+

WO2000071078A2 - Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere - Google Patents

Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere Download PDF

Info

Publication number
WO2000071078A2
WO2000071078A2 PCT/FR2000/001422 FR0001422W WO0071078A2 WO 2000071078 A2 WO2000071078 A2 WO 2000071078A2 FR 0001422 W FR0001422 W FR 0001422W WO 0071078 A2 WO0071078 A2 WO 0071078A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
nucleic acid
activity
composition according
vector
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/001422
Other languages
English (en)
Other versions
WO2000071078A3 (fr
Inventor
Philippe Erbs
Richard Jund
Original Assignee
Transgene
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene filed Critical Transgene
Priority to JP2000619390A priority Critical patent/JP2003500342A/ja
Priority to EP00931350A priority patent/EP1183371A2/fr
Priority to CA002374941A priority patent/CA2374941A1/fr
Priority to AU49314/00A priority patent/AU774391B2/en
Publication of WO2000071078A2 publication Critical patent/WO2000071078A2/fr
Publication of WO2000071078A3 publication Critical patent/WO2000071078A3/fr
Priority to HK02106412.5A priority patent/HK1046426A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • composition intended for the implementation of an antitumor or antiviral treatment in a mammal
  • the present invention relates to a cytotoxic composition
  • a cytotoxic composition comprising a first nucleic acid sequence coding for all or part of the p53 protein and a second nucleic acid sequence coding for all or part of a polypeptide having at least one cytotoxic activity, in particular anti-tumor activity or antiviral.
  • the present invention is particularly useful in the context of the implementation of a treatment by gene therapy of proliferative or infectious diseases.
  • P53 is a nuclear phosphoprotein involved in particular in controlling the expression of proteins involved in the cell cycle (Ozbun et al, 1995, Adv. Cancer Res. 66, 71-141- Selter et al, 1994, Int. J. Biochem. 26, 145-154) and participating in numerous cellular processes linked to genome stability and cell apoptosis (Harris et al, 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88, 1442-1445; Kastan et al , 1991, Cancer Res. 51, 6304-6311; Kuerbitz et al, 1992, PNAS, 89, 7491-7495).
  • the p53 gene has been identified and sequenced.
  • the sequence of cDNA is described in Matlashe ski et al., 1984, EMBO J., 3, 3257-3262 and that of the protein in Lamp, 1986, Mol. Cell Biol. , 6, 1379-1385.
  • natural and functional polymorphic variants have been identified for which certain amino acids are replaced by others without however affecting the p53 function.
  • mutations have been described in the cancer literature which can result in a loss of the function of this protein (Holstein et al, 1991, Science, 253, 49-53; Levine et al, 1991, Nature , 351, 453-456).
  • compositions whose various constituents are chosen so as to obtain a synergistic effect of their respective activities and of the improved properties of said constituents. More particularly, such compositions make it possible to inhibit or delay cell proliferation by inducing the specific death of tumor cells, a better presentation of the antigens and / or stimulation of the immune cells of. the host organism.
  • the present invention offers an advantageous and effective alternative to the techniques of the prior art, in particular for treating cancer in humans or animals.
  • the invention relates firstly to a composition intended for the implementation of an antitumor or antiviral treatment, or any applications requiring cell death, in a mammal comprising: (i) a nucleic acid sequence coding for all or part p53 polypeptide,
  • nucleic acid sequence coding for all or part of a polypeptide having at least one cytotoxic activity, said nucleic acid sequences being placed under the control of the elements necessary for their expression in a host cell of said mammal .
  • polypeptide having at least one cytotoxic activity is intended to denote any peptide substance capable of inducing or activating an immune response directed specifically against a tumor cell
  • cytotoxic activity is then called anti-tumor activity
  • a cell infected with a virus cytotoxic activity is then called antiviral activity
  • said cytotoxic activity results in the death of said cell.
  • the p53 activity can be measured by the analysis of the arrest of the cell cycle in the Gl / S and G2 / M phase, of the induction of apoptosis, of the suppression of the cellular transformation induced by the oncogenes or inhibition of angiogenesis.
  • the cytotoxic activity of a given polypeptide in particular an anti-tumor activity, can be assessed m vi tro by measuring cell survival either by short-term viability tests (such as for example the tryptan blue test or MTT), either by clonogenic survival tests (colony formation) (Brown and outers, 1999, Cancer Research, 59, 1391-1399) or in vivo by measuring tumor growth (size and / or volume) in an animal model (Ovejera and Houchens, 1981, Seitim. Oncol., 8, 386-393).
  • short-term viability tests such as for example the tryptan blue test or MTT
  • clonogenic survival tests colony formation
  • tumor growth size and / or volume
  • the invention relates to a composition characterized in that said polypeptide having cytotoxic activity is chosen from cytokmes, proteins encoded by a gene called “suicide gene” and antiangiogenic protein factors.
  • said polypeptide in (ii) is a cytokme
  • it is preferably a cytokme chosen from interferons ⁇ , ⁇ and ⁇ , mterleukins, and in particular IL-2, IL-4 l 'IL-6, IL-10 or IL-12, tumor necrotizing factors (TNF) and colony stimulating factors (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ).
  • said cytokme is selected from 1 mterleukme-2 (IL-2) and 1 gamma mterferon (IFN- ⁇ ).
  • Mterleukme-2 is in particular responsible for the proliferation of activated T lymphocytes, the multiplication and activation of cells of the immune system (for the nucleic acid sequence see in particular FR 85 09480).
  • IFN- ⁇ activates phagocytic cells and increases the expression of class I and II surface antigens of the major histocompatibility complex (for the nucleic acid sequence see in particular FR 85 09225).
  • the invention also relates to such a composition characterized in that said polypeptide in (it) has at least one enzymatic activity selected from thymid ek ase activity, pu ⁇ ne nucleoside phosphorylase activity, guanme activity or uracil or orotate phosphoribosyl transferase and cytosme dammase activity.
  • the genes coding for such polypeptides are called "suicide genes". Many suicide / predrug gene pairs are currently available. We can cite more particularly, the couples:
  • TK HSV-1 herpes simplex virus type 1
  • GCV ganciclovir
  • CDase is an enzyme which intervenes in the metabolic pathway of pyrimidmes by which the exogenous cytosme is transformed by means of a hydrolytic desammation into uracil.
  • CDase activities have been demonstrated in prokaryotes and lower eukaryotes (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacte ⁇ ol. 102, 607-615; Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219-228; De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 38, 257-263; Hoep ⁇ ch et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-118; Esders and Lynn, 1985, J. Biol.
  • CDase also deactivates a cytosme analog, 5-fluorocytosme (5-FC) into 5-fluorouracil (5-FU) which is a highly cytotoxic compound especially when it is converted into 5-fluoro-UMP (5-FUMP ).
  • Cells lacking CDase activity, due either to inactivating mutation of the gene coding for the enzyme, or their natural deficiency for this enzyme (for example mammalian cells) are resistant to 5-FC (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacte ⁇ ol. 102, 607-615; Kilstrup and al., 1989, J. Bacteriol. 1989 171, 2124-2127).
  • This phenomenon is due to the excretion by cells expressing CDase activity, of 5-FU which intoxicates neighboring cells by simple diffusion through the cell membrane.
  • This passive diffusion property of 5-FU constitutes an advantage compared to the tk / GCV reference system for which the neighborhood effect requires contact with the cells which express tk (Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 1831-1835). This effect therefore constitutes an additional advantage of the use of CDase in the context of gene therapy, in particular anti-cancer therapy.
  • sensitivity to 5-FC varies widely across cell lines. Low sensitivity is observed, for example, in human tumor lines PANC-1 (pancreatic carcinoma) and SK-BR-3 (sem adenocarcmoma) transduced by a retrovirus expressing the codA gene of E. Coli (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175). This undesirable phenomenon could be explained by the absence or the weak endogenous conversion of 5-FU formed by the enzymatic action of CDase into cytotoxic 5-FUMP.
  • This stage normally carried out in mammalian cells by the phosphorybosyl orotate transferase (Peters et al., 1991, Cancer 68, 1903-1909), may be absent in certain tumors and thus render gene therapy, based on CDase, ineffective.
  • uracil is transformed into UMP by the action of uracil phosphoribosyl transferase (consequently exhibiting UPRTase activity).
  • This enzyme also converts 5- FU to 5-FUMP.
  • furl mutants of the yeast S. cerevisiae are resistant to high concentrations of 5-FU (10 mM) and 5-FC (10 mM) because in the absence of UPRTase activity, 5-FU, originating from the desammation of 5-FC by CDase, n is not transformed into cytotoxic 5-FUMP (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacte ⁇ ol. 102, 607-615).
  • upp and FUR1 genes coding for UPRTase respectively from E. coli and S. cerevisiae have been cloned and sequenced (Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157).
  • a polypeptide having UPRTase activity denotes a polypeptide capable of converting uracil or one of its derivatives into a monophosphatic analogue and, in particular 5-FU into 5-FUMP.
  • mutation is meant the addition, deletion and / or substitution of one or more residues at any location of said polypeptide.
  • the native UPRTase in question in the present invention can be of any origin, in particular prokaryotic, fungal or yeast.
  • the nucleic acid sequences encoding the UPRTases of E. coli Anderson et al., 1992, Eur. J.
  • application PCT / FR99 / 00904 describes a FUR1 gene devoid of 105 nucleotides in 5 ′ of the coding part allowing the synthesis of a UPRTase deleted from the first 35 residues in the N-termmal position and starting with the methionm in position 36 in native protein.
  • the mutant gene expression product designated FUR1A105, is capable of complementing a furl mutant of S. cerevi siae.
  • the truncated mutant exhibits a higher UPRTase activity than that of the native enzyme.
  • the polypeptide encoded according to the invention is a deletion mutant of a native UPRTase.
  • the deletion is preferably located in the N-term region of the original UPRTase. It can be total (concern all the residues of said N-termal region) or partial (concern one or more residues continuous or not in the primary structure).
  • a polypeptide is made up of N-termmale, central and C-terminal parts, each representing approximately one third of the molecule.
  • the UPRTase of S. cerevi siae having 251 amino acids its N-term part consists of the first 83 residues starting with the methionme called initiator located in the first position of the native form.
  • the PRTase of E. coli its N-term part covers positions 1 to 69.
  • the polypeptide according to PCT / FR99 / 00904 derives from a native UPRTase at least by deletion of all or part of the N-termmal region upstream of the second ATG codon of said Native UPRTase. Total deletion of the above region is preferred.
  • the UPRTase encoded by the FUR1 gene comprises a first ATG codon (initiator ATG codon) in position +1 followed by a second in position +36.
  • the deletion of residues +1 to 35 can be envisaged in the context of the present invention, giving a polypeptide starting with methionine normally found in position +36 of the native form.
  • a preferred polypeptide according to PCT / FR99 / 00904 comprises an amino acid sequence substantially as shown in the sequence identifier IDS NO: 1, starting at the Met residue in position 1 and ending at the Val residue in position 216.
  • patent applications WO96 / 16183 and PCT / FR99 / 00904 describe the use of a fusion protein coding for a two-domain enzyme having the CDase and UPRTase activities and demonstrate that the transfer of a hybrid gene codA :: upp or FCY1:: FUR1 or
  • FCY1:: FUR1A105 carried by an expression plasmid increases the sensitivity to 5-FC of transfected B16 cells.
  • the protein and nucleic acid sequences described in these two applications are incorporated into the description of the present application.
  • the polypeptide according to PCT / FR99 / 00904 is a fusion polypeptide in which it is fused in phase with at least one second polypeptide.
  • the fusion can take place at any location of the first polypeptide, the N or C-terminal ends are preferred and in particular the N-terminal end.
  • the phase fusion implements a second polypeptide exhibiting cytosine deaminase activity (CDase) and derived from a native cytosine deaminase, so that the fusion polypeptide according to the invention exhibits CDase and UPRTase activities.
  • An FCY1:: FUR1 fusion is preferred.
  • Such a bifunctional polypeptide makes it possible to improve the sensitivity of the target cells to 5-FC and to 5-FU.
  • the second polypeptide according to the invention is capable of metabolizing 5-FC to 5-FU.
  • a CDase of prokaryotic or lower eukaryotic origin is used. Even more preferably, it is a yeast CDase and in particular that encoded by the FCY1 gene from Saccharomyces cerevisiae.
  • the cloning and the sequence of genes coding for CDases from different sources are available in the literature and in specialized databases. It is indicated that the sequence of the FCY1 gene is disclosed in Erbs et al. (1997, Curr. Genêt. 31, 1-6). It is of course possible to use a CDase mutant having a conversion capacity comparable to or greater than that of the native enzyme.
  • CDase sequences from published data, of carrying out possible mutations, of testing the enzymatic activity of the mutant forms in an acellular or cellular system according to the technology of the art or by following the protocol indicated below and in phase fusing the polypeptides of CDase and UPRTase activity.
  • a preferred example is a polypeptide comprising an amino acid sequence substantially as shown in the sequence identifier IDS NO: 2, starting at the Met residue in position 1 and ending at the Val residue in position 373.
  • the term "substantially” has the definition given previously.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence as shown in the sequence identifier IDS NO: 2 is very particularly suitable for the implementation of the invention.
  • a fusion of CDase and UPRTase activities improves the sensitivity of target cells to 5-FC and 5-FU.
  • a person skilled in the art is capable of cloning the CDase or UPRTase sequences from the published data, of carrying out possible mutations, of testing the enzymatic activities of the mutant forms in an acellular or cellular system according to l technology. art or by following the protocol indicated in application PCT / FR99 / 00904 and to merge, in particular in phase, the polypeptides of CDase and UPRTase activity, and consequently all or part of the corresponding genes.
  • a polypeptide according to the invention can be produced by conventional methods of chemical synthesis or else by recombinant DNA techniques (see for example Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Sprmg Harbor, Laboratory Press, Cold Sprmg Harbor, NY).
  • a nucleotide sequence coding for said polypeptide is introduced into a cell to generate a transformed cell, said transformed cell is cultured under conditions suitable for allowing the production of said polypeptide and said harvest is harvested. polypeptide from cell culture.
  • the producer cell can be of any origin and without limitation, a bacterium, a yeast or a mammalian cell, insofar as the nucleotide sequence considered is either integrated into its genome or integrated into an appropriate expression vector capable to replicate.
  • the nucleotide sequence is placed under the control of transcription and translation signals. allowing its expression in the producer cell.
  • Expression vectors and control signals are known to those skilled in the art.
  • the polypeptide it can be recovered from the medium or from the cells (after lysis thereof) and subjected to conventional purification steps (by chromatography, electrophoresis, filtration, immunopurification, etc.).
  • PCT / FR99 / 0904 also describes a nucleotide sequence coding for a said polypeptide which may be a cDNA or genomic sequence or of a mixed type. It may optionally contain one or more mtrons, these being of native, heterologous origin (for example the mtron of the ⁇ -rabbit globule gene, etc.) or synthetic in order to increase expression in the host cells. As indicated, said sequence can code for a polypeptide derived from the native enzyme or a mutant exhibiting comparable or improved activity.
  • the sequences used can be obtained by conventional molecular biology techniques, for example by bank screening using specific probes, by expression bank immuno-screening, by PCR using suitable primers or by chemical synthesis.
  • the mutants can be generated from the native sequences by substitution, deletion and / or addition of one or more nucleotides using the techniques of site-directed mutagenesis, PCR, digestion by restriction enzymes and ligation or by synthesis chemical.
  • the functionality of the mutants and of the constructs can be verified by assaying the enzymatic activity or by measuring the sensitivity of target cells to 5-FC and / or 5-FU.
  • the composition of the invention is characterized in that the nucleic acid sequence (n) is selected from the nucleic sequences of the genes CodA, upp, FUR1, FCY1 and FUR1 ⁇ 105, or by a combination of all or part of the said sequences.
  • the invention relates more particularly to a said composition characterized in that said polypeptide in (ii) has at least one CDase activity and one UPRTase activity.
  • nucleic acid sequences are intended to denote both distinct sequences which code for at least two distinct polypeptides as well as fused sequences which code for fusion polypeptides, it being understood that the production of such polypeptides can be carried out under the control of the same regulatory elements (polycistronic cassette) or of independent, identical or different elements, homologous or heterologous with respect to the vector containing them, constitutive or inducible.
  • the composition of the invention comprises at least one nucleic acid sequence (ii) coding for a fusion polypeptide in which a first polypeptide exhibiting UPRTase or CDase activity is fused in phase with at least one second polypeptide, said second polypeptide exhibiting CDase or UPRTase activity, respectively.
  • such a polypeptide is characterized in that the fusion with the second polypeptide is carried out at the N-terminal end of said first polypeptide.
  • said composition is characterized in that the nucleic acid sequence coding for said fusion polypeptide is a hybrid sequence comprising:
  • UPRTase or CDase a second nucleic acid sequence coding for a second polypeptide exhibiting Cdase or UPRTase activity, respectively.
  • hybrid nucleic acid sequence coding for said fusion polypeptide may also contain an IRES type sequence.
  • the invention relates in particular to such a composition for which the first nucleic acid sequence is selected from upp, FUR1 and FUR1 ⁇ 105, and in that the second nucleic acid sequence is selected from CodA and FCY1, and vice versa.
  • a hybrid nucleic acid sequence is chosen from the hybrid sequences described in patent applications WO96 / 16183 and PCT / FR99 / 00904.
  • the composition according to the present invention is characterized in that said polypeptide having cytotoxic activity (ii) is an anti-angiogenic protein factor.
  • Angiogenesis is the process responsible for the formation of new capillaries from the existing vascular network.
  • an anti-angiogenic factor is considered to be a cytotoxic agent, in particular an anti-tumor agent.
  • angiostasis angiostasis, endostasis, platelet factor PF4, thrombospondme-1, PRP (for Prolifer Related Protein), VEGI (for Vascular Endothelial Growth Inhibitor) and urokinase.
  • PRP Prolifer Related Protein
  • VEGI Vascular Endothelial Growth Inhibitor
  • nucleic acid sequences (i) or (11) can be easily obtained by cloning, by PCR or by chemical synthesis according to the conventional techniques in use. They may be native genes or derivatives thereof by mutation, deletion, substitution and / or addition of one or more nucleotides. Furthermore, their sequences are widely described in the literature available to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a composition as presented above, characterized in that said nucleic acid sequences (i) and (ii) are inserted into a recombinant vector of plasmid or viral origin, as well as to a such a recombinant vector carrying such nucleotide sequences placed under the control of the elements necessary for their expression in a host cell.
  • compositions of the invention can comprise said nucleic acid sequences (i) and (ii) inserted in the same recombinant vector or in distinct recombinant vectors.
  • recombinant vector is meant a vector of plasmid or viral origin, and optionally such a vector associated with one or more substances improving the transfection efficiency and / or the stability of said vector and / or the protection said vector in vivo against the immune system of the host organism.
  • substances are widely documented in the literature accessible to those skilled in the art (see for example Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Biocon ugate Chemistry 5, 647-654).
  • they may be polymers, lipids, in particular catiomics, liposomes, nuclear or viral proteins or even neutral lipids. These substances can be used alone or in combination. Examples of such compounds are in particular available in patent applications WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 or WO 99/05183.
  • a possible combination is a recombinant plasmid vector associated with cationic lipids (DOGS, DC-CHOL, sperm-chol, spermid-chol etc ...) and neutral lipids (DOPE).
  • plasmids which can be used in the context of the present invention are vast. They may be cloning and / or expression vectors. In general, they are known to those skilled in the art and many of them are commercially available, but it is also possible to construct or modify them by genetic manipulation techniques. Mention may be made, as examples, of the plasmids derived from pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) or also p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201).
  • a plasmid used in the context of the present invention contains an origin of replication ensuring the initiation of replication in a producer cell and / or a host cell (for example, the ColEl origin will be retained for a plasmid intended to be produced in E. coli and the o ⁇ P / EBNAl system if it is desired to be self-replicating in a mammalian host cell, Lupton and Lev e, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). It can also comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells (complementation of an auxotrophy mutation, gene coding for resistance to an antibiotic, etc.).
  • sequence cer which promotes the monomeric maintenance of a plasmid (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, integration sequences in the cell genome).
  • a viral vector Being a viral vector, one can envisage a vector deriving from a poxvirus (vaccinia virus, in particular MVA, canaripox, etc.), from an adenovirus, from a retrovirus, from a virus herpes, an alphavirus, a foamyvirus or a virus associated with one adenovirus.
  • a non-replicative and non-tegrative vector will be used.
  • the adenoviral vectors are very particularly suitable for the implementation of the present invention. However, it should be noted here that in the context of the implementation of the present invention, the nature of the vector is of little importance.
  • Retroviruses have the property of infecting and integrating mainly in dividing cells and in this regard are particularly suitable for cancer application.
  • a recombinant retrovirus according to the invention generally comprises the LTR sequences, an encapsidation region and the nucleotide sequence according to the invention placed under the control of the retroviral LTR or of an internal promoter such as those described below. It can be derived from a retrovirus of any origin
  • MoMuLV Moloney murme leukemia virus
  • MVS Murme sarcoma virus
  • Fb29 Friend murme retrovirus
  • the retroviral vector according to the invention may include modifications in particular at the level of the LTRs (replacement of the promoter region by a eukaryotic promoter) or of the encapsidation region (replacement by a heterologous encapsidation region, for example type VL30) (see French applications 94 08300 and 97 05203).
  • a defective adenoviral vector for replication that is to say devoid of all or part of at least one region essential for replication selected from regions E1, E2, E4 and.
  • a deletion from the El region is preferred.
  • it can be combined with other modification (s) / deletion (s) affecting in particular all or part of the regions E2, E4 and / or L1-L5, insofar as the essential detective functions are complemented in trans by means of 'a complementation line and / or a helper virus in order to ensure the production of the viral particles of interest.
  • use may be made of second generation vectors of the state of the art (see for example international applications WO 94/28152 and WO 97/04119).
  • the deletion of the majority of the region E1 and of the transcription unit E4 is very particularly advantageous.
  • the adenoviral vector can also be devoid of all or part of the non-essential E3 region.
  • the origin of the adenoviral vector according to the invention can be varied both from the point of view of the species and of the serotype.
  • adenovirus of human or animal origin canine, avian, bovine, murme, ovine, porcine, simian .
  • Mention may more particularly be made of the adenoviruses CAV-1 or CAV-2 of canine origin, DAV of avian origin or else Bad of type 3 of bovine origin (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176, Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol.
  • an adenoviral vector of human origin preferably deriving from an adenovirus of serotype C, in particular of type 2 or 5, will be preferred.
  • An adenoviral vector according to the present invention can be generated in vitro in Esche ⁇ chia coli (E. coli) by homologous ligation or recombination (see for example international application WO 96/17070) or alternatively by recombination in a complementation line.
  • E. coli Esche ⁇ chia coli
  • the elements necessary for expression consist of all the elements allowing the transcription of the nucleotide sequence into RNA and the translation of the mRNA into polypeptide, in particular the promoter sequences and / or efficient regulatory sequences in said cell, and optionally the sequences required to allow excretion or expression on the surface of target cells of said polypeptide. These elements can be regulable or constitutive.
  • the promoter is adapted to the selected vector and to the host cell. Mention may be made, by way of examples, of the eukaryotic promoters of the PGK genes.
  • the early promoter of the SV40 virus (Simian Virus), the RSV LTR (Rous Sarcoma Virus), the MPSV promoter, the TK-HSV- promoter 1, the early promoter of the CMV virus (Cytomegalovirus), the promoters of the vaccinia virus p7.5K pH5R, pKlL, p28, fold and the adenoviral promoters E1A and MLP or a combination of said promoters.
  • It can also be a promoter stimulating expression in a tumor or cancer cell. Muc-1 promoters overexpressed in sem and prostate cancers can be mentioned in particular (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest.
  • CMV Cytomegalovirus
  • tissue-specific promoter region in particular when the tumor to be treated originates from a particular cell type, or can be activated under defined conditions.
  • the literature provides a great deal of information relating to such promoter sequences.
  • the necessary elements may, in addition, include additional elements improving the expression of the nucleotide sequence according to the invention or its maintenance in the host cell. Mention may in particular be made of the metric sequences (WO 94/29471), secretion signal sequences, nuclear localization sequences, internal sites for reiteration of translation of the IRES type, poly A sequences for transcription termination.
  • the invention relates more particularly to a recombinant vector, in particular an adenoviral vector defective for replication, comprising: (i) a nucleic acid sequence encoding all or part of the p53 polypeptide,
  • the present invention also relates to a viral particle, in particular adenoviral, comprising a recombinant viral vector according to the invention.
  • a viral particle in particular adenoviral, comprising a recombinant viral vector according to the invention.
  • Such a viral particle can be generated from a viral vector according to any conventional technique in the art. Its propagation is carried out in particular in a complementation cell adapted to the deficiencies of the vector.
  • adenoviral vector use will be made, for example, of a complementation line as described in application WO 94/28152, to line 293 established from human embryonic kidney cells, which effectively complements the El function (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), the line A549-E1 (Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84) or a line allowing a double complementation ( Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783; international application WO 97 / 04119).
  • Helper viruses can also be used to at least partially complement defective functions.
  • complementation cell is meant a cell capable of providing in trans the early and / or late factors necessary for encapsidation of the viral genome in a viral capsid to generate a viral particle containing the recombinant vector. Said cell may not alone complement all the defective functions of the vector and in this case can be transfected / transduced by a vector / helper virus providing complementary functions.
  • the invention also relates to a process for preparing a viral particle, according to which:
  • a recombinant vector according to the invention is introduced into a cell, in particular a complementation cell capable of complementing said vector in trans, so as to obtain a said transfected cell,
  • the viral particle can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods is to lyse the cells by consecutive freeze / thaw cycles to collect the virions in the lysis supernatant. These can be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifugation in particular through a gradient of cesium chloride ).
  • the invention also relates to a eukaryotic host cell comprising the DNA fragments present in the composition according to the invention.
  • Said host cell is advantageously a mammalian cell and, preferably, a human cell. It will preferably be a 293 cell, LCA4 or PERC6.
  • Such a cell is particularly useful for producing viral particles at high titer, without generating particles competent for replication.
  • the invention also relates to a host cell comprising a nucleotide sequence, a recombinant vector according to the invention or infected with a viral particle according to the invention.
  • a host cell is constituted by any cell transfectable by a recombinant vector or mfectable by a viral particle, as defined above.
  • a mammalian cell and in particular numa e is particularly suitable. It can comprise said vector in a form integrated into the genome or not (episome).
  • It can be a primary or tumor cell of any origin, in particular hematopoietic (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscle (satellite cell, myocyte, myoblast, smooth muscle ..) .), cardiac, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • hematopoietic totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage
  • muscle satellite cell, myocyte, myoblast, smooth muscle ..) .
  • cardiac pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • the invention also relates to a composition intended for the implementation of an antitumor or antiviral treatment, or any applications requiring cell death, in a mammal comprising:
  • polypeptide having at least one cytotoxic activity (ii) all or part of a polypeptide having at least one cytotoxic activity, said polypeptides being defined as indicated above.
  • Another object according to the invention consists of a formulation intended for the implementation of an antitumor or antiviral treatment in a mammal, characterized in that it comprises a composition (based on nucleic acid or polypeptide as described above) ), an adenoviral vector or a viral particle according to the invention, as well as a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a support is preferably isotonic, hypotomal or weakly hypertomal and has a relatively low ionic strength, such as for example a sucrose solution.
  • a support can contain any solvent, or aqueous or partially aqueous liquid such as sterile non-pyrogenic water.
  • the pH of the formulation is also adjusted and buffered to meet the requirements for use in vivo.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient, as well as solubilizers, stabilizers, preservatives.
  • a pharmaceutically acceptable diluent for injectable administration, an aqueous, non-aqueous or isotonic solution formulation is preferred. It can be presented as a single dose or in multidose in liquid or dry form (powder, lyophilisate, etc.) capable of being reconstituted extemporaneously with an appropriate diluent.
  • said formulation also comprises pharmaceutically acceptable amounts of a prodrug capable of being transformed into a cytotoxic molecule by a polypeptide having at least one cytotoxic activity.
  • Such a prodrug will be selected in particular from the group consisting of acyclovir or ganciclovir
  • said prodrug is 5-fluorocytosme (5FC) or 5-fluorouracil (5-FU).
  • said formulation may also comprise one or more substances potentiating the cytotoxic effect of 5-FU.
  • drugs which inhibit the enzymes of the de novo pyrimidmes biosynthesis pathway (for example those cited below), drugs such as Leucovor (Waxman et al., 1982, Eur. J.
  • a formulation according to the invention is more particularly intended for the preventive or curative treatment of diseases by gene therapy and is more particularly intended for proliferative diseases (cancers, tumors, restenosis, etc.) and for diseases of infectious origin, in particular viral for which it is necessary to limit the proliferation of infected cells (induced by hepatitis B or C viruses, HIV, herpes, retroviruses, etc.).
  • a formulation according to the invention can be manufactured in a conventional manner for administration by the local, parenteral or digestive route. There are many possible routes of administration.
  • Mention may be made, for example, of the metagastric, subcutaneous, metacardiac, intramuscular, intravenous, mtrapé ⁇ tonéale, mtratumoral, mtranasal, mtrapulmonary or tratracheal route.
  • administration by aerosol or instillation is advantageous.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary according to various parameters, for example, the individual, the disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • the preparations based on viral particles according to the invention can be formulated in doses of between 10 4 and 10 14 pfu (plaque-forming units), advantageously 10 5 and 10 13 pfu and, preferably, 10 6 and 10 12 ufp.
  • doses comprising from 0.01 to 100 mg of DNA, preferably 0.05 to 10 mg and, in a very preferred fact, 0.5 to 5 mg can be considered.
  • a composition based on polypeptides preferably comprises from 0.05 to 10 g and, most preferably, from 0.5 to 5 g of said polypeptide.
  • the doses can be adjusted by the clinician.
  • the present invention also relates to the therapeutic or prophylactic use of a composition, of a recombinant vector or of a viral particle according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of the human or animal body by therapy gene, in particular for the preparation of an antitumor or antiviral medicament intended to inhibit the growth or cause the rejection of a tumor or the death of an infected cell.
  • the drug can be administered directly in vivo (for example by intravenous injection, in an accessible tumor or at its periphery, in the lungs by aerosol, in the vascular system by means of an appropriate probe ...) .
  • the invention also extends to a method for the treatment of diseases by gene therapy, characterized in that a nucleotide sequence, a recombinant vector, is administered to an organism or to a host cell in need of such treatment. a viral particle or a host cell according to the invention.
  • a nucleotide sequence, a recombinant vector or a viral particle allowing the expression of a polypeptide according to the invention having UPRTase activity
  • the administration of the UPRTase and CDase sequences can be simultaneous or consecutive, the order of administration being unimportant.
  • the therapeutic use or the method of treatment also comprises an additional step according to which the host organism or cell is administered pharmaceutically acceptable amounts of a predrogue, advantageously d analog of cytosine and, in particular of 5-FC.
  • a predrogue advantageously d analog of cytosine and, in particular of 5-FC.
  • a dose of 50 to 500 mg / kg / day can be used with a preference for 200 mg / kg / day.
  • the predrogue is administered according to standard practices and this in a prior, concomitant or even after that of the therapeutic agent according to the invention.
  • the oral route is preferred.
  • Either a single dose of the pre-drug or repeated doses may be administered long enough to allow the production of the toxic metabolite within the host organism or cell.
  • the therapeutic use or the method of treatment is associated with a second treatment of the patient by surgery (in particular by removing the tumor partially or totally), by radiotherapy or chemotherapy.
  • the treatment according to the invention is applied beforehand, concomitantly or following said second treatment.
  • this treatment will be applied following said second treatment.
  • Figure 1 shows the in vitro antiproliferative effect of a buffer (Mock), an empty adenovirus (Ad-null), an adenovirus expressing FCUl (Ad-FCUl) or p53 (Ad-p53) or p53 and FCUl (Ad-p53FCUl) on SW480 cells at an MOI of 1 in the absence of prodrug (100% corresponds to the viability of uninfected cells).
  • FIG. 2 shows the in vitro antiproliferative effect of Mock, of an empty adenovirus, of an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl on B16F0 cells at an MOI of 100 in the absence of prodrug (100% corresponds to the viability of uninfected cells).
  • FIG. 3 shows the in vitro antiproliferative effect of Mock, of an empty adenovirus, of an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl on LoVo cells at an MOI of 1 in the absence of prodrug (100% corresponds to the viability of uninfected cells).
  • FIG. 4 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FU of SW480 cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 5 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FU of the B16F0 cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCU1 or p53 or p53 and FCU1 (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 6 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FU of LoVo cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCU1 or p53 or p53 and FCU1 (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 7 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of SW40 cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 8 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of the B16F0 cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 9 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of LoVo cells infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCU1 or p53 or p53 and FCU1 (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • FIG. 10 represents the survival rate of B6D2 mice in which B16F0 tumor cells treated with different adenoviral compositions have been implanted.
  • FIG. 11 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of SK-BR-3 cells (ATCC HTB-22) infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl (100% corresponds to the viability of infected cells in the absence of prodrug).
  • Figure 12 shows sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of T47-D cells
  • FIG. 13 shows the sensitization in the presence of different concentrations of 5FC of WiDr cells (ATCC CCL-218) infected with Mock, an empty adenovirus, an adenovirus expressing FCUl or p53 or p53 and FCUl (100% corresponds to the viability of the infected cells in the absence of prodrug).
  • the constructions described below are carried out according to the general techniques of genetic engineering and molecular cloning, detailed in Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Sprmg Harbor, Laboratory Press, Cold Sprmg Harbor, NY) or according to the recommendations from the manufacturer when using a commercial kit.
  • the homologous recombination steps are preferably carried out in the E. coli BJ 5183 strain (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I from E. coli (Klenow).
  • adenoviral genome fragments used in the various constructions described below are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 genome as disclosed in the Genebank database under the reference M73260.
  • the cells are transfected or transduced and cultured according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • the coding region of p53 was amplified by PCR from the plasmid pC53-SN3 (Baker et al., 1990, Science 249, 912-915) used as template and the following primers:
  • the EcoRI and Xbal sites were introduced respectively 5 ′ and 3 ′ of the coding sequence of p53.
  • the PCR fragment of p53 was cut with EcoRI and Xbal and then inserted into the pCI-neo plamide (Promega Corp) to give the plasmid pCI-neop53.
  • the Xhol-Xbal fragment of pCI-neop53 containing the p53 gene is isolated and introduced into the vector pTG6600 (Lathe et al, 1987, Gene 57, 193-191) cleaved by these same enzymes, to give the transfer vector pTG6600p53.
  • the adenoviral vector Adp53 is reconstituted by homologous recombination in the E.
  • Adp53 contains the genome of Ad5 deleted from most of the regions El (nucleotides 459 to 3328) and E3 (nucleotides 28249 to 30758) and in place of El, an expression cassette for the p53 gene placed under control of the CMV early promoter and ⁇ -globule / Ig hybrid splicing sequences.
  • the viral particles are generated by transfection into a 293 cell line (ATCC CRL1573) which complement the E1 function.
  • EXAMPLE 2 Construction of an adenovirus expressing a bicistronic unit p53 -IRES-FCUl (Adp53FCUl).
  • the Ncol-Sall fragment of the plasmid pCI-neoFCUl described in French patent application No. 98.05054 containing the FCU1 fusion gene is isolated and introduced into the vector pTG4369 linearized by Ncol-Sall.
  • the plasmid pTG4369FCU1 thus obtained contains the FCU1 gene downstream of the IRES (for Internal Ribosome Entry Site) sequence of EMCV (encephalomyocarditis virus).
  • the SacI-NotI fragment of pCI-neop53 is isolated and then inserted into the vector pTG4369FCU1 linearized by SacI-NotI to give the vector pTG4369p53FCU1 in which the p53 gene is placed upstream of the IRES sequence.
  • the Nhel-Mlul fragment of pTG4369p53FCU1 containing the sequence p53IRESFCU1 is inserted into the vector pTG6600 cleaved by these same enzymes to give the transfer vector pTG6600p53IRESFCU1.
  • the adenoviral vector Adp53FCU1 is reconstituted by homologous recombination in the E. coli strain BJ5183 between the PacI-BstEII fragment of pTG6600p53IRESFCU1 and the vector pTG6624 linearized by ClaI.
  • Adp53FCUl contains the genome of Ad5 deleted from most of the El regions (nucleotides 459 to 3328) and E3
  • the Xhol-Mlul fragment of pCI-neoFCUI (described in French patent application No. 98.05054) containing the FCU1 fusion gene is isolated and introduced into the vector pTG6600 linearized by Xhol-Mhul to give the transfer vector pTG6600FCUl.
  • the homologous recombination between the PacI-BstEII fragment carrying FCUl and isolated from pTG6600FCUl and the vector pTG6624 linearized by ClaI makes it possible to generate the adenoviral vector pTG6624FCUl deleted from the El and E3 regions and comprising in place of El the FCU1 gene placed under the control of the CMV promoter and the ⁇ -globin / Ig hybrid splicing sequences.
  • Adenoviral particles are generated by transfection into a 293 cell line
  • adenoviral constructs of the previous examples are used to infect in vitro 3 tumor cell lines:
  • the cells are infected (MOI of 1 for SW480 and LoVo and MOI of 100 for B16 (F0)) then cultivated in the presence or absence of prodrug (5-fluorocytosine (5FC) or 5-fluorouracil (5FU)) at different concentrations. After trypsinization (at D + 10 for SW480 and at D + 8 for B16 (F0)), the viability of the cells is evaluated with trypan blue. The values reported correspond to the means obtained after 4 counts.
  • FIGS. 7 to 9 illustrate similar results obtained using 5FC as a prodrug. These results demonstrate that there is a synergy between the expression products of FCU1 and of p53 for the induction of mortality when 5FC or 5FU are used as prodrugs.
  • the adenoviral constructs comprising the p53 gene (Adp53) or the p53 and FCU1 genes (Adp53FCUl) or a non-recombinant adenoviral construct (Ad null) are injected at a dose of 5.10 8 UI on three consecutive days (D + 9, D + 10 and J-rll). From D + 9, 1 ml of 0.9% saline solution or 1 ml of a 1% 5-FC solution are injected mtrapé ⁇ tonéale, twice a day. The results presented in FIG. 10 show an increase in the survival rate of the mice in which the Adp53FCU1 was injected and who were treated with 5-FC.
  • the cancer cells present in patients to be treated generally express a non-functional form of p53. Consequently, in order to test the compositions of the invention under conditions comparable with the pathological situations, the adenoviral constructs of the preceding examples were used to infect m vitro 3 types of tumor cell lines: - The SK-BR-3 tumor line (ATCC HTB-22) whose p53 gene is mutated and codes for a non-functional p53 protein (Arg ⁇ 75 > HIS I75 ) (Kovach et al,
  • T47-D tumor line ATCC HTB-133 whose p53 gene is mutated and codes for a non-functional p53 protein (Leu 19 > HIS I94 ) (Nigro et al, 1989, Nature, 342, 705-708)
  • the WiDr tumor line (ATCC CCL-218) whose p53 gene is mutated and codes for a non-functional p53 protein (Arg 273 > H ⁇ s 2 7 3 ) (Li et al,
  • Adp53 and Adp53FCU1 an adenovirus expressing the p53 polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant: (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53, (ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.

Description

Composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère
La présente invention concerne une composition cytotoxique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie de la protéine p53 et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, notamment antitumorale ou antivirale. La présente invention est particulièrement utile dans le cadre de la mise en oeuvre d'un traitement par thérapie génique de maladies prolifératives ou infectieuses.
La p53 est une phosphoprotéine nucléaire intervenant notamment dans le contrôle de l'expression des protéines impliquées dans le cycle cellulaire (Ozbun et al, 1995, Adv. Cancer Res . 66, 71-141- Selter et al, 1994, Int. J. Biochem. 26, 145-154) et participant à de nombreux processus cellulaires liés à la stabilité du génome et à l'apoptose cellulaire (Harris et al, 1996, J. Natl . Cancer Inst. 88, 1442-1445 ; Kastan et al, 1991, Cancer Res. 51, 6304-6311 ; Kuerbitz et al, 1992, PNAS, 89, 7491-7495) .
Le gène p53 a été identifié et séquence. La séquence du cDNA est décrite dans Matlashe ski et al., 1984, EMBO J., 3, 3257-3262 et celle de la protéine dans Lamp , 1986, Mol. Cell Biol . , 6, 1379-1385. De même, des variants polymorphiques naturels et fonctionnels ont été identifiés pour lesquels certains amino acides sont remplacés par d'autres sans toutefois affecter la fonction p53. Par ailleurs, de nombreuses mutations ont été décrites dans la littérature relative au cancer qui peuvent se traduire par une perte de la fonction de cette protéine (Holstein et al, 1991, Science, 253, 49-53 ; Levine et al, 1991, Nature, 351, 453-456). Par exemple, Baker et al, (1989, Science, 244, 217) ont constaté que dans plus de 70% des tumeurs colorectales la fonction de ce gène p53 est perdue. Par ailleurs, plusieurs études m vi tro ont montré que la restauration de l'activité p53 dans les cellules déficientes pour cette activité permet de supprimer la croissance cellulaire ou d'induire l'apoptose des cellules (Baker et al, 1990, Science, 249, 912-915 ; Shaw et al, 1992, PNAS, 89, 4495-4499). De façon similaire, plusieurs études ont confirmé qu'il est possible de supprimer m vivo la croissance des cellules tumorales par l'application d'une thérapie visant à restaurer de l'activité du gène p53 défectueux (Fu]i ara et al, 1994, J. Natl. Cancer Inst . 86, 1458-1462 ; ills et al, 1994, Hum. Gène Therapy, 5, 1079-1088 ; Hamada et al, 1996, Cancer Res. 56, 3047-3054).
En outre, faisant suite aux travaux de Lowe et al. (1993, Cell 74, 957-967, 1994, Science 266, 807-810) mettant en évidence une résistance accrue de cellules tumorales n'exprimant pas le gène p53 à l'égard de différents types d'agents cytotoxiques et radiations, l'utilisation de la protéine p53 fonctionnelle, ou de son gène, a été envisagée afin de développer une méthode de sensibilisation des cellules tumorales auxdits agents. Plus particulièrement, il a été montré que la transfection d'une cellule tumorale humaine de colon dont le gène p53 est rendu inactif par mutation avec un plasmide exprimant le gène p53 sauvage permet m vi tro de sensibiliser cette cellule au 5-Fluorouracιle (5-FU) (Yang et al, 1996, Clin. Cancer. Res. 2, 1649-1657).
Nous avons maintenant mis en évidence de nouvelles compositions cytotoxiques dont les différents constituants sont choisis de façon à obtenir un effet synergique de leurs activités respectives et des propriétés améliorées desdits constituants. Plus particulièrement, de telles compositions permettent d' inhiber ou de retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort spécifique des cellules tumorales, une meilleure présentation des antigènes et/ou une stimulation des cellules immunes de l'organisme hôte. La présente invention offre une alternative avantageuse et efficace aux techniques de l'art antérieur, notamment pour traiter le cancer de 1 ' homme ou de 1 ' animal . L'invention concerne en premier lieu une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral, ou toute applications nécessitant la mort cellulaire, chez un mammifère comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53,
(ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.
Dans le cadre de la présente invention, il est possible d'utiliser en (i) l'intégralité de la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide p53 ou une partie seulement de ce polypeptide, ou un polypeptide dérivé ou muté, dans la mesure où la fonction de p53 est conservée. De telles séquences sont bien connues de l'homme du métier et il est possible de se référer par exemple à Matlashewski et al., 1984, EMBO J., 3, 3257-3262 , Prives et al., 1994, Cell, 78, 543-546 ou Chen et al., 1996, Gène et Deve . , 10, 2438-2451, dont les contenus sont incorporés dans la présente demande.
Par « polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique », on entend désigner toute substance peptidique susceptible d'induire ou d'activer une réponse immune dirigée spécifiquement contre une cellule tumorale
(l'activité cytotoxique est alors appelée activité antitumorale) ou une cellule infectée par un virus (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antivirale) ou d' inhiber la croissance et / ou la division d'une telle cellule tumorale ou infectée Selon un cas préféré, ladite activité cytotoxique se traduit par la mort de ladite cellule.
Etant donné les propriétés du polypeptide p53 comme transactivateur transcπptionnel (Farmer et al., 1992, Nature, 358, 83-86) ou comme polypeptide capable d' interagir avec d'autres protéines (Harπs, 1996, Carcmogenesis , 17, 1187-1198), l'activité p53 peut être mesurée par l'analyse de l'arrêt du cycle cellulaire en phase Gl/S et G2/M, de l'induction de l'apoptose, de la suppression de la transformation cellulaire induite par les oncogènes ou de l' inhibition de 1 ' angiogénèse .
L'activité cytotoxique d'un polypeptide donné, notamment une activité anti-tumorale, peut être évaluée m vi tro par la mesure de la survie cellulaire soit par des tests de viabilité à court terme (tel que par exemple le test au bleu tryptan ou MTT) , soit par des tests de survie clonogénique (formation de colonies) (Brown et outers, 1999, Cancer Research, 59, 1391-1399) ou m vivo par la mesure de la croissance des tumeurs (taille et/ou volume) dans un modèle animal (Ovejera et Houchens , 1981, Seitim. Oncol. , 8, 386-393) .
Selon une première variante, l'invention concerne une composition caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est choisi parmi les cytokmes, les protéines codées par un gène appelé « gène suicide » et les facteurs protéiques antiangiogéniques .
Plus particulièrement, lorsque ledit polypeptide en (ii) est une cytokme, il s'agit préférentiellement d'une cytokme choisie parmi les interférons α, β et γ, les mterleukines , et notamment l'IL-2, l'IL-4 l'IL-6, l'IL-10 ou l'IL-12, les facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et les facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C- CSF, M-CSF... ) . Selon un mode de réalisation préféré, ladite cytokme est sélectionnée parmi 1 ' mterleukme-2 (IL-2) et 1 ' mterféron gamma (IFN-γ) . L' mterleukme-2 est notamment responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, de la multiplication et de l'activation des cellules du système immunitaire (pour la séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09480). L'IFN-γ active les cellules phagocytaires et accroît l'expression des antigènes de surfaces de classe I et II du complexe majeur d' histocompatibilité (pour la séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09225) . Selon une seconde variante, l'invention concerne également une telle composition caractérisée en ce que ledit polypeptide en (il) présente au moins une activité enzymatique sélectionnée parmi l'activité thymid e k ase, l'activité puπne nucleoside phosphorylase, l'activité guanme ou uracile ou orotate phosphoribosyl transférase et l'activité cytosme désammase .
Plusieurs études ont permis d'identifier des polypeptides qui ne sont pas toxiques en tant que tels mais qui présentent des propriétés enzymatiques catalytiques capables de transformer une substance inactive (prédrogue) , par exemple un nucleoside ou un analogue de nucleoside, en substance hautement toxique pour la cellule, par exemple un nucleoside modifié qui peut être incorporé dans les chaînes d'ADN ou d'ARN en élongation, avec pour conséquence, notamment, l' inhibition de la division cellulaire ou des dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort de la cellule renfermant de tels polypeptides. Les gènes codant pour de tels polypeptides sont dits « gènes suicides ». De nombreux couples gène suicide / prédrogue sont actuellement disponibles. On peut citer plus particulièrement, les couples :
- la thymidme kmase du virus herpès simplex de type 1 (TK HSV-1) et l'acyclovir ou le ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc . Natl. Acad. Sci . USA 90 , 7024-7028 ; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552 , Ram et al., 1997, Nat . Med. 3 , 1354-1361) ;
- le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide ( ei et al., 1994, Human Gène Therapy 5, 969-978) ;
- la purme nucleoside phosphorylase d ' Escherichia coli ( E. Coli ) et la 6-methylpurme deoxyπbonucleoside (Sorscher et al., 1994, Gène Therapy 1, 233-238) ;
- la guanme phosphoribosyl transférase d ' E. coli et la 6-thιoxanthme (Mzoz et Moolten, 1993, Human Gène
Therapy 4 , 589-595) et
- la cytosme désammase (CDase) et la 5- fluorocytosme (5FC) .
Plus particulièrement, la CDase est un enzyme qui intervient dans la voie métabolique des pyrimidmes par laquelle la cytosme exogène est transformée par le biais d'une desammation hydrolytique en uracile. Des activités CDases ont été mises en évidence chez les procaryotes et les eucaryotes inférieurs (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteπol. 102 , 607-615 ; Beck et al., 1972, J. Bacteriol . 110 , 219-228 ; De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 38 , 257-263 ; Hoepπch et al., 1974, J. Inf . Dis. 130 , 112-118 ; Esders et Lynn, 1985, J. Biol . Chem. 260 , 3915-3922) mais elles sont absentes chez les mammifères (Koechl et al., 1966, Biochem Pharmacol . 15, 435-446 ; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22 , 137-153). Les gènes FCY1 de Saccharomyces cerevi siae ( S . cerevisiae) et co A d'E. coli codant respectivement pour la CDase de ces deux organismes sont connus et leurs séquences publiées (EP 402 108 ; Erbs et al., 1997, Curr. Genêt. 31 , 1-6 ; O93/01281) .
La CDase désamme également un analogue de la cytosme, la 5-fluorocytosme (5-FC) en 5-fluorouracile (5-FU) qui est un composé hautement cytotoxique notamment lorsqu' il est converti en 5-fluoro-UMP (5-FUMP) . Les cellules dépourvues d'activité CDase, en raison soit d'une mutation inactivante du gène codant pour l'enzyme, soit de leur déficience naturelle pour cette enzyme (par exemple les cellules mammifères) sont résistantes au 5-FC (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteπol . 102 , 607-615 ; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol . 1989 171 , 2124-2127). Par contre, il a été montré qu'il est possible de transmettre la sensibilité au 5-FC à des cellules mammifères dans lesquelles la séquence codant pour une activité CDase a été transférée (Huber et al., 1993, Cancer Res. 53 , 4619- 4626 ; Mullen et al., 1992, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89 , 33-37 ; WO 93/01281). De plus, dans ce cas, les cellules avoismantes non transformées deviennent également sensibles au 5-FC (Huber et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 , 8302-8306). Ce phénomène, appelé effet de voisinage (bystander en anglais), est dû à l'excrétion par les cellules exprimant l'activité CDase, de 5-FU qui intoxique les cellules voisines par simple diffusion à travers la membrane cellulaire. Cette propriété de diffusion passive du 5-FU constitue un avantage par rapport au système de référence tk/GCV pour lequel l'effet de voisinage nécessite un contact avec les cellules qui expriment tk (Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 , 1831-1835) . Cet effet constitue par conséquent un atout supplémentaire de l'utilisation de la CDase dans le cadre de la thérapie génique, notamment anticancéreuse.
Cependant, la sensibilité au 5-FC varie beaucoup selon les lignées cellulaires. Une faible sensibilité est observée par exemple dans des lignées tumorales humâmes PANC-1 (carcinome de pancréas) et SK-BR-3 (adénocarcmome du sem) transduites par un rétrovirus exprimant le gène codA d' E. Coli (Harris et al., 1994, Gène Therapy 1, 170- 175) . Ce phénomène indésirable pourrait s'expliquer par l'absence ou la faible conversion endogène du 5-FU formé par l'action enzymatique de la CDase en 5-FUMP cytotoxique. Cette étape, normalement assurée dans les cellules mammifères par l' orotate phosphorybosyl transférase (Peters et al., 1991, Cancer 68 , 1903-1909), peut être absente dans certaines tumeurs et rendre ainsi la thérapie génique, basée sur la CDase, inopérante.
Chez les procaryotes et eucaryotes inférieurs, 1' uracile est transformée en UMP par l'action de l' uracile phosphoribosyl transférase (présentant par conséquent une activité UPRTase) . Cette enzyme convertit également le 5- FU en 5-FUMP. Ainsi des mutants furl de la levure S . cerevisiae sont résistants à de fortes concentrations de 5-FU (10 mM) et de 5-FC (10 mM) car en absence d'activité UPRTase, le 5-FU, provenant de la desammation du 5-FC par la CDase, n'est pas transformé en 5-FUMP cytotoxique (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteπol . 102 , 607-615). Les gènes upp et FUR1 codant pour l' UPRTase respectivement d'E. coli et de S . cerevisiae ont été clones et séquences (Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204 , 51-56 ; Kern et al., 1990, Gène 88 , 149-157) .
Au sens de la présente invention, un polypeptide ayant une activité UPRTase désigne un polypeptide capable de convertir l' uracile ou un de ses dérivés en un analogue monophosphaté et, en particulier la 5-FU en 5-FUMP. Par «mutation», il faut entendre l'addition, la délétion et/ou la substitution d'un ou plusieurs résidus à un endroit quelconque dudit polypeptide. L' UPRTase native dont il est question dans la présente invention peut être d'une origine quelconque, notamment procaryotique, fongique ou de levure. A titre îllustratif, les séquences d'acide nucléique codant pour les UPRTases d'E. coli (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204 , 51-56), de Lactococcus lacti s (Mart ussen et Hammer, 1994, J. Bacteriol . 176, 6457-6463), de Mycobacteπum bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol . Int 41 , 1117-1124) et de Bacillus subtili s (Martmussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention. Mais on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre une UPRTase de levure et notamment celle codée par le gène FUR1 de S . cerevi siae dont la séquence divulguée dans Kern et al. (1990, Gène 88 , 149-157) est introduite ici par référence. A titre indicatif, les séquences des gènes et celles des UPRTases correspondantes peuvent être trouvées dans la littérature et les banques de données spécialisées (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medlme...).
Par ailleurs, la demande PCT/FR99/00904 décrit un gène FUR1 dépourvu de 105 nucléotides en 5 ' de la partie codante permettant la synthèse d'une UPRTase délétée des 35 premiers résidus en position N-termmale et débutant à la méthionme en position 36 dans la protéine native. Le produit d'expression du gène mutant, désigné FUR1A105 , est capable de complémenter un mutant furl de S . cerevi siae . En outre, le mutant tronqué présente une activité UPRTase supérieure à celle de l'enzyme native. Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polypeptide codé selon l'invention est un mutant de délétion d'une UPRTase native. La délétion est de préférence localisée dans la région N-termmale de 1' UPRTase d'origine. Elle peut être totale (concerner l'ensemble des résidus de ladite région N-termmale) ou partielle (concerner un ou plusieurs résidus continus ou non dans la structure primaire) . D'une manière générale, un polypeptide est constitué de parties N-termmale, centrale et C-terminale, chacune représentant environ le tiers de la molécule. Par exemple, l' UPRTase de S . cerevi siae ayant 251 acides aminés, sa partie N-termmale est constituée des 83 premiers résidus débutant à la méthionme dite initiatrice située en première position de la forme native. Quant à l' PRTase d'E. coli , sa partie N- termmale couvre les positions 1 à 69.
Ainsi, d'une manière tout à fait préférée, le polypeptide selon PCT/FR99/00904 dérive d'une UPRTase native au moins par délétion de tout ou partie de la région N-termmale en amont du second codon ATG de ladite UPRTase native. La délétion totale de la région précitée est préférée. Par exemple, 1 ' UPRTase codée par le gène FUR1 comprend un premier codon ATG (codon ATG initiateur) en position +1 suivi d'un second en position +36. Ainsi, la délétion des résidus +1 à 35 peut être envisagée dans le cadre de la présente invention, donnant un polypeptide débutant à la méthionine trouvée normalement en position +36 de la forme native.
Un polypeptide préféré selon PCT/FR99/00904 comprend une séquence en acides aminés sensiblement telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 1, débutant au résidu Met en position 1 et se terminant au résidu Val en position 216. Le terme « sensiblement » fait référence à un degré d' identité avec ladite séquence IDS NO: 1 supérieure à 70%, avantageusement supérieur à 80%, de préférence, supérieure à 90% et, de manière tout à fait préférée, supérieur à 95%. Encore plus préférentiellement , il comprend la séquence en acides aminés représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 1. Comme mentionné ci-dessus, il peut comporter des mutations supplémentaires . On peut citer notamment la substitution du résidu serine en position 2 (position 37 dans 1 ' UPRTase native) par un résidu alanine .
En outre, les demandes de brevet W096/16183 et PCT/FR99/00904 décrivent l'utilisation d'une protéine de fusion codant pour une enzyme à deux domaines ayant les activités CDase et UPRTase et démontrent que le transfert d'un gène hybride codA : : upp ou FCY1 : : FUR1 ou
FCY1 : : FUR1A105 porté par un plasmide d'expression augmente la sensibilité au 5-FC de cellules B16 transfectées . Les séquences protéiques et nucléiques décrites dans ces deux demandes sont incorporées dans la description de la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide selon PCT/FR99/00904 est un polypeptide de fusion dans lequel il est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide. Bien que la fusion puisse avoir lieu à un endroit quelconque du premier polypeptide, les extrémités N ou C- terminales sont préférées et notamment l'extrémité N-terminale. Avantageusement, la fusion en phase met en oeuvre un second polypeptide présentant une activité cytosine désaminase (CDase) et dérivant d'une cytosine désaminase native, de sorte que le polypeptide de fusion selon l'invention présente les activités CDase et UPRTase. Une fusion FCY1 : : FUR1 est préférée. Un tel polypeptide bifonctionnel permet d'améliorer la sensibilité des cellules cibles à la 5-FC et à la 5-FU. De préférence, le second polypeptide selon l'invention est capable de métaboliser la 5-FC en 5-FU.
Selon PCT/FR99/00904, on a recours à une CDase d'origine procaryote ou eucaryote inférieur. Encore plus préférentiellement , il s'agit d'une CDase de levure et en particulier celle codée par le gène FCY1 de Saccharomyces cerevisiae . Le clonage et la séquence des gènes codant pour les CDases de différentes sources sont disponibles dans la littérature et les banques de données spécialisées. On indique que la séquence du gène FCY1 est divulguée dans Erbs et al. (1997, Curr. Genêt. 31 , 1-6) . Il est bien entendu possible d'utiliser un mutant de CDase ayant une capacité de conversion comparable ou supérieure à celle de l'enzyme native. L'homme de l'art est capable de cloner les séquences CDase à partir des données publiées, de procéder à d'éventuelles mutations, de tester l'activité enzymatique des formes mutantes dans un système acellulaire ou cellulaire selon la technologie de l'art ou en suivant le protocole indiqué ci-après et de fusionner en phase les polypeptides d'activité CDase et UPRTase.
Un exemple préféré est un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés sensiblement telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 2, débutant au résidu Met en position 1 et se terminant au résidu Val en position 373. Le terme « sensiblement » a la définition donnée précédemment. Un polypeptide comprenant la séquence en acides aminés telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 2 convient tout particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention. Une fusion des activités CDase et UPRTase permet d'améliorer la sensibilité des cellules cibles à la 5-FC et à la 5-FU.
L'homme de l'art est capable de cloner les séquences de CDase ou UPRTase à partir des données publiées, de procéder à d'éventuelles mutations, de tester les activités enzymatiques des formes mutantes dans un système acellulaire ou cellulaire selon la technologie de l'art ou en suivant le protocole indiqué dans la demande PCT/FR99/00904 et de fusionner, notamment en phase, les polypeptides d'activité CDase et UPRTase, et par conséquent tout ou partie des gènes correspondants.
D'une manière générale, un polypeptide selon l'invention peut être produit par les méthodes conventionnelles de synthèse chimique ou bien par les techniques de 1 'ADN recombinant (voir par exemple Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual , Cold Sprmg Harbor, Laboratory Press, Cold Sprmg Harbor, NY) . Ainsi selon le procédé de préparation décrit dans PCT/FR99/00904 on introduit une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide dans une cellule pour générer une cellule transformée, on cultive ladite cellule transformée dans des conditions appropriée pour permettre la production dudit polypeptide et on récolte ledit polypeptide à partir de la culture cellulaire. La cellule productrice peut être d'une origine quelconque et sans limitation, une bactérie, une levure ou bien une cellule de mammifère, dans la mesure où la séquence nucléotidique considérée est soit intégrée dans son génome soit intégrée dans un vecteur d'expression approprié capable de se répliquer. Bien entendu, la séquence nucléotidique est placée sous le contrôle de signaux de transcription et de traduction permettant son expression dans la cellule productrice. Vecteurs d'expression et signaux de contrôle sont connus de l'homme du métier. Quant au polypeptide, il peut être récupéré du milieu ou des cellules (après lyse de celles- ci) et soumises à des étapes de purifications classiques (par chromatographie , électrophorèse, filtration, immunopurification etc...) .
PCT/FR99/0904 décrit également une séquence nucléotidique codant pour undit polypeptide qui peut être une séquence ADNc ou génomique ou de type mixte. Elle peut éventuellement contenir un ou plusieurs mtrons, ceux-ci étant d'origine native, hétérologue (par exemple l'mtron du gène β-globme de lapin...) ou synthétiques afin d'augmenter l'expression dans les cellules hôtes. Comme dé à indiqué, ladite séquence peut coder pour un polypeptide dérivant de l'enzyme native ou un mutant présentant une activité comparable ou améliorée. Les séquences employées peuvent être obtenues par les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple par criblage de banque à l'aide de sondes spécifiques, par immunocriblage de banque d'expression, par PCR au moyen d'amorces adéquates ou par synthèse chimique. Les mutants peuvent être générés à partir des séquences natives par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides en mettant en oeuvre les techniques de mutagénèse dirigée, de PCR, de digestion par les enzymes de restriction et ligation ou encore par synthèse chimique. La fonctionnalité des mutants et des constructions peut être vérifiée par le dosage de l'activité enzymatique ou par la mesure de la sensibilité de cellules cibles aux 5-FC et/ou 5-FU.
Par conséquent, selon un cas précis, la composition de l'invention est caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique (n) est sélectionnée parmi les séquences nucléiques des gènes CodA, upp, FUR1 , FCY1 et FUR1Δ105, ou par une combinaison de tout ou partie desdites séquences.
L'invention concerne plus particulièrement une dite composition caractérisée en ce que ledit polypeptide en (ii) présente au moins une activité CDase et une activité UPRTase.
Par « combinaison de séquences d'acide nucléique » on entend désigner aussi bien des séquences distinctes qui codent pour au moins deux polypeptides distincts que des séquences fusionnées qui codent pour des polypeptides de fusion, étant entendu que la production de tels polypeptides peut être réalisée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation (cassette polycistronique) ou d'éléments indépendants, identiques ou différents, homologues ou hétérologues vis à vis du vecteur les renfermant, constitutifs ou inductibles.
Selon un mode particulier de réalisation, la composition de l'invention comprend au moins une séquence d'acide nucléique (ii) codant pour un polypeptide de fusion dans lequel un premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide, ledit second polypeptide présentant une activité CDase ou UPRTase, respectivement.
Plus particulièrement, un tel polypeptide est caractérisé en ce que la fusion avec le second polypeptide est réalisée à l'extrémité N-terminale dudit premier polypeptide .
Selon un cas préféré, ladite composition est caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide de fusion est une séquence hybride comprenant :
- une première séquence d'acide nucléique codant pour un premier polypeptide présentant une activité
UPRTase ou CDase, - une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un second polypeptide présentant une activité Cdase ou UPRTase, respectivement.
Une telle séquence d'acide nucléique hybride codant pour ledit polypeptide de fusion peut en outre renfermer une séquence de type IRES .
L'invention concerne notamment une telle composition pour laquelle la première séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi upp, FUR1 et FUR1Δ105, et en ce que la seconde séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi CodA et FCY1 , et vice-versa. De manière tout à fait préférée, une telle séquence d'acide nucléique hybride est choisie parmi les séquences hybrides décrites dans les demandes de brevet W096/16183 et PCT/FR99/00904. Selon une troisième variante, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique (ii) est un facteur protéique anti-angiogénique . L' angiogénèse est le processus responsable de la formation de nouveaux capillaires à partir du réseau vasculaire dé à existant. Ce processus complexe est finement régulé dans les tissus sains par la balance des effets de nombreux facteurs angiogémques et anti-angiogéniques . Cependant, dans certaines pathologies, et notamment lors de la formation d'une tumeur, ce processus est dérégulé : les facteurs angiogémques prennent le pas sur les facteurs anti- angiogéniques ce qui permet une vasculaπsation importante des tumeurs et par voie de conséquence leur développement rapide et / ou l'apparition de métastases. C'est pourquoi, dans le cadre de la présente invention, un facteur anti- angiogémque est considéré comme étant un agent cytotoxique, notamment antitumoral. Parmi les différents facteurs anti -angiogémques connus à l'heure actuelle on peut: notamment citer 1 ' angiostatme, 1 ' endostatme, le facteur plaquettaire PF4 , la thrombospondme-1 , le PRP (pour Prolifer Related Protein) , le VEGI (pour Vascular Endothelial Growth Inhibitor) et l'urokmase.
Les séquences d'acide nucléique (i) ou (11) peuvent être aisément obtenues par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques conventionnelles en usage. Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces derniers par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieur nucléotides. Par ailleurs, leur séquences sont largement décrites dans la littérature consultable par l'homme de l'art.
La présente invention a également trait à une composition telle que présentée ci-dessus caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (il) sont insérées dans un vecteur recombinant d'origine plasmidique ou virale, ainsi qu'à un tel vecteur recombinant portant de telles séquences nucléotidiques placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte.
Plus particulièrement, les compositions de l'invention peuvent comprendre lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) insérées dans un même vecteur recombinant ou dans des vecteurs recombinants distincts.
Par « vecteur recombinant » selon l'invention, on entend désigner un vecteur d'origine plasmidique ou virale, et éventuellement un tel vecteur associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et / ou la stabilité dudit vecteur et/ou la protection dudit vecteur in vivo à l'égard du système immunitaire de l'organisme hôte. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol . Soc. 32 , 115-121 ; Hodgson et Solaiman , 1996, Nature Biotechnology 14 , 339-342 ; Remy et al., 1994, Biocon ugate Chemistry 5, 647-654). A titre îllustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment catiomques, de liposomes, de protéines nucléaires ou virales ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Des exemples de tels composés sont notamment disponibles dans les demandes de brevet WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 ou WO 99/05183. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermme-chol , spermidme-chol etc...) et des lipides neutres (DOPE) .
Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (Gibco BRL) , pUC (Gibco BRL) , pBluescript (Stratagène) , pREP4 , pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201) . De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oπP/EBNAl si l'on désire qu'il soit autoréplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Lev e, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 ; Yates et al., Nature 313 , 812- 815) . Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d ' auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...) . Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monoméπque d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire) .
S 'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un poxvirus (virus de la vaccine, notamment MVA, canaripox... etc) , d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un foamyvirus ou d'un virus associé à 1 ' adénovirus . On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif et non tégratif. A cet égard, les vecteurs adénoviraux conviennent tout particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention. Toutefois, il convient de noter ici que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, la nature du vecteur revêt peu d'importance. Les rétrovirus ont la propriété d' infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un rétrovirus recombinant selon l'invention comporte généralement les séquences LTR, une région d' encapsidation et la séquence nucléotidique selon l'invention placée sous le contrôle du LTR rétroviral ou d'un promoteur interne tels que ceux décrits ci-après. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque
(murm, primate, félin, humain, etc.) et en particulier du MoMuLV (Moloney murme leukemia virus) , MVS (Murme sarcoma virus) ou Friend murme rétrovirus (Fb29) . Il est propagé dans une lignée d' encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc...) . Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTR (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d' encapsidation (remplacement par une région d' encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203) .
On pourra également avoir recours à un vecteur adénoviral défectif pour la réplication c'est à dire dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions El, E2 , E4 et. Une délétion de la région El est préférée. Mais elle peut être combinée à d'autres modification (s) / délétion (s) touchant notamment tout ou partie des régions E2 , E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles détectives sont complémentées en trans au moyen d'une lignée de complémentation et/ou d'un virus auxiliaire afin d'assurer la production des particules virales d'intérêt. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales WO 94/28152 et WO 97/04119) . A titre îllustratif , la délétion de la majorité de la région El et de l'unité de transcription E4 est tout particulièrement avantageuse. Dans le but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adénoviral peut en outre être dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle. Selon une autre alternative, on peut mettre en oeuvre un vecteur adénoviral minimal retenant les séquences essentielles à 1 ' encapsidation, à savoir les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d ' encapsidation. Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, murme, ovine, porcine, simienne...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol . , 1993, 128: 171-176 , Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol . , 1989, 70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gène, 1987, 60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré m vitro dans Escheπchia coli (E. coli) par ligation ou recombmaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO 96/17070) ou encore par recombmaison dans une lignée de complémentation. Les différents vecteurs adénoviraux ainsi que leurs techniques de préparation sont connus
(voir par exemple Graham et Prevect, 1991, m Methods m
Molecular Biology, vol 7, p 109-128 ; Ed : E.J. Murey, The Human Press Inc) .
Les éléments nécessaires à l'expression sont constitués par l'ensemble des éléments permettant la transcription de la séquence nucléotidique en ARN et la traduction de l'ARNm en polypeptide, notamment les séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requises pour permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. Ces éléments peuvent être régulables ou constitutifs. Bien entendu, le promoteur est adapté au vecteur retenu et à la cellule hôte On peut citer, à titre d'exemples, les promoteurs eucaryotes des gènes PGK
(Phospho Glycérate Kmase) , MT (metallothioneme ; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol . 7, 838-848), α-1 antitrypsme, CFTR, les promoteurs du gène codant pour la créâtme kmase musculaire, pour l'actme, pour le surfactant pulmonaire, îmmunoglobulme, β-actme (Tab et al., 1982, Mol. Cell Biol . 2, 426-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus) , le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus) , le promoteur de MPSV, le promoteur TK-HSV- 1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) , les promoteurs du virus de la vaccine p7.5K pH5R, pKlL, p28, pli et les promoteurs adénoviraux E1A et MLP ou une combinaison desdits promoteurs. Il peut également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sem et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryomc antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosmose surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sem et du pancréas (Harπs et al., 1994, Gène Therapy 1, 170-175) et α-fétoproteme surexpπmée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). Le promoteur précoce du Cytomegalovirus (CMV) est tout particulièrement préféré. Il est également possible d'utiliser une région promotrice tissu-spécifîque, notamment lorsque la tumeur à traiter est issue d'un type cellulaire particulier, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices . Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionnels améliorant l'expression de la séquence nucléotidique selon l'invention ou son maintien dans la cellule hôte. On peut citer notamment les séquences mtromques (WO 94/29471), séquences signal de sécrétion, séquences de localisation nucléaire, sites internes de ré itiation de la traduction de type IRES, séquences poly A de terminaison de la transcription.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne plus particulièrement un vecteur recombinant, notamment un vecteur adénoviral défectif pour la réplication, comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53 ,
(ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte et étant définies comme indiqué ci-dessus. La présente invention a également pour objet une particule virale, notamment adénovirale, comprenant un vecteur viral recombinant selon l'invention. Une telle particule virale peut être générée à partir d'un vecteur viral selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art. Sa propagation est effectuée notamment dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences du vecteur. S 'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à une lignée de complémentation telle que décrite dans la demande WO 94/28152, à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), la lignée A549-E1 (Imler et al., 1996, Gène Therapy 3 , 75-84) ou une lignée permettant une double complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70 , 559-565 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gène Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al., 1995 Gène Therapy 2, 775-783 ; demande internationale WO 97/04119) . On peut également employer des virus auxiliaires pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives. Par cellule de complémentation, on entend une cellule capable de fournir en trans les facteurs précoces et/ou tardifs nécessaires à 1 ' encapsidation du génome viral dans une capside virale pour générer une particule virale contenant le vecteur recombinant. Ladite cellule peut ne pas complémenter à elle seule toutes les fonctions défectives du vecteur et dans ce cas peut être transfectée / transduite par un vecteur / virus auxiliaire apportant les fonctions complémentaires .
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel :
(i) on introduit un vecteur recombinant selon l'invention dans une cellule, notamment une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une dite cellule transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et
(iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également à partir des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation / décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse . Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium... ) . L'invention a également trait à une cellule hôte eucaryote comprenant les fragments d'ADN présents dans la composition selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine. Il s'agira de préférence d'une cellule 293, LCA4 ou PERC6. Une telle cellule est notamment utile pour produire les particules virales à haut titre, sans générer de particules compétentes pour la réplication . L' invention concerne également une cellule hôte comprenant une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant selon l'invention ou infectée par une particule virale selon l'invention. Aux fins de la présente invention, une cellule hôte est constituée par toute cellule transfectable par un vecteur recombinant ou mfectable par une particule virale, tels que définis ci- avant. Une cellule de mammifère et notamment numa e convient tout particulièrement. Elle peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée dans le génome ou non (épisome) . Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment hématopoiétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire (cellule satellite, myocyte, myoblaste, muscle lisse...), cardiaque, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
L'invention concerne également une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral, ou toute applications nécessitant la mort cellulaire, chez un mammifère comprenant :
(i) tout ou partie du polypeptide p53,
(ii) tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdits polypeptides étant définis comme indiqué précédemment .
Un autre objet selon l'invention consiste en une formulation destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte une composition (à base d'acide nucléique ou de polypeptide telle que décrite précédemment) , un vecteur adénoviral ou une particule virale selon l'invention, ainsi qu'un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support est préfèrentîellement isotonique, hypotomque ou faiblement hypertomque et présente une force ionique relativement faible, tel que par exemple une solution de sucrose . Par ailleurs, un tel support peut renfermer tout solvant, ou liquide aqueux ou partiellement aqueux tel que de l'eau stérile non pyrogène. Le pH de la formulation est en outre ajusté et tamponné afin de répondre aux exigences α ' utilisation m vivo . La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Pour une administration injectable, on préfère une formulation en solution aqueuse, non-aqueuse ou isotonique. Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisât...) susceptible d'être reconstituée de manière extemporanée par un diluant approprié .
Selon un mode particulier de l'invention, ladite formulation comporte en outre des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prodrogue capable d'être transformée en molécule cytotoxique par un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique.
Une telle prodrogue sera notamment sélectionnée dans le groupe consistant en l'acyclovir ou le ganciclovir
(GCV) , la cyclophosphophamide, la 6-méthylpurme deoxyribonucleoside, la 6-thιoxanthme, la cytosine ou un de ses dérivés ou l' uracile ou un de ses dérivés. De manière tout à fait préférée, ladite prodrogue est la 5- fluorocytosme (5FC) ou la 5-fluorouracile (5-FU ) .
Par ailleurs, notamment dans le cadre de formulations renfermant une composition selon la seconde variante évoquée ci -dessus, il convient de noter que ladite formulation peut également comprendre une ou plusieurs substances potentialisant l'effet cytotoxique du 5-FU. On peut citer en particulier, les drogues inhibant les enzymes de la voie de biosynthèse de novo des pyrimidmes (par exemple celles citées ci-après) , les drogues telles que la Leucovor (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol . 18 , 685-692) qui en présence du produit du métabolisme du 5-FU (5-FdUMP) augmente 1' inhibition de la thymidylate synthase ce qui entraîne une diminution du pool de dTMP nécessaire à la réplication et enfin les drogues telles que le méthotréxate (Cadman et al., 1979, Science 250 , 1135-1137) qui en inhibant la dihydrofolate réductase et en élevant le pool d' incorporation de PRPP (phosphoribosylpyrophosphate) provoque l'augmentation de 5-FU dans 1 'ARN cellulaire.
Une formulation selon 1 ' invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives (cancers, tumeurs, resténose ... etc) et aux maladies d' origine infectieuse, notamment virale pour lesquelles il est nécessaire de limiter la prolifération des cellules infectées (induites par les virus de l'hépatite B ou C, le HIV, l'herpès, les rétrovirus .... etc .) . Une formulation selon 1 ' invention peut être fabriquée de manière conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou digestive. Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut citer par exemple la voie mtragastrique, sous- cutanée, mtracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, mtrapéπtonéale, mtratumorale, mtranasale, mtrapulmonaire ou tratrachéale . Pour ces trois derniers modes de réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu, de la maladie à traiter ou encore du ou des gène (s) d'intérêt à transférer. Les préparations à base de particules virales selon 1 ' invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 1013 ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. Pour ce qui est du vecteur recombinant selon l'invention, des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées. Une composition à base de polypeptides comprend de préférence de 0,05 à 10 g et, de manière tout à fait préférée, de 0,5 à 5 g dudit polypeptide. Bien entendu, les doses peuvent être adaptées par le clinicien.
La présente invention est également relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'une composition, d'un vecteur recombinant ou d'une particule virale selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique, notamment pour la préparation d'un médicament antitumoral ou antiviral destiné à inhiber la croissance ou provoquer le rejet d'une tumeur ou la mort d'une cellule infectée. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible ou à sa périphérie, dans les poumons par aérosol, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée...) . On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter m vi tro selon les techniques de l'art et de les réadmi ster au patient. Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications envisageables, on peut citer les cancers du sem, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomas virus) , de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du larynx du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie etc...) . Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose) . Enfin pour ce qui esc des maladies infectieuses, l'application au SIDA peut être envisagée.
Il est par ailleurs envisageable, le cas échéant et sans sortir du cadre de la présente invention, de procéder à des administrations simultanées ou successives par des voies différentes des différents composants compris dans la composition ou la formulation pharmaceutique selon l'invention.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement des maladies par thérapie génique, caractérisé en ce que l'on administre à un organisme ou à une cellule hôte ayant besoin d'un tel traitement une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant, une particule virale ou une cellule hôte selon l'invention. Lorsque la méthode de traitement met en oeuvre une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant ou une particule virale permettant l'expression d'un polypeptide selon l'invention ayant une activité UPRTase, il peut être avantageux d'administrer en outre une seconde séquence nucléotidique codant pour un second polypeptide présentant une activité CDase, ladite seconde séquence nucléotidique étant portée par ledit vecteur recombinant ou particule virale ou par un vecteur ou une particule virale indépendante. Dans ce dernier cas, l'administration des séquences UPRTase et CDase peut être simultanée ou consécutive, l'ordre d'administration étant sans importance .
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement comprend également une étape supplémentaire selon laquelle on administre à l'organisme ou la cellule hôte des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prédrogue, avantageusement d'un analogue de cytosine et, en particulier de la 5-FC. A titre îllustratif, une dose de 50 à 500 mg/kg/jour peut être employée avec une préférence pour 200 mg/kg/jour. Dans le cadre de la présente invention, la prédrogue est administrée selon les pratiques standards et ceci de manière préalable, concomittante ou encore postérieure à celle de l'agent thérapeutique selon l'invention. La voie orale est préférée. On peut administrer une dose unique de prédrogue ou des doses répétées pendant un temps suffisamment long pour permettre la production du métabolite toxique au sein de l'organisme ou de la cellule hôte.
Selon une mode avantageux de l'invention, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement est associée à un second traitement du patient par chirurgie (notamment par ablation de la tumeur partiellement ou totalement) , par radiothérapie ou chimiothérapie. Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit second traitement. De manière préféré, ce traitement sera appliqué suite audit second traitement.
Les exemples qui suivent ont pour but d' illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif.
La figure 1 montre l'effet antiprolifératif in vi tro d'un tampon (Mock) , d'un adénovirus vide (Ad-null), d'un adénovirus exprimant FCUl (Ad-FCUl) ou p53 (Ad-p53) ou p53 et FCUl (Ad-p53FCUl) sur les cellules SW480 à une MOI de 1 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées) .
La figure 2 montre l'effet antiprolifératif in vi tro de Mock, d'un adénovirus vide, d'un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl sur les cellules B16F0 à une MOI de 100 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées) .
La figure 3 montre l'effet antiprolifératif in vi tro de Mock, d'un adénovirus vide, d'un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl sur les cellules LoVo à une MOI de 1 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées) .
La figure 4 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules SW480 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 5 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules B16F0 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 6 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules LoVo infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 7 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules SW40 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 8 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules B16F0 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 9 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules LoVo infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 10 représente le taux de survie de souris B6D2 dans lesquelles ont été implantées des cellules tumorales B16F0 traitées par différentes compositions adénovirales . La figure 11 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules SK-BR-3 (ATCC HTB-22) infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 12 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules T47-D
(ATCC HTB-133) infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
La figure 13 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules WiDr (ATCC CCL-218) infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCUl ou p53 ou p53 et FCUl (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue) .
EXEMPLES :
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual , Cold Sprmg Harbor, Laboratory Press, Cold Sprmg Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial . Les étapes de recombmaison homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5 ' protubérantes à l'aide du grand fragment de 1 'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow) . Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260. En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites et cultivées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier.
EXEMPLE 1 : Construction d'un adénovirus exprimant p 53 (Adp53) .
La région codante de p53 a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pC53-SN3 (Baker et al., 1990, Science 249, 912-915) utilisé comme matrice et des amorces suivantes :
En 5' terminal :
5 ggcagccagaattccttccgggtcac3 ( SEQ ID NO : 3 ) En 3 ' terminal : 5 'ggctgtcagtggggatctagaagtggag3 ' (SEQ ID NO : 4 )
Les sites EcoRl et Xbal ont été introduits respectivement en 5 ' et en 3 ' de la séquence codante de p53. le fragment PCR de p53 a été coupé par EcoRI et Xbal puis inséré dans le plamide pCI-neo (Promega Corp) pour donner le plasmide pCI-neop53. Le fragment Xhol-Xbal de pCI-neop53 renfermant le gène p53 est isolé et introduit dans le vecteur pTG6600 (Lathe et al, 1987, Gène 57, 193- 201) clivé par ces mêmes enzymes, pour donner le vecteur de transfert pTG6600p53. Le vecteur adénoviral Adp53 est reconstitué par recomb aison homologue dans la souche E. coli BJ5183 entre le fragment PacI-BstEII de pTG6600p53 et le vecteur pTG6624 linéarisé par Clal . La construction finale Adp53 contient le génome de 1 'Ad5 délété de l'essentiel des régions El (nucléotides 459 à 3328) et E3 (nucléotides 28249 à 30758) et en lieu et place de El, une cassette d'expression du gène p53 placé sous le contrôle du promoteur précoce CMV et des séquences d'épissage hybrides β-globme/Ig. Les particules virales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293 (ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El.
EXEMPLE 2 : Construction d'un adénovirus exprimant une unité bicistronique p53 -IRES-FCUl (Adp53FCUl) .
Le fragment Ncol-Sall du plasmide pCI-neoFCUl décrit dans la demande de brevet française No. 98.05054 renfermant le gène de fusion FCUl est isolé et introduit dans le vecteur pTG4369 linéarisé par Ncol-Sall . Le plasmide pTG4369FCUl ainsi obtenu contient le gène FCUl en aval de la séquence IRES (pour Internai Ribosome Entry Site ou site interne d'entrée des ribosomes) de EMCV (encephalomyocarditis virus) . Le fragment Sacl-Notl de pCI-neop53 est isolé puis inséré dans le vecteur pTG4369FCUl linéarisé par Sacl-Notl pour donner le vecteur pTG4369p53FCUl dans lequel le gène p53 est placé en amont de la séquence IRES. Le fragment Nhel-Mlul de pTG4369p53FCUl renfermant la séquence p53IRESFCUl est inséré dans le vecteur pTG6600 clivé par ces mêmes enzymes pour donner le vecteur de transfert pTG6600p53IRESFCUl . Le vecteur adénoviral Adp53FCUl est reconstitué par recombmaison homologue dans la souche E. coli BJ5183 entre le fragment PacI-BstEII de pTG6600p53IRESFCUl et le vecteur pTG6624 linéarisé par Clal . La construction finale
Adp53FCUl contient le génome de l'Ad5 délété de l'essentiel des régions El (nucléotides 459 à 3328) et E3
(nucléotides 28249 à 30758) et en lieu et place de El, une cassette d'expression du bicistron p53-FCUl placé sous le contrôle du promoteur précoce CMV et des séquences d'épissage hybrides β-globme/lg. Les particules adénovirales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293 (ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El . EXEMPLE 3 : Construction de l' adénovirus exprimant le gène de fusion FCUl (AdFCUl) .
Le fragment Xhol-Mlul de pCI-neoFCUI (décrit dans la demande de brevet français No. 98.05054) renfermant le gène de fusion FCUl est isolé et introduit dans le vecteur pTG6600 linéairisé par Xhol-Mhul pour donner le vecteur de transfert pTG6600FCUl. Comme décrit précédemment, la recombinaison homologue entre le fragment PacI-BstEII portant FCUl et isolé de pTG6600FCUl et le vecteur pTG6624 linéarisé par Clal permet de générer le vecteur adénoviral pTG6624FCUl délété des régions El et E3 et comportant à la place de El le gène FCUl placé sous le contrôle du promoteur CMV et des séquences d'épissage hybrides β-globine/Ig . Les particules adénovirales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293
(ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El.
EXEMPLE 4 : Infection par les adénovirus AdFCUl, Adp53 et Adp53FCϋl. 4.1 Résultats in vitro .
Les constructions adénovirales des exemples précédents sont utilisées pour infecter in vi tro 3 lignées cellulaires tumorales :
- la lignée tumorale humaine SW480 (adénocarcinome de colon/ATCC CCL-228) dont le gène p53 n'est pas fonctionnel ,
- la lignée cellulaire tumorale humaine LoVo (adénocarcinome de colon / ATCC CCL-229) dont le gène p53 est fonctionnel et - la lignée mélanome de souris B16(F0) (ATCC CRL-
6322)
Les cellules sont infectées (MOI de 1 pour SW480 et LoVo et MOI de 100 pour B16(F0)) puis cultivées en présence ou en absence de prodrogue (5-fluorocytosine (5FC) ou 5-fluorouracile (5FU)) à différentes concentrations. Après trypsinisation (à J+10 pour SW480 et à J+8 pour B16(F0)), la viabilité des cellules est évaluée au bleu trypan. Les valeurs reportées correspondent aux moyennes obtenues après 4 comptages.
En absence de prodrogue (Figures 1 à 3) , on observe un effet antiprolifératif des cellules infectées par un adénovirus exprimant p53 (Adp53 et Adp53FCUl) dans les lignées SW480 principalement et plus faiblement dans les lignées B16F0. Toutefois, malgré l'expression de p53 qui induit l'apoptose ou la suppression de la croissance des cellules, aucun effet antiprolifératif n'est observé dans la lignée LoVo ; cela indique que la seule administration de p53, notamment dans des cellules tumorales dont le gène p53 est fonctionnel, est insuffisante, voire inopérante, pour permettre la mise en oeuvre d'un protocole de thérapie antitumorale efficace.
Au contraire, on constate qu'en présence de différentes concentrations de prodrogue 5FU (Figures 4 à 6) , les cellules infectées par Adp53 sont sensibilisées par rapport aux cellules non infectées ou infectées par un adénovirus non recombinant illustrant ainsi l'action connue de p53 dans la toxicité du 5FU. Toutefois, conformément à la présente invention, on constate également que, de manière surprenante, la présence de FCUl augmente très sensiblement la toxicité du 5FU dans les cellules (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de 5FU) traduisant ainsi un effet clairement synergique des deux types d'agent.
Les figures 7 à 9 illustrent les résultats analogues obtenus en utilisant 5FC comme prodrogue. Ces résultats mettent en évidence qu'il existe une synergie entre les produits d'expression de FCUl et de p53 pour l' induction de la mortalité lorsque le 5FC ou le 5FU sont utilisés comme prodrogues. 4.2 Résultats in vivo . Des cellules B16F(0) (3.105 cellules) sont injectées par voie sous cutanée à 4 groupes de 8 souris immunocompétentes B6D2 à JO . Dès que les tumeurs deviennent palpables (environ J+9), les constructions adénovirales comprenant le gène p53 (Adp53) ou les gènes p53 et FCUl (Adp53FCUl) ou une construction adénovirale non recombinante (Ad null) sont injectées à une dose de 5.108 UI à trois jours consécutifs (J+9, J+10 et J-rll) . A partir de J+9, 1 ml d'une solution saline à 0,9% ou 1 ml d'une solution de 5-FC à 1% sont injectées par voie mtrapéπtonéale, deux fois par jour. Les résultats présentés à la figure 10 mettent en évidence une augmentation du taux de survie des souris dans lesquelles a été injecté l'Adp53FCUl et qui ont été traitées au 5-FC.
EXEMPLE 5 : Infection de cellules exprimant une protéine p53 non fonctionnelle par AdFCUl, Adp53 et Adp53FCUl
Les cellules cancéreuses présentes chez des patients à traiter expriment généralement une forme non fonctionnelle de p53. Par conséquent, afin de tester les compositions de l'invention dans des conditions comparables avec les situations pathologiques, les constructions adénovirales des exemples précédents ont été utilisés pour infecter m vitro 3 types de lignées cellulaires tumorales : - La lignée tumorale SK-BR-3 (ATCC HTB-22) dont le gène p53 est muté et code pour une protéine p53 non fonctionnelle (Argι75 >HISI75) (Kovach et al,
1991, J. Nat. Cancer Inst . , 83, 1004-1009)
- La lignée tumorale T47-D (ATCC HTB-133) dont le gène p53 est muté et code pour une protéine p53 non fonctionnelle (Leu19 >HISI94) (Nigro et al, 1989, Nature, 342, 705-708)
- La lignée tumorale WiDr (ATCC CCL-218) dont le gène p53 est muté et code pour une protéine p53 non fonctionnelle (Arg273 >Hιs273) (Li et al,
1995, Int. J. Cancer, 64, 383-387) Les cellules sont infectées (MOI de 1) puis cultivées en présence ou en absence de différentes concentrations de prodrogue (5-fluorocytosme (5FC) ) selon les conditions décrites dans l'exemple 4. Après trypsmisation, la viabilité des cellules est évaluée au bleu trypan. Les valeurs reportées sur les figures 11 à 13 correspondent aux moyennes obtenues après 4 comptages .
Pour chacune de ces lignées, un effet antiprolifératif est observé en l'absence de prodrogue dans les cas où l'infection est réalisée par un adénovirus exprimant le polypeptide p53 (Adp53 et Adp53FCUl) .
Les résultats obtenus (Figures 11 à 13) sont comparables à ceux observés dans l'exemple 4. Plus particulièrement, on constate que la co-expression de p53 et de FCUl dans les cellules cultivées en présence de 5-FC augmente très sensiblement la toxicité de cette prodrogue à l'égard des cellules, confirmant ainsi l'effet synergique de ces deux produits d'expression.

Claims

REVENDICATIONS
1 Composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant .
(i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53 ,
(ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité antitumorale ou antivirale est choisi parmi les cytokmes, les protéines codées par les gènes suicides et les facteurs protéiques anti -angiogémques .
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est une cytokme choisie parmi les interférons α, β et γ, les mterleukmes, les facteurs nécrosant des tumeurs et les facteurs stimulateurs de colonies .
4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est 1 ' mterleukme-2 (IL-2).
5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est l' terféron gamma (IFN-γ) .
6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide présente au moins une activité cytotoxique sélectionnée parmi l'activité thymidme kmase, l'activité pur e nucleoside phosphorylase, l'activité guanme phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit polypeptide présente au moins une activité CDase et une activité UPRTase.
8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique (ii) est sélectionnée parmi CodA, upp, FUR1 , FCY1 et FUR1Δ105.
9. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit polypeptide est un polypeptide de fusion dans lequel un premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide, ledit second polypeptide présentant une activité CDase ou UPRTase, respectivement .
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la fusion avec le second polypeptide est réalisée à l'extrémité N-terminale dudit premier polypeptide.
11. Composition selon la revendication 9-10, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide de fusion est une séquence hybride comprenant :
- une première séquence d'acide nucléique codant pour un premier polypeptide présentant une activité
UPRTase, - une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un second polypeptide présentant une activité CDase.
12. Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que la première séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi upp, FUR1 et FUR1Δ105, et en ce que la seconde séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi CodA et FCY1.
13. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est un facteur protéique antiangiogénique choisi parmi 1 ' angiostatine, 1 ' endostatme, le facteur plaquettaire PF4 , la thrombospondme-1, le PRP, le VEGI et l'urokmase.
14. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (il) sont insérées dans un vecteur recombinant d'origine plasmidique ou virale.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (il) sont insérées dans le même vecteur recombinant .
16. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) sont insérées dans des vecteurs recombinants distincts.
17. Vecteur comprenant :
(i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53,
(ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte.
18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
19. Particule virale comprenant un vecteur selon la revendication 18.
20. Procédé de préparation d'une particule virale selon la revendication 19, selon lequel : (i) on introduit un vecteur viral selon la revendication 18 dans une cellule capable de produire ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (m) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
21. Composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant :
(i) tout ou partie du polypeptide p53, (ii) tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, selon laquelle ledit polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique est tel que défini dans les revendications 1 à 13.
22. Formulation destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumorale ou antiviral chez un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte une composition selon l'une des revendications 1 à 16, un vecteur selon les revendications 17-18 , une particule virale selon la revendication 19, ou une composition selon selon la revendication 21, ainsi qu'un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
23. Formulation selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comporte des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prodrogue capable d'être transformée en molécule cytotoxique par un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique .
24. Formulation selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite prodrogue est sélectionnée parmi la 5-fluorouracile (5-FU) et la 5-fluorocytosme
((5-FC) .
25. Utilisation d'une composition selon les revendications 1 à 16, d'un un vecteur selon les revendications 17-18 , d'une particule virale selon la revendication 19, ou d'une composition selon selon la revendication 21, pour la préparation d'un médicament antitumoral ou antiviral.
PCT/FR2000/001422 1999-05-25 2000-05-25 Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere WO2000071078A2 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000619390A JP2003500342A (ja) 1999-05-25 2000-05-25 哺乳動物の抗腫瘍治療または抗ウイルス治療用に設計された組成物
EP00931350A EP1183371A2 (fr) 1999-05-25 2000-05-25 Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere
CA002374941A CA2374941A1 (fr) 1999-05-25 2000-05-25 Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere
AU49314/00A AU774391B2 (en) 1999-05-25 2000-05-25 Composition designed for implementing an antitumoral or antiviral treatment in a mammal
HK02106412.5A HK1046426A1 (zh) 1999-05-25 2002-08-29 哺乳動物抗腫瘤和抗病毒治療的組合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9906892A FR2794025A1 (fr) 1999-05-25 1999-05-25 Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere
FR99/06892 1999-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000071078A2 true WO2000071078A2 (fr) 2000-11-30
WO2000071078A3 WO2000071078A3 (fr) 2001-04-19

Family

ID=9546225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2000/001422 WO2000071078A2 (fr) 1999-05-25 2000-05-25 Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1183371A2 (fr)
JP (1) JP2003500342A (fr)
AU (1) AU774391B2 (fr)
CA (1) CA2374941A1 (fr)
FR (1) FR2794025A1 (fr)
HK (1) HK1046426A1 (fr)
WO (1) WO2000071078A2 (fr)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1327688A1 (fr) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses avec capacité lytique augmentée
JP2009286795A (ja) * 2002-07-03 2009-12-10 Ono Pharmaceut Co Ltd モノクローナル抗体
US7893033B2 (en) 2002-05-06 2011-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents
US8779105B2 (en) 2005-05-09 2014-07-15 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD-1)
US20160075782A1 (en) 2005-07-01 2016-03-17 E.R. Squibb & Sons, L. L. C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US9683048B2 (en) 2014-01-24 2017-06-20 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
US10472419B2 (en) 2014-01-31 2019-11-12 Novartis Ag Antibody molecules to TIM-3 and uses thereof
US10570204B2 (en) 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
US11344620B2 (en) 2014-09-13 2022-05-31 Novartis Ag Combination therapies
US12252535B2 (en) 2014-03-14 2025-03-18 Novartis Ag Antibody molecules to LAG-3 and uses thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602005012535D1 (de) * 2004-11-08 2009-03-12 Transgene Sa Aus teilen bestehendes kit für die durchführung einer antitumorbehandlung oder antiviralen behandlung in einem säugetier

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5856153A (en) * 1994-11-17 1999-01-05 Cayla Suicide genes and new associations of pyrimidine nucleobase and nucleoside analogs with new suicide genes for gene therapy of acquired diseases
US6030956A (en) * 1996-10-24 2000-02-29 Boulikas; Teni Combination gene therapy for human cancers

Cited By (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8052965B2 (en) 2002-01-14 2011-11-08 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patientenzorg Viruses with enhanced lytic potency
WO2003057892A3 (fr) * 2002-01-14 2004-02-26 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Virus a puissance lytique accrue
EP1327688A1 (fr) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses avec capacité lytique augmentée
US7893033B2 (en) 2002-05-06 2011-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents
US7906628B2 (en) 2002-05-06 2011-03-15 The Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents
JP2012236861A (ja) * 2002-07-03 2012-12-06 Ono Pharmaceut Co Ltd 感染症治療剤
US9393301B2 (en) 2002-07-03 2016-07-19 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
US8728474B2 (en) 2002-07-03 2014-05-20 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
JP2009286795A (ja) * 2002-07-03 2009-12-10 Ono Pharmaceut Co Ltd モノクローナル抗体
US9067999B1 (en) 2002-07-03 2015-06-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
US9073994B2 (en) 2002-07-03 2015-07-07 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
US9439962B2 (en) 2002-07-03 2016-09-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
US9402899B2 (en) 2002-07-03 2016-08-02 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiative composition
US8779105B2 (en) 2005-05-09 2014-07-15 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD-1)
US10441655B2 (en) 2005-05-09 2019-10-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD-1)
US9358289B2 (en) 2005-05-09 2016-06-07 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies in combination with anti-CTLA-4 antibodies
US9387247B2 (en) 2005-05-09 2016-07-12 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD-1)
US9084776B2 (en) 2005-05-09 2015-07-21 E.R. Squibb & Sons, L.L.C. Methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies
US9492540B2 (en) 2005-05-09 2016-11-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies
US9492539B2 (en) 2005-05-09 2016-11-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibodies to Programmed Death 1 (PD-1)
US9580505B2 (en) 2005-07-01 2017-02-28 E.R. Squibb & Sons, L. L. C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (PD-L1)
US9580507B2 (en) 2005-07-01 2017-02-28 E.R. Squibb & Sons, L. L. C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (PD-L1)
US20160075782A1 (en) 2005-07-01 2016-03-17 E.R. Squibb & Sons, L. L. C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US10570204B2 (en) 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
US11708412B2 (en) 2013-09-26 2023-07-25 Novartis Ag Methods for treating hematologic cancers
US9815898B2 (en) 2014-01-24 2017-11-14 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
US10752687B2 (en) 2014-01-24 2020-08-25 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
US9683048B2 (en) 2014-01-24 2017-06-20 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
US11827704B2 (en) 2014-01-24 2023-11-28 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
US10472419B2 (en) 2014-01-31 2019-11-12 Novartis Ag Antibody molecules to TIM-3 and uses thereof
US10981990B2 (en) 2014-01-31 2021-04-20 Novartis Ag Antibody molecules to TIM-3 and uses thereof
US11155620B2 (en) 2014-01-31 2021-10-26 Novartis Ag Method of detecting TIM-3 using antibody molecules to TIM-3
US12252535B2 (en) 2014-03-14 2025-03-18 Novartis Ag Antibody molecules to LAG-3 and uses thereof
US11344620B2 (en) 2014-09-13 2022-05-31 Novartis Ag Combination therapies

Also Published As

Publication number Publication date
CA2374941A1 (fr) 2000-11-30
FR2794025A1 (fr) 2000-12-01
AU774391B2 (en) 2004-06-24
AU4931400A (en) 2000-12-12
HK1046426A1 (zh) 2003-01-10
EP1183371A2 (fr) 2002-03-06
WO2000071078A3 (fr) 2001-04-19
JP2003500342A (ja) 2003-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2292882C (fr) Mutant ayant une activite uracile phosphoribosyl transferase
JP4672659B2 (ja) 改善されたシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド
JP2013209415A (ja) 哺乳類における抗腫瘍または抗ウイルス治療を行う目的において設計された要素のキット
EP1183371A2 (fr) Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere
EP1100916A2 (fr) Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement cytotoxique, notamment antitumoral ou antiviral, chez un mammifere
WO2003059395A2 (fr) Antisens diriges contre le csf-1 humain
EP1366167A2 (fr) Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 49314/00

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2374941

Country of ref document: CA

Ref country code: JP

Ref document number: 2000 619390

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

Ref country code: CA

Ref document number: 2374941

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000931350

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09979210

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000931350

Country of ref document: EP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载