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WO2000036127A1 - Procede pour augmenter la teneur en composes soufres et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues - Google Patents

Procede pour augmenter la teneur en composes soufres et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues Download PDF

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WO2000036127A1
WO2000036127A1 PCT/FR1999/003179 FR9903179W WO0036127A1 WO 2000036127 A1 WO2000036127 A1 WO 2000036127A1 FR 9903179 W FR9903179 W FR 9903179W WO 0036127 A1 WO0036127 A1 WO 0036127A1
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WO
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sat
plant
plants
cysteine
transit peptide
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Application number
PCT/FR1999/003179
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Michel Droux
Anne Lappartient
Richard Derose
Dominique Job
Original Assignee
Aventis Cropscience S.A.
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Publication date
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Definitions

  • Methionine is the first essential limiting amino acid in plants, in particular legumes, which are one of the bases of animal nutrition. Cysteine, another sulfur amino acid, is not an essential amino acid, but can be considered as a limiting element for animal nutrition since cysteine is derived, in animals, from methionine. In corn, sulfur amino acids are also limiting amino acids after lysine and tryptophan. In fact, the majority of reserve proteins in the seeds of these plants are poor in these amino acids. The overproduction of methionine and cysteine in the seeds of legumes (soybeans, alfalfa, peas, ...) and corn will therefore have a considerable impact on the nutritional quality of these seeds.
  • the increase in the nutritional quality of foods derived from legume seeds has been obtained by supplementation with chemically synthesized free methionine.
  • the average methionine + cysteine content of soybeans and peas is around 20 mg per g of protein. This content must be increased to a value of around 25 mg cysteine + methionine / g of protein to cover the dietary requirements of adult humans, and to a value of around 48 mg of cysteine + methionine / g of proteins to cover those of pigs (De Lumen, BO, Food Technology (1997) 51, 67-70).
  • plants overexpressing a protein rich in methionine and cysteine in their seed have a lower methionine, free cysteine and also glutathione level than the control plants ([ 2] Tabe, L. & Droux, M., 4 , h Workshop on Sulfur Metabolim, in press).
  • peptides rich in sulfur amino acids exhibiting antifungal or antibacterial activity have been identified (WO 97/30082, WO 99/02717, WO 9909184, WO 99/24594, WO 99/53053).
  • the expression of these peptides in plants increases the ability of said plants to resist certain fungal or bacterial attacks. Again, the production of such peptides in plants remains limited to the ability of plant cells and plants to produce the sulfur-containing amines necessary for the synthesis of these peptides. Indeed, the expression of these peptides in the plant cell is at the expense of the glutathione stock, considered as a reservoir for cysteine.
  • cysteine In plants, the biosynthesis of methionine is carried out from cysteine, this same cysteine being involved in the synthesis of glutathione.
  • Glutathione is a form of storage of reduced sulfur and represents 60 to 70% of organic sulfur in the cell. Glutathione plays an important role for plants in resistance against oxidative stress and the elimination of toxic compounds. It thus participates in the elimination of xenobiotic compounds: heavy metals (for example) via the formation of phytochelatins and metallothionines; herbicides, via glutathione S-transferase activity; which are toxic to the plant, and in the plant's defense mechanisms against microorganisms.
  • heavy metals for example
  • herbicides via glutathione S-transferase activity
  • glutathione S-transferase activity which are toxic to the plant, and in the plant's defense mechanisms against microorganisms.
  • cysteine two distinct pathways, one for the preparation of methionine, the other for the preparation of glutathione ( Figure 1) and the various enzymes involved are set out below.
  • the SAT (El) and OASTL (E2) activities are at a metabolic crossroads between the assimilation of nitrogen and organic carbon (serine) and inorganic sulfur (reduced sulfur resulting from the sequence of assimilation and reduction of sulphate , gray frame). Cysteine is then incorporated into proteins, but also participates in the synthesis of glutathione and methionine. For this last amino acid, the synthesis of its carbon skeleton (O- ph ⁇ sphohomoserine) is derived from aspartate.
  • the aspartate is also the precursor in the synthesis of lysine, threonine and isoleucine.
  • the diagram indicates the presence of a potential limiting step for the synthesis of methionine, by regulation at the transcriptional level of CGS (cystathionine ⁇ -synthase) ([3] Giovanelli J. in Sulfur Nutrition and Sulfur Assimilation in Higher Plants, (1990) pp. 33-48; [4] Chiba Y. & al. (1999), Science. 286, 1371-1374).
  • Methionine is the precursor of SAM (S-adenosylmethionine) involved in most methylation reactions, and of SMM (S-methylmethionine) considered as a form of transport and storage of methionine ([3]).
  • the enzymes E1 and E2 are present in the three compartments of the plant cell, that is to say, the plastids, the cytosol and the mitochondria (5-6, 9, 12). These three enzymes are called El SAT2 and SAT4 for the enzyme (putative) chloroplast, SAT1 to the mitochondrial enzyme, SAT3 and SAT3 (SAT52) for the cytoplasmic enzyme. These attributions of the locations are based on the analysis of the sequences. For the enzymes of methionine synthesis, the situation is different since the enzymes E3 and E4 are exclusively located in the plasts (10-1 1, 13-14, 16), while the terminal enzyme E5 is in the cytosol (20).
  • the enzymes associated with the glutathione biosynthetic pathway are localized in both the chloroplast and the cytosol ([21] Hell. R. and Bergmann. L .. Planta (1990) 180, 603-612).
  • the enzyme E3 from the methionine synthesis pathway has a ⁇ ' m (substrate concentration giving half the maximum speed) of the order of 200 ⁇ M to 500 ⁇ M for cysteine (10, 16, [ 22] Kreft, BD. & Al. Plant Physiol. (1 994) 104, 1215-1220).
  • the enzyme E6, from the glutathione synthesis pathway also has a high K m for cysteine, of the order of 200 ⁇ M [21].
  • the present invention therefore consists in increasing the level of cysteine and methionine synthesized in the cellular compartments of plant cells, and in particular in the chloroplastic compartment. Increase in cysteine levels.
  • Sulfur precursor of glutathione and methionine and its derivatives advantageously makes it possible to increase the level of methionine and / or glutathione in plant cells and plants, and subsequently to improve the production of proteins, natural or heterologous, enriched in sulfur amino acids in plant cells and plants, as well as plant tolerance to different stresses regulated by glutathione.
  • This increase according to the invention is obtained by overexpressing a Serine acetyltransferase (SAT) in plant cells and plants.
  • SAT Serine acetyltransferase
  • the present invention therefore relates to a process for increasing the production of cysteine, glutathione, methionine and their sulfur derivatives, by plant cells and plants, said method comprising overexpressing SAT in plant cells. and plants containing said plant cells.
  • the overexpressed SAT can be constituted by any SAT, whether it is of plant origin, in particular SAT2 or SAT4, SATl, SAT3, SAT3 ' (SAT52), or of any other origin, in particular bacterial, in a native or mutated form or deleted from a fragment, and functional in the synthesis of O-acetylserine.
  • SAT sensitive to cysteine can in particular be a SAT sensitive to cysteine.
  • a plant SAT for example a chloroplastic or mitochondrial SAT (SAT2.
  • SAT insensitive SAT in the cysteine
  • a SAT plant for example a cytoplasmic SAT (SAT-3), or an SAT of mutated bacterial, rendered insensitive cysteine mutaeénippoe J22] and [23] . the contents of which are incorporated here by reference
  • the SAT is a SAT of Arabidopsis thaliana [12].
  • the SAT is overexpressed in the cytoplasm of plant cells.
  • the SAT is either a plant cytoplasmic SAT, in particular SAT 3 (L34076) or SAT3 'or SAT52 (U30298). represented by SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2, respectively, or an SAT of bacterial origin as defined above.
  • SAT overexpressed in the cytoplasm can also be a non-cytoplasmic plant SAT. for example a chloroplastic or mitochondrial SAT.
  • non SAT cytoplasmic plant are naturally expressed in the cytoplasm in the form of a precursor protein comprising a signal targeting to different cell compartment of the cytoplasm wherein the functional mature SAT is released.
  • SAT protein overexpressed in the cytoplasm is a SAT of a non-cytoplasmic plant amputated from its address signal or signals to different cellular compartments of the cytoplasm.
  • the non amputated cytoplasmic SAT of its addressing signal is the LOAS 'represented by SEQ ID NO 3
  • the SAT is overexpressed in the mitochondria.
  • the protein is advantageously expressed in the cytoplasm in the form of a signal / S AT peptide fusion protein. the functional mature SAT being released inside the mitochondria.
  • the signal peptide mitochondrial addressing is advantageously constituted by at least a mitochondrial targeting signal peptide of a plant protein mitochondrial localization as the signal peptide subunit / 3-F1 ATPase tobacco [[25] Hemon P . & al. 1990, Plant Mol. Biol. 15, 895-904], or the signal peptide of SAT1 represented by amino acids 1 to 63 on SEQ ID NO 4.
  • mitochondrial SAT is the LOAS (U22964) represented by SEQ ID NO 4.
  • the SAT is overexpressed in the chloroplasts of plant cells.
  • the SAT will be expressed in chloroplasts by any appropriate means, in particular by any means known in the art and widely described in the prior art.
  • the SAT is --incommunée in chloroplasts by integration into the chloroplast DNA of a chimeric gene comprising a DNA sequence encoding said SAT, under the control of regulatory elements in 5 'and 3' functional in chloroplasts.
  • Techniques for inserting genes into chloroplasts, such as regulatory elements suitable for the expression of said genes in chloroplasts are well known to those skilled in the art, and in particular described in the following patents and patent applications: US 5,693,507, US 5,451, 513 and WO 97/32977.
  • the SAT is overexpressed in the cytoplasm in the form of a fusion protein transit peptide / SAT.
  • the transit peptide having the function of addressing the SAT to which it is fused towards the chloroplasts.
  • functional mature SAT being released within the chloroplast after cleavage at the chloroplast membrane.
  • SAT SAT can be a chloroplast of plant origin. like SAT2 or SAT4, represented by SAQ ID NO 5 or 6 respectively
  • SAT can also be a plant cytoplasmic SAT or SAT of bacterial origin as defined above.
  • SAT cytoplasmic also imply SAT non cytoplasmic amputated of their signal addressed to a different compartment of the cytoplasm as defined above.
  • Transit peptides their structures, modes of operation and their use in the construction of chimeric genes for the targeting of a heterologous protein in chloroplasts, as well as chimeric transit peptides comprising several transit peptides are well known from those skilled in the art and widely described in the literature. These include patent applications following: EP 189 707, EP 218 571 and EP 508 909. and the references cited in these patent applications, the content of which is incorporated here by reference
  • the SAT can be homologous or heterologous to the transit peptide.
  • the fusion protein is the SAT2 or SAT4 protein expressed naturally in the chloroplasts of plant cells.
  • the transit peptide may be a transit peptide of a SAT2, shown as amino acids 1 to 32 of SEQ ID 5, or the transit peptide of a SAT4. represented by amino acids 1 to 30 of SEQ ID NO 6, or else a transit peptide of another protein with plastid location, in particular the transit peptides defined below.
  • Protein localization by means plastid protein expressed in the cytoplasm of plant cells in the form of a fusion protein transit peptide / protein, the mature protein is localized in the chloroplast after cleavage of the transit peptide.
  • a plant EPSPS transit peptide is described in particular in patent application EP 218 571, while a plant ssu RuBisCO transit peptide is described in patent application EP 189 707.
  • the transit peptide also comprises, between the C-terminal part of the transit peptide and the N-terminal part of the SAT, a sequence part of the mature N-terminal part of a protein with plastid localization, this part of sequence generally comprising less than 40 amino acids of the N-terminal part of the mature protein, preferably less than 30 amino acids, more preferably between 15 and 25 amino acids.
  • Such transit peptide comprising a transit peptide fused to a portion of the N-terminal portion of a protein is located in plastids is in particular described in patent application EP 1 89 707, particularly for the transit peptide and part N-terminal of plant RuBisCO ssu.
  • the transit peptide also comprises, between the C-terminal part of the N-terminal part of the mature protein and the N-terminal part of the SAT, a second transit peptide of a vegetable protein with plastid localization.
  • this chimeric transit peptide comprising the association of several transit peptides is an optimized transit peptide (OTP) constituted by the fusion of a first transit peptide, with a sequence part of the mature N-terminal part d '' a protein with plastid localization, which is fused with a second transit peptide.
  • OTP optimized transit peptide
  • Such an optimized transit peptide is described in patent application EP 508 909, more particularly the optimized transit peptide comprising the transit peptide of the ssu RuBisCO of sunflower, fused to a peptide consisting of the 22 amino acids of the N-terminal part of the RuBisCO ssu of mature corn, fused to the transit peptide of the RuBisCO ssu of corn.
  • the present invention also relates to a transit peptide / SAT fusion protein. in which the SAT defined above is heterologous to the transit peptide, and in which the transit peptide consists of at least one transit peptide of a natural plant protein with plastid location as defined above.
  • nucleic acid sequence means a nucleotide sequence which may be of DNA or RNA type, preferably of DNA type, in particular double strand, whether it is of natural or synthetic origin, in particular a DNA sequence for which the codons coding for the fusion protein according to the invention will have been optimized as a function of the host organism in which it will be expressed, these optimization methods being well known to those skilled in the art.
  • nucleic acid sequence coding for a SAT is the use of a nucleic acid sequence coding for a SAT according to the invention defined above, in particular for cytoplasmic addressing.
  • mitochondrial or chloroplastic in a process for the transformation of plants, as a coding sequence making it possible to modify the content of cysteine, methionine and derivatives, and glutathione of transformed plants.
  • This sequence can of course also be used in association with other gene (s) marker (s) and / or coding sequence (s) for one or more other agronomic properties.
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) comprising a coding sequence as well as heterologous 5 ′ and 3 ′ regulatory elements capable of functioning in a host organism, in particular plant cells or plants, the coding sequence comprising at least a sequence of nucleic acid encoding an SAT as defined above.
  • host organism any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced. It is a question in particular of bacteria, for example E. coli, yeasts, in particular of the genera
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco, cotton, etc.
  • the regulatory elements necessary for the expression of acid sequence nucleic acid coding for a fusion protein according to the invention are well known to those skilled in the art depending on the host organism. They include in particular promoter sequences, transcription activators, terminator sequences, including start and stop codons. The means and methods for identifying and selecting the regulatory elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the invention relates more particularly to the transformation of plants.
  • promoter regulatory sequence in plants any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants can be used, in particular a promoter expressing in particular in the leaves of plants, such as for example so-called promoters of original origin.
  • bacterial, viral or vegetable or also so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit of a plant or any suitable known promoter which can be used.
  • promoters of plant origin promoters histone be mentioned as described in EP 0 507 698. or rice actin promoter (US 5,641, 876).
  • the promoters of a plant virus gene mention will be made of that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S). or the circovirus promoter (AU 689 31 1).
  • promoter regulatory sequence specific for particular regions or tissues of plants and more particularly seed-specific promoters ([26] Datla, R. & al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269 - 296), in particular the promoters of napine (EP 255 378), of phaseoline. glutenin, zein. heliantinin (WO 92/17580). of albumin (WO 98/45460), the oélosine (WO 98/45461). ATS 1 or 1 ⁇ TS3 (WO 99/20275).
  • promoter regulatory sequence other regulatory sequences which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators (“enhancer”), such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644. or the tobacco etch virus (VTE) described by Carrington & Freed.
  • transcription activators such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644. or the tobacco etch virus (VTE) described by Carrington & Freed.
  • any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the terminator nos dAgrobaclerium tumefaciens, or of plant origin, such as for example a histone terminator as described in application EP 0 633 317, can be used.
  • the present invention relates also a cloning and / or expression vector for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene as defined above.
  • This vector also comprises the above chimeric gene. at least one origin of replication.
  • This vector may comprise a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention.
  • transformation vectors according to the host organism to be transformed are well known in the art and widely described in the literature.
  • it s' will include a virus that can be used for the transformation of developed plants and further containing its own elements for replication and expression.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the chimeric gene according to the invention may be employed in combination with a selectable marker gene, either in a single vector, both genes being associated convergently, divergently or collinear, or in two vectors employed simultaneously for the transformation of the host organism.
  • selectable marker genes include the antibiotic resistance genes, the herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for easily identifiable enzymes such as the enzyme GUS (or GFP , * 'Green Fluorescent Protein "), genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells.
  • selection marker genes are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • the invention also relates to a transforming host organisms method, in particular plant cells by integration of at least a sequence of nucleic acid or a chimeric gene as defined above, which transformation may be obtained by any appropriate known means, fully described in the specialized literature and in particular the references cited in the present application, more particularly by the vector according to the invention.
  • a series of methods involves bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted in a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods can be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation in PEG.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular the plant cell or the plant.
  • the present invention also relates to host organisms, in particular plant cells or plants, transformed and containing a chimeric gene defined above.
  • the present invention also relates to plants containing cells transformed, especially plants regenerated from transformed cells.
  • the regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to the transformed plants resulting from the culture and / or the crossing of the regenerated plants above, as well as the seeds of transformed plants.
  • the transformed plants obtainable according to the invention can be of the monocotyledon type such as for example cereals, sugar cane, rice and corn or dicotyledons such as for example tobacco, soybeans, rapeseed, cotton, beet, clover, etc.
  • the plants transformed according to the invention may contain other genes of interest, conferring on plants new agronomic properties.
  • genes conferring new agronomic properties on transformed plants there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring tolerance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases.
  • Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • Mention may also be made of the genes modifying the constitution of the modified plants, in particular the content and quality of certain essential fatty acids (EP 666 91 8) or also the content and quality of the proteins, in particular in the leaves and / or seeds of said plants.
  • proteins enriched in sulfur amino acids [1]; WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/3 1554; WO 94/20828; WO 92/14822, US 5,939,599 , US 5,912,424).
  • These proteins enriched in sulfur amino acids will also have the function of trapping and storing cysteine and / or excess methionine, making it possible to avoid the possible problems of toxicity linked to an overproduction of these sulfur amino acids by trapping them.
  • genes of interest may be combined with the chimeric gene according to the invention or by conventional crossing two plants each containing one of the genes (the first chimeric gene of the invention and the second gene coding for the protein interest) or by performing the transformation of plant cells of a plant containing the gene encoding the protein of interest with the chimeric gene of the invention.
  • the three subcellular compartments corresponding to the cytosol are prepared from pea leaves (preparation from a subcellular fractionation of pea protoplasts. [12]). mitochondria and chloroplasts [12]. Soluble proteins are extracted therefrom and the serine acetyltransferase activity present in each of the compartments is measured using a technique described [12, 17].
  • the activity of the serine acetyltransferase is measured by high performance liquid chromatography (HPLC), by assaying the O-acetylserine formed during the reaction (reaction 1), after derivatization with orthophthalaldehyde (OPA).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • OPA orthophthalaldehyde
  • a defined amount of the protein extract. corresponding to cytosol. and to the various soluble fraction of chloroplasts (stroma) and mitochondria (matrix) is desalted on a PD10 column (Pharmacia) previously equilibrated in 50 mM Hepes-HCl buffer, pH 7.5 and 1 mM EDTA.
  • the enzymatic reaction is carried out in the presence of 50 mM Hepes-HCl, pH 7.5, ImM dithiotreitol, 10 mM L-serine. 2.5 mM acetyl-CoA, in a reaction volume of 100 ⁇ l, at 25 ° C. After 10 to 15 min of incubation, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ l of 20% trichloroacetic acid (W / V). The proteins thus precipitated are then removed by centrifugation for 2 min at 15,000 g.
  • the supernatant, containing the reaction product (OAS), is mixed with 500 ⁇ l of a derivatization solution (54 mg of OPA dissolved in 1 ml of absolute ethanol, 9 ml of a borate -NaOH 400 solution mM, pH 9.5 and 0.2 ml of 14 M ⁇ -mercaptoethanol) and incubated for 2 min.
  • a fraction of this mixture (20 ⁇ l) is injected onto a reverse phase column (AccQ Tag CJS column, 3.9 X 150 mm, Waters) connected to an HPLC system.
  • the buffers used for the elution of the compounds derived from OPA are: Buffer A, 85 mM sodium acetate, pH 4.5, and 6% acetonitile (V / V), pH 4.5; Buffer B. acetonitrile. 60% (VV) in water.
  • O-acetylserine, derived by OPA is eluted by a continuous linear gradient of buffer B in buffer A from 25 to 70% (V / V), and detected by fluorescence at 455 nm (excitation at 340 nm) .
  • the retention time of O-acetylserine is in our conditions of the order of 6.2 min, and the amount of product formed in the enzymatic tests is quantified from a standard curve produced with O-acetylserine.
  • the enzymatic tests have been optimized in order to respect the optimal pH of the reaction, the linearity as a function of time, and in order to operate in saturating concentrations of substrates.
  • the concentration of L-cysteine allowing the obtaining of 50% inhibition (IC50) under the standard conditions of the reaction calculated for different enzymatic preparations is shown in Table I.
  • the determinations of the enzymatic activity of the serine acetyltransferase and of the IC50 were carried out in 9 different experiments (stroma), and in 3 for cytosolic extracts and from the mitochondria.
  • the activity of the serine acetyltransferase of the chloroplast of spinach leaves is sensitive to cysteine.
  • Arabidopsis thaliana it appears that only the activity of the isoform associated with the cytosolic compartment is controlled by the level of cysteine ([27] Mr. Noji et al., 1998, J.
  • the inhibition constant K ⁇ was estimated to be around 30 (+ 2.2) ⁇ M (variable substrate serine), and 22 ( ⁇ 2 ⁇ M) (variable substrate: acetyl- CoA).
  • cysteine is an inhibitor of non-competitive type for serine acetyltransferase activity and moreover of allosteric type (Hill constant of the order of 1.6 ⁇ 0.3 ⁇ M) using kinetic equations.
  • classics [29] Segel, IH (1995), John Wiley and Sons, New York).
  • Serine acetyltransferase of the plant cell such as its bacterial homologous forms an enzymatic complex with o-acetylserine (thiol) lyase, the enzyme which catalyzes the condensation of the sulfur with reduced O-acetylserine.
  • This bienzymatic complex is called cysteine synthase.
  • All of the chloroplast serine acetyltransferase exists in a complex form with O-acetylserine (thiol) lyase, while the majority of O-acetylserine (thiol) lyase is in the free form.
  • the distribution of each of these enzymes in each of the subcellular compartments of pea leaves is described in Table II.
  • the ratio of the activity o-acetylserine (thiol) lyase ( ⁇ ASTL) by serine acetyltransferase activity (SAT) accounts for the large excess of OASTL on the SAT.
  • ⁇ ASTL activity o-acetylserine
  • SAT serine acetyltransferase activity
  • O-acetylserine the reaction product of serine acetyltransferase, dissociates this bienzymatic complex, and sulfur tends to stabilize it [14].
  • These protein-protein interactions within the complex confer new properties on each of the enzymes, in particular the serine acetyltransferase acquires new catalytic properties compared to the free form.
  • O-acetylserine (thiol) lyase complex is inactive in the synthesis of cysteine. and only the free form (in excess in the cell) catalyzes the synthesis of cysteine [14].
  • a chloroplastic fraction (Pisum sativum), previously incubated in the presence of an optimal concentration of cysteine (0J mM), leading to the inhibition of the serine acetyltransferase (see FIG. 2) is then subjected to a gel filtration chromatography allowing the separation molecules according to their molecular mass. Under these conditions the cysteine synthase complex dissociates into tetramers of serine acetyltransferase and dimers of O-acetylserine (thiol) lyase. The serine acetyltransferase chloroplast in its free form is always sensitive to inhibition by cysteine.
  • SAT serine acetyltransferase
  • ⁇ ASTL O-acetylserine
  • the functional cysteine synthase complex in the cell is represented by the association of two molecular populations.
  • cysteine the cysteine synthase complex fixes cysteine which modifies the protein-protein interactions within the cysteine synthase complex. and leads to dissociation into SAT tetramers and OASTL dimers.
  • SAT thus in its free form is also sensitive to cysteine, and we know that this structure tends to form aggregates (outside the cysteine synthase complex) and which result in a loss of its activity [14].
  • Example 2 Isolation and characterization of a gene coding for a putative cytoplasmic serine acetyltransferase isoform (SAT3) [12] The procedure described on page 502 of Ruffet & al. [12], in particular the chapters described under the titles "Bacterial strain and growth conditions” and "Isolation of A. thaliana serine acetyltransferase cDNA clones by complementation in E. coli". A gene coding for a putative cytosolic serine acetyltransferase (Z34888 or L34076) represented in FIG.
  • SAT3 putative cytoplasmic serine acetyltransferase isoform
  • the primers which were used for the amplification of the nucleotide sequence and its cloning into the vector used for the transformation of tobacco plants are the following: Oligo 1: 5 'GAGAGAGGAT CCTCTTTCCA ATCATAAACC ATGGCAACAT
  • GCATAGACAC ATGC 3 'Oligo 2 5' GGCTCACCAG ACTAATACAC TAAATTGTGT TTACCTCGAG
  • the N-terminus of the amino acid sequence of the SAT3 isoform does not have the characteristics of addressing peptides in an organelle (mitochondria or chloroplast). This analysis leads to suppose a cytosolic localization for this isoform [12]. The absence of a chloroplastic addressing peptide for this isoform could be confirmed during an import experiment in chloroplasts ([29]
  • the SAT 3 gene (L34076) has a structure without introns.
  • the protocol defined for the overexpression of the enzyme in E. coli allows the purification of the enzyme in its free form or in complex with the plant O-acetylserine (thiol) lyase, the cysteine synthase complex [14] .
  • the effect of cysteine on the activity of serine acetyltransferase was analyzed by a spectrophotometric assay based on the consumption of acetyl-CoA during reaction i, as a function of the incubation time. .
  • Example 3 The procedure of Example 3 is repeated with the following oligonucleotides 3 and 4:
  • Oligo 3 5 * GAGAGAGGAT ⁇ TCTTATCG CCGCGTTAAT ATGCCACCGG CCGGAGAACTC C 3 'Oligo 4: 5' GAGCCTTACC AGTCTAATGT AGTATATTTC AACCTCGAGA
  • GAGAG 3 'A gene coding for an acetyltransferase (U 30298) represented in FIG. 5 is isolated (SEQ ID NO 2).
  • SEQ ID NO 2 The structure of the N-terminal (absence of the necessary conditions allowing addressing in an organelle) indicates that this isoform has a cytosolic localization.
  • cysteine On the other hand, it is given sensitive to cysteine [27]. This result differs from the data obtained with pea (and spinach) leaves. in the sense that the cysteine regulatory site appears to be confined to the cytosol in A. thaliana. [27].
  • J. lhaliana has at least two cytosolic isolates: SAT3 (example 3) and SAT3 '(or U30298. Example 4).
  • the gene corresponding to SAT3 ' has an intron.
  • a gene coding for a serine acetyltransferase (L78443) represented in FIG. 6 (SEQ ID NO 3) was isolated by functional complementation of a strain of Escherichta coli deficient for the serine acetyltransferase activity. [12] Analysis of the primary sequence shows strong similarities with the sequence of the bacterial enzyme (52.1% homology and 39% identity).
  • the primers which were used for the amplification of the nucleotide sequence and its cloning in the vector used for the transformation of tobacco plants are the following:
  • Oligo 5 5 'GAGAGAGGAT ⁇ CCTCCTCC TCCTCCTCCT ATGGCTGCGT GCATCGACAC CTG 3'
  • Oligo 6 5 'GCTCACCAGC CTAATACATT AAACTTTTTC AGCTCGAGAG
  • AGAG 3 These primers allow the instruction of the restriction sites BamHI in 5' (GGATCC) and Sacl in 3 '(GAGCTC).
  • a second gene is obtained which codes for a putative mitochondrial serine acetyltransferase (U22964) represented in FIG. 7 (SEQ ID NO 4) by repeating the same procedure with oligo 7 in replacement of oligo 5 as primer in 5 '.
  • the N-terminal end of the amino acid sequence of the SAT1 isoform has the characteristics of addressing peptides in an organelle (mitochondria or chloroplast). Mitochondrial localization has recently been confirmed by the construction of a fusion protein including the 5 'portion and the "green fluorescent protein" (5'SAT1-GFP) and by the transformation of Arabidopsis thaliana plants [27].
  • the gene for SATl '(L78443) or SATl (U22964), like its counterpart (SAT3) does not have an intron.
  • the protocol defined for the overexpression of the enzyme in E. coli allows the purification of the enzyme (in its form without transit peptide, SAT L78443) in its free form or in complex with O-acetylserine (thiol ) plant lyase, the cysteine synthase complex [14].
  • the effect of cysteine on the activity of serine acetyltransferase was analyzed by a spectrophotometric assay based on the consumption of acetyl-CoA during reaction 1, as a function of the incubation time. (see example 3).
  • the analysis was also carried out by an assay of the reaction product (OAS) by HPLC (see example 1).
  • the mitochondrial fraction devoid of plastid and cytosolic contamination was obtained using the protocol defined for the mitochondria of pea leaves [12].
  • the molecular mass of the polypeptide revealed by the antibodies directed against the peptide [-TKTLHTRPLLEDLDR-] (see amino acid sequence of SATl) is of the order of 34,000 daltons, a value which is in agreement with the mass of the protein obtained by sequence analysis programs for predicting cleavage sites.
  • Example 3 The procedure described for Example 3 is repeated for the present example.
  • a gene coding for a serine acetyltransferase (L78444) represented in FIG. 8 (SEQ ID NO 5) was isolated by functional complementation of a strain of Escherichia coli deficient for the serine acetyltransferase activity.
  • SEQ ID NO 5 A gene coding for a serine acetyltransferase (L78444) represented in FIG. 8 (SEQ ID NO 5) was isolated by functional complementation of a strain of Escherichia coli deficient for the serine acetyltransferase activity.
  • Analysis of the primary sequence showed the presence of strong similarities with the sequence of the bacterial enzyme (49.5% homology and 35.4% identity).
  • the primers which were used for the amplification of the nucleotide sequence and its cloning into the vector used for the transformation of tobacco plants (in bold characters in FIG. 8 are the following:
  • Oligo 8 5 'GAGAGAGGAT CCGACAAGTT GGCATAATTT ATGGTGGATC TATCTTCCT 3' Oligo 9: 5'CCTGTGTGAT TGTCGTGTAG TACTCTAGAA
  • the primers which were used for the amplification of the nucleotide sequence and its cloning in the vector used for the transformation of tobacco plants are the following:
  • Oligo 10 5 'GAGAGAGGAT ⁇ GACAAGTTGG CATAATTTAT GGCTTGTATA
  • Oligo 11 5'TACCTCGTAC CACTCAGAAC TCTAGAAACT CGAGAGAGAG3 '
  • the analysis of the N-terminal portion of the sequence has characteristics for addressing the protein in an organelle (mitochondria or chloroplast).
  • the SAT 4 gene like that of SAT2, is complex and has several introns. Sequence comparison of the SAT4 with its counterparts in J. thaliana plants, and other organisms suggest an origin of prokaryotic-type ( Figure 10).
  • analysis of the N-terminal sequence using the ChloroP program http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorP/] indicates a high probability for the presence of a transit peptide chloroplastic type.
  • Figure 10 represents the comparison of the sequences, it was carried out using the Clustavv program (Vector NTI software).
  • SAT2 and SAT4 are closer to prokaryotic SATs than are SAT3, SATl and SAT52.
  • the branch also includes a red alga SAT (AB00848) identified as a protein with a chloroplastic localization and sensitive to cysteine ([32] Toda & al. 1998, Biochim. Biophys. Acta 1403. 72-84) .
  • SAT4 is identified on chromosome 4 (Bac clone F8D20, accession AL031 135).
  • Example 8 Constructions used for the transformation of tobacco plants - small Havanna variety Expression of the transgene in the leaves
  • Transformations of tobacco plants are carried out via Agrobacterium tuméfaciens EHA105, containing the vector pBI121 (Clonetch) ( Figures 1 1 and 12).
  • SAT3 or SATl 'OR any SAT insensitive to cysteine
  • a kanamycin resistance gene (NPTIl) coding for the neomycin phosphotransferase used as a selection marker for tobacco processing.
  • the expression of the NPTI1 gene is dependent on the promoter and the terminator of the nopaline synthase of A. tumefaciens. Downstream, the? -Glucuronidase gene cloned between the unique sites ZtamHl and Sacl, is under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the polyadenylation signal of the nopaline synthase gene from Ti plasmid.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • OTP-SAT3 construct is carried out between the Xho and Sacl sites of the deleted vector of the / - -glucuronidase gene (FIG. 11) SAT1, SAT3, SAT3'- SAT2, SAT4 or all SATs
  • NPTIl kanamycin resistance gene
  • the promoter constituting the tobacco mosaic will be replaced by a promoter which allows
  • the leaf discs are incubated for a few minutes with the agrobacteria solution and then transferred to MS medium (Sigma M-5519) supplemented with 0.05 mg / 1 of ⁇ -naphthalene acetic acid (NAA, Sigma). 2 mg / 1 of 6-benzylaminopurine (BAP) and 7 mg / 1 of phytoagar, for 2 to 3 days.
  • the leaf discs are then transferred to an identical medium to which are added 350 mg / l of cefotaxine (bacteriostatic) and 75 mg / l of kanamycin (selection agent).
  • the discs on which calluses have developed as well as young shoots are transplanted onto an identical medium in order to accelerate the growth of the shoots. A week later, the green shoots are excised and transferred to the same hormone-free medium, in order to allow the development of the roots, this for about 2 weeks, at the end of which the young plants are transferred to the ground and cultivated in the greenhouse.
  • Example 10 Analysis of the results for the transgenic plants SAT3 and SATl '(L78443) (truncated form of SATl U22964) and controls.
  • the determination of free methionine and SMM is carried out by the methods of determination of free amino acids after extraction and derivation by orthophthaldehyde and separation by HPLC ([34] Brunet, P. & al., J. Chrom. (1988 ) 455, 173-182).
  • the measurement of the activity of the serine acetyltransferase is carried out as described in the assay methodology for the O-acetylserine formed, by the HPLC technique, or by the coupling method in the presence of an excess of O-acetylserine. (thiol) lyase [12], [14].
  • the activity of the SAT transgene in transformed plants i.e. in vivo
  • the extracts are taken up in 0.1 M hydrochloric acid (1 ml / 100 mg of powder). After an incubation period of around 10 min, the debris is removed by centrifugation for 15 min at 15,000 g. A fraction of the supernatant obtained, containing the free amino acids is derivatized for 1 min at 25 ° C in the presence of a solution of ortho-phthalaldehyde (54 mg solution of ortho-phthalaldehyde, 10% methanol, 90% sodium borate 400 mM, pH 9.5, and 0.2 ml of /? - mercaptoethanol).
  • ortho-phthalaldehyde 54 mg solution of ortho-phthalaldehyde, 10% methanol, 90% sodium borate 400 mM, pH 9.5, and 0.2 ml of /? - mercaptoethanol.
  • the OPA-amino acid derivatives are then separated by reverse phase chromatography on a UPHDO-15M column (0.46 x 150 mm, Interchim) connected to an HPLC system (Waters).
  • the buffers used to carry out the elution are, Buffer A: sodium acetate, 85 mM, pH 4.5 supplemented with final 6% acetonitirile; buffer B: 60% acetonitrile in water.
  • the separation of the derivatives is carried out according to the gradient (1 ml / min): 0 min. 30% B in A; 8 min, 60% B in A; 9 min, 80% B in A; 10 min, 100% B; 12 min, 100% B.
  • the fluorescence emitted by the derivatives is measured at 455 nm after excitation at 340 nm (fluorimeter SFM25, Kontron).
  • the retention time of O-acetylserine under our experimental conditions is 9.5 min.
  • the identity of the peak corresponding to O-acetylserine is confirmed by co-elution with a known quantity of the pure product.
  • a second check was carried out to confirm the position of O-acetylserine in the various analyzes.
  • the samples, before incubation with the OPA, are previously treated with final 0.2 M NaOH. Under these conditions, the acetate function in the OH position of the serine is transferred to the amine function and thus allowing the formation of .V-acetylserine. The latter compound is no longer detected under our experimental conditions and therefore leads to the disappearance of the peak corresponding initially to O-acetylserine.
  • Plant analyzes include: 1; Demonstration of the transgene insertion in the genome by PCR using the primers 5 'and 3' corresponding to the SAT used for transformation; 2, as evidenced by an analysis of the messenger messengers using probes corresponding to the SAT transgenes used for the transformation of plants according to known techniques; 3, demonstration of the enzymatic activity associated with the SAT protein according to the methods described in the literature ([14]) and localization of the transgene; 4. dosage of the SAT reaction product, i.e.
  • O-acetylserine ( ⁇ AS) in transformed plants 5, determination of cysteine and its direct derivatives, glutathione and methionine (and its methylated derivatives); 5, analysis of the total amino acid composition of plants and seeds associated with each of the transgenes obtained (free amino acids and bound to proteins) according to traditional techniques; 6; analysis of the impact of over-e xpression of SAT activity in the plant cell on the content of enzymatic activity associated with the sulfur assimilation sequence (sulfate transporters, ATP-sulfurylase, APS reductase, sulfite reductase and in particular O-acetylserine (thiol) lyase, the enzyme directly associated with SAT activity for the synthesis of cysteine ([14]).
  • the enzymes associated with the synthesis sequence of methionine and glutathione are analyzed in order to account for the impact of the cysteine content on the metabolism associated with the synthesis of glutathione and methionine.
  • Expression of the Arabidopsis thaliana serine acetyltransferase gene in tobacco leads to an increase in the cysteine level, the glutathione level and the methionine level in the tissues of transformed plants compared to the control plants. In general, this increase in the content of free sulfur compounds is associated with the expression of the transgene in the plant cell (FIG. 13). The measurement is made in the leaves of 3 different plants of each homozygous line. The SAT activity is measured by its capacity to promote the synthesis of cysteine according to the protocol described above ([14]).
  • the expression of the transgene under the control of the constitutive promoter CaMV leads to increasing the capacity (the maximum potential enzymatic activity measured in vitro) of the SAT by a factor 2 to 8 compared to the level measured in the control plants (transformed plants with an empty vector).
  • a measure of the content o-acetylserine (free ⁇ AS) was performed.
  • the level of OAS in the plant cell average rate of 4 nmol / g fresh matter for the control plants, 6 independent measurements
  • the sub-cellular localization of the SAT1 '(truncated form of SAT1) and SAT3 transgenes in the transformed tobacco plants could be clarified by preparing the chloroplast fraction of the transformed plants having the highest enzymatic activity compared to the plants PBI (controls). The activity associated with the chloroplast compartment is compared with that measured in the total extract ( Figure 16).
  • the serine acetyltransferase activity values correspond to 3 lines for PBI (5 plants per line), 5 lines for SAT1 'and SAT3 represented by 5 plants each.
  • the columns in gray correspond to activities measured in total realized extracted from each of the lines, and black columns represent the average of the measured activity in each chloroplast preparations.
  • cysteine A direct consequence of the increased level of cellular cysteine results in increased synthesis of glutathione and methionine (see Figure 1).
  • the fate of cysteine is multiple and apart from its incorporation at the protein level, its participation in the synthesis of multiple compounds such as vitamins (biotin, thiamine, ... and other sulfur derivatives of the cell), cysteine also participates to the synthesis uu glutathione (t ⁇ peptide associated with many defense mechanisms of the plant and considered as a reservoir of cysteine) and methionine.
  • the level of glutathione is directly correlated to that of cysteine and results in an increase of 2 to 7 times the natural rate measured in controlled plants (PBI) ( Figure 17).
  • the correlation coefficient calculated for the distribution of points is 0.92.
  • a 4-fold increase in the content of Cysteine in transgenic tobacco plants overexpressing SAT results in a 3-4 fold increase in the level of glutathione.
  • the analysis was carried out with fully developed leaves (approximately 2 months) of plants homozygous for the transgene. Control plants are transformed plants with empty constructs. This result indicates that cysteine is the limiting factor for the synthesis of glutathione in the plant cell. Therefore, indirectly any modification of the level of serine acetyltransferase in the cell will result, via the increase in the level of cysteine, an increase in the content in intra-cellular glutathione. This result implies that the transgenic plants obtained have acquired stress resistance properties compared to the control plants (PBI).
  • cysteine and glutathione considered a reservoir leads to increased availability in the synthesis of polypeptides rich in cysteine (for example for resistance to plant pathogenic attacks) and cysteine rich in methionine (for animal feed)
  • the maximum shelf obtained under our experimental conditions is about 39 +/- 7 nmol / g fresh material methionine which corresponds to an increase of the average natural rate of about 6 +/- 2 per g material namole fresh (PBI control).
  • the maximum value obtained for methionine requires an increase in the cysteine content of the cell from 4 to 5 times its maximum level.
  • the regression coefficient is 0.50.
  • SMM S-methylmethionine
  • the SMM derives directly from methionine methylathion in the presence of S-adenosylmethionine.
  • This compound is important for the cell and is a form of transport of methyl groups (of methionine) in the plant.
  • homocysteine a sulfur precursor for the synthesis of methionine and cysteine derived
  • the MMS allows the synthesis of two molecules of methionine ([3], [35], & Bourgis al., 1999, Plant Cell 1 1 J 485-1497).
  • SMM is the direct precursor for the synthesis of a compound such as 3-dimethylsulfoniopropionate involved in the resistance of plants to salt stress ([36], Hanson AD & al., 1994, Plant PhysiolJ 05, 103-1 10) .
  • salt stress [36], Hanson AD & al., 1994, Plant PhysiolJ 05, 103-1 10) .
  • Such an approach has multiple consequences, in particular for increasing the potential of plants on soils rich in salts.
  • the serine acetyltransferase is considered a limiting factor for the sulfur assimilation and synthesis of cysteine. Its role in bacteria is important since the reaction product, (O-acetylserine. ⁇ AS) or its derivative (N-acetylserine) is the effector which modulates the expression of the genes of the sulfur assimilation sequence as : 1. transport of sulfate. 2, ATP sulfurylase. 3. APS kinase. And 4, PAPS reductase ([37], Kredich NM, 1987, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, pp. 419-428).
  • the equivalent amount of protein (50 mg) is subjected to an SDS-PAGE (12%) and after separation of the proteins, these are transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the presence of the OASTL is revealed by incubation with antibodies against OASTL chloroplast of leaf spinach ([7]).
  • the overexpression of SAT in the plant cell therefore leads to increasing the capacity to synthesize cysteine in the chloroplast. It is therefore safe to assume that the expression of the genes coding for the enzymes of the sulfate assimilation and reduction pathway (sulfate transporter, ATP sulfurylase, APS reductase, sulfite reductase) is also modulated like OASTL (and references [38-41]).
  • the increase in intracellular OAS content (which derives from the activity of
  • SAT signals an artificial state of sulfur stress (absence of sufficient reduced sulfur) to the cell (in transformed plants) which leads to inducing the enzymes of the sulfate assimilation pathway.
  • Example 12 Analysis of the results for the SAT1 transgenic plants (CDNA U22964 or SATlj, form with transit peptide) and controls.
  • the methionine content is multiplied by 2 to 3 times compared to the natural level measured in the control plants.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour augmenter la production de cystéine, de méthionine, de glutathion et de leurs dérivés par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les cellules végétales, et les plantes contenant lesdites cellules végétales.

Description

Procédé pour augmenter la teneur en composés soufrés et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues
La methionine est le premier acide aminé essentiel limitant chez les plantes, en particulier les légumineuses qui sont une des bases de l'alimentation animale. La cysteine, autre acide aminé soufré, n'est pas un acide aminé essentiel, mais peut être considérée comme un élément limitant pour la nutrition animale puisque la cysteine dérive, chez les animaux, de la methionine. Dans le maïs, les acides aminés soufrés sont aussi des acides aminés limitant après la lysine et le tryptophane. En effet les protéines de réserve majoritaires des graines de ces plantes, sont pauvres en ces acides aminés. La surproduction de methionine et de cysteine dans les graines des légumineuses (soja, luzerne, pois,...) et du maïs aura donc un impact considérable sur la qualité nutritionnelle de ces graines. Jusqu'à présent, l'augmentation de la qualité nutritionnelle des aliments dérivés des graines de légumineuses a été obtenue par complémentation avec de la methionine libre synthétisée chimiquement. Par exemple, les contenus moyens en methionine + cysteine du soja et du pois sont de l'ordre de 20 mg par g de protéines. Ce contenu doit être augmenté à une valeur de l'ordre de 25 mg cysteine + méthionine/g de protéines pour couvrir les besoins alimentaires de l'homme adulte, et à une valeur de l'ordre de 48 mg de cysteine + méthionine/g de protéines pour couvrir ceux des porcs (De Lumen, B.O., Food Technology (1997) 51 , 67-70).
Les techniques de caractérisation des protéines enrichies en acides aminés soufrés et la préparation de plantes transgéniques permettant l'expression de telles protéines, de manière à augmenter la teneur en acides aminés soufrés de ces plantes, et donc leur valeur nutritive pour l'alimentation animale, donc à diminuer l'apport en methionine de synthèse, sont maintenant bien connus et décrites dans la littérature([l ] orit, A.A. & al.. Eur. J. Biochem. (1991 ) 195, 329-334 ; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). L'enrichissement en protéines à fortes teneurs en acides aminés soufrés par une telle approche reste toutefois limité à la capacité des cellules végétales et des plantes à produire lesdits acides aminés soufrés nécessaire à la sythèse de la protéine. En effet, les plantes sur-exprimant une protéine riche en methionine et cysteine au niveau de leur graine, comme par exemple les lupins exprimant l'albumine 8 S, présentent un taux en methionine, cysteine libre et aussi glutathion inférieur aux plants témoins ( [2] Tabe , L. & Droux, M., 4,h Workshop on Sulphur Metabolim, sous presse).
De même, des peptides riches en acides aminés soufrés présentant une activité antifongique ou antibactérienne ont été identifiés (WO 97/30082, WO 99/02717, WO 9909184, WO 99/24594, WO 99/53053). L'expression de ces peptides dans les plantes permet d'augmenter la capacité des dites plantes à résister à certaines agressions fongiques ou bactériennes. Là encore, la production de tels peptides dans les plantes reste limitée à la capacité des cellules végétales et des plantes à produire les aminés soufrés nécessaires à la synthèse de ces peptides. En effet, l'expression de ces peptides dans la cellule végétale se fait au détriment du stock de glutathion, considéré comme un réservoir pour la cysteine.
Or, on a constaté que le paramètre limitant d'une telle approche est bien lié à cette capacité à produire de la methionine ou de la cysteine. Il est donc important de pouvoir modifier dans les plantes cette capacité à produire de la methionine et de la cysteine en quantités suffisantes pour permettre la production de protéines hétérologues à haute teneur en acides aminés soufrés, c'est à dire de mettre en œuvre une stratégie moléculaire visant à augmenter les taux de cysteine et de methionine chez les plantes, et plus particulièrement les plantes de culture d'intérêt agronomique.
Chez les plantes, la biosynthèse de methionine est effectuée à partir de la cysteine, cette même cysteine étant impliquée dans la synthèse du glutathion.
Le glutathion est une forme de stockage du soufre réduit et représente 60 à 70% du soufre organique dans la cellule. Le glutathion joue un rôle important pour les plantes dans la résistance contre les stress oxydatifs et l'élimination des composés toxiques. Il participe ainsi à l'élimination des composés xénobiotiques: des métaux lourds (par exemple) via la formation des phytochélatines et des métallothionines; des herbicides, via l'activité glutathion S-transférase; qui sont toxiques pour la plante, et dans des mécanismes de défenses de la plante contre les micro-organismes. En augmentant la teneur en cysteine d'une plante, et par conséquence sa teneur en glutathion, il est alors possible de moduler la réponse de la plante aux différents stress cités ci-dessus.
Il existe donc à partir de la cysteine. deux voies métaboliques distinctes, l'une pour la préparation de la methionine, l'autre pour la préparation du glutathion (Figure 1 ) et dont les différentes enzymes impliquées sont rappelées ci-après. Les activités SAT (El) et OASTL (E2) sont à un carrefour métabolique entre l'assimilation de l'azote et du carbone organique (serine) et du soufre inorganique (soufre réduit issue de la séquence d'assimilation et de réduction du sulfate, cadre grisé). La cysteine est ensuite incorporée dans les protéines, mais aussi participe à la synthèse du glutathion et de la methionine. Pour ce dernier acide aminé, la synthèse de son squelette carbonée (O- phυsphohomoserine) dérive de l'aspartate. L'aspartate est aussi le précurseur à la synthèse de la lysine, de la thréonine et de l'isoleucine. D'autre part est indiquée sur le schéma la présence d'une étape limitante potentielle pour la synthèse de la methionine, par la régulation au niveau transcriptionnelle de la CGS (cystathionine γ-synthase) ([3] Giovanelli J. in Sulfur Nutrition and Sulfur Assimilation in Higher Plants, (1990) pp. 33-48 ; [4] Chiba Y. & al. (1999), Science. 286, 1371-1374). La methionine est le précurseur du SAM (S-adenosylméthionine) impliqué dans la plupart des réactions de méthylations, et du SMM (S-méthylméthionine) considéré comme une forme de transport et de stockage de la methionine ([3]).
Chez les plantes les étapes finales de synthèse de la cysteine impliquent les deux enzymes suivantes :
El) Serine acétyltransférase (EC 2.3.1.30) (SAT):
Serine + acétyl-Coenzyme A *- O-acétylsérine + Coenzyme A
E2) 0-acétylsérine (thiol) lyase (EC 4.2.99.8) (OASTL):
O-acétylsérine + sulfide *"- cysteine + acétate La synthèse de la methionine à partir de la cysteine implique une succession des trois enzymes suivantes :
E3) cystathionine ^-synthase (EC 4.2.99.9) (CGS) : iJ-phosphohomosérine + cysteine ^~ cystathionine -*- Pi
Pi signifie phosphate inorganique. E4) cystathionine / yase (EC 4.4.1.8) (CBL) : cystathionine + HoO • - homocystéine + pyruvate + NH4 "
E5) methionine synthase (EC 2.1.1.14) (MS) : homocystéine + 5-méthyItétrahydrofolate •»- methionine + tétrahydrofolate
La synthèse du glutathion à partir de la cysteine implique pour sa part une succession des deux enzymes suivantes :
E6) γ-glutamylcystéine synthéthase (EC 6.3.2.2) glutamate + L-cystéine + ATP *~ γ-glutamylcystéine + ADP + Pi
E7) glutathion synthéthase (EC 6. 3.2.3) γ-glutamylcystéine + glycine + ATP *~ glutathion+ ADP + Pi
Toutes ces enzymes ont été caractérisées et clonées chez les plantes ([5 ] Lunn, J.E. & al.. Plant Physiol. (1990) 94, 1345-1352 ; [6 ] Rolland, N & al.. Plant Physiol. (1992) 98, 927-935 ; [ 7 ] Droux, M. & al, Arch. Biochem. Biophys. (1992) 295, 379- 390 ; [ 8 ] Rolland, N. & al., Arch. Biochem ( 1993) 300, 213-222 ; [9 ] Ruffet. M.L. & al.. Plant Physiol. (1994) 104, 597 - 604 ; [10 ] Ravanel. S. & al.. Arch. Biochem. Biophys. (1995) 316, 572 - 5584 ; [ 1 1] Droux, M.& al, Arch. Biochem. Biophys. (1995) 31, 585 - 595 ; [12 ] Ruffet, M.L. & al., Eur. J. Biochem. (1995) 227, 500 - 509 ; [13] Ravanel, S. & al., Biochem. J. (1996) 320, 383 - 392 ; [14] Ravanel, S. & al., Plant Mol. Biol. (1996) 29, 875 - 882 ; [15 ] Rolland, N. & al., Eur. J. Biochem. (1996) 236, 272 - 282 ; [16 ] Ravanel, S. & al., Biochem. J. (1998) 331 , 639-648 ; [17 ] Droux. M & al., Eur. J. Biochem. (1998) 255, 235-245 ; [18 ] May, M.L, Leaver, C.J.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 , 10059- 10063 ; [19 ] Ullmann, P. & al., Eur. J. Biochem. (1996) 236, 662-669 ; [20 ] Eichel, J. & al., Eur. J. Biochem. (1995) 230, 1053-1058).
On sait que pour la synthèse de cysteine. les enzymes El et E2 sont présentes dans les trois compartiments de la cellule végétale, c'est-à-dire, les plastes, le cytosol et les mitochondries (5-6, 9, 12). Ces trois enzymes El sont dénommées SAT2 et SAT4 pour l'enzyme (putative) chloroplastique, SAT1 pour l'enzyme mitochondriale , SAT3 et SAT3' (SAT52) pour l'enzyme cytoplasmique. Ces attributions des localisations sont basée sur l'analyse des séquences. Pour les enzymes de la synthèse de la methionine, la situation est différente puisque les enzymes E3 et E4 sont exclusivement localisées dans les plastes ( 10-1 1 , 13- 14, 16), alors que l'enzyme terminale E5 est dans le cytosol (20).
Les enzymes associées à la voie de biosynthèse du glutathion sont pour leur part localisées à la fois dans le chloroplaste et le cytosol ([21 ] Hell. R. and Bergmann. L.. Planta (1990) 180, 603-612).
L'enzyme E3, de la voie de synthèse de la methionine, présente un λ' m (concentration en substrat donnant la moitié de la vitesse maximum) de l'ordre de 200 μM à 500 μM pour la cysteine ( 10, 16, [22] Kreft. B-D. & al.. Plant Physiol. ( 1 994) 104, 1215-1220). L'enzyme E6, de la voie de synthèse du glutathion, présente aussi un Km élevé pour la cysteine, de l'ordre de 200 μM [21 ].
On a maintenant constaté que l'enzyme serine acetyltransferase chloroplastique
(Figure 2) et à un moindre niveau la SAT mitochondriale étaient inhibées par la cysteine. contrairement à l'enzyme cytoplasmique (Figure 2). cette inhibition constituant le facteur limitant essentiel de la synthèse de cysteine dans les cellules végétales, et en aval de la methionine et du glutathion.
La présente invention consiste donc à augmenter le taux de cysteine et de methionine synthétisées dans les compartiments cellulaires des cellules végétales, et notamment dans le compartiment chloroplastique. L'augmentation du taux de cysteine. précurseur soufré du glutathion et de la methionine et ses dérivés, permet avantageusement d'augmenter le taux de methionine et/ou de glutathion dans les cellules végétales et les plantes, et subséquemment d' améliorer la production de protéines, naturelles ou hétérologues, enrichies en acides aminés soufrés dans les cellules végétales et les plantes, de même que la tolérance des plantes aux différents stress régulés par le glutathion.
Cette augmentation selon l'invention est obtenue en surexprimant une Serine acetyltransferase (SAT) dans les cellules végétales et les plantes.
La présente invention concerne donc un procédé pour augmenter la production de cysteine, glutathion, methionine et leurs dérivés soufrés, par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les cellules végétales. et des plantes contenant les dites cellules végétales.
La SAT surexprimée peut être constituée par toute SAT, qu'elle soit d'origine végétale, notamment SAT2 ou SAT4, SATl, SAT3 , SAT3' (SAT52), ou de toute autre origine, notamment bactérienne, sous une forme native ou mutée ou délétée d'un fragment, et fonctionnelle dans la synthèse de l' O-acétylserine.
Elle peut notamment être une SAT sensible à la cysteine. comme par exemple une SAT de plante, par exemple une SAT chloroplastique ou mitochondriale (SAT2.
SAT4, SATl), ou une SAT native d'origine bactérienne ([22] Nakamori & al.. 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64, 1607- 161 1 ; [23] Takagi H. & al., 1999, Febs Lett. 452.
323-327 ; [24], Mino K. & al., 1999, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 168-179).
Elle peut aussi être une SAT insensible à la cysteine, comme par exemple une SAT de plante, par exemple une SAT cytoplasmique (SAT3), ou une SAT d'origine bactérienne mutée, rendue insensible à la cysteine par mutaeénèse J22] et [23]. dont les contenus sont incorporés ici par référence), ou toute SAT de plantes mutée et fonctionnelle dans la synthèse de l'O-acétylsérine ( le précurseur carboné pour la synthèse de la cysteine).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT est une SAT d'Arabidopsis thaliana [12]. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans le cytoplasme des cellules végétales. La SAT est soit une SAT cytoplasmique de plante, en particulier la SAT 3 (L34076) ou SAT3' ou SAT52 (U30298). représentée par la SEQ ID NO 1 ou la SEQ ID NO 2 respectivement, ou une SAT d'origine bactérienne telle que définie ci-dessus. La SAT surexprimée dans le cytoplasme peut également être une SAT de plante non cytoplasmique. par exemple une SAT chloroplastique ou mitochondriale. Ces SAT non cytoplasmiques de plante sont naturellement exprimées dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine précurseur comprenant un signal d'adressage vers le compartiment cellulaire différent du cytoplasme dans lequel la SAT mature fonctionnelle est libérée. Pour surexprimer ces SAT fonctionnelles matures dans le cytoplasme, on les ampute de leur signal d'adressage. Dans ce cas. la protéine SAT surexprimée dans le cytoplasme est une SAT de plante non cytoplasmique amputée de son ou ses signaux d'adressage vers des compartiments cellulaires différents du cytoplasme.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT non cytoplasmique amputée de son signal d'adressage est la SATl ' représentée par la SEQ ID NO 3
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans les mitochondries. La protéine est avantageusement exprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide signal/S AT. la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l'intérieur des mitochondries. Le peptide signal d'adressage mitochondrial est avantageusement constitué par au moins un peptide signal d'adressage mitochondrial d'une protéine végétale à localisation mitochondriale, comme le peptide signal de la sous unité /3-F1 ATPase de tabac [[25] Hemon P. & al. 1990, Plant Mol. Biol. 15, 895-904], ou le peptide signal de la SATl représenté par les acides aminé 1 à 63 sur la SEQ ID NO 4.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT mitochondriale est la SATl (U22964) représentée par la SEQ ID NO 4.
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans les chloroplastes des cellules végétales.
La SAT sera exprimée dans les chloroplastes par tout moyen approprié, en particulier par tout moyen connu de l'homme du métier et largement décrit dans l'état de la technique.
Selon un mode particulier de réalisation de l"in\ ention, la SAT est --inexprimée dans les chloroplastes par intégration dans l'ADN chloroplastique d'un gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite SAT, sous le contrôle d'éléments de régulations en 5' et 3 ' fonctionnels dans les chloroplastes. Les techniques d'insertion de gènes dans les chloroplastes, comme les éléments de régulations appropriés à l'expression desdits gènes dans les chloroplastes sont bien connus de l'homme du métier, et notamment décrits dans les brevets et demandes de brevet suivants : US 5,693.507, US 5.451 ,513 et WO 97/32977.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/SAT. le peptide de transit ayant pour fonction d'adresser la SAT à laquelle il est fusionné vers les chloroplastes. la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l 'intérieur des chloroplastes après clivage au niveau de la membrane chloroplastique.
Dans ce cas. la SAT peut être une SAT chloroplastique d'origine végétale. comme la SAT2 ou la SAT4, représentée par la SAQ ID NO 5 ou 6 respectivement
La SAT peut également être une SAT cytoplasmique d'origine végétale ou une SAT d'origine bactérienne telles que définies précédemment. Dans les SAT cytoplasmique on entend également les SAT non cytoplasmiques amputées de leur signal d'adressage vers un compartiment différent du cytoplasme telles que définies précédemment.
Les peptides de transit, leurs structures, leurs modes de fonctionnement et leur utilisation dans la construction de gènes chimères pour l'adressage d'une protéine hétérologue dans les chloroplastes, ainsi que des peptides de transit chimères comprenant plusieurs peptides de transit sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera notamment les demandes de brevet suivants : EP 189 707, EP 218 571 et EP 508 909. et les références citées dans ces demandes de brevet, dont le contenu est incorporé ici par référence
Dans la protéine de fusion selon l'invention, la SAT peut être homologue ou hétérologue du peptide de transit. Dans le premier cas, la protéine de fusion est la protéine SAT2 ou la SAT4 exprimée naturellement dans les chloroplastes des cellules végétales. Dans le second cas, le peptide de transit peut être un peptide de transit d'une SAT2, représentée par les acides aminés 1 à 32 de la SEQ ID 5, ou le peptide de transit d'une SAT4. représenté par les acides aminés 1 à 30 de la SEQ ID NO 6, ou encore un peptide de transit d'une autre protéine à localisation plastidiale, notamment les peptides de transit définis ci-après. On entend par protéine à localisation plastidiale une protéine exprimée dans le cytoplasme des cellules végétales sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/protéine, la protéine mature étant localisée dans le chloroplaste après clivage du peptide de transit.
Un peptide de transit d'EPSPS de plante est notamment décrit dans la demande de brevet EP 218 571 , alors qu'un peptide de transit de ssu RuBisCO de plante est décrit dans la demande de brevet EP 189 707.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de transit comprend également, entre la partie C-terminale du peptide de transit et la partie N-tcrminale de la SAT une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, cette partie de séquence comprenant généralement moins de 40 acides aminés de la partie N-terminale de la protéine mature, de préférence moins de 30 acides aminés, plus préférentiellement entre 15 et 25 acides aminés. Un tel peptide de transit comprenant un peptide de transit fusionné à une partie de la partie N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale est notamment décrit dans la demande de brevet EP 1 89 707, plus particulièrement pour le peptide de transit et la partie N-terminale de ssu RuBisCO de plante.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de transit comprend également entre la partie C-terminale de la partie N-terminale de la protéine mature et la partie N-terminale de la SAT un deuxième peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale. Préférentiellement, ce peptide de transit chimère comprenant l'association de plusieurs peptide de transit est un peptide de transit optimisé (OTP) constitué par la fusion d'un premier peptide de transit, avec une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, laquelle est fusionnée avec un deuxième peptide de transit. Un tel peptide de transit optimisé e->t décrit dans la demande de brevet EP 508 909, plus particulierèrement le peptide de transit optimisé comprenant le peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol, fusioné à un peptide constitué par les 22 acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs mature, fusioné au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs. La présente invention concerne également une protéine de fusion peptide de transit/SAT. dans laquelle la SAT définie plus haut est hétérologue du peptide de transit, et dans laquelle le peptide de transit est constitué par au moins un peptide de transit d'une protéine végétale naturelle à localisation plastidiale tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/SAT décrite ci-dessus. Selon la présente invention, on entend par " séquence d'acide nucléique "' une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin, qu'elle soit d'origine naturelle ou synthétique, notamment une séquence d'ADN pour laquelle les codons codant pour la protéine de fusion selon l'invention auront été optimisés en fonction de l'organisme hôte dans lequel elle sera exprimée, ces méthodes d'optimisations étant bien connues de l'homme du métier.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour une SAT selon l'invention définie précédemment, en particulier pour un adressage cytoplasmique. mitochondrial ou chloroplastique, dans un procédé pour la transformation des plantes, comme séquence codante permettant de modifier le contenu en cysteine, methionine et dérivés, et glutathion des plantes transformées. Cette séquence peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre(s) gène(s marqueur(s) et/ou séquence(s) codante(s) pour une ou plusieurs autres propriétés agronomiques.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une SAT telle que définie précédemment.
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres
Saccharomyces ou Kluyve omyces, Pichia. de champignons, en particulier Aspergillus. d'un baculovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicelluluiie différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698. ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641 ,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S). ou le promoteur du circovirus (AU 689 31 1).
On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ([26 ] Datla, R.& al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269- 296), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline. de la glutenine, de la zéine. de l'héliantinine (WO 92/17580). de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461 ). de l'ATS l ou de 1ΑTS3 (WO 99/20275). Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644. ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation. on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos dAgrobaclerium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus. au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
Pour la transformation des organismes hôtes, le gène chimère selon l'invention peut être employé en association avec un gène marqueur de sélection, soit dans un même vecteur, les deux gènes étant associés de manière convergente, divergente ou colinéaire, ou encore dans deux vecteurs employés simultanément pour la transformation de l'organisme hôte. De tels gènes marqueurs et leur utilisation pour la transformation d'organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS (ou GFP, *' Green Fluorescent Protein "), des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071 , WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti dAgrobacterium tumefaciens ou Ri dAgrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au
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en de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant un gène chimère défini ci-dessus. La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475. US 5,464,763, US 5, 177,010, US 5,187,073, EP 267, 159, EP 604 662, EP 672 752. US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371 ,014, US 5,478,744. US 5.179.022. US 5,565,346, US 5,484,956, US 5.508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318. US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc
Les plantes transformées selon l'invention peuvent contenir d'autres gènes d'intérêt, conférant aux plantes de nouvelles propriétés agronomiques. Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une tolérance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies . De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91 /02071 et WO 95/06128. On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 91 8) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés ([1 ]; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/3 1554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822, US 5 939 599, US 5 912 424). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cysteine et/ou la methionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant.
On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéincs, les dits peptides a\ ant égalemem une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et WO 99/09189), la drosomicine (WO 99/02717), la thanatine (WO 99/24594) ou l'héliomicine (WO 99/53053). Ces autres gènes d'intérêt peuvent être combinés au gène chimère selon l'invention soit par croisement conventionnel de deux plantes contenant chacune l'un des gènes (la première le gène chimère selon l'invention et la seconde le gène codant pour la protéine d'intérêt) soit en effectuant la transformation de cellules végétales d'une plante contenant le gène codant pour la protéine d'intérêt avec le gène chimère selon l'invention.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning. T.Maniatis, E.F.Fritsch. J.SambrookJ982.
Le contenu de toutes les références citées dans la description ci-dessus et dans les exemples ci-après est incorporé au contenu de la présente demande de brevet par référence.
Exemple 1. Mise en évidence de l'inhibition de la serine acetyltransferase chloroplastique de feuilles de pois (Pisum sativum) par la cysteine
On prépare à partir de feuilles de pois les trois compartiments subcellulaires correspondant au cytosol (préparation à partir d'un fractionnement subccllulaire de protoplastes de pois. [12]). aux mitochondries et aux chloroplastes [12]. On en extrait les protéines solubles et on mesure l'activité serine acetyltransferase présente dans chacun des compartiments au moyen d'une technique décrite [12, 17].
Description de la méthode de dosage:
L'activité de la serine acetyltransferase est mesurée par chromatographie liquide haute performance (HPLC), en dosant l'O-acétylserine formée au cours de la réaction (réaction 1), après dérivatization avec de l'orthophtalaldéhyde (OPA). Une quantité définie de l'extrait protéique. correspondant au cytosol. et aux différentes fraction.. solubles des chloroplastes (stroma) et mitochondries (matrice), est dessalé sur une colonne PD10 (Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon 50 mM Hepes-HCl, pH 7,5 et 1 mM EDTA. La réaction enzymatique est effectuée en présence de 50 mM Hepes-HCl, pH 7.5, ImM dithiotreitol, 10 mM L-serine. 2.5 mM acétyl-CoA, dans un volume réactionnel de 100 μl, à 25 °C. Après 10 à 15 min d'incubation, la réaction est arrêtée par l'addition de 50 μl d'acide trichloroacétique 20% (P/V). Les protéines ainsi précipitées sont ensuite éliminées par une centrifugation de 2 min à 15,000g. Le surnageant, contenant le produit de la réaction (OAS), est mélangé avec 500 μl d'une solution de dérivatization (54 mg d'OPA dissous dans 1 ml d'éthanol absolu, 9 ml d'une solution de borate -NaOH 400 mM, pH 9,5 et 0,2 ml de β-mercaptoethanol 14 M) et incubé pendant 2 min. Une fraction de ce mélange (20 μl) est injectée sur une colonne de phase inverse (colonne AccQ Tag C J S, 3,9 X 150 mm, Waters) connectée à un système HPLC. Les tampons utilisés pour l'élution des composés dérivés par l'OPA sont:Tampon A, 85 mM acétate de sodium, pH 4.5, et acétonitile 6% (V/V), pH 4,5; Tampon B. acétonitrile. 60 % (V V) dans de l'eau. L'O-acétylsérine, dérivée par l'OPA, est éluée par un gradient linéaire continu du tampon B dans le tampon A de 25 à 70 % (V/V), et détectée par fluorescence à 455 nm (excitation à 340 nm). Le temps de rétention de l'O-acétylserine est dans nos conditions de l'ordre de 6.2 min, et la quantité de produit formé dans les essais enzymatiques est quantifiée à partir d'une courbe étalon réalisée avec de l'O-acétylserine. Les essais enzymatiques ont été optimisés afin de respecter le pH optimal de la réaction, la linérarité en fonction du temps, et afin d'opérer dans des concentrations saturantes en substrats.
Effet de la cysteine sur l'activité serine acetyltransferase de feuilles de pois L'incubation (2 min) est réalisée en présence de l'extrait protéique (cytosol, matrice et stroma), et des concentrations croissantes de L-cystéine (de 0 à 1 mM), avant l'ajout de concentrations saturantes des substrats de la serine acetyltransferase, la L- serine ( 10 mM) et l'acétyl-CoA (2,5 mM). La réaction enzymatique et le dosage de l'O- acétylserine résiduelle dans le surnageant sont effectués comme décrit précédemment. Le résultat de ces expériences est représenté sur le graphe de la figure 2 en annexe.
Si on ajoute de la cysteine libre (de 0 à 1 mM, Figure 2) aux différents essais, on constate une très forte inhibition de l'activité serine acetyltransferase chloroplastique (constante d'inhibition de l'ordre de 30 μM). L'activité serine acetyltransferase mitochondriale est inhibée mais pour des concentrations supérieures de cysteine (constante d'inhibition de l'ordre de 300 μM). En revanche, l'activité serine acetyltransferase cytosolique est insensible à l'inhibition par la cysteine jusqu'à des concentrations de l'ordre de 1 mM (figure 2). Ce résultat prouve donc que seule l'activité serine acetyltransferase chloroplastique, donc l'enzyme associée à la voie de l'assimilation du sulfate, est inhibée par le produit final, la L-cysléinc. Tableau I: Détermination des activités spécifiques et des valeurs de CI50 pour la cysteine pour chacune des isoformes de la serine acetyltransferase.
Figure imgf000016_0001
La concentration en L-cystéine permettant l'obtention de 50% d'inhibition (CI50) dans les conditions standards de la réaction calculée pour différentes préparations enzymatiques est représentée dans le tableau I. Les déterminations de l'activité enzymatique de la serine acetyltransferase et de la CI50 ont été effectuées lors de 9 expériences différentes (stroma), et lors de 3 pour les extraits cytosolique et issus de la mitochondrie. De même, l'activité de la serine acetyltransferase du chloroplaste de feuilles d'épinards est sensible à la cysteine. A l'opposée, chez Arabidopsis thaliana il apparaît que seul l'activité de l'isoforme associée au compartiment cytosolique soit contrôlée par le niveau de cysteine ([27] Noji M. & al. 1998, J. Biol. Chem. 273, 32739-32745 ; [28] Inoue K. & al. 1999, Eur. J. Biochem. 266, 220-227). Pour ces auteurs, l'activité associée au compartiment chloroplastique est insensible à la cysteine. II semblerait donc que l'inhbition de l'activité serine acetyltransferase chloroplastique par la cysteine soit un phénomène plante-spécifique, mais en particulier très marquée chez les légumineuses comme le pois.
Etude du mode d'inhibition de l'activité serine acetyltransferase par la cvstéine La vitesse de la réaction enzymatique a été déterminée pour des concentrations fixes de cysteine (0 μM; 10 μM; 20 μM; 40 μM; 60 μM et 100 μM) en faisant varier soit la concentration en L-serine soit en acétyl-CoA. pour des concentrations saturantes du second co-substrat. Pour chacune des cinétiques obtenues, l'affinité de l'enzyme pour ces substrats ne semble pas être affectée, mais par contre la vitesse maximale de la réaction est modifiée. Plus la concentration en L-cystéine augmente, plus la vitesse de synthèse de l'O-acétylserine est diminuée. Pour chacune des conditions analysées, la constante d'inhibition K\ a été estimée de l'ordre de 30 (+ 2.2) μM (substrat variable la serine), et de 22 (± 2 μM) (substrat variable: l'acétyl-CoA). Nous avons pu montré que la cysteine est un inhibiteur de type non-compétitif pour l'activité serine acetyltransferase et de plus de type allostérique (constante de Hill de l'ordre de 1 ,6 ± 0,3 μM) en utilisant les équations cinétiques classiques ([29] Segel, I.H. (1995), John Wiley and Sons, New- York). Ces résultats indiquent que l'inhibition de l'enzyme chloroplastique prend place en un site différent du site actif, et de plus qui n'existe pas sur l'isoforme serine acetyltransferase, présente dans le cystosol.
Ces valeurs de constantes d'inhibition sont consistantes avec la concentration en cysteine déterminée dans les chloroplastes de pois de 40 ± 10 μM (2 nmoles / mg chlorophylle), valeur qui est calculée pour un volume du compartiment stromatique de l'ordre de 35 à 65 μl par mg de chlorophylle.
Dissociation du complexe bi-enzymatique, cysteine synthase, par la cysteine
La serine acetyltransferase de la cellule végétale, comme son homologue bactérien, forme un complexe enzymatique avec l'O-acétylserine (thiol) lyase, l'enzyme qui catalyse la condensation du soufre réduit avec l'O-acétylserine. Ce complexe bienzymatique est appelée cysteine synthase. Toute la serine acetyltransferase du chloroplaste existe sous une forme en complexe avec l'O-acetylserine (thiol) lyase, alors que la majorité de l'O-acetylserine (thiol) lyase est sous la forme libre. La distribution de chacune de ces enzymes dans chacun des compartiments sub-cellulaires de feuilles de pois est décrite dans le Tableau II.
Tableau II : Activité spécifique des activités serine acetyltransferase et O- acétylserine (thiol) lyase des compartiments cellulaires de feuilles de pois
Figure imgf000017_0001
Le rapport de l'activité O-acétylserine (thiol) lyase (ΟASTL) à l'activité serine acetyltransferase (SAT) rend compte du large excès de l'OASTL sur la SAT. En particulier dans le stroma (chloroplaste) où s'effectue l'assimilation et la réduction du sulfate, et dans le cytosol, 95% de l'activité OASTL est sous forme libre. Ces conditions sont nécessaires pour une synthèse optimale de la cysteine [14]. Le complexe cysteine synthase est composée d'un tctramère de serine acetyltransferase et de deux dimèics d' O-acétylserine (thiol) lyase. L'O-acétylserine, le produit de la réaction de la serine acetyltransferase, dissocie ce complexe bienzymatique, et le soufre tend à stabiliser celui-ci [14]. Ces interactions protéines-protéines au sein du complexe confèrent de nouvelles propriétés à chacunes des enzymes, en particulier la serine acetyltransferase acquière de nouvelles propriétés catalytiques comparativement à la forme libre. De plus. l'O-acetylserine (thiol) lyase en complexe est inactive dans la synthèse de la cysteine. et seul la forme libre (en excès dans la cellule) catalyse la synthèse de la cysteine [14].
Une fraction chloroplastique (Pisum sativum), préalablement incubée en présence d'une concentration optimale de cysteine (0J mM), conduisant à l'inhibition de la serine acetyltransferase (voir figure 2) est ensuite soumise à une chromatographic de gel filtration permettant la séparation des molécules en fonction de leur masse moléculaire. Dans ces conditions le complexe cysteine synthase se dissocie en tétramères de serine acetyltransferase et dimères d' O-acétylserine (thiol) lyase. La serine acetyltransferase chloroplastique sous sa forme libre est toujours sensible à l'inhibition par la cysteine. Pour afiner ce résultat et confirmer que l'inhibition de l'enzyme n'est pas dépendante de l'interaction avec l'OASTL, une serine acetyltransferase a été partiellement purifiée à partir de chloroplaste de pois, par une chromatographie d'échanges d'ions suivie par une chromatographie de filtration moléculaire réalisée en présence d'O-acétylserine ( 1 M). une condition qui entraîne la dissociation du complexe.
La fraction de serine acetyltransferase ainsi libre de contaminations par l'O- acétylserine (thiol) lyase est incubée en présence de concentrations croissantes de cysteine dans les conditions décrites dans le tableau I et Figure 2 . La CL„ calculée est de l'ordre de 15 +/- 3 micromolaire et est comparable à la valeur obtenue précédemment pour l'enzyme dans les conditions du chloroplaste (voir Tableau I). Ce dernier résultat permet d'établir un modèle pour rendre compte de l'inhibition de la serine acetyltransferase chloroplastique. Dans la figure 3. la forme tétramérique de la serine acetyltransferase (SAT) est figurée par les cercles gris et le dimère de l'O-acétylserine (thiol) lyase (ΟASTL) par les cercles noirs. Le complexe cysteine synthase fonctionnelle dans la cellule est figuré par l'association des deux populations moléculaires. En présence de cysteine, le complexe cysteine synthase fixe de la cysteine qui modifie les interactions protéines-protéines au sein du complex cysteine synthase. et conduit à la dissociation en tétramères de SAT et dimères d'OASTL. La SAT ainsi sous sa forme libre est aussi sensible à la cysteine, et l'on sait que cette structure à tendance à former des aggrégats (hors du complexe cysteine synthase) et qui se traduisent par une perte de son activité [14].
Exemple 2. Isolement et caractérisation d'un gène codant pour une isoforme serine acetyltransferase putative cytoplasmique (SAT3) [ 12] On reprend dans cet exemple le mode opératoire décrit en page 502 de Ruffet & al. [12], en particulier les chapitres décrits sous les titres " Bacterial strain and growth conditions " et " Isolation of A. thaliana serine acetyltransferase cDNA clones by complémentation in E. coli ". Un gène codant pour une serine acetyltransferase putative cytosolique (Z34888 ou L34076) représentée sur la Figure 4 (SEQ ID NO 1 ), a été isolé par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichia coli déficiente pour l'activité serine acetyltransferase. L'analyse de la séquence primaire a montré la présence d'une forte similitude avec la séquence de l'enzyme bactérienne (56% d'homologie et 41% d'identité).
Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac sont les suivantes : Oligo 1 : 5 ' GAGAGAGGAT CCTCTTTCCA ATCATAAACC ATGGCAACAT
GCATAGACAC ATGC 3 ' Oligo 2 : 5 ' GGCTCACCAG ACTAATACAC TAAATTGTGT TTACCTCGAG
AGAGAG 3 ' Ces amorces permettent l'introduction des sites de restriction Bam fil en 5" (GGATCC) et Sacl en 3 ' (GAGCTC).
L'extrémité N-terminale de la séquence en acide aminé de l'isoforme SAT3 ne présente pas les caractéristiques des peptides d'adressage dans un organite (mitochondrie ou chloroplaste). Cette analyse conduit à supposer une localisation cytosolique pour cette isoforme [12]. L'absence de peptide d'adressage de type chloroplastique pour cette isoforme a pu être confirmé lors d'expérience d'import dans les chloroplastes ([29]
Murillo & al. 1995, Cell. and Mol. Biol. Research 41. 425-433). A l'opposé, une étude utilsant des constructions incluant une portion en de la séquence nucléotidique et une protéine marqueur (Green Fluorescent Protein, GFP) ont montré que la présence du produit de fusion (5'-SAT3-GFP) dans le chloroplaste de plants d' A. lhaliana transformés (stade végétatif de la plante) et aussi dans le cytosol (au stade florale) [27 ].
Le gène de la SAT 3 (L34076) présente une structure sans introns.
Exemple 3. Sur-expression et purification de la SAT3 chez Escherichia coli
Le protocole défini pour la sur-expression de l'enzyme chez E. coli permet la purification de l'enzyme sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acétylserine (thiol) lyase de plante, le complexe cysteine synthase [14]. Avec les protéines purifiées, l'effet de la cysteine sur l'activité de la serine acetyltransferase a été analysée par un dosage spectrophotométrique basé sur la consommation de l'acétyl-CoA au cours de la réaction i , en fonction du temps d'incubation. Cette analyse s'effectue dans un milieu ( 1 ml ) contenant 50 mM Hepes-HCl, pH 7.5, 2 mM L-serine et 0.2 mM Acetyl-CoA. La réaction est suivie en mesurant la diminution de l'absorbance à 232 nm (coefficient d'extinction moléculaire de 4200 M"1cm-1 )([30 ] Kredich, N.M. & al., J. Biol. Chem. (1969) 244, 2428-2439). Nous avons pu montrer que cette isoforme (SAT3) sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acétylserine (thiol) lyase est insensible à la cysteine. Ce résultat nous permet de confirmer que cet ADNc (L34076, Figure 4) code pour une serine acetyltransferase cytosolique, car la composition en acides aminés de l'extrémité N-terminale ne présente pas les caractéristiques de peptides de transit, et de plus cette serine acetyltransferase est insensible à la cysteine. Ce dernier résultat est similaire aux observations obtenues pour l'activité serine acetyltransferase cytosolique de feuilles de pois (Figure 2 et Tableau I).
Exemple 4. Isolement et caractérisation d'un gène codant pour une isoforme serine acetyltransferase cytoplasmique (SAT3' ) (U30298)
On reprend le mode opératoire de l'exemple 3 avec les oligonucléotides 3 et 4 suivants :
Oligo 3 : 5 * GAGAGAGGAT ÇÇTCTTATCG CCGCGTTAAT ATGCCACCGG CCGGAGAACTC C 3 ' Oligo 4: 5 ' GAGCCTTACC AGTCTAATGT AGTATATTTC AACCTCGAGA
GAGAG 3 ' On isole un gène codant pour une acetyltransferase (U 30298) représentée sur la figure 5 (SEQ ID NO 2). L'analyse de la séquence primaire a montre la présence d'une forte similitude avec la séquence de l'enzyme bactérienne (51.6 % d'homologie et 42.6 % d'identité). La structure du N-terminale (absence des conditions nécessaires permettant un addressage dans un organites) indique qur cette isoforme possède une localisation cytosolique. Par contre elle est donnée sensible à la cysteine [27]. Ce résultat diffère des données obtenues avec les feuilles de pois (et d'épinards). dans le sens que le site de régulation par la cysteine semble être confinée au cytosol chez A . thaliana. [27]. De plus, il semblerait que J. lhaliana possède au moins deux isolbrmes cytosoliques : SAT3 (exemple 3) et SAT3' (ou U30298. exemple 4). A la différence du gène de la SAT3. le gène correspondant à la SAT3' présente un intron.
Exemple 5. Isolement et caractérisation de gènes codant pour une isoforme serine acetyltransferase (SATl')
Le mode opératoire décrit pour l'exemple 3 est repris pour le présent exemple.
Un gène codant pour une serine acetyltransferase (L78443) représenté sur la figure 6 (SEQ ID NO 3) a été isolée par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichta coli déficiente pour l'activité serine acetyltransférase.[ 12 ] L'analyse de la séquence primaire montre de fortes similitudes avec la séquence de l'enzyme bactérienne (52.1% d'homomlogie et 39% d'identité). Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac (en caractères gras sur la figure 3) sont les suivantes :
Oligo 5 : 5 ' GAGAGAGGAT ÇÇCCTCCTCC TCCTCCTCCT ATGGCTGCGT GCATCGACAC CTG 3'
Oligo 6 : 5 ' GCTCACCAGC CTAATACATT AAACTTTTTC AGCTCGAGAG
AGAG 3 ' Ces amorces permettent l'instroduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en 3' (GAGCTC). On obtient un deuxième gène codant pour une serine acetyltransferase putative mitochondriale (U22964) représenté sur la figure 7 (SEQ ID NO 4) en reprenant le même mode opératoire avec l 'oligo 7 en remplacement de l' oligo 5 comme amorce en 5'.
Oligo 7°: 5 ' GAGAGAGGAT CCGGCCGAGA AAAAAAAAAA ATGTTGCCGG TCACAAGTCG CCG 3'
L'extrémité N-terminale de la séquence en acide aminé de l'isoforme SATl présente les caractéristiques des peptides d'adressage dans un organite (mitochondrie ou chloroplaste). Une localisation mitochondriale a été confirmé récemment par la construction d'une protéine de fusion incluant la portion 5' et la " green fluorescent protéine " (5'SAT1-GFP) et par tranformation de plants d'Arabidopsis thaliana [27]. Le gène de la SATl ' (L78443) ou SATl (U22964), comme son homologue (SAT3) ne présente pas d'intron.
Exemple 6. Sur-expression et purification de la SATl chez Esche chia coli. Localisation de cette isoforme chezJ. thaliana
Le protocole défini pour la sur-expression de l'enzyme chez E. coli permet la purification de l'enzyme (sous sa forme sans peptide de transit, SAT L78443) sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acetylserine (thiol) lyase de plante, le complexe cysteine synthase [14]. Avec les protéines purifiées, l'effet de la cysteine sur l'activité de la serine acetyltransferase a été analysée par un dosage spectrophotométrique basé sur la consommation de l'acétyl-CoA au cours de la réaction 1, en fonction du temps d'incubation (voir exemple 3). L'analyse a été aussi effectuée par un dosage du produit de la réaction (OAS) par HPLC (voir exemple 1). Nous avons pu montrer que cette isoforme (SATl ') sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acétylserine (thiol) lyase est insensible à la cysteine. Ce dernier résultat parallèle les observations obtenues pour l'activité serine acetyltransferase mitochondriale de feuilles de pois (Figure 2 et Tableau I). Cette dernière étant inhibée pour des concentrations non-physiologiques de cysteine. Avec une préparation de mitochondries obtenue à partir de feuilles de pois, ou à partir de protoplastes isses de cultures de cellules, la localisation de cette isoforme dans la mitochondrie a pu être confirmée.
La fraction mitochondriale dépourvue de contaminations plastidiale et cytosolique a été obtenue en utilisant le protocole défini pour les mitochondries de feuilles de pois [12]. La masse moléculaire du polypeptide révélé par les anticorps dirigés contre le peptide [-TKTLHTRPLLEDLDR-] (voir séquence acide aminé de la SATl) est de l'ordre de 34000 daltons, une valeur qui est en accord avec la masse de la protéine obtenue grâce aux programmes d'analyse de séquence pour la prédiction des sites de clivages.
Exemple 7. Isolement et caractérisation de gènes codant pour une isoforme serine acetyltransferase (SAT2)
Le mode opératoire décrit pour l'exemple 3 est repris pour le présent exemple. Un gène codant pour une serine acetyltransferase (L78444) représenté sur la figure 8 (SEQ ID NO 5) a été isolé par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichia coli déficiente pour l'activité serine acetyltransferase. [12] L'analyse de la séquence primaire a montré la présence de fortes similitudes avec la séquence de l'enzyme bactérienne (49.5% d'homologie et 35.4% d'identité). Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac (en caractères gras sur la figure 8 sont les suivantes :
Oligo 8 : 5 ' GAGAGAGGAT CCGACAAGTT GGCATAATTT ATGGTGGATC TATCTTCCT 3' Oligo 9 : 5'CCTGTGTGAT TGTCGTGTAG TACTCTAGAA
ACTCGAGAGA GAG 3'
Ces amorces permettent l'introduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en 3' (GAGCTC). L'analyse de la portion N-terminale de la séquence présente des caractéristiques pour un adressage de la protéine dans un organite (mitochondrie ou chloroplaste). A la différence des autres isoformes décrites ci-dessus, le gène de la SAT 2 est complexe et présente plusieurs introns. La comparaison des séquences de la SAT2 avec ses homologues d'A. thaliana, de plantes, et d'autres organismes laissent supposer une origine de type procaryotique (Figure 10). De plus, l'analyse de la séquence N- terminale en utilisant le programme chloroP [http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorP/], indique de forte probabilité pour la présence d'un peptide de transit de type chloroplastique. Exemple 8. Isolement et caractérisation de gènes codant pour une isoforme serine acetyltransferase (SAT4)
Un gène codant pour une serine acetyltransferase (SAT4) représenté sur la figure
9 (SEQ ID NO 6) a été isolée par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichia coli déficiente pour l'activité serine acetyltransferase. [12] L'analyse de la séquence primaire a montré la présence de fortes similitudes avec la séquence de l'enzyme bactérienne (44.5% d'homologie et 32% d'identité)
Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac sont les suivantes :
Oligo 10 :5' GAGAGAGGAT ÇÇGACAAGTTGG CATAATTTAT GGCTTGTATA
AACGGCGAGA ATCGTGATTT TTCTT 3'
Oligo 11: 5'TACCTCGTAC CACTCAGAAC TCTAGAAACT CGAGAGAGAG3 '
Ces amorces permettent l'introduction des sites de restriction Baml l en 5"
(GGATCC) et Sacl en 3' (GAGCTC).
L'analyse de la portion N-terminale de la séquence présente des caractéristiques pour un adressage de la protéine dans un organite (mitochondrie ou chloroplaste). Le gène de la SAT 4, comme celui de la SAT2, est complexe et présente plusieurs introns. La comparaison des séquences de la SAT4 avec ses homologues d'J. thaliana, de plantes, et autres organismes laissent supposer une origine de type procaryotique (Figure 10). De plus, l'analyse de la séquence N-terminale en utilisant le programme ChloroP [http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorP/], indique une forte probabilité pour la présence d'un peptide de transit de type chloroplastique. La figure 1 0 représente la comparaison des séquences, elle a été réalisée en utilisant le programme Clustavv (Vector NTI software). La SAT2 et la SAT4 sont plus proches des SATs procaryotiques que ne le sont les SAT3, SATl et SAT52. De plus, l'embranchement comprend aussi une SAT d'algue rouge (AB00848) identifié comme une protéine possédant une localisation chloroplastique et sensible à la cysteine ([32] Toda &al. 1998, Biochim. Biophys. Acta 1403. 72-84). La SAT4 est identifiée sur le chromosome 4 (Bac clone F8D20, accession AL031 135).
Exemple 8. Constructions utilisées pour la transformation des plants de tabac- variété petit Havanna Expression du transgène dans les feuilles
Les transformations des plants de tabac sont réalisées par l'intermédiaire dAgrobacterium tuméfaciens EHA105, contenant le vecteur pBI121 (Clonetch) (Figures 1 1 et 12). SAT3 (ou SATl' OU toute SAT insensible à la cysteine)
Afin d'obtenir une expression de la SAT3 (SEQ ID NO 1) de l'exemple 2 dans le chloroplaste (Figure 1 1 ), on introduira en position 5' de l'ADNc une extension qui permettra l'adressage dans ce compartiment. Pour cela, le peptide de transit optimisé décrit auparavant sera utilisé.
Entre les bordures gauche (BG) et droite (BD) du T-DNA est clone un gène de résistance à la kanamycine (NPTIl) codant pour la néomycine phosphotransférase utilisé comme marqueur de sélection pour la transformation du tabac. L'expression du gène NPTIl est sous la dépendance du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase de A. tumefaciens. En aval, le gène de la ?-glucuronidase clone entre les sites uniques ZtamHl et Sacl, est sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou- fleur (CaMV) et le signal de polyadénylation du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti. L'insertion du produit de la construction OTP-SAT3 s'effectue entre les sites Xho et Sacl du vecteur délété du gène de la /- -glucuronidase (Figure 1 1 ) SATl, SAT3, SAT3'- SAT2, SAT4 ou toutes SATs
Afin d'obtenir une expression de la SAT dans tous lescompartiments subcellulaires (cytosol, mitochondrie ou chloroplaste). on introduira le transgène dans le vecteur approprié décrit dans la figure 12.
Entre les bordures gauche (BG) et droite (BD) du T-DNA est clone un gène de résistance à la kanamycine (NPTIl) codant pour la néomycine phosphotransférase utilisé comme marqueur de sélection pour la transformation du tabac. L'expression du gène NPTIl est sous la dépendance du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase de
A. tumefaciens. En aval, le gène de la /3-glucuronidase clone entre les sites uniques BamHl et Sacl , est sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou- fieur (CaMV) et le signal de polyadénylation du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti. L'insertion du gène codant pour une SAT s'effectue entre les sites BamHl et Sacl du vecteur délété du gène de la β-glucuronidase (Figure 12). Expression des transgènes dans les graines Une construction similaire à celle présentée dans les figure 1 1 ou 12 est réalisée dans le but d'obtenir une expression spécifique du transgène dans les graines. Cette stratégie pourrait être importante puisque les graines composent l'apport principale pour l'alimentation animale. Pour cela le promoteur constitutif de la mosaïque du tabac sera remplacé par un promoteur qui permet une expression spécifique du trαnsgène pendant la mise en place des réserves de la graine.
Exemple 9. Transformation du tabac
Dé jeunes feuilles de plants de tabac (âgés de 3 à 4 semaines) dont la surface est stérilisée avec une solution de javel 10% (V/V) pendant 10 min puis rincée à l'eau stérile, sont découpées à l'emporte-pièce (30 disques par construction). 20 ml d'une culture de 48 heures dAgrobacterium tumefaciens EHA105 (contenant le vecteur pBI121 modifié selon l'invention) sont centrifugés puis resuspendus dans 4 ml d'une solution de MgS04 1 OmM. Les disques foliaires sont incubés pendant quelques minutes avec la solution d'agrobactéries puis transférés sur milieu MS (Sigma M-5519) supplémenté avec 0,05 mg/1 d'acide a-naphtalène acétique (NAA, Sigma). 2 m g/1 de 6- benzylaminopurine (BAP) et 7 mg/1 de phytoagar, pendant 2 à 3 jours. Les disques foliaires sont ensuite transférés sur un milieu identique auquel sont ajoutés 350 mg/1 de cefotaxine (bacteriostatique) et 75 mg/1 de kanamycine (agent de sélection). Au bout de 2 semaines, les disques sur lesquels se sont développés des cals ainsi que de jeunes pousses sont repiqués sur un milieu identique afin d'accélérer la croissance des pousses. Une semaine plus tard, les pousses vertes sont excisées et transférées sur le même milieu sans hormone, afin de permettre le développement des racines, ceci pendant 2 semaines environ, au bout desquelles les jeunes plantes sont transférées en terre et cultivées en serre.
Exemple 10. Analyse des résultats pour les plantes transgéniques SAT3 et SATl ' (L78443) (forme tronquée de la SATl U22964) et témoins.
L'impact de l'expression de SAT3, SATl ', OTP-SAT3 dans les feuilles ou dans les graines de plants de tabac est analysé au niveau du contenu en composés soufrés, la cysteine et la methionine (et dérivés comme le S-méthylméthionine ou SMM) et le glutathion. La cysteine et le glutathion sont mis en évidence par la Méthode de Fahey ([33] Fahey, R.C. and Newton, G.L., Methods Enzymol. (1987) 143. 85-96), après dérivatization des composés par le thiolyte (mBBR de Calbiochem) et séparation par chromatographie liquide haute performance (CLHP) [33]. Le dosage de la methionine libre et du SMM est effectué par les méthodes de dosage des acides aminés libres après extraction et dérivation par l'orthophtaldéhyde et séparation par CLHP ([34] Brunet, P. & al., J. Chrom. (1988) 455, 173-182). La mesure de l'activité de la serine acetyltransferase s'effectue comme décrit dans la méthodologie de dosage de l'O- acetylserine formée, par la technique HPLC, ou par la méthode de couplage en présence d'un excès d'O-acétylserine (thiol) lyase [12], [14]. L'activité du transgène SAT dans les plants transformés (c.a.d in vivo) est révélée par le dosage de l'O-acétylsérine produite lors de l'activité de l'enzyme et accumulée transitoirement dans la cellule.
Le dosage de 1" O-acétylserine dans les extraits de plantes suit le protocole suivant.
Après broyage des feuilles de tabacs en une fine poudre dans l'azote liquide, les extraits sont repris dans l'acide chlorhydrique 0,1 M (1 ml /100 mg de poudre). Après une période d'incubation de l'ordre de 10 min, les débris sont éliminés par une centrifugation de 15 min à 15.000g. Une fraction du surnageant obtenu, contenant les acides aminés libres, est dérivatisée pendant 1 min à 25°C en présence d'une solution d' orthophtalaldéhyde (solution de 54 mg d'orthophtalaldéhyde, 10% méthanol, 90% de borate de sodium 400 mM, pH 9.5, et 0.2 ml de /?-mercaptoethanol). Les dérivés OPA- acides aminés sont alors séparés par chromatographie en phase inverse sur une colonne UPHDO-15M (0.46 x 150 mm, Interchim) connectée à un système HPLC (Waters). Les tampons utilisés pour réaliser l'élution sont, Tampon A : acétate de sodium, 85 mM, pH 4.5 additionné d'acétonitirile 6% final ; tampon B : 60% acétonitrile dans l'eau. La séparation des dérivés s'effectue selon le gradient (1 ml/min): 0 min. 30% B dans A ; 8 min, 60 % B dans A ; 9 min, 80 % B dans A ; 10 min, 100 % B ; 12 min, 100 % B. En sortie de colonne, la fluorescence émise par les dérivés est mesurée à 455 nm après excitation à 340 nm (fluorimètre SFM25, Kontron).
Le temps de rétention de l'O-acétylsérine dans nos conditions expérimentales est de 9,5 min. L'identité du pic correspondant à l'O-acétylsérine est confirmée par une co- élution avec une quantité connue du produit pur. De plus, un deuxième contrôle e t effectué pour confirmer la position de l'O-acétylsérine dans les différentes analyses. Les échantillons, avant l'incubation avec l'OPA, sont préalablement traités par du NaOH 0.2 M finale. Dans ces conditions, la fonction acétate en position OH de la serine est transférée sur la fonction aminé et permettant ainsi la formation de la .V-acétylsérine. Ce dernier composé n'est plus détecté dans nos conditions expérimentales et conduit donc à la disparition du pic correspondant initialement à l'O-acétylsérine.
Les plants transformés avec le transgène SAT ont été préalablement sélectionnés sur kanamycine et menés à graines. Les plants contrôles (PBI, trois lignées indépendantes contenant le vecteur de transformation et une cassette GUS) sont traités de façon identique. Les analyses des plantes comprennent : 1 ; mise en évidence de l'insertion du transgène au niveau du génome par PCR en utilisant les primers 5" et 3 ' correspondant aux SAT utilisées pour la transformation ; 2, mise en évidence du messager par une analyse des messagers à l'aide de sondes correspondant aux transgènes SATs utilisés pour la transformation des plantes selon les techniques connues ; 3, mise en évidence de l'activité enzymatique associée à la protéine SAT selon les méthodes décrites dans la littérature ([14]) et localisation du transgène ; 4. dosage du produit de la réaction SAT, soit l'O-acétylserine (ΟAS) dans les plantes transformées; 5, dosage de la cysteine et de ses dérivés directs, le glutathion et la methionine (et ses dérivés méthylés) ; 5, analyse de la composition en acides aminés totals des plantes et graines associées à chacun des transgènes obtenus (acides aminés libres et liées aux protéines) selon les techniques traditionnelles ; 6 ; analyse de l'impact de la sur-expression de l'activité SAT dans la cellule végétale sur le contenu en activité enzymatique associée à la séquence d'assimilation du soufre (transporteurs de sulfate, ATP-sulfurylase, APS reductase, sulfite reductase et en particulier l'O-acétylserine (thiol) lyase, l'enzyme directement associée à l'activité SAT pour la synthèse de la cysteine ([14]). De plus, les enzymes associées à la séquence de synthèse de la methionine et du glutathion sont analysées afin de rendre compte de l'impact du contenu en cysteine sur le métabolisme associé à la synthèse du glutathion et de la methionine. L'expression du gène de la serine acetyltransferase dArabidopsis thaliana dans le tabac conduit à une augmentation du taux en cysteine, du taux en glutathion et du taux en methionine dans les tissus des plantes transformées par rapport aux plantes contrôles. En général cette augmentation du contenu en composés soufrés libres est associée à l'expression du transgène dans la cellule végétale (Figure 13). La mesure est effectuée dans les feuilles de 3 plantes différentes de chaque lignée homozygote. L'activité SAT est mesurée par sa capacité à promouvoir la synthèse de cysteine selon le protocole décrit précédemment ([14]).
L'expression du transgène sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV conduit à augmenter la capacité (l'activité enzymatique potentielle maximale mesurée in vitro) de la SAT d'un facteur 2 à 8 par rapport au niveau mesuré dans les plantes contrôles (plantes transformées avec un vecteur vide). Pour rendre compte de l'activité réelle du transgène SAT, une mesure du contenu en O-acétylserine (ΟAS libre) a été effectuée. Ainsi, le taux d'OAS dans la cellule végétale (taux moyen de 4 nmoles/ g matière fraîche pour les plantes contrôles, 6 mesures indépendantes) a pu être multiplié d'un facteur 2 à 10 fois dans les plantes transformées (2 mesures indépendantes). Ainsi, associée à l'augmentation nette de la capacité de l'activité enzymatique de la SAT est associée une augmentation de l' OAS libre intracellulaire qui résulte de l'activité du transgène in vivo, et à une augmentation du contenu en cysteine libre dans la plupart des transgènes SAT par rapport aux plants contrôles (Figure 14). La teneur en cysteine dans les plantes contrôle (PBI) et dans les plants T2 de tabac transformés avec une SAT (lignées SATl ' et SAT3) est déterminées comme dérivés de monobromobimane par HPLC pour 3 plantes par lignées ([33]). La teneur en cysteine des lignées transgéniques est augmentée de 2 à 10 fois par comparaison aux plantes contrôle (PBI).
Le contenu en cysteine libre dans la plupart des plantes transgéniques exprimant une SAT est significativement supérieur de 2 à 10 fois au taux naturel mesuré dans les plantes contrôles PBI (d'une valeur de 5 nmoles /g matière fraîche, moyenne calculée sur trois lignées indépendantes et contenant chacune 5 plantes). Cet impact de l'expression de la SAT est observé dès la génération TI . Par contre aucune corrélation n'a pu être mise en évidence entre le contenu en cysteine (et par ailleurs en OAS libre; et l'activité SAT des transgènes mesurées in vitro. Par contre une corrélation positive et significative a pu être mesurée entre le contenu en OAS cellulaire et le taux de cysteine de la cellule (Figure 15). Par comparaison aux plantes contrôle, une augmentation de 3 à 10 fois du niveau d' O-acétylserine libre in vivo liée à l'activité du transgène, résulte en une augmentation de 3 à 8 fois du niveau de cysteine dans les plantes. L'analyse a été réalisée sur des feuilles complètement développées (environ 2 mois) de plantes homozygotes pour le transgène. Les plantes contrôle sont des plantes transformées avec des construits vides (PBI). Une augmentation du contenu en OAS libre cellulaire liée à l'activité du transgène SAT dans les plants transformés est positivement corrélée avec une augmentation du contenu en cysteine. Ainsi, une augmentation en moyenne de 6 fois du taux d'OAS libre est associée avec une augmentation de 6-fois le taux en cysteine. La pente associée avec la distribution des points est de 1 ,06 +/- 0 ,09 (coefficient de régression de 0.67). Elle indique que pour chaque molécule d' OAS accumulée une mole de cysteine est synthétisée. La valeur de cette pente et l'absence de plateau observées dans nos conditions expérimentales indiquent que la formation de sulfide (assimilation du sulfate et réduction en sulfide) n'est pas une séquence limitante et que l'activité SAT paraît être le facteur limitant dans la cellule pour la formation de la cysteine (Figure 1 )
La localisation sub-cellulaire des transgènes SATl ' (forme tronquée de la SATl ) et SAT3 dans les plants de tabacs transformés a pu être précisée par une préparation de la fraction chloroplastique des plants transformés présentant l'activité enzymatique la plus élevée par rapport au plants PBI (contrôles). L'activité associée au compartiment chloroplastique est comparée à celle mesurée dans l'extrait total ( Figure 16). Les valeurs d'activté serine acetyltransferase correspondent à 3 lignées pour les PBI (5 plantes par lignées), 5 lignées pour la SATl ' et la SAT3 représentées par 5 plantes chacunes. Les colonnes en gris correspondent aux activités mesurées dans l'extrait total réalisé a partir de chacune des lignées, et les colonnes en noir représentent la moyenne des activités mesurées dans chacune des préparations chloroplastiques .
Ces résultats établissent définitivement que la SAT3 est une isoforme de la serine acetyltransferase localisée dans le cytosol de la cellule végétale, et que la forme tronquée de la SATl (absence de peptide de transit) est aussi localisée dans le compartiment cytosolique. En ce qui concerne la SAT3, ces résultats confirment nos interprétations dérivées de l'analyse de la séquence protéique [12].
Une conséquence directe de l'augmentation du taux de la cysteine cellulaire résulte en une synthèse accrue du glutathion et de la methionine (voir Figure 1 ). Le devenir de la cysteine est multiple et mis à part son incorporation au niveau des protéines, sa particiption à la synthèse de composés multiples comme les vitamines (biotine, thiamine, ...et autre dérivés soufrés de la cellule), la cysteine participe aussi à la synthèse uu glutathion (tπpeptide associe a de nombreux mécanismes de défense de la plante et considéré comme réservoir de cysteine) et de la methionine. En effet, dans les plants transformés avec le transgène SAT le taux de glutathion est directement corrélé à celui de la cysteine et se traduit par une augmentation de 2 à 7 fois le taux naturel mesuré dans les plants contrôls (PBI) (Figure 17 ). Le coefficient de corrélation calculé pour la distribution des points est de 0.92. Une augmentation de 4 fois de la teneur en cysteine dans les plants de tabac transgénique surexprimant la SAT résulte en une augmentation de 3 à 4 fois du niveau de glutathion. L'analyse a été effectuée avec des feuilles pleinement développées (environ 2 mois) de plantes homozygotes pour le transgène. Les plantes contrôles sont des plantes transformées avec des construits vides. Ce résultat indique que la cysteine est le facteur limitant de la synthèse du glutathion dans la cellule végétale. Donc, indirectement toute modification du taux de serine acetyltransferase dans la cellule aura pour conséquence, via l'augmentation du taux de cysteine, une augmentation du contenu en glutathion intra-cellulaire. Ce résultat implique que les plantes transgéniques obtenues ont acquis des propriétés de résistances aux stress par rapport aux plantes contrôles (PBI). Cet aspect a été observé récemment ([34], Blaszczyl A. & al., 1999, The Plant Journal 20, 237-243). De plus, le contenu en cysteine et glutathion considéré comme un réservoir entraîne une disponibilité accrue lors de la synthèse de polypeptides riches en cystéines (par exemples pour la résistances aux attaques phytopathogènes), et riches cysteine et en methionine (pour l'alimentation animales)
L'augmentation de la cysteine dans la cellule végétale entraîne aussi une augmentation du contenu relatif en methionine (Figure 18). Par contre , à l'opposé du résultats observés pour le glutathion, la courbe présente un plateau qui semble indiquer l'existence d'un autre site de contrôle qui limiterait la synthèse de la methionine. De plus, l' homocystéine, issue de la voie de transsulfuration , et le précurseur soufrés à la synthèse de la cysteine ne semble pas s'accumuler . Cette observation indique donc que le pool de folates de la cellule végétale, indispensable pour la méthylation et la formation de la methionine n'est pas un facteur limitant. Cette limitation se situerait donc en aval de la cysteine et en amont de l'homocystéine. Elle concerne la synthèse du précurseur carboné pour la synthèse de la methionine qui dérive de l'aspartate (()- phosphohomoserine et/ou cystathionine ). Le niveau de l'aspartokinase (la première enzyme de la voie de l'aspartate pour la synthèse de la Lysine, thréonine et methionine) est contrôlé par plusieurs effecteurs comme la thréonine, et le S-adenosylmethionine (SAM) issue de la synthèse de la methionine ([3]). La cystathionine γ-synthasc (voir Figure 1 ) est directement régulé au niveau transcriptionnelle [3] et plus exactement la methionine ou l'un de ses dérivés contrôles la stabilité de son messager [4]). Le plateau maximale obtenu dans nos conditions expérimentales est de l'ordre de 39 +/- 7 nmoles /g matière fraîche de methionine ce qui correspond à une multiplication du taux naturel moyen de l'ordre de 6 +/- 2 namole per g matière fraîche (contrôle PBI). La valeur maximale obtenue pour la methionine nécessite une augmentation du contenu en cysteine de la cellule de 4 à 5 fois son taux maximale. Le coefficient de régression est de 0.50.
De plus, l'augmentation de la methionine dans les cellules conduit à multiplier le taux de S-methylméthionine (SMM) de 2 à 10 fois selon les plantes. Le SMM dérive directement de la méthylathion de la methionine en présence de S-adenosylméthionine. Ce composé est important pour la cellule et est une forme de transport des groupements méthyls (de methionine) dans la plante. En effet, en présence d'une molécule d' homocystéine (le précurseur soufré à la synthèse de la methionine et dérivant de la cysteine) , le SMM permet la synthèse de deux molécules de methionine ([3], [35], Bourgis & al., 1999, Plant Cell 1 1 J 485- 1497). Il pourrait donc avoir un rôle primordial lors de la synthèse des protéines de réserves dans la graine. De plus, le SMM est le précurseur directe pour la synthèse de composé comme le 3-dimethylsulfoniopropionate impliqué dans la résistance des plantes aux stress salins ([36], Hanson A.D. & al., 1994, Plant PhysiolJ 05, 103-1 10). Une telle approche présente de multiples conséquences en particulier pour augmenter les potentialités des plantes sur des sols riches en sels.
Evidence pour un rôle régulateur de la voie d'assimilation du sulfate in vivo.
La serine acetyltransferase est considéré comme un facteur limitant pour l'assimilation du soufre et la synthèse de la cysteine. Son rôle chez les bactéries est important puisque le produit de la réaction, (O-acetylserine. ΟAS) ou son dérivé (le N- acétylserine) est l'effecteur qui module l'expression des gènes de la séquence d'assimilation du soufre comme: 1. le transport du sulfate. 2, l'ATP sulfurylase. 3. l'APS kinase.et 4, la PAPS reductase ([37], Kredich N.M., 1987, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium : cellular and molecular biology, pp. 419-428). Chez les plantes, un rôle de l'OAS dans la modulation de l'expression de plusieurs gènes a pu être mise en évidence et concerne les transporteurs de sulfates, ([38], Smith F.W. & al. 1997, The Plant Journal 12, 875-884 ; [39], Hawkesford M.J. & al. 1995, Z. Pfanzenernârh. Bodenk. 158, 55-57 ; [40], Clarkson D.T. & al. 1999, Plant Physiol. Biochem. 37, 283-290), l'ATP sulfurylase ([39-40]) et l'APS reductase ([41 j. Neuenschwander U. & al. 1991 , Plant Physiol., 97, 253-258). Le rôle de l'activité serine acetyltransferase dans la modulation des gènes a été postulé d'après les caractéristiques cinétiques du complex cysteine synthase (bi-enzyme complexe composé de la serine acetyltransferase et de l'O-acétylserine (thiol) lyase) ([41], Droux & al. In Sulphur and Nutrition in Plants, sous Presse ), et a conduit à décrire un modèle pour rendre compte du mécanisme de régulation des gènes. Le rôle de l'OAS est aussi déterminant dans la régulation de l'expression des gènes lors de la formation des graines ([42], Kim H. & al.. 1999, Planta 209, 282-289).
Dans les plantes transgéniques qui sur-expriment une SAT dans le cytosol, une augmentation transitoire en OAS a pu être mise en évidence (augmentation de 2 à 10 fois son taux naturel, voir figure 15). Parallèlement, dans la plupart des plantes transgéniques, une augmentation de l'activité OASTL a été mesurée (Figure 19). Cette augmentation de 2 à 5 fois par rapport à l'activité mesurée dans les contrôles PBI, ne concerne que l'activité associée au chloroplaste. De plus, dans un western Blot. le signal observée est plus important dans la plupart des lignées transgéniques (Figure 20) indiquant que l'augmentation de l'activité correspond à une induction de la synthèse de novo de l'OASTL. Ce résultat original correspond à la première démonstration du rôle de l'OAS (in planta) dans la modulation des gènes de la séquence d'assimilation du sulfate, en particulier pour l'OASTL chloroplastique.
Pour la figure 20, la quantité équivalente de protéine (0J50 mg) est soumise à un SDS-PAGE (12%) et après séparation des protéines, celles-ci sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. La présence de l'OASTL est révélée par une incubation avec des anticorps dirigés contre l'OASTL chloroplastique de feuille d'épinards ([7]). La sur-expression de la SAT dans la cellule végétale conduit donc à augmenter la capacité à synthétiser la cysteine dans le chloroplaste. Il est donc permis de supposer que l'expression des gènes codant pour les enzymes de la voie d'assimilation et de réduction du sulfate (transporteur de sulfate, ATP sulfurylase, APS reductase, sulfite reductase) est aussi modulée comme l'OASTL (et références [38-41 ]). L'augmentation du contenu intracellulaire en OAS (qui dérive de l'activité de la
SAT) signale un état de stress soufrés (absence de soufre réduit suffisant) artificielle à la cellule (dans les plantes transformées) qui conduit à induire les enzymes de la voie d'assimilation du sulfate.
Impact de l'augmentation en cysteine dans la cellule sur le contenu générale en acides aminés. Cette augmentation en composés soufrés s'accompagne d'une augmentation du contenu en acides aminés essentiels comme la thréonine, l'isoleucine, et la lysine (leur contenu est multiplié par 2 en moyenne). Par contre le taux de glutamate est divisé par 2 comme celui de l'aspartate. Cette dernière observation est directement liée à l'augmentation du contenu en THR. LYS et ILE. Toutes les augmentations en acides aminés sont corrélées avec une augmentation en l'activité de la serine acetyltransferase (SAT3, ou SATl ') dans le cytosol. De plus, l'augmentation de ces composés soufrés conduit à améliorer le rapport nutritionnelle N/S de la plante (sur la base des acides aminé libres). Il se traduit par une baisse de ce rapport relatif due à l'enrichissement en composé soufrés totaux (cysteine. methionine, SMM et glutathion). Ce facteur est important car il conditionne le contenu des graines en polypeptides et conduit à un enrichissement (ou à un appauvrissement si le rapport N/S est trop élevé) des protéines de réserves riches en acides aminé soufrés au détriment des polypeptides pauvres en ces composés.
Exemple 11 Analyse des plants transgéniques OTP-SAT3 (OTP-SAT1')
L'analyse des transformants au stade TO des plantes transgéniques exprimant une SAT insensible à la cysteine (ici comme exemple la SAT3 ou SATl ", forme tronquée de la SATl U22964), dans les feuilles ou dans les graines (sous le contôle d'un promoteur graine spécifique), révèle une augmentation de la teneur en cysteine libre, mais aussi du glutathion (2.6 fois le taux naturel), et en methionine. Les plantes exprimant ces mêmes isoformes dans le cytosol sous le contôle d'une promoteur graine spécifique révèlent un taux de composé soufrés supérieurs aux plantes témoins.
Exemple 12 Analyse des résultats pour les plantes transgéniques SATl (CDNA U22964 ou SATlj , forme avec peptide de transit) et témoins.
L'impact d'une expression de la serine acetyltransferase dans les mitochondries a été analysé en transformant les plantes avec la construction (Figure 12) contenant la séquence entière de la SATl . L'analyse des plantes au stade TO permet de mettre en évidence une augmentation en cysteine libre dans la cellule (Figure 21 ). L'analyse est effectuée sur les feuilles formées avant l'apparition de la hampe florale. Les quatorze lignées présentent une multiplication du taux de cysteine de 2 à 6 fois par comparaison avec le plant contrôle (PBI). L'augmentation en cysteine s'accompagne d'un effet général sur le contenu en composé soufrés avec une multiplication par 4 du contenu en glutathion dans la cellule (Figure 22). A l'opposé d'une expression de la SAT dans le compartiment cytosolique, l'allure générale de la distribution des valeurs dans les différentes lignées présente un plateau qui indiquerait une limitation dans la synthèse du glutathion. Cette limitation peut concener le taux de glutamate et/ou de glycine, ou un contrôle du glutathion sur sa propre synthèse (rétro-inhibition de l'une des enzymes participant à la synthèse du glutathion, enzyme E6 et/ou E7 voir Figure 1).
De même le contenu en methionine est multipliée par 2 à 3 fois par rapport au taux naturel mesuré dans les plants contrôles.

Claims

Revendications
1. Procédé pour augmenter la production de cysteine, glutathion, methionine et leurs dérivés soufrés par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les cellules végétales, et les plantes contenant les dites cellules végétales.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SAT surexprimée dans les cellules végétales est une SAT sensible à la cysteine.
3.
Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la SAT est une SAT de plante ou une SAT native d'origine bactérienne.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SAT surexprimée dans les cellules végétales est une SAT insensible à la cysteine.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la SAT est une SAT de plante ou une SAT d'origine bactérienne ou de plante mutée, rendue insensible à la cysteine par mutagénèse.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la SAT est surexprimmée dans le cytoplasme des cellules végétales.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la SAT est une SAT d'origine bactérienne.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la SAT est une
SAT cytoplasmique de plante, en particulier d'Arabidopsis thaliana.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la SAT est la SAT 3, représentée le SEQ ID NO 1.
10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la SAT est une SAT de plante non cytoplasmique amputée de son ou ses signaux d'adressage vers des compartiments cellulaires différents du cytoplsame.
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la SAT est la SAT 1 ' représentée par la SEQ ID NO 2.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans les mitochondries.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide signal/S AT, la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l'intérieur des mitochondries.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le peptide signal d'adressage mitochondrial est constitué par au moins un peptide signal d'une protéine végétale naturelle à localisation mitochodriale, comme par exemple le petide signal de la SATl représenté par les acides aminés 1 à 63 sur la SEQ ID NO 3..
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la SAT est une SAT mitochondriale d'origine végétale, en particulier d' Arabidopsis thaliana.
16. Procédé selon la revendication 15. caractérisé en ce que la SAT est la SATl représentée par la SEQ ID NO 3.
17. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans les chloroplastes des cellules végétales.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans les chloroplastes par intégration dans l'ADN chloroplastique des cellules végétales d'un gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite SAT, sous le contrôle d'éléments de régulations en 5' et 3' fonctionnels dans les chloroplastes.
19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/SAT, la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l'intérieur des chloroplastes.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la SAT est homologue du peptide de transit.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la SAT est une
SAT chloroplastique d'origine végétale, en particulier d' Arabidopsis thaliana.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que la SAT est la SAT2 ou la SAT4 représentée par la SEQ ID NO 5 ou 6 respectivement.
23. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la SAT est hétérologue du peptide de transit.
24. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la SAT est une SAT cytoplasmique d'origine végétale ou une SAT d'origine bactérienne, telle que définie dans l'une des revendications 3 à 5 ou 9 à 1 1.
25. Procédé selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce que le peptide de transit est un peptide de transit d'une autre protéine à localisation plastidiale.
26. Procédé selon la revendication 25. caractérisé en ce que le peptide de transit est constitué par le peptide de transit d'une EPSPS de plante ou le peptide de transit d'une ssu RuBisCO de plante .
27. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que le peptide de transit comprend un peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale et une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale entre la partie C-terminale du peptide de transit et la partie N- terminale de la SAT.
28. Procédé selon la revendication 27. caractérisé en ce que la partie de séquence comprend généralement moins de 40 acides aminés de la partie N-terminale de la protéine mature, de préférence moins de 30 acides aminés, plus préférentiellement entre 15 et 25 acides aminés.
29. Procédé selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que le peptide de transit comprend entre la partie C-terminale de la partie N-terminale de la protéine mature et la partie N-terminale de la SAT un deuxième peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que le peptide de transit est un peptide de transit optimisé (OTP) constitué par la fusion d'un premier peptide de transit, avec une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, laquelle est fusionnée avec un deuxième peptide de transit.
31. Protéine de fusion peptide de transit/SAT, caractérisé en ce que la SAT est hétérologue du peptide de transit.
32. Protéine de fusion selon la revendication 31, telle que définie dans les revendications 24 à 30.
33. Séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/SAT selon l'une des revendications 31 ou 32.
34. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une SAT.
35. Gène chimère selon la revendication 34, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, les baculovirus, ou les cellules végétales et les plantes.
36. Gène chimère selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante la contenant.
37. Gène chimère selon la revendication 36, caractérisé en ce que l'élément de régulation en 5' comprend les séquences de régulation promotrice dans cellules végétales et les plantes, choisi parmi les promoteur s'exprimant dans les feuilles des plantes, les promoteurs constitutifs, ou les promoteurs lumière dépendants d'origine bactérienne, virale ou végétale
38. Gène chimère selon la revendication 36, caractérisé en ce que l'élément de régulation en 5' comprend les séquences de régulation promotrice dans les cellules végétales et les plantes, choisi parmi les promoteurs spécifiques des graines.
39. Gène chimère selon la revendication 38, caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs de la napine, de la phaseoline. de la glutenine, de la zéine, de l'héliantinine, de l'albumine ou de l'oléosine.
40. Gène chimère selon l'une des revendications 34 à 39, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une SAT code pour une SAT telle que définie dans les revendications 2 à 30.
41. Gène chimère selon l'une des revendications 34 à 39, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une SAT est la séquence d'acide nucléique selon la revendication 33.
42. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère tel que défini selon l'une des revendications 34 à 41.
43. Procédé de transformation des organismes hôtes caractérisé en ce que l'on intègre dans le génome dudit organisme hôte au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 33 ou un gène chimère selon l'une des revendications 34 à 41.
44. Procédé selon la revendication 43, au moyen du vecteur selon la revendication 42.
45. Procédé selon l'une des revendications 43 ou 44, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia. les champignons, en particulier Aspergillus. les baculovirus, ou les cellules végétales et les plantes.
46. Procédé selon la revendication 45, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante la contenant.
47. Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir d'une cellule végétale transformée.
48. Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une plante monocotylédone, en particulier choisie parmi les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs, ou une plante dicotyledone, en particulier choisie parmi le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave et le trèfle.
49. Organisme hôte transformé, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 33 ou un gène chimère selon l'une des revendications 34 à 41.
50. Organisme hôte selon la revendication 49, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 43 à 48.
51. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 33 ou un gène chimère selon l'une des revendications 34 à 41.
52. Plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellule végétale selon la revendication 51.
53. Plante selon la revendication 52, caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir d'une cellule végétale selon la revendication 51.
54. Plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 53.
55. Plante génétiquement modifiée selon l'une des revendications 52 à 54, caractérisée en ce qu'elle est une plante monocotylédone, en particulier choisie parmi les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs, ou une plante dicotyledone, en particulier choisie parmi le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave et le trèfle.
56. Plante génétiquement modifiée selon l'une des revendications 52 à 55, caractérisée en ce qu'elle comprend d'autres gènes d'intérêt.
57. Plante génétiquement modifiée selon la revendication 56, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un autre gène modifiant la teneur et la qualité des protéines de ladite plante, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines.
58. Plante génétiquement modifiée selon l'une des revendications 56 ou 57, caractérisée en ce que le gène code pour une protéine enrichie en acides aminés soufrés.
59. Graines des plantes génétiquement modifiées selon l'une des revendications 52 à 58.
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