ¹³ j0—「'M、化合物 1 】0 10—⁴Mの濃度範囲（いずれも 10倍比）で実験を行った。化合物 1は、細胞内 Ca"濃度測定においては ET-1添加約 1分前、それ以外の実験においては ET- 1添加約 2 時間前に添加した。

⑥統計処理

結果は平均値土標準誤差で示した。群間の有意差検定は一元配置分散分析で解祈し、 Dunnetの多重比較により p値を算出した。 p値が^以下の場合を有意とした。各実験の ET- 1の EC₅。値および化合物の IC₅。値は、 Logistic回帰法により算出した。

(結果）

① MC3T3- E1の ET-1誘発細胞内 Ca²⁺濃度上昇に対する化合物 1の抑制効果

マウス骨芽細胞様細胞である MC3T3 - E1において、 ET -】（1 (T¹²〜 10—⁶M)は濃度依存的に細胞内 Ca²⁺濃度を上昇させた（図 3 A)。 ET-1 の EC₅。値は 7.39 X 10— ⁹Mであつた。化合物 1 (10— ¹²〜10—⁴M)は、 ET- 1(10— )により誘発された細胞内 Ca"濃度上昇作用を濃度依存的に抑制した（図 3 B)。化合物 1の IC₅„値は 1.02X10— ^SMであつた。

② MC3T3- E1の ET-1誘発細胞増殖に対する化合物 1の抑制効果

マウス骨芽細胞様細胞である MC3T3-E1 において、 ET-l(10-'³〜10—^f'M)«[³H]- thymi dineの取り込みを濃度依存的に有意に上昇させ DNA合成を増加させた（図 4 A)oET-lの EC_5D値は 9.84Χ1(Γ^Ι2Μであった。化合物 1 (10-'²〜 Μ)は、 ET- 1 (10- ⁱ⁰M) により誘発された [ ]- thymidine の取り込み上昇作用を濃度依存的に抑制した (図 4 B)。化合物 1の IC₅。値は 1.15X10"^SMであった。

同様に、 WST-1 による細胞数測定実験においても、 ET-1U0一'²〜 101)は MC3T3- E1 の細胞数を濃度依存的に有意に上昇させた（図 5 A)。 ET-1 の EC₅。値は 2.20X 10— M であった。化合物 1 (10— u lO—Wは、 ET-1 (101)により誘発された細胞数上昇作用を濃度依存的に抑制した（図 5 B)。化合物 1の IC₅。値は 9.54X10— ⁹Mでめった。試験例 3 ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞の ET— 1誘発細胞増殖に対する抑制試験（1)

(方法） ①使用細胞

実験にはホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞株である PPC-1 を用いた (International Journal of Cancer, 44, 898-903, 1989) 。

② PPC- 1細胞増殖に対する ET-1の作用および被検薬による増殖抑制効果の検討細胞増殖の指標として DNA合成量を測定した。 DNA合成量は、 [ ]ラベルした thymidineの取り込み量を測定した。細胞を 96穴プレートに FCS無添加の培地を用いて 1 Xl0⁴cel Is/well の割合で蒔いて 5 日間培養した。その後溶媒及び ET - 1 を加え 24時間培養した。続いて培養液中に [ - methyl]- thymidine, 0.5 n Ci/well を添加し 6時間パルスラベルした。続いて最終濃度 0.2 となるように SDS溶液を添加し細胞を溶解させた後、 DNA合成に使用された [ -me t hy 1 ] - 1 hym i d i neの放射活性を液体シンチレーシヨン力ゥン夕一で測定した。対照として溶媒を添加した測定値を 10( とし、 DNA合成増加率を算出した。

③被検薬

本実験において、最終濃度として ET- 1 10-^|3〜10—⁶Μ(10倍比）、化合物 1 】0一 ¹¹¹ 〜3Χ10—⁶Μの濃度範囲（3倍比）で実験を行った。化合物 1は、 ET- 1添加約 2時間前に添加した。

④統計処理

結果は平均値土標準誤差で示した。群間の有意差検定は一元配置分散分析で解祈し、 Dunnettの多重比較により ρ値を算出した。 p値が ¾以下の場合を有意とした。化合物 1の IC_5fl値は logistic回帰法により算出した。

(結果）

図 6 Aに示すように、ホルモン非感受性ヒト前立腺癌細胞株 PPC-1 において、 ET-1 (10-¹³〜10- ⁶ M) は濃度依存的に [¾]- thymidineの取り込みを上昇させ、細胞増殖促進作用を示した。 ET- 1の作用は 10—⁸M以上で有意であった。

化合物 1 (10- '。〜3Χ10-⁶Μ)は ET-1 (10— )で誘発される PPC - 1 細胞増殖促進を濃度依存的に抑制し、 IC₅₍₎値は 28 ± 9.8 ηΜであった（図 6 Β)。化合物 1の抑制作用は 3Χ1(Γ 以上で有意であった。試験例 4 ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞の ET— 1誘発細胞増殖に対する抑制試験（2)

(方法）

①使用細胞

実験にはホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞株である PPC- 1 を用いた (International lournal of Cancer, 44, 898-903, 1989) 。

② ET-1による増殖反応および被検薬による ET-1誘発増殖抑制効果の検討

細胞数は、 alamar blueの試験溶液を用いて測定した。 24wel 1プレートに細胞を 2X10⁴cel ls/well蒔き込み、接着後培地を FCS非添加の培地に変換してさらに 24時間培養した。その後溶媒及び ET- 1を（ ¹¹〜^— )添加し、 96時間培養した。培地の最終容量は 500 X 1 とし、培養液中に alamar blueを 50 1添加し 4時間インキュベーションした。反応後 24well プレートの各穴から反応液を 100 u 1 採取し、 96well プレートに移しかえ、吸光度（波長 405n , 参照波長 650 ）をプレートリーダ一で測定した。対照として溶媒を加えた測定値を 100%とし、細胞数増加率を算出した。

化合物の抑制効果 φ検討には、化合物 1を〜- 10_⁵Μの最終濃度で、 ET- 1 を 10-⁷Μ添加 30分前に添加した。

また本実験において ET-1 の崩壊が懸念されたため、刺激後 48 時間で新しい ET-1添加培地と交換した。

(結果）

表 2に示すように、 ET- 1 は 10— から ΕΤ-】による PPC -】の細胞増殖作用が観察された。

表 2

(n=7)

また、表 3に示すように化合物 1は 10—⁶Mから ET- 1 10-⁷Mによる PPC- 1の細胞増殖を抑制した。

表 3

(n=7)

試験例 5 前立腺癌患者に対する臨床試験

(方法）

前立腺癌患者に対する臨床試験は以下の条件で行った。

対象：ホルモン非依存性の又は抗アンドロゲン療法後に再発したステージ D 2の前立腺癌患者 1 8名（45歳以上）

披検薬：化合物 1

剤形： 2、 1 0及び 4 Omg錠

用量： 2、 4、 10、 20、 60、 1 20及び 24 OmgZ日（ 1日 1又は 2回投与）

投与期間： 4週間（28曰）

評価指標：以下の項目を投与前後に測定した。

①前立腺特異抗原（P S A)

②骨マーカ一（骨アルカリフォスファタ一ゼ又はデォキシピリジノリン）

③骨疼痛（疼痛スコア VA S (visual analogue scale )の変化 Z鎮痛薬の使用量の変化）

(結果）

化合物 1は 2mg/日の用量から各効果指標の改善が認められた。化合物 1は、患者 1 8名中 9名の疼痛スコア VASを改善させた。化合物 1は患者 1 8名中 4 名の鎮痛薬の使用量を低下させた。化合物 1は患者 1 0名の前立腺癌マーカー P S Aを改善させ、 2名の P 5 Aを維持させた。化合物 1は患者 1 8名中 1 1名の骨代謝マーカー骨アルカリ：'ォスファタ一ゼを減少させ、患者 1 8名中 1 4名の骨代謝マーカーデォキシピリジノリン Zクレアチニン比を約 4 0 %改善させた。試験例 6 ヒ卜に経口投与した時の血漿中濃度

(方法）

化合物 1の経口投与時の薬物動態、忍容性および安全性を評価する目的で前立腺摘出手術を施行した進行性前立腺癌患者 3名を対象として化合物 1を 1 O m g 単回投与した。化合物 1の血漿中未変化体濃度を測定するために、投与前ならびに投与後 3 0分、 1時間、 1時間 3 0分、 2時間、 3時間、 4時間、 6時間、 8 時間、 1 2時間、 2 4時間、 3 6時間及び 4 8時間の各時点でへパリンリチウムを含むポリエチレンチューブに血液を 6 mlづっ採取し、速やかに遠心分離（4 °C，

1 0分間， 3500rpm)して血漿を得た。血漿サンプルは濃度測定までマイナス 7 0 °C にて冷凍保存した。血漿中濃度は L C一 M S ZM S法を用いて測定した。

(結果）

表 4に示す通り、化合物 1を 1 O m g単回経口投与時の C m a X及び A U Cは、 ABT- 627を 2 O m g投与時と比べて各々約 1 1倍及び約 1 8倍高い値を示した。表 4

)6^lh Inernational Conference on Endothelin, Oct 10-13, 1999, abstract No. 219 試験例 1の結果から、化合物 1がェンドセリン誘発性の疾患の疼痛緩和剤として有用であることが確認された。

試験例 2の結果から、化合物 1が造骨性の骨病変を改善し、造骨に伴う疼痛緩和剤として有用であることが確認された。

また試験例 2において、 ET- 1 は I X I O 'M程度の非常に低濃度から骨芽様細胞の細胞応答を引き起こすことが示された。ヒト前立腺癌細胞株の ET-l産生能に関する報告では約数十 pg/ml 10⁶cells/24hr の ET-1 産生が報告されている (Nat. Med. , 1 (9), 944-949, 1995)。この濃度は約 1 X】0 ¹Μにあたり、試験例 2の結果は、前立腺癌の骨転移患者の骨転移部位において、前立腺癌細胞から産生された ET-1が造骨性の骨病変を形成しうる可能性を強く示唆する知見である。試験例 2において、化合物 1は、 ΙΟηΜ付近の低濃度で骨芽様細胞の ΕΤ- 1 による細胞応答を抑制することが示された。よって化合物 1は、 ET- 1の関与が示唆されている前立腺癌患者の造骨性骨病変に対して改善効果を示すことが強く示唆された。更に試験例 1の結果を併せて考えると、化合物 1は、前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和剤として有用であることが強く示唆された。

また、試験例 5の結果によっても、化合物 1が前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和剤として有用であることが確認された。試験例 3及び 4の結果から、化合物 1がホルモン抵抗性の前立腺癌の癌細胞増殖抑制剤として有用であることが確認され、化合物 1は前立腺癌の進展抑制効果を示すことが強く示唆された。

また、試験例 5の結果によっても、化合物 1が前立腺癌の進展抑制剤として有効であることが確認された。更には、試験例 6において、化合物 1は公知 ET_A受容体拮抗剤として知られる ABT- 627の 1/2の用量で AUCが約 1 8倍と高く、化合物 1の経口投与時の経口吸収性及び薬物動態は特に優れていることが示唆された。ヒト £1 受容体に対する親和性 (K i値）は化合物 1が 0.697nM(W097/22595)、 ABT- 627が

0.48nM(J. Pharmacol. Exp. Ther. , 276, 473-481, 1996)とほぼ同等であるが、化合物 1は ABT- 627よりも優れた経口治療薬として期待される。

また、試験例 5において、化合物 1は 2mgの用量から有効性を示し、これは前立腺癌患者に対して 1 Omgの用量から有意な疼痛改善が報告された ABT - 627 (Proceedings of ASCO, Vol.19, 1314, 2000)の 1 /5の量であり、化合物 1は前立腺癌の優れた経口治療薬であることが確認された。産業上の利用可能性

本発明によれば、臨床において有効な優れた前立腺癌の経口治療薬を提供できる。即ち、癌（特に前立腺癌、乳癌）、関節炎、前立腺炎、神経膠腫、末梢動脈閉塞症、月経困難症、片頭痛、狭心症、急性心筋梗塞、脳梗塞、くも膜下出血、糖尿病性神経障害、リウマチ、緑内障、消化性潰瘍、出産時の陣痛等のエンドセリン誘発性疾患の疼痛緩和薬を提供することができる。また、造骨性病変の改善薬及び/又は造骨に伴う疼痛緩和薬、とりわけ、前立腺癌の骨転移による造骨性病変改善薬及び Z又は前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和薬を提供することができる。更に、前立腺癌の癌細胞増殖抑制薬及び Z又は前立腺癌の進展抑制薬を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. N— [6—メトキシー 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン誘発性疾患の疼痛緩和用医薬組成物。

2. エンドセリン誘発性疾患が前立腺癌である請求の範囲 1記載の医薬組成物。

3. N- [6—メトキシ一 5— （2—メトキシフエノキシ）一 2— （2—ピリミジニル）一 4—ピリミジェル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造骨性病変の改善用医薬組成物。

4. N- [6—メトキシ一 5— (2—メトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する造骨に伴う疼痛緩和用医薬組成物。

5. N— [6—メトキシ一 5— (2—メトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル） —4—ピリミジニル] — 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺癌の骨転移に伴う疼痛緩和用医薬組成物。

6. N— [6—メトキシー 5— （ 2—メトキシフエノキシ）一 2— （2—ピリミジニル）一 4一ピリミジニル] _ 2—フエニルェテンスルホンアミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺癌の骨転移による造骨性病変の改善用医薬組成物。

7. N— [6—メトキシ _ 5 _ ( 2—メトキシフエノキシ）一 2— （2—ピリミジニル）一 4—ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺癌の癌細胞増殖抑制用医薬組成物。

8. 前立腺癌がホルモン非依存性前立腺癌である請求の範囲 7記載の癌細胞増殖抑制用医薬組成物。

9. N— [6—メトキシ一 5— (2—メトキシフエノキシ）一 2— (2—ピリミジニル） —4—ピリミジニル] 一 2—フエニルェテンスルホンアミドまたはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺癌の進展抑制用医薬組成物。