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WO2000022425A1 - Micro-systeme a multiples points d'analyse chimique ou biologique - Google Patents

Micro-systeme a multiples points d'analyse chimique ou biologique Download PDF

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WO2000022425A1
WO2000022425A1 PCT/FR1999/002446 FR9902446W WO0022425A1 WO 2000022425 A1 WO2000022425 A1 WO 2000022425A1 FR 9902446 W FR9902446 W FR 9902446W WO 0022425 A1 WO0022425 A1 WO 0022425A1
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WO
WIPO (PCT)
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organic compound
micro
fixing means
function
reagent
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/002446
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English (en)
Inventor
Jean-Frédéric Clerc
Patrice Caillat
Gérard Bidan
Marc Cuzin
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
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Priority to JP2000576272A priority patent/JP2002527747A/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
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    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the present invention relates to a micro-system with multiple points of chemical or biological analysis implementing a coupling between the probes and a substrate.
  • microelectronics is increasingly called upon to be a link in much more complex systems in which several functions are integrated. These systems or micro-systems range from physical sensor applications to the latest development of so-called "biological" chips.
  • a sensitive cell capable of measuring a physical phenomenon is associated with an integrated circuit capable of ensuring the processing of information and its exploitation. This is the case with pneumatic safety cushions for the automotive industry (known as an "air bag” in English terminology).
  • an integrated circuit undergoes a finishing allowing it to be used in a biological medium. This is the case, for example, with an integrated glucose meter or blood pressure probes.
  • the interface between the medium of conventional microelectronics and that of sensors or biologists is the key element of these micro-systems.
  • each cuvette is filled with a different DNA probe and the analyte whose genomic sequence is to be known is brought into contact at the time of analysis with all of the cuvettes.
  • analytical chemistry also the demand is strong towards the miniaturization of the cuvettes of chemical reactions t
  • a first technique consists in activating sites where the reagents will then be deposited and fixed by various chemical molecules. It is a technique mainly used on glass substrates.
  • the reagents are deposited by micro-pipetting or by a technique of the inkjet type.
  • On the chemical side to ensure the interface between the substrate and the reagent, mention may be made of silanes, lysines, thioles when the substrate is previously coated with gold. This chemistry is complex, especially when it comes to controlling its reproducibility on a substrate that may have a few thousand different sites. Mention may be made, as representative of this technique, of US Pat. No. 5,474,796 which relates to surface structuring: the reagents are fixed to a substrate having hydrophilic zones and hydrophobic zones. The matrixing obtained is therefore very regular.
  • the reagent is a DNA probe, in particular an oligonucleotide of around twenty bases
  • the probe base after base on each site. It is known to use successive masks to make this synthesis in situ: each site is covered with a photoprotected base. The photomasking then makes it possible to remove the protection from the sites and to chemically attach an additional photoprotected base. The operation is repeated until the desired probe is obtained at each site. It is currently possible to build tens of thousands of different probes on a substrate. This technique is excellent but it does not make it possible to obtain probes with a large number of bases (the limit is approximately 20).
  • a third technique relates to electrodeposition on site electrically polarized of a conductive polymer carrying the selected reactive species.
  • the substrate is electrically connected to the outside and soaked in a tank containing the chemical species to be deposited.
  • the site chosen is polarized and the copolymerization is carried out (in less than a minute at a voltage below I V).
  • different reagents were fixed on different areas of the substrate, thus allowing a multipoint analysis.
  • each site is provided with a compound organic offering a biotin function.
  • Each site can then receive a chemical or biological probe constituted by a determined reagent (a small piece of a DNA strand for example) associated for example with an avidin or streptavidin function.
  • a chemical or biological probe constituted by a determined reagent (a small piece of a DNA strand for example) associated for example with an avidin or streptavidin function.
  • the coupling which takes place between the avidin and biotin functions ensures the fixation of the probes on their respective sites.
  • the subject of the invention is therefore a process for producing a micro-system with multiple points of chemical or biological analysis, comprising the steps consisting in:
  • each micro-cuvette being intended to receive a reagent and being provided with fixing means making it possible to attach said reagent to it
  • the step consisting in fixing the first organic compound on the means for fixing the micro-cuvettes is carried out by electro-polymerization, the fixing means being electrically accessible conductive means, the hooking function of the first organic compound with the fixing means consisting of a conductive monomer, a counter-electrode being used to carry out the electro-polymerization.
  • the conductive means can comprise an electrode common to all the micro-cuvettes.
  • the structure can be designed from a substrate, one face of which has said common electrode, a layer of insulating material being deposited on said common electrode, the layer of insulating material being hollowed out up to said common electrode to form the micro-cuvettes whose bottom is constituted by the common electrode.
  • the structure can also be designed from an active substrate having a plurality of electrodes on one of its faces, this plurality of electrodes constituting the fixing means, a layer of insulating material being deposited on said face, the layer of insulating material being hollowed out to the electrodes to form the micro-cuvettes, multiplexing means being provided for electrically connecting the plurality of electrodes in order to carry out the electro-polymerization.
  • the counter-electrode may be an electrode integral with the structure or be placed opposite the fixing means during the electro-polymerization operation.
  • the conductive monomer of the first organic compound is pyrrole.
  • the step consisting in fixing the first organic compound on the means for fixing the micro-cuvettes consists in putting using a covalent bond between the attachment function of the first organic compound with the fixing means and the fixing means.
  • This covalent bond is for example of silanization type (silane-biotin) or a self-assembly using a thiol-biotin bond.
  • the step consisting in fixing the first organic compound to the means for fixing the micro-cuvettes is carried out chemically, by adding a reagent capable of causing polymerization on the means for fixing the first compound organic.
  • This first organic compound can be pyrrole and the reagent capable of causing the polymerization of a ferric salt.
  • the hooking function of the first organic compound with the second organic compound is a biotin function, the hooking function of the second organic compound with the first organic compound being an avidin or streptavidin function.
  • the first organic compound can be a biotinilated pyrrole.
  • the second organic compound can consist of said reagent directly attached to the avidin or streptavidin function.
  • the step consisting in placing, in each microcuvette, the second organic compound can comprise the deposition of a solution containing the second organic compound in each microcuvette then the elimination of this solution so as to keep only the probes obtained by selective attachment of the first and second organic compounds, for example by binding between biotin and streptavidin / avidin.
  • the second organic compound can also consist of said reagent attached to the avidin or streptavidin function via a biotin function.
  • the step consisting in placing, in each microcuvette, the second organic compound can comprise the deposition of a first solution of avidin or of streptavidin in each microcuvette, then the elimination of this first solution to reveal the first organic compound with the biotin function complexed by said avidin or said streptavidin, then the deposition of a second solution containing said reagent in biotinilated form, then the elimination of this second solution to keep only the probes obtained.
  • the invention also relates to a micro-system with multiple chemical or biological analysis points constituted by a structure provided with micro-cuvettes, each micro-cuvette being intended to receive a reagent and being provided with fixing means allowing attaching said reagent thereto via a first organic compound, the reagent being part of a second organic compound, the first organic compound comprising a bonding function with the second organic compound and a bonding function with the means fixing, these two attachment functions being separated by a spacer, the second organic compound comprising an attachment function with the corresponding attachment function of the first organic compound.
  • the fixing means are electrodes and the attachment function with the fixing means of the first organic compound is a conductive polymer.
  • the fixing means can form a common electrode.
  • the micro-cuvettes can be formed in an insulating layer of said structure, the fixing means forming the bottom of the micro-cuvettes.
  • the structure may include a counter-electrode arranged in opposition with respect to the bottom of the micro-cuvettes in order to be able to establish an electric field between the counter-electrode and the fixing means.
  • said conductive polymer is a polypyrrole.
  • the fixing means and the attachment function of the first organic compound with the fixing means are such that they form a covalent bond.
  • This covalent bond is for example of the silanization (silane-biotin) or self-assembly type using a thiol-biotin bond.
  • the attachment function of the first organic compound with the fixing means comprises a polymerization reagent, by chemical means, on the fixing means.
  • This reagent can be a ferric salt.
  • the first organic compound comprises a biotin function for its attachment with an avidin or streptavidin function of the second organic compound.
  • the first organic compound can be a biotinilated polypyrrole.
  • the second organic compound can consist of said reagent directly attached to the avidin or streptavidin function.
  • the second organic compound can also consist of said reagent attached to the avidin or steptavidin function via a biotin function.
  • FIG. 1A to 1E show different stages in the production of a structure for a micro-system with multiple points of chemical or biological analysis according to the present invention
  • FIG. 2 illustrates a step of electropolymerization carried out in the micro-cuvettes of a structure intended for a micro-system with multiple points of chemical or biological analysis according to the present invention
  • FIG. 3 shows a micro-bowl of the structure shown in Figure 2 and at the bottom of which is fixed a first organic compound, according to the method of producing a micro-system according to one invention, -
  • FIG. 4 represents another structure intended for a micro-system with multiple chemical or biological analysis points according to the present invention
  • - Figure 5 illustrates a step of electropolymerization carried out in the micro-cuvettes of the structure shown in Figure 4;
  • - Figures 6 to 8 illustrate the step of placing in a microcuvette the second organic compound to obtain a chemical or biological analysis probe according to the present invention;
  • - Figure 9 illustrates the method of manufacturing a first organic compound usable for the present invention.
  • Figures 1 to 8 illustrate the alternative embodiment for which the means for fixing the first organic compound are electrodes and for which the placement of this first organic compound is by electro-polymerization, these electrodes allowing the application of a potential electric.
  • the structure may include a passive substrate, that is to say that it does not include integrated electronics.
  • the substrate may be coated with a conductive plane (for example metallic) itself covered with a layer of a material ensuring the function of electrical insulation and in which the micro-cavities are formed. These lead locally to the driver plane. The exposed areas of the conductive plane then constitute the reception electrodes.
  • the substrate can also be active, in which case the electronics integrated into it can serve various functions: localized heating of sites, local pH measurement, reading of a fluorescence signal, etc. In most cases, it is not possible to short-circuit the sites for the subsequent functions which must remain addressable on each site independently of the others. The multiplexing necessary for these functions can then be used during the process of producing the micro-system. It is indeed possible to address all the sites collectively to carry out the operation of fixing the reagents. Each site may subsequently be addressed individually.
  • Figures 1A to 1E are cross-sectional and partial views. They illustrate a first embodiment of a micro-system according to the invention for which the counter-electrode is situated on the surface and for which the substrate is passive.
  • FIG. 1A represents a substrate 1 constituted by a wafer which can be made of a material such as glass, silicon, plastic. On a main face of this wafer, a metallic layer 3, for example in chromium, gold or platinum, with a thickness of between 0.1 and 10 ⁇ m, has been deposited. As shown in FIG. 1B, a photosensitive polymer film 5, for example a polyimide film with a thickness of between 1 and 50 ⁇ m, is deposited on the metal layer 3.
  • a photosensitive polymer film 5 for example a polyimide film with a thickness of between 1 and 50 ⁇ m
  • Micro-cuvettes 7 are then formed by exposure and development of the polyimide film (see FIG. 1C). They are advantageously formed with sloping sides. The micro-cuvettes formed locally reveal the metal layer 3. A new metal layer 9 is then uniformly deposited on the polyimide film including the interior of the micro-cuvettes 7.
  • the metal layer 9 can be made of chromium, gold or platinum and be 0.1 to 10 ⁇ m thick.
  • a layer of masking resin 11 is deposited on the metal layer 9 and areas to be etched in this metal layer 9 are defined.
  • Each micro-bowl 7 has at its bottom an electrode 9a, all the electrodes 9a being electrically connected by means of the metal layer 3.
  • a common electrode 9b covers the upper face of the polymer film 5. This structure is ready for the next step consisting in placing the first organic compound at the bottom of the micro-cuvettes.
  • FIG. 2 illustrates the electropolymerization step.
  • a structure 20 provided with micro-cuvettes 21 and which, unlike the case described above, is formed from an active substrate 22.
  • the micro-cuvettes 21 have been formed in an insulating layer 23 deposited on the substrate 22
  • the bottom of the micro-cuvettes 21 is constituted by the electrodes 24 which can be, by multiplexing, electrically connected.
  • a common counter electrode 25 has been deposited on the upper part of the insulating layer 23. A potential difference can therefore be applied between the counter electrode 25 and the electrodes 24 electrically connected by multiplexing.
  • a layer 26 containing suitable monomers for example a mixture of pyrrole and biotinylated pyrrole like that described below, is deposited on the face of the substrate 20 having the micro-cuvettes.
  • An appropriate potential difference is applied between the counter electrode 25 and the electrodes 24.
  • the micro-cuvettes are rinsed and dried.
  • An organic compound 30 is then obtained, as shown in FIG. 3, consisting of biotinilated polypyrrole, fixed on the electrodes 24. This organic compound adheres to the electrodes 24 by the pyrrole cycles and presents biotin molecules 31 attached to pyrrole cycles by spacers 32.
  • the structure intended to constitute the microsystem according to the invention may not include a counter electrode directly deposited on itself.
  • the structure 40 comprises for example a passive substrate 41, one face of which is covered with a metal layer 42 forming an electrode.
  • An insulating layer 43 has been deposited on the metal layer 42 and etched to form micro-cuvettes 44.
  • the electro-polymerization is then carried out, as shown in FIG. 5, in a tank 45 filled with an appropriate solution 46 containing a mixture of pyrrole and biotinilated pyrrole monomers.
  • a DC voltage generator 47 is connected between the electrode 42 and a counter-electrode 48 arranged opposite the bottom of the micro-cuvettes 44.
  • the electropolymerization causes the deposition of biotinilated polypyrrole on the visible areas of the electrode 42 as for FIG. 3.
  • FIGS. 6, 7 and 8 illustrate the fixing of the second organic compound.
  • the electropolymerization tank 45 may include an additional electrode serving as a reference.
  • the next step in the process is represented in FIG. 6. It consists in placing, in each microcuvette, a solution 50 comprising the second organic compound 51.
  • This second organic compound comprises for example an avidin or streptavidin function if the first compound organic is biotinilated.
  • a DNA probe can thus be constituted by choosing as the second organic compound DNA streptavidin which is marketed.
  • Biotin / streptavidin recognition is widely used industrially because of the high recognition rate, insensitivity to temperature variations, a large choice of buffer, pH, etc.
  • FIG. 7 shows the attachment carried out between the biotin function of the organic compound 30 and the avidin or streptavidin function of the organic compound 51. After rinsing and drying, a micro-system is obtained, an analysis point of which is shown in FIG. 8.
  • the micro-cuvette 21 is provided with probes formed by the association of organic compounds 30 and 51.
  • DNA, RNA, oligonucleotides, enzymes, nucleic or amino acids, proteins, antigens or any product which can be linked to 1 ′ can be attached to the biotinilated polypyrrole at the bottom of the microcuvettes.
  • avidin or streptavidin
  • biotin can form not only the association: polypyrrole-biotin / (strept) avidin-reactive, but also the association: polypyrrole-biotin / (strept) avidin / biotin-reactive.
  • Biotinilated DNA which is a commercial product.
  • Biotin / streptavidin / biotin double recognition has the same qualities as the biotin / streptavidin recognition reaction.
  • the invention allows collective placement of the first organic compound on the bottom of the microwells.
  • the biotinilated polypyrrole which clings to the bottom of the microcuvettes is advantageously a copolymer synthesized from pyrrole and biotinilated pyrrole for which the biotin is attached to the nitrogen atom of a pyrrole cycle by a hydrophilic spacer.
  • This spacer can be crucial. It must be long enough to ensure unrestricted recognition of biotin by avidin. A length of at least eleven atoms is particularly suitable.
  • Figure 9 is a diagram showing the synthesis of a biotinilated pyrrole. This summary is obtained by coupling an aminoalkylpyrrole and a biotin entity. The synthesis of the aminoalkylpyrrole was carried out using a reaction as described by JIRKOWSKY and BAUDY in Synthesis, 1981, page 481. The reagents used and the conditions of the reactions are as follows: i) 4,7,10-trioxa- 1.13-tridecanediamine (3 eq.), acetic acid / dioxane at reflux, for 5 h, yield 32%; ii) 10% KOH at reflux for 5 h, yield

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Abstract

L'invention concerne la réalisation d'un micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique. La réalisation comprend les étapes consistant à: concevoir une structure pourvue de micro-cuvettes (21), chaque micro-cuvette étant destinée à recevoir un réactif et étant pourvue de moyens de fixation (24) permettant d'y rattacher ledit réactif; placer un premier composé organique (30) sur les moyens de fixation (24) des micro-cuvettes, le premier composé organique comportant une fonction d'accrochage avec un deuxième composé organique (51) et une fonction d'accrochage avec les moyens de fixation (24); placer, dans chaque micro-cuvette (21), le deuxième composé organique (51), le deuxième composé organique comportant une fonction d'accrochage avec la fonction d'accrochage correspondant du premier composé organique (30) et comportant ledit réactif, pour obtenir dans chaque micro-cuvette des sondes d'analyse chimique ou biologique constituées par le réactif attaché aux moyens de fixation (24) par le couplage des fonctions d'accrochage des premier (30) et deuxième (51) composés organiques entre eux.

Description

MICRO-SYSTEME A MULTIPLE POINTS D'ANALYSE CHIMIQUE OU
BIOLOGIQUE
Domaine technique
La présente invention concerne un micro-système à multiple points d'analyse chimique ou biologique mettant en oeuvre un couplage entre les sondes et un substrat.
La micro-électronique classique est de plus en plus appelée à être un maillon de systèmes beaucoup plus complexes dans lesquels plusieurs fonctions sont intégrées. Ces systèmes ou micro-systèmes vont des applications capteurs physiques aux derniers développement de puces dites "biologiques".
Dans le premier cas, une cellule sensible capable de mesurer un phénomène physique est associé à un circuit intégré capable d'assurer le traitement de l'information et son exploitation. C'est le cas des coussins pneumatiques de sécurité de 1 ' industrie automobile (connus sous le nom de "air-bag" dans la terminologie anglo-saxonne) . Dans le deuxième cas, un circuit intégré subit une finition lui permettant d'être utilisé dans un milieu biologique. C'est le cas par exemple d'un mesureur de glucose intégré ou des sondes de pression sanguine . Dans tous les cas, l'interface entre le milieu de la micro-électronique classique et celui des capteurs ou des biologistes est l'élément clef de ces micro-systèmes .
L'analyse chimique ou biologique est en train de subir la révolution de la miniaturisation liée à l'utilisation des microtechnologies. Lorsque des tests multiples peuvent être regroupés sur un support de quelques mm2, les coûts sont réduits et une analyse naguère exceptionnelle peut être utilisée de façon courante.
La demande vers des systèmes permettant l'analyse chimique ou biologique à très grand nombre de points est en émergence à l'heure actuelle avec l'apparition du screening en pharmacologie et des tests ADN en biologie.
Dans le premier cas, il faut déterminer sur un support comportant un grand nombre de cuvettes remplies du même réactif, l'effet de différentes molécules que l'on dépose sélectivement dans chaque cuvette de façon séquentielle. Dans le deuxième cas chaque cuvette est remplie d'une sonde ADN différente et 1 ' analyte dont on veut connaître la séquence génomique est mis en contact au moment de l'analyse avec 1 ' ensemble des cuvettes . En chimie analytique également la demande est forte vers la miniaturisation des cuvettes de réactions chimiques t
Tant d'un point de vue réalisation des cuvettes, dépôt des liquides dans ces cuvettes que système de lecture et d'acquisition des résultats, les efforts en Recherche et Développement sont importants.
Etat de la technique antérieure
Dans le domaine de l'analyse biologique ou plus généralement des tests en pharmacologie de nouvelles molécules, la réduction de la taille de l'outil de test est extrêmement séduisante d'un point de vue économique. Plus précisément, on peut assimiler un micro-système d'analyse à une structure associant un support sur lequel des réactifs différents sont tout d'abord fixés puis mis en présence de la solution à analyser, et une méthode permettant de mesurer la réactivité obtenue. Eventuellement, un traitement dans le micro-système lui-même de 1 ' information obtenue peut être prévu.
Il existe différentes techniques pour fixer des réactifs différents sur un substrat.
Une première technique consiste à activer des sites où seront ensuite déposés et fixés les réactifs par des molécules chimiques diverses. C'est une technique principalement employée sur des substrats en verre. Les réactifs sont déposés par micro-pipettage ou par une technique du type jet d'encre. Côté chimie, pour assurer 1 ' interface entre le substrat et le réactif, on peut citer les silanes, les lysines, les thioles lorsque le substrat est préalablement recouvert d'or. Cette chimie est complexe, surtout lorsqu'il s'agit de maîtriser sa reproductibilité sur un substrat pouvant comporter quelques milliers de sites différents. On peut citer, comme représentatif de cette technique, le brevet US 5 474 796 qui se rapporte à la structuration de surface : les réactifs sont fixés sur un substrat présentant des zones hydrophiles et des zones hydrophobes . Le matriçage obtenu est de ce fait très régulier.
Selon une deuxième technique appliquée au domaine des puces à ADN (le réactif est une sonde ADN, notamment un oligonucléotide d'une vingtaine de bases), il a été proposé de construire la sonde base après base sur chaque site. Il est connu d'utiliser des masquages successifs pour faire cette synthèse in situ : chaque site est recouvert d'une base photoprotégée. Le photomasquage permet ensuite d'ôter la protection des sites et de venir accrocher chimiquement une base supplémentaire photoprotégée. L'opération est répétée jusqu'à l'obtention, sur chaque site, de la sonde voulue. Il est actuellement possible de construire plusieurs dizaines de milliers de sondes différentes sur un substrat. Cette technique est excellente mais elle ne permet pas d'obtenir des sondes à grand nombre de bases (la limite est d'environ 20) . Il est possible également de fixer au départ une base protégée non plus par un radical photosensible mais par un radical chimiquement sensible. Il faut alors, par pipettage ou par une technique du type jet d'encre, venir localement sur les sites choisis pour ôter la protection de la base existante et y accrocher une base supplémentaire.
Une troisième technique concerne 1 ' électrodéposition sur site polarisé électriquement d'un polymère conducteur porteur de l'espèce réactive choisie. On peut se reporter à ce sujet à l'article "Electropolymerization of pyrrole and immobilization of glucose oxidase in a flow System : influence of the operating conditions on analytical performance" de Juan-C . VIDAL et al., paru dans Biosensors &
Bioelectronics, vol. 13, No 3-4, pages 371-382, 1998. Le substrat est relié électriquement vers l'extérieur et trempé dans une cuve contenant 1 ' espèce chimique à déposer. Le site choisi est polarisé et la copolymérisation s'effectue (en moins d'une minute sous une tension inférieure à I V). On passe à une autre solution porteuse d'un autre réactif, un autre site est polarisé à la surface du substrat et ainsi de suite. Par ce moyen, des réactifs différents ont été fixés sur des zones différentes du substrat, permettant ainsi une analyse multipoint.
Une amélioration intéressante de cette dernière technique consiste à intégrer l'électronique d'adressage des sites dans le substrat lui-même. Les polymères conducteurs utilisés pour ce procédé sont les polyanilines, les polypyrroles. On peut se reporter à ce sujet aux documents WO 94/22 889, FR-A-2 741 475 et FR-A-2 741 476. Cette façon de faire est intéressante car la fixation de la sonde sur son site est forte, reproductible et bien maîtrisée. C'est une technique séquentielle : chaque site est polarisé successivement et le substrat est recouvert totalement ou trempé dans la solution porteuse du réactif à chaque passe. Cependant, lorsque le nombre de sites devient important, le temps de traitement de chaque support de sites devient prohibitif : autant de fois le temps de copolymérisation plus le temps de rinçage et d'introduction du nouvel électrolyte.
L'utilisation de ces dispositifs à sondes biologiques peut faire appel à une palette très étendue de méthodes : mesure électrique par impédance-métrie, microbalance, mesure optique par changement d'indice de réfraction, marquage radioactif, fluorescence. Cette dernière méthode est de plus en plus utilisée car elle est relativement facile à mettre en oeuvre et elle présente une bonne sensibilité. Schématiquement, elle consiste à coupler 1 ' analyte à tester avec un fluophore. L ' analyte est mis en contact avec le réactif fixé localement sur le micro-système. S'il y a réaction/appariement de quelque nature que ce soit, il restera sur la zone de test 1 ' analyte portant le fluophore. Après lavage, une lecture de la fluorescence permettra de déterminer s'il y a eu appariement sur le site porteur.
Exposé de 1 ' invention
Pour remédier aux problèmes de l'art antérieur, la présente invention propose l'utilisation d'une structure où chaque site est pourvu d'un composé organique offrant une fonction biotine. Chaque site peut alors recevoir une sonde chimique ou biologique constituée par un réactif déterminé (un petit morceau d'un brin d'ADN par exemple) associé par exemple à une fonction avidine ou streptavidine . Dans ce cas, le couplage qui se réalise entre les fonctions avidine et biotine assure la fixation des sondes sur leurs sites respectifs .
L'invention a donc pour objet un procédé de réalisation d'un micro-système à multiple points d'analyse chimique ou biologique, comprenant les étapes consistant à :
- concevoir une structure pourvue de micro-cuvettes, chaque micro-cuvette étant destinée à recevoir un réactif et étant pourvue de moyens de fixation permettant d'y rattacher ledit réactif,
- obtenir un premier composé organique comprenant une fonction d'accrochage avec lesdits moyens de fixation et une fonction d'accrochage avec un deuxième composé organique, ces deux fonctions d'accrochage étant séparées par un espaceur,
- obtenir un deuxième composé organique comprenant une fonction d'accrochage avec la fonction d'accrochage correspondante du premier composé organique et comprenant un réactif,
- fixer le premier composé organique sur les moyens de fixation des micro-cuvettes au moyen de sa fonction d'accrochage correspondante,
- placer, dans chaque micro-cuvette, un deuxième composé organique pour obtenir dans chaque micro-cuvette des sondes d'analyse chimique ou biologique constituées par le réactif attaché aux moyens de fixation par le couplage des fonctions d'accrochage correspondantes des premier et deuxième composés organiques. Selon une première variante, l'étape consistant à fixer le premier composé organique sur les moyens de fixation des micro-cuvettes s'effectue par électro-polymérisation, les moyens de fixation étant des moyens conducteurs accessibles électriquement, la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation étant constituée par un monomère conducteur, une contre-électrode étant utilisée pour effectuer 1 ' électro-polymérisation. Les moyens conducteurs peuvent comprendre une électrode commune à toutes les micro-cuvettes . La structure peut être conçue à partir d'un substrat dont une face présente ladite électrode commune, une couche de matériau isolant étant déposée sur ladite électrode commune, la couche de matériau isolant étant creusée jusqu'à ladite électrode commune pour former les micro-cuvettes dont le fond est constitué par l'électrode commune. La structure peut aussi être conçue à partir d'un substrat actif présentant une pluralité d'électrodes sur l'une de ses faces, cette pluralité d'électrodes constituant les moyens de fixation, une couche de matériau isolant étant déposée sur ladite face, la couche de matériau isolant étant creusée jusqu'aux électrodes pour former les micro-cuvettes, des moyens de multiplexage étant prévus pour relier électriquement la pluralité d'électrodes afin de réaliser 1 ' électro-polymérisation. La contre-électrode peut être une électrode solidaire de la structure ou être placée en regard des moyens de fixation lors de l'opération d' électro-polymérisation. Avantageusement, le monomère conducteur du premier composé organique est du pyrrole.
Selon une deuxième variante, l'étape consistant à fixer le premier composé organique sur les moyens de fixation des micro-cuvettes consiste à mettre en oeuvre une liaison covalente entre la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation et les moyens de fixation. Cette liaison covalente est par exemple de type silanisation (silane-biotine) ou un auto-assemblage mettant en oeuvre une liaison thiol-biotine .
Selon une troisième variante, l'étape consistant à fixer le premier composé organique sur les moyens de fixation des micro-cuvettes s'effectue par voie chimique, par addition d'un réactif apte à provoquer la polymérisation sur les moyens de fixation du premier composé organique. Ce premier composé organique peut être du pyrrole et le réactif apte à provoquer la polymérisation d'un sel ferrique. Selon un aspect particulièrement avantageux, la fonction d'accrochage du premier composé organique avec le deuxième composé organique est une fonction biotine, la fonction d'accrochage du deuxième composé organique avec le premier composé organique étant une fonction avidine ou streptavidine. Le premier composé organique peut être un pyrrole biotinilé. Le deuxième composé organique peut être constitué dudit réactif directement rattaché à la fonction avidine ou streptavidine. Dans ce cas, l'étape consistant à placer, dans chaque micro-cuvette, le deuxième composé organique peut comprendre le dépôt d'une solution contenant le deuxième composé organique dans chaque micro-cuvette puis l'élimination de cette solution pour ne garder que les sondes obtenues par accrochage sélectif des premier et deuxième composés organiques, par exemple par liaison entre la biotine et la streptavidine/avidine .
Le deuxième composé organique peut aussi être constitué dudit réactif rattaché à la fonction avidine ou streptavidine par l'intermédiaire d'une fonction biotine. Dans ce cas, l'étape consistant à placer, dans chaque micro-cuvette, le deuxième composé organique peut comprendre le dépôt d'une première solution d' avidine ou de streptavidine dans chaque micro-cuvette, puis l'élimination de cette première solution pour révéler le premier composé organique avec la fonction biotine complexée par ladite avidine ou ladite streptavidine, ensuite le dépôt d'une deuxième solution contenant ledit réactif sous forme biotinilée, puis l'élimination de cette deuxième solution pour ne garder que les sondes obtenues .
L'invention a aussi pour objet un micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique constitué par une structure pourvue de micro-cuvettes, chaque micro-cuvette étant destinée à recevoir un réactif et étant pourvue de moyens de fixation permettant d'y rattacher ledit réactif par l'intermédiaire d'un premier composé organique, le réactif faisant partie d'un deuxième composé organique, le premier composé organique comportant une fonction d'accrochage avec le deuxième composé organique et une fonction d'accrochage avec les moyens de fixation, ces deux fonctions d'accrochage étant séparées par un espaceur, le deuxième composé organique comportant une fonction d'accrochage avec la fonction d'accrochage correspondante du premier composé organique.
Selon une première variante, les moyens de fixation sont des électrodes et la fonction d'accrochage avec les moyens de fixation du premier composé organique est un polymère conducteur. Les moyens de fixation peuvent former une électrode commune. Les micro-cuvettes peuvent être formées dans une couche isolante de ladite structure, les moyens de fixation formant le fond des micro-cuvettes. La structure peut comporter une contre-électrode disposée en opposition par rapport au fond des micro-cuvettes afin de pouvoir établir un champ électrique entre la contre-électrode et les moyens de fixation. Avantageusement, ledit polymère conducteur est un polypyrrole.
Selon une deuxième variante, les moyens de fixation et la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation sont tels qu'ils forment une liaison covalente. Cette liaison covalente est par exemple de type silanisation (silane-biotine) ou un auto-assemblage mettant en oeuvre une liaison thiol-biotine .
Selon une troisième variante, la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation comporte un réactif de polymérisation, par voie chimique, sur les moyens de fixation. Ce réactif peut être un sel ferrique.
Selon un aspect particulièrement avantageux, le premier composé organique comprend une fonction biotine pour son accrochage avec une fonction avidine ou streptavidine du deuxième composé organique. Le premier composé organique peut être un polypyrrole biotinilé. Le deuxième composé organique peut être constitué dudit réactif directement rattaché à la fonction avidine ou streptavidine. Le deuxième composé organique peut aussi être constitué dudit réactif rattaché à la fonction avidine ou steptavidine par l'intermédiaire d'une fonction biotine.
Brève description des dessins.
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donné à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels :
- les figures 1A à 1E représentent différentes étapes de la réalisation d'une structure destinée à un micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique selon la présente invention ;
- la figure 2 illustre une étape d' électropolymérisation effectuée dans les micro-cuvettes d'une structure destinée à un micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique selon la présente invention ;
- la figure 3 représente une micro-cuvette de la structure représentée à la figure 2 et au fond de laquelle est fixé un premier composé organique, selon le procédé de réalisation d'un micro-système conforme à 1 ' invention , -
- la figure 4 représente une autre structure destinée à un micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique selon la présente invention,
- la figure 5 illustre une étape d' électropolymérisation effectuée dans les micro- cuvettes de la structure représentée à la figure 4 ; - les figures 6 à 8 illustrent l'étape consistant à placer dans une micro-cuvette le deuxième composé organique pour obtenir une sonde d'analyse chimique ou biologique conforme à la présente invention ; - la figure 9 illustre le procédé de fabrication d'un premier composé organique utilisable pour la présente invention.
Description détaillée de mode de réalisation de 1 ' invention. Les figures 1 à 8 illustrent la variante de réalisation pour laquelle les moyens de fixation du premier composé organique sont des électrodes et pour laquelle le placement de ce premier composé organique se fait par électro-polymérisation, ces électrodes permettant l'application d'un potentiel électrique.
Pour cette variante de réalisation, deux cas sont à considérer. La structure peut comporter un substrat passif, c'est-à-dire qu'il ne comporte pas d'électronique intégrée. Dans ce cas, le substrat peut être revêtu d'un plan conducteur (par exemple métallique) lui-même recouvert d'une couche d'un matériau assurant la fonction d'isolation électrique et dans lequel sont formées les micro-cavités. Celles-ci débouchent localement sur le plan conducteur. Les zones découvertes du plan conducteur constituent alors les électrodes de réception.
Le substrat peut aussi être actif auquel cas l'électronique qui lui est intégrée peut servir à différentes fonctions : chauffage localisé des sites, mesure locale de pH, lecture d'un signal de fluorescence, etc. Dans la plupart des cas, il n'est pas possible de laisser en court-circuit les sites pour les fonctions ultérieures qui doivent rester adressables sur chaque site indépendamment des autres. Le multiplexage nécessaire à ces fonctions peut alors être utilisé au cours du procédé de réalisation du micro-système. Il est en effet possible d'adresser collectivement tous les sites pour effectuer l'opération de fixation des réactifs. Chaque site pourra ultérieurement être adressé de façon individuelle .
Les figures 1A à 1E sont des vues en coupe transversale et partielles. Elles illustrent un premier mode de réalisation d'un micro-système selon l'invention pour lequel la contre-électrode est située en surface et pour lequel le substrat est passif.
La figure 1A représente un substrat 1 constitué par une plaquette qui peut être en un matériau tel que le verre, le silicium, le plastique. Sur une face principale de cette plaquette on a déposé une couche métallique 3, par exemple en chrome, en or ou en platine, d'une épaisseur comprise entre 0,1 et 10 μm. Comme le montre la figure 1B, on dépose, sur la couche métallique 3, un film de polymère photosensible 5, par exemple un film de polyimide d'une épaisseur comprise entre 1 et 50 μm.
Des micro-cuvettes 7 sont ensuite formées par insolation et développement du film de polyimide (voir la figure 1C) . Elles sont avantageusement formées avec des flancs en pente. Les micro-cuvettes formées révèlent localement la couche métallique 3. Une nouvelle couche métallique 9 est alors uniformément déposée sur le film de polyimide y compris l'intérieur des micro-cuvettes 7. La couche métallique 9 peut être en chrome, en or ou en platine et avoir 0,1 à 10 μm d ' épaisseur .
Comme le montre la figure 1D, une couche de résine de masquage 11 est déposée sur la couche métallique 9 et des zones à graver dans cette couche métallique 9 sont définies.
La couche métallique 9 est alors gravée aux endroits accessibles et la résine 11 est retirée. On obtient la structure représentée à la figure 1E. Chaque micro-cuvette 7 présente en son fond une électrode 9a, toutes les électrodes 9a étant connectées électriquement grâce à la couche métallique 3. Une électrode commune 9b recouvre la face supérieure du film de polymère 5. Cette structure est prête pour l'étape suivante consistant à placer le premier composé organique au fond des micro-cuvettes.
La figure 2 illustre l'étape d' électropolymérisation. On a représenté une structure 20 pourvue de micro-cuvettes 21 et qui, contrairement au cas décrit précédemment, est constituée à partir d'un substrat actif 22. Les micro-cuvettes 21 ont été formées dans une couche isolante 23 déposée sur le substrat 22. Le fond des micro-cuvettes 21 est constitué par les électrodes 24 qui peuvent être, par multiplexage, reliées électriquement. Comme pour le cas décrit précédemment, une contre-électrode commune 25 a été déposée sur la partie supérieure de la couche isolante 23. Une différence de potentiel peut donc être appliquée entre la contre-électrode 25 et les électrodes 24 reliées électriquement par multiplexage.
Une couche 26 contenant des monomères appropriés, par exemple un mélange de pyrrole et de pyrrole biotinilé comme celui décrit plus loin, est déposée sur la face du substrat 20 présentant les micro-cuvettes. Une différence de potentiel appropriée est appliquée entre la contre-électrode 25 et les électrodes 24. Lorsque 1 ' électro-polymérisation est achevée, les micro-cuvettes sont rincées et séchées . On obtient alors, comme le montre la figure 3, un composé organique 30, constitué de polypyrrole biotinilé, fixé sur les électrodes 24. Ce composé organique adhère aux électrodes 24 par les cycles pyrroles et présente des molécules de biotine 31 rattachées à des cycles pyrroles par des espaceurs 32.
La structure destinée à constituer le micro-système selon 1 ' invention peut ne pas comporter de contre-électrode directement déposée sur elle-même. Une telle structure est représentée à la figure 4. Dans ce cas, la structure 40 comprend par exemple un substrat passif 41 dont une face est recouverte d'une couche métallique 42 formant électrode. Une couche isolante 43 a été déposée sur la couche métallique 42 et gravée pour former des micro-cuvettes 44. L' électro-polymérisation est alors réalisée, comme représenté à la figure 5, dans une cuve 45 remplie d'une solution appropriée 46 contenant un mélange de monomères pyrrole et pyrrole biotinilé. Un générateur de tension continue 47 est branché entre l'électrode 42 et une contre-électrode 48 disposée en vis-à-vis du fond des micro-cuvettes 44. L' électropolymérisation provoque le dépôt de polypyrrole biotinilé sur les zones apparentes de l'électrode 42 comme pour la figure 3. Les figures 6, 7 et 8 illustrent la fixation du deuxième composé organique. La cuve d' électro-polymérisation 45 peut comporter une électrode supplémentaire servant de référence.
L'étape suivante du procédé est représentée par la figure 6. Elle consiste à placer, dans chaque micro-cuvette, une solution 50 comportant le deuxième composé organique 51. Ce deuxième composé organique comporte par exemple une fonction avidine ou streptavidine si le premier composé organique est biotinilé. Une sonde ADN peut ainsi être constituée en choisissant comme deuxième composé organique de l'ADN streptavidine qui est commercialisé. La reconnaissance biotine/streptavidine est très utilisée industriellement à cause du taux de reconnaissance élevé, de l'insensibilité aux variations de température, d'un large choix du tampon, du pH, etc.
La figure 7 montre l'accrochage effectué entre la fonction biotine du composé organique 30 et la fonction avidine ou streptavidine du composé organique 51. Après rinçage et séchage, on obtient un micro-système dont un point d'analyse est représenté à la figure 8. La micro-cuvette 21 est pourvue de sondes constituées par l'association des composés organiques 30 et 51.
Sur le polypyrrole biotinilé du fond des micro-cuvettes, on peut fixer des séquences d'ADN, d'ARN, des oligonucléotides, des enzymes, des acides nucléiques ou aminés, des protéines, des antigènes ou tout produit pouvant être lié à 1 ' avidine (ou la streptavidine) ou à la biotine. En effet, on peut former non seulement l'association : polypyrrole-biotine/ (strept) avidine-réactif , mais aussi l'association : polypyrrole-biotine/ (strept) avidine/biotine-réactif .
On peut alors utiliser de l'ADN biotinilé qui est un produit commercialisé. La double reconnaissance biotine/streptavidine/biotine présente les mêmes qualités que la réaction de reconnaissance biotine/streptavidine.
Il est à noter que 1 ' invention permet le placement de manière collective du premier composé organique sur le fond des micro-cuvettes.
Le polypyrrole biotinilé qui s'accroche au fond des micro-cuvettes est avantageusement un copolymère synthétisé à partir de pyrrole et de pyrrole biotinilé pour lequel la biotine est rattachée à l'atome d'azote d'un cycle pyrrole par un espaceur hydrophile. Le choix de cet espaceur peut être crucial. II doit être suffisamment long pour assurer une reconnaissance non restreinte de la biotine par 1' avidine. Une longueur d'au moins onze atomes est particulièrement appropriée.
La figure 9 est un schéma représentant la synthèse d'un pyrrole biotinilé. Cette synthèse est obtenue par couplage d'un aminoalkylpyrrole et d'une entité biotine. La synthèse de 1 ' aminoalkylpyrrole a été menée en utilisant une réaction telle que décrite par JIRKOWSKY et BAUDY dans Synthesis, 1981, page 481. Les réactifs utilisés et les conditions des réactions sont les suivants : i) 4,7, 10-trioxa-l, 13-tridécanediamine (3 eq. ) , acide acétique/dioxanne à reflux, pendant 5 h, rendement 32% ; ii) KOH 10% à reflux pendant 5 h, rendement
65% ; iii) ester de d-biotine N- hydroxysuccinimide (1 eq. ) dans le diméthylformamide à température ambiante pendant 16 h, rendement 54%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de réalisation d'un micro-système à multiple points d'analyse chimique ou biologique, comprenant les étapes consistant à :
- concevoir une structure (20, 40) pourvue de micro-cuvettes (21, 44), chaque micro-cuvette étant destinée à recevoir un réactif et étant pourvue de moyens de fixation permettant d'y rattacher ledit réactif,
- obtenir un premier composé organique (30) comprenant une fonction d'accrochage avec lesdits moyens de fixation et une fonction d'accrochage avec un deuxième composé organique, ces deux fonctions d'accrochage étant séparées par un espaceur,
- obtenir un deuxième composé organique (51) comprenant une fonction d'accrochage avec la fonction d'accrochage correspondante du premier composé organique (30) et comprenant un réactif, - fixer le premier composé organique (30) sur les moyens de fixation (24) des micro-cuvettes (21) au moyen de sa fonction d'accrochage correspondante,
- placer, dans chaque micro-cuvette (21) , un deuxième composé organique (51) pour obtenir dans chaque micro-cuvette (21) des sondes d'analyse chimique ou biologique constituées par le réactif attaché aux moyens de fixation par le couplage des fonctions d'accrochage correspondantes des premier et deuxième composés organiques.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape consistant à fixer le premier composé organique (30) sur les moyens de fixation (24) des micro-cuvettes (21) s'effectue par électro-polymérisation, les moyens de fixation étant des moyens conducteurs accessibles électriquement, la fonction d'accrochage du premier composé organique (30) avec les moyens de fixation étant constituée par un monomère conducteur, une contre-électrode (25) étant utilisée pour effectuer 1 ' électro-polymérisation.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens conducteurs comprennent une électrode (42) commune à toutes les micro-cuvettes .
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite structure (40) est conçue à partir d'un substrat (41) dont une face présente ladite électrode commune (42), une couche de matériau isolant (43) étant déposée sur ladite électrode commune, la couche de matériau isolant étant creusée jusqu'à ladite électrode commune (42) pour former les micro-cuvettes (44) dont le fond est constitué par l'électrode commune.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite structure (20) est conçue à partir d'un substrat actif (22) présentant une pluralité d'électrodes (24) sur l'une de ses faces, cette pluralité d'électrodes constituant les moyens de fixation, une couche de matériau isolant (23) étant déposée sur ladite face, la couche de matériau isolant (23) étant creusée jusqu'aux électrodes (24) pour former les micro-cuvettes, des moyens de multiplexage étant prévus pour relier électriquement la pluralité d'électrodes (24) afin de réaliser l' électropolymérisation.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la contre- électrode (9b, 25) est une électrode solidaire de ladite structure.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la contre- électrode est une électrode (48) placée en regard des moyens de fixation lors de l'opération d' électropolymérisation .
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le monomère conducteur du premier composé organique (30) est du pyrrole.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape consistant à fixer le premier composé organique (30) sur les moyens de fixation (24) des micro-cuvettes (21) consiste à mettre en oeuvre une liaison covalente entre la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation et les moyens de fixation.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape consistant à fixer le premier composé organique sur les moyens de fixation des micro-cuvettes s'effectue par voie chimique, par addition d'un réactif apte à provoquer la polymérisation sur les moyens de fixation du premier composé organique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le premier composé organique est du pyrrole et en ce que le réactif apte à provoquer la polymérisation est un sel ferrique.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la fonction d'accrochage du premier composé organique (30) avec le deuxième composé organique (51) est une fonction biotine, la fonction d'accrochage du deuxième composé organique (51) avec le premier composé organique (30) étant une fonction avidine ou streptavidine .
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le premier composé organique (30) est un pyrrole biotinilé.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13 , caractérisé en ce que le deuxième composé organique (51) est constitué dudit réactif directement rattaché à la fonction avidine ou streptavidine.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape consistant à placer, dans chaque micro-cuvette (21) , le deuxième composé organique (51) comprend le dépôt d'une solution (50) contenant le deuxième composé organique (51) dans chaque micro-cuvette (21) puis l'élimination de cette solution pour ne garder que les sondes obtenues .
16. Procédé selon l'une des revendications
12 ou 13 , caractérisé en ce que le deuxième composé organique (51) est constitué dudit réactif rattaché à la fonction avidine ou streptavidine par l'intermédiaire d'une fonction biotine.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape consistant à placer, dans chaque micro-cuvette (21), le deuxième composé organique (51) comprend le dépôt d'une première solution d ' avidine ou de streptavidine dans chaque micro-cuvette, puis l'élimination de cette première solution pour révéler le premier composé organique (30) avec la fonction biotine complexée par ladite avidine ou ladite streptavidine, ensuite le dépôt d'une deuxième solution contenant ledit réactif sous forme biotinilée, puis l'élimination de cette deuxième solution pour ne garder que les sondes obtenues.
18. Micro-système à multiples points d'analyse chimique ou biologique constitué par une structure (20, 40) pourvue de micro-cuvettes (21, 44), chaque micro-cuvette étant destinée à recevoir un réactif et étant pourvue de moyens de fixation (24) permettant d'y rattacher ledit réactif par l'intermédiaire d'un premier composé organique (30), le réactif faisant partie d'un deuxième composé organique (51) , le premier composé organique (30) comportant une fonction d'accrochage avec le deuxième composé organique (51) et une fonction d'accrochage avec les moyens de fixation (24), ces deux fonctions d'accrochage étant séparées par un espaceur, le deuxième composé organique (51) comportant une fonction d'accrochage avec la fonction d'accrochage correspondante du premier composé organique (30).
19. Micro-système selon la revendication
18, caractérisé en ce que les moyens de fixation sont des électrodes (9a, 24) et en ce que la fonction d'accrochage avec les moyens de fixation du premier composé organique est un polymère conducteur.
20. Micro-système selon la revendication
19, caractérisé en ce que les moyens de fixation forment une électrode commune (42) .
21. Micro-système selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que les micro-cuvettes (21) sont formées dans une couche isolante (23) de ladite structure (20), les moyens de fixation (24) formant le fond des micro-cuvettes.
22. Micro-système selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que ladite structure (20) comporte une contre-électrode (25) disposée en opposition par rapport au fond des micro-cuvettes afin de pouvoir établir un champ électrique entre la contre-électrode et les moyens de fixation (24) .
23. Micro-système selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que ledit polymère conducteur est un polypyrrole.
24. Micro-système selon la revendication 18, caractérisé en ce que les moyens de fixation et la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation sont tels qu'ils forment une liaison covalente.
25. Micro-système selon la revendication 18, caractérisé en ce que la fonction d'accrochage du premier composé organique avec les moyens de fixation comporte un réactif de polymérisation, par voie chimique, sur les moyens de fixation.
26. Micro-système selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit réactif est un sel ferrique .
27. Micro-système selon l'une quelconque des revendications 18 à 26, caractérisé en ce que le premier composé organique (30) comprend une fonction biotine pour son accrochage avec une fonction avidine ou streptavidine du deuxième composé organique (51) .
28. Micro-système selon la revendication 27, caractérisé en ce que le premier composé organique
(30) est un polypyrrole biotinilé.
29. Micro-système selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que le deuxième composé organique (51) est constitué dudit réactif directement rattaché à la fonction avidine ou streptavidine .
30. Micro-système selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que le deuxième composé organique (51) est constitué dudit réactif rattaché à la fonction avidine ou streptavidine par l'intermédiaire d'une fonction biotine.
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