WO2000078999A1 - Procede de traitement prealable d'un echantillon aux fins de quantification du cholesterol, et procede associe de quantification du cholesterol dans des lipoproteines specifiques - Google Patents
Procede de traitement prealable d'un echantillon aux fins de quantification du cholesterol, et procede associe de quantification du cholesterol dans des lipoproteines specifiques Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a pretreatment method for accurately and efficiently separating and quantifying cholesterol present in a specific fraction by a simple operation with a small number of samples, and a method for measuring cholesterol in a specific fraction using the same.
- Lipids such as cholesterol form lipoproteins with apoproteins in the blood. These lipoproteins are classified into chylomicron, ultra-low specific gravity lipoprotein (VLDL), low specific gravity lipoprotein (LDL), high specific gravity lipoprotein (HDL), etc. according to their physical properties.
- LDL is one of the causative substances causing arteriosclerosis
- HDL high specific gravity lipoprotein
- epidemiologically cholesterol levels in LDL are positively correlated with the frequency of atherosclerotic diseases, while cholesterol levels in HDL are inversely correlated with the frequency of atherosclerotic diseases. Things are known. Therefore, the measurement of cholesterol in LDL and HDL is widely used today for the purpose of preventing and diagnosing ischemic heart disease.
- lipoproteins other than HDL are aggregated in advance, and only cholesterol 5 terol in HDL is enzymatically reacted, and then the enzyme is deactivated and the aggregate is redissolved and the absorbance is measured.
- Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 6-224110 Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 6-224110
- this method requires at least three operations of adding reagents, it can be applied only to a limited number of automatic analyzers, and has a problem in versatility.
- the use of high-concentration salts was not satisfactory in terms of waste disposal of reagents to the analyzer.
- cholesterol oxidase and cholesterol esterase are allowed to act on lipoproteins other than HDL in the presence of a special surfactant, and cholesterol contained in these is preferentially acted on, and then cholesterol other than HDL.
- a method for measuring cholesterol in HDL while suppressing the reaction to nitric acid is also known (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-299), but the free form and ester of lipoproteins other than HDL in the first reaction are known.
- the present invention is greatly different from the present invention in that a special surfactant for introducing both type cholesterol out of the reaction system and cholesterol oxidase and cholesterol esterase are required at the same time.
- lipoproteins other than HDL are precipitated.
- a method for measuring cholesterol (HDL-C) in unprecipitated HDL using a combination of a precipitating reagent and a cholesterol measuring reagent is disclosed.
- a modified enzyme and sulfated ⁇ -cyclodextrin are used as a precipitating agent. This method is a feasible method when used as a method, and also has a problem in terms of accuracy, such as turbidity caused by the effect of the precipitant, which may interfere with the measurement system.
- the present invention basically does not require polyadione or the like, and can accurately and efficiently quantify cholesterol in a specific fraction by a simple operation, and is suitably used for various automatic analyzers. It is an object of the present invention to provide a method for performing such operations.
- the present inventors have reported that the quantitative value of cholesterol in a specific fraction using a substance acting only on a specific lipoprotein such as HDL, which was reported in the above "Biological Sample Analysis", was higher than the value of the precipitation method.
- a small amount of free cholesterol present on the surface or in the immediate vicinity was extracted from lipoproteins (LD, VLDL, etc.) other than the t, H0DL fraction that should not be measured. And concluded that this was the cause of the positive error.
- a quantitative method using a substance acting only on a specific lipoprotein can be obtained.
- the present invention was completed by finding that the value of 5 coincides with the value of 5 by the precipitation method.
- the present invention provides a sample for cholesterol quantification, wherein an enzyme using free cholesterol as a substrate is allowed to act on a sample containing lipoprotein before measuring cholesterol present in a specific lipoprotein in the sample. It provides a pretreatment method for the above.
- the present invention provides a method for measuring the cholesterol present in a specific lipoprotein using a substance which acts only on a specific lipoprotein, after allowing an enzyme using free cholesterol as a substrate to act on a sample containing the lipoprotein. And a method for quantifying a specific lipoprotein cholesterol. 5 Brief description of drawings
- FIG. 1 is a drawing showing the correlation between the present invention and the precipitation method in Example 1
- FIG. 2 is a drawing showing the correlation between the present invention and the precipitation method in Example 2.
- FIG. 3 is a drawing showing the effect of the reaction promoting substance in Example 5.
- an enzyme using free cholesterol as a substrate is first acted on as a pretreatment to consume the free cholesterol.
- any enzyme that uses free cholesterol as a substrate such as cholesterol dehydrogenase or cholesterol oxidase, may be used. These may be derived from microorganisms, animals, plants, etc., or may be produced by genetic manipulation. It does not matter whether or not there is chemical modification.
- the above enzymes are generally used at 0.01 to 100 units ZmI, preferably at 0.1 to 100 units ZmI.
- the conditions for causing the enzyme using free cholesterol as a substrate to act on the sample are not particularly limited, and may be the conditions recommended for the enzyme. However, it is necessary to pay attention so that the reaction of converting ester-type cholesterol into free-type cholesterol does not occur at the stage of applying an enzyme using free-type cholesterol to the sample. In other words, the presence or absence of cholesterol esterase does not matter, but it is necessary to maintain conditions that do not make it substantially effective.
- a coenzyme can be used as the enzyme using free cholesterol as a substrate, and nicotinamide adenine dinucleotide and the like can be used as the coenzyme.
- These enzymes can be used alone or in combination of two or more. The amount used varies depending on the enzyme, and is not particularly limited, but is 0.001 unit to 100 units / mI, preferably 0.1 unit to 100 units ZmI.
- the enzyme using free cholesterol as a substrate used in the present invention has no restriction on its origin, and the concentration and the like can be appropriately selected so as to satisfy desired performance and operability. Therefore, for example, in order to complete the pretreatment within a certain period of time, the amount of the enzyme may be increased, and conversely, if the enzyme is to be saved, the time of the pretreatment may be extended.
- pretreatment can be performed in a short time by using a small amount of enzyme. This is the case where it is required to complete.
- the co-presence of a reaction promoting substance selected from the following groups reduces the amount of enzyme in the pretreatment using an enzyme using free cholesterol as a substrate without prolonging the pretreatment time.
- reaction accelerator used for the above purpose examples include flufenamic acid, mephenamic acid, 2,2 ', 6', 2 "-terpyridine, tiglic acid, fusidic acid, betamethasone acetate, monensin, mevinolin and the like. (Similarly, if a salt of a reaction promoting substance or a metal derivative of a reaction promoting substance (aluminum derivative, etc.) exists, the same applies.) Of these, flufenamic acid and mephenamic acid are non-steroidal anti-inflammatory drugs.
- the agents, fusidic acid and monensin are substances known as antibiotics.
- the concentration of the reaction accelerator used can be determined experimentally according to the conditions of the measurement system, but in general, for flufenamic acid, about 0.01 to 1 O OmM, and for fusidic acid. About 0.01 to 1 OmM, about 0.01 to 5 mM for mephenamic acid, 2, 2 ', 6', 2 "_ terpyridine and betamethasone acetate, about 0.01 to 1 mM for monensin and mevinolin In the case of tiglic acid, it may be used at about 1 to 500 OmM.
- the amount of the enzyme using free cholesterol as a substrate can be reduced to several tenths to several tenths. It is also possible to reduce the reaction time with the same enzyme seal.
- a specific liposome may be used.
- other enzymes excluding those that substantially affect lipoproteins
- salts including those that substantially affect lipoproteins
- buffers for adjusting pH including those that substantially affect lipoproteins
- surfactants substantially affect lipoproteins
- preservatives proteins such as albumin, antibodies, antibiotics, specific liposomes such as saponins, lectins, polyadiones
- a reagent having an affinity for a protein can also be used.
- a pretreatment agent for measuring cholesterol present in a specific lipoprotein in a sample a pretreatment agent containing the following components can be used.
- enzymes using free cholesterol as a substrate such as cholesterol dehydronagease and cholesterol oxidase.
- reaction-promoting substances such as flufenamic acid, mephenamic acid, 2,2 ', 6', 2 "-terpyridine 0, tiglic acid, fusidic acid, betamethasone acetate, monensin, and mevinolin.
- the cholesterol present in the specific lipoprotein in the sample is measured.
- a method of measuring cholesterol present in a specific lipoprotein in a sample any method capable of measuring cholesterol present in the specific lipoprotein using a substance that acts only on the specific lipoprotein can be used. Any method can be used.
- a surfactant selected from polyoxyethylene alkylene phenyl ether and polyalkylene alkylene tribenzyl phenyl ether disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. A substance that acts only on lipoproteins in the presence of lipoproteins.
- the white methods there is a method in which the cholesterol in the high-density lipoprotein is preferentially reacted with the enzyme reagent for measuring cholesterol, and the reaction site of the cholesterol is measured within the time.
- Emulgen A-60 (manufactured by Kao Corporation) is an example of a commercial product of the former polyoxyethylene alkylene phenyl ether, and an example of a commercial product of the polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether is the latter.
- Emargen B66 (manufactured by Kao Corporation).
- Another method is to use the modified enzyme disclosed in Biological Sample Analysis, Vol. 19, No. 5, pp. 305 to 322 as a substance acting only on a specific lipoprotein.
- sulfated ⁇ -cyclodextrin and magnesium chloride are used to suppress the reaction of lipoprotein fractions other than HDL, but these can be used if the pretreatment method of the present invention is used. There is no need.
- the method for measuring cholesterol present in a specific lipoprotein can be carried out using a reagent used in a usual method for measuring cholesterol, except that a substance that acts only on a specific lipoprotein is used.
- Examples of the components contained in the reagents used include enzymes such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, isoquenate dehydrogenase, diaphorase, and peroxidase, color formers, coenzymes, electron acceptors, proteins (such as albumin ), 0 preservatives, surfactants, salts, acids, buffers for adjusting ⁇ .
- enzymes such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, isoquenate dehydrogenase, diaphorase, and peroxidase
- color formers such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, isoquenate dehydrogenase, diaphorase, and peroxidase
- color formers such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, isoquenate dehydrogenase, diaphorase, and peroxidase
- any of ionic and nonionic surfactants can be used.
- polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene Examples include polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, alkylbenzenesulfonate, bile acids, and the like.
- the amount of the surfactant used varies depending on the compound and is not particularly limited, but is used in the range of 0.001% to 5%, preferably 0.001% to 5%. .
- the buffer is not particularly limited, and a simple buffer such as Good's buffer, phosphoric acid, tris, or phthalate can be used.
- the amount of use is also limited. However, it is used in the range of 0.05 M to 2 M, preferably 0.01 to 1 M.
- the method of quantifying cholesterol in a specific lipoprotein fraction according to the present invention is typically performed by first adding a pretreatment agent that acts only on free cholesterol to a measurement sample and then reacting only a specific lipoprotein. Of cholesterol in a specific lipoprotein fraction by adding and mixing a cholesterol quantification reagent (hereinafter referred to as “quantification reagent”) containing a substance that acts on cholesterol and a reagent used in a usual cholesterol measurement method .
- Specific examples thereof include a method in which cholesterol dehydrogenase and a coenzyme (NAD) are mixed in a sample, and a cholesterol measuring reagent containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, etc. is added, and cholesterol dehydrogenase is added to the sample. And cholesterol esterase, etc., and then add a cholesterol measurement reagent containing cholesterol esterase, etc., and mix the sample with cholesterol oxidase together with peroxidase, 41-aminoantipyrine or catalase, then contain cholesterol esterase, etc.
- NAD cholesterol dehydrogenase and a coenzyme
- cholesterol measuring reagent Add cholesterol measuring reagent, mix cholesterol oxidase with test sample together with peroxidase, 4-aminoantipyrine, etc., and then cholesterol esterase, cholesterol Examples include a method of adding a cholesterol measuring reagent containing terol dehydrogenase, NAD, and the like, but the method is not limited thereto.
- any of the known enzymatic measurement methods can be used.
- a method using a combination of cholesterol esterase and cholesterol oxidase as enzyme reagents examples include a method using a combination of esterase and cholesterol dehydrogenase.
- the enzyme used in the first reaction as the pretreatment reaction and the enzyme used in the cholesterol measurement in the second reaction as the quantification method may be the same or different.
- an excessive amount of the enzyme may be used and used in the second reaction. The point is that a small amount of free cholesterol present on the lipoprotein surface is consumed (first reaction, pretreatment reaction), and then the specific What is necessary is to make it possible to quantify most cholesterol (free cholesterol + ester cholesterol) constituting the lipoprotein in a state where the enzyme acts only on the lipoprotein.
- the method for detecting terol is not particularly limited.For example, absorbance analysis performed by further combining peroxidase and chromogen, or diaphorase or an electron acceptor and a reducing chromogenic reagent, and directly detecting coenzyme and hydrogen peroxide A method of doing so can also be used.
- the coenzyme may be amplified by a coenzyme cycling system.
- a quantification kit for measuring cholesterol in a specific lipoprotein suitable for the method it is preferable to use a quantification kit for measuring cholesterol in a specific lipoprotein suitable for the method.
- Such a kit can be easily designed based on the above description.
- Examples of such a kit include a case where cholesterol oxidase is used as a representative enzyme using free cholesterol as a substrate and a case where cholesterol dehydrogenase is used. It is as follows if divided into two.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein comprising:
- the term "hydrogen peroxide consuming substance” refers to a substance that consumes and eliminates hydrogen peroxide generated by the reaction between cholesterol oxidase 5 and cholesterol, and examples thereof include catalase and 4-aminoantipyrine. And a redox coloring reagent containing a hydrogen donor such as a binder reagent.
- a redox coloring reagent containing a hydrogen donor such as a binder reagent.
- couplers such as 4-aminoantipyrine and hydrogen donors such as Trinder's reagents are those that develop color by combining them and reacting with hydrogen peroxide, and the color development of (2) or (3) above It is used as an agent.
- reagent (1) used in the pretreatment step of the present invention it is preferable that only one of a coupler and a hydrogen donor is used as the reagent (1) used in the pretreatment step of the present invention, and hydrogen peroxide is consumed in a non-color-forming reaction.
- a color reaction it is also possible to make a color reaction and adjust the measured value (it can be adjusted by subtracting the color value of reagent (1) from the color value of reagent (2) or reagent (3)).
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein (F) The following reagents (1) and (2)
- a kit for the determination of cholesterol in a specific lipoprotein consisting of 5.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- a first reagent containing cholesterol dehydrogenase, a coenzyme, and a coenzyme reaction product consuming substance (and optionally a reaction promoting substance);
- a substance that acts only on a specific lipoprotein and a second reagent containing cholesterol esterase A kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein, comprising:
- a kit for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein is provided.
- the coenzyme reaction product consuming substance refers to cholesterol, cholesterol dehydrogenase, and a reduced coenzyme (eg, NADH) generated by the reaction of 0 coenzyme (eg, NAD).
- a reduced coenzyme eg, NADH
- 0 coenzyme eg, NAD
- substances returned to enzymes examples of which include lactate dehydrogenase and pyruvate (substrate).
- the reaction product of coenzyme is generated by the addition of reagent (1), and the reaction product is consumed in (2), (H), (H) and (N).
- the reagent (1) is added based on the color value of the reagent (2) or the reagent (3). By subtracting the color value at the pretreatment stage, cholesterol in a specific lipoprotein can be quantified.
- a substance that consumes the reaction product may be added to the reagent (1) in advance, and after the consumption, the reagent (2) or the reagent (3) may be added to develop the color. At this time, it is better to mix the reagent (2) 0 or the reagent (3) with a substance that reduces the effect of the substance consuming the reaction product.
- the kits (Thu), (U), (R) and (R) the color of a different wavelength from the color of the pre-processing is measured. It is not necessary to deduct.
- reaction-promoting substances such as flufenamic acid, mephenamic acid, 2, 2 ', 6', 2 "-terpyridine, tiglic acid, fusidic acid, betamethasone acetate, monensin, mevinolin, etc.
- the present invention is not limited to the treatment method (agent) and the method (kit) for quantifying cholesterol in the specific lipoprotein of the present invention using the same.
- Determination of cholesterol using enzyme with free cholesterol as substrate For example, a method for quantifying free cholesterol assembled using cholesterol oxidase, bar oxidase, a color former, etc., or a method for determining total cholesterol assembled using cholesterol oxidase, cholesterol esterase, peroxidase, chromogen, etc.
- the use of free cholesterol as a substrate in this case, cholesterol oxidase
- the present invention it is possible to efficiently determine cholesterol in a specific fraction by a simple operation 5 without using polyanion or the like, as well as mechanical pretreatment such as centrifugation. Also, since precipitation with polyanion does not occur, the measurement device (especially the cell) does not become dirty, and there is no variation in measured values. Things.
- reaction accelerator when used, it is possible to reduce the amount of enzyme used in the pretreatment, which uses free cholesterol as a substrate.
- the method of the present invention can perform accurate and specific measurements on a wide range of samples by a simple operation with a small number of samples, so that it can be applied to various automatic analyzers, and can be used for clinical tests. It is extremely useful to place it in an area.
- cholesterol in HDL was quantified as described below for 30 serum samples containing lipoprotein, and the measured values were compared.
- the absorbance at 600 nm was measured immediately before the addition of the second reagent and 5 minutes after the addition, and the HDL cholesterol concentration in the serum sample was determined from the difference (2-point method).
- a control serum with a known concentration was used as a calibration substance. The above operations were performed using a Hitachi Model 7150 automatic analyzer.
- the mixture was mixed with 00 ⁇ l, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. 50 HI of the supernatant was collected, and Triton X—100%, cholesterol esterase 1 unit Zm I, cholesterol oxidase 1 unit / mI, peroxidase 5 units mI, and disulfobutylmetatruidine 0.04 Cholesterol measurement reagent consisting of 100 mM MES buffer (pH 6.5) containing 0.04% of 4-aminoantipyrene and 0.04% of 4-aminoantipyrine. The mixture was mixed with 3 ml of a cholesterol measuring reagent, incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then incubated at 600 nm. The absorbance was measured, and the cholesterol concentration in HDL was determined.
- Cholesterol dehydrogenase, NAD and phosphate buffer of the first reagent of Example 1 were combined with 5 units of cholesterol oxidase of ZmI (Toyobo), 5 units of cholesterol oxidase of ZmI (Toyobo) and 1 O OmM MES (p The measured values were compared in place of H6).
- Example 3 shows the results.
- FIG. 3 shows the results of averaging the relative absorbance of the four samples. Note that in the figure, Luxoxidase is designated as COD.
- the relative absorbance increased at all pH values depending on the concentration of flufenamic acid. It was confirmed that the use of a reaction promoting substance can reduce the amount of cholesterol-grade oxidase used.
- reaction promoting substance can be used in a method for measuring free cholesterol using an enzyme using free cholesterol as a substrate or a method for measuring total cholesterol.
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Description
明 細 書 コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用
する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
5 技術分 野
本発明は、 少ない試料で簡便な操作により、 正確に、 効率良く特定画分に存 在するコレステロールを分離定量するための前処理方法およびこれを用いる特定 0 画分中のコレステロール測定方法に関する。 背景技術
コレステロール等の脂質は、 血中においてアポ蛋白と共にリポ蛋白質を形成し ている。 このリポ蛋白質は物理的な性状の違いにより、 カイロミクロン、 超低比 5 重リポ蛋白 （V LDL)、 低比重リポ蛋白 （LDL)、 高比重リポ蛋白 （HDL) 等に分類される。 これらのリポ蛋白のうち、 LDLは動脈硬化を引き起こす原因 物質の一つであり、 一方、 HDLは抗動脈硬ィ匕作用を示す事が知られている。 すなわち、 疫学的にいえば、 LDL中のコレステロール値は、 動脈硬化性疾患 の発症頻度と正相関を示し、 一方、 HDL中のコレステロール値は動脈硬化性疾 0 患の発症頻度と逆相関を示す事が知られている。 従って、 今日では、 虚血性心疾 患の予防や診断を目的として L D L中や H D L中のコレステロールの測定が広く 行われている。
この LDLや HDL中のコレステロールの測定法としては、 たとえば超遠心分 離によって L DLや HDLを、 他のリポ蛋白と分離した後、 コレステロール測定 5 に供する方法や、 電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行って、 その発色 強度を測定する方法が知られている。 しかしながら、 これらの方法は、いずれも、 操作が煩雑であったり、 多数の検体を処理できないなどの問題があり、 日常的に ほとんど用いられていない。
現在、 H D L中のコレステロールの測定方法として、 臨床検査の領域で用いら
れている方法には、 検体に沈澱剤を加えて H D L以外のリポ蛋白を凝集させ、 こ れを遠心分離によって取り除き、 分離された H D Lのみを含む上清中のコレステ ロールを測定する沈澱法がある。 この方法は、 超遠心法や電気泳動法に比較して 簡便であるものの、 沈澱剤を加えて分離する操作を含むために、 比較的多量の検 5 体量を要し、 また、 分析誤差を生じる可能性も高く、 全分析工程を完全に自動化 する事はできなかった。
一方、 酵素的に H D L中のコレステロールを分別定量する方法も検討されてい る。 たとえば、 胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、 酵素反応を行う 方法 （特開昭 6 3— 1 2 6 4 9 8号） が知られている。 この方法は、 反応初期の 0 酵素反応は L D L中のコレステロール濃度に比例し、 その後の反応速度は H D L 中のコレステロール濃度に比例する事を利用したものであるが、 H D L中のコレ ステロールと他のリポ蛋白中のコレステロールの反応を完全に分別する事はでき ず、 正確性に問題があった。
また、 H D L以外のリポ蛋白をあらかじめ凝集させておき、 H D L中のコレス 5 テロールのみを酵素的に反応させた後に、 酵素を失活させると同時に凝集を再溶 解して吸光度を測定するという方法 （特開平 6— 2 4 2 1 1 0号） が知られてい る。 しかしながら、 この方法は少なくとも 3回の試薬を添加する操作が必要であ るため、限定された自動分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。 また、 沈澱の再溶解に際しては、 高濃度の塩を使う等、 分析器機に対するダメー 0 ジゃ試薬廃棄の点でも満足できるものではなかった。
更に第一反応中に、 特殊な界面活性剤の存在下でコレステロール才キシダーゼ 及びコレステロールエステラーゼを H D L以外のリポ蛋白に作用させ、 これらに 含まれるコレステロールを優先的に作用させたのち、 H D L以外のコレステロ一 ルに対する反応を抑制しながら H D L中のコレステロールを測定する方法 （特開 5 平 9— 2 9 9号） も知られているが、 第一反応中で H D L以外のリポ蛋白の遊離 型及びエステル型コレステロールの両方を反応系外に導くための特殊な界面活性 剤とコレステロール才キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼを同時に必要と する点などで本発明と大きく異なっている。
更にまた、 特許第 2 6 0 0 0 6 5号では、 H D L以外のリポ蛋白を沈澱させる
沈澱試薬とコレステロール測定試薬を組み合わせて使用し、 沈澱しない H D L中 のコレステロール （H D L— C ) を測定する方法が開示されるが、 実際には修飾 した酵素と硫酸化 α―シクロデキス卜リンを沈澱剤として用いる場合に実施可能 性がある方法であり、 また沈殿剤の効果によって生じる濁りが測定系に妨害を与 5 えてしまうなど、 精度の点でも問題のある測定法であった。
上記の特許方法についての論文発表とされる 「生物試料分析」、 第 1 9巻、 第 5号の第 3 0 5頁から第 3 2 0頁では、 修飾酵素による H D L— Cの測定につい て、 修飾酵素を反応系に導入するだけではプラス誤差を与える （沈殿法に比べ、 高い値が出る） ため、 高脂血症患者血清中の H D L— Cは測定できないことを認 0 めた上で、 これをさけるためにポリア二オンの 1種である硫酸化シクロデキスト リンと塩化マグネシウムを沈殿剤として用い、 H D L— Cを測定したことを報告 している。
上記特許方法の沈澱剤によって生ずる濁りの影響を軽減するために界面活性剤 を共存させる （特開平 8— 1 1 6 9 9 6号） 技術や、 抗体を使用する （特開平 95 一 9 6 6 3 7号）、 糖化合物を使用する （特開平 7— 3 0 1 6 3 6号） 等の技術 もあるが、 これらはいずれも凝集生成を引き起こす試薬が含まれることを条件と するものであり、 基本的にポリア二オン等の沈殿剤の使用はさけられないもので あった。
最近本発明者らは、特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用することにより、 0 沈殿剤を使用しなくても特定画分中のコレステロールを正確に定量しうることを 見いだし、 特許出願した （特願平 9一 2 4 4 8 2 1号）。 この方法は、 従来の沈 殿法とは極めて相関性が高いものであるが、 沈殿法との測定値の関係では、 上記 「生物試料分析」 で報告されたのと同様な傾向が認められており、 医療機関など で従来の沈殿法と継続したデータを得るために、 ポリア二オン等が添加されてい 5 た。
しかしながら、 ポリア二オン等を加え、 測定系中に沈殿を生じさせることは、 セルの汚れ等の問題や、 測定値のばらつきの関係から望ましいものでなく、 系中 からの沈殿物の追放が強く求められていた。 更に、 測定原理上は不必要なポリア 二オン等を、 データを一致させるためだけに用いることは経済的にも不合理なこ
とであり、 その解決も求められていた。
従って、本発明は基本的にポリア二オン等を必須とせず、簡便な操作で正確に、 かつ効率よく特定画分中のコレステロールを定量する事ができ、 種々の自動分析 装置に好適に使用される方法を提供することを課題とする。
5
発 明 の 開 示
本発明者等は、 前記 「生物試料分析」 中で報告された、 H D L等の特定のリポ 蛋白のみに作用する物質を利用した特定画分中のコレステロールの定量値が沈殿 法の値よリ高くでる原因について追求していたところ、 測定されるべきでな t、 H 0 D L画分以外のリポ蛋白 （L Dし、 V L D L等） からも表面ないしその極近傍に 存在する少量の遊離型コレステロールが引き出され、 これが正誤差を生じる原因 であるとの結論を得た。 そして、 この知見に基づき、 リポ蛋白が実質的に変化し ない条件で遊離型コレステロールのみを予め消費してからコレステロール値を測 定すれば、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用した定量法の値と沈殿法で 5 の値が一致することを見いだし、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測 定するに先立ち、 リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素 を作用させることを特徴とするコレステロール定量用試料の前処理方法を提供す るものである。
0 また本発明は、 リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素 を作用させた後、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用して特定のリポ蛋白 中に存在するコレステロールを測定することを特徴とする特定のリポ蛋白コレス テロール定量法を提供するものである。 5 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における本発明と沈殿法の相関関係を示す図面であり、 図 2 は実施例 2における本発明と沈殿法の相関関係を示す図面である。
図 3は、 実施例 5における反応促進物質の効果を示す図面である。
発明を実施するための最良の形態
本発明においては、 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測 定するに先立ち、 まず前処理として試料に遊離型コレステロールを基質とする酵 素を作用させ、 遊離型コレステロールを消費する。
5 遊離型コレステロールを基質とする酵素としては、 例えばコレステロールデヒ ドロナゲーゼ、 コレステロール才キシダーゼなど遊離型コレステロールを基質と するものならばいずれでも差し支えない。 これらは、 微生物由来、 動物由来、 植 物由来など、 いずれでも、 また遺伝子操作により作られたものでも良い。 また化 学修飾の有無も問わない。 上記酵素は、 一般的には 0 . 0 0 1単位〜 1 0 0単位 0 Zm Iで、 好ましくは 0 . 1単位〜 1 0 0単位 Zm Iで使用される。
試料に上記遊離型コレステロールを基質とする酵素を作用させるための条件 は、 特に制約はなく、 当該酵素について推奨される条件でよい。 しかしながら、 試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素を作用させる段階において、 エス テル型コレステロールを遊離型コレステロールに変換する反応が生じないように 5 注意する必要がある。 すなわち、 コレステロールエステラーゼの有無は問題では ないが、 これを実質的に作用せしめない条件を維持する必要がある。
前記の遊離型コレステロールを基質とする酵素は必要に応じて、 補酵素を使用 することができ、 補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドなどが 使用できる。 これらの酵素は、 単独で、 或いは 2種以上を組み合わせて用いる事 0 ができ、 またその使用量は酵素によって異なり、 特に制限されるものではないが 0 . 0 0 1単位〜 1 0 0単位/ m Iで、 好ましくは 0 . 1単位〜 1 0 0単位 Zm I で使用される。
本発明において使用される遊離型コレステロールを基質とする酵素は、 前記の ようにその由来についての制約はなく、 濃度などは所望の性能、 操作性を満たす 5 ように適宜選択できる。 従って、 例えば一定の時間内に前処理を完了させるため には、 酵素を増量すれば良いし、 逆に、 酵素を節約したいなら、 前処理時間を延 長すれば良い。
しかしながら、 自動分析機での測定を前提とした検査薬の場合には、 両方を同 時に満たすことが要望される。 すなわち、 少量の酵素の利用で短時間に前処理を
完了させることが求められる場合である。 このような場合、 以下の群から選ばれ る反応促進物質を共存させることで、 遊離型コレステロールを基質とする酵素を 使用する前処理において、 前処理の時間を延長することなく、 酵素量を低減し、 所望の性能を得ることが可能である。
5 上記の目的のために利用される反応促進物質としては、 例えば、 フルフエナム 酸、 メフエナム酸、 2， 2'， 6'， 2 "—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシン、 メビノリン等 （反応促進物質の塩あるいは反 応促進物質の金属誘導体 （アルミニウム誘導体等） が存在するものはそれらも同 様） が挙げられる。 このうち、 フルフエナム酸およびメフエナム酸は、 非ステロ 0 イド系抗炎症剤、 フシジン酸およびモネンシンは抗生物質として知られている物 質である。
これら化合物の反応促進物質としての使用に当たっては、 それぞれの物性や、 測定系の pH、 イオン強度、 混在物の種類、 濃度などを考慮し、 濃度等を適宜選 択することが必要である。
5 反応促進剤の使用濃度は、 測定系の条件に合わせ実験的に決めることが可能で あるが、 一般的には、 フルフエナム酸の場合は、 0.0 1〜1 O OmM程度、 フ シジン酸の場合は、 0.0 1〜 1 OmM程度、 メフエナム酸、 2， 2'， 6'， 2"_ テルピリジン、 酢酸ベータメタゾンの場合は、 0.0 1〜5mM程度、 モネンシ ン、 メビノリンの場合は、 0.0 1〜1 mM程度、 チグリン酸の場合は、 1〜5 0 0 OmM程度で使用すればよい。
上記の反応促進剤を利用することにより、 遊離型コレステロールを基質とする 酵素の使用量を数分の一ないし数十分の一にすることが可能となる。 また、 同じ 酵素璽で反応時間を短縮することも可能となる。
上記の遊離型コレステロールを基質とする酵素 （および必要な場合は反応促進 5 剤） による前処理においては、 更に測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整す る目的で、 また、 特定のリポ蛋白の凝集を生じない範囲で、 他の酵素 （リポ蛋白 に実質的に影響を与えるものを除く） や塩、 p H調整のための緩衝剤、 界面活性 剤 （リポ蛋白に実質的に影響を与えるものを除く）、 防腐剤、 アルブミンなどの 蛋白質類、 抗体、 抗生物質、 サポニン、 レクチン、 ポリア二オンなど特定のリポ
蛋白に親和性を有する試薬を使用することもできる。
従って、 本発明において、 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロ一 ルを測定するための前処理剤として、 次のような構成成分を含んだものを利用す ることができる。
5 (必須成分）
例えばコレステロールデヒドロナゲーゼ、 コレステロール才キシダーゼな どの遊離型コレステロールを基質とする酵素。
(任意成分）
例えば、 フルフエナム酸、 メフエナム酸、 2， 2 '， 6 '， 2 "—テルピリジン 0 、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシン、 メビノリ ン等の反応促進物質。
(その他成分）
例えば N A D等の補酵素、 バーオキシダーゼ、 カタラーゼ、 ジァホラーゼ 、 ァスコルビン酸酸化酵素などの他の酵素、 ピルビン酸などの酸、 塩、 p 5 H調整のための緩衝剤、 リポ蛋白に実質的に影響を与えない界面活性剤、 防腐剤、 アルブミンなどの蛋白質類、 抗体、 抗生物質、 サポニン、 レクチ ン、 ポリア二オン、 4—ァミノアンチピリン等のカップラー、 トリンダー 試薬等の水素供与体など酸化系発色試薬類、 フヱナジンメ卜サルフエ一卜 等の電子受容体類、 ニトロブルーテ卜ラゾリゥ厶等の還元系発色試薬類。
0 本発明においては、 上記前処理によリリポ蛋白中の遊離型コレステロールを消 費させた後、 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測定する。 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測定する方法として は、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用して当該リポ蛋白中に存在するコ レステロールを測定することができる方法であれば何れの方法をも利用すること 5 ができる。
その方法の一例としては、 例えば、 特開平 1 1 一 5 6 3 9 5号に開示のポリオ キシェチレンアルキレンフエニルエーテル及びポリ才キシェチレンアルキレン卜 リベンジルフエ二ルエーテルから選ばれる界面活性剤を特定のリポ蛋白のみに作 用する物質とし、. その存在下、 コレステロール測定用酵素試薬を添加し、 リポ蛋
白のうち、 高比重リポ蛋白中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用 酵素試薬と反応する時間内にそのコレステロールの反応置を測定する方法が挙げ られる。
このうち前者のポリオキシエチレンアルキレンフエニルエーテルの市販品の例 5 としてはェマルゲン A— 6 0 (花王社製） などが、 後者のポリ才キシエチレンァ ルキレン卜リベンジルフエニルエーテルの市販品の例としてはェマルゲン B 6 6 (花王社製） 等があげられる。
更に、 別の方法としては、 生物試料分析、 第 1 9巻、 第 5号の第 3 0 5頁から 第 3 2 0頁に開示の修飾酵素を、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質として用い 0 る方法が挙げられる。 この文献の方法では、 H D L以外のリポ蛋白画分の反応を 抑制するために硫酸化 α—シクロデキス卜リンと塩化マグネシウムを用いている が、 本発明の前処理方法を利用すればこれらを使用する必要はなくなる。 特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測定する方法は、 特定のリポ蛋 5 白のみに作用する物質を利用する以外は、 通常のコレステロールの測定方法に用 いる試薬により実施することができる。用いられる試薬に含まれる成分としては、 例えば、 コレステロールエステラーゼ、 コレステロール才キシダーゼ、 コレステ ロールデヒドロゲナーゼ、 イソクェン酸デヒドロゲーゼ、 ジァホラーゼ、 パーォ キシダーゼなどの酵素類、発色剤、補酵素、電子受容体、蛋白質（アルブミン等)、 0 防腐剤、 界面活性剤、 塩、 酸、 ρ Η調整のための緩衝剤等が挙げられる。
上記成分のうち、 界面活性剤としては、 イオン性、 非イオン性のいずれのもの も使用することができ、 例えばポリ才キシエチレンアルキルエーテル、 ポリ才キ シエチレンアルキルフエニルエーテル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピ レン縮合物、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、 アルキルベンゼンス 5 ルホン酸塩、 胆汁酸類等が挙げられる。 この界面活性剤の使用量は化合物によつ て異なり、 特に制限されるものではないが 0 . 0 0 0 1 %〜5 %で、 好ましくは 0 . 0 0 1 % ~ 5 %で使用される。
また、 緩衝剤としては、 特に制約なく、 グッドの緩衝剤、 りん酸、 卜リス、 フ タル酸塩など一 的なものを使用できる。 また、 その使用量も特に制限させるも
のではないが 0 . 0 0 5 M〜2 M、 好ましくは 0 . 0 1 ~ 1 Mで使用される。 本発明により特定のリポ蛋白画分中のコレステロールを定量する方法は、 典型 的には、 まず測定試料中に遊離型コレステロールのみに作用する前処理剤を添加 作用させた後に、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質と通常のコレステロールの 測定方法に用いる試薬を含むコレステロール定量試薬 （以下、 「定量試薬」 とい う） を添加混合して特定リポ蛋白画分中のコレステロール量を測定する方法であ る。
その具体的な例としては、検体にコレステロールデヒドロゲナーゼと補酵素（N A D ) を混和し、 ついでコレステロールエステラーゼ、 コレステロールォキシダ 0 ーゼなどを含有するコレステロール測定試薬を添加する方法、 検体にコレステロ 一ルデヒドロゲナーゼと N A Dを混和し、 ついでコレステロールエステラーゼな どを含有するコレステロール測定試薬を添加する方法、 検体とコレステロールォ キシダーゼをパー才キシダーゼ、 4一ァミノアンチピリンあるいはカタラーゼな どと共に混合したのちコレステロールエステラーゼなどを含有するコレステロ一 5 ル測定試薬を添加する方法、 検体とコレステロールォキシダーゼをバーオキシダ ーゼ、 4ーァミノアンチピリンなどと共に混合したのちコレステロールエステラ ーゼ、 コレステロールデヒドロゲナーゼ、 N A Dなどを含有するコレステロール 測定試薬を添加する方法などを挙げることができるが、 これに限定されるもので はない。
0 特定のリポ蛋白画分中のコレステロールを測定する方法としては、 公知の酵素 的測定法のいずれも用いる事ができるが、 例えば酵素試薬としてコレステロール エステラーゼ及びコレステロール才キシダーゼを組み合わせて用いる方法、 コレ ステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを組み合わせて用 いる方法等が挙げられる。
5 本発明においては、 前処理反応である第一反応に使用される酵素と、 定量方法 である第二反応のコレステロール測定に使用される酵素は、 同一でもまた異なつ ていても差し支えない。 また第一反応において、 過剰量の酵素を使用しこれを第 二反応に使用しても差し支えない。 要は、 リポ蛋白表面に存在する少量の遊離型 コレステロールを消費し （第一反応 前処理反応）、 次いで測定すべき特定のリ
ポ蛋白のみに酵素が作用する状態として当該リポ蛋白を構成する大部分のコレス テロール （遊離型コレステロール +エステル型コレステロール） を定量できるよ うにすればよいのである。
また、 これらのコレステロール測定用酵素試薬を添加した後、 最終的にコレス
5 テロールを検出する方法は特に制限されず、例えばパー才キシダーゼと色原体や、 ジァホラーゼあるいは電子受容体と還元系発色試薬をさらに組み合わせて行う吸 光度分析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法なども利用することができる。 補酵素は補酵素サイクリング系により増幅しても良い。
本発明方法を容易に実施するためには、 これに適した特定のリポ蛋白中のコレ 0 ステロールを測定するための定量用キットを用いることが好ましい。
このようなキットは、 上での説明に基づき容易に設計することができるが、 そ の例を、 遊離型コレステロールを基質とする酵素の代表としてコレステロール才 キシダーゼを用いる場合と、 コレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合に分 けて示せば次の通りである。
5 [コレステロール才キシダーゼの場合のキット]
(ィ） 次の試薬 （1 ) および （2 )
( 1 ) コレステロール才キシダーゼおよび過酸化水素消費物質 （場合によって 更に反応促進物質） を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ 0 び発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(口） 次の試薬 （1 ) および （2 )
( 1 ) コレステロール才キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼおよび過酸 化水素消費物質 （場合によって更に反応促進物質） を含む第 1試薬、 5 ( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質および発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(ハ） 次の試薬 （1 )、 （2 ) および （3 )
( 1 ) コレステロールォキシダーゼおよび過酸化水素消費物質 （場合によって 更に反応促進物質） を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
( 3 ) コレステロールエステラーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
上記キッ卜において、 過酸化水素消費物質とは、 コレステロールォキシダーゼ 5 とコレステロールの反応により生じる過酸化水素を消費し、 消失させる物質をい い、 その例としては、 カタラーゼ、 4—ァミノアンチピリン等のカップラー、 卜 リンダ一試薬等の水素供与体を含む酸化還元系発色試薬などが挙げられる。 このうち、 4ーァミノアンチピリン等のカップラーおよびトリンダー試薬等の 水素供与体はこれらを組み合わせ、 過酸化水素と反応させることにより発色する 0 ものであり、 上記の （2 ) または （3 ) の発色剤として用いられるものである。
しかし、 本発明の前処理工程で用いる試薬 （1 ) としては、 カップラーまたは水 素供与体の一方のみを用い、 非発色反応で過酸化水素を消費させることが好まし い。もちろん、発色反応させ、測定値の方で調整することも可能である（試薬（ 1 ) での発色値を、 試薬 （2 ) または試薬 （3 ) の発色値から差し引くことにより調 5 整できる）。
[コレステロールデヒドロゲナーゼの場合のキッ卜]
(二） 次の試薬 （1 ) および （2 )
( 1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素 （場合によって更に反応 促進物質） を含む第 1試薬、
0 ( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(ホ） 次の試薬 （1 ) および （2 )
( 1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素 （場合によって更に反応 5 促進物質） を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロール才キシダーゼ、 コ レステロールエステラーゼ、 パー才キシダーゼおよび発色剤を含む第 2 試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(へ） 次の試薬 （1 ) および （2)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素およびコレステロールエステ ラーゼ （場合によって更に反応促進物質） を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬
5 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(卜） 次の試薬 （1 ) および （2)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素およびコレステロールエステ ラーゼ （場合によって更に反応促進物質） を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロール才キシダーゼ、 パ 0 一才キシダーゼおよび発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(チ） 次の試薬 （1 )、 (2) および （3)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素 （場合によって更に反応 促進物質） を含む第 1試薬、
5 (2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロールエステラーゼを含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
(リ） 次の試薬 （1 )、 (2) および （3)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素 （場合によって更に反応 0 促進物質） を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロール才キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼ、 パ一才キ シダーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
5 (ヌ） 次の試薬 （1 ) および （2)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素および補酵素反応生成物消費 物質 （場合によって更に反応促進物質） を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
(ル） 次の試薬 （1 ) および （2)
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素および補酵素反応生成物消費 物質 （場合によって更に反応促進物質） を含む第 1試薬、 5 (2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ び発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
上記のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いるキッ卜において、 補酵素反応 生成物消費物質とは、 コレステロール、 コレステロールデヒドロゲナーゼおよび 0 補酵素 （例えば NAD) の反応により生じる還元型補酵素 （例えば NAD H) を 再び元の補酵素に戻す物質をいい、 その例としては、 乳酸脱水素酵素とピルビン 酸 （基質） の例が挙げられる。 上記のキットでは、 いずれも試薬 （1 ) の添加に より補酵素の反応生成物が生じるが、 このうち、 （二)、 （へ）、 （チ） および（ヌ） において、 反応生成物を消費せずに、 そのまま、 測定段階において試薬 （1 ) 添 5 加による発色と同じ波長の光を測定する場合には、 試薬 （2) または試薬 （3) による発色値から、 試薬 （1 ) を添加した前処理の段階での発色値を差し引くこ とにより、 特定のリポ蛋白中のコレステロールを定量することができる。 また試 薬 （1 ) に、 予め反応生成物を消費する物質を添加しておき、 これを消費してか ら試薬（2) または試薬（3) を添加して発色させてもよい。 この際、 試薬（2) 0 または試薬 （3) には、 反応生成物を消費する物質の作用を減じる物質を配合し た方がよい。 一方、 キット （木）、 （卜）、 （リ） および （ル） では、 前処理の発 色とは別の波長の発色を測定することになるので、 必ずしも測定値から前処理の 発色値を差し引かなくてもよい。
なお、 前述したフルフエナム酸、 メフエナム酸、 2， 2' ， 6 ' ， 2"—テルピリ 5 ジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシン、 メビノリン 等の反応促進物質の用途は、 本発明の前処理方法 （剤） およびこれを利用する本 発明の特定のリポ蛋白中のコレステロールの定量方法 （キット） に限定されるも のではない。
遊離型コレステロールを基質とする酵素を使用するコレステロールの定量方
法、 例えば、 コレステロール才キシダーゼ、 バーオキシダーゼ、 発色剤等を使用 して組み立てられる遊離型コレステロールの定量方法あるいはコレステロール才 キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼ、 パー才キシダーゼ、 発色剤等を使用 して組み立てられる総コレステロールの定量方法にフルフエナム酸等の反応促進 5 物質を共存させれば、 遊離型コレステロールを基質とする酵素 （ここではコレス テロール才キシダーゼ） の使用量を低減すること、 酵素反応の反応時間の短縮等 の効果を得ることが当然に可能である。
そして、 コレステロール定量方法に関する本明細書等の記載 （例えば、 界面活 性剤を選択して特定のリポ蛋白を測定対象にすること等） を参照すれば、 より具 0 体的に所望の定量方法を組み立てられる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 遠心分離などの機械的前処理はもちろん、 ポリア二オン等を 用いることなく、 簡便な操作で効率良く特定画分中のコレステロールを定垦する 5 ことが可能となる。 そして、 ポリア二オン等での沈殿を生じることがないので、 測定装置 （特にセル） 等が汚れることがなく、 また、 測定値のばらつきも生じな いないので、 従来のコレステロール測定方法に比べ優れたものである。
また、 後記実施例に示すように、 中性脂肪レベルが高い検体についても従来の 沈殿法と相関の高い測定値が得られるものであり、 試料を選ばない点でも優れた 0 ものである。
更に、 反応促進剤を使用した場合は、 前処理での遊離型コレステロールを基質 とする酵素の使用釁を少なくすることが可能となる。
このように、 本発明方法は少ない試料で、 簡便な操作により、 広い範囲の試料 について正確で、 かつ特異的な測定が可能であるため、 種々の自動分析装置に適 5 用でき、 臨床検査の領域に置いても極めて有用である。 実 施 例
次に、 実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、 本発明はこれらに何ら制約 されるものではない。
実施例 1
下記に示す本発明法および沈殿法により、 リポ蛋白を含む 30例の血清検体に ついて、 下記のように H D L中のコレステロールを定量し、 これらの測定値を比 5 較した。
( 本発 明 法 ）
検体 3 μ I に、 0. 1単位 Zm Iのコレステロールデヒドロゲナ一ゼ （天野製 薬製）、 2.5 mMの N A Dおよび 4—ァミノアンチピリン 0.03 %を含む 1 0 mMのりん酸緩衝液 （第 1試薬； p H 8.5) 300 1を添加した （前処理）。
0 約 5分後、 ェマルゲン B— 66 1 %. コレステロールエステラーゼ （旭化成）
1.3単位 Zm I、 コレステロール才キシダーゼ （旭化成） 2単位/ m I、 パー ォキシダーゼ （東洋紡） 5単位 I及びジスルホブチルメタ卜ルイジン 0.0 4%を含む 1 00|711^1の1^£ 5緩衝液 （p H 6) からなるコレステロール測定試 薬 （第 2試薬） 1 00 /^ 1を加えた。
5 第 2試薬添加直前と添加後 5分後の 600 nmにおける吸光度を測定し、 その 差より血清検体中の H DLコレステロール濃度を求めた（2ポイン卜法)。 また、 較正用物質として濃度既知のコントロール血清を用いた。 なお、 以上の操作は、 日立 7 1 50型自動分析装置を用いて行った。
( 沈殿法 ）
0 HDLC 2 「第一」 分画試薬 （第一化学薬品株式会社製） 200 t Iを検体 2
00 μ Iと混和し、 3000 r pmで 1 0分間遠心分離を行った。 この上清 50 H Iを採取し、 T r i t o n X— 1 00 Ί %、 コレステロールエステラーゼ 1 単位 Zm I、 コレステロール才キシダーゼ 1単位/ m I、 パー才キシダーゼ 5単 位 m I及びジスルホブチルメタ卜ルイジン 0.04 %、 4—ァミノアンチピリ 5 ン 0.04 %を含む 1 00 mMの M E S緩衝液 （ p H 6.5) からなるコレステロ ール測定試薬 3 m I と混合し、 37 で 1 0分間ィンキュベー卜した後、 600 nmにおける吸光度を測定し、 H D L中のコレステロール濃度を求めた。
( 結 果 ）
結果を表 1および図 1に示す。
表 1
この結果よリ明らかなごとく、 本発明方法はポリァニオン等を使用しないにも かかわらず、 従来の沈澱法と極めて良好な相関を示していた。 実施例 2
実施例 1の第 1試薬のコレステロールデヒドロゲナーゼ、 NADおよびりん酸 緩衝液を 5単位 Zm Iのコレステロール才キシダーゼ （東洋紡）、 5単位 Zm I のパ一才キシダーゼ （東洋紡製） および 1 O OmM M E S (p H 6) に代え、 測定値を比較した。
( 結 果 ）
結果を表 2および図 2に示す。
表 2
5
0
5 この結果より明らかなごとく、 本発明方法はポリア二オン等を使用しないにも かかわらず、 従来の沈澱法と極めて良好な相関を示していた。 0 実施例 3
実施例 1及び実施例 2の試薬を用い、 中性脂肪レベルの異なる血清 5検体を測 定し、 従来法と測定値を比較した。 この結果を表 3に示す。
5
表 3
5
0 表 3に示すように、 本発明によれば中性脂肪レベルが高い検体についても従来 法と同レベルの測定値が得られた。 実施例 4
実施例 2の第一試薬における 5単位 Zm Iのコレステロールォキシダーゼを、 5 下記表 4の濃度、 組合せになる組成に変えて、 実施例 1 と同様の測定を行い、 そ の測定値を沈殿法および実施例 2の方法 （基準試験系） と比較した。 なお第二試 薬は実施例 1 と同一のものを使用した。 この結果を表 5に示す。
( 試験用試薬組成 ） 0
5
表 4 試験系 組 成 内 容
5 基 準 コレステロ一ル才キシダーゼ
(5単位 1 )
A コレステロ一ル才キシダーゼ
( 1単位 Zm 1 )
B フルフエナム酸 + コレステロール才キシダー -ゼ 0
(0. 1 5 m M) ( 1単位 Zm 1 )
C メフエナ厶酸 + コレステロール才キシダー -ゼ
( 0. 1 mM) ( 1単位 1 )
D 2， 2 ' , 6 '， 2"—テル + コレステロール才キシダー 'ゼ ピリジン （ 0. 5 m M ) ( 1単位 Zm 1 ) 5
E チグリン酸 + コレステロール才キシダー 'ゼ
( 5 0 mM) ( 1単位 Zm 1 )
F フシジン酸 + コレステロール才キシダーゼ
( 0. 1 m M) ( 1単位 Zm 1 )
G 酢酸ベータメタゾン + コレステロール才キシダーゼ 0
(0. 2 mM) ( 1単位 Zm I )
H モネンシン + コレステロール才キシダーゼ
( 0. 2 mM) ( 1単位 I )
1 メピノリン + コレステロール才キシダーゼ
(0. 0 5 mM) ( 1単位 1 ) 5
( 結 果 ）
OAV66io ioodT, ,3d98f -
LO
o LO o
CM CM
この結果より、 基準試験系 （実施例 2) に比べコレステロール才キシダーゼを 1 /5に減らした場合 （試験系 A)、 相関係数は若干低くなリ、 切片の値も若干 増加したが、 反応促進物質を使用した場合は、 コレステロール才キシダーゼが 1 5であっても基準試験系とほぼ同様な結果が得られ、 反応促進物質を用いるこ
5 とによりコレステロールォキシダーゼの使用量を減らすことができることが明ら かとなつた。 実施例 5
1.25単位 171 1 パー才キシダーゼ （東洋紡）、 0.0 1 % 4一アミノアン 0 チピリン、 0.02% ジスルホブチルメタ卜ルイジン、 50mM N a C Iを共 通して含み、 緩衝液の種類と p H、 コレステロール才キシダーゼ （東洋紡） およ びフルフエナム酸 （シグマ） の濃度の異なる下記表 6に記載の試薬 （J〜し） を 調製した。 5
0
5
表 6
血清検体 3 At Iに、 試薬」〜 Lを 3 0 0 At I添加し、 3 7 °Cで 5分間反応させ た後、 6 0 0 n mにおける吸光度を測定した。 以上の操作は、 日立 7 1 5 0型自 動分析機を用いて行った。
4例の血清検体を試薬 J〜 Lで測定した。
5 試薬」〜 Lそれぞれについて、 5 . 0単位 Zm I コレステロール才キシダーゼ、 O m M フルフエナム酸の試薬で得られた吸光度を 1 0 0として、 各コレステロ ール才キシダーゼ、 フルフエナム酸濃度の試薬毎に相対吸光度を計算した。
( 結 果 ）
4検体の相対吸光度を平均した結果を図 3に示す。 なお、 図中でコレステロ一
ルォキシダ一ゼは C O Dと表記した。
この結果、 いずれの p Hにおいても、 フルフエナム酸の濃度依存的に相対吸光 度が増加した。 反応促進物質の使用により、 コレステロール才キシダーゼの使用 量を減らすことができることが確認された。
5 また、 反応促進物質が、 遊離型コレステロールを基質とする酵素を使用する遊 離型コレステロールの測定法あるいは総コレステロールの測定法にも使用できる ことが明らかとなった。
0
5
0
5
Claims
1 . 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測定するに先立ち、 リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素を作用させること 5 を特徴とするコレステロール定量用試料の前処理方法。
2 . 試料中の特定のリポ蛋白中に存在するコレステロールを測定するに先立ち、 リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素並びにフルフエナ 厶酸、 メフエナム酸、 2， 2 '， 6 ' , 2 "—テルピリジン、チグリン酸、 フシジン酸、 0 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質を 作用させることを特徴とするコレステロール定量用試料の前処理方法。
3 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素が、 コレステロール才キシダーゼ またはコレステロールデヒドロゲナーゼである請求項第 1項または第 2項記載の 5 前処理方法。
4 . リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素を作用させ た後、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用して特定のリポ蛋白中に存在す るコレステロールを測定することを特徴とする特定のリポ蛋白中のコレステロ一 0 ル定量法。
5 . リポ蛋白を含む試料に遊離型コレステロールを基質とする酵素並びにフル フエナム酸、 メフエナム酸、 2， 2 '， 6 ' , 2 "—テルピリジン、 チグリン酸、 フシ ジン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促 5 進物質を作用させた後、 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を利用して特定のリ ポ蛋白中に存在するコレステロールを測定することを特徴とする特定のリポ蛋白 中のコレステロール定量法。
6 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素が、 コレステロール才キシダーゼ
および またはコレステロールデヒドロゲナーゼである請求項第 4項または第 5 項記載の定量法。
7 . 特定のリポ蛋白が高比重リポ蛋白である請求項第 4項ないし第 6項の何れ 5 かの項記載の定量法。
8 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素を含み、 リポ蛋白に作用する物質 を実質的に含まないコレステロール測定用試料の前処理剤。 0
9 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素と、 フルフエナム酸、 メフエナム 酸、 2， 2 '， 6 '， 2 "—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータメタ ゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質とを含み、 リポ蛋 白に作用する物質を実質的に含まないコレステロール測定用試料の前処理剤。 5
1 0 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素を含み、 コレステロールエステ ラーゼを実質的に含まないコレステロール測定用試料の前処理剤。
1 1 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素と、 フルフエナム酸、 メフェナ 厶酸、 2， 2 '， 6 '， 2 "—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸べ一タメ 0 タゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質とを含み、 コレ ステロールエステラーゼを実質的に含まないコレステロール測定用試料の前処理 剤。
1 2 . 遊離型コレステロールを基質とする酵素がコレステロールデヒドロナゲ 5 ーゼまたはコレステロール才キシダーゼである請求項第 8項ないし第 1 0項の何 れかの項記載のコレステロール測定用試料の前処理剤。
1 3 . 次の試薬、
( 1 )コレステロール才キシダーゼおよび過酸化水素消費物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ び発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
5 1 4. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
0
1 5. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロール才キシダーゼ、 コ レステロールエステラーゼ、 パーォキシダーゼおよび発色剤を含む第 2 5 試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
1 6. 次の試薬、
( 1 ) コレステロール才キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼおよび過酸 0 化水素消費物質を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質および発色剤を含む第 2試薬 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
1 7. 次の試薬、
5 (1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素およびコレステロールエステ ラーゼを含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
1 8. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素およびコレステロールエステ ラーゼを含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロール才キシダーゼ、 パ 5 一才キシダーゼおよび発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
1 9. 次の試薬、
( 1 )コレステロール才キシダーゼおよび過酸化水素消費物質を含む第 1試薬、0 (2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
( 3 ) コレステロールエステラーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
20. 次の試薬、
5 (1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロールエステラーゼを含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。 0
2 1. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼおよび補酵素を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロール才キシダーゼ、 コレステロールエステラーゼ、 パー才キ シダーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
5 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
22. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素および補酵素反応生成物消費 物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
5 23. 次の試薬、
(1 ) コレステロールデヒドロゲナーゼ、 補酵素および補酵素反応生成物消費 物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ び発色剤を含む第 2試薬
0 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
24. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールォキシダーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム酸、
2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータ 5 メタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質およ び (c)過酸化水素消費物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ び発色剤を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
0
25. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム 酸、 2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸べ 一夕メタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質 5 および (c)補酵素を含む第 1試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
26. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロール才キシダーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム酸、
2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータ メタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質、 （c 5 )コレステロールエステラーゼおよび (d)過酸化水素消費物質を含む第 1
試薬、
( 2 ) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質および発色剤を含む第 2試薬 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。 0
27. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)補酵素、 （c)フルフエナム酸 、 メフエナム酸、 2, 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジ ン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる 反応促進物質および（ コレステロールエステラーゼを含む第 1試薬、5 (2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬
よリなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
28. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)補酵素、 （c)フルフエナム酸 0 、 メフエナム酸、 2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジ ン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる 反応促進物質および (d)コレステロールエステラーゼを含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロール才キシダーゼ、 ノヽ ° 一才キシダーゼおよび発色剤を含む第 2試薬
5 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キット。
29. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールォキシダーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム酸、
2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータ
メタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質およ び (c)過酸化水素消費物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
( 3 ) コレステロールエステラーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
5 よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
30. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム 酸、 2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸べ 0 一夕メタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質 および (c)補酵素を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロールエステラーゼを含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
5
3 1. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)フルフエナム酸、 メフエナム 酸、 2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸べ 一夕メタゾン、 モネンシンおよびメピノリンから選ばれる反応促進物質 0 および (c)補酵素を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質を含む第 2試薬、
(3) コレステロールォキシダーゼ、 コレステロールエステラーゼ、 パーォキ シダーゼおよび発色剤を含む第 3試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
5
32. 次の試薬、
(1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)補酵素、 （c)フルフエナム酸 、 メフエナム酸、 2， 2'， 6'， 2" _テルピリジン、 チグリン酸、 フシジ ン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる
反応促進物質および（d)補酵素反応生成物消費物質を含む第 1試薬、 (2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質およびコレステロールエステラーゼ を含む第 2試薬
よりなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定量用キッ卜。
33. 次の試薬、
( 1 ) (a)コレステロールデヒドロゲナーゼ、 （b)補酵素、 （c)フルフエナム酸 、 メフエナム酸、 2， 2'， 6'， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジ ン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる 0 反応促進物質および (d)補酵素反応生成物消費物質を含む第 1試薬、
(2) 特定のリポ蛋白のみに作用する物質、 コレステロールエステラーゼおよ び発色剤を含む第 2試薬
よリなる特定のリポ蛋白中のコレステロール定置用キッ卜。 5
34. フルフエナム酸、 メフエナム酸、 2， 2 ' ， 6， ， 2"—テルピリジン、 チ グリン酸、 フシジン酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから 選ばれる遊離型コレステロールを基質とする酵素の反応促進物質。
35. 遊離型コレステロールを基質とする酵素が、 コレステロールォキシダー 0 ゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼである請求項第 34項記載の反応促進 物質。
36. 遊離型コレステロールを基質とする酵素並びにフルフエナム酸、 メフエ ナム酸、 2， 2 ' ， 6 ' ，2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン酸、 酢酸べ一 5 タメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物質を作用させ ることを特徴とする遊離型コレステロールの定量法。
37. 少なくとも、 遊離型コレステロールを基質とする酵素並びにフルフエナ 厶酸、 メフエナム酸、 2， 2 ' ，6 ' ， 2"—テルピリジン、 チグリン酸、 フシジン
酸、 酢酸ベータメタゾン、 モネンシンおよびメビノリンから選ばれる反応促進物 質を作用させることを特徴とする総コレステロールの定量法。
5
0
5
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