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WO2000078970A1 - Acides nucleiques et proteines correspondant au gene abc1 humain - Google Patents

Acides nucleiques et proteines correspondant au gene abc1 humain Download PDF

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WO2000078970A1
WO2000078970A1 PCT/FR2000/001595 FR0001595W WO0078970A1 WO 2000078970 A1 WO2000078970 A1 WO 2000078970A1 FR 0001595 W FR0001595 W FR 0001595W WO 0078970 A1 WO0078970 A1 WO 0078970A1
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WO
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nucleic acid
abc1
nucleotide
sequence
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/001595
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English (en)
Inventor
Patrice Denefle
Marie-Françoise Rosier-Montus
Isabelle Arnould-Reguigne
Catherine Prades
Laurent Naudin
Cendrine Lemoine
Nicolas Duverger
Gerd Assmann
Stephan Rust
Harald Funke
H. Bryan Brewer
Original Assignee
Aventis Pharma S.A.
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Priority to BR0011724-2A priority patent/BR0011724A/pt
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids corresponding to the various exons and introns of the ABC1 gene, which it is currently demonstrated to be a causative gene for pathologies linked to a dysfunction of the cholesterol metabolism inducing diseases such as atherosclerosis, more particularly disruption of the reverse transport of cholesterol, and more particularly family deficiencies in HDL (FHD), such as Tangier's disease.
  • the invention also relates to means for detecting polymorphisms in general, and mutations in particular, in the ABC1 gene or in the corresponding protein produced by the allelic form of the ABCL gene.
  • the invention also provides pharmaceutical compositions comprising a nucleic acid containing the coding region of the ABC1 gene and pharmaceutical compositions containing the ABC1 protein intended for the treatment of diseases linked to a deficit in the reverse transport of cholesterol, such as Tangier's disease.
  • the invention also provides methods for screening small molecules acting on the protein ABC1 which can by themselves constitute products acting on the reverse transport of cholesterol and as such, can make it possible to fight effectively against atherosclerosis from the therapeutic point of view.
  • High density lipoproteins are one of the four major classes of lipoproteins that circulate in the blood plasma.
  • lipoproteins are involved in different metabolic pathways such as lipid transport, bile acid formation, steroidogenesis, cell proliferation and in addition interfere with plasma proteinase systems.
  • HDL are perfect acceptors of free cholesterol and, in combination with cholesterol ester transfer proteins (CETP), lipoprotein lipase (LPL), hepatic lipase (HL) and lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT), play a major role in the reverse transport of cholesterol, i.e. the transport of excess cholesterol in peripheral cells to the liver for its elimination from the body in the form of bile acid.
  • HDL has been shown to play a central role in the transport of cholesterol from peripheral tissues to the liver.
  • Various diseases related to HDL deficiency have been described, including Tangier's disease, HDL deficiency and LCAT deficiency.
  • LPL lipoprotein lipase
  • LCAT acyltransferase
  • dysfunctions in the reverse transport of cholesterol could be induced by physiological deficits affecting one or more of the stages of transport of stored cholesterol, from the intracellular vesicles to the membrane surface at which it is taken up by the HDL.
  • the linkage study focused on a well-characterized family over eleven generations, many of whose members are affected by Tangier's disease, the family comprising five lines of inbreeding. This study made it possible to identify a region located in the locus
  • a region of approximately 1cM located in locus 9q31 in humans is generally associated with familial HDL deficiencies. More specifically, it has been shown that a gene coding for a protein of the ABC transporter family, located precisely in the 1 cM region of locus 9q31, was implicated in pathologies linked to a deficit in the reverse transport of cholesterol. More particularly, it has been shown according to the invention that the gene coding for the transporter ABC-1 was mutated in patients affected in the reverse transport of cholesterol, and very particularly in patients suffering from Tangier disease.
  • the transporter proteins ABC ("ATP-binding cassette") constitute a family of proteins which are extremely conserved during evolution, from bacteria to humans.
  • ABC transport proteins are involved in the membrane transport of various substrates, for example ions, amino acids, peptides, sugars, vitamins or even steroid hormones.
  • ABC transporter proteins which have been identified in humans have been associated with various diseases.
  • cystic fibrosis is caused by mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene.
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
  • certain phenotypes of multiple drug resistance in tumor cells have been associated with mutations in the gene encoding the MDR protein (multi-drug resistance), which also has an ABC transporter structure.
  • PFIC2 Another ABC carrier, designated PFIC2, seems to be involved in a form of familial intrahepatic cholestasis. progressive, this protein being potentially responsible, in humans, for the export of bile salts.
  • ABC1 a cDNA encoding a new mouse transporter ABC was identified and designated ABC1 (Luciani et al., 1994). This protein is characteristic of ABC transporters in that it has a symmetrical structure comprising two transmembrane domains linked to a highly hydrophobic segment and to two NBF motifs.
  • the gene encoding human ABC1 protein has also been shown to be expressed in various tissues, most notably at elevated levels in the placenta, liver, lung, adrenal glands and fetal tissue. These authors also showed that the expression of the gene coding for the human protein ABC1 was induced during the differentiation of monocytes into macrophages in vitro. In addition, the expression of the gene coding for the ABC1 protein is increased when human macrophages are incubated in the presence of acetylated low density lipoproteins (AcLDLs).
  • AcLDLs acetylated low density lipoproteins
  • Such alleles are moreover capable of containing substitutions, additions or deletions of nucleotides in non-coding regions located respectively on the 5 'side of the first exon or on the 3' side of the last exon of the gene, in particular in regulatory regions, for example in promoter sequences or in activator sequences (in English " enhancer "), such as to induce defects - increase or decrease - in the synthesis of the ABC1 polypeptide.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located). For example, a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated. The same polynucleotide separated from adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be “isolated”.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and remain nevertheless in the isolated state of the fact that the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide is in the "purified" state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA sequences or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single chain form or in duplex form.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1) an analogue of a purine, (2) an analogue of 'a pyrimidine, or (3) a similar sugar, examples of such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04 064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.
  • variant of a nucleic acid is meant a nucleic acid which differs by one or more bases with respect to the reference polynucleotide.
  • a variant nucleic acid may be of natural origin, such as an allelic variant found naturally, or may also be an unnatural variant obtained for example by mutagenesis techniques. In general, the differences between the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are reduced so that the nucleotide sequences of the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are very close and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not alter the amino acid sequences encoded by said variant nucleic acid.
  • nucleotide changes in a variant nucleic acid can also result in substitutions, additions, deletions in the polypeptide encoded by the variant nucleic acid compared to the peptides encoded by the reference nucleic acid.
  • modifications of nucleotides in the coding regions can produce substitutions, conservative or non-conservative in the amino acid sequence.
  • the variant nucleic acids according to the invention code for polypeptides which retain substantially the same biological function or activity as the polypeptide of the reference nucleic acid or the ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides coded by the initial nucleic acid.
  • fragment will be understood to mean a reference nucleic acid according to the invention, a nucleotide sequence of reduced length compared to the reference nucleic acid and comprising, on the common part, a nucleotide sequence identical to the nucleic acid of reference.
  • Such a “fragment” of nucleic acid according to the invention may, where appropriate, be included in a larger polynucleotide of which it is constitutive. Such fragments include, or alternatively consist of oligonucleotides of length ranging from 8, 10, 12, 15, 18, 20 to 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 or 1500 nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
  • variant of a polypeptide according to the invention, is mainly meant a polypeptide whose amino acid sequence contains one or more substitutions, additions or deletions of at least one amino acid residue, relative to the sequence amino acids of the reference polypeptide, it being understood that the amino acid substitutions can be either conservative or non-conservative.
  • fragment of a polypeptide according to the invention, is meant a polypeptide whose amino acid sequence is shorter than that of the reference polypeptide and which comprises over the entire part common with these reference polypeptides, a sequence in identical amino acids.
  • Such fragments may, if appropriate, be included within a larger polypeptide of which they are part.
  • Such fragments of a polypeptide according to the invention can have a length of 10, 15, 20, 30 to 40, 50, 100, 200 or 300 amino acids.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences, within the meaning of the present invention, can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE,
  • GENETICS COMPUTER GROUP GCG
  • GCG 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity may be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), using only the default parameters (S. F AltschuI et al, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F AltschuI et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402).
  • the query sequence and the databases used can be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under high stringency conditions, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. .
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or also in the work of F. AUSUBEL et al (1999). NUCLEIC ACIDS OF GENE ABC1 GENOMIC SEQUENCES
  • the human ABC1 gene would comprise 48 exons and 47 introns, if one refers in particular to the structure of the ABC1 gene which is orthologous in mice.
  • genomic nucleotide sequences of the ABC1 gene have been isolated and characterized according to the invention, these genomic sequences comprising both exonic sequences and new intronic sequences, which can be used in particular for the production of various means of detection of the ABC1 gene. or its nucleotide expression products in a sample. These partial genomic sequences are shown in Table 1 below.
  • a first subject of the invention consists of a nucleic acid comprising at least 245 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO 1 -14, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80%, advantageously 90%, preferably 95% and very preferably 98% of nucleotide identity with a nucleic acid comprising at least 245 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 1 -14, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 15-47, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 15-47, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • thirty-five introns of the ABC1 gene have been isolated and characterized, at least partially.
  • the nucleotide sequences of the ABC1 gene introns, as well as their fragments and their variants, can also be used as nucleotide probes or primers to detect the presence of at least one copy of the ABC1 gene in a sample, or to amplify a determined target sequence. within the ABCL gene
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 8 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 48-89, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 48-89, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 48-89, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a potentially regulatory genomic nucleotide sequence located downstream of the 3 'end of the last exon of the ABC1 gene was isolated. It is the polynucleotide of sequence SEQ ID NO 90.
  • the characterization of polymorphisms in this potentially regulatory sequence would be likely to allow the achievement of appropriate detection means, probes or primers, specific to some of these polymorphisms capable of inducing defects in the regulation of l of the ABC1 gene.
  • Such biologically active fragments of the sequence SEQ ID NO 90 can in particular be cloned into vectors for selection of suitable regulatory sequences, such as one vectors pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, p ⁇ gal-Basic, p ⁇ gal-Enhancer, or even pEGFP-1, sold by the company Clontech.
  • suitable regulatory sequences such as one vectors pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, p ⁇ gal-Basic, p ⁇ gal-Enhancer, or even pEGFP-1, sold by the company Clontech.
  • the invention further relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a polynucleotide selected from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 90, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 90, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a partial sequence of the cDNA corresponding to the expression of the ABC1 gene has been identified by Langman et al. (1999).
  • This partial sequence of the ABCI cDNA comprises 6880 nucleotides and contains the entire open reading phase corresponding to the ABC1 protein produced in subjects not affected by disorders linked to the reverse transport of cholesterol.
  • the cDNA sequence described by Langmann et al. (1999) also contains part of the 5'-UTR region (nucleotides 1 to 120) and part of the 3'-UTR region (nucleotides 6727 to 6880).
  • the analyzes of expression of the transcript of sequence SEQ ID No. 91 were carried out by RT-PCR, as described in Example 1. These analyzes carried out using polyA + RNA from different tissues made it possible to show that the ABC1 gene was expressed in the fetal brain, brain, heart, placenta and uterus.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide of sequence SEQ ID NO 91 of the cDNA of the human ABC1 gene, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the cDNA of the human ABC1 gene of sequence SEQ ID NO 91 comprises an open reading phase going from the nucleotide at position 121 (base A of the translation initiation codon ATG) to the nucleotide at position 6723 of the sequence SEQ ID NO 91 A polyadenylation signal (of sequence ATTAAA) is present, starting at the nucleotide at position 9454 of the sequence SEQ ID NO 91.
  • the cDNA of sequence SEQ ID NO 91 codes for the polypeptide ABC1 with a length of 2201 amino acids, and having the amino acid sequence SEQ ID NO 139.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least eight consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID NO 92, a biologically active fragment thereof or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a polynucleotide of sequence SEQ ID NO 92, a biologically active fragment thereof or a nucleic acid of complementary sequence.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with a polynucleotide of sequence SEQ ID NO 92, a biologically active fragment thereof or a nucleic acid of complementary sequence.
  • This mutation consists both of a deletion of a segment of 14 nucleotides ("TGAGAGGAAGTTCT") located from the nucleotide at position 472 to the nucleotide at position 485 of the normal genomic DNA of sequence SEQ ID NO 2 and by an insertion of an Alu type sequence of 110 nucleotides within the sequence of exon12 of the ABCL gene upstream of the nucleotide at position 486 of the normal genomic DNA of sequence SEQ ID NO 2.
  • Exon 12 carrying this deletion / insertion mutation has the nucleotide sequence SEQ ID NO 93.
  • the mutated cDNA corresponding to the nucleotide sequence SEQ ID NO 94 codes for a mutated ABC1 polypeptide with a length of 2233 amino acids, of sequence SEQ ID NO 140, the structure of which is greatly altered compared to the normal polypeptide ABC1 of sequence SEQ iD NO 139.
  • nucleotide sequences SEQ ID NO 93 and 94 as well as the polypeptide sequence SEQ ID NO 140 also form part of the invention.
  • This mutation consists of a deletion of the nucleotide (G) in position
  • sequence of exon 13 of the ABC1 gene carrying this mutation is the polynucleotide of sequence SEQ ID NO 95.
  • the cDNA corresponding to this mutation in exon 13 of the ABC1 gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO 96.
  • the mutated protein encoded by the mutated ABC1 gene having a length of 574 amino acids, that is to say approximately a quarter of the amino acid length of the normal protein.
  • the truncated polypeptide has the amino acid sequence SEQ ID NO 141.
  • the structural characteristics making it possible to differentiate the normal sequences from the mutated sequences of ABCI can be used in order to provide means for detecting the mutated sequences of ABCI in a sample, in particular probes hybridizing specifically with the mutated ABCI sequences or alternatively primer pairs making it possible to selectively amplify the regions of the ABC1 gene carrying the mutations described above, the detection of the presence of these mutations can in particular be carried out by length discrimination amplified nucleic acid fragments, by hybridization of the amplified fragments using specific probes described above, or by direct sequencing of these amplified fragments.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least eight consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 93-96, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • such a nucleic acid comprises: a) either at least two consecutive nucleotides of the sequence Alu located in the sequences SEQ ID NO 93 and 94, preferably 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 or 100 consecutive nucleotides of the Alu sequence localized in the sequences SEQ ID NO 93 and 94; b) or at least the two "CT" nucleotides located on either side of the deleted base G, in the sequences SEQ ID NO 94 and 95.
  • primers which hybridize with a nucleic sequence localized in the region of an ABCI sequence.
  • the invention further relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a polynucleotide selected from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 93-96, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 93-96, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • polymorphisms are represented in the present description in the form of nucleotide sequences with a length of 41 bases, the polymorphic base being located in the center of the polymorphic fragment. For each of the polymorphisms identified, each allele is thus represented as a sequence of 41 bases, the polymorphism itself being defined by the two nucleotide sequences corresponding respectively to each of the forms.
  • the polymorphisms identified in the ABC1 gene are shown in Table IV below.
  • the detection of these polymorphisms within a DNA sample originating from a subject can for example be carried out by a specific amplification of the nucleotide region of ABCI containing the polymorphic base, then sequencing of the amplified fragment in order to determine the nature of the allele or alleles carried by said subject.
  • the detection of these polymorphisms within a DNA sample originating from a subject can also be carried out using probes or nucleotide primers hybridizing specifically with a determined allele containing one of the polymorphic bases of a polymorphism of the ABC1 gene according to the invention.
  • suitable nucleotide primers are, for example, primers whose base at the 3 ′ end hybridizes with the base located immediately on the 5 ′ side of the polymorphic base of the fragment comprising said polymorphism.
  • a homogeneous phase method based on FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • amplified fragments of genomic DNA containing polymorphisms are incubated with a fluorescein labeled primer at the 5 ′ end, in the presence of labeled dideoxynucleotides triphosphate and a modified Taq polymerase.
  • the labeled primer is extended by one base by incorporation of the allele-specific labeled dideoxynucleotide present on the complementary genomic DNA sequence.
  • the fluorescence intensities for the two marker compounds of the labeled dideoxynucleotides are analyzed directly without separation or purification. All of these steps can be carried out in the same tube and the modifications of the fluorescence signal followed in real time.
  • the elongated primer can be analyzed by mass spectrometry of the MALDI-TOF type. The base localized at the polymorphic site is identified by measuring the mass added to the microsequencing primer (Haff and Smirnov, 1997).
  • nucleotide primers can for example be immobilized on a support.
  • immobilize on a support for example in an orderly manner, multiple primers specific as described above, each of the primers being suitable for the detection of one of the polymorphisms of the ABC1 gene according to the invention.
  • the polymorphisms of the ABC1 gene according to the invention are useful in particular as genetic markers in studies of association between the presence of a given allele in a subject and the predisposition of this subject to a given pathology, particularly to one of the pathologies already associated with the chromosomal region 9q31 preferentially with a pathology linked to a dysfunction of the reverse transport of cholesterol.
  • phenotypes complex traits
  • the biallelic polymorphisms according to the invention are useful in any of the methods described in the prior art intended to demonstrate a statistically significant correlation between a genotype and a phenotype.
  • Biallelic polymorphisms can be used in linkage analysis ("linkage analysis”) and in allele sharing processes ("allele sharing”).
  • linkage analysis linkage analysis
  • allele sharing allele sharing processes
  • the biallelic polymorphisms according to the invention are used to identify genes associated with characters (phenotypes) detectable by using association studies, an approach which does not require recourse to families affected by the character, and which also allows the identification of genes associated with complex and sporadic characters.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences of the ABC1 gene comprising at least one biallelic polymorphism as described above.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least eight consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO 97-108 and comprising the polymorphic base, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • NUCLEOTIDE PROBES AND PRIMERS NUCLEOTIDE PROBES AND PRIMERS
  • nucleic acid fragments derived from any of the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 94-96 and 97-108 are useful for detecting the presence at least one copy of a nucleotide sequence of the ABC1 gene or of a fragment or a variant (containing a mutation or a polymorphism) of the latter in a sample.
  • the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 8 consecutive nucleotides of a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of 10, 12, 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides d a nucleic acid according to the invention, in particular a nucleic acid of nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108, or d 'a nucleic acid of complementary sequence.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucleotides consecutive of a nucleic acid according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the definition of a probe and of a nucleotide primer according to the invention therefore includes oligonucleotides which hybridize, under the conditions of high stringency hybridization defined above, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID NO 1 - 14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108 or with a sequence complementary to the latter. Examples of primers and primer pairs for amplifying different regions of the ABC1 gene are shown in Table V below.
  • probes and primers preferred according to the invention, these comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 109- 138, or nucleic acids of complementary sequence.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of Narang et al. (1979) or Brown et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of Beaucage et al. (1980) or the solid support technique described in EU Patent No. EP 0 707 592.
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a marker detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes (32P, 33P, 3H, 35S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the probes according to the invention may have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by Urdea et al. (1991) or in European patent n ° EP-0 225 807 (CHIRON).
  • oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations with genomic DNA or also in hybridizations with the corresponding messenger RNA when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • Such solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the wells of microtiter plates, polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles. Consequently, the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid as described above in a sample, said method comprising the steps of:
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable label.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which may be used to detect target sequences of interest or alternatively to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the nucleic acids according to the invention, more particularly nucleic acids of sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108 or the nucleic acids of complementary sequence.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips".
  • matrices such as "DNA chips”.
  • Such ordered matrices have been described in particular in US Pat. No. 5,143,854, in PCT applications No. WO 90/150 70 and 92/10092.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any of the nucleic acids according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48- 89, 90, 92, 93-96 and 97-108, or a variant thereof.
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92 , 93-96 and 97-
  • said method comprising the steps of: a) contacting the sample in which the presence of the target nucleic acid is suspected with a pair of nucleotide primers whose hybridization position is located respectively on the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid region whose amplification is sought, in the presence of the reagents necessary for the amplification reaction; and b) detection of the amplified nucleic acids.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 and 97-108
  • said kit or kit comprising: a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located on the 5 ′ side and of the 3 'side of the target nucleic acid whose amplification is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.
  • primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 109 and 110, making it possible to amplify the region of exon 12 of the ABC1 gene carrying the first mutation (deletion / insertion) described above, or nucleic acids of complementary sequence.
  • primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 111 and 112, making it possible to amplify the region of exon 13 of the ABC1 gene carrying the second mutation (deletion of a G base) described above, or nucleic acids of complementary sequence.
  • primers according to the invention generally comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID NO 109- 138, or nucleic acids of complementary sequence.
  • the invention also relates to nucleotide primers comprising at least 15 consecutive nucleotides of a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 97-108 or a nucleic acid of complementary sequence, the base of the 3 'end of these primers being complementary to the nucleotide located immediately on the 5' side of the polymorphic base of one of the sequences SEQ ID NO 97-108 or of their complementary sequences.
  • the invention also relates to nucleotide primers comprising at least 15 consecutive nucleotides of a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 97-108 or a nucleic acid of complementary sequence, the base of the 3 'end of these primers being complementary to a nucleotide located at 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more nucleotides on the 5 'side of the polymorphic base of one of the sequences SEQ ID NO 97-108 or their complementary sequences.
  • primers whose nucleotide at the 3 'end is complementary to a nucleotide located more than 20 nucleotides on the 5' side of the polymorphic base of one of the sequences SEQ ID NO 97-108, the man of the profession will advantageously refer to the corresponding genomic sequence among the sequences SEQ ID NO 1 -14 or also SEQ ID NO 15-47 and 48-90, comprising the polymorphism whose nature of the allele is sought.
  • Such primers are particularly useful in the context of methods for genotyping subjects and / or genotyping populations, in particular in the context of studies of association between allelic forms.
  • particular or forms of particular allele groups (haplotypes) in subjects and the existence of a particular phenotype (character) in these subjects for example the predisposition of these subjects to develop diseases linked to a deficit in transport reverse cholesterol, or the predisposition of these subjects to develop a pathology whose candidate chromosomal region is located on chromosome 9, more * precisely on the arm 9q and more precisely still in the locus 9q31.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention.
  • such a recombinant vector will comprise a nucleic acid chosen from the following nucleic acids: a) a nucleic acid of sequence SEQ ID NO 92 or a biologically active fragment of the latter; b) a nucleic acid comprising a polynucleotide of sequence SEQ ID NO 91, 94 or 96; c) a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO 15-47 and 48-90 d) a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid chosen from the group consisting sequences SEQ ID N015-47 and 48-90 or a fragment or a variant thereof; d) a nucleic acid hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 15-47 and 48-90, or a fragment or a variant of the latter.
  • vector within the meaning of the present invention is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • a recombinant vector according to the invention is used in order to amplify the nucleic acid which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host.
  • they are expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid in accordance with the invention, regulatory sequences for directing transcription and / or translation.
  • a recombinant vector according to the invention will comprise in particular the following elements: (1) elements for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted, such as promoters and aetivator sequences ("enhancers ");
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, markers or selection markers.
  • the bacterial promoters may be the Lad, LacZ promoters, the promoters of the RNA polymerase of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • bacteriophage vectors such as bacteriophage P1 vectors such as the vector p158 or even the vector p158 / neo8 described by Sternberg (1992, 1994), will preferably be used.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA). Mention may also be made of other commercially available vectors such as the vectors pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
  • baculovirus type vectors such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect cells of the Sf9 line (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera fr ⁇ giperda.
  • a recombinant vector according to the invention can also be a retroviral vector or also an adeno-associated vector (AAV).
  • AAV adeno-associated vector
  • Such adeno-associated vectors are for example described by Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), or even McLaughlin BA et al. (1996).
  • the latter must be introduced into a host cell.
  • the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art to transform or transfect cells, either in primary culture or in the form of cell lines. It is also possible to carry out the introduction of the polynucleotides according to the invention in vivo or ex vivo, for the prevention or treatment of diseases linked to a deficit in the reverse transport of cholesterol.
  • a person skilled in the art may advantageously refer to different techniques, such as the calcium phosphate precipitation technique (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE Dextran (Gopal, 1985), electroporation (Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), direct microinjection (Harland et al., 1985), DNA-loaded liposomes (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
  • the polynucleotide Once the polynucleotide has been introduced into the host cell, it can be stably integrated into the genome of the cell. Integration can be carried out at a specific location in the genome, by homologous recombination, or can be integrated at random. In some embodiments, the polynucleotide can be stably maintained in the host cell in the form of an episome fragment, the episome comprising sequences permitting maintenance and replication thereof, either independently or in synchronization with the cell cycle.
  • a method for introducing a polynucleotide according to the invention into a host cell comprises a step during which a preparation comprising a vector is introduced pharmaceutically compatible and a “naked” polynucleotide according to the invention, placed under the control of appropriate regulatory sequences, by local injection into the chosen tissue, for example a smooth muscle tissue, the “naked” polynucleotide being absorbed by the cells of this fabric.
  • compositions for in vitro and in vivo use comprising “naked” polynucleotides are for example described in PCT application No. WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, University of Ottawa) as well as in the articles by Tacson and al. (1996) and de Huygen et al. (1996).
  • compositions for the in vivo production of the ABCL protein comprise a polynucleotide coding for the ABC1 polypeptide placed under the control of appropriate regulatory sequences, in solution in a physiologically vector acceptable.
  • the amount of vector that is injected into the chosen host organism varies depending on the site of the injection. As an indication, it can be injected between approximately 0.1 and approximately 100 ⁇ g of the polynucleotide encoding the protein ABC1 in the body of an animal, preferably of a patient susceptible to developing a disease linked to a deficit in reverse transport. cholesterol or having already developed this disease, in particular a patient having a predisposition for Tangier disease or having already developed the disease. Consequently, the invention also relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction of reverse cholesterol transport, comprising a nucleic acid coding for the protein ABC1, in association with one or more physiologically compatible excipients .
  • a composition will comprise the polynucleotide of sequence SEQ ID NO 91, placed under the control of the appropriate regulatory elements.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction of the reverse transport of cholesterol, comprising a recombinant vector according to the invention, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid according to the invention, coding for the protein ABC1, for the manufacture of a medicament intended for the prevention of Atherosclerosis in various forms or more particularly for the treatment of subjects affected by a reverse cholesterol transport dysfunction.
  • the invention also relates to the use of a recombinant vector according to the invention, comprising a nucleic acid coding for the protein ABC1, for the manufacture of a medicament intended for the prevention of Atherosclerosis in various forms or more particularly to the treatment of subjects affected by a dysfunction of the reverse transport of cholesterol.
  • Vectors useful in somatic gene therapy methods and compositions containing such vectors are provided.
  • the present invention also relates to a new therapeutic approach for the treatment of pathologies linked to the transport of cholesterol. It offers an advantageous solution to the drawbacks of the prior art, by demonstrating the possibility of treating pathologies linked to the transport of cholesterol by gene therapy, by the transfer and in vivo expression of a gene coding for an ABC1 protein involved. in the transport and metabolism of cholesterol.
  • the invention thus offers a simple means allowing a specific and effective treatment of associated pathologies such as for example Atherosclerosis.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) or ensuring the expression of a protein of therapeutic interest by introducing information genetics in the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either ex vivo in a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo in the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • the present invention therefore also relates to a new therapeutic approach for the treatment of pathologies linked to the transport of cholesterol, consisting in transferring and expressing in vivo genes coding for ABCL.
  • the applicant has now shown that it is possible to construct recombinant viruses containing a DNA sequence coding for an ABC1 protein involved in cholesterol metabolism, to administer these recombinant viruses in vivo, and that this administration allows stable and efficient expression of a biologically active ABC1 protein in vivo, and without cytopathological effect.
  • the present invention also results from the demonstration that adenoviruses constitute particularly efficient vectors for the transfer and expression of the ABC1 gene.
  • the present invention shows that the use of recombinant adenoviruses as vectors makes it possible to obtain sufficiently high levels of expression of this gene to produce the desired therapeutic effect.
  • Other viral vectors such as retroviruses or adeno-associated viruses (AAV) allowing stable expression of the gene are also claimed.
  • the present invention thus offers a new approach for the treatment and prevention of cardiovascular and neurological pathologies linked to abnormal cholesterol transport.
  • the invention therefore also relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic sequence coding for a protein ABC1 involved in the metabolism of cholesterol.
  • the invention also relates to the use of such a defective recombinant virus for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of cardiovascular diseases.
  • the present invention also relates to the use of cells genetically modified ex vivo by a virus as described above, or of cells producing such viruses, implanted in the organism, allowing a prolonged and efficient expression in vivo of a protein. ABC1 biologically active.
  • the present invention shows that it is possible to incorporate a DNA sequence coding for ABC1 into a viral vector, and that these vectors make it possible to efficiently express a mature, biologically active form. More particularly, the invention shows that the in vivo expression of ABC1 can be obtained by direct administration of an adenovirus or by implantation of a producer or genetically modified cell by an adenovirus or by a retrovirus incorporating such DNA.
  • the present invention is particularly advantageous because it makes it possible to induce a controlled expression and without harmful effect of ABC1 in organs which are not normally concerned with the expression of this protein.
  • a significant release of the ABC1 protein is obtained by implantation of cells producing vectors of the invention, or infected ex vivo with vectors of the invention.
  • the cholesterol transporter activity produced in the context of the present invention can be of the human or animal ABC1 type.
  • the nucleic sequence used in the context of the present invention can be a cDNA, a genomic DNA (gDNA), a RNA (in the case of retroviruses) or a hybrid construct consisting for example of a cDNA in which one or more introns would be inserted. . They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. Particularly advantageously, a cDNA or a gDNA is used. In particular, the use of a gDNA allows better expression in human cells.
  • these sequences are advantageously modified, for example by site-directed mutagenesis, in particular for the insertion of appropriate restriction sites.
  • the sequences described in the prior art are in fact not constructed for use according to the invention, and prior adaptations may prove to be necessary, in order to obtain important expressions.
  • a construct coding for a derivative of these ABCL proteins comprises for example any sequence obtained by mutation, deletion and / or addition with respect to the native sequence, and coding for a product retaining cholesterol-carrying activity.
  • the biological activity of the derivatives thus obtained can then be easily determined, as indicated in particular in the examples the measurement of the efflux of cholesterol from the cells.
  • the derivatives within the meaning of the invention can also be obtained by hybridization from nucleic acid libraries, using as probe the native sequence or a fragment thereof.
  • derivatives are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, molecules exhibiting greater resistance to proteases, molecules having greater therapeutic efficacy or less side effects, or possibly new biological properties.
  • the derivatives also include the modified DNA sequences allowing improved expression in vivo.
  • the present invention relates to a defective recombinant virus comprising a cDNA sequence coding for a protein ABC1 involved in the transport and metabolism of cholesterol.
  • the DNA sequence is a gDNA sequence.
  • the vectors of the invention can be prepared from different types of virus.
  • vectors derived from adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), herpes viruses are used. (HSV) or retroviruses.
  • AAV adeno-associated viruses
  • HSV herpes viruses
  • the viruses according to the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used within the framework of the • present invention therefore lacks at least sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized. Among these serotypes, it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise the ITRs, a sequence allowing the encapsidation and the sequence coding for the ABCL protein.
  • the E1 region at least is made non-functional.
  • the E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes are non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more several bases in the genes considered.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions and the sequence coding for ABC1 is inserted at the level of the inactivated E1 region.
  • it comprises a deletion in region E1 at the level of which are inserted the region E4 and the sequence coding for ABC1 (French patent application FR94 13355).
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, inter alia, the DNA sequence coding for the protein ABC1. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid into an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the sequence coding for the ABC1 protein bordered by two repeated regions inverted (ITR) from AAV, and a plasmid carrying the encapsidation genes (rep and cap genes) from AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITR inverted
  • rep and cap genes encapsidation genes
  • retroviruses are integrative viruses, infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and approx).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said coding sequence is generally constructed, then used to transfect a cell line called packaging, able to provide trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861, 719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • adenoviral vectors according to the invention are particularly advantageous for direct administration in vivo of a purified suspension, or for the ex vivo transformation of cells, in particular autologous, with a view to their implantation.
  • the adenoviral vectors according to the invention also have significant advantages, such as in particular their very high infection efficiency, making it possible to carry out infections from small volumes of viral suspension.
  • a line producing retroviral vectors containing the sequence coding for the protein ABC1 is used, for implantation in vivo.
  • the lines which can be used for this purpose are in particular the cells PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90 / 02806) and GP + envAm-12 (US5,278,056), modified to allow the production of a retrovirus containing a nucleic sequence coding for an ABC1 protein according to the invention.
  • totipotent stem cells, precursors of blood cell lines can be removed and isolated from the subject.
  • These cultured cells can then be transfected with the retroviral vector containing the sequence coding for the ABC1 protein under the control of viral, non-viral, non-viral and macrophage-specific promoters or even under the control of its own promoter. These cells are then re-introduced into the subject. The differentiation of these cells will be at the origin of blood cells expressing the ABC1 protein, in particular at the origin of monocytes which, transformed into macrophages, participate in the elimination of cholesterol from the arterial wall. These macrophages expressing the ABC1 protein will have an increased capacity to metabolize excess cholesterol and will make it available on the cell surface for its elimination by the primary acceptors of membrane cholesterol.
  • the sequence coding for the protein ABC1 is placed under the control of signals allowing its expression in the infected cells.
  • They may be homologous or heterologous expression signals, that is to say signals different from those naturally responsible for the expression of the ABCL II protein.
  • They may in particular be sequences responsible for the expression other proteins, or synthetic sequences.
  • they may be sequences of eukaryotic or viral genes or derived sequences, stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular, the promoters of the E1A, MLP genes of adenovirus, the CMV promoter, LTR-RSV, etc.
  • ubiquitous promoters HPRT, vimentin, ⁇ -actin, tubulin, etc.
  • filament promoters intermediates desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.
  • promoters of therapeutic genes type MDR, CFTR, factor VIII, etc.
  • tissue specific promoters pyruvate kinase, villin, promoter of the intestinal fatty acid binding protein, ⁇ -actin promoter of smooth muscle cells, specific promoters for the liver; Apo A1, Apo Garlic, human albumin, etc.
  • promoters responding to a stimulus steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences, etc.
  • the inserted gene does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • the invention relates to a defective recombinant virus comprising a nucleic sequence coding for a protein ABC1 involved in the metabolism of cholesterol under the control of a promoter chosen from LTR-RSV or the early promoter of CMV .
  • the present invention also relates to any use of a virus as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of pathologies linked to the transport of cholesterol.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for an intravenous injection, such as for example in the patient's portal vein.
  • injectable formulation in particular for an intravenous injection, such as for example in the patient's portal vein.
  • They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • Direct injection into the patient's portal vein is advantageous because it makes it possible to target the infection in the liver and thus to concentrate the therapeutic effect in this organ.
  • the doses of defective recombinant virus used for injection can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the viral vector, of the mode of administration used, of the pathology concerned or also of the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 ⁇ pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 1 ⁇ pfu / ml.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells.
  • the techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • compositions according to the invention can directly comprise the producer cells, with a view to their implantation.
  • another subject of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more defective recombinant viruses as described above. More particularly, the invention relates to any population of human cells infected with these viruses. They may in particular be cells of blood origin (totipotent stem cells or precursors), fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, smooth and endothelial muscle cells, glial cells, etc.
  • the cells according to the invention can come from primary cultures. These can be removed by any technique known to those skilled in the art, then cultured under conditions allowing their proliferation. As regards more particularly fibroblasts, these can be easily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. These cells can be used directly for infection by viruses, or stored, for example by freezing, for the establishment of autologous libraries, for later use.
  • the cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from pre-established banks (see for example EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
  • the cells in culture are then infected with the recombinant viruses, to give them the capacity to produce an ABC1 protein. biologically active.
  • the infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, a person skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles carried out. It is understood that these steps must be carried out under conditions of appropriate sterility when the cells are intended for administration in vivo.
  • the doses of recombinant virus used for infection of the cells can be adapted by a person skilled in the art according to the aim sought.
  • the conditions described above for administration in vivo can be applied to infection in vitro.
  • retroviruses For infection with retroviruses, it is also possible to co-cultivate the cells which it is desired to infect with cells producing the recombinant retroviruses according to the invention. This makes it possible to dispense with the purification of retroviruses.
  • Another subject of the invention relates to an implant comprising mammalian cells infected with one or more defective recombinant viruses as described above or cells producing recombinant viruses, and an extracellular matrix.
  • the implants according to the invention comprise 10 ⁇ to 1010 cells. More preferably, they include 10 ⁇ to 10 ⁇ .
  • the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support allowing the anchoring of the cells.
  • gelling agents are used for the inclusion of cells in a matrix having the constitution of a gel, and to promote the anchoring of the cells on the support, if necessary.
  • Different cell adhesion agents can therefore be used as gelling agents, such as in particular collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc.
  • collagen is used. It can be collagen of human, bovine or murine origin. More preferably, type I collagen is used.
  • compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of cells.
  • anchoring designates any form of biological and / or chemical and / or physical interaction resulting in the adhesion and / or fixing of the cells on the support.
  • the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. It is preferred to use, within the framework of the invention, a solid, non-toxic and / or biocompatible support.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of pathologies linked to the transport of cholesterol, in particular obesity, hypertriglyceridemia, or, in the field of cardiovascular diseases, myocardial infarction, angina, sudden death, heart failure, and stroke.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising any one of the nucleic acids of the invention, and more particularly a nucleic acid of sequence SEQ ID NO 91, 94 or 96
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising a recombinant vector as described above.
  • the preferred host cells according to the invention are for example the following:
  • prokaryotic host cells cher'Escherichia coli strains (strain DH5- ⁇ ), of Bacillus subtilis, of Salmonella typhimurium, or of strains of species such as Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococus;
  • HeLa cells ATCC No. CCL2
  • Cv 1 cells ATCC No. CCL70
  • COS cells ATCC No. CRL 1650
  • Sf-9 cells ATCC N ° CRL 1711
  • CHO cells ATCC N ° CCL-61
  • 3T3 cells ATCC N ° CRL-6361.
  • the invention relates to a polypeptide encoded by a mutated ABC1 gene, and more particularly to a mutated ABC1 gene in patients suffering from a deficit in reverse cholesterol transport, very particularly in patients suffering from Tangier's disease.
  • the first mutation corresponds to the insertion of a fragment of a hundred base pairs within the coding sequence, at the level of exon 12 of the ABC1 gene, leading to the production of a biologically inactive polypeptide of 2233 amino acids of sequence SEQ ID NO 140.
  • the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 140 has, compared to the normal polypeptide of sequence SEQ iD NO 139, the following differences: a) a deletion of a peptide fragment of sequence "DERKFW "and replacing the peptide fragment with the sequence" EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG "encoded by 'the Alu type nucleotide fragment inserted.
  • the second mutation concerns the introduction of an early stop codon in the first quarter of the coding sequence, at the level of exon 13 of the ABC1 gene, leading to the production of a truncated polypeptide having 574 amino acids of sequence SEQ ID NO 141.
  • the deletion of the G base induces a change in the reading frame leading to a protein whose COOH-terminal end is not found in the amino acid sequence of the normal ABC1 polypeptide. It is the COOH-terminal sequence "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG" of the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 141.
  • These two polypeptides are useful in particular for the preparation of antibodies which recognize them specifically.
  • Such antibodies constitute means for detecting the production of these mutated ABC1 polypeptides in a sample from a test subject, preferably from a patient with symptoms characteristic of a deficit in the reverse transport of cholesterol, and most preferably in a patient with the characteristic symptoms of Tangier disease.
  • the invention therefore relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence SEQ ID NO 140.
  • the invention relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence SEQ ID NO 141.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% amino acid identity with an amino acid sequence chosen from the group consisting of peptides of sequences SEQ ID NO 140 and 141, or a peptide fragment of the latter.
  • a first preferred peptide fragment will comprise at least 5 consecutive amino acids of the peptide fragment of sequence "EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG" included in the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 140.
  • a second preferred peptide fragment will comprise at least 5 consecutive amino acids of the peptide fragment of sequence "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG" included in the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 141.
  • part of the invention is a polypeptide having at least 85%, 90%, 95% or 99% identity in amino acids with an amino acid sequence chosen from the group consisting of peptides of sequences SEQ ID NO 140 and 141, or a peptide fragment thereof.
  • polypeptides according to the invention will have a length of 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100 or 200 consecutive amino acids of a nucleic acid according to the invention, in particular a amino acid sequence polypeptide selected from the sequences
  • a polypeptide according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100 or 200 consecutive amino acids of a polypeptide according to the invention, more particularly of a polypeptide chosen from the sequences SEQ ID NO 140 and 141.
  • polypeptides according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • the invention also relates to a process for the production of one of the polypeptides of sequences SEQ ID NO 140 and 141, or of a peptide fragment or of a variant of the latter, said method comprising the steps of: a ) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector; b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a); c) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cell, for example by sonication or by osmotic shock; d) separating and purifying from said culture medium or also from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide; e) where appropriate, characterize the recombinant polypeptide produced.
  • the peptides according to the invention can be characterized by fixation on an immunity affinity chromatography column on which the antibodies directed against this polypeptide or against a fragment or a variant of the latter have been immobilized beforehand.
  • a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to the methods known to those skilled in the art and described for example in F. Ausubel et al (1989 ).
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or solid phase.
  • a polypeptide according to the invention may be prepared by the technique or in a homogeneous solution described by Houben Weyl (1974) or the solid phase synthesis technique described by Merrifield (1965a; 1965b).
  • polypeptides called “homologous” to any of the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID NO 140 and 141, or their fragments or variants.
  • Such homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptides.
  • the equivalent amino acid according to the present invention will be understood, for example replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or alternatively the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • E glutamic acid
  • a pyro-glutamic acid a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the synthesis of peptide containing at least one residue in the D form is described by Koch (1977).
  • two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
  • polypeptides comprising at least one non-peptide bond such as a retro-inverso bond (NHCO), a carba bond (CH 2 CH 2 ) or even a ketomethylene bond (CO-CH 2 ).
  • NHCO retro-inverso bond
  • CH 2 CH 2 carba bond
  • CO-CH 2 ketomethylene bond
  • polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid will retain their capacity to be recognized by antibodies directed against the unmodified polypeptides.
  • the mutated ABC1 polypeptides according to the invention in particular the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID NO 140-141] or the fragments thereof as well as the homologous peptides can be used for the preparation of antibodies, in particular for the purpose of detecting the production of altered forms of the ABC1 polypeptide in a patient.
  • a first preferred antibody according to the invention is directed against a peptide fragment comprising at least 5 consecutive amino acids of the peptide fragment of sequence "EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG" included in the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 140.
  • a second preferred antibody according to the invention is directed against a peptide fragment comprising at least 5 consecutive amino acids of the peptide fragment of sequence "RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG" included in the mutated ABC1 polypeptide of sequence SEQ ID NO 141.
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments
  • any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the polypeptide or the fragment of target polypeptide according to the invention.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by Kohler and Milstein (1975).
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by Kozbor et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by Martineau et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also comprise fragments of antibodies obtained using phage banks Ridder et al., (1995) or also humanized antibodies Reinmann et al. (1997); Léger et al., (1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended to identify the presence and / or the quantity of antigens present in a sample.
  • An antibody according to the invention may include in. in addition to an detectable isotopic or non-isotopic marker, for example fluorescent or else being coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • an detectable isotopic or non-isotopic marker for example fluorescent or else being coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the subject of the mention is furthermore a method for detecting the presence of a polypeptide in accordance with the invention in a sample, said method comprising the steps of: a) bringing the sample to be tested into contact with an antibody such as described above; b) detecting the antigen / antibody complex formed.
  • the invention also relates to a kit or kit for diagnosis or for the detection of the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising: a) an antibody as defined above; b) a reagent allowing the detection of the antigen / antibody complexes formed.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions intended for the prevention or treatment of a deficit in the metabolism of cholesterol such as atherosclerosis, particularly in the transport of cholesterol, and more particularly still in the reverse transport of cholesterol, characterized in that they comprise a therapeutically effective amount of a polynucleotide capable of giving rise to the production of an effective amount of the normal ABC1 polypeptide, in particular of the polypeptide of sequence SEQ iD NO 139.
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions intended for the prevention or treatment of a deficit in the metabolism of cholesterol such as atherosclerosis, particularly in the transport of cholesterol, and more particularly still in the reverse transport of cholesterol, characterized in that they comprise a therapeutically effective amount of ABC1 polypeptide no rmal, in particular of the polypeptide of sequence SEQ ID NO 139.
  • Such pharmaceutical compositions will advantageously be suitable for the administration, for example parenterally, of an amount of the ABC1 polypeptide ranging from 1 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day, preferably at least 0.01 mg / kg / day and most preferably between 0.01 and 1 mg / kg / day.
  • compositions according to the invention can be administered either orally, rectally, parenterally, intravenously, subcutaneously or even intra-dermally.
  • the invention also relates to the use of the polypeptide ABC1 of sequence SEQ ID NO 139 for the manufacture of a medicament intended for the prevention of Atherosclerosis in various forms or more particularly for the treatment of subjects affected by a dysfunction of reverse transport cholesterol.
  • the invention finally relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of subjects affected by a dysfunction of reverse cholesterol transport, comprising a therapeutically effective amount of the polypeptide of sequence SEQ ID NO 139
  • the subject of the invention is also a method of preventive or curative therapeutic treatment of diseases caused by a deficiency in the metabolism of cholesterol, more particularly in the transport of cholesterol and even more particularly in the reverse transport of cholesterol, such a method comprising a step during which is administered to a patient a polynucleotide capable of giving rise to the expression of the ABC1 polypeptide in said patient, said polynucleotide being, where appropriate, associated with one or more vehicles and or excipients physiologically compatible.
  • the patient will be administered a pharmaceutical composition comprising a polynucleotide, as defined above.
  • the invention also relates to a method of preventive or curative therapeutic treatment of diseases caused by a deficiency in the metabolism of cholesterol, more particularly in the transport of cholesterol and even more particularly in the reverse transport of cholesterol , such a method comprising a step during which is administered to a patient a therapeutically effective amount of the ABC1 polypeptide in said patient, said polypeptide being, where appropriate, associated with one or more physiologically compatible vehicles and / or excipients.
  • the patient will be administered a pharmaceutical composition comprising a polypeptide, as defined above.
  • the invention also relates to various methods of screening compounds for therapeutic use useful in the treatment of diseases due to a deficit in the metabolism of cholesterol, particularly in the transport of cholesterol, more particularly still in the reverse transport of cholesterol, such as Tangier's disease, or more generally FHD-like conditions.
  • the invention therefore also relates to the use of the ABC1 polypeptide, or of cells expressing the ABC1 polypeptide, for screening active principles for the prevention or treatment of diseases resulting from a dysfunction of reverse cholesterol transport.
  • the catalytic sites and oligopeptide or immunogenic fragments of the ABC1 polypeptide can be used to screen libraries of products by a whole host of existing techniques.
  • the fragment used in this type of screening can be free in solution, fixed on a solid support, on the cell surface or still in the cell. The formation of binding complexes between the ABCI fragments and the agent tested can then be measured.
  • the invention also relates to a method of screening for a compound active on the metabolism of cholesterol, an agonist or antagonist of the ABC1 polypeptide, said method comprising the following steps: a) preparing membrane vesicles containing the ABC1 polypeptide and a lipid substrate comprising a detectable marker; b) incubating the vesicles obtained in step a) with an agonist or antagonist candidate compound; c) qualitatively and quantitatively measuring the release of the lipid substrate comprising a detectable marker; d) compare the measurement obtained in step b) with a measurement of the release of the lipid substrate marked by the vesicles which have not been previously incubated with the agonist or antagonist candidate compound.
  • the membrane vesicles are synthetic lipid vesicles, which can be prepared according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the ABC1 protein can be a recombinant ABC1 protein.
  • the membrane vesicles are vesicles of plasma membranes derived from cells expressing the ABC1 polypeptide. They can be cells naturally expressing the ABC1 polypeptide or cells transfected with a recombinant vector coding for the ABC1 polypeptide.
  • the lipid substrate is chosen from cholesterol or phosphatidyl choline.
  • the lipid substrate is radioactively labeled, for example by an isotope chosen from 3 H or 125 l.
  • the lipid substrate is marked by a fluorescent compound, such as NBD or pyrene.
  • the membrane vesicles comprising the labeled lipid substrate and the ABC1 polypeptide are immobilized on the surface of a solid support before step b).
  • the measurement of the fluorescence or of the radioactivity released by the vesicles is a direct reflection of the activity of transport of the lipid substrate by the ABC1 polypeptide.
  • the invention also relates to a method of screening for a compound active on the metabolism of cholesterol, an agonist or antagonist of the ABC1 polypeptide, said method comprising the following steps: a) obtaining cells, for example a cell line, expressing naturally or after transfection the ABC1 polypeptide; b) incubating the cells of step a) in the presence of anion labeled with a detectable label; c) washing the cells of step b) in order to remove the excess of the labeled anion which has not penetrated into these cells; d) incubating the cells obtained in step c) with an agonist or antagonist candidate compound of the ABC1 polypeptide; e) measuring the efflux of the labeled anion; f) compare the value of the efflux of the labeled anion determined in step e) with the value of the efflux of the labeled anion measured with cells which have not been previously incubated in the presence of the candidate agonist compound or antagonist of the ABC1 polypeptide.
  • the cells used are cells expressing naturally the ABCL II polypeptide can be human monocytes in primary culture, purified from a population of human blood mononuclear cells . They can also be human monocytic cell lines, such as the leukemic monocytic line THP1.
  • the cells used in the screening method described above can be cells not expressing naturally, or alternatively expressing at a low level, the ABC1 polypeptide, said cells being transfected with a recombinant vector according to the invention capable of directing the expression of the ABC1 polypeptide
  • the cells can be cells with a natural deficit in anion transport, or cells pretreated with one or more inhibitors of anion channels, such as Verapamil TM or tetraethylammonium.
  • the anion is a radioactively labeled iodide, such as the salts K 125 l or Na 125 l.
  • the measurement of the efflux of the labeled anion is determined periodically over time during the experiment, thus also making it possible to establish a kinetic measurement of this efflux.
  • the value of the efflux of the labeled anion is determined by measuring the quantity of the labeled anion present at a given time in the cell culture supernatant.
  • the value of the efflux of the labeled anion is determined as the proportion of radioactivity found in the cell culture supernatant relative to the total radioactivity corresponding to the sum of the radioactivity found in the lysates. and radioactivity found in the cell culture supernatant.
  • the subject of the invention is also a method of screening for a compound active on the metabolism of cholesterol, an agonist or antagonist of the ABC1 polypeptide, said method comprising the following steps: a) culturing cells of a human monocytic line in a medium appropriate culture, in the presence of purified human albumin; b) incubating the cells of step a) simultaneously in the presence of a compound stimulating the production of IL-1 beta and of the candidate compound agonist or antagonist; c) incubating the cells obtained in step b) in the presence of an appropriate concentration of ATP; d) measure of IL-1 beta released in the cell culture supernatant. e) compare the value of the release of IL-1 beta obtained in step d) with the value of IL-1 beta released in the culture supernatant of cells which have not been previously incubated in the presence of compound agonist or antagonist candidate.
  • the cells used belong to the human leukemic monocytic line THP1.
  • the compound stimulating the production of IL-1 beta is a lipopolysaccharide.
  • the production of IL-1 alpha, IL-6 and TNF alpha by these cells is also qualitatively and / or quantitatively determined.
  • the level of expression of the messenger RNA coding for IL-1 beta is also determined.
  • Figure 1 illustrates the segregation of the mutation by insertion of an Alu sequence in exon 12 of the ABC1 gene. Insertion-deletion in exon
  • FIG. 12 of the ABC1 gene consists of a deletion of 14 nucleotides and an insertion of 110 nucleotides as shown in FIG. 1A.
  • FIG. 1B represents the pedigree Nu and the size of the DNA fragments obtained for each of the patients after amplification by PCR of exon 12.
  • Lane M corresponds to the mobility markers (Gibco BRL).
  • Lane C corresponds to a control DNA.
  • Figure 2 illustrates the deletion mutation of a single nucleotide in exon
  • the expression profile of the polynucleotides according to the present invention is determined according to the Northern blot analysis and reverse transcription coupled to PCR protocols described in particular by Sambrook et al (ref. CSH Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). "Molecular Clo ⁇ ing: A Laboratory Manual,” 2 ⁇ d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
  • a pair of primers synthesized from the complete DNA of the human gene ABC1 of sequence SEQ ID NO 91 is used to detect the corresponding cDNA.
  • the polymerase chain reaction (PCR) is carried out on cDNA templates corresponding to polyA + mRNAs (Clontech) retrotranscribed.
  • Reverse transcription into cDNA is carried out with the enzyme SUPERSCRIPT II (GibcoBRL, Life Technologies) according to the conditions described by the manufacturer.
  • the polymerase chain reaction is carried out according to standard conditions, in 20 ⁇ l of reaction mixture with 25 ng of the cDNA preparation.
  • the reaction mixture is composed of 400 ⁇ M of each of the dNTPs, of 2 units of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (Ampli Taq Gold; Perkin Elmer), of 0.5 ⁇ M of each primer, of 2.5 mM MgCI2, and of PCR buffer.
  • Thirty four PCR cycles (30 s denaturation at 94 ° C, 30 s hybridization broken down as follows during the 34 cycles: 64 ° C 2 cycles, 61 ° C 2 cycles, 58 ° C 2 cycles and 55 ° C 28 cycles and one minute elongation per kilobase at 72 ° C) are carried out after a first denaturation step at 94 ° C for 10 min in a Perkin Elmer 9700 thermocycler.
  • the PCR reactions are visualized on agarose gel by electrophoresis.
  • the cDNA fragments obtained can be used as probes for analysis by Northern blot and can also be used for the exact determination of the polynucleotide sequence
  • a cDNA probe produced as described above is labeled with 32 P using the High Prime DNA labeling system (Boehringer) according to the instructions indicated by the manufacturer. After labeling, the probe is purified on a micro-column of Sephadex G50 (Pharmacia) according to the instructions indicated by the manufacturer. The labeled and purified probe is then used for the detection of the expression of mRNAs in different tissues.
  • the Northern blot containing RNA samples from different human tissues ((Multiple Tissue Northern, MTN, Clontech) Blot 2, reference 77759-1) is hybridized with the labeled probe.
  • the protocol followed for hybridizations and washes can either be directly that described by the manufacturer (User manual PT1200-1) or an adaptation of this protocol using the methods known to those skilled in the art and described for example in F. Ausubel et al (1999). We may thus vary for example the prehybridization and hybridization temperatures in the presence of formamide.
  • the blot is analyzed after a night of exposure on contact with a phosphor screen revealed using the Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
  • the sequence of the 3'-UTR region of the human ABC1 gene cDNA has been identified by database searches.
  • Oligonucleotide primers were synthesized from the partial consensus sequence derived from EST sequences, in order to amplify, by an RT-PCR reaction, the 3 ′ end of the cDNA of the human ABC1 gene, then to determine the sequence thereof. .
  • the oligonucleotide primers used are the following:
  • Reverse transcription of poly (A) + mRNA from brain, fetal brain, heart, uterus and placenta tissues was carried out by elongation using primers oligodT using the Superscript TM kit (sold by the company Life Technologies Inc.), according to the manufacturer's instructions.
  • a PCR reaction was carried out on the products which may or may not have undergone a first reverse trancription step under the following conditions:
  • PCR buffer also containing 50 ng of DNA or about 25 ng of cDNA.
  • thermocycling device Perkin Elmer 9700 Thermal Cycler
  • hybridization step at 64 ° C for 2 cycles, at 61 ° C for 2 cycles, at 58 ° C for 2 cycles and at 55 ° C for 28 cycles).
  • a complete clone can be directly isolated by hybridization by screening a cDNA library using a polynucleotide probe specific for the sequence of the gene of interest.
  • a specific probe of 30-40 nucleotides is synthesized using a synthesizer of the Applied Biosystem / Perkin Elmer brand according to the chosen sequence.
  • the oligonucleotide obtained is radiolabelled, for example with 32 P- ⁇ -ATP using the T4 polynucleotide kinase and is purified according to the usual methods (eg Maniatis et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY 1982 or F.Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons Eds, 1989).
  • the bank of clones containing the cDNA that we want to screen is spread on culture medium in a Petri dish (1.5% agar) containing the appropriate antibiotics according to the usual methods mentioned above (F. Ausubel et al.).
  • the colonies thus produced after incubation are transferred to nitrocellulose filters and screened using the radiolabelled nucleotide probe, according to the usual methods and the colonies hybridizing with the probe are isolated and subcloned.
  • the DNA of the clones thus identified is prepared and analyzed by sequencing.
  • the clones containing the fragments corresponding to the complete cDNA are purified and recloned in the vector pcDNA3 according to the protocols known to those skilled in the art and presented for example in F. Ausubel et al (1989).
  • RNA oligonucleotide is ligated to the 5 'end of an mRNA population.
  • a set of primers specific respectively to the adapter ligated in 5 ′ and of a sequence located in 3 ′ of the gene of interest is used in PCR to amplify the 5 ′ portion of the sought cDNA.
  • the amplified fragment is then used to reconstruct the complete cDNA.
  • Verification of the alteration of the level of expression of the ABC1 gene causing the Tangier cell phenotype may be determined by hydridation of these sequences with probes corresponding to mRNAs from fibroblasts from subjects with or without the disease, according to the methods described below:
  • RNAs are obtained from cell cultures of fibroblasts from normal subjects or those suffering from Tangier disease by the isothiocyanate method of gua ⁇ idine (Chomczynski & Sacchi, 1987).
  • the poly (A) + mRNAs are obtained by affinity chromatography on oligo (dT) -cellulose columns (Sambrook et al., 1989) and the cDNAs used as probes are obtained by RT-PCR (DeRisi et al., 1997) with oligonucleotides labeled with a fluorescent product (Amersham Pharmacia Biotech; CyDye TM).
  • the glass membranes containing the sequences presented in this patent application, corresponding to the Tangier gene, are hydrided with the cDNA probes, obtained from fibroblasts (lyer et al., 1999).
  • the use of the Amersham / molecular Dynamics system (Avalanche Microscanner TM) allows the quantification of the expressions of the sequence products on the healthy or affected cell type.
  • the ABC1 gene can be expressed in mammalian cells.
  • a typical eukaryotic expression vector contains a promoter which allows initiation of RNA transcription, a protein coding sequence, and the signals required for termination of transcription and for polyadenylation of the transcript. It also contains additional signals as enhancers, the (de) Kozak sequence and sequences necessary for the splicing of the mRNA.
  • An efficient transcription is obtained with the early and late elements of the promoters of the SV40 virus, the retroviral LTRs or the early promoter of the CMV virus. However, cellular elements such as the actin promoter can also be used.
  • Many expression vectors can be used to implement the present invention such as the vector pcDNA3.
  • the normal ABC1 polypeptide encoded by the complete cDNA of ABC1, the isolation of which is described in Example 2 (cloning of the full cDNA), or also the mutated ABC1 polypeptides whose complete cDNA can also be obtained according to the techniques described in Example 2, can be easily produced in a bacterial expression system, of insect cells using baculovirus vectors or in mammalian cells with or without the vaccinia virus vectors. All the methods are today widely described and known to those skilled in the art. For example, a detailed description can be found in F. Ausubel et al. (1989).
  • the antibodies in the present invention can be prepared by various methods (Current Protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Scientific, David D. Moore, JG Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl - Massachusetts General Hospital Harvard Medical School, chapter 11).
  • cells expressing a polypeptide of the present invention are injected into an animal to induce the production of serum containing the antibodies.
  • the proteins are prepared and purified in order to avoid contamination. Such a preparation is then introduced into the animal in order to produce polyclonal antisera of greater activity.
  • the antibodies of the present invention are monoclonal antibodies.
  • Such monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma technique. (K ⁇ hler et al, Nature 256: 495 (1975); Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6: 51 1 (1976); Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammeling and al., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas, Elsevier, NY, pp. 563-681 51981). In general, such methods involve immunizing the animal (preferably a mouse) with a polypeptide or, better still, with a cell expressing the polypeptide.
  • These cells can be cultured in a suitable tissue culture medium. However, it is preferable to culture the cells in an Eagle medium (modified Earle) supplemented with 10% of fetal bovine serum (inactivated at 56 ° C) and supplemented with approximately 10 g of non-essential amino acids, of 1000 U / ml of penicillin and approximately 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • Eagle medium modified Earle
  • fetal bovine serum inactivated at 56 ° C
  • non-essential amino acids of 1000 U / ml of penicillin and approximately 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the splenocytes of these mice are extracted and fused with an appropriate myeloma cell line.
  • myeloma cell line SP20
  • the parental myeloma cell line SP20
  • the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium and then cloned by limiting dilution as described by Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)).
  • the hybridoma cells obtained after such a selection are tested in order to identify the clones secreting antibodies capable of binding to the polypeptide.
  • antibodies capable of binding to the polypeptide can be produced according to a 2-step procedure using anti-idiotypic antibodies such a method is based on the fact that the antibodies are themselves antigens and therefore it is possible to obtain an antibody recognizing another antibody.
  • the antibodies specific for the protein are used to immunize an animal, preferably a mouse.
  • the splenocytes of this animal are then used to produce hybridoma cells, and these cells are screened to identify clones that produce an antibody whose ability to bind to the specific protein-antibody complex may be blocked by the polypeptide.
  • These antibodies can be used to immunize an animal to induce the formation of more protein-specific antibodies.
  • Fab and F (ab ') 2 and the other antibody fragments of the present invention could be used according to the methods described herein.
  • Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as Papain (to produce the Fab fragments) or Pepsin (to produce the F (ab ') 2 fragments).
  • secret fragments recognizing the protein can be produced by applying recombinant DNA technology or synthetic chemistry.
  • chimeric "humanized" monoclonal antibodies can be produced using genetic constructs derived from hybridoma cells producing the monoclonal antibodies described above. Methods for producing chimeric antibodies are known to those of skill in the art.
  • Tangier's disease is characterized by accelerated catabolism of high density lipoprotein particles (HDL) and an accumulation of cholesterol in the tissues.
  • HDL high density lipoprotein particles
  • the skin fibroblasts of patients with Tangier's disease have a reduced capacity to eliminate their cholesterol content by the cholesterol efflux process ensured by the apolipoprotein Al (apoA-1), major protein of HDL (Francis et al., 1995).
  • apoA-1 apolipoprotein Al
  • This characteristic corresponding to a loss of function is also found in other fibroblastic cells of patients with familial HDL deficiency (Mardi et al., 1999).
  • Correction of the phenotype of Tangier fibroblasts can be ensured by the transfection of the complete cDNA of ABC1 according to the invention, in said cells.
  • the cDNA is inserted into an expression vector which is then transfected according to the methods described below:
  • EMMEM EMMEM medium
  • GIBCO EMMEM medium
  • fetal calf serum 2 mM glutamine, 100 IU / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of steptomycin (medium designated by EMMEM10).
  • these cells are preloaded with cholesterol by incubation for 24 hours with 50 ⁇ g / ml of cholesterol in the medium described above without calf serum but containing 2 mg / ml bovine albumin (BSA, fraction V).
  • BSA bovine albumin
  • the fibroblasts preloaded with confluent cholesterol on 24-well plates are incubated in the EMMEM10 medium and 1 ⁇ Ci / ml of 1, 2- 3 H- cholesterol (50 Ci / mmol; Dupont; Wilmington, DE) for 48 hours. Approximately 100,000 counts per minute are obtained per well or 1,000 counts per minute and per ⁇ g of cellular protein.
  • the cells are washed three times with EMMEM / BSA medium, and incubated with this medium for 24 hours before transfecting the gene of interest and starting the efflux by adding 10 ⁇ g / ml of proteoliposome containing apoA-1 in an EMMEM / BSA environment.
  • proteoliposomes are prepared by sonication of phosphatidylcholine and purified human apoA-1 (Jonas, 1986). Cell transfection is carried out by the calcium phosphate precipitation technique (Sambrook et al., 1989). After the efflux period, generally 20 hours, the medium is collected, centrifuged (1000 g, 5 min), and the radioactivity determined by counting in liquid scintillation. The residual radioactivity in the cells is also determined overnight after extraction of the lipids in isopropanol. The percentage of efflux is calculated by dividing the radioactivity measured in the supernatant by the sum of the radioactivities measured, in the supernatant and the cell extract.
  • An internal control is carried out by transfection of a marker gene and incubation over 24 hours with an EMMEM / BSA medium without proteoliposome containing PapoA-1.
  • the efflux of cellular cholesterol from normal fibroblasts and transfected with a control gene corresponds to 6 ⁇ 2% whereas that obtained from fibroblasts suffering from Tangier disease and transfected by this control gene is less than 1%.
  • the transfection of fibroblasts affected by Tangier's disease with a plasmid containing the complete cDNA or the genomic DNA of ABC1 according to the invention would make it possible to restore the capacity of these cells to eliminate their excess cholesterol to a corresponding level to that of normal fibroblasts.
  • EXAMPLE 8 Isolation and characterization of genomic fragments of the human ABC1 gene.
  • the labeled cDNA fragment was used to screen the library of cosmids LLNL (Lawrence Livermore National Labs) of chromosome 9, immobilized on a Nylon TM filter.
  • the cos3a clone was subcloned in the form of an EcoRI fragment in the vector Gen3zf (-) and sequenced at both ends using the Big Dye Terminator technology on a sequencer of the ABI377 type (Applied Biosystems, Perkin Elmer).
  • genomic sequences corresponding to the human ABC1 gene were isolated and characterized. These sequences were compared with human and mouse sequences referenced in the databases making it possible to determine the intron-exon junction.
  • the detection of polymorphisms and or of mutations in the sequences of the transcripts or in the genomic sequence of the ABC1 gene can be carried out according to different protocols.
  • the method of choice is direct sequencing.
  • the method of choice consists in preparing the cDNAs and directly sequencing them.
  • the method of choice consists in preparing the cDNAs and directly sequencing them.
  • the technique of detection of mutations by direct sequencing consists in comparing the genomic sequences of the ABC1 gene obtained from homozygotes for the disease or from at least 8 individuals (4 individuals affected by the pathology studied and 4 individuals not affected). Sequence divergences constitute polymorphisms. All those modifying the amino acid sequence of the wild-type protein can be mutations capable of affecting the function of said protein, which it is interesting to consider more particularly for the study of co-segregation of the mutation and of the disease ( genotype-phenotype correlation) in the pedigree or in the case / control association studies for the analysis of sporadic cases.
  • EXAMPLE 11 Identification of a deletion of a nucleotide in exon 13 of the ABC1 gene in patients with TANGIER disease
  • the analysis of mutations in the ABC1 gene was carried out on genomic DNA of several individuals belonging to a family of which several members are affected by Tangier's disease with early coronary disorders.
  • a deletion of a nucleotide has been identified in exon 13 (DG 1764: Leu548Leu; 575 End). This deletion introduces a stop codon in position 575 which makes it possible to predict a truncation of the protein ABC1 coded by the mutated ABC1 gene, this truncation leading to the stethesis of a polypeptide deleted from a large part of the normal amino acid sequence, and in particular from the two cassettes ATP fixation.
  • a perfect correlation between the observation of the symptoms of the disease and the presence of this deletion of a nucleotide was found in the whole family ( Figure 1).
  • EXAMPLE 12 Identification of an insertion of a segment of nucleotides into exon 12 of the ABC1 gene.
  • the results found on the DNA of a family containing cases of Tangier disease without coronary complications are shown in Table IV.
  • the genomic DNA of the patients was amplified using the primers described above using the Qiagen's Star Taq kit or even the Supertaq kit, using the hybridization conditions and amplification cycle conditions recommended by the constructor.
  • the amplified PCR products were purified using a kit sold by the company Qiagen, then sequenced by the Big Dye Terminator method on an ABI377 sequencer (Applied Biosystems, Perkin Elmer).
  • the applicant carried out a linkage study by including four additional families as well as additional markers referenced in public databases in order to refine the candidate region to around 1 cM, with reference to the genetic map published by Généthon (Dib ét al., 1996)
  • the candidate region is therefore located between these two excluded markers.
  • S1 The first pedigree, "S1" has been extended. Affected individuals have a homozygous genotype for all markers in the 8cM region as well as for more distant markers, located on either side of this region.
  • One of the cousins of the individual S1, related to S1 by the two parents (double consanguinity) has four children. Two of these children have on their paternal origin chromosome a conservation of a large part of the diseased haplotype (in the defined region of 8 cM). These two children also have the characteristic characteristic of heterozygous parents of the family affected by Tangier's disease, namely a level of HDL which is half the level observed in patients not affected by the disease.
  • the homozygous character for the markers is no longer observed in the chromosomal region from the marker D9S1866 (which is heterozygous in these individuals), which made it possible to define D9S1866 as the telomeric terminal of the candidate region.
  • telomeric terminal was observed in the "Nu" family, in which one of the four children from first cousin parents was a patient affected by homozygous Tangier disease.
  • EXAMPLE 15 Isolation and characterization of the human ABC1 gene.
  • the cos3a clone was subcloned in the form of an EcoRI fragment in the vector Gen3zf (-) and sequenced at both ends using the Big Dye Terminator technology on an ABI377 type sequencer.
  • the clones containing separate inserts (determined after sequencing the ends of the different inserts or by determining the size of the latter) which were too long to be completely sequenced using the primers hybridizing with the sequences of the vector, were further analyzed by the transposon insertion technique and then sequencing using specific primers of the transposon ("GPS" system marketed by the New Eng ⁇ and Biolabs Company).
  • genomic sequences corresponding to the human ABC1 gene were isolated and characterized. These sequences were compared with human and mouse sequences referenced in databases.
  • the genomic DNA of the patients was amplified using the primers described above using the Qiagen's Star Taq kit or even the Supertaq kit, using the hybridization conditions and amplification cycle conditions recommended by the constructor.
  • amplified PCR products were purified using a kit sold by the company Qiagen, then sequenced by the Big Dye Terminator method on an ABI377 sequencer.
  • EXAMPLE 16 Construction of Recombinant Vectors Containing a Polynucleotide Encoding the ABC1 Protein I. Synthesis of Human ABC1 ⁇ ene.
  • RNA 500 ng isolated from human placenta tissue (Clontech,
  • oligonucleotide primers 5'-1 GCCACCCCGTATGAACAGGG-3 '(nt 6731 -6751 of the cDNA of ABC1). These oligonucleotide primers were synthesized by the phosphoramidite method on a DNA synthesizer of the ABI 394 type (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • the sites recognized by the restriction enzyme Not1 were incorporated into the amplified cDNA of 6676 bp by a new amplification step using 50 ng of the human ABC1 cDNA as template, and 0.25 ⁇ M of the oligonucleotide primers described above containing, at their 5 ′ end, the site recognized by the restriction enzyme NotI, in the presence of 200 ⁇ M of each of said dideoxynucleotides dATP, dCTP, dTTP and dGTP as well as the DNA polymerase of Pyrococcus furiosus ( Stratagene, Inc. La Jolla, CA, USA).
  • the PCR reaction was carried out for 30 cycles each comprising a denaturation step at 95 ° C for one minute, a renaturation step at 50 ° C for one minute and an extension step at 72 ° C for two minutes, in a thermocycler for PCR (Cetus Perkin Elmer Norwalk, CT, USA).
  • ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • the ⁇ -galactosidase cDNA of the expression vector pCMV- ⁇ (Clontech, Palo Alto, CA, USA, Gene Bank Accession n ° U02451) was deleted by digestion with the restriction endonuclease Notl and replaced by a polysite containing, from the 5 'end to the 3' end, the following sites: Notl, Ascl, Rsrll, Avril, Swal, and Notl (sequence of the cloning polysite:
  • this cloning polysite having been cloned at the NotI site.
  • the DNA fragment included between the EcoRI and SanI sites of the modified pCMV expression vector was isolated and cloned into the modified Xbal site of the shuttle vector pXCXII (McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988).
  • a cloning polysite comprising, from the 5 ′ end to the 3 ′ end, the restriction sites Xbal, EcoRI, Sfil, Pmel, Nhel, Srfl, Pacl, Sali and Xbal (of sequence:
  • the EcoRI-Sall DNA fragment isolated from the modified pCMV- ⁇ vector containing the CMV promoter / enhancer, the FV40 splice donor and acceptor sites and the FV40 polyadenylation signal was then cloned into the EcoRi-Sall site. of the modified pXCX shuttle vector, designated pCMV-11.
  • the human ABC1 cDNA is obtained by an RT-PCR reaction, as described above, and clones at the NotI site in the vector pCMV-12, resulting in obtaining the vector pCMV-ABC1.
  • the ABC1 cDNA contained in the pCMV-ABC1 vector consists of a DNA fragment of 6676 bp comprising the sequence going from the nucleotide at position 75 to the nucleotide at position 6751 of the human ABC1 cDNA.
  • the recombinant ABCLrldV adenovirus containing the human ABC1 cDNA was constructed according to the technique described by McGrory et al. (1988).
  • the vector pAD12-ABC1 was cotransfected with the vector tGM17 according to the technique of CHEN and OKAYAMA (1987).
  • the vector pAD12-Luciferase was constructed and cotransfected with the vector pJM17.
  • the recombinant adenoviruses were identified by PCR amplification and subjected to two purification cycles before large-scale amplification in the human kidney embryonic cell line HEK 293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Infected cells were collected 48 to 72 hours after infection with adenoviral vectors and subjected to five cycles of freeze-thaw lysis.
  • the crude lysates were extracted using Freon (Halocarbon 113, Matheson Product, Scaucus, NJ USA), sedimented twice in cesium chloride supplemented with 0.2% murine albumin (Sigma Chemical Co., Saint -Louis, MO, USA) and dialyzes extensively against buffer composed of 150 nM NaCI, 10 mM Hepes (pH 7.4), 5 mM KCI, 1 mM MgCI 2 , and 1 mM CaCI 2 .
  • the recombinant adenoviruses were stored at -70 ° C and titrated before their administration to animals or their incubation with cells in culture.
  • the absence of contaminating wild-type adenovirus was confirmed by screening using PCR amplification using oligonucleotide primers located on the structural part of the deleted region.
  • Polyclonal antibodies specific for the human ABC1 polypeptide were prepared in rabbits and chicks by injection of the synthetic peptide "LHKNQTVVDVAVLTSFLQDEKVKESYV", derived from the ABC1 protein. These polyclonal antibodies are used to detect and / or quantify the expression of the human ABC1 gene in cells and animal models by immunoblotting and / or immunodetection.
  • ABC1 The biological activity of ABC1 can be followed by quantifying the cholesterol flows induced by apoA-1 from cells transfected with the vector pCMV-ABCI which have been loaded with cholesterol (Remaley et al., 1997).
  • the expression of human ABC1 can be monitored by immunoblotting as well as by quantification of the cholesterol efflux induced by apoA-1 from transfected and / or infected cells.
  • An appropriate volume (100 to 300 ⁇ l) of a medium containing the purified recombinant adenovirus (pABd -AdV or pLucif-AdV) containing 10 8 to 10 9 units forming lysis plaques (PFUs) are infused into the saphenous vein of mice (C57BU6, both control mice and transgenic or knockout mouse models) on day 0 of the experiment.
  • the physiological role of the ABC1 protein in lipoprotein metabolism is assessed by determining the total amount of cholesterol, triglycerides, phospholipids and free cholesterol (Sigma and Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), cholesterol -HDL (CIBA-Corning, Oberlin, OH, USA) and mouse apolipoproteins Al, A-Il, E and B (Foger et al., 1997), before (day zero) and after (days 2, 4, 7 , 10, 14) administration of the adenovirus.
  • the effect of ABC1 expression on the development of atherosclerosis can be assessed by quantifying the average area of aortic injury in apoE mice after administration of the rABC1 -Adv vector.
  • ABC1 can be produced, according to Waisman's teaching
  • EXAMPLE 17 Use of vesicles for the screening of agonist and antagonist molecules of the ABCL protein
  • the basis of this test is the reconstitution of membranes which have incorporated the ABC1 protein and which contain substrates such as cholesterol or phopholipids.
  • the ABC1 protein can then be activated or its function suppressed by the addition of molecules of interest.
  • the exit of the substrates through the channel formed by the ABC1 protein is then detected.
  • a lipid substrate such as phospholipids, cholesterol or cholesterol ester, radioactive of the 3H-cholesterol type, 125-1-cholesterol, 3H-phospphatidylcholine or else fluorescent with NBD or pyrene (Molecular Probes; http: // www.probes.com) and phospatidyle- Egg choline (1 mM) are dried on the base of a glass bottle. In this bottle are mixed both sodium cholate and the ABC1 protein with a mole-to-mole ratio of 0.3. The whole is mixed with the vortex for 5 minutes then incubated at 25 ° C for 30 minutes then dialysis against a saline buffer. The proteoliposome produced according to this protocol is followed by turbidimetry to verify its good manufacture. - b) Capture of the proteoliposome on a solid surface
  • This step can be carried out by incorporating integrin-type binding proteins.
  • a capture by the antibodies directed against the protein ABC1 and previously adsorbed on a 96 or 384 well plate is used.
  • This step is carried out by incubating products for 1 hour at 37 ° C. d) Determination of the activation or inhibition of the protein ABC1 If the substrate is fluorescent, the fluorescence of the supernatant reveals the activity of the product to induce transport of lipid outward from the proteoliposome. Or, the use of the Confocal system informs us about the quantities of substrate inside and outside the proteoliposome. If the substrate is radioactive, the use of plates of the CytoStar type having a bottom with scintillation liquid makes it possible to reveal the subtrate still sequestered in the proteoliposome.
  • EXAMPLE 18 Use of anion transport for the screening of agonist and antagonist molecules of the protein ABC1).
  • the principle of this test resides in the property that the protein ABC1 has to transport the anions during its activation.
  • the macrophagic cells of the THP-1 lines human monocytic leukemia cells, are a model of differentiated macrophages. The cells are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in 48-well plates at a density of 2 105 cells per well.
  • the fibroblastic cells of patients with Tangier's disease can be used as a negative control because their protein ABC1 is not functional.
  • Another negative control can be obtained by the addition of anti-ABCL antibodies b)
  • the use of detecting cells in anionic transport or else cells treated with anionic channel inhibitors can also be used.
  • anionic channel inhibitors Verapamil type, a P-glycoprotein inhibitor or tetraethylammonium, a potassium channel inhibitor
  • ESS Earles's modified know solution medium
  • EXAMPLE 19 Use of THP-1 macrophages expressing IL-1beta for the screening of agonist and antagonist molecules of the protein ABC1).
  • the macrophagic cells of the THP-1 lines are a model of differentiated macrophages.
  • the cells are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in multiwell plates at the density of 2 105 cells per well.
  • the cells are then washed and placed in RPMI 1640 medium containing 1 mg / ml of purified human albumin fraction IV.
  • the products are added to the extracellular medium. Simultaneously, the cells are then activated by adding lipopolysaccharide (LPS) during
  • IL-1beta 3 hours at 1 ⁇ g / ml followed by an incubation of 30 minutes in the presence of ATP at 5 mmol / L.
  • concentrations of IL-1beta and controlling IL-1 alpha, tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) and IL-6 are determined by ELISA kits according to the manufacturers' instructions (R&D Sytem; IL-1 Human beta Chemiluminescent ELISA reference QLB00).
  • the variations in mRNA of IL-1beta which is not supposed to be affected are evaluated by the technique of Nothern blot with the corresponding probe.

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Abstract

La présente invention concerne des acides nucléiques correspondant aux différents exons et introns du gène ABC1, dont il est présentement démontré qu'il est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, plus particulièrement des perturbations du transport inverse du cholestérol, et plus particulièrement des déficiences familiales en HDL (FHD), comme la maladie de Tangier.

Description

ACIDES NUCLEIQUES ET PROTEINES CORRESPONDANT AU GENE ABCl HUMAIN
La présente invention concerne des acides nucléiques correspondant aux différents exons et introns du gène ABC1 , dont il est présentement démontré qu'il est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, plus particulièrement des perturbations du transport inverse du cholestérol, et plus particulièrement des déficiences familiales en HDL (FHD), comme la maladie de Tangier. L'invention concerne également des moyens de détection de polymorphismes en général, et de mutations en particulier, dans le gène ABC1 ou dans la protéine correspondante produite par la forme allélique du gène ABCL L'invention fournit également des compositions pharmaceutiques comprenant un acide nucléique contenant la région codante du gène ABC1 et des compositions pharmaceutiques contenant la protéine ABC1 destinées au traitement de maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol, telle que la maladie de Tangier.L'invention forunit également des méthodes de criblages de petites molécules agissant sur la protéine ABC1 qui peuvent par elle même constituer des produit agissant sur le transport inverse du cholestérol et en tant que telles, peuvent permettre de lutter efficacement contre l'athérosclérose du point de vue thérapeutique.
Les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont l'une des quatre classes majeures de lipoprotéines qui circulent dans le plasma sanguin.
Ces lipoprotéines sont impliquées dans différentes voies métaboliques telles que le transport lipidique, la formation des acides biliaires, la stéroïdogénèse, la prolifération cellulaire et en outre interfèrent avec les systèmes de protéinase plasmatique.
Les HDL sont de parfaits accepteurs de cholestérol libre et, en combinaison avec les protéines de transfert d'ester de cholestérol (CETP), la lipoprotéine lipase (LPL), la lipase hépatique (HL) et la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT), jouent un rôle majeur dans le transport inverse du cholestérol, c'est à dire le transport du cholestérol en excès dans les cellules périphériques vers le foie pour son élimination de l'organisme sous forme d'acide biliaire. II a été démontré que les HDL jouent un rôle central dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Diverses maladies liées à une déficience en HDL ont été décrites, comprenant la maladie de Tangier, la déficience en HDL et la déficience en LCAT.
La déficience impliquée dans la maladie de Tangier est reliée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraînent une dégradation des HDLs. Néanmoins, pour la maladie de Tangier, la nature exacte du déficit n'a pas encore été précisément définie.
Dans la maladie de Tangier, ce déficit cellulaire conduit à une perturbation du métabolisme lipoprotéique. Les particules HDL n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDL n'assurent plus le retour du cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoquent des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées.
La maladie de Tangier, dont les symptômes ont été décrits ci-dessus, est classée parmi les affections familiales liées au métabolisme des HDL qui sont les plus couramment détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes.
De nombreuses études ont montré qu'un niveau réduit de cholestérol HDL est un excellent facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.
Dans ce contexte, des syndromes liés aux déficiences en HDL ont présenté un intérêt accru durant la décennie passée du fait qu'elles permettent d'accroître la compréhension du rôle des HDL dans l'athérogénèse. Plusieurs mutations dans le gène apo A-l ont été caractérisées. Ces mutations sont rares et peuvent conduire à une absence de production d'apo A-l.
Des mutations dans les gènes codant pour la lipoprotéine lipase (LPL) ou son activateur apoC-ll sont associées à des hypertriglycéridémies sévères et des niveaux de HDL-c fortement réduits. Des mutations dans le gène codant pour l'enzyme lécithine: cholestérol, acyltransférase (LCAT) sont également associées à une déficience sévère en HDL.
De plus, des dysfonctionnements dans le transport inverse du cholestérol pourraient être induits par des déficits physiologiques affectant une ou plusieurs des étapes de transport du cholestérol stocké, des vésicules intracellulaires vers la surface membranaire au niveau de laquelle celui-ci est pris en charge par les HDL.
Il existe donc un besoin croissant dans l'état de la technique d'identifier des gènes impliqués dans l'une quelconque des étapes du métabolisme du cholestérol et/ou des lipoprotéines, et en particulier de gènes associés à des dysfonctionnements du transport inverse du cholestérol des cellules périphériques vers le foie.
Récemment, une étude de la ségrégation de différentes formes alleliques de 343 marqueurs microsatellites répartis sur l'ensemble du génome et distants entre eux en moyenne de 10,3 cM a été réalisée.
L'étude de liaison (linkage) a porté sur une famille bien caractérisée sur onze générations, dont de nombreux membres sont affectés par la maladie de Tangier, la famille comportant cinq lignées de consanguinité. Cette étude a permis d'identifier une région localisée dans le locus
9q31 du chromosome 9 humain statistiquement associé à l'affection (Rust S. et al., Nature Genetics, vol. 20, Septembre 1998, pages 96-98).
Toutefois, l'étude de RUST et al. définit seulement une large région du génome dont des altérations sont susceptibles d'être associées à la maladie de Tangier. Il est simplement précisé que la région 9q31 -34 concernée contient des ESTs mais aucun gène connu.
Il a désormais été montré selon l'invention qu'une région d'environ 1cM située dans le locus 9q31 chez l'homme était associée, de manière générale, à des déficiences familiales en HDL. De manière plus précise, il a été montré qu'un gène codant pour une protéine de la famille des transporteurs ABC, localisé précisément dans la région de 1 cM du locus 9q31 , était impliqué dans des pathologies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol. Plus particulièrement, il a été montré selon l'invention que le gène codant pour le transporteur ABC-1 était muté chez des patients affectés dans le transport inverse du cholestérol, et tout particulièrement chez des patients atteints de la maladie de Tangier. Les protéines transporteurs ABC (" ATP-binding cassette ") constituent une famille de protéines qui sont extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme.
Les protéines transporteurs ABC sont impliqués dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes.
La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de déterminer que ces protéines avaient une structure générale commune, notamment deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF.
Plusieurs des protéines transporteurs ABC qui ont été identifiées chez l'homme, ont été associées à diverses maladies.
Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à des mutations dans le gène codant la protéine MDR (multi-drug résistance), qui a également une structure de transporteur ABC.
D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US n°5,858,719) ou encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, telle que la protéine ABC-3.
De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2, semble impliquer dans une forme de cholestasie intrahépatique familiale progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.
En 1994, un ADNc codant pour un nouveau transporteur ABC de souris a été identifié et désigné ABC1 (Luciani et al., 1994). Cette protéine est caractéristique des transporteurs ABC en ce qu'elle comporte une structure symétrique comprenant deux domaines transmembranaires liés à un segment hautement hydrophobe et à deux motifs NBF.
Chez l'homme, un ADNc partiel comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte du transporteur ABC1 humain a été identifié (Langmann et al., 1999).
Il a également été montré que le gène codant pour la protéine ABC1 humaine est exprimé dans divers tissus, et plus particulièrement à des niveaux élevés dans le placenta, le foie, le poumon, les glandes surrénales ainsi que les tissus fœtaux. Ces auteurs ont également montré que l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 humaine était induite pendant la différenciation des monocytes en macrophages in vitro. De plus, l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 est augmentée lorsque les macrophages humains sont incubés en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).
Toutefois, le rôle exact de la protéine ABC1 humaine dans le système de transport des lipides est totalement inconnu. Il est simplement supposé que la protéine ABC1 possède une activité de translocase des phospholipides. II a désormais été montré selon l'invention que des patients atteints de la maladie de Tangier comportaient un gène ABC1 muté. Plusieurs mutations distribuées dans différents exons du gène ABC1 ont été identifiées dans le génome de différents malades, en particulier de malades affectés d'une forme sévère de la maladie associée à des désordres coronariens. Par ailleurs, divers polymorphismes ont été trouvés à la fois dans les exons et dans les introns du gène ABC1 chez des patients atteints de formes plus légères de la maladie, indiquant que ces patients portent des allèles particuliers du gène, distinct du ou des allèles " sauvages ". De tels allèles, en partie caractérisables par ces polymorphismes, sont par ailleurs susceptibles de contenir des substitutions, additions ou délétions de nucléotides dans des régions non codantes localisées respectivement du côté 5' du premier exon ou encore du côté 3' du dernier exon du gène, en particulier dans des régions régulatrices, par exemple dans des séquences promotrices ou encore dans des séquences activatrices (en anglais " enhancer "), de nature à induire des défauts-augmentation ou diminution- dans la synthèse du polypeptide ABC1 .
Il a ainsi été identifié une' première mutation particulière chez un patient atteint de la maladie de Tangier, dans le gène ABC-1 , qui est localisée dans l'exon 13, et qui consiste en une substitution d'un nucléotide provoquant l'introduction d'un codon d'arrêt de traduction précoce dans la phase ouverte de lecture, conduisant à la synthèse d'un polypeptide tronqué comprenant environ d'un quart de la séquence d'acides aminés du polypeptide synthétisé chez les patients non affectés par la maladie de Tangier. Une seconde mutation particulière dans le gène ABC1 a été trouvée, qui consiste en une insertion d'un fragment de 100 nucléotides dans l'exon 12, conduisant à la synthèse d'un polypeptide anormal en ce qu'il contient une délétion de 6 résidus et une insertion de 38 amino-acides, ce en position 468 de la séquence de la protéine. II a en outre été confirmé selon l'invention que le gène ABC1 était régulé positivement par les lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).
DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple un polynucleotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucleotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucleotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucleotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucleotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucleotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucleotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucleotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucleotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucleotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucleotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse. En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides. De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial. Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie. On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucleotide plus grand duquel il est constitutif. De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 8, 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention. Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.
Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.
De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 100, 200 ou 300 acides aminés. Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE,
GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F AltschuI et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F AltschuI et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité de repeats.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures. 3- HYBRIDATION :
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65°C.
- 2 fois 15 minutes à 65°C SSC 1X et SDS 0,1% à 65°C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1999). ACIDES NUCLEIQUES DU GENE ABC1 SEQUENCES GENOMIQUES
Le gène ABC1 humain comprendrait 48 exons et 47 introns, si l'on se réfère notamment à la structure du gène ABC1 orthologue chez la souris-.
Plusieurs séquences nucleotidiques génomiques partielles du gène ABC1 ont été isolées et caractérisées selon l'invention, ces séquences génomiques comprenant à la fois des séquences exoniques et des séquences introniques nouvelles, qui peuvent être utilisées notamment pour la réalisation de différents moyens de détection du gène ABC1 ou de ses produits d'expression nucleotidiques dans un échantillon. Ces séquences génomiques partielles sont représentées dans le tableau 1 ci-après.
Tableau I Séquences génomiques partielles du gène ABC1 humain
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Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 1 -14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 1 -14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Trente deux exons du gène ABC1 ont été caractérisés, au moins partiellement, par leur séquence nucléotidique, comme indiqué dans le Tableau II ci-dessous.
Tableau II
Figure imgf000015_0002
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Ainsi, l'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 15-47 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Par ailleurs, trente-cinq introns du gène ABC1 ont été isolés et caractérisés, au moins partiellement. Les séquences nucleotidiques des introns du gène ABC1 , ainsi que leurs fragments et leurs variants peuvent aussi être utilisés comme sondes ou amorces nucleotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABC1 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène ABCL
Les références aux séquences introniques du gène ABC1 sont indiquées dans le Tableau III ci-dessous.
Tableau III
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L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a en outre pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
En outre, une séquence nucléotidique génomique potentiellement régulatrice localisée en aval de l'extrémité 3' du dernier exon du gène ABC1 a été isolée. Il s'agit du polynucleotide de séquence SEQ ID NO 90. La caractérisation de polymorphismes dans cette séquence potentiellement régulatrice (présence éventuelle de séquences régulatrices de type activatrice ou " enhancer "), en particulier chez des patients affectés de formes légères de déficit dans le transport inverse du cholestérol, en particulier de formes légères de la maladie de Tangier, serait de nature à permettre la réalisation de moyens de détection appropriés, sondes ou amorces, spécifiques de certains de ces polymorphismes susceptibles d'induire des défauts dans la régulation de l'expression du gène ABC1.
Afin d'identifier les fragments polynucléotidiques biologiquement actifs de la séquence SEQ ID NO 90, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) qui décrit l'utilisation d'un vecteur recombinant portant un gène marqueur (par exemple la β galactosidase, la chloramphenicol acétyl transférase, etc.) dont l'expression peut être détectée lorsque ce gène marqueur est placé sous le contrôle d'un promoteur adapté et d'un fragment biologiquement actif du polynucleotide de séquence SEQ ID NO 90. De tels fragments biologiquement actifs de la séquence SEQ ID NO 90 peuvent être notamment clones dans des vecteurs de sélection de séquences régulatrices appropriés, tels que l'un des vecteurs pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Enhancer, ou encore pEGFP-1 , commercialisés par la Société Clontech.
L'invention a en outre pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
I
ADNc COMPLET
Comme déjà indiqué précédemment, une séquence partielle de l'ADNc correspondant à l'expression du gène ABC1 a été identifiée par Langman et al. (1999). Cette séquence partielle de l'ADNc d'ABCI comprend 6880 nucléotides et contient la totalité de la phase ouverte de lecture correspondant à la protéine ABC1 produite chez les sujets non affectés de troubles liés au transport inverse du cholestérol. La séquence d'ADNc décrite par Langmann et al . (1999) contient en outre une partie de la région 5'-UTR (nucléotides 1 à 120) et une partie de la région 3'-UTR (nucléotides 6727 à 6880).
Il a désormais été isolé et caractérisé selon l'invention la totalité de l'ADNc complet correspondant au gène ABC1 , qui comprend une région 3'- UTR nouvelle , qui constitue une région nucléique importante, notamment du point de vue de la stabilité des ARN messagers dans la cellule.
Les analyses d'expression du transcrit de séquence SEQ ID N°91 ont été réalisées par RT-PCR, comme décrit dans l'Exemple 1. Ces analyses effectuées à partir d'ARN polyA+ de différents tissus ont permis de montrer que le gène ABC1 était exprimé dans le cerveau fœtal, le cerveau, le cœur, le placenta et l'utérus.
En conséquence, l'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 91 de l'ADNc du gène ABC1 humain, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. L'ADNc du gène ABC1 humain de séquence SEQ ID NO 91 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 121 (base A du codon d'initiation de la traduction ATG) au nucléotide en position 6723 de la séquence SEQ ID NO 91. Un signal de polyadénylation (de séquence ATTAAA) est présent, débutant au nucléotide en position 9454 de la séquence SEQ ID NO 91. L'ADNc de séquence SEQ ID NO 91 code pour le polypeptide ABC1 d'une longueur de 2201 acides aminés, et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 139.
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a aussi pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
POLYMORPHISMES AU SEIN DU GENE ABC1 MUTATIONS
Selon l'invention, plusieurs mutations ont été identifiées dans la séquence du gène ABCL ces mutations conduisant à des altérations structurales majeures du polypeptide ABC1 codé par les séquences mutées. Ces mutations ont été retrouvées particulièrement dans des patients atteints de formes sévères de la maladie de Tangier, associées à de graves désordres coronariens. Deux mutations particulièrement délétères sont décrites ci-après.
1. Mutation dans l'exon 12
Cette mutation consiste à la fois en une délétion d'un segment de 14 nucléotides (" TGAGAGGAAGTTCT ") localisé du nucléotide en position 472 au nucléotide en position 485 de l'ADN génomique normal de séquence SEQ ID NO 2 et en une insertion d'une séquence de type Alu de 110 nucléotides au sein de la séquence de l'exon12 du gène ABCL en amont du nucléotide en position 486 de l'ADN génomique normal de séquence SEQ ID NO 2. L'exon 12 portant cette mutation de délétion/insertion a la séquence nucléotidique SEQ ID NO 93.
L'ADNc muté correspondant a la séquence nucléotidique SEQ ID NO 94, code pour un polypeptide ABC1 muté d'une longueur de 2233 acides aminés, de séquence SEQ ID NO 140, dont la structure est fortement altérée par rapport au polypeptide ABC1 normal de séquence SEQ iD NO 139.
Les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93 et 94 ainsi que la séquence polypeptidique SEQ ID NO 140 font également partie de l'invention.
2 Mutation dans l'exon 13
Cette mutation consiste en une délétion du nucléotide (G) en position
1232 de la séquence génomique SEQ ID NO 2, qui est localisé dans l'exon
13 (nucléotide G en position 106 de la séquence de l'exon 13 SEQ ID NO 1 7). Cette délétion ponctuelle d'une base introduit un codon stop dans la phase de lecture normale dans l'ARNm du gène ABC1 .
La séquence de l'exon 13 du gène ABC1 portant cette mutation est le polynucleotide de séquence SEQ ID NO 95.
L'ADNc correspondant à cette mutation dans l'exon 13 du gène ABC1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO 96.
La protéine mutée codée par le gène ABC1 muté ayant une longueur de 574 acides aminés, c'est-à-dire environ le quart de la longueur en acides aminés de la protéine normale. Le polypeptide tronqué a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 141 . Les caractéristiques structurales permettant de différencier les séquences normales des séquences mutées d'ABCI (génomiques, ARN messagers, ADNc) peuvent être mises à profit afin de réaliser des moyens de détections des séquences mutées d'ABCI dans un échantillon, en particulier des sondes hybridant spécifiquement avec les séquences mutées d'ABCI ou encore des couples d'amorces permettant d'amplifier sélectivement les régions du gène ABC1 portant les mutations décrites ci- dessus, la détection de la présence de ces mutations pouvant notamment être effectuée par discrimination de la longueur des fragments d'acide nucléique amplifiés, par hybridation des fragments amplifiés à l'aide des sondes spécifiques décrites ci-dessus, ou encore par séquençage direct de ces fragments amplifiés.
Ainsi, l'invention a encore pour objet un acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, un tel acide nucléique comprend : a) soit au moins deux nucléotides consécutifs de la séquence Alu localisée dans les séquences SEQ ID NO 93 et 94, de préférence 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou 100 nucléotides consécutifs de la séquence Alu localisée dans les séquences SEQ ID NO 93 et 94 ; b) soit au moins les deux nucléotides " CT " situés de par et d'autre de la base G délétée, dans les séquences SEQ ID NO 94 et 95.
Font également partie de l'invention les amorces hybridant avec une séquence nucléique localisée dans la région d'une séquence d'ABCI
(génomique, ARN messager) portant l'une ou l'autre des deux mutations décrites ci-dessus. L'invention concerne en outre un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
AUTRES POLYMORPHISMES D'autres polymorphismes ont été retrouvés au sein de la séquence du gène ABC1 , notamment des substitutions de nucléotides localisées à la fois dans les régions codantes (exons) et dans les régions non codantes.
Concernant les polymorphismes retrouvés au sein des régions codantes, il s'agit essentiellement de substitutions d'un seul nucléotide localisé sur la troisième base des codons du cadre ouvert de lecture d'ABCI , ces substitutions n'entraînant pas de modification quant à la nature de l'acide aminé codé, compte tenu des règles de dégénérescence génétique chez l'homme, bien connues de l'homme du métier.
Ces polymorphismes sont représentés dans la présente description sous la forme de séquences nucleotidiques d'une longueur de 41 bases, la base polymorphe étant localisée au centre du fragment polymorphe. Pour chacun des polymorphismes repérés, chaque allèle est ainsi représenté comme une séquence de 41 bases, le polymorphisme lui-même étant défini par les deux séquences nucleotidiques correspondant respectivement à chacune des formes. Les polymorphismes identifiés dans le gène ABC1 sont représentés dans le Tableau IV ci-dessous.
Tableau IV Polymorphismes retrouvés dans le gène ABC1
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La détection de ces polymorphismes au sein d'un échantillon d'ADN provenant d'un sujet peut par exemple être réalisée par une amplification spécifique de la région nucléotidique d'ABCI contenant la base polymorphe, puis séquençage du fragment amplifié afin de déterminer la nature de l'allèle ou des allèles portés par ledit sujet.
La détection de ces polymorphismes au sein d'un échantillon d'ADN provenant d'un sujet peut aussi être réalisé à l'aide de sondes ou d'amorces nucleotidiques hybridant spécifiquement avec un allèle déterminé contenant l'une des bases polymorphes d'un polymorphisme du gène ABC1 selon l'invention.
A titre illustratif, des amorces nucleotidiques appropriées sont par exemple des amorces dont la base à l'extrémité 3' hybride avec la base localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe du fragment comprenant ledit polymorphisme. Après l'étape d.hybridation de l'amorce spécifique, une étape d'élongation avec un mélange des deux dideoxynucleotides complémentaires de la base polymorphe dudit polymorphisme, par exemple marqués différentiellement par fluorescence, puis une étape détection du signal de fluorescence obtenu permet de déterminer lequel des deux dideoxynucleotides fluorescents différemment marqués a été incorporé et de déduire directement la nature de la base polymorphe présente au niveau de ce polymorphisme.
Différentes approches peuvent être utilisées pour le marquage et la détection des dideoxynucleotides. Une méthode en phase homogène basée sur le FRET ("Fluorescence résonance energy transfer") a été décrite par Chen et Kwok (1997). Selon cette méthode, des fragments amplifiés d'ADN génomique contenant des polymorphismes sont incubés avec une amorce marquée à la fluorescéine à l'extrémité 5', en présence de dideoxynucleotides triphosphate marqués et une polymérase Taq modifiée. L'amorce marquée est allongée d'une base par incorporation du didéoxynucléotide marqué spécifique de l'allèle présent sur la séquence d'ADN génomique complémentaire. A la fin de cette réaction de génotypage, les intensités de fluorescence pour les deux composés marqueurs des dideoxynucleotides marqués sont analysées directement sans séparation ni purification. L'ensemble de ces étapes peut être réalisé dans le même tube et les modifications du signal de fluorescence suivies en temps réel. Selon un autre mode de réalisation, l'amorce allongée peut être analysée par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. La base localisée au niveau du site polymorphique est identifiée par mesure de la masse ajoutée à l'amorce de microséquençage (Haff et Smirnov, 1997).
De telles amorces nucleotidiques peuvent par exemple être immobilisées sur un support. De plus, il est possible d'immobiliser sur un support, par exemple de manière ordonnée, de multiples amorces spécifiques telles que décrites ci-dessus, chacune des amorces étant adaptée à la détection de l'un des polymorphismes du gène ABC1 selon l'invention.
Les polymorphismes du gène ABC1 selon l'invention sont utiles notamment comme marqueurs génétiques dans des études d'association entre la présence d'un allèle donné chez un sujet et la prédisposition de ce sujet à une pathologie donnée, particulièrement à l'une des pathologies déjà associées à la région chromosomique 9q31 préférentiellement à une pathologie liée à un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol. Les méthodes pour l'analyse génétique de caractères (phénotypes) complexes sont de différents types (Lander and Schork, 1994). En général, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utiles dans l'un quelconque des procédés décrits dans l'état de la technique destiné à démontrer une corrélation statistiquement significative entre un génotype et un phénotype. Les polymorphismes bialléliques peuvent être utilisés dans des analyses de liaison ("linkage aπalysis") et dans des procédés de partage d'allèles ("allèle sharing"). De préférence, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utilisés pour identifier des gènes associés à des caractères (phénotypes) détectables en utilisation des études d'association, une approche qui ne nécessite pas le recours à des familles affectées par le caractère, et qui permet en outre l'identification de gènes associés à des caractères complexes et sporadiques.
D'autres méthodes statistiques mettant en œuvre des polymorphismes bialléliques selon l'invention sont par exemple celles décrites par Forsell et al. (1997), Xiong et al. (1999), Horvath et al. (1998), Sham et al. (1995) ou encore Nickerson et al. (1992).
Selon un autre aspect, l'invention concerne également les séquences nucleotidiques du gène ABC1 comprenant au moins un polymorphisme biallélique tel que décrit ci-dessus. Ainsi, l'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 97-108 et comprenant la base polymorphe, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. SONDES ET AMORCES NUCLEOTIDIQUES
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucleotidiques SEQ ID N° 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 94-96 et 97-108 sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène ABC1 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.
Les sondes ou les amorces nucleotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucleotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers. Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABC1 sont représentés dans le Tableau V ci-dessous.
Tableau V Amorces pour l'amplification de fragments nucléiques du gène ABC1
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Selon un premier mode de réalisation de sondes et d'amorces préférées selon l'invention, celles-ci comprennent tout ou partie d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 109- 138, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N°EP 0 707 592.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucleotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5- bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez-pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (1991 ) ou encore dans le brevet européen n° EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucleotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex. En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci- avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1 ) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucleotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; 2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucleotidiques sont immobilisées sur un support. Selon un autre aspect, les sondes oligonucleotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucleotidiques telles que décrites ci- dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucleotidiques comprennent un marqueur détectable. Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci- dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucleotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes PCT N° WO 90/150 70 et 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucleotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995. Les amorces nucleotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108, ou encore un variant de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-
108 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucleotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en œuvre le procédé d'amplification tel que défini ci- dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucleotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1 -14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108 ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucleotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucleotidiques telles que décrites ci-dessus.
Selon un premier mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 109 et 1 10, permettant d'amplifier la région de l'exon 12 du gène ABC1 portant la première mutation (délétion/insertion) décrite ci-dessus, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire. Selon un second mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 111 et 112, permettant d'amplifier la région de l'exon 13 du gène ABC1 portant la seconde mutation (délétion d'une base G) décrite ci-dessus, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.
Selon un troisième mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent, de manière générale, tout ou partie d'un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 109- 138, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.
Selon un quatrième mode de réalisation préféré, l'invention a également trait à des amorces nucleotidiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 97-108 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire du nucléotide localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi des amorces nucleotidiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 97-108 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires. Pour construire des amorces dont le nucléotide à l'extrémité 3' est complémentaire d'un nucléotide localisé à plus de 20 nucléotides du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108, l'homme du métier se référera avantageusement à la séquence génomique correspondante parmi les séquences SEQ ID NO 1 -14 ou encore SEQ ID NO 15-47 et 48-90, comprenant le polymorphisme dont la nature de l'allèle est recherchée.
De telles amorces sont particulièrement utiles dans le cadre de procédés de génotypage de sujets et/ou de génotypage de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre des formes allèles particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières (haplotypes) chez des sujets et l'existence d'un phenotype (caractère) particulier chez ces sujets, par exemple la prédisposition de ces sujets à développer des maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol, ou encore la prédisposition de ces sujets à développer une pathologie dont la région chromosomique candidate se situe sur le chromosome 9, plus* précisément sur le bras 9q et plus précisément encore dans le locus 9q31 .
VECTEURS RECOMBINANTS L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 92 ou un fragment biologiquement actif de ce dernier ; b) un acide nucléique comprenant un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 91 , 94 ou 96 ; c) un acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 15-47 et 48-90 d) un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N015-47 et 48-90 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 15-47 et 48-90, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin. Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1 ) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des séquences aetivatrices (" enhancers ") ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1 ) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lad, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda. Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996).
Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABC1 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (1992, 1994).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223- 3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene). II peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivées de Spodoptera frυgiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5. Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), ou encore McLaughlin BA et al. (1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces derniers doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol.
Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., 1973 ; Chen et al., 1987), le DEAE Dextran (Gopal, 1985), l'électroporation (Tur-Kaspa, 1896 ; Potter et al., 1984), la microinjection directe (Harland et al., 1985), Les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
Une fois que le polynucleotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule. L'intégration peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucleotide peut être maintenu de manière stable dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire. Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucleotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur pharmaceutiquement compatible et un polynucleotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucleotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.
Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N° WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) et de Huygen et al. (1996) .
Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo de la protéine ABCL Cette composition comprend un polynucleotide codant pour le polypeptide ABC1 placé sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.
La quantité de vecteur qui est injecté à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100 μg du polynucleotide codant la protéine ABC1 ans le corps d'un animal, de préférence d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit dans le transport inverse du cholestérol ou ayant déjà développé cette maladie, en particulier un patient ayant une prédisposition pour la maladie de Tangier ou ayant déjà développé, la maladie. En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un acide nucléique codant pour la protéine ABC1 , en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. Avantageusement, une telle composition comprendra le polynucleotide de séquence SEQ ID NO 91 , placé sous le contrôle des éléments de régulation appropriés.
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un vecteur recombinant selon l'invention, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique selon l'invention, codant pour la protéine ABC1 , pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant un acide nucléique codant pour la protéine ABC1 , pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs
La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies liées au transport du cholestérol par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'un gène codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et efficace des pathologies associées comme par exemple l'Athérosclérose.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891 ), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431 ), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABCL De manière particulièrement avantageuse, la demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique. La présente invention résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression du gène ABC1 . En particulier, la présente invention montre que l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés de ce gène pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV) permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.
La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies cardiovasculaires et neurologiques liées aux anomalies du transport du cholestérol. L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol.
L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies cardiovasculaires.
La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active.
La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABC1 dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo de ABC1 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.
La présente invention est particulièrement avantageuse car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABC1 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative de la protéine ABC1 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.
L'activité de transporteur du cholestérol produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABC1 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagénèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des- expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABCL Un dérivé de ces protéines ABC1 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité transporteur de cholestérol. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans les exemples la mesure de l'efflux de cholestérol à partir des cellules. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la • présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant pour la protéine ABC1 Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1 , Beard et al., Virology 75 (1990) 81 ), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABCL Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1- L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en œuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABC1 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABC1 (Demande de brevet Français FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991 ) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABC1. La recombinaison homologue se produit après co- transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5.139,941 , EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABC1 , ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABC1 selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861 ,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en œuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de transport de cholestérol. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale. Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en œuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 , pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4.861.719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotente, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises ne culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 sous le contrôle de promoteurs viraux, non viraux, non viraux et spécifiques des macrophages ou encore sous le contrôle de son propre promoteur. Ces cellules sont alors re-introduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules sanguines exprimant la protéine ABC1 , notamment à l'origine des monocytes qui, transformés en macrophages, participent à l'élimination du cholestérol de la paroi artériel. Ces macrophages exprimant la protéine ABC1 auront une capacité accrue à métaboliser le cholestérol en excès et le mettront à disposition à la surface cellulaire pour son élimination par les accepteurs primaires du cholestérol membranaire.
Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABC1 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir de signaux d'expression homologues ou hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression de la protéine ABCL II peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, α-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie ; Apo Al, Apo Ail, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique codant pour une la protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe. Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 10^ pfu/ml, et de préférence 106 à 101 υ pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation. A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souche totipotente ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21 a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABC1 biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus. Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 10^ à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 10^ à 10^.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou biocompatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglyceridémie, ou, dans le domaine des affections cardiovasculaires, l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 91 , 94 ou 96
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que ci-dessus décrit. Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes :
a) cellules hôtes procaryotes: souches ά'Escherichia coli (souche DH5-α), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ;
b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N°CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N°CCL70), cellules COS (ATCC N°CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N°CRL 1711), cellules CHO (ATCC N°CCL-61 ) ou encore cellules 3T3 (ATCC N°CRL-6361 ).
POLYPEPTIDES ABC1 MUTES Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide codé par un gène ABC1 muté, et plus particulièrement un gène ABC1 muté chez des patients atteints d'un déficit dans le transport inverse du cholestérol, tout particulièrement chez des patients atteints de la maladie de Tangier.
Comme déjà indiqué précédemment, deux mutations délétères ont été identifiées chez des patients atteints de la maladie de Tangier.
La première mutation correspond à l'insertion d'un fragment d'une centaine de paires de bases au sein de la séquence codante, au niveau de l'exon 12 du gène ABC1 , conduisant à la production d'un polypeptide biologiquement inactif de 2233 acides aminés de séquence SEQ ID NO 140. Le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140 possède, par rapport au polypeptide normal de séquence SEQ iD NO 139, les différences suivantes : a) une délétion d'un fragment peptidique de séquence " DERKFW " et le remplacement de ce fragment peptidique par la séquence " EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG "codée par ' le fragment nucléotidique de type Alu inséré.
La seconde mutation concerne l'introduction d'un codon stop précoce dans le premier quart de la séquence codante, au niveau de l'exon 13 du gène ABC1 , conduisant à la production d'un polypeptide tronqué ayant 574 acides aminés de séquence SEQ ID NO 141. En outre, la délétion de la base G induit un changement du cadre de lecture conduisant à une protéine dont l'extrémité COOH-terminale ne se retrouve pas dans la séquence d'acides aminés du polypeptide ABC1 normal. Il s'agit de la séquence COOH-terminale " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG " du polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141.
Ces deux polypeptides sont utiles notamment pour la préparation d'anticorps les reconnaissant spécifiquement. De tels anticorps constituent des moyens de détection de la production de ces polypeptides ABC1 mutés dans un échantillon provenant d'un sujet à tester, préférentiellement d'un patient présentant des symptômes caractéristiques d'un déficit dans le transport inverse du cholestérol, et de manière tout à fait préférée chez un patient présentant les symptômes caractéristiques de la maladie de Tangier.
Selon un autre aspect, l'invention concerne donc un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés SEQ ID NO 140.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés SEQ ID NO 141.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141 , ou un fragment peptidique de ce dernier.
Un premier fragment peptidique préféré comprendra au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140.
Un second fragment peptidique préféré comprendra au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141.
Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141 , ou un fragment peptidique de ce dernier.
De préférence, des polypeptides selon l'invention auront une longueur de 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100 ou 200 acides aminés consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un polypeptide de séquence en acides aminés choisie parmi les séquences
SEQ ID N°140 et 141.
Alternativement, un polypeptide selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100 ou 200 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'invention, plus particulièrement d'un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO 140 et 141 .
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141 , ou d'un fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immuπoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1989). Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par Houben Weyl (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield (1965a; 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO 140 et 141 , ou de leurs fragments ou variants.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.
On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par Koch (1977). Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
Font également partis de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2).
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés.
ANTICORPS
Les polypeptides ABC1 mutés selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID NO 140-141] ou les fragments de ces derniers ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps, notamment en vue de détecter la production de formes altérés du polypeptide ABC1 chez un patient.
Un premier anticorps préféré selon l'invention est dirigé contre un fragment peptidique comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140.
Un second anticorps préféré selon l'invention est dirigé contre un fragment peptidique comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141 .
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monocloπaux ou des fragments
(par exemple les fragments F (ab)'2) Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention .
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975). La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N° 4,946,778 ou encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages Ridder et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés Reinmann et al. (1997); Léger et al., (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon. Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en. outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, la mention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic ou pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés.
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET METHODES DE
TRAITEMENT THERAPEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme du cholestérol telle que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité therapeutiquement efficace d'un polynucleotide capable de donner lieu à la production d'une quantité efficace du polypeptide ABC1 normal, en particulier du polypeptide de séquence SEQ iD NO 139. L'invention a en outre pour objet des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme du cholestérol telle que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité therapeutiquement efficace du polypeptide ABC1 normal, en particulier du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139.
De telles compositions pharmaceutiques seront avantageusement adaptées pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une quantité du polypeptide ABC1 allant de 1 μg/kg/jour à 10 mg/kg/jour, de préférence au moins 0,01 mg/kg/jour et de manière tout à fait préférée entre 0,01 et 1 mg/kg/jour.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être indifféremment administrées par voie orale, rectale, parentérale, intra- veineuse, sous-cutanée ou encore intra-dermique.
L'invention concerne aussi l'utilisation du polypeptide ABC1 de séquence SEQ ID NO 139 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
L'invention est enfin relative à une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant une quantité therapeutiquement efficace du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies provoquées par une déficience dans le métabolisme du cholestérol, plus particulièrement dans le transport du cholestérol et encore plus particulièrement dans le transport inverse du cholestérol, une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administrée à un patient un polynucleotide capable de donner lieu à l'expression du polypeptide ABC1 chez ledit patient, ledit polynucleotide étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et ou excipients physiologiquement compatibles. De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un polynucleotide, telle que définie ci-dessus.
Selon encore un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies provoquées par une déficience dans le métabolisme du cholestérol, plus particulièrement dans le transport du cholestérol et encore plus particulièrement dans le transport inverse du cholestérol, une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administrée à un patient une quantité therapeutiquement efficace du polypeptide ABC1 chez ledit patient, ledit polypeptide étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et/ou excipients physiologiquement compatibles.
De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide, telle que définie ci-dessus.
METHODES DE CRIBLAGE D'UN COMPOSE AGONISTE OU ANTAGONISTE DU POLYPEPTIDE ABCL
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi divers procédés de criblage de composés à visée thérapeutique utiles dans le traitement de maladies dues à un déficit dans le métabolisme du cholestérol, particulièrement dans le transport du cholestérol, plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, telles que la maladie de Tangier, ou plus généralement les affections de type FHD.
L'invention est donc également relative à l'utilisation du polypeptide ABC1 , ou de cellules exprimant le polypeptide ABC1 , pour cribler des principes actifs pour la prévention ou le traitement de maladies résultant d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol. Les sites catalytiques et fragments oligopeptidiques ou immunogéniques du polypeptide ABC1 peuvent servir pour cribler des banques de produits par tout une foule de techniques existantes. Le fragment utilisé dans ce type de criblage peut être libre en solution, fixé sur un support solide, à la surface cellulaire ouencore dans la cellule. La formation des complexes de liaisons entre les fragments d'ABCI et l'agent testé peut alors être mesuré.
Une autre technique de criblage de produit qui peut être utilisée dans les criblages à haut flux donnant accès à des produits ayant de l'affinité pour la protéine d'intérêt est décrite dans l'application WO84/03564. Dans cette méthode, appliquée à la protéine ABC1 , différents produits sont synthétisés sur une surface solide. Ces produits réagissent avec la protéine ABC1 ou des fragments de celle-ci et le complexe est lavé. Les produits liant la protéine ABC1 sont ensuite détectés par des méthodologies connues de l'homme de l'art. Des anticorps non neutralisants peuvent aussi être utilisés pour capturer un peptide et l'immobiliser sur un support. Une autre possibilité est d'utiliser un criblage de produit utilisant la compétition d'anticorps neutralisants ABC1 , la protéine ABC1 et un produit potentiellement liant la protéine ABCL De cette manière, les anticorps peuvent être utilisés pour détecter la présence de peptide ayant des motifs antigéniques commun avec ABC1.
Dans les produits à évaluer et permettant d'augmenter l'activité d'ABCI , on mentionnera notamment les homologues d'ATP spécifiques des kinases impliquées dans l'activation de la molécules ainsi que des phosphatases qui pourront éviter la déphosphorylation issue de ces dites kinases. On nommera notamment les inhibiteurs de du type phosphodiestérase (PDE) théophylline et 3--sobutyl-1-methylxanthine ou les activatèurs d'adénylcyclase forskoline.
Aussi, nous revendiquons dans cette invention l'utilisation de tout procédé de criblage de produits basé sur la méthode de translocation du cholestérol (voir l'exemple 17) entre les membranes ou vésicules, et ceci dans tous les types synthétiques ou cellulaires, c'est à dire de mammifères, d'insectes, de bactéries ou de levures exprimant de manière constitutive ou bien ayant incorporés la séquence d'ABCI humaine. A cet effet, des analogues lipidiques marqués peuvent être utilisés.
De même, il a été décrit que la protéine ABC1 permettait le transport d'anion (Becq et al. Journal of Biological Chemistry vol 272, n°5 pages 2695-2699, 1997 et Yamon et al. Blood vol 90, n°8 pages 2911 -2915, 1997) et' ce transport était activé par des inhibiteurs de phosphatase comme l'acide okadaique et l'orthovanadate ainsi que part l'élévation de l'AMPc par des agents comme la forskoline. Nous revendiquons l'utilisation de ce système pour cribler des molécules modulant l'activité de la protéine ABC1 (voir Exemple 18).
Yamon et al (Blood vol 90, n°8 pages 2911 -2915, 1997) ont démontré que la protéine ABC1 de souris était impliquée dans la sécrétion d'une cytokine proinflammatoire IL-1beta dans des macrophages péritoneaux de souris. On peux donc aussi proposer une méthode de criblage de produits modulant l'activité de la protéine ABC1 par détermination du relargague de l'IL-1 beta à partir de tout type cellulaire exprimant deux protéines (voir Exemple 19).
De plus, sachant que la disruption de nombreux transporteurs ont été décrits (van, den Hazel. H., H. Pichler, V. M. M. do, E. Leitner, A. Goffeau, and G. Daum. 1999. PDR16 and PDR17, two homologous gènes of Saccharomyces cerevisiae, affect lipid biosynthesis and résistance to multiple drugs. J Biol Chem. 274 (4):1934-41 ), on peux penser utiliser des mutants cellulaires ayant un phenotype caractéristique et complémenter la fonction de ceux-ci par ABC1 et utiliser l'ensemble à des fin de criblage.
L'invention est également relative à un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) préparer des vésicules membranaires contenant le polypeptide ABC1 et un substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; b) incuber les vésicules obtenues à l'étape a) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) mesurer qualitativement et ou quantitativement la libération du substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; d) comparer la mesure obtenue à l'étape b) avec une mesure de la libération du substrat lipidique marqué par les vésicules n'ayant pas préalablement été incubées avec le composé candidat agoniste ou antagoniste.
Selon un premier aspect du procédé de criblage ci-dessus, les vésicules membranaires sont des vésicules lipidiques synthétiques, qui peuvent être préparées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Selon cet aspect particulier, la protéine ABC1 peut être une protéine ABC1 recombinante.
Selon un second aspect, les vésicules membranaires sont des vésicules de membranes plasmiques dérivées de cellules exprimant le polypeptide ABC1. Il peut s'agir de cellules exprimant naturellement le polypeptide ABC1 ou encore de cellules transfectées avec un vecteur recombinant codant pour le polypeptide ABC1. Selon un troisième aspect du procédé de criblage ci-dessus, le substrat lipididique est choisi parmi le cholestérol ou la phosphatidyl choline.
Selon un quatrième aspect, le substrat lipidique est marqué radioactivement, par exemple par un isotope choisi parmi le 3H ou 125l.
Selon un cinquième aspect, le substrat lipidique est marqué par un composé fluorescent, tel que le NBD ou le pyrène.
Selon un sixième aspect, les vésicules membranaires comprenant le substrat lipidique marqué et le polypeptide ABC1 sont immobilisées à la surface d'un support solide préalablement à l'étape b).
Selon un septième aspect, la mesure de la fluorescence ou de la radioactivité libérée par les vésicules est le reflet direct de l'activité de transport du substrat lipidique par le polypeptide ABC1.
L'invention est encore relative à un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir des cellules, par exemple une lignée cellulaire, exprimant naturellement ou après transfection le polypeptide ABC1 ; b) incuber les cellules de l'étape a) en présence d'anion marqué par un marqueur détectable ; c) laver les cellules de l'étape b) afin d'éliminer l'excès de l'anion marqué n'ayant pas pénétré dans ces cellules ; d) incuber les cellules obtenues à l'étape c) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 ; e) mesurer l'efflux de l'anion marqué ; f) comparer la valeur de l'efflux de l'anion marqué déterminé à l'étape e) avec la valeur de l'efflux de l'anion marqué mesuré avec des cellules n'ayant pas préalablement été incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1. Selon un premier aspect du procédé de criblage ci-dessus, les cellules mises en œuvre sont des cellules exprimant naturellement le polypeptide ABCL II peut s'agir de monocytes humains en culture primaire, purifiés à partir d'une population de cellules mononucléées du sang humain. Il peut s'agir aussi de lignées de cellules monocytaires humaines, telles que le lignée leucémique monocytaire THP1.
Selon un second aspect, les cellules mises en œuvre dans le procédé de criblage décrit ci-dessus peuvent être des cellules n'exprimant pas naturellement, ou alternativement exprimant à un faible niveau-, le polypeptide ABC1 , lesdites cellules étant transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention capable de diriger l'expression du polypeptide ABC1
Selon un troisième aspect, les cellules peuvent être des cellules ayant un déficit naturel dans le transport anionique, ou encore des cellules prétraitées avec un ou plusieurs inhibiteurs des canaux anioniques, tels que le Verapamil™ ou le tetra éthylammonium.
Selon un quatrième aspect dudit procédé de criblage, l'anion est un iodure marqué radioactivement, tels que les sels K125l ou Na125l.
Selon un cinquième aspect, la mesure de l'efflux de l'anion marqué- est déterminé périodiquement au cours du temps pendant l'expérience, permettant ainsi d'établir aussi une mesure cinétique de cet efflux.
Selon un sixième aspect, la valeur de l'efflux de l'anion marqué est déterminée par la mesure de la quantité de l'anion marqué présent à un temps donné dans le surnageant de culture cellulaire.
Selon un septième aspect, la valeur de l'efflux de l'anion marqué est déterminée comme la proportion de radioactivité retrouvée dans le surnageant de culture cellulaire par rapport à la radioactivité totale correspondant à la somme de la radioactivité retrouvée dans les lysats cellulaires et de la radioactivité retrouvée dans le surnageant de culture cellulaire.
L'invention a encore pour objet un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) cultiver des cellules d'une lignée monocytaire humaine dans un milieu de culture approprié, en présence d'albumine humaine purifiée ; b) incuber les cellules de l'étape a) simultanément en présence d'un composé stimulant la production d'IL-1 beta et du composé candidat agoniste ou antagoniste; c) incuber les cellules obtenues à l'étape b) en présence d'une concentration appropriée d'ATP ; d) mesurer d'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture cellulaire. e) comparer la valeur de la libération de l'IL-1 beta obtenue à l'étape d) à la valeur de l'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture de cellules n'ayant pas été préalablement incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste.
Selon un premier aspect du procédé de criblage décrit ci-dessus, les cellules utilisées appartiennent à la lignée monocytaire leucémique humaine THP1.
Selon un second aspect du procédé criblage, le composé stimulant la production d'IL-1 beta est un lipopolysaccharide.
Selon un troisième aspect dudit procédé, on détermine également qualitativement et/ou quantitativement la production d'IL-1 alpha, de IL-6 et de TNF alpha par ces cellules.
Selon un quatrième aspect, le niveau d'expression de l'ARN messager codant pour l'IL-1 beta est également déterminé.
L'invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants : La Figure 1 illustre la ségrégation de la mutation par insertion d'une séquence Alu dans l'exon 12 du gène ABC1. L'insertion-délétion dans l'exon
12 du gène ABC1 consiste en une délétion de 14 nucléotides et d'une insertion de 110 nucléotides comme représenté sur la figure 1A. La figure 1 B représente le pédigré Nu et la taille des fragments d'ADN obtenus pour chacun des patients après amplification par PCR de l'exon 12. La piste M correspond aux marqueurs de mobilité (Gibco BRL) . La piste C correspond à un ADN témoin.
La Figure 2 illustre la mutation par délétion d'un seul nucléotide dans l'exon
13 du gène ABCL La séquence du brin complémentaire a été obtenue et est représentée de 3' vers 5'. La séquence codant pour les acides aminés 546 à 552 du polypeptide ABC1 est représentée pour différents patients de la famille étudiée, respectivement pour un individu homozygote (Figure 2-a), hétérozygote (Figure 2-b) et non affecté (Figure 2-c). La séquence de la Figure 2-a a été retrouvée chez trois individus homozygotes, la séquence de la Figure 2-b a été retrouvée chez cinq individus hétérozygotes et la séquence de la Figure 2-c a été retrouvée chez quatre individus non affectés.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Distribution tissulaire des transcrits du gène ABC1 selon l'invention
Le profil d'expression des polynucléotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de Northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (réf. CSH Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). " Molecular Cloπing : A Laboratory Manual, " 2πd éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).
Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de l'ADN complet du gène humain ABC1 de séquence SEQ ID NO 91 est utilisé pour détecter l'ADNc correspondant. La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ (Clontech) rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT II (GibcoBRL, Life Technologies) selon les conditions décrites par le fabricant. La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 μl de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc. Le mélange réactionnel est composé de 400 μM de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0,5 μM de chaque amorce, de 2,5 mM MgCI2, et de tampon PCR. Trente quatre cycles de PCR ( denaturation 30 s à 94 °C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 34 cycles : 64°C 2 cycles, 61 °C 2 cycles, 58°C 2 cycles et 55°C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72°C) sont réalisés après une première étape de denaturation à 94°C durant 10 min dans un thermocycler Perkin Elmer 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par électrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.
Dans le cas d'une analyse par Northern Blot, une sonde d'ADNc produite comme décrit ci-dessus est marquée au 32P grâce au système de marquage d'ADN High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant. Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus.
Le Northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains ((Multiple Tissue Northern , MTN, Clontech) Blot 2, référence 77759-1 ) est hybride avec la sonde marquée.
. Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut être soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel d'utilisation PT1200-1 ) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1999). On pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.
Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml)
+ 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml)
- Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité de séquences répétées.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- HYBRIDATION :
- Oter le mix de pré-hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée. - Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer. ,
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 % à 65°C.
- 2 fois 15 minutes à 65°C SSC 1 X et SDS 0,1 % à 65°C.
Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au contact d'un écran au phosphore révélé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
EXEMPLE 2 : Obtention de l'ADNc complet du gène ABC1
La séquence de la région 3'-UTR de l'ADNc du gène ABC1 humain a été identifiée par recherche dans les bases de données.
Un criblage itératif d'une base de données de séquences EST ( "Genbank mouse human subdivision EST, v.1 1 1 ") a été réalisé à l'aide du logiciel BLAST.
Des amorces oligonucleotidiques ont été synthétisées à partir de la séquence consensus partielle dérivée des séquences EST, afin d'amplifier par une réaction de RT-PCR l'extrémité 3' de l'ADNc du gène ABC1 humain, puis d'en déterminer la séquence. Les amorces oligonucleotidiques utilisées sont les suivantes :
1 . 5'- AAACCAGACAGTAGTGGACG-3', (SEQ ID NO 142)
2. 5'-GTTACTGCCACCAGAACAGC-3', (SEQ ID NO 143)
3. 5'- TGATAAGCTGTTCTGGTGGC-3',(SEQ ID NO 144)
4. 5'-CTTGGCTTTTGCATTGTTGC-3', (SEQ ID NO 145) 5. 5'- CAATGCAAAAGCCAAGAAAG-3',(SEQ ID NO 146)
6. 5'-TGCAACGATGCCATATCAC-3\ (SEQ ID NO 147)
7. 5'-CAACTCCTTACTTCGGTTCCTC-3',(SEQ ID NO 148)
8. 5'-GTTTTCTGAGGTGTCCCAAAG-3'( SEQ ID NO 149)
La transcription inverse de l'ARNm poly(A)+ à partir de tissus de cerveau, de cerveau fœtal, de cœur, d'utérus et de placenta (Banques commercialisées par la société Clontech) a été réalisé par élongation à l'aide d'amorces oligodT en utilisant le kit Superscript™ (commercialisé par la société Life Technologies Inc.), selon les instructions du fabricant.
Dans chaque expérience, on a pu exclure la présence d'ADN contaminant du fait de l'absence de polynucléotides amplifiés par PCR dans les échantillons ne contenant pas de transcriptase inverse.
Une réaction PCR a été effectuée sur les produits ayant subi ou non une première étape de trancription inverse dans les conditions suivantes :
- 400 μM dNTP, 2 Unités d'ADN polymérase Taq ( Thermus aquaticus, Ampli Taq Gold, commercialisée par la société Perkin Elmer), 0,5 μM de chacune des amorces, 2,5 mM de Mg Cl2, l'ensemble étant présent dans un tampon pour PCR contenant également 50 ng d'ADN ou environ 25 ng d'ADNc.
- La réaction PCR a été effectuée pendant 30 cycles dans un appareil thermocycleur ("Perkin Elmer 9700 Thermal Cycler") dans des micro-plaques de 96 puits.
- Après une denaturation initiale à 94°C pendant 10 minutes, chaque cycle a été réalisé de la manière suivante :
- étape de denaturation à 94°C pendant 30 secondes; étape d'hybridation pendant 30 secondes (à 64°C pendant 2 cycles, à 61 °C pendant 2 cycles, à 58°C pendant 2 cycles et à 55°C pendant 28 cycles).
- étape d'élongation pendant un temps correspondant à 1 minute par kilobase.
- La réaction PCR est arrêtée par une étape finale d'extension de 7 minutes.
Différentes autres approches peuvent être utilisées pour isoler l'ADNc correspondant à l'ADNc complet de ABC1 .
Par exemple un clone complet peut être directement isolé par hybridation en criblant une banque d'ADNc au moyen d'une sonde polynucléotidique spécifique de la séquence du gène d'intérêt. En particulier une sonde spécifique de 30-40 nucléotides est synthétisée en utilisant un synthétiseur de marque Applied Biosystem/Perkin Elmer selon la séquence choisie.
L'oligonucléotide obtenu est radiomarqué, par exemple au 32P-γ- ATP en utilisant la T4 polynucleotide kinase et est purifié selon les méthodes usuelles (e.g. Maniatis et al. Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY 1982 ou encore F.Ausubel et al . (Current Protocols in Molecular Biology, J.Wiley and Sons Eds, 1989).
La banque de clones contenant l'ADNc que l'on veut cribler est étalée sur milieu de culture en boîte de Pétri (1.5% agar) contenant les antibiotiques appropriés selon les méthodes usuelles citées ci dessus (F.Ausubel et al.). Les colonies ainsi produites après incubation sont transférées sur filtres de nitrocellulose et criblées au moyen de la sonde nucléotidique radiomarquée, selon les méthodes usuelles et les colonies hybridant avec la sonde sont isolées et sous clonées.
L'ADN des clones ainsi repéré est préparé et analysé par séquençage. Les clones contenant les fragments correspondant à l'ADNc complet sont purifiés et reclonés dans le vecteur pcDNA3 selon les protocoles connus de l'homme de l'art et présentés par exemple dans F. Ausubel et al (1989) .
Différentes méthodes sont connues pour identifier les extrémités 5' et 3' du cDNA correspondant aux gènes décrits dans la présente demande. Ces méthodes incluent mais ne se limitent pas au clonage par hybridation, au clonage utilisant des protocoles similaires ou identiques à la 3' ou 5' RACE- PCR (Rapid Amplification of cDNA End-PCR) qui sont bien connues de l'homme de l'art.
Par exemple, on pourra utiliser le kit commercialisé par la société Clontech (Marathon Ready™ cDNA kit , protocole référencé PT1156-1 ) ou alternativement une méthode similaire à la 5'RACE est disponible pour caractériser l'extrémité 5' manquante d'un cDNA (Fromont-Racine et al. Nucleic Acid Res.21 (7) :1683-1684 (1993)). En bref, un oligonucléotide d'ARN est ligaturé à l'extrémité 5' d'une population d'ARNm. Après retrotranscription en cDNA, un jeu d'amorces spécifiques respectivement de l'adaptateur ligaturé en 5' et d'une séquence située en 3' du gène d'intérêt est utilisé en PCR pour amplifier la portion 5' du cDNA recherché. Le fragment amplifié est ensuite utilisé pour reconstruire l'ADNc complet. EXEMPLE 3 : Analyse du profil d'expression génique pour la maladie de Tangier
La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABC1 entraînant le phenotype cellulaire de Tangier peut-être déterminé par hydridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de fibroblastes de sujets atteints ou non de la maladie, selon les méthodes décrites ci-dessous :
1. Préparation des ARN totaux, des ARNm poly(A)+ et de sondes de cDNA Les ARN totaux sont obtenus à partir de cultures cellulaires des fibroblastes de sujets normaux ou bien atteints de la maladie de Tangier par la méthode à l'isothiocyanate de guaπidine(Chomczynski & Sacchi, 1987). Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., 1989) et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., 1997) avec des oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDye™).
2. Hydridation et détection des niveaux d'expressions
Les membranes de verre contenant les séquences présentées dans cette demande de brevet, correspondant au gène Tangier sont hydridées avec les sondes de cDNA, obtenues à partir des fibroblastes (lyer et al., 1999). L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche Microscanner™) permet la quantification des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté.
EXEMPLE 4 : Construction du vecteur d'expression contenant l'ADNc complet de ABC1 dans des cellules de mammifères
Le gène ABC1 peut être exprimé dans des cellules de mammifères. Un vecteur d'expression eucaryote typique contient un promoteur qui permet l'initiation de la transcription de l'ARN , une séquence codant pour la protéine, et les signaux requis pour la terminaison de la transcription et pour la polyadenylation du transcrit. Il contient aussi des signaux supplémentaires comme des enhancers, la séquence (de) Kozak et des séquences nécessaires pour l'épissage de l'ARNm. Une transcription efficace est obtenue avec les éléments early et late des promoteurs du virus SV40, les LTR rétroviraux ou le promoteur early du virus CMV. Cependant des éléments cellulaires comme le promoteur de l'actine peuvent aussi être employés. De nombreux vecteurs d'expression peuvent être employés pour mettre en œuvre la présente invention comme le vecteur pcDNA3.
EXEMPLE 5 : Production des polypeptides ABC1 normaux et mutés.
Le polypeptide ABC1 normal codé par l'ADNc complet de ABC1 dont l'isolement est décrit dans I' Exemple 2 (clonage du cDNA complet), ou encore les polypeptides ABC1 mutés dont l'ADNc complet peut également être obtenu selon les techniques déctites à l'Exemple 2, peuvent être facilement produits dans un système d'expression bactérienne, de cellules d'insectes en utilisant les vecteurs baculovirus ou encore dans des cellules de mammifères avec ou sans les vecteurs du virus de la vaccine. Toutes les méthodes sont aujourd'hui largement décrites et connues de l'homme de l'art. On en trouvera par exemple une description détaillée dans F.Ausubel et al. (1989).
EXEMPLE 6 : Production d'un anticorps dirigé contre l'un des polypeptides ABC1 mutés.
Les anticorps dans la présente invention peuvent être préparés par différentes méthodes (Current Protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl - Massachusetts General Hospital Harvard Médical School, chapitre 11). Par exemple, les cellules exprimant un polypeptide de la présente invention sont injectées dans un animal afin d'induire la production de sérum contenant les anticorps. Dans une des méthodes décrites, les protéines sont préparées et purifiées afin d'éviter des contaminations. Une telle préparation est alors introduite dans l'animal dans le but de produire des antisera polyclonaux de plus grande activité.
Dans la méthode préférée, les anticorps de la présente invention sont des anticorps monoclonaux. De tels anticorps monoclonaux peuvent être préparés en utilisant la technique d'hybridome. (Kόhler et al, Nature 256 :495 (1975) ; Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6 :51 1 (1976) ; Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6:292 (1976) ; Hammeling et al., in : Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 51981 ). En général, de telles méthodes impliquent d'immuniser l'animal (préférentiellement une souris) avec un polypeptide ou, mieux encore, avec une cellule exprimant le polypeptide. Ces cellules peuvent être mises en culture dans un milieu de culture tissulaire adéquat. Cependant, il est préférable de cultiver les cellules dans un milieu Eagle (Earle modifié) supplementé avec 10% de sérum bovin foetal (inactivé à 56°C) et additionné d'environ 10 g l\ d'acides aminés non essentiels, de 1000 U/ml de pénicilline et d'environ 100 μg/ml de streptomycine.
Les splenocytes de ces souris sont extraits et fusionnés avec une lignée cellulaire de myelome adéquate. Cependant, il est préférable d'utiliser la lignée cellulaire de myelome parentale (SP20) disponible à l'ATCC. Après fusion, les cellules d'hybridomes résultantes sont sélectivement maintenues en milieu HAT puis clonées par dilution limite comme décrit par Wands et al. (Gastroentérology 80:225-232 (1981 )). Les cellules d'hybridomes obtenues après une telle sélection sont testées afin d'identifier les clones sécrétant des anticorps capables de se fixer au polypeptide. D'autre part, d'autres anticorps capables de se fixer au polypeptide peuvent être produits selon une procédure en 2 étapes utilisant des anticorps anti-idiotypique une telle méthode est fondée sur le fait que les anticorps sont eux-mêmes des antigènes et en conséquence il est possible d'obtenir un anticorps reconnaissant un autre anticorps. Selon cette méthode, les anticorps spécifiques de la protéine sont utilisés pour immuniser un animal, préférentiellement une souris. Les splenocytes de cet animal sont ensuite utilisés pour produire des cellules hybridomes, et ces dernières sont criblées pour identifier les clones qui produisent un anticorps dont la capacité à se fixer au complexe protéine-anticorps spécifique peut- être bloqué par le polypeptide. Ces anticorps peuvent être utilisés pour immuniser un animal afin d'induire la formation en plus grande quantité d'anticorps spécifiques de la protéine.
Il serait apprécié que Fab et F(ab')2 et les autres fragments des anticorps de la présente invention puissent être utilisés selon les méthodes décrites ici. De tels fragments sont typiquement produits par clivage protéolytique à l'aide d'enzymes telles que la Papaïne (pour produire les fragments Fab) ou la Pepsine (pour produire les fragments F(ab')2). Sinon, les fragments sécrètes reconnaissant la protéine peuvent être produits en appliquant la technologie de l'ADN recombinant ou de la chimie de synthèse. Pour l'utilisation in vivo d'anticorps chez l'homme il serait préférable d'utiliser des anticorps monoclonaux chimériques " humanisés ". De tels anticorps peuvent être produits en utilisant des constructions génétiques dérivés de cellules d'hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus. Les méthodes pour produire les anticorps chimériques sont connus par l'homme de l'art. (Pour revue, voir : Morrison, Science 229 :1202 (1985) ; Oi et al., Biotechnique 4 :214 (1986) ; Cabilly et al., US patent n°4,816,567 ; Taniguchi et al., EP 171496 ; Morrison et al., EP 173494 ; Neuberger et al., WO 8601533 ; Robinson et al., WO 8702671 ; Boulianne et al ; Nature 312 :643 (1984) ; Neuberger et al., Nature 314 : 268 (1985)).
EXEMPLE 7 : Correction du phenotype cellulaire de la maladie de Tangier
La maladie de Tangier est caractérisée par un catabolisme accéléré des particules lipoprotéiques de haute densité (HDL) et une accumulation de cholestérol dans les tissus. Notamment, les fibroblastes de peau des patients atteints de la maladie de Tangier ont une capacité réduite à éliminer leur contenu en cholestérol par le processus d'efflux de cholestérol assuré par l'apolipoprotéine A-l (apoA-l), protéine majeure des HDL (Francis et al., 1995). Cette caractéristique correspondant à une perte de fonction est aussi retrouvée dans d'autres cellules fibroblastiques de patients atteints de déficit familial en HDL (Mardi et al., 1999). La correction du phenotype des fibroblastes de Tangier peut être assurée par la transfection de l'ADNc complet de ABC1 selon l'invention, dans lesdites cellules. L'ADNc est inséré dans un vecteur d'expression qui est ensuite transfecté selon les méthodes décrites ci-dessous :
1. Préparation des cultures fibroblastiques de sujets normaux et de sujets atteints de la maladie de Tangier
Les fibroblastes primaires de peau humaine sont obtenus par la mise en culture de biopsie de peau provenant de l'avant bras. Ces biopsies sont effectuées sur des patients atteints de la maladie de Tangier ayant les particularités cliniques et biochimiques des " homozygotes ", c'est à dire des amygdales oranges, des concentrations plasmatiques d'apoA-l et de cholestérol-HDL inférieur au 5èmθ percentile. Les lignées de fibroblastes normaux sont obtenus chez l'American Type Culture Collection (Rockville, MD). Les fibroblastes sont cultivés dans un milieu EMMEM (Eagle-modified minimium essential médium ; GIBCO) complété par 10% de sérum de veau foetal, de la glutamine à 2 mM, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 μg/ml de steptomycine (milieu désigné par EMMEM10). En vue de la réalisation de l'étude de l'efflux de cholestérol, ces cellules sont pré-chargées en cholestérol par incubation de 24 heures avec 50μg/ml de cholestérol dans le milieu décrit ci-dessus sans sérum de veau mais contenant 2 mg/ml d'albumine bovine (BSA, fraction V).
2. Etude de l'efflux de cholestérol Les fibroblastes pré-chargés en cholestérol à confluence sur des plaques à 24 puits sont incubés dans le milieu EMMEM10 et 1 μCi/ml de 1 ,2-3H- cholestérol (50 Ci/mmol ; Dupont ; Wilmington, DE) durant 48 heures. Environ 100 000 coups par minute sont obtenus par puits ou 1000 coups par minute et par μg de protéine cellulaire. Les cellules sont lavées trois fois avec du milieu EMMEM/BSA, et incubées avec ce milieu durant 24 heures avant de transfecter le gène d'intérêt et de démarrer l'efflux par ajout de 10 μg/ml de protéoliposome contenant l'apoA-l en milieu EMMEM/BSA. Ces protéoliposomes sont préparés par sonication de phosphatidylcholine et d'apoA-l humaine purifiée (Jonas, 1986). La transfection cellulaire s'effectue par la technique de précipitation de phosphate de calcium (Sambrook et al., 1989). Après la période d'efflux, en général 20 heures, le milieu est collecté, centrifugé (1000 g, 5 min), et la radioactivité déterminée par comptage en scintillation liquide. La radioactivité résiduelle dans les cellules est aussi déterminée sur la nuit après extraction des lipides dans l'isopropanol. Le pourcentage d'efflux est calculé en divisant la radioactivité mesurée dans le surnageant par la somme des radioactivités mesurées, dans le surnageant et l'extrait cellulaire. Un contrôle interne est réalisé par transfection d'un gène marqueur et l'incubation sur 24 heures avec un milieu EMMEM/BSA sans protéoliposome contenant PapoA-l. L'efflux de cholestérol cellulaire à partir de fibroblastes normaux et transfectes par un gène témoin correspondent à 6±2% alors que celui obtenu à partir de fibroblastes atteints de la maladie de Tangier et transfectes par ce gène témoin est inférieur à 1%. En revanche la transfection des fibroblastes atteints de la maladie de Tangier par un plasmide contenant l'ADNc complet ou encore l'ADN génomique de ABC1 selon l'invention permettrait de restaurer la capacité de ces cellules à éliminer leur excès de cholestérol à un niveau correspondant à celui de fibroblastes normaux.
EXEMPLE 8 : Isolement et caractérisation de fragments génomiques du gène ABC1 humain.
Un fragment d'environ 3 kb de l'ADNc de ABC1 humain a été obtenu à partir du clone d'ADNc désigné " pf10 " contenant le premier domaine de fixation de l'ATP de ABCL ce clone d'ADNc étant décrit dans l'article de Luciani ét al. (1994).
Ce fragment d'ADNc obtenu par digestion du clone pf10 à l'aide de l'endonucléase de restriction EcoRI, a été isolé sur un gel d'agarose après électrophorèse, puis marqué avec la digoxigénine selon les instructions du constructeur (kit commercialisé par Boehringer Mannheim, référence 1 585 614)
Le fragment d'ADNc marqué a été utilisé afin de cribler la banque de cosmides LLNL (Lawrence Livermore National Labs) du chromosome 9, immobilisés sur un filtre de Nylon™.
Six clones positifs ont été identifiés. Pour ces six cosmides, la sonde a hybride avec des colonies uniques. Un clone représentatif a été isolé à partir de chacune de ces colonies.
Les clones LLNLC 131J087 Q2 (désignés ici cos3a) et LLNLc 13101165 Q2 (désignés ici cos6f) ont été analysés plus en détail.
Le clone cos3a a été sous-cloné sous la forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur Gen3zf(-) et séquence aux deux extrémités en utilisant la technologie Big Dye Terminator sur un séquenceur de type ABI377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer).
Les clones contenant des inserts distincts (déterminés après séquençage des extrémités des différents inserts ou encore par détermination de la taille de ceux-ci) qui étaient de longueur trop grande pour être complètement séquences à l'aide des amorces hybridant avec, les séquences du vecteur, ont été analysés plus avant par la technique d'insertion de transposon puis de séquençage à l'aide d'amorces spécifiques du transposon (système " GPS " commercialisé par la Société New England Biolabs).
De cette manière, des séquences génomiques correspondant au gène ABC1 humain ont été isolées et caractérisées. Ces séquences ont été comparées avec des séquences humaines et de souris référencées dans les bases de données permettant de déterminer les jonction intron-exon..
EXEMPLE 9 : Détermination de polymorphismes/mutations dans le gène ABCL
La détection de polymorphismes et ou de mutations dans les séquences des transcrits ou dans la séquence génomique du gène ABC1 peut être réalisée selon différents protocoles. La méthode de choix est le séquençage direct.
Pour les patients dont on peut obtenir une préparation d'ARNm la méthode de choix consiste à préparer les cDNAs et les sequencer directement, Pour les patients dont on ne dispose que de l'ADN, et dans le cas d'un transcrit où la structure du gène correspondant est inconnue ou partiellement connue il est nécessaire de déterminer précisément sa structure intron-exon ainsi que la séquence génomique du gène correspondant. Il s'agit donc dans un premier temps d'isoler le ou les clones de cosmides ou de BAC d'ADN génomique correspondant au transcrit étudié selon la méthode décrite dans l'exemple 8, de sequencer l'insert du ou des clones correspondants et de déterminer la structure intron-exon en comparant la séquence de l'ADNc à celle de l'ADN génomique obtenu.
La technique de détection de mutations par séquençage direct consiste à comparer les séquences génomiques du gène ABC1 obtenues à partir des homozygotes pour la maladie ou d'au moins 8 individus ( 4 individus affectés par la pathologie étudiée et 4 individus non affectés). Les divergences de séquence constituent des polymorphismes. Tous ceux modifiant la séquence en acides aminés de la protéine sauvage peuvent être des mutations susceptibles d'affecter la fonction de ladite protéine qu'il est intéressant de considérer plus particulièrement pour l'étude de co-ségrégation de la mutation et de la maladie (corrélation génotype-phénotype) dans le pedigree ou encore dans les études d'association cas/témoin pour l'analyse des cas sporadiques.
EXEMPLE 10 : Identification d'un gène causal d'une maladie liée à un déficit du transport inverse du cholestérol par la mutation causale ou une différence transcriptionnelle
Parmi les mutations identifiées selon la méthode décrite dans l'Exemple 9, toutes celles associées au phenotype malade sont susceptibles d'être causales. La validation de ces résultats est faite en séquençant le gène chez tous les individus atteints et leurs apparentés (dont l'ADN est disponible). D'autre part, la réalisation de Northern blot ou RT-PCR, selon la méthode décrite dans l'Exemple 1 , à partir d'ARN spécifique d'individus atteints et non-atteints permet de détecter des variations notables du niveau d'expression du gène étudié, en particulier une absence de transcription du gène.
EXEMPLE 11 : Identification d'une délétion d'un nucléotide dans l'exon 13 du gène ABC1 chez des patients atteints de la maladie de TANGIER L'analyse de mutations dans le gène ABC1 a été réalisée sur de l'ADN génomique de plusieurs individus appartenant à une famille dont plusieurs membres sont atteints de la maladie de Tangier avec des désordres coronariens précoces.
Une délétion d'un nucléotide a été identifiée dans l'exon 13 (DG 1764 : Leu548Leu ;575 End). Cette délétion introduit un codon stop en position 575 qui permet de prédire une troncation de la protéine ABC1 codée par le gène ABC1 muté, cette troncation conduisant à la stnthèse d'un polypeptide délété d'une grande partie de la séquence normale d'acides aminés, et en particulier des deux cassettes de fixation à l'ATP. Une corrélation parfaite entre l'observation des symptômes de la maladie et la présence de cette délétion d'un nucléotide a été retrouvée dans l'ensemble de la famille (Figure 1 ).
EXEMPLE 12 : Identification d'une insertion d'un segment de nucléotides dans l'exon 12 du gène ABC1.
Dans une autre famille dont plusieyrs membres sont atteints de la maladie de Tangier, on a observé une insertion de 1 10 paires de bases ayant la strcture d'une séquence nucléotidique répétée de type Alu-sq, accompagnée d'une délétion de 14 paires de bases dans l'exon 12 (Figure 2). Cette mutation par insertion/délétion permet de prédire une délétion de 65 acides aminés (DERKFW) aisni qu'une insertion en phase de 38 acides aminés (EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG).
Cette mutation ne permet pas la synthèse d'un polypeptide transporteur ABC1 normal. Il epeut donc être conclu que la maladie de Tangier, chez les individus de cette famille, est provoquée par un défaut dans le gène ABCL
EXEMPLE 13. : Identification de polymorphismes bialléliques dans le gène ABC1 Des amorces pour l'amplification de l'ADN des patients ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1 , de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de la structure secondaire durant l'étape d'épissage de l'ARN soit incluses dans les fragments amplifiés.
Les différents couples d'amorces spécifiquement mis au point sont présentés dans le tableau V.
Les résultats trouvés sur l'ADN d'une famille contenant des cas de maladie de Tangier sans complication coronariennes sont montrés dans le tableau IV. L'ADN génomique des patients a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci-dessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq ou encore le kit Supertaq, en utilisant les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur. Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la Société Qiagen, puis séquences par la méthode Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer).
EXEMPLE 14 : Identification d'une région de 1 cM sur le locus 9q31 associée à la maladie de Tangier
Une première analyse de liaison (" linkage ") a été décrite dans l'article de Rust et al. (1998). Cet article a présenté une analyse de liaison sur trois familles de patients atteints de la maladie de Tangier et défini un intervalle candidat de 8 cM en 9q31.
Le demandeur a réalisé une étude de liaison en incluant quatre familles supplémentaires ainsi que des marqueurs additionnels référencés dans des bases de données publiques afin d'affiner la région candidate à environ 1 cM, en référence à la carte génétique publiée par le Généthon (Dib ét al., 1996)
Les résultats d'analyse de liaison présentés ci-après ont permis- au demandeur d'exclure de la région candidate les segments génomiques respectivement proximaux (centromerique) et distaux (télomerique) aux marqueurs D9S271 et D9S1866.
La région candidate est donc localisée entre ces deux marqueurs exclus.
Une information importante ayant permis d'affiner la région candidate a été obtenue à partir de la portion E1 du pedigree décrit dans l'article de Rust et al. (1998). En effet il a été montré sur le chromosome maternel, à l'origine de la partie E121m, que l'événement de recombinaison (crossing- over) déjà décrit dans la figure 2 de cet article (entre les marqueurs D9S277 et D9S53), devait en fait être localisé de façon télomerique par rapport au marqueur D9S271. La borne centromerique de l'intervalle candidat étant située entre D9S271 et D9S277.
Dans deux des nouvelles familles, respectivement la famille " S1 " et la famille " NU ", des événements de recombinaison supplémentaires ont été observés. Ces événements de recombinaison ont permis de déplacer la borne télomerique de l'intervalle candidat, du marqueur D9S1677 (décrit dans l'artcle de Rust et al 1998) au marqueur D9S1866.
Le premier pedigree, " S1 ", a été étendu. Les individus atteints présentent un génotype homozygote pour tous les marqueurs de la région de 8cM ainsi que pour des marqueurs plus lointains, localisés de part et d'autre de cette région. L'un des cousins de l'individu S1 , apparenté à S1 par les deux parents (double consanguinité) possède quatre enfants. Deux de ces enfants présentent sur leur chromosome d'origine paternel une conservation d'une grande partie de l'haplotype malade (dans la région défini de 8 cM). Ces deux enfants présentent également la caractéristique typique des parents hétérozygotes de la famille atteinte de la maladie de Tangier, à savoir un niveau de HDL qui est de moitié le niveau observé chez des patients non affectés par la maladie.
Cependant, le caractère homozygote pour les marqueurs n'est plus observé dans la région chromosomique à partir du marqueur D9S1866 (qui est hétérozygote chez ces individus), ce qui a permis de définir D9S1866 comme borne télomerique de la région candidate.
La même borne télomerique a été observée dans la famille " Nu ", dans laquelle l'un des quatre enfants issus de parents cousins au premier degré, était un patient affecté de la maladie de Tangier homozygote.
Une homozygotie pour les marqueurs sur l'ensemble de la région candidate a été observée chez ce patient.
L'un de ses frères, hétérozygote (au niveau phénotypique), présente un événement de recombinaison (crossing-over) sur l'un des deux chromosomes, de telle manière que ce frère est homozygote (au niveau génétique) pour tous les marqueurs télomériques incluant le marqueur D9S1866, mais hétérozygote (au niveau génétique) pour les marqueurs localisés dans la région vers le centromère. Comme ce patient ne présentait pas un phenotype de patient homozygote, la région télomerique incluant le marqueur D9S1866 a pu être exclue.
EXEMPLE 15: Isolement et caractérisation du gène ABC1 humain.
Un fragment d'environ 3 kb de l'ADNc de ABC1 humain a été obtenu à partir du clone d'ADNc désigné " pf10 " contenant le premier domaine de fixation de l'ATP de ABCL ce clone d'ADNc étant décrit dans l'article de Luciani ét al. (1994).
Ce fragment d'ADNc obtenu par digestion du clone pf 1 0 à l'aide de l'endonucléase de restriction EcoRI, a été isolé sur un gel d'agarose après électrophorèse, puis marqué avec la digoxigénine selon les instructions du constructeur (kit commercialisé par Boehringer Manπheim) Le fragment d'ADNc marqué a été utilisé afin de cribler la banque de cosmides LLNL du chromosome 9, immobilisés sur un filtre de Nylon™.
Six clones positifs ont été identifiés. Pour ces six cosmides, la sonde a hybride avec des colonies uniques.
Un clone représentatif a été isolé à partir de chacune de ces colonies. Les clones LLNLC 131J087 Q2 (désignés ici cos3a) et LLNLc
13101 165 Q2 (désignés ici cosβf) ont été analysés plus en détail.
Le clone cos3a a été sous-cloné sous la forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur Gen3zf(-) et séquence aux deux extrémités en utilisant la technologie Big Dye Terminator sur un séquenceur de type ABI377. Les clones contenant des inserts distincts (déterminés après séquençage des extrémités des différents inserts ou encore par détermination de la taille de ceux-ci) qui étaient de longueur trop grande pour être complètement séquences à l'aide des amorces hybridant avec les séquences du vecteur, ont été analysés plus avant par la technique d'insertion de transposon puis de séquençage à l'aide d'amorces spécifiques du transposon (système " GPS " commercialisé par la Société New Engïand Biolabs).
De cette manière, des séquences génomiques correspondant au gène ABC1 humain ont été isolées et caractérisées. Ces séquences ont été comparées avec des séquences humaines et de souris référencées dans les bases de données.
Les séquences des jonctions intron-exon ont été déterminées.
Des amorces pour l'amplification de l'ADN des patients ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène
ABC1 , de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de la structure en lariat durant l'étape d'épissage soit incluse dans les fragments amplifiés.
L'ADN génomique des patients a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci-dessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq ou encore le kit Supertaq, en utilisant les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur.
Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la Société Qiagen, puis séquences par la méthode Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI377.
EXEMPLE 16: Construction de vecteurs recombinants contenant un polynucleotide codant pour la protéine ABC1 I. Synthèse de du αène ABC1 humain.
De l'ARN total (500 ng) isolé de tissu de placenta humain (Clontech,
Palo Alto, CA, USA) a été utilisé comme source pour la synthèse de l'ADNc du gène ABC1 humain, en mettant en oeuvre le système " Superscript one step RT-PCR (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA ) et les amorces oligonucleotidiques spécifiques de ABC1 (0,25 μM) suivante:
- amorce aller : 5'-CTACCCACCCTATGAACAAC-3' (nt 75-94 de l'ADNc ABC1 );
- amorce retour: 5'-1 GCCACCCCGTATGAACAGGG-3' (nt 6731 -6751 de l'ADNc de ABC1 ). Ces amorces oligonucleotidiques ont été synthétisées par la méthode au phosphoramidite sur un appareil synthétiseur d'ADN de type ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Les sites reconnus par l'enzyme de restriction Notl ont été incorporés dans l'ADNc amplifié de 6676 pb par une nouvelle étape d'amplification en utilisant 50 ng de l'ADNc de ABC1 humain comme matrice, et 0,25 μM des amorces oligonucleotidiques décrites ci-dessus contenant, à leur extrémité 5', le site reconnu par l'enzyme de restriction Notl, en présence de 200μM de chacun desdits dideoxynucleotides dATP, dCTP, dTTP et dGTP ainsi que l'ADN polymérase de Pyrococcus furiosus (Stratagene, Inc. La Jolla, CA, USA).
La réaction PCR a été réalisée pendant 30 cycles comprenant chacun une étape de denaturation à 95°C pendant une minute, une étape de renaturation à 50°C pendant une minute et une étape d'extension à 72°C pendant deux minutes, dans un appareil thermocycleur pour PCR (Cetus Perkin Elmer Norwalk, CT, USA).
II. Clonage de l'ADNc du αène ABC1 humain dans un vecteur d'expression:
L'insert de 6676 pb de l'ADNc de ABC1 humain a été clone au site de restriction Notl du vecteur d'expression pCMV contenant un promoteur précoce du cytomégalovirus et une séquence activatrice (" Enhancer ") ainsi que le signal de polyadenylation de SV40 (Beg et al., 1990; Applebaum-
Boden, 1996), afin de réaliser le vecteur d'expression désigné pABC1.
La séquence de l'ADNc clone a été confirmée par un séquençage sur les deux brins en utilisant la trousse de réaction " ABI Prism Big Dye
Terminator Cycle Sequencing ready " (commercialisée par Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un séquenceur capillaire de type
ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
III. Construction d'un vecteur adénoviral recombinant contenant l'ADNc du αène ABC1 humain.
A- Modification du vecteur d'expression pCMV-6.
L'ADNc de la β-galactosidase du vecteur d'expression pCMV- β(Clontech, Palo Alto, CA, USA, Gène Bank Accession n°U02451 ) a été délété par digestion avec l'endonucléase de restriction Notl et remplacé par un polysite de clonage contenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', les sites suivants: Notl, Ascl, Rsrll, Avril, Swal, et Notl (séquence du polysite de clonage:
5 -CGGCCGCGGCGCGCCCGGACCGCCTAGGATTTAAATCGCGGCCCGCG-3'
ce polysite de clonage ayant été clone au niveau du site Notl.
Le fragment d'ADN compris entre les sites EcoRI et Sanl du vecteur d'expression pCMV modifié a été isolé et clone dans le site Xbal modifié du vecteur navette pXCXII (McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988).
B-modification du vecteur navette pXCXII. Un polysite de clonage comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' les sites de restriction Xbal, EcoRI, Sfil, Pmel, Nhel, Srfl, Pacl, Sali et Xbal (de séquence:
S -GCTCTAGAATTCGGCCTCCGTGGCCGTTTAAACGCTAGCGCCCGGGCTTAATTAA GTCGACTCTAGAGC-3')
a été insérée au niveau du site Xbal (nucléotide en position 3329) du vecteur pXCXII (McKinnon et al., 1982; McGrory et al., 1988).
Le fragment d'ADN EcoRI-Sall isolé du vecteur pCMV-β modifié contenant le promoteur/enhancer de CMV, les sites donneurs et accepteurs d'épissage de FV40 et le signal de polyadenylation de FV40 a ensuite été clone dans le site EcoRi-Sall du vecteur navette pXCX modifié, désigné pCMV-11.
C- Préparation du vecteur navette pAD12-ABC1.
L'ADNc ABC1 humain est obtenu par une réaction de RT-PCR, comme décrit ci-dessus, et clone au niveau du site Notl dans le vecteur pCMV-12, résultant dans l'obtention du vecteur pCMV-ABC1.
L'ADNc ABC1 contenu dans le vecteur pCMV-ABC1 est constitué d'un fragment d'ADN de 6676 pb comprenant la séquence allant du nucléotide en position 75 au nucléotide en position 6751 de l'ADNc ABC1 humain.
P. Construction de l'adénovirus recombinant ABC1.
L'adénovirus recombinant ABCLrldV contenant l'ADNc ABC1 humain a été construit selon la technique décrite par McGrory et al. (1988).
Brièvement, le vecteur pAD12-ABC1 a été cotransfecté avec le vecteur tGM17 selon la technique de CHEN et OKAYAMA (1987).
De même, le vecteur pAD12-Luciferase a été construit et cotransfecté avec le vecteur pJM17. Les adénovirus recombinants ont été identifiés par amplification PCR et soumis à deux cycles de purification avant une amplification à grande échelle dans la lignée de cellules embryonnaires de rein humain HEK 293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Les cellules infectées ont été collectées 48 à 72 heures après leur infection par les vecteurs adénoviraux et soumis à cinq cycles de lyse par congélation et décongélation.
Les lysats bruts ont été extraits à l'aide de Fréon (Halocarbone 113, Matheson Product, Scaucus, N.J. USA), sédimentés deux fois dans le chlorure de césium supplémenté d'albumine murine à 0,2% (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, MO, USA) et dialyses extensivement contre du tampon composé de 150 nM NaCI, 10 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, et 1 mM CaCI2.
Les adénovirus recombinants ont été conservés à -70°C et titrés avant leur administration à des animaux ou leur incubation avec des cellules en culture.
L'absence d'adénovirus contaminant de type sauvage a été confirmée par criblage à l'aide d'amplification PCR en utilisant des amorces oligonucleotidiques localisées sur la partie structurale de la région délétée.
IV Validation de l'expression de l'ADNc ABC1 humain.
Des anticorps polyclonaux spécifiques du polypeptide ABC1 humain ont été préparés chez des lapins et des poussins par injection du peptide synthétique " LHKNQTVVDVAVLTSFLQDEKVKESYV ", dérivé de la protéine ABC1. Ces anticorps polyclonaux sont utilisés pour détecter et/ou quantifier l'expression du gène ABC1 humain dans des cellules et des modèles animaux par immunoempreinte et/ou immunodétection.
L'activité biologique de ABC1 peut être suivie en quantifiant les flux de cholestérol induits par apoA-l à partir de cellules transfectées par le vecteur pCMV-ABCI qui ont été chargées en cholestérol (Remaley et al., 1997).
V. Expression in vitro de l'ADNc abd humain dans les cellules. Des cellules de la lignée HEK293 et de la lignée COS-7 (American Tissue Culture Collection, Betesda, MD, USA), ainsi que des fibroblastes en culture primaire dérivés de patients Tangier ou de patients atteints d'hypo- alphalipoprotéinémie sont transfectes avec le vecteur d'expression pCMV- ABC1 (5-25μg) en utilisant de la Lipofecta ine (BRL, Gaithersburg, MD, USA) ou par co-précipitation à l'aide de chlorure de calcium (Chen et al., 1987).
Ces cellules peuvent être également infectées avec le vecteur pABd-AdV (Indice d'infection, MOI=10). L'expression de ABC1 humain peut être suivie par immunoempreinte ainsi que par quantification de l'efflux de cholestérol induit par apoA-1 à partir de cellules transfectées et/ou infectées.
La complémentation du défaut génétique dont sont atteints les patients Tangier et les patients hypo-alphalipoprotéinémiques à partir de fibroblastes de ces patients, peut être confirmée par la détection de l'expression du gène ABC1 normal, ce qui permet d'établir l'importance fonctionnelle de ce récepteur.
VI. : Expression in vivo du αène ABC1 dans différents modèles animal.
Un volume approprié (100 à 300 μl) d'un milieu contenant l'adénovirus recombinant purifié (pABd -AdV ou pLucif-AdV) contenant de 108 à 109 unités formant des plages de lyse (PFUs) sont infusées dans la veine Saphène de souris (C57BU6, à la fois souris témoins et modèles de souris transgéniques ou knock-out ) au jour 0 de l'expérience .
L'évaluation du rôle physiologique de la protéine ABC1 dans le métabolisme des lipoprotéines est réalisée par détermination de la quantité totale de cholestérol, de triglycérides , de phospholipides et de cholestérol libre (Sigma et Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), de cholestérol-HDL (CIBA-Corning, Oberlin, OH, USA) et des apolipoprotéines A-l, A-Il, E et B de souris (Foger et al., 1997), avant (jour zéro) et après (jours 2, 4, 7, 10, 14) l'administration de l'adénovirus.
Des études cinétiques à l'aide de produits marqués radioactivement tels qu'apoA-l-HDL, CE-HDL ainsi que apoB-LDL et CE-LDL sont réalisées au jour 5 après l'administration des vecteurs rLucif-AdV et rABCLAdV afin d'évaluer l'effet de l'expression de ABC1 sur le métabolisme des HDLs et des LDLs ainsi que sur la libération du cholestérol vers le foie.
L'effet de l'expression de ABC1 sur le développement de l'athérosclérose peut être évalué en quantifiant la surface moyenne de lésion aortique dans des souris apoE après administration du vecteur rABC1 -Adv.
De plus, des souris transgéniques et des lapins surexprimant le gène
ABC1 peuvent être produits, conformément à l'enseignement de Waisman
(1995) et Hoeg (1996) en utilisant des constructions contenant l'ADNc de
ABC1 humain sous le contrôle de promoteurs endogènes tels que ABC1 , CMV ou apoE.
L'évaluation de l'effet à long terme de l'expression de ABC1 sur la cinétique des lipides, lipoprotéines, apolipoprotéines plasmatiques et sur l'athérosclérose pourra être réalisée comme décrit ci-dessus.
EXEMPLE 17 : Utilisation de vésicules pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABCL
La base de cette essai est la reconstitution de membranes ayant incorporé la protéine ABC1 et contenant des substrats comme le cholestérol ou des phopholipides. La protéine ABC1 peut alors être activés ou sa fonction réprimée par l'ajout de molécules d'intérêt. La sortie des substrats par le canal formé par la protéine ABC1 est alors détectée.
a) Reconstitution d'une membrane contenant la protéine ABC1 et un substrat lipidique marqué.
Différentes stratégies peuvent être employées pour fabriquer ces membranes, des méthodes utilisant des solvant organiques, des moyens mécaniques comme la sonication, la " French press ", ou bien par des cycles de congélation- décongélation, ou encore utilisant des détergents (les cholates, le Chaps, Chapso) (référence : Rigaud et al. Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246).
Plus particulièrement, un substrat lipidique comme des phospholipides, du cholestéol ou ester de cholestérol, radioactif du type 3H-cholestérol, 125-1- cholestérol, 3H-phospphatidylcholine ou bien fluorescent avec du NBD ou du pyrene (Molecular Probes ; http ://www.probes.com) et de la phospatidyle- choline d'œuf (1 mM) sont séchés sur le culot d'un flacon en verre. Dans ce flacon sont mélangés à la fois du cholate de sodium et la protéine ABC1 au ratio mole à mole de 0,3. L'ensemble est mélangé au vortex pendant 5 minutes puis incubé à 25°C durant 30 minutes puis dialyse contre un tampon salin. Le protéoliposome réalisé selon ce protocole est suivi par turbidimétrie pour vérifier sa bonne fabrication. - b) Capture du protéoliposome sur une surface solide
Cette étape peut être réalisée en incorporant des protéines de fixation du type intégrine. Dans ce protocole, on utilise une capture par les anticorps dirigés contre la protéine ABC1 et préalablement adsorbée sur une plaque 96 ou 384 puits.
Une solution contenant ces anticorps à la concentration de 100 μg/l sont absorbés sur ces plaques multipuits par incubation sur la nuit à 4°C. Après lavage, la plaque est ensuite saturée par de l'albumine bovine à 1 mg/ml incubé durant 2 heures à 37°C. L'ensemble est encore lavé et incubé avec les protéoliposomes contenant ABC1 durant 2 heures à 37°C. c) Liaison aux molécules d'intérêt
Cette étape est réalisée par incubation de produits durant 1 heure à 37°C d) Détermination de l'activation ou inhibition de la protéine ABC1 Si le substrat est fluorescent, la fluorescence du surnageant nous révèle l'activité de produit à induire un transport de lipide vers l'extérieur du protéoliposome. Ou encore, l'utilisation de système Confocal nous informe sur les quantités de substrat à l'intérieur et l'extérieur du protéoliposome. Si le substrat est radioactif, l'utilisation de plaques du type CytoStar ayant un fond avec du liquide de scintillation permet de révéler le subtrat encore séquestré dans le protéoliposome.
EXEMPLE 18 : Utilisation de transport d'anion pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABC1). Le principe de cet essai réside dans la propriété qu'a la protéine ABC1 à transporter les anions lors de son activation. a) Les cellules macrophagiques de la lignées THP-1 , cellules humaines monocytic leukemia, sont un modèle de macrophages différenciés. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal dans des plaques 48-multipuits à la densité de 2 105 cellules par puits. Les cellules fibroblastiques de patients atteints de la maladie de Tangier peuvent être utilisées comme témoin négatif parce que leur protéine ABC1 n'est pas fonctionnelle. Un autre témoin négatif peut être obtenu par l'ajout d 'anticorps anti-ABCL b) L'utilisation de cellules détectives en transport anioniques ou bien des cellules traitées avec des inhibiteurs de canals anioniques (type Verapamil, un inhibiteur de P-glycoprotéine ou le tetraethylammonium, un inibiteur de canal potassique) peuvent être aussi utilisés. c) Pour l'essai proprement dit, les cellules sont ensuite lavées par un milieu Earles's modified sait solution (ESS) préchargées avec 1 ml de Kl à 1 μmol/L
(0,1 μCi/ml de Nal125) dans ce milieu ESS pour 30 minutes à 37°C. Les produits sont alors ajoutés dans le milieu extracellulaire. Les cellules sont ensuite lavées par le milieu ESS. d) La quantité d'iiodure dans le milieu est détectée toute les minutes durant 11 minutes. Les deux premiers points correspondent à l'efflux basai. A la fin de l'incubation, le milieu est repris et la quantité d'iodine restant dans les cellules est compté suite à la lyse des cellules dans du NaOH 1 molaire. e) La quantité totale de radioactivité au temps zéro est égale à la somme de la radioactivité trouvée dans les surnageant et résiduelle dans les cellules. Les courbes d'efflux sont construites en marquant le pourcentage de radioactivité libéré dans le milieu en fonction du temps.
EXEMPLE 19 : Utilisation de macrophages THP-1 exprimant l'IL-1béta pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABC1).
Le principe de ce test est que toutes substances modulant l'activité de la protéine ABC1 a des répercussions sur la synthèse d'IL-1 beta.
a) Les cellules macrophagiques de la lignées THP-1 , cellules humaines monocytic leukemia, sont un modèle de macrophages différenciés. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal dans des plaques multipuits à la densité de 2 105 cellules par puits. b) Pour l'essai proprement dit, les cellules sont ensuite lavées et placés dans un milieu RPMI 1640 contenant 1 mg/ml d'albumine humaine purifiée fraction IV. c) Les produits sont ajoutés dans le milieu extracellulaire. Simultanément, les cellules sont alors activées par ajout de lipopolysaccharide (LPS) durant
3 heures à 1 μg/ml suivit par une incubation de 30 minutes en présence de ATP à 5 mmol/L. d) Les concentrations en IL-1beta et en contrôle l'IL-1 alpha, le tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) et l'IL-6 sont déterminées par des kits ELISA selon les instructions des fabriquants (R&D Sytem ; IL-1 béta humain Chemiluminescent ELISA référence QLB00). Les variations en ARNm de l'IL-1béta qui n'est pas censé être affecté sont évaluées par la technique de Nothern blot avec la sonde correspondante.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 1 -14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 15-47 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
6. Acide nucléique comprenant un polynucleotide de séquence SEQ ID NO 91 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique comprenant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
8. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques
SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
9. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques
SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
11. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
12. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
13. Acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 97-108 et comprenant la base polymorphe, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
14. Sonde ou amorce nucléotidique spécifique du gène ABC1 , d'une longueur d'au moins 15 nucléotides choisie parmi les acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
15. Sonde ou amorce selon la revendication 14, comprenant un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 109-138, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
16. Sonde ou amorce nucléotidique utile pour la détection d'une mutation dans le gène ABC1 , d'une longueur d'au moins 15 nucléotides, choisie parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 11 et 12.
17. Sonde ou amorce nucléotidique selon la revendication 16, comprenant un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 109 — 112, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
18. Sonde ou amorce nucléotidique utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABC1 , d'une longueur d'au moins 15 nucléotides, choisie parmi les acides nucléiques selon la revendication 13.
19. Sonde ou amorce selon la revendication 18, comprenant un polynucleotide choisi parmi les séquences nucleotidiques SEQ ID NO 142- 149, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
20. Amorce nucléotidique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire du nucléotide localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.
21 . Amorce nucléotidique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucleotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucleotidiques SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.
22. Procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 contenu dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
a) mise en contact de l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucleotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
23. Procédé d'amplification selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucleotidiques sont choisies parmi les amorces selon l'une quelconque des revendications 14 à 19.
24. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 comprenant : a) un couple d'amorces nucleotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
25. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucleotidiques sont choisies dans le groupe constitué des amorces selon l'une des revendications 14 à 19.
26. Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé marqueur dont la présence est détectable.
27. Procédé de détection de la présence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléiques selon l'une des revendications 14 à 19 avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
28. Procédé de détection selon la revendication 27, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
29. Nécessaire pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucleotidiques selon l'une quelconque des revendications 14 à 19; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
30. Nécessaire de détection selon la revendication 29, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
31. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
32 Vecteur selon la revendication 31 caractérisé en ce qu'il est un adénovirus.
33 Vecteur selon l'une des revendications 32 et 33 caractérisé en ce qu'il est l'ABC1-rldV
34 Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 31 à 33.
35. Polypeptide ABC1 muté, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 140.
36. Polypeptide ABC1 muté, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 141.
37. Anticorps dirigé contre un polypeptide ABC1 muté selon l'une quelconque des revendications 35 et 36, ou un fragment peptidique de ce dernier..
38. Anticorps selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend un composé détectable.
39. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant les étapes de: a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 37 ou 38; b) détection du complexe antigène/anticorps formé .
40. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps selon l'une des revendications 37 ou 38; b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.
41. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
42. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 31 , en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
43. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
44. Utilisation d'un vecteur recombinant selon la revendication 31 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
45 Utilisation selon la revendication 44 caractérisé en ce que le vecteur est l'ABC1 -rldV.
46. Utilisation du polypeptide ABC1 de séquence SEQ ID NO 139 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
47. Composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant une quantité therapeutiquement efficace du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139.
48 Utillisation du polypeptide ABC1 , ou de cellules exprimant le polypeptide ABC1 , pour cribler des principes actifs pour la prévention ou le traitement de maladies résultant d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.,
49. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) préparer des vésicules membranaires contenant le polypeptide ABC1 et un substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; b) incuber les vésicules obtenues à l'étape a) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) mesurer qualitativement et/ou quantitativement la libération du substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; d) comparer la mesure obtenue à l'étape b) avec une mesure de la libération du substrat lipidique marqué par les vésicules n'ayant pas préalablement été incubées avec le composé candidat agoniste ou antagoniste.
50. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABCL ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir des cellules, par exemple une lignée cellulaire, exprimant naturellement ou après transfection le polypeptide ABC1 ; b) incuber les cellules de l'étape a) en présence d'anion marqué par un marqueur détectable ; c) laver les cellules de l'étape b) afin d'éliminer l'excès de l'anion marqué n'ayant pas pénétré dans ces cellules ; d) incuber les cellules obtenues à l'étape c) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 ; e) mesurer l'efflux de l'anion marqué ; f) comparer la valeur de l'efflux de l'anion marqué déterminé à l'étape e) avec la valeur de l'efflux de l'anion marqué mesuré avec des cellules n'ayant pas préalablement été incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABCL
51. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) cultiver des cellules d'une lignée monocytaire humaine dans un milieu de culture approprié, en présence d'albumine humaine purifiée ; b) incuber les cellules de l'étape a) simultanément en présence d'un composé stimulant la production d'IL-1 beta et du composé candidat agoniste ou antagoniste; c) incuber les cellules obtenues à l'étape b) en présence d'une concentration appropiée d'ATP ; d) mesurer d'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture cellulaire. e) comparer la valeur de la libération de l'IL-1 beta obtenue à l'étape d) à la valeur de l'IL-1 beta libérée dans le surangeant de culture de cellules n'ayant pas été préalablement incubées en présence du composé candidat agonsite ou antagoniste.
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