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WO2000028037A1 - GENE tfIIIA DE CANDIDA ALBICANS (CatfIIIA) ET LA PROTEINE CODEE CATFIIIA - Google Patents

GENE tfIIIA DE CANDIDA ALBICANS (CatfIIIA) ET LA PROTEINE CODEE CATFIIIA Download PDF

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WO2000028037A1
WO2000028037A1 PCT/FR1999/002739 FR9902739W WO0028037A1 WO 2000028037 A1 WO2000028037 A1 WO 2000028037A1 FR 9902739 W FR9902739 W FR 9902739W WO 0028037 A1 WO0028037 A1 WO 0028037A1
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WO
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sequence
dna
catfiiia
gene
polynucleotide
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/002739
Other languages
English (en)
Inventor
Florence Bordon-Pallier
Sylvie Camier
André SENTENAC
Original Assignee
Aventis Pharma S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP99971854A priority patent/EP1129197A1/fr
Priority to JP2000581204A priority patent/JP2002531068A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • TflIIA gene from Candida albicans (CatflIIA) and the coded protein CATFIIIA.
  • the present invention relates to the transcription factor of Candida albicans hereinafter called CATFIIIA and its analogs as well as the polynucleotides (RNA, DNA) coding for this protein or for polypeptides analogous to this protein.
  • the present invention also relates to the process for the preparation of these polypeptides and polynucleotides, their use for the study of the mechanisms of transcription in Candida albicans and for the preparation of inhibitors of this transcription factor CATFIIIA which can be used as antifungal agents and the pharmaceutical compositions containing such inhibitors.
  • the present invention therefore relates in particular to a new transcription factor of Candida albicans and the DNA sequence coding for this transcription factor, their preparation and their uses.
  • the following abbreviations will also be used below: AA for amino acids, AN for nucleic acids, RNA for ribonucleic acid, RNase for ribonuclease, DNA or DNA for deoxyribonucleic acid, cDNA for complementary DNA, bp for base pairs, PCR for reaction in chain by a polymerase, CA or Candida a. for Candida albicans and SC or Saccharomyces c. for Saccharomyces c ⁇ revisiae.
  • polynucleotides hereinafter designates the polynucleotides of the present invention, namely the DNA sequences and also RNA coding for the factor CATFIIIA of the present invention and its homologs having the same function of transcription factor.
  • CAtflIIA has the meaning given above to polynucleotides.
  • polypeptides denotes below the polypeptides of the present invention, namely the factor CATFIIIA of the present invention and its analogs or homologs functional as defined below, therefore having the same function of transcription factor.
  • CATFIIIA has the meaning given above to polypeptides.
  • tflIIA or tfC2
  • CAtflIIA or CAtfC2 designates the gene coding for the transcription factor of Candida albicans CATFIIIA.
  • the spectrum of known fungal infections ranges from fungal attack of the skin or nails to more serious mycotic infections of internal organs. Such infections and the resulting diseases are identified as yeast infections. Antimycotic substances with fungistatic or fungicidal effects are used for the treatment of these fungal infections.
  • the present invention thus relates to the identification of antimycotic substances and in particular of anti-Candida albicans substances.
  • the present invention thus relates to inhibitors of transcription factors which can be used as antifungal agents.
  • Candida albicans is a pathogenic yeast that causes infectious diseases in the human body.
  • intracellular targets In order to find ways to treat diseases, one can choose intracellular targets and the transcription factor TFIIIA can be one of these targets.
  • this factor plays a key role in the initiation of transcription of 5S RNA genes by RNA polymerase III.
  • SC which is a yeast close to CA
  • this SC yeast could not survive without an additional source of 5S RNA when the chromosomal gene for factor TFIIIA was interrupted, this additional 5S RNA being synthesized using of a plasmid without the participation of the factor TFIIIA (reference: S. Camier, A. -M. Dechampesme, A. Sentenac. / Proc. Natl. Acad. Sci. (1995) 92, 9338-9342).
  • TFIIIA The tflIIA gene and the corresponding protein TFIIIA would be involved in the regulation of the biological mechanism of transcription as indicated below. Since the TFIIIA protein was purified as a transcription factor for the first time in 1980 from Xenopus oocytes [Segall et Al, J. Biol. Chem., 255, 11986-11991 (1980)], work has been carried out in vivo and in vitro in Xenopus to study the mechanism of transcription control exerted by TFIIIA.
  • TFIIIA from Xenope is necessary for the initiation of transcription of the 5S RNA gene [Sakonji et al, Cell 19, 13-25 (1980)] and binds to an internal control region of the 5S RNA gene [ Bogenhagen et al, Cell, 19, .. 27-35 (1980)].
  • DNA-binding transcription factors are known which also have this zinc finger structure such as, for example, in humans, XT1 of the human tumor gene.
  • tfC2 yeast tflIIA
  • the present invention thus made it possible to isolate the DNA and RNA polynucleotides coding for the protein of the transcription factor CATFIIIA of Candida albicans and to reveal their nucleotide sequences.
  • the subject of the present invention is therefore an isolated polynucleotide containing a nucleotide sequence chosen from the following group: a) a polynucleotide having at least 50% or at least 60% and preferably at least 70% of identity with a polynucleotide encoding a polypeptide having the function of transcription factor and having an amino acid sequence homologous to the sequence SEQ ID No. 3 indicated below. b) a polynucleotide complementary to the polynucleotide a) c) a polynucleotide comprising at least 15 consecutive bases of the polynucleotide defined in a) and b).
  • the present invention thus relates to a polynucleotide defined above such that this polynucleotide is a DNA.
  • the present invention thus relates to a polynucleotide defined above such that this polynucleotide is an RNA.
  • the present invention more specifically relates to the polynucleotide as defined above comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the present invention has thus made it possible to isolate the DNA sequence coding for the transcription factor of Candida albicans CATFIIIA.
  • the present invention also made it possible to reveal the nucleic acid sequence of the CAtflIIA gene and also the amino acid sequence of the CATFIIIA protein encoded by this gene.
  • a subject of the present invention is therefore a DNA sequence as defined by the above polynucleotide, characterized in that this DNA sequence is that of the gene CAtflIIA coding for a protein having the biological function of the transcription factor of Candida albicans CATFIIIA and containing the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • Such a sequence SEQ ID No. 1 of the present invention therefore comprises 2060 nucleotides.
  • the present invention specifically relates to a DNA sequence as defined above having the sequence starting at nucleotide 720 and ending at nucleotide 1955 of SEQ ID No. 1. Such a sequence therefore comprises 1236 nucleotides.
  • the present invention also relates to the DNA sequence of the CAtflIIA gene as defined above coding for the amino acid sequence SEQ ID No. 3.
  • the sequence SEQ ID No. 3 therefore comprises 412 AA.
  • the present invention particularly relates to the DNA sequence coding for the transcription factor CATFIIIA as defined above as well as the DNA sequences which hybridize with it and / or exhibit significant homologies with this sequence or fragments thereof and having the same function.
  • the present invention also relates to a DNA sequence as defined above comprising modifications introduced by deletion, insertion and / or substitution of at least one nucleotide coding for a protein having the same biological activity as the transcription factor. CATFIIIA.
  • the subject of the present invention is in particular the DNA sequence as defined above as well as the DNA sequences which have a nucleotide sequence homology of at least 50% or at least 60% and preferably at least 70% with said DNA sequence.
  • the present invention thus also relates to the DNA sequence as defined above as well as the DNA sequences which code for a protein of similar function whose AA sequence has a homology of at least 40% and in particular 45% or at least 50%, rather at least 60% and preferably at least 70% with the AA sequence encoded by said DNA sequence.
  • sequences which hybridize one includes the DNA sequences which hybridize with one of the DNA sequences above under standard conditions of high, medium or low stringency and which code for a polypeptide having the same function of factor of transcription.
  • the stringency conditions are those carried out under conditions known to those skilled in the art such as those described by Sambrook et al, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  • Such stringency conditions are, for example, 65 ° hybridization C, for 18 hours in a 5 x SSPE solution; 10 x Denhardt's; 100 ⁇ g / ml ssDNA; 1% SDS followed by 3 washes for 5 minutes with 2 x SSC; 0.05% SDS, then 3 washes for 15 minutes at 65 ° C in 1 x SSC; 0.1% SDS.
  • the high stringency conditions include, for example, hybridization at 65 ° C for 18 hours in a 5 x SSPE solution; 10 x Denhardt; 100 ⁇ g / ml ssDNA; 1% SDS followed by 2 washes for 20 minutes with a 2 x SSC solution; 0.05% SDS at 65 ° C followed by a final wash for 45 minutes in a 0.1 x SSC solution; 0.1% SDS at 65 ° C.
  • the conditions of medium stringency include, for example, a final wash for 20 minutes in a 0.2 x SSC, 0.1% SDS solution at 65 ° C.
  • sequences which have significant homologies we include the sequences having an identity. oder or significant nucleotide sequence with one of the above DNA sequences and which encode a protein having the same function of transcription factor.
  • DNA sequences which may belong to other fungi than Candida albicans and in particular to SC, and which are similar or identical to the DNA sequence of the Candida albicans gene CatflIIA. These similar DNA sequences are not necessarily identical to the DNA sequence of the Candida albicans CatflIIA gene. Sequence homology at the nucleotide level may be moderate or important.
  • the present invention thus relates in particular to DNA sequences which have a nucleotide sequence homology of at least 50%, preferably of at least 60% and even more more preferred at least 70% with the CAtflIIA sequence of the present invention.
  • these similar DNA sequences do not necessarily code for proteins which are identical, in terms of amino acid sequence, to the protein encoded by the CAtflIIA gene.
  • the present invention relates in particular to DNA sequences which code for proteins called homologous having an amino acid sequence homology of at least 40%, in particular 45%, preferably at least 50%, more preferably at least 60% and even more preferably at least 70% with the protein encoded by CAtflIIA of the present invention.
  • the gene of the present invention is represented as a single-stranded DNA sequence as indicated in SEQ ID No. 1 but it is understood that the present invention includes the DNA sequence complementary to this single-stranded DNA sequence and also includes the so-called double-stranded DNA sequence consisting of these two DNA sequences complementary to one another.
  • the DNA sequence as defined above is an example of a combination of codons coding for amino acids corresponding to the amino acid sequence SEQ ID No. 3, but it is also understood that the present invention includes any other combination arbitrary codons coding for this same amino acid sequence SEQ ID No. 3.
  • DNA sequences modified as indicated above or even homologous DNA sequences as defined above can be used known to those skilled in the art and in particular those described in the work of Sambrook, J. Fritsh, EF ⁇ Maniatis, T. (1989) entitled: 'Molecular cloning: a laboratory manual', Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
  • the homologous DNA sequences as defined above can in particular be isolated according to the methods known to those skilled in the art, for example by the PCR technique using degenerate nucleotide primers for amplify these DNAs from genomic libraries or cDNA libraries of the corresponding fungi.
  • the cDNAs can also be prepared from RNA isolated from fungi of different species studied in the context of the present invention such as Candida albicans but for example and just as well: Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida glabrata, Candida lusianiae or Candida rugosa or also fungi such as Saccharomyces cerevisiae or even fungi of the Aspergillus or Cryptococcus type and in particular, for example, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitisocytypus capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoc- cidioides brasiliens and Sporothrix schenckii or fungi of the classes of phycomycetes or eumycetes in particular the subclasses of basidiomycetes, ascomycetes, mehiascomyc
  • the polynucleotides of the present invention can thus be obtained using the usual cloning and screening methods such as those of cloning and sequencing from fragments of chromosomal DNA extracted from cells.
  • cloning and screening methods such as those of cloning and sequencing from fragments of chromosomal DNA extracted from cells.
  • the clones containing a DNA identical to that of the probe can thus be identified under stringent conditions.
  • polypeptide having the function of CATFIIIA transcription factor and having the amino acid sequence SEQ ID No. 3 encoded by the DNA sequence as defined above and the analogs of this polypeptide .
  • polypeptide analogues polypeptides whose amino acid sequence has been modified by substitution, deletion or addition of one or more amino acids but which retain the same biological function.
  • Such analogous polypeptides can be produced spontaneously or can be produced by post-transcriptional modification or by modification of the DNA sequence of the present invention as indicated above, using the techniques known to those skilled in the art: among these techniques , mention may in particular be made of the directed mutagenesis technique known to a person skilled in the art (Kramer, W., et al., Nucl. Acids Res., 12, 9441 (1984); Kramer, W. and Fritz, HJ, Methods in Enzymology, 154, 350 (1987); Zoller, MJ and Smith, M. Methods in Enzymology, 100, 468 (1983)).
  • modified DNA can be carried out as indicated above and in particular by using well-known chemical synthesis techniques such as for example the phosphotriester method [Letsinger, R.L and Ogilvie, K.K., K. Am. CHEM. Soc, 91, 3350 (1969); Merrifield, R.B., Sciences, 150, 178 (1968)] or the phosphoamidite method [Beaucage, S.L and Caruthers, M .H., Tetrahedron Lett. , 22, 1859 (1981); McBRIDE, L.J. and Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett., 24 245 (1983)] or by the combination of these methods.
  • phosphotriester method Letsinger, R.L and Ogilvie, K.K., K. Am. CHEM. Soc, 91, 3350 (1969); Merrifield, R.B., Sciences, 150, 178 (1968)
  • the phosphoamidite method Beaucage, S.L and Caruth
  • polypeptides of the present invention can therefore be prepared by techniques known to those skilled in the art, in particular partially by chemical synthesis or also by the recombinant DNA technique by expression in a prokaryotic or eukaryotic host cell as indicated below. .
  • the present invention particularly relates to the process for the preparation of the recombinant protein CATFIIIA having the amino acid sequence SEQ ID No. 3 comprising the expression of the DNA sequence as defined above in an appropriate host and then the isolation and purification of said recombinant protein.
  • polypeptide of the present invention it is possible in particular to use the techniques of recombinant DNA using the genetic engineering and cell culture methods known to those skilled in the art.
  • the following steps can thus be carried out: first preparation of the appropriate gene, then incorporation of this gene into a vector, transfer of the vector carrying the gene into an appropriate host cell, production of the polypeptide by expression of the gene, isolation of the polypeptide, the polypeptide thus produced can then be purified.
  • polypeptides of the present invention obtained by expression of the polynucleotides of the present invention can be purified from cell cultures transformed by methods well known to those skilled in the art such as precipitation with ammonium sulfate or ethanol, extraction under acidic conditions, chromatography anion or cation exchanger, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC). Techniques well known to those skilled in the art can be used to regenerate the protein when it is denatured during its isolation or purification.
  • the DNA sequences according to the present invention and in particular SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 can be prepared according to techniques known to those skilled in the art, in particular by chemical synthesis or by screening a genomic library or a cDNA library using probes of synthetic oligonucleotides by known hybridization techniques, thus amplification of DNA from isolated fragments or by reverse transcriptase from messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • the advantage of the technique comprising first the isolation of mRNA by extraction of total RNA then the synthesis of cDNA from these mRNA by reverse transcriptase lies in particular in the fact that the mRNA does not contain the introns then that these non-coding sequences are present in genomic DNA.
  • plasmid which can be supplied with a suitable commercial kit and then transforming a bacterial strain with the plasmid thus obtained.
  • E. coli XL1 Blue or DH5 alpha can be used.
  • the clones can then be cultured to extract the plasmid DNA according to the conventional techniques of those skilled in the art referenced above (Sambrook, Fritsh and Maniatis).
  • the amplified fragment contained in the plasmid DNA can be sequenced.
  • the polypeptides of the present invention can be obtained by expression in a host cell containing a polynucleotide according to the present invention and in particular a DNA sequence coding for a polypeptide of the present invention preceded by a suitable promoter sequence.
  • the host cell can be a prokaryotic cell, for example E. coli or a eukaryotic cell such as yeasts, for example ascomycetes, including saccharomyces, or mammalian cells, for example Cos cells.
  • the present invention particularly relates to the expression vector containing a DNA sequence as defined above.
  • such a DNA sequence is thus in particular the DNA sequence of the CAtflIIA gene coding for a protein having the biological function of the transcription factor of Candida albicans CATFIIIA and containing the nucleotide sequence SEQ ID N ° l.
  • such a DNA sequence is thus more particularly the DNA sequence starting at nucleotide 720 and ending at nucleotide 1955 of SEQ ID No. 1.
  • such a DNA sequence is thus even more particularly that of the CAtflIIA gene as defined above coding for the amino acid sequence SEQ ID No. 3.
  • such a DNA sequence is thus a DNA sequence as defined above coding for the transcription factor CATFIIIA as well as the DNA sequences which hybridize with it and / or have significant homologies with this sequence or fragments thereof or even DNA sequences comprising modifications introduced by deletion, insertion and / or substitution of at least one nucleotide coding for a protein having the same biological activity as the factor of CATFIIIA transcription.
  • such a DNA sequence is in particular a DNA sequence as defined above as well as similar DNA sequences which have a nucleotide sequence homology of at least 50% or at least. at least 60% and preferably at least 70% with said DNA sequence or similar DNA sequences which code for a protein whose AA sequence has a homology of at least 40% and in particular 45% or d 'at least 50%, rather at least 60% and preferably at least 70% with the AA sequence encoded by said DNA sequence.
  • Expression vectors are vectors allowing expression of the protein under the control of a suitable promoter.
  • Such a vector can be a plasmid, a cosmid or a viral DNA.
  • the promoter can for example be the lac promoter, the trp promoter, the tac promoter, the ⁇ -lactamase promoter or the PL promoter.
  • the promoter can be, for example, the PGK promoter or the GAL promoter.
  • the promoter can for example be the SV40 promoter or the adenovirus promoters.
  • Baculovirus-like vectors can also be used for expression in insect cells.
  • the host cells are, for example, prokaryotic cells or eukaryotic cells.
  • Prokaryotic cells are for example E. coli, Bacillus or Streptomyces.
  • Eukaryotic host cells include yeasts as well as cells of higher organisms, for example mammalian cells or insect cells.
  • the mammalian cells are for example fibroblasts such as CHO or BHK hamster cells and Cos monkey cells.
  • the insect cells are for example SF9 cells.
  • the present invention therefore relates to a method which comprises the expression of a polynucleotide according to the present invention coding for the protein CATFIIIA in a host cell transformed by a polynucleotide according to the present invention and in particular a DNA sequence coding for the acid sequence amines SEQ ID N ° 3.
  • the host cell is in particular a eukaryotic cell.
  • the vectors used can be for example pGEX or pBAD and the host cell can be E. coli or for example the vector pYX222 and the host cell can in particular be Saccharomyces cerevisiae.
  • the subject of the present invention is in particular the host cell transformed with a vector as defined above and containing a DNA sequence according to the present invention.
  • the present invention thus relates to the process for the preparation of a recombinant protein according to the present invention, as defined above, in which the host cell is E. coli DH5 alpha or E. coli XLl-Blue or in particular Saccharomyces cerevisiae .
  • the host cell is E. coli DH5 alpha or E. coli XLl-Blue or in particular Saccharomyces cerevisiae .
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • the present invention very specifically relates to the plasmid deposited at the CNCM under the number 1-2072.
  • This gene therefore corresponds to the sequence 720-1955 of SEQ ID No. 1.
  • the TFIIIA protein encoded by the CAtflIIA gene is therefore a transcription factor.
  • the TFIIIA protein encoded by the gene of the present invention has a biological role as a protein binding to DNA and would be useful as a transcription factor.
  • the gene of the present invention is expressed in different tissues and plays an important role in initiating transcription of the 5S ribosomal RNA gene.
  • the study of these factors can also be useful in the analysis of the mechanisms of regulation of transcription.
  • the subject of the present invention is therefore a method of screening for antifungal products, characterized in that it includes a step in which the activity of CATFIIIA transcription factor as defined above is measured in the presence of each of the products whose antifungal properties are to be determined and the products having an inhibitory effect on this activity are selected .
  • the activity of CATFIIIA or one of its functional counterparts consisting of a transcription factor TFIIIA is measured in the presence of each of the products for which it is desired to determine antifungal properties and products with an inhibiting effect on this activity are selected.
  • Such screening can be done by measuring the transcription activity of TFIIIA in the presence of potential activators or inhibitors to be tested.
  • the transcription of 5S RNA can for example be measured in vitro directly by detecting the synthesis of 5S RNA in an appropriate reaction medium. Transcription activity can also be measured in vivo by a cell viability test. For example, the transcription activity can be advantageously measured in cells of a mutant of Saccharomyces cerevisiae not expressing TFIIIA of SC transformed by the CAtflIIA gene.
  • the invention also encompasses the use of a product selected as indicated above for its inhibitory properties of a transcription factor TFIIIA for obtaining an antifungal agent.
  • the present invention will be better understood with the aid of the experimental part which follows and which describes the cloning of the CAtflIIa gene of the present invention.
  • the present invention thus relates to the use of a product selected by the. method of screening for antifungal products as defined above to obtain an antifungal agent.
  • the present invention also relates to the use of the gene for the transcription factor CAtflIIA of
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing, as active principle, at least one inhibitor of the transcription factor of Candida albicans as defined above.
  • Such compositions may in particular be useful for treating topical and systemic fungal infections.
  • the pharmaceutical compositions indicated above can be administered by the oral, rectal, parenteral or local route by topical application to the skin and mucous membranes or by intravenous or intramuscular injection.
  • These compositions can be solid or liquid and can be presented in all the pharmaceutical forms commonly used in human medicine such as, for example, simple or coated tablets, capsules, granules, suppositories, injections, ointments, creams, gels and aerosol preparations; they are prepared according to the usual methods.
  • the active ingredient can be incorporated therein into excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting, dispersing or emulsifying agents, preservatives.
  • excipients usually used in these pharmaceutical compositions such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting, dispersing or emulsifying agents, preservatives.
  • the dosage will vary depending on the product used, the subject being treated and the condition involved.
  • a subject of the present invention is thus in particular the use of the compositions as defined above as antifungal agents.
  • a subject of the present invention is also a method of inducing an immunological response in a mammal comprising the inoculation into this mammal of the polypeptide according to the present invention as defined above or a fragment of this polypeptide having the same function of way to produce an antibody to protect the animal from disease.
  • a subject of the present invention is thus antibodies directed against the polypeptides of the present invention as defined above having the function of transcription factor CATFIIIA or against a fragment of these polypeptides having the same function and coded by the polynucleotides of the present invention and in particular by a DNA sequence as defined above.
  • the polypeptides of the present invention can thus be used as immunogens to produce immunospecific antibodies for these polypeptides.
  • the term antibody used denotes both monoclonal and polyclonal, chimeric, single chain antibodies, non-human antibodies and human antibodies, as well as Fab fragments, thus including the products of an immunoglobulin Fab library.
  • the antibodies generated against the polypeptides of the present invention can be obtained by administration of the polypeptides of the present invention or of fragments carrying epitopes, their analogs or even cells to an animal, preferably non-human, using routine protocols for the preparation of monoclonal antibodies. Such antibodies can be prepared by methods well known in this field such as those described in the book Antibodies, Laboratory manual Ed. Harbow and David Larre, Cold Spring Harbor laboratory Eds, 1988.
  • a very particular subject of the present invention is thus an antibody directed against the CATFIIIA protein of the present invention or a fragment of this protein having in particular the same function.
  • Another subject of the present invention is the use of the gene for the transcription factor CAtflIIA or the transcription factor encoded by this gene as defined above for the preparation of compositions useful for the diagnosis or treatment of diseases caused by yeast pathogenic Candida albicans.
  • the present invention also relates to the use of the polynucleotides of the present invention as diagnostic reagents.
  • the detection of a polynucleotide according to the present invention coding for the protein TFIIIA of Candida albicans or its analogues in a eukaryote in particular a mammal and more particularly a human being can constitute a means of diagnosis of a disease: thus, one can detect such a polynucleotide according to the present invention and in particular a DNA sequence by a wide variety of techniques in a eukaryote in particular a mammal and more particularly a human being, infected by an organism containing at least one of the polynucleotides of the present invention.
  • the nucleic acids for such use as a diagnostic tool can be detected from infected cells or tissues, such as bone, blood, muscle, cartilage or skin.
  • genomic DNA can be used directly or even be amplified by PCR or another amplification technique.
  • RNA or DNA and cDNA can also be used for the same purpose.
  • the line of the fungus present in a eukaryote, in particular a mammal and more particularly a human being can be characterized by the analysis of the genotype. Deletions or insertions can be detected by the change in size of the amplified product by comparison with the genotype of the reference sequence.
  • the mutation points can be identified by hybridization DNA amplified with the radioactively labeled sequences of polynucleotides of the present invention. Perfectly complementary sequences can thus be distinguished from duplexes which are poorly resistant to digestion by nucleases. Differences in DNA sequences can also be detected by alterations in the electrophoretic mobility of DNA fragments in gels, with or without denaturing agent, or by direct DNA sequencing (reference: Myers et al. Science, 230: 1242 (1985)).
  • Sequence changes at specific locations can also be revealed by nuclease protection experiments such as RNase I and SI or by chemical cleavage methods (reference: Cotton et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 85: 4397-4401 (1985)
  • Cells containing one of the polynucleotides of the present invention carrying mutations or polymorphisms can also be detected by a large number of techniques which in particular make it possible to determine the serotype, for example the RT technique -PCR can be used to detect mutations. It is particularly preferred to use RT-PCR techniques in conjunction with automatic detection systems, such as for example in the GeneScan technique.
  • RNA and ADNC can be used in the techniques PCR or RT-PCR.
  • primers complementary to the polynucleotides encoding the polypeptides of the present invention can be e used to identify and analyze mutations.
  • Primers can thus be used to amplify DNA isolated from the infected individual. In this way mutations in the DNA sequence can be detected and used to diagnose the infection and determine the serotype or classification of the infectious agent.
  • Such techniques are usual for those skilled in the art and are described in particular in the manual 'Current Protocols in Molecular Biology', Ausubel et al, ed. John Wiley ⁇ sons, Inc., 1995).
  • the present invention thus relates to a method for diagnosing a disease and preferably a fungal infection caused in particular by Candida albicans such as yeast infections as indicated above, this method comprising determining from a sample taken from an infected individual, an increase in the amount of polynucleotide of the present invention.
  • Such a polynucleotide can in particular have a DNA sequence of the present invention as defined above. Increases or decreases in the amount of polynucleotides can be measured by techniques well known to those of skill in the art, such as amplification, PCR, RT PCR, Northern blotting or other hybridization techniques.
  • a diagnostic method in accordance with the present invention consists in detecting an excessive expression of the polypeptides of the present invention, by comparison with control samples made up of normal, uninfected tissues used to detect the presence of an infection.
  • the present invention also relates to a kit for the diagnosis of fungal infections comprising a DNA sequence according to the present invention as defined above or a sequence having a similar function or a functional fragment of this sequence, the encoded polypeptide by this sequence or a polypeptide fragment having the same function or an antibody directed against such a polypeptide encoded by this DNA sequence or against a fragment of this polypeptide.
  • This kit may thus contain a DNA sequence according to the present invention as defined above and for example the DNA sequence SEQ ID No. 1 or a fragment of this sequence or even the sequence 720 to 1955 of SEQ ID N ° l.
  • kit may likewise contain a polypeptide according to the present invention or a fragment of this polypeptide and in particular the protein having the sequence in AA SEQ ID No. 3 or still an antibody as defined above.
  • a kit can be prepared according to methods well known to those skilled in the art.
  • the bacterium Escherichia coli (E. coli) of the line DH5 alpha (Gibco BRL) or XL1-Blue type K12 (Stratagene) was used for the preparation of the plasmids of the present invention.
  • the growth of this bacterium was carried out according to the usual conditions in LB liquid medium which contains 10 g of bacterotryptone, 5 g of yeast extract and 10 g of NaCl for one liter of water and which also contains 100 microg / ml of 'ampicillin (SIGMA).
  • the incubation was carried out at 37 ° C. under a normal atmosphere and shaking at 225 rpm.
  • the viability of the strain is checked when the strain grows on LB medium + ampicillin at 100 microg / ml. It can be noted that an ampicillin Bla resistance gene is part of the vector into which the CAtflIIA fragments are cloned.
  • the selection of the strains containing the plasmids containing the tflIIA gene of Candida albicans of the present invention can be carried out by the culture of the strains in this medium containing ampicillin (100 microg / ml), such a medium allowing survival only strains which contain the ampicillin resistance gene and thus only strains which contain the tflIIA gene from Candida a. of the present invention.
  • ampicillin 100 microg / ml
  • the Plasmid DNA of several bacteria from each of the clones indicated below is prepared using a commercial kit (Qiagen Plasmids kit) .
  • the fragments corresponding to the sequence of the CAtflIIA gene are sequenced on both strands according to conventional techniques known in the art. skilled in the art (use of the ABI 377 XL sequencer, Perkin Elmer) b) Cloning and sequencing of the CAtflIIA gene:
  • the gene coding for the transcription factor of CA ie SEQ ID No. 1 represented in FIG. 1, was isolated from the genomic fragment library of Candida albicans. (Sanglard et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 39, 2378-2386, (1995)). The structure of the gene has been identified by sequencing. The strategy used is based on the assumption that SC and CA are close yeasts whose gene structure can be homologous. We proceeded as follows:
  • oligonucleotides also made it possible to synthesize a DNA fragment from genomic DNA from Candida albicans in order to prepare a probe labeled with 32P (phosphorus 32) using a kit (Mega Prime, Amersham). This fragment was used for the screening of the Sau 3A genomic fragment library of Candida albicans cloned into the BamHI site of the vector YEp24 (multicopy-Ura3) [Botstein et al., Gene, 8, 17-24, (1979)] .
  • the E. coli DH5 alpha cells transformed with the vector YEp24 (multicopy vector with selection gene URA3) containing the fragments described above (17,000 clones) are spread on dishes containing LB + ampicillin medium and cultured at 37 ° C.
  • the filters are kept for 10 minutes at
  • the probe is labeled with 32P with the MegaPrime kit and (alpha
  • Hybridization on a filter with the 32P-labeled probe made it possible to select several positive clones which were reseeded on dishes in order to isolate them. Individual clones were thus isolated.
  • the YEp24 plasmids containing Candida albicans inserts were recovered from these colonies.
  • the restriction map of each of these plasmids was established, and made it possible to note that all of the inserts came from the same region of the genome of Candida albicans.
  • the following oligonucleotides were used: INT-Cand located at position: 720-740 of SEQ ID No. 1 and named
  • TFIIIA of Saccharomyces cerevisiae Analysis of the protein makes it possible to find the 9 zinc finger patterns which are characteristic of the transcription factor TFIIIA.
  • the comparison of the protein sequences of CATFIIIA and TFIIIA of SC makes it possible to highlight a similarity of 50% and an identity of 45%.
  • account has been taken of the fact that in Candida albicans the codon CTG is translated into serine and that there are 2 CTG codons in Candida albicans TFIIIA.
  • a fragment contained in clone 9 was amplified by PCR using primers containing the sequences recognized by the restriction enzymes EcoRI and Xhol and hybridizing to the tfC2 gene, the primers are the following: 5-EcoTF located at position 720 -732 of SEQ ID N ° l and named SEQ ID N ° 8 and
  • 0.5 micrograms of DNA of clone 9 are added to 50 microliters of a reaction solution containing 200 nanograms / ml of each dNTP, the primers indicated above at a rate of 25 micromoles / 1 for each, 2mM MgC12, 1 x Pfu Buffer, 5U Pfu polymerase (Perkin Elmer).
  • the reaction medium is subjected to 30 PCR cycles each corresponding to 94 ° C for 30 seconds, then to 60 ° C for 45 seconds then to 72 ° C for 1 minute.
  • the fragment containing the coding sequence for CATFIIIA was subcloned into the vectors pYX122 (CEN, HIS 3) and pYX222 (2 micron, HIS3) (R and D System).
  • This plasmid was used to transform cells of Saccharomyces c. YWRI (Mat alpha, can 1-100, his 3-11, leu 2-3, 112 trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, tfC2 :: leu2 + pJA230), (Camier et al, Proc Natl. Acad. Sci. 92 9338-9342, 1995).
  • the TFIIIA factor gene of Candida albicans was isolated in three clones 9, 18 and 47 obtained as indicated above in Example 1 from the gene bank of Candida albicans using a hybridization technique. The structure of this gene has been identified by sequencing.
  • the CATFIIIA protein of the CAtflIIA gene obtained in Example 1 consists of 412 AA and shows strong homology with the factor TFIIIA of SC. This protein contains a region rich in SER residues in the N-terminal part and 9 zinc fingers whose arrangement is identical to that of the protein TFIIIA of SC. 3) The subcloning of the factor TFIIIA gene from Candida albicans was carried out and the gene was placed under the control of an SC promoter.

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Abstract

La présente invention concerne le facteur de transcription de Candida albicans nommé ci-après CATFIIIA et ses analogues ainsi que les polynucléotides (ARN, ADN) codant pour cette protéine ou pour les polypeptides analogues de cette protéine et également le procédé de préparation de ces polypeptides et polynucléotides, leur utilisation pour la préparation d'inhibiteurs de ce facteur de transcription CATFIIIA pouvant être utilisés comme agents antifongiques et les compositions pharmaceutiques contenant de tels inhibiteurs.

Description

Gène tflIIA de Candida albicans (CatflIIA) et la protéine codée CATFIIIA.
La présente invention concerne le facteur de transcrip- tion de Candida albicans nommé ci-après CATFIIIA et ses analogues ainsi que les polynucleotides (ARN, ADN) codant pour cette protéine ou pour les polypeptides analogues de cette protéine.
La présente invention concerne également le procédé de préparation de ces polypeptides et polynucleotides, leur utilisation pour l'étude des mécanismes de la transcription chez Candida albicans et pour la préparation d'inhibiteurs de ce facteur de transcription CATFIIIA pouvant être utilisés comme agent antifongiques et les compositions pharmaceutiques contenant de tels inhibiteurs.
La présente invention concerne donc notamment un nouveau facteur de transcription de Candida albicans et la séquence d'ADN codant pour ce facteur de transcription, leur préparation et leurs utilisations. Nous utiliserons également ci-après les abréviations suivantes : AA pour acides aminés, AN pour acides nucléiques, ARN pour acide ribonucleique, RNase pour ribonuclease, ADN ou DNA pour acide désoxyribonucléique, ADNc pour ADN complémentaire, pb pour paires de bases, PCR pour réaction en chaîne par une polymerase, CA ou Candida a. pour Candida albicans et SC ou Saccharomyces c. pour Saccharomyces cβrevisiae.
On utilisera également le terme screening qui désigne une technique de criblage spécifique et le terme primer qui désigne un oligonucléotide utilisé en amorce. Le terme polynucleotides désigne ci-après les polynucleotides de la présente invention soit les séquences d'ADN et également ARN codant pour le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses homologues ayant la même fonction de facteur de transcription. Le terme CAtflIIA a le sens donné ci-dessus à polynucleotides.
Le terme polypeptides désigne ci-après les polypeptides de la présente invention soit le facteur CATFIIIA de la présente invention et ses analogues ou homologues fonctionnels tels que définis ci-après, ayant donc la même fonction de facteur de transcription. Le terme CATFIIIA a le sens donné ci-dessus à polypeptides.
Nous appellerons tflIIA (ou tfC2) le gène codant pour le facteur de transcription TFIIIA tandis que CAtflIIA (ou CAtfC2) désigne le gène codant- our le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
Le spectre des infections fongiques connues s'étend de l'attaque fongique de la peau ou des ongles à des infections mycotiques plus graves d'organes internes. De telles infections et les maladies qui en résultent sont identifiées comme des mycoses. Des substances antimycotiques à effets fongistatiques ou fongicides, sont utilisées pour le traitement de ces mycoses. La présente invention concerne ainsi l'identification de substances antimycotiques et notamment de substances anti- Candida albicans .
La présente invention concerne ainsi des inhibiteurs de facteurs de transcription pouvant être utilisés comme agents antifongiques.
Candida albicans est une levure pathogène qui cause des maladies infectieuses dans l'organisme humain. Dans le but de trouver des moyens de traiter des maladies, on peut choisir des cibles intracellulaires et le facteur de transcription TFIIIA peut être l'une de ces cibles.
Dans les organismes eucaryotes, ce facteur- joue un rôle clé dans l'initiation de la transcription des gènes ARN 5S par la RNA-polymérase III. En particulier, pour SC qui est une levure proche de CA, il a été montré que cette levure SC ne pouvait pas survivre sans une source additionnelle de ARN 5S lorsque le gène chromosomique du facteur TFIIIA était interrompu, cet ARN 5S additionnel étant synthétisé au moyen d'un plasmide sans la participation du facteur TFIIIA (référence: S. Camier, A. -M. Dechampesme, A. Sentenac . /Proc . Natl. Acad. Sci. (1995) 92, 9338-9342).
Le gène tflIIA et la protéine correspondante TFIIIA seraient impliqués dans la régulation du mécanisme biologique de la transcription comme indiqué ci-après. Depuis que la protéine TFIIIA a été purifiée comme facteur de transcription pour la première fois en 1980 à partir d'ovocytes de Xénope [Segall et Al, J. Biol. Chem., 255, 11986-11991 (1980)], des travaux ont été menés in vivo et in vitro dans le Xénope pour étudier le mécanisme de contrôle de la transcription exercé par TFIIIA. On a ainsi montré que TFIIIA de Xénope est nécessaire pour l'initiation de la transcription du gène ARN 5S [Sakonji et al, Cell 19, 13-25 (1980)] et se lie à une région de contrôle interne du gène ARN 5S [Bogenhagen et al, Cell, 19 ,..27-35 (1980)].
La séquence en nucléotides de l'ADNc de tflIIA de xénope et la séquence correspondante en acides aminés ont déjà été publiées [Ginberg et al, Cell, 39,479-489 (1984)]. On peut noter que ce gène code pour une protéine ayant 9 doigts de zinc, un doigt de zinc correspondant à un motif contenant deux cystéines et deux histidines reliées par un atome de zinc (CYS2 HIS2) (C2H2) . Cette structure en doigt de zinc constitue un domaine de liaison des protéines à l'ADN et est donc considérée comme un domaine essentiel pour un groupe de protéines qui se lient à l'ADN (DNA binding proteins) . [Miller et al, Embo J., 4, 1607-1614 (1985)]
On peut noter que l'on connaît d'autres facteurs de transcription se liant à l'ADN qui possèdent également cette structure en doigt de zinc tels que par exemple, chez.- l' être humain, XTl du gène de la tumeur humaine de Wilms, [Gessier et al, Nature, 343, 774-778 (1990)], le répresseur humain de transcription YY1 [Shi et al, Cell, 67, 377-388 (1991)], la protéine MAZ associée au promoteur cMYC [Bossone et al, Proc . Natl. Acad. Sci., USA, 89, 7452-7456 (1992)] ou encore spl [Ku ahara et al, J. Biol. Chem, 29, 8627-8631 (1990)].
L'étude de différents organismes tels que notamment l'homme, le xénope ou Candida albicans a montré qu'il existe ce que l'on peut appeler une famille de facteurs de transcriptions TFIIIA possédant les caractéristiques suivantes : - ils sont associés à l'ARN polymerase III
- ils possèdent 9 doigts de zinc
- ils sont indispensables pour la transcription du gène codant pour l'ARN 5S. Une fonction essentielle connue de la protéine codée par le gène tflIIA (tfC2) de la levure est d'initier la transcription du gène de l'ARN 5S chez Saccharomyces cerevisiae (Camier et al., Proc . Natl. Acad. Sa USA (1995) 92 : 9338-9342) .
La présente invention a ainsi permis d' isoler les polynucleotides ADN et ARN codant pour la protéine du facteur de transcription CATFIIIA de Candida albicans et de révéler leurs séquences nucléotidiques . La présente invention a donc pour objet un polynucléotide isolé contenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe suivant : a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la séquence SEQ ID N°3 indiquée ci-après. b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consé- cutives du polynucléotide défini en a) et b) .
La présente invention a ainsi pour objet un polynucléotide défini ci -dessus tel que ce polynucléotide est un ADN.
La présente invention a ainsi pour objet un polynucléotide défini ci-dessus tel que ce polynucléotide est un ARN.
La présente invention a plus précisément pour objet le polynucléotide tel que défini ci -dessus comprenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°l.
La présente invention a ainsi permis d' isoler la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA.
La présente invention a également permis de révéler la séquence d'acides nucléiques du gène CAtflIIA et également la séquence d'acides aminés de la protéine CATFIIIA codée par ce gène .
La présente invention a ainsi pour objet une séquence d'ADN telle que définie par le polynucléotide ci-dessus caractérisée en ce que cette séquence d'ADN est celle du gène CAtflIIA codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°l. Une telle séquence SEQ ID n°l de la présente invention comprend donc 2060 nucléotides.
La présente invention a précisément pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ayant la séquence commençant au nucléotide 720 et se terminant au nucléotide 1955 de SEQ ID N°l. Une telle séquence comprend donc 1236 nucléotides.
La présente invention a aussi pour objet la séquence d'ADN du gène CAtflIIA telle que définie ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
La séquence SEQ ID N°3 comprend donc 412 AA. La présente invention a particulièrement pour objet la séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
La présente invention a notamment pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucléotidique d'au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN.
La présente invention a ainsi également pour objet la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protéine de fonction similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec la séquence en AA codée par ladite séquence d'ADN. Par séquences qui hybrident, on inclut les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standard de stringence élevée, moyenne ou basse et qui codent pour un polypeptide ayant la même fonction de facteur de transcription. Les conditions de stringence sont celles réalisées dans les conditions connues de l'homme du métier telles que celles décrites par Sambrook et al, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. De telles conditions de stringence sont par exemple une hybridation à 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt ' s ; 100 μg/ml ADNss ; 1 % SDS suivie de 3 lavages pendant 5 minutes avec 2 x SSC ; 0,05 % SDS, puis 3 lavages pendant 15 minutes à 65°C dans 1 x SSC ; 0,1 % SDS. Les conditions de forte stringence comprennent par exemple une hybridation à 65°C, pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE ; 10 x Denhardt ; 100 μg/ml ADNss ; 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC ; 0,05 % SDS à 65°C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC ; 0,1 % SDS à 65°C. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 65°C.
Par séquences qui présentent des homologies significatives, on inclut les séquences ayant une identité. odérée ou importante de séquence nucleotidique avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction de facteur de transcription.
Par séquence d'ADN similaires, on entend ainsi des séquences d'ADN qui peuvent appartenir à d'autres mycètes que Candida albicans et notamment à SC, et qui sont similaires ou identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans CatflIIA. Ces séquences d'ADN similaires ne sont pas forcément identiques à la séquence d'ADN du gène de Candida albicans CatflIIA. L' homologie de séquence au niveau nucleotidique peut-être modérée ou importante. La présente invention concerne ainsi notamment les séquences d'ADN qui présentent une homologie de séquence nucleotidique d'au moins 50 %, de façon préférée d'au moins 60 % et de façon encore plus préférée d'au moins 70 % avec la séquence CAtflIIA de la présente invention.
De plus, ces séquences d'ADN similaires ne codent pas forcément pour des protéines identiques, au niveau de la séquence en acides aminés, à la protéine codée par le gène CAtflIIA. Ainsi la présente invention concerne notamment les séquences d'ADN qui codent pour des protéines dites homologues ayant une homologie de séquence en acides aminés d'au moins 40 %, notamment 45 %, de façon préférée au moins de 50 %, de façon plus préférée au moins de 60 % et de façon encore plus préférée au moins de 70 % avec la protéine codée par CAtflIIA de la présente invention.
Le gène de la présente invention est représenté comme une séquence ADN simple brin comme indiqué dans SEQ ID N°l mais il est entendu que la présente invention inclut la séquence ADN complémentaire de cette séquence ADN simple brin et inclut également la séquence ADN dite double brin constituée de ces deux séquences ADN complémentaires d'une de l'autre. La séquence d'ADN telle que définie ci-dessus est un exemple de combinaison de codons codant pour les acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3, mais il est entendu également que la présente invention inclut toute autre combinaison arbitraire de codons codant pour cette même séquence d'acides aminés SEQ ID N°3.
Pour la préparation des polynucleotides et notamment des séquences d'ADN telles que définies ci-dessus, des séquences d'ADN modifiées comme indiqué ci-dessus ou encore des séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus, on peut utiliser les techniques connues de l'homme du métier et notamment celles décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J. Fritsh, E. F. § Maniatis, T. (1989) intitulé : 'Molecular cloning : a laboratory manual ' , Laboratory, Cold Spring Harbor NY. Les séquences d'ADN homologues telles que définies ci-dessus peuvent notamment être isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier par exemple par la technique de PCR en utilisant des amorces nucléotidiques dégénérées pour amplifier ces ADN à partir de banques génomiques ou de banques d'ADNc des mycètes correspondants. Les ADNc peuvent également être préparés à partir de ARN isolés de mycètes d'espèces différentes étudiées dans le cadre de la présente invention telles que Candida albicans mais par exemple et tout aussi bien : Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotro- picalis, Candida quillermondii, Candida glabrata, Candida lusianiae ou Candida rugosa ou encore des mycètes telles que Saccharomyces cerevisiae ou encore des mycètes du type Asper- gillus ou Cryptococcus et notamment, par exemple, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoc- cidioides brasiliens and Sporothrix schenckii ou encore des mycètes des classes des phycomycetes or eumycetes en particulier les sous-classes de basidiomycètes, ascomycètes, mehiascomycétales (levure) et plectascales, gymnascales (champignon de la peau et des cheveux) ou de la classe des hyphomycètes, notamment les sous-classes conidiosporales et thallosporales parmi lesquels les espèces suivantes : mucor, rhizopus, coccidioides, paracoccidioides (blastomyces, brasiliensis) , endomyces (blastomyces) , aspergillus, menici- lium (scopulariopsis) , trichophyton (ctenomyces) , epidermo- phton, microsporon, piedraia, hormodendron, phialophora, sporotrichon, cryptococcus, candida, geotrichum, trichosporon ou encore toropsulosis .
Les polynucleotides de la présente invention peuvent ainsi être obtenus en utilisant les méthodes usuelles de clonage et de criblage telles que celles de clonage et sequençage à partir de fragments d'ADN chromosomique extraits de cellules. Par exemple, pour obtenir les polynucleotides de la présente invention, on peut partir d'une banque de fragments d'ADN chromosomique. On peut préparer une sonde correspondant à un oligonucléotide marqué par un élément radioactif, constituée de préférence de 17 nucléotides ou plus et dérivée d'une séquence partielle. Les clones contenant un ADN identique à celui de la sonde peuvent être ainsi identifiés sous des conditions stringentes. Par le sequençage de clones individuels ainsi identifiés, en utilisant des primers de sequençage issus de la séquence d'origine, il est alors possible de prolonger la séquence dans les deux directions pour déterminer la séquence du gène complet. De façon usuelle et efficace, un tel sequençage peut être réalisé en utilisant un ADN double brin dénaturé préparé à partir d'un plasmide. De telles techniques sont décrites par Maniatis, T. Fritsch, E.F. et Sambrook comme indiqué ci- dessus . (Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989) (notamment en 1.90 et 13.70 dans les chapitres de screening par hybridation et sequençage à partir de ADN double brin dénaturé) .
Dans le cadre de la présente invention, on pourrait notamment utiliser une banque de fragments d'ADN chromosomique de Candida albicans comme indiqué ci-après à l'exemple 1 dans la partie expérimentale.
Une description détaillée des conditions opératoires dans lesquelles a été réalisée la présente invention est donnée ci-après. L'invention a tout particulièrement pour objet le polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus et les analogues de ce polypeptide. Par analogues de polypeptides, on entend les polypeptides dont la séquence d'acides aminés a été modifiée par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés mais qui conservent la même fonction biologique. De tels polypeptides analogues peuvent être produits spontanément ou peuvent être produits par modification post- transcriptionnelle ou encore par modification de la séquence ADN de la présente invention comme indiqué ci-dessus, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier : parmi ces techniques, on peut citer notamment la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier (Kramer, W., et al., Nucl. Acids Res . , 12, 9441 (1984) ; Kramer, W. and Fritz, H.J. , Methods in Enzymology, 154, 350 (1987) ; Zoller, M.J. and Smith, M. Methods in Enzymology, 100, 468 ( 1983 ) ) .
La synthèse d'ADN modifiés peut être faite comme indiqué ci- dessus et notamment en utilisant des techniques de synthèse chimique bien connues telles que par exemple la méthode au phosphotriester [Letsinger, R.L and Ogilvie, K.K., K. Am. CHEM. Soc, 91, 3350 (1969) ; Merrifield, R.B., Sciences, 150, 178 (1968)] ou la méthode à la phosphoamidite [Beaucage, S.L and Caruthers , M .H., Tetrahedron Lett . , 22, 1859 (1981) ; McBRIDE, L.J. and Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett., 24 245 (1983)] ou encore par la combinaison de ces méthodes. Les polypeptides de la présente invention peuvent donc être préparés par les techniques connues de l'homme du métier, notamment partiellement par synthèse chimique ou encore par la technique de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote comme indiqué ci-après .
La présente invention a particulièrement pour objet le procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN telle que définie ci-dessus dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protéine recombinante.
Pour produire le polypeptide de la présente invention, on peut notamment utiliser les techniques de l'ADN recombi- nant en utilisant les méthodes de génie génétique et de culture cellulaire connues de l'homme du métier. On peut ainsi procéder par les étapes suivantes : d'abord préparation du gène approprié, puis incorporation de ce gène dans un vecteur, transfert du vecteur porteur du gène dans une cellule hôte appropriée, production du polypeptide par expression du gène, isolement du polypeptide, le polypeptide ainsi produit pouvant être ensuite purifié.
Les polypeptides de la présente invention obtenus par l'expression des polynucleotides de la présente invention peuvent être purifiés à partir de cultures de cellules transformées par les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que précipitation au sulfate d'ammonium ou à l'éthanol, extraction en conditions acides, chromâtographie échangeuse d'anions ou de cations, chromatographie d'interaction hydrophobique, chromatographie d'affinité, chromatographie à l' hydroxylapâtite et la chromatographie à haute performance liquide (HPLC) . Des techniques bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour régénérer la protéine lorsque celle-ci est dénaturée durant son isolement ou sa purification.
Les séquences d'ADN selon la présente invention et notamment SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 peuvent être préparées selon les techniques connues de l'homme du métier notamment par synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique ou d'une banque d'ADNc à l'aide de sondes d' oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation, ainsi amplification d'ADN à partir de fragments isolés ou encore par réverse transcriptase à partir d'ARN messager (ARNm) . L'avantage de la technique comprenant d'abord l'isolement d'ARNm par extraction des ARN totaux puis la synthèse d'ADNc à partir de ces ARNm par réverse transcriptase réside notamment dans le fait que l'ARNm ne contient pas les introns alors que ces séquences non codantes sont présentes dans l'ADN génomique.
On peut procéder en utilisant les techniques usuelles de clonage connues de l'homme du métier et notamment décrites dans l'ouvrage de Sambrook, J. Fritsh, E. F. § Maniâtis, T. (1989) intitulé: 'Molecular cloning : a laboratory manual ' , Laboratory, Cold Spring Harbor NY.
Dans ces techniques, on peut procéder au clonage par insertion de fragment dans un plasmide qui peut être fourni avec un kit commercial adapté puis transformation d'une souche bactérienne par le plasmide ainsi obtenu. On peut utiliser notamment la souche E. coli XL1 Blue ou DH5 alpha. Les clones peuvent ensuite être cultivés pour extraire l'ADN plasmidique selon les techniques classiques de l'homme du métier référencées ci-dessus (Sambrook, Fritsh et Maniatis) . On peut procéder au sequençage de l'ADN du fragment amplifié contenu dans l'ADN plasmidique.
Les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par expression dans une cellule hôte contenant un polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN codant pour un polypeptide de la présente invention précédée d'une séquence promoteur convenable. La cellule hôte peut être une cellule procaryote, par exemple E. coli ou une cellule eucaryote telle que les levures comme par exemple les ascomycètes parmi lesquels les saccharomyces ou encore des cellules de mammifères comme par exemple des cellule Cos.
La présente invention a particulièrement pour objet le vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est donc ainsi notamment la séquence d'ADN du gène CAtflIIA codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°l . Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi plus particulièrement la séquence d'ADN commençant au nucléotide 720 et se terminant au nucléotide 1955 de SEQ ID N°l.
Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi encore plus particulièrement celle du gène CAtflIIA tel que défini ci-dessus codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3. Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est ainsi une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus codant pour le facteur de transcription CATFIIIA ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci ou encore les séquences d'ADN comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA. Dans le vecteur d'expression, une telle séquence d'ADN est notamment une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus ainsi que les séquences d'ADN similaires qui ont une homologie de séquence nucleotidique d'au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN ou encore les séquences d'ADN similaires qui codent pour une protéine dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec la séquence en AA codée par ladite séquence d'ADN. Les vecteurs d'expression sont des vecteurs permettant l'expression de la protéine sous le contrôle d'un promoteur convenable. Un tel vecteur peut être un plasmide, un cosmide ou un ADN viral. Pour les cellules procaryotes, le promoteur peut être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur tac, le promoteur β-lactamase ou le promoteur PL. Pour les cellules de levure, le promoteur peut être par exemple le promoteur PGK ou le promoteur GAL. Pour les cellules de mammifères, le promoteur peut être par exemple le promoteur SV40 ou les promoteurs de l' adénovirus .
Des vecteurs type Baculovirus peuvent être aussi utilisés pour l'expression dans des cellules d'insectes. Les cellules hôtes sont par exemple des cellules procaryotes ou des cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes sont par exemple E. coli, Bacillus ou Streptomyces . Les cellules hôtes eucaryotes comprennent des levures ainsi que des cellules d'organismes supérieurs, par exemple des cellules de mammifères ou des cellules d'insectes. Les cellules de mammifères sont par exemple des fibroblastes tels que des cellules CHO ou BHK de hamster et des cellules Cos de singe. Les cellules d'insectes sont par exemple des cellules SF9.
La présente invention concerne donc un procédé qui comprend l'expression d'un polynucléotide selon la présente invention codant pour la protéine CATFIIIA dans une cellule hôte transformée par un polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID N°3. Dans la réalisation d'un tel procédé, la cellule hôte est notamment une cellule eucaryote.
Pour la réalisation de la présente invention, les vecteurs utilisés peuvent être par exemple pGEX ou pBAD et la cellule hôte peut être E. coli ou par exemple le vecteur pYX222 et la cellule hôte peut être notamment Saccharomyces cerevisiae.
La présente invention a notamment pour objet la cellule hôte transformée avec un vecteur tel que défini ci-dessus et renfermant une séquence d'ADN selon la présente invention. La présente invention a ainsi pour objet le procédé de préparation d'une protéine recpmbinante selon la présente invention, tel que défini ci-dessus, dans lequel la cellule hôte est E. coli DH5 alpha ou E. coli XLl-Blue ou notamment Saccharomyces cerevisiae. Un exposé détaillé des conditions dans lesquelles peuvent être menées les opérations indiquées ci-dessus est donné ci- après dans la partie expérimentale. On a ainsi obtenu un plasmide dans lequel est inséré le gène de la présente invention et on obtient ainsi également ce plasmide introduit dans une cellule hôte en opérant selon les techniques usuelles connues de l'homme du métier.
La présente invention a très précisément pour objet le plasmide déposé à la CNCM sous le numéro 1-2072.
Il s'agit ainsi précisément de la souche XL1-Blue/Yep24- Catfc2 renfermant le gène CAtflIIA selon la présente invention.
Ce gène correspond donc à la séquence 720-1955 de SEQ ID N°l.
Les conditions opératoires dans lesquelles a été réalisée la présente invention sont décrites ci-après dans la partie expérimentale .
La protéine TFIIIA codée par le gène CAtflIIA est donc un facteur de transcription. En effet, la protéine TFIIIA codée par le gène de la présente invention a un rôle biologique comme protéine se liant à l'ADN et serait utile comme facteur de transcription.
En particulier, le gène de la présente invention est exprimé dans différents tissus et joue un rôle important dans l'initiation de la transcription du gène de l'ARN ribosomal 5S. L'étude de ces facteurs peut également être utile dans l'analyse des mécanismes de régulation de la transcription. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de criblage de produits antifongiques caractérisé en ce qu'il comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que défini ci-dessus en présence de chacun des produits dont on souhaite déterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
La mise en évidence dans le cadre de la présente invention de l' homologie fonctionnelle des facteurs de transcription de Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae, illustrée dans la partie expérimentale ci-après, permet d'envisager de nombreuses applications pour le facteur de transcription CATFIIIA de la présente invention.
En particulier du fait qu'il apparaît que l'activité de SCTFIIIA est essentielle pour la survie cellulaire, des substances inhibitrices de cette activité peuvent être utilisables comme agents antifongiques, soit en tant que médicaments soit sur le plan industriel .
Par exemple, pour cribler des substances antifongiques telles que des substances actives sur Candida albicans, on mesure l'activité de CATFIIIA ou de l'un de ses homologues fonctionnels constitué par un facteur de transcription TFIIIA en présence de chacun des produits dont on souhaite déterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
On peut effectuer un tel criblage en mesurant l'activité de transcription de TFIIIA en présence d' activateurs ou d'inhibiteurs potentiels à tester. La transcription de l'ARN 5S peut par exemple être mesurée in vitro directement en détectant la synthèse de l'ARN 5S dans un milieu réactionnel approprié . L'activité de transcription peut également être mesurée in vivo par un test de viabilité cellulaire. Par exemple, l'activité de transcription peut être avantageusement mesurée dans des cellules d'un mutant de Saccharomyces cerevisiae n'exprimant pas TFIIIA de SC transformées par le gène CAtflIIA.
L'invention englobe également l'utilisation d'un produit sélectionné comme indiqué ci-dessus pour ses propriétés inhibitrices d'un facteur de transcription TFIIIA pour l'obtention d'un agent antifongique.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide de la partie expérimentale qui suit et qui décrit le clonage du gène CAtflIIa de la présente invention. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné par le. procédé de criblage de produits antifongiques tel que défini ci-dessus pour l'obtention d'un agent antifongique.
La présente invention a également pour objet l'utili- sation du gène du facteur de transcription CAtflIIA de
Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que défini ci-dessus pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques tel que défini ci-dessus et utilisé comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans .
La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans telles que définies ci-dessus. De telles compositions peuvent notamment être utiles pour traiter les infections fongiques topiques et systémiques. Les compositions pharmaceutiques indiquées ci-dessus peuvent être administrées par voie buccale, rectale, par voie parenterale ou par voie locale en application topique-' sur la peau et les muqueuses ou par injection par voie intraveineuse ou intramusculaire. Ces compositions peuvent être solides ou liquides et se présenter sous toutes les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine comme, par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les pommades, les crèmes, les gels et les préparations en aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le principe actif peut y être incorporé à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie sera variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause. La présente invention a ainsi notamment pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-dessus comme agents antifongiques.
La présente invention a encore pour objet une méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide selon la présente invention tel que défini ci-dessus ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie . La présente invention a ainsi pour objet des anticorps dirigés contre les polypeptides de la présente invention tels que définis ci-dessus ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA ou contre un fragment de ces polypeptides ayant la même fonction et codés par les polynucleotides de la présente invention et notamment par une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus.
Les polypeptides de la présente invention peuvent ainsi être utilisés comme immunogènes pour produire des anticorps immunospécifiques de ces polypeptides. Le terme anticorps utilisé désigne les anticorps aussi bien monoclonaux que polyclonaux, chimériques, simple chaîne, les anticorps non humains et les anticorps humains, aussi bien que les fragments Fab, incluant ainsi les produits d'une banque d' immunoglobuline Fab. Les anticorps générés contre les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par administration des polypeptides de la présente invention ou de fragments portant des épitopes, leurs analogues ou encore des cellules à un animal, de préférence non humain, en utilisant des protocoles de routine pour la préparation d'anticorps monoclonaux. De tels anticorps peuvent être préparés par les méthodes bien connues dans ce domaine telles que celles décrites dans l'ouvrage Antibodies, Laboratory manuel Ed. Harbow et David Larre, Cold Spring Harbor laboratory Eds, 1988.
La présente invention a ainsi tout particulièrement pour objet un anticorps dirigé contre la protéine CATFIIIA de la présente invention ou un fragment de cette protéine ayant notamment la même fonction.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation du gène du facteur de transcription CAtflIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène tel que défini ci-dessus pour la préparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans .
La présente invention concerne aussi l'utilisation des polynucleotides de la présente invention comme réactifs de diagnostic. La détection d'un polynucléotide selon la présente invention codant pour la protéine TFIIIA de Candida albicans ou de ses analogues chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, peut constituer un moyen de diagnostic d'une maladie : ainsi, on peut détecter un tel polynucléotide selon la présente invention et notamment une séquence d'ADN par une grande variété de techniques chez un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, infectés par un organisme contenant au moins l'un des polynucleotides de la présente invention. Les acides nucléiques pour une telle utilisation d'outil de diagnostic peuvent être détectés à partir de cellules ou de tissus infectés-, tels que l'os, le sang, le muscle, le cartilage ou la peau. Pour cette détection, l'ADN génomique peut être utilisé directement ou encore être amplifié par PCR ou une autre technique d'amplification. Les ARN ou ADN et ADNc peuvent également être utilisés dans le même but. Par les techniques d'amplification, la lignée du mycète présent dans un eucaryote en particulier un mammifère et plus particulièrement un être humain, peut être caractérisée par l'analyse du génotype. Des délétions ou des insertions peuvent être détectées par le changement de taille du produit amplifié par comparaison avec le génotype de la séquence de référence. Les points de mutations peuvent être identifiés par hybridation de l'ADN amplifié avec les séquences, marquées par un élément radioactif, de polynucleotides de la présente invention. Des séquences parfaitement complémentaires peuvent ainsi être distinguées de duplex qui résistent mal à la digestion par des nucléases. Les différences de séquences d'ADN peuvent aussi être détectées par des altérations de la mobilité électrophorétique de fragments d'ADN dans des gels, avec ou sans agent dénaturant, ou par un sequençage direct d'ADN (référence : Myers et al. Science, 230 : 1242 (1985)). Des changements de séquences à des localisations spécifiques peuvent aussi être révélées par des expériences de protection contre des nucléases telles que RNase I et SI ou par des méthodes de clivage chimique (référence : Cotton et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 85 : 4397-4401 (1985) . Des cellules contenant l'un des polynucleotides de la présente invention portant des mutations ou des polymor- phismes peuvent aussi être détectées par un grand nombre de techniques permettant notamment de déterminer le sérotype. Par exemple, la technique RT-PCR peut être utilisée pour détecter les mutations. Il est particulièrement préféré d'utiliser les techniques de RT-PCR en conjonction avec des systèmes de détection automatique, tels que par exemple dans la technique GeneScan. ARN et ADNC peuvent être utilisés dans les techniques PCR ou RT-PCR. Par exemple, des amorces complémentaires des polynucleotides codant pour les polypeptides de la présente invention peuvent être utilisés pour identifier et analyser les mutations.
Des amorces peuvent ainsi être utilisées pour amplifier un ADN isolé de l'individu infecté. De cette façon des mutations dans la séquence d'ADN peuvent être détectées et utilisées pour diagnostiquer l'infection et déterminer le sérotype ou le classement de l'agent infectieux. De telles techniques sont usuelles pour l'homme du métier et sont décrites notamment dans le manuel ' Current Protocols in Molecular Biology' , Ausubel et al, éd. John Wiley § sons, Inc., 1995). La présente invention concerne ainsi un procédé de diagnostic d'une maladie et de préférence d'une infection fongique provoquée notamment par Candida albicans telles que des mycoses comme indiqué ci-dessus, ce procédé comprenant la détermination à partir d'un échantillon prélevé sur un individu infecté, d'une augmentation de la quantité de polynucléotide de la présente invention. Un tel polynu- cléotide peut notamment avoir une séquence d'ADN de la présente invention telle que définie ci-dessus. Des augmentations ou des diminutions de la quantité de polynucleotides peuvent être mesurées par les techniques bien connues de l'homme du métier telles que notamment l'amplifi- cation, la PCR, RT PCR, Northern blotting ou autres techniques d'hybridation.
De plus, une méthode de diagnostic en accord avec la présente invention consiste en la détection d'une expression trop importante de polypeptides de la présente invention, par comparaison avec des échantillons de contrôle constitués de tissus normaux non infectés utilisés pour détecter la présence d'une infection.
Les techniques qui peuvent être utilisées pour détecter ainsi les quantités de protéines exprimées dans un échantillon d'une cellule hôte sont bien connues de l'homme du métier. On peut ainsi citer par exemple les techniques de radioimmu- noassay ou de competitive-binding, analyse par Western Blot et test ELISA (ref Ausubel indiqué ci-dessus) .
La présente invention a encore pour objet un kit pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN selon la présente invention telle que définie ci-dessus ou une séquence ayant une fonction similaire ou un fragment fonctionnel de cette séquence, le polypeptide codé par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide. Ce kit pourra ainsi contenir une séquence d'ADN selon la présente invention telle que définie ci -dessus et par exemple la séquence d'ADN SEQ ID N°l ou un fragment de cette séquence ou encore la séquence 720 à 1955 de SEQ ID N°l.
Un tel kit pourra de même contenir un polypeptide selon la présente invention ou un fragment de ce polypeptide et notamment la protéine ayant la séquence en AA SEQ ID N°3 ou encore un anticorps tel que défini ci-dessus. Un tel kit peut-être préparé selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Les séquences SEQ ID N° 1 à 9 indiquées dans la présente invention sont décrites ci-après.
La partie expérimentale ci-après permet de décrire la présente invention sans toutefois la limiter. Partie expérimentale Exemple 1 : Clonage et sequençage du gène CAtflIIA a) Conditions de culture :
La bactérie Escherichia coli (E. coli) de la lignée DH5 alpha (Gibco BRL) ou XL1- Blue type K12 (Stratagène) a été utilisée pour la préparation des plasmides de la présente invention . La croissance de cette bactérie a été effectuée selon les conditions usuelles en milieu liquide LB qui renferme 10 g de bactotryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl pour un litre d'eau et qui renferme également 100 microg/ml d'ampicilline (SIGMA) . La colonie a été prélevée sur milieu solide LB + agar + ampicilline puis cultivée dans 100 ml de milieu LB et incubée jusqu'à DO (600 nm) = 0.8.
L'incubation a été effectuée à 37°C sous atmosphère normale et agitation à 225 rpm. La viabilité de la souche est vérifiée lorsque la souche pousse sur milieu LB + ampicilline à 100 microg/ml. On peut noter qu'un gène de résistance à l' ampicilline Bla fait partie du vecteur dans lequel sont clones les fragments de CAtflIIA. Ainsi, la sélection des souches renfermant les plasmides contenant le gène tflIIA de Candida albicans de la présente invention peut être opérée par la culture des souches dans ce milieu renfermant de l' ampicilline (100 microg/ml) , un tel milieu permettant la survie uniquement des souches qui renferment le gène de résistance à l' ampicilline et ainsi uniquement des souches qui renferment le gène tflIIA de Candida a. de la présente invention.
Pour la conservation des souches obtenues, 15 % de glycérol sont ajoutés au milieu de culture : les cultures sont donc conservées dans le milieu de suspension LB +100 microgrammes/ml d' ampicilline + 15 % de glycérol à la concentration bactérienne de DO (600 nm = 0.8 sous forme d'aliquots en cryotubes de 1 ml par tube. Pour le sequençage, l'ADN plasmidique de plusieurs bactéries issues de chacun des clonages .indiqués ci-après est préparé en utilisant un kit commercial (Qiagen Plasmids kit) . Les fragments correspondant à la séquence du gène CAtflIIA sont séquences sur les deux brins suivant les techniques classiques connues de l'homme du métier (utilisation du séquenceur ABI 377 XL, Perkin Elmer) . b) Clonage et sequençage du gène CAtflIIA :
Dans le cadre de la présente invention, le gène codant pour le facteur de transcription de CA soit SEQ ID N°l représenté à la figure 1 a été isolé à partir de la banque de fragment génomique de Candida albicans. (Sanglard et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 39, 2378-2386, (1995)). La structure du gène a été identifiée par sequençage. La stratégie utilisée repose sur l'hypothèse que SC et CA sont des levures proches dont la structure des gènes peut être homologue . On a procédé comme suit :
Dans le cadre de la présente invention, en utilisant le site internet de Standford qui permet d'accéder aux séquences préliminaires du génome de Candida albicans, une fraction de séquence homologue à tflIIA de S. cerevisiae a été identifiée. Ce fragment contient un cadre ouvert de lecture (258 pb) codant pour une protéine pour laquelle on peut identifier deux motifs en doigts de zinc et une région riche en résidus serine caractéristique du facteur TFIIIA de SC. Ce cadre ouvert de lecture contient en réalité 259 nucléotides. Afin d'amplifier le fragment correspondant de Candida albicans, deux oligonucléotides ont été sélectionnés dans cette séquence. Ces oligonucléotides sont les suivants : INT CAND situé à la position 720-740 de SEQ ID N°l et nommé SEQ ID N°4 et
3' CAND situé à la position 955-978 de SEQ ID N°l et nommé SEQ ID N°5. On a ainsi obtenu un fragment de 259 paires de bases.
Il a d'abord été confirmé par PCR qu'il est possible d'amplifier un fragment d'ADN génomique de CA, préparé à partir de cellules de CA par les méthodes usuelles connues de l'homme du métier, et d'autre part dans la banque de gènes de
CA. Ces oligonucléotides ont aussi permis de synthétiser un fragment d'ADN à partir d'ADN génomique de Candida albicans afin de préparer une sonde marquée au 32P (phosphore 32) en utilisant un kit (Mega Prime, Amersham) . Ce fragment a été utilisé pour le criblage de la banque de fragments génomiques Sau 3A de Candida albicans clones dans le site BamHI du vecteur YEp24 (multicopie-Ura3 ) [Botstein et al., Gène, 8, 17-24, (1979)].
Les cellules E. coli DH5 alpha transformées avec le vecteur YEp24 (vecteur multicopie avec gène de sélection URA3) contenant les fragments décrits ci-dessus (17000 clones) sont étalées sur des boîtes contenant un milieu LB + ampicilline et cultivées à 37°C.
Une réplique sur filtre de nitrocellulose est ensuite traitée par des techniques connues de l'homme du métier comme par exemple NaOH : 0,5M, 5 minutes ; Tris-HCl : 1M (pH = 7,5)
5 minutes ; NaCl 1, 5M/Tris-HCl 0,5M (pH 7,5).
Pour le séchage, les filtres sont gardés pendant 10 minutes à
80°C puis fixés aux UV (Stratalinker) . Préhybridation et hybridation sont réalisées dans un tampon de NaP04
(pH 7,2) 0,5M ,- EDTA lOmM ; SDS 7 % (réf.," Church et Gilbert,
PNAS 81 : 1991 (1984) ) .
La sonde est marquée au 32P avec le kit MegaPrime et (alpha
32P)dCTP (Amersham UK) . L'hybridation est réalisée pendant toute la nuit à 65°C. Les filtres sont ensuite lavés dans 1 %
SDS, 40 mM NaP04 (pH 7,2), six fois pendant 5 minutes à 65°C et ils sont ensuite soumis à une autoradiographie pendant toute la nuit.
L'hybridation sur filtre avec la sonde marquée au 32P a permis de sélectionner plusieurs clones positifs qui ont été réensemencés sur boîtes afin de les isoler. Des clones individuels ont ainsi été isolés.
On a ainsi obtenu trois types de clones que l'on nomme 9, 18 et 47 contenant trois inserts différents du gène CAtflIIA de la présente invention : l'analyse par PCR a confirmé la présence du fragment de 259 pb.
Les plasmides YEp24 contenant des inserts de Candida albicans ont été récupérés à partir de ces colonies. La carte de restriction de chacun de ces plasmides a été établie, et a permis de constater que tous les inserts provenaient d'une même région du génome de Candida albicans . Pour le sequençage de cette région on a utilisé les oligonucléotides suivants : INT-Cand situé à la position : 720-740 de SEQ ID N°l et nommé
SEQ ID N°4
3'-Cand situé à la position : 955-978 de SEQ ID N°l et nommé
SEQ ID N°5
Cont-Int situé à la position : 719-741 de SEQ ID N°l et nommé SEQ ID N°6
Can-Korl situé à la position 1365-1389 de SEQ ID N°l et nommé
SEQ ID N°7 et le séquenceur ABI 377 XL (Perkin Elmer) . Le sequençage de cette région a permis de mettre en évidence les points suivants :
1) Les trois clones contiennent tous seulement un cadre de lecture ouvert, ininterrompu de 1236 pb avec la même séquence qui code pour une protéine .
2) Le cadre de lecture ouvert code pour une protéine de 412 AA qui montre une homologie importante avec le facteur
TFIIIA de Saccharomyces cerevisiae. L'analyse de la protéine permet de retrouver les 9 motifs en doigt de zinc qui sont caractéristiques du facteur de transcription TFIIIA. La comparaison des séquences protéique de CATFIIIA et TFIIIA de SC, permet de mettre en évidence une similarité de 50 % et une identité de 45 %. Pour la traduction en acides aminés il a été tenu compte du fait que dans Candida albicans le codon CTG est traduit en serine et qu'il y a 2 codons CTG dans Candida albicans TFIIIA. On peut noter :
- La conservation de la région riche en Serine dans la partie N-terminale
- la présence d'une très longue région intermédiaire entre les doigts de zinc 8 et 9 caractéristique de SC. Les différences de séquence entre les protéines TFIIIA de SC et TFIIIA de Candida albicans se situent dans la partie C-terminale en dehors des motifs en doigt de zinc. Le plasmide YEp24 contenant la région promotrice et la séquence codante pour CATFIIIA a été transformé dans la souche E. Coli XL1 Blue puis déposé sous le numéro 1-2072 à la CNCM, Institut Pasteur 25 rue de Docteur ROUX 75015 Paris, le 15 septembre 1998. Exemple 2 : expression du gène tflIIA
Un fragment contenu dans le clone 9 a été amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant les séquences reconnues par les enzymes de restriction EcoRI et Xhol et s'hybridant au gène tfC2, les amorces sont les suivantes : 5-EcoTF situé à la position 720-732 de SEQ ID N°l et nommé SEQ ID N°8 et
3 '-Xhol situé à la position 1946-1960 de SEQ ID N°l et nommé SEQ ID N°9. On procède donc à une amplification par PCR de l'ADN génomique de la façon suivante :
0,5 microgrammes d'ADN du clone 9 sont ajoutés à 50 microlitres d'une solution réactionnelle contenant 200 nanogrammes/ml de chaque dNTP, les primers indiqués ci-dessus à raison de 25 micromoles/1 pour chacun, 2mM MgC12, 1 x Pfu Buffer, 5U Pfu polymerase (Perkin Elmer) .
Le milieu réactionnel est soumis à 30 cycles PCR correspondant chacun à 94°C pendant 30 secondes, puis à 60°C pendant 45 secondes puis à 72°C pendant 1 minute. Le fragment contenant la séquence codante de CATFIIIA a été sous-cloné dans les vecteurs pYX122 (CEN, HIS 3) et pYX222 (2 micron, HIS3) (R et D System) . Ce plasmide a été utilisé pour transformer des cellules de Saccharomyces c. YWRI (Mat alpha, can 1-100, his 3-11, leu 2-3, 112 trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, tfC2 :: leu2 + pJA230) , (Camier et al, Proc . Natl. Acad. Sci. 92 9338-9342, 1995).
La souche transformée selon les mêmes méthodes que celles indiquées ci-dessus permet l'expression du facteur de transcription TFIIIA de Candida albicans contenant un tag HA. Conclusion
Les réalisations expérimentales indiquées ci -dessus montrent donc les points suivants :
1) Le gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été isolé dans trois clones 9, 18 et 47 obtenus comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1 à partir de la banque de gènes de Candida albicans en utilisant une technique d'hybridation. La structure de ce gène a été identifiée par sequençage.
2) La protéine CATFIIIA du gène CAtflIIA obtenue à l'exemple 1 est constituée de 412 AA et montre une forte homologie avec le facteur TFIIIA de SC. Cette protéine contient une région riche en résidus SER dans la partie N-terminale et 9 doigts de zinc dont la disposition est identique à celle de la protéine TFIIIA de SC. 3) Le sous-clonage du gène du facteur TFIIIA de Candida albicans a été réalisé et le gène a été placé sous contrôle d'un promoteur de SC.

Claims

REVENDICATIONS
1) Polynucléotide isolé contenant une séquence nucleotidique choisie dans le groupe suivant: a) un polynucléotide ayant au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec un polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription et ayant une séquence en acides aminés homologue de la séquence SEQ ID N°3. b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) . c) un polynucléotide comprenant au moins 15 bases consécutives du polynucléotide défini en a) et b) .
2) Polynucléotide selon la revendication 1 tel que ce polynucléotide est un ADN. 3) Polynucléotide selon la revendication 1 tel que ce polynucléotide est un ARN.
4) Polynucléotide tel que défini à la revendication 2 comprenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°l
5) Séquence d'ADN telle que définie aux revendications 1, 2 et 4 caractérisée en ce que cette séquence d'ADN est celle du gène CAtflIIA codant pour une protéine ayant la fonction biologique du facteur de transcription de Candida albicans CATFIIIA et contenant la séquence de nucléotides SEQ ID N°l
6) Séquence d'ADN selon la revendication 5 ayant la séquence commençant au nucléotide 720 et se terminant au nucléotide
1955 de SEQ ID N°l.
7) Séquence d'ADN du gène CAtflIIA selon la revendication 5 ou 6 codant pour la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 (412 AA) . 8) Séquence d'ADN codant pour le facteur de transcription CATFIIIA selon les revendications 5 à 7 ainsi que les séquences d'ADN qui hybrident avec celle-ci et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction. 9) Séquence d'ADN selon les revendications 5 à 8 comprenant des modifications introduites par suppression, insertion et/ou substitution d'au moins un nucléotide codant pour une protéine ayant la même activité biologique que le facteur de transcription CATFIIIA.
10) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 9 ainsi que les séquences d'ADN qui ont une homologie de séquence nucleotidique d'au moins 50 % ou au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec ladite séquence d'ADN.
11) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 10 ainsi que les séquences d'ADN qui codent pour une protéine de fonction similaire dont la séquence en AA a une homologie d'au moins 40 % et notamment de 45 % ou d'au moins 50 %, plutôt au moins 60 % et de préférence au moins 70 % avec la séquence en AA codée par ladite séquence d'ADN.
12) Polypeptide ayant la fonction de facteur de transcription CATFIIIA et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 codée par la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 et les analogues de ce polypeptide.
13) Procédé de préparation de la protéine recombinante CATFIIIA ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°3 comprenant l'expression de la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11 dans un hôte approprié puis l'isolement et la purification de ladite protéine recombinante.
14) Vecteur d'expression contenant la séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 à 11.
15) Cellule hôte transformée avec un vecteur selon la revendication 14. 16) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans lequel la cellule hôte est E. coli DH5 alpha ou E.'coli XLl-Blue.
17) Procédé tel que défini à la revendication 13 dans laquelle la cellule hôte est Saccharomyces cerevisae.
18) Plasmide déposé à la CNCM sous le numéro 1-2072. 19) Procédé de criblage de produits antifongiques caractérisé en ce qu'il comprend une étape où l'on mesure l'activité de facteur de transcription de CATFIIIA tel que défini à la revendication 12 en présence de chacun des produits dont on souhaite déterminer les propriétés antifongiques et l'on sélectionne les produits ayant un effet inhibiteur sur cette activité.
20) Utilisation d'un produit sélectionné par le procédé selon la revendication 19 pour l'obtention d'un agent antifongique. 21) Utilisation du gène du facteur de transcription CAtflIIA de Candida albicans ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la sélection d'un produit ayant des propriétés antifongiques selon la revendication 19 comme inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans.
22) Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un inhibiteur du facteur de transcription de Candida albicans tel que défini à la revendication 21.
23) Utilisation des compositions telles que définies à la revendication 22 comme agents antifongiques.
24) Méthode d'induction d'une réponse immunologique chez un mammifère comprenant l'inoculation à ce mammifère du polypeptide tel que défini à la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction de façon à produire un anticorps permettant de protéger l'animal contre la maladie.
25) Anticorps dirigé contre le polypeptide tel que défini à la revendication 12 ou un fragment de ce polypeptide ayant la même fonction.
26) Utilisation du gène CAtflIIA ou du facteur de transcription codé par ce gène selon l'une des revendications 5 à 12 pour la préparation de compositions utiles pour le diagnostic ou le traitement de maladies causées par la levure pathogène Candida albicans .
27) Kit pour le diagnostic d'infections fongiques comprenant une séquence d'ADN tel que défini à l'une des revendications 5 à 11 ou une séquence ayant une fonction similaire ou un fragment fonctionnel de cette séquence, le polypeptide codé par cette séquence ou un fragment polypeptidique ayant la même fonction ou un anticorps dirigé contre un tel polypeptide codé par cette séquence d'ADN ou contre un fragment de ce polypeptide.
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