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WO2000043779A1 - Identification des ligands d'un recepteur capable de s'internaliser - Google Patents

Identification des ligands d'un recepteur capable de s'internaliser Download PDF

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WO2000043779A1
WO2000043779A1 PCT/FR2000/000113 FR0000113W WO0043779A1 WO 2000043779 A1 WO2000043779 A1 WO 2000043779A1 FR 0000113 W FR0000113 W FR 0000113W WO 0043779 A1 WO0043779 A1 WO 0043779A1
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receptor
ligand
internalization
receptors
cell
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PCT/FR2000/000113
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Inventor
Hubert Vaudry
Nicolas Chartrel
Alain Beaudet
Zsolt Lenkei
Catherine Llorens-Cortes
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite Mc Gill
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method applicable to the identification of potential ligands for a receptor capable of internalizing.
  • the invention relates more particularly, but not exclusively, to receptors belonging to the family of receptors with 7 transmembrane domains coupled to G proteins as well as those of the family of tyrosine kinase receptors to a single transmembrane domain.
  • GPCR G proteins
  • valorization on a therapeutic level implies beforehand to isolate their endogenous ligand and, by the same token, to elucidate their function.
  • the identification process consisting in evaluating the production of second messengers requires knowing the signaling pathway of the receptor. In the presence of an orphan receptor, having no idea of the path involved, it is necessary to test all of the known signaling pathways with the hope that the receptor of interest is not coupled to a path still unknown. This therefore requires having a large amount of sample. This approach also implies that the receptor of interest is coupled to a cascade of second messengers in the heterologous transfection systems in which they are expressed, which is not necessarily the case.
  • the object of the present invention is precisely to propose a new method for detecting and / or identifying ligands for orphan receptors which proves to be more reliable than those mentioned above, feasible on samples of low volumes and usable in the presence of other endogenous receptors and a large number of ligands, peptide or non-peptide, for these annexed endogenous receptors.
  • the method developed in the context of the present invention takes advantage of the properties of receptors with seven transmembrane domains, coupled to G proteins, or tyrosine kinase receptors, of internalizing in the cells which express them under the action of agonist ligands. Internalization is a fairly universal phenomenon that affects a large number of receptors.
  • ⁇ -arestine 2 the option of labeling either a ligand or a protein involved in signal transduction or in the desensitization of a receptor after activation, such as labeled ⁇ -arestine 2, is not completely reliable. There may indeed remain an ambiguity as to the identity of the receiver whose internalization has been followed. Moreover recent data suggest that different proteins may be involved in the internalization and desensitization mechanisms of various receptors. ⁇ -arestine 2, in particular, does not seem to play a universal role. For example, when monitoring the mobilization of ⁇ -arestine coupled to EGFP, during stimulation of the orphan receptor by its ligand, there is phosphorylation of the receptor which can then fix the mobilized ⁇ -arestine2-GFP from the membrane cytoplasm.
  • the claimed screening method precisely has the advantage of removing this indeterminacy.
  • the present invention relates to a method useful for detecting and / or identifying in a library of peptide, pseudopeptide or non-peptide compounds, a biological extract and / or a purified fraction of a tissue extract, a ligand of a receptor of interest and capable of undergoing internalization induced by the binding of said ligand, characterized in that it comprises at least the steps consisting in: - expressing said receptor in a form marked on the surface of a cell,
  • the present invention therefore involves labeling the orphan receptor for which, in particular, potential agonists are sought.
  • the fact of marking in itself the orphan receptor is clearly advantageous with regard to the detection techniques mentioned above. Indeed, this approach offers the possibility of directly visualizing the target studied.
  • the receptor When the receptor is brought into contact with the endogenous ligand, it is the ligand-receptor-marker complex which is internalized. There is no ambiguity about the identity of the internalized receptor.
  • the cell constitutively overexpresses the labeled receptor.
  • the labeling is intracellular, on the cytoplasmic tail of the receptor and therefore has the advantage of not hindering the binding of the ligand.
  • markers suitable for the invention may be either an autofluorescent protein or an epitopic marker capable of being detected by immunohistochemistry.
  • the fluorescent proteins which can be used in the claimed process preferably belong to the family of wild fluorescent protein GFP and its mutants (Ex: EGFP, EBFP and EYFP).
  • EGFP wild fluorescent protein GFP
  • EBFP EBFP
  • EYFP mutant fluorescent protein GFP
  • non-fluorescent markers capable of also being used according to the invention, mention may be made most particularly of hemaglutinin, polyhistidine, myc and flag proteins and viral epitopes.
  • highly immunogenic compounds there are already commercially highly selective antibodies (e.g. monoclonal antimyc antibodies, Clontech; antihemaglutinin influenza antibodies, Boehringer; anti-vesicular somatostatitis virus antibody, Clontech; anti-polyhistidine antibody, In Vitrogen).
  • This type of labeling is particularly advantageous insofar as it allows a high measurement sensitivity which results in the detection of a ligand concentration of the order of 10 "8 M, that is to say 100 fmoles in 10
  • the internalization of the complex is visible by confocal or even optical microscopy when the receptor is strongly expressed and if the ligand is in sufficient concentration (minimum 10 "8 M).
  • This internalization is preferably detected by confocal and / or optical microscopy.
  • the other endogenous, unlabeled receptors present on the surface of the host cells are not visible and do not interfere with the measurement. No background noise is therefore noted, which is particularly interesting in view of the high sensitivity of the measurement method.
  • the claimed method turns out to have sufficient sensitivity to allow visualization of an internalization of a receptor-ligand conjugate within the fraction tested notwithstanding the presence of other endogenous receptors and a large number of ligands, peptide or non-peptide for these additional endogenous receptors.
  • the claimed screening method proves to be suitable for the study of any receptor provided that it has the capacity to internalize.
  • the receptor of interest is coupled to a protein G.
  • the claimed method is particularly interesting for characterizing receptor ligands belonging to the receptor family with 7 transmembrane domains coupled to the G protein, the GPCRs, to the family of tyrosine kinase receptors with a single transmembrane domain or to the family of cytokine receptors.
  • labeling receptors at C-terminal has the following advantages:
  • the expression detection method is rapid and can be carried out on non-fixed living cells.
  • the receptor to be studied is coupled to a marker and then expressed on the surface of a host cell.
  • these two operations namely the labeling and expression of said receptor at the level of a host cell, they of course both fall within the competence of those skilled in the art.
  • the procedure is as follows: The sequence of the coding part of the receptor of interest is inserted in phase, in an expression vector, upstream or downstream of the coding sequence of the fluorescent protein (GFP, EGFP, EBFP, EYFP) or an epitopic marker.
  • These expression vectors (of the pGFP-N1 or pGFP-C1, N1 or C1 type indicate the position of the receptor relative to the protein either at the N-terminal or at the C-terminal) already contain the sequence of these markers.
  • the cells are transfected by a conventional method (such as the liposome method, calcium phosphate), then selected for their resistance to an antibiotic.
  • a conventional method such as the liposome method, calcium phosphate
  • proteins of the GFP family it is possible to sort the cells expressing the receptor coupled to the fluorescent protein by flow cytometry.
  • these are eukaryotic cells such as, for example, epithelial cells from monkey kidneys: COS-7; hamster ovaries: CHO; and human embryonic kidney cells: HEK 293).
  • the two receivers are of course capable of internalizing. This option thus offers the possibility of screening potential ligands for several receptors simultaneously on the same sample.
  • the host cells are brought into contact with a potential ligand.
  • the cells are therefore brought into contact with either a bank of peptide, pseudopeptide or non-peptide compounds, a biological extract or even purified fractions of a tissue extract.
  • This contacting is carried out under conditions sufficient to allow cellular internalization of the receptor-marker-ligand complex (s). These sufficient conditions are of course appreciated by those skilled in the art, in terms of temperature, duration and concentration. It may also be necessary to carry out repeated experiments.
  • internalization of ligand-receptor complexes in mammalian cells is optimal at 37 ° C.
  • the average half-life of the internalization process (time required for 50% of occupied surface receptors to be internalized) is around 10 minutes.
  • exposures to the ligand of 20 to 40 minutes are usually optimal for the identification of internalized receptors, the optimal ligand concentrations are of the order of 10 to 20 times the affinity of the ligand for its receptor (Kd).
  • the visualization is carried out directly by observing the displacement of the fluorescence.
  • the receptor is labeled with a non-fluorescent antigen
  • the internalization is visualized by confocal microscopy after fixation of the cells and detection of the antigenic epitopes by secondary antibodies coupled to a fluorophore.
  • the antigenic epitopes can be revealed by an enzymatic reaction, or with the help of a radioactive antibody which is concretized in both cases by the accumulation of opaque deposits visible both by light and electron microscopy.
  • the claimed method proves to be particularly advantageous for detecting and / or identifying the endogenous ligand (s) of an orphan receptor or else identifying new agonists or antagonists for a known receptor, that is to say which knows the endogenous ligand.
  • this method proves to be particularly useful for the search for ligands for orphan receptors and more particularly receptors for peptides, using biological preparations such as tissue extracts.
  • the present invention also extends to any ligand of a receptor of interest, identified using the claimed method.
  • the examples and figures submitted below are presented by way of non-limiting illustration of the present invention.
  • FIGURES Figures 1 Figure 1a: Visualization by confocal microscopy of the neurotensin type 1 receptor coupled to the fluorescent protein EGFP (NTR1-
  • FIG. 1b Visualization of the internalization of the NTR1-EGFP receptor characterized by the formation of numerous fluorescent cytoplasmic vesicles of 0.6 ⁇ m in diameter inside CHO cells incubated with neurotensin concentrations of 10 and 100 nM.
  • Figures 2 Visualization of the internalization of the NTR1- receptor
  • EGFP with or without acid washing, in the presence of: 10 nM of neurotensin (FIG. 2a) or of a purified fraction of extract of frog brains (FIG. 2b).
  • the conditions are the same as in FIG. 1, and also include an acid wash of the endogenous ligand still bound to the surface of the cells at the end of the charge period.
  • Figure 3 Internalization of the NTR1-EGFP receptor in the presence of 10 prepurified fractions of an extract of frog brains.
  • Figure 4 Radioimmunoassay of the prepurified fractions of an extract of frog brains using an antibody directed against the conserved region of neurotensin. Materials and methods
  • the amplified sequence was inserted into the expression vector pEGFP-N1 (Clontech) at the Hindlll and BamH1 sites.
  • the construction was verified on an AbiPrism 377 automatic sequencer (Perkin-Elmer) using fluorescent ddNTPs.
  • the CHO-K1 cells (American Type Culture Collection: ATCC) were cultured in a humid atmosphere at 5% CO2, in F12 medium supplemented with 7.5% fetal calf serum, 1 mM glutamine, 100 units / ml of penicillin and 100 units / ml streptomycin (Boehringer
  • CHO-K1 (approximately 2.6x106 cells) were transfected with 8 ⁇ g of plasmid using cationic liposomes (Dosper, Boehringer). The transfected cells are selected for their resistance to geneticin. The clones obtained were sorted using flow cytometry which takes into account the intensity of the fluorescence of each cell. A second selection was made using a fluorescence microscope, observing the level of expression of the fluorescent NTR1-EGFP receptor, located on the membrane surface of the cells of each of the clones. 3) Pre-purification of frog brain extract
  • 2541 brains of male green frog (species Rana ridibunda), corresponding to a weight of fresh tissue of 215 g, were collected in the laboratory from freshly sacrificed animals. The brains were frozen on dry ice immediately after being removed and stored at -80 ° C.
  • the brains were immersed for 15 min in 0.5 M boiling acetic acid (2 liters), then homogenized in a mixer. The homogenate was centrifuged at 4000 x g for 30 min at 4 ° C. The supernatant was then prefiltered on an assembly of 10 columns of Sep-Pak C18 (Waters Associates, Milford, MA) mounted in series at a flow rate of 2 ml / min. The material fixed on the Sep-Pak columns was eluted with 20 ml of a 70% acetonitrile solution. This operation was repeated 2 times.
  • the material eluted from the Sep-Pak columns was partially evaporated in order to remove the acetonitrile, then centrifuged at 13,000 xg for 5 min. The supernatant was removed and divided into 2. Each of the 2 pools was then injected into a Vydac C18 218TP1010 semi-preparative column (1 x 25 cm) (The Séparations Group, Hesperia, CA) balanced with a solution of water / trifluoroacetic acid (99.9: 0.1; vo vol) at a flow rate of 2 ml / min.
  • Peptide material attached to the matrix was eluted using an acetonitrile gradient rising from 14 to 42% in 40 min at a flow rate of 2 ml / min, then rising from 42 to 56% for 60 min at a flow rate 1 ml / min.
  • the eluate was collected in 1 min fraction and the absorbance measured at 215 and 280 nm.
  • the elution fractions were stored at -20 ° C. Before the experiments internalisation, each of the fractions was diluted with water, partially evaporated in order to remove the acetonitrile, and made up to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the cells are distributed (50% confluence, 20,000 cells per well) then cultured overnight on multi-well slides (LabTek, Nunc) pretreated with polyallylamine (0.1 mg / ml, Aldrich) . On these slides, the volume of incubations (except for the loading period) and washes is 250 ⁇ l per well. 90 min before the start of the experiment, the cell medium is changed to a medium supplemented with cycloheximide (70 ⁇ M, Sigma).
  • the cells are then preincubated for 15 min on ice in cold Earle's buffer (pH 7.4, containing 140 mM NaCI, 5 mM KG, 1.8 mM CaCI 2 , 3.6 mM MgCI 2 , 0.1% albumin bovine serum, 0.01% glucose and 0.8 mM 1.10-phenanthroline).
  • the cells are then incubated for 30 min with the ligand diluted in 50 ⁇ l of Earle's buffer at 4 ° C (loading period).
  • a batch of cells is subjected to a hypertonic acid wash (0.2 M acetic acid and 0.5 mM NaCl in Earle's buffer, pH 4 for 2 min at 4 ° C.) in order to dissociate the ligand of its surface receptors.
  • Internalization is caused by replacing the medium with Earle's buffer at 37 ° C and incubation of the slides at 37 ° C for 20 to 30 min (hunting period).
  • the cells are rinsed with cold Earle's buffer, fixed with 4% paraformaldehyde dissolved in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.4, rinsed again in cold Earle's buffer and then assembled. using Vectashield (Vector).
  • the cells are examined with a Leica TCS NT confocal microscope configured with an inverted microscope (Leica DM IRBE) equipped with an argon / krypton laser with excitation and emission filters of 488 and 530-600 nm respectively. 1024-1024 pixel images of individual cells are obtained using a 63x oil immersion objective. 6) Radioimmunoassay of neurotensin on prepurified fractions of an extract of frog brains
  • a volume of 5 ⁇ l of each fraction collected at the outlet of semi-preparative HPLC is subjected to a radioimmunoassay of neurotensin.
  • the neurotensin assay was carried out using an antibody directed against the C-terminal fragment of the pig neurotensin
  • the antibody is used at a final dilution of 1: 50,000, and the sensitivity of the assay is 10 pg.
  • the radioimmunoassay is carried out at 4 ° C in a 0.02 M veronal buffer (pH 8.6) containing 4% bovine serum albumin and 7000 cpm of (3- [125i] iodotyrosyl) neurotensin (Amersham, Buckingamshire, UK ). The samples and the antibody were incubated at 4 ° C for 48 h.
  • the separation of the tracer fraction linked to the antibody was carried out by precipitation by adding to each sample a solution of ⁇ -globulins (1% in 0.02 M veronal buffer) and a solution of polyethylene glycol (20% in 0.02 M veronal buffer containing 0.1% bovine serum albumin and 0.1% newt X-100). After an incubation of 20 min at room temperature, the samples are centrifuged (3000 x g, 30 min) and the pellets counted in a gamma counter.
  • NTR1-EGFP receptor Characterization of the NTR1 -EGFP receptor
  • the NTR1-EGFP receptor is stably expressed in the CHO cell line and its binding and intracellular signal transmission properties have been determined.
  • the affinity of neurotensin was found to be of the same order (0.3 nM) for the NTR1-EGFP receptor and the wild-type NT1 receptor.
  • the labeled receptor leads to the production of phosphate inositols with an EC50 (1 nM) identical to that obtained for the wild-type NT1 receptor (results not shown).
  • fractions in pool 2 that is to say fractions 11 to 20 (0.5 ⁇ l of volume of original fraction diluted to 50 ⁇ l with Ear's buffer) were tested individually. Only fractions 15,16,17,18 induce the internalization of the NTR1-EGFP receptor (Fig. 3). This internalization is not detected if the cells are subjected to an acid wash at the end of the charge period (Fig. 2b) indicating that the internalization observed is the result of the binding of a specific ligand to the NTR1-EGFP receptors during the loading period.
  • the radioimmunoassay of the prepurified fractions of a frog brain extract using an antibody directed against the conserved region of neurotensin shows that the immunoreactive material is exclusively contained in the fractions 15,16,17,18 (Fig. 4).
  • the total apparent amount of neurotensin measured in the elution fractions of the semi-preparative HPLC is 894 ng in 16 ml, which corresponds to a value of 352 pg of peptide per frog brain. Consequently, the material causing the internalization of the NTR1-EGFP receptor, contained in the fractions 15,16,17,18 corresponds to the endogenous neurotensin of the frog brain.
  • the internalization process described above is a direct, simple, specific and reliable means, making it possible to detect, from the observation of a single cell, an amount of neurotensin as low as 500 fmoles in 50 ⁇ l. It appears that this measurement can be carried out both on a pure neurotensin solution and on a fraction of tissue extract containing not only neurotensin but also a large number of other neuropeptides (the minimum estimated number per fraction being 50 peptides) , with a similar sensitivity since we manage to detect, according to the RIA assay, about 250 fmoles.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé utile pour détecter et/ou identifier dans une banque de composés peptidiques, pseudopeptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus, un ligand d'un récepteur d'intérêt et capable de subir une internalisation induite par la fixation dudit ligand caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant à: exprimer à la surface d'une cellule ledit récepteur sous une forme marquée; mettre en présence ladite cellule avec ladite banque dans des conditions suffisantes pour permettre une internalisation cellulaire dudit complexe récepteur-ligand et visualiser cette internalisation via la détection du marqueur associé audit récepteur.

Description

IDENTIFICATION DES LIGANDS D'UN RECEPTEUR CAPABLE DE S' INTERNALISER
La présente invention a pour objet un procédé de criblage applicable à l'identification de ligands potentiels pour un récepteur capable de s'intemaliser.
L'invention concerne plus particulièrement, mais non exclusivement les récepteurs appartenant à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G ainsi que ceux de la famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire.
A ce jour, environ 800 récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (GPCR) ont été clones de différentes espèces eucaryotes. Chez l'homme, 240 GPCRs ont été isolés. Pour seulement 140 d'entre eux le ligand endogène est connu, pour les 100 autres restants qui constituent le pool des récepteurs orphelins, ils sont à identifier.
Parallèlement, plusieurs centaines de nouveaux médicaments agissant sur les GPCRs ont été enregistrés, au cours de ces vingt dernières années.
En conséquence, les récepteurs orphelins nouvellement clones sont d'un grand intérêt pour la recherche pharmaceutique dans la mesure où ils sont susceptibles de représenter des cibles thérapeutiques potentielles.
Toutefois, leur valorisation sur un plan thérapeutique implique au préalable d'isoler leur ligand endogène et, par là même, d'élucider leur fonction.
Sur l'ensemble de ces récepteurs orphelins couplés aux protéines
G, seuls 5 ligands endogènes ont à ce jour été isolés, tous appartenant à des familles de peptides nouveaux : les orexines / hypocrétines, la nociceptine / orphanine, le PrRP, peptide libérant la prolactine, l'apeline et le peptide de type leucokinin (leucokinin-like).
Pour les identifier, les auteurs ont criblé dans tous les cas des fractions de tissus purifiées sur différents tests. Pour le choix des tests, ils ont mis à profit le fait que lorsque l'agoniste se fixe sur son récepteur, il y a formation d'un second messager qui va produire, suivant la voie de signalisation utilisée par le récepteur, différents produits et qui va dans tous les cas aboutir à un changement de pH intracellulaire.
Dans le cas de la nociceptine, les auteurs ont mesuré l'accumulation d'AMPc, résultant de la stimulation de l'adénylate cyclase.
Dans le cas des orexines, les auteurs ont mesuré l'accumulation de Ca2+ intracytoplasmique résultant de la stimulation de la phospholipase C. Dans le cas du PrRP, les auteurs ont mesuré la formation d'acide arachidonique résultant de la stimulation de la phospholipase A2.
Dans le cas de l'apeline, ils ont mesuré les modifications de l'acidification du milieu extracellulaire à l'aide d'un " cytosenseur" .
Toutefois, l'ensemble de ces voies d'identification n'est pas totalement satisfaisant pour les raisons suivantes :
La démarche d'identification consistant à évaluer la production de seconds messagers nécessite de connaître la voie de signalisation du récepteur. En présence d'un récepteur orphelin, n'ayant aucune idée de la voie mise en jeu, il s'avère nécessaire de tester l'ensemble des voies de signalisation connues avec l'espoir que le récepteur d'intérêt ne soit pas couplé à une voie encore inconnue. Ceci nécessite donc de disposer d'une quantité d'échantillon importante. Cette démarche implique également que le récepteur d'intérêt soit couplé à une cascade de seconds messagers dans les systèmes de transfection hétérologues dans lesquels ils sont exprimés, ce qui n'est pas nécessairement le cas.
Quant à l'approche consistant à mesurer l'acidification du milieu extracellulaire, suite à la production de protons par la cellule activée, elle se heurte au problème suivant : si l'on met en présence des banques de peptides ou des fractions purifiées d'extraits de tissus avec un récepteur orphelin exprimé à la surface d'une cellule, on mesure une modification de pH extracellulaire qui résulte de la stimulation non seulement du récepteur orphelin mais aussi de tous les récepteurs endogènes présents. On ne peut donc pas délimiter facilement le ligand responsable de l'activation du récepteur orphelin.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une nouvelle méthode pour détecter et/ou identifier les ligands de récepteurs orphelins qui s'avère plus fiable que celles évoquées ci-dessus, réalisable sur des échantillons de faibles volumes et exploitable en présence d'autres récepteurs endogènes et d'un nombre important de ligands, peptidiques ou non peptidiques, pour ces récepteurs endogènes annexes. La méthode développée dans le cadre de la présente invention met à profit les propriétés qu'ont les récepteurs à sept domaines transmembranaires, couplés aux protéines G, ou les récepteurs à tyrosine kinase, de s'internaliser dans les cellules qui les expriment sous l'action de ligands agonistes. L' intemalisation est un phénomène assez universel qui touche un grand nombre de récepteurs. Cette intemalisation peut ainsi être visualisée en microscopie confocale, optique ou même électronique lorsque le ligand est marqué avec une molécule fluorescente ou un marqueur épitopique. Les complexes ligand-récepteurs suivent alors un cheminement intracellulaire caractéristique, qui a déjà été bien étudié. Par exemple, cette technique de marquage fluorescent ou épitopique a déjà été préconisée pour suivre le trafic intracellulaire soit :
- d'un ligand marqué, complexé à son récepteur respectif, ledit récepteur subissant une intemalisation induite par son activation,
- d'une protéine impliquée dans la transduction du signal, en l'occurrence la protéine kinase C marquée,
- soit encore d'une protéine impliquée dans la désensibilisation d'un récepteur après l'activation de celui-ci, en l'occurrence la β-arestine 2 marquée.
Toutefois, l'option consistant à marquer soit un ligand soit une protéine impliquée dans la transduction du signal ou encore dans la désensibilisation d'un récepteur après l'activation de celui-ci, comme la β- arestine 2 marquée n'est pas totalement fiable. Il peut en effet demeurer une ambiguïté sur l'identité du récepteur dont l' intemalisation a été suivie. De plus des données récentes suggèrent que des protéines différentes peuvent être impliquées dans les mécanismes d'internalisation et de désensibilisation de divers récepteurs. La β-arestine 2, en particulier, ne semble pas jouer un rôle universel. Par exemple, lorsque l'on suit la mobilisation de la β-arestine couplée à l'EGFP, lors de la stimulation du récepteur orphelin par son ligand, il y a phosphorylation du récepteur qui peut alors fixer la β-arestine2-GFP mobilisée du cytoplasme à la membrane. Il y a ensuite séquestration du récepteur et intemalisation. Or, dans le cas de la recherche d'un ligand endogène d'un récepteur orphelin surexprimé à la surface de cellules eucaryotes, la mise en contact avec une banque de peptides ou de fractions purifiées de tissu résulte en l'activation non seulement du récepteur orphelin mais aussi de tous les récepteurs endogènes couplés aux protéines G. Il en résulte donc une mobilisation de la β-arestine 2-GFP non seulement par le récepteur orphelin mais aussi par les récepteurs endogènes. Ceci ne permet donc pas d'identifier le ligand responsable de l'activation du récepteur orphelin.
De même, dans le cas d'une banque de peptides ou de fractions de tissus purifiées contenant le ligand endogène recherché, si tous les peptides sont marqués de façon homogène on ne peut pas identifier celui que l'on recherche.
Le procédé de criblage revendiqué a précisément pour avantage de lever cette indétermination.
Plus précisément, la présente invention concerne un procédé utile pour détecter et/ou identifier dans une banque de composés peptidiques, pseudopeptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus, un ligand d'un récepteur d'intérêt et capable de subir une intemalisation induite par la fixation dudit ligand, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant à : - exprimer ledit récepteur sous une forme marquée à la surface d'une cellule,
- mettre en présence ladite cellule avec ladite banque, l'extrait biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus et contenant au moins un composé peptidique, pseudopeptidique ou non peptidique susceptible d'être un ligand dudit récepteur, dans des conditions suffisantes pour permettre une intemalisation cellulaire dudit complexe récepteur-ligand et
- visualiser cette intemalisation via la détection du marqueur lié audit récepteur.
La présente invention implique donc le marquage du récepteur orphelin pour lequel notamment sont recherchés des agonistes potentiels.
Le fait de marquer en soit le récepteur orphelin est nettement avantageux au regard des techniques de détection évoquées ci-dessus. En effet, cette approche offre la possibilité de visualiser directement la cible étudiée. Lors de la mise en contact du récepteur avec le ligand endogène, c'est le complexe ligand-récepteur-marqueur qui est intemalisé. Il n'y a pas d'ambiguïté sur l'identité du récepteur intemalisé. De plus, dans le procédé revendiqué, la cellule surexprime constitutivement le récepteur marqué. Le marquage est intracellulaire, sur la queue cytoplasmique du récepteur et a donc pour avantage de ne pas gêner la fixation du ligand.
En ce qui concerne les marqueurs convenant à l'invention, il peut s'agir soit d'une protéine autofluorescente soit d'un marqueur épitopique susceptible d'être détecté par immunohistochimie.
Les protéines fluorescentes pouvant être mises en œuvre dans le procédé revendiqué appartiennent de préférence à la famille de la protéine fluorescente sauvage GFP et ses mutants (Ex : EGFP, EBFP et EYFP). Wang S. & Haizeirigg T. (1994) Nature, 369:400-403 ; Yang TT et al. (1996) Nucleic Acid Res, 24: 4592-4593 ; Heim R & Tsien RY (1994) Curr. Biol., 6:1 , 178-182; Ormô M et al., (1996) Science, 273:1392-1395.
A titre illustratif des marqueurs non fluorescents susceptibles d'être également mis en œuvre selon l'invention, on peut tout particulièrement citer l'hémaglutinine, la polyhistidine, les protéines myc et flag et les épitopes viraux. Il existe déjà pour tous ces composés fortement immunogènes des anticorps sélectifs hautement affins dans le commerce (ex : anticorps monoclonaux antimyc, Clontech; anticorps antihémaglutinine influenza, Boehringer; anticorps anti-virus de la somatostatite vésiculaire, Clontech; anticorps anti-polyhistidine, In Vitrogen). Leur détection implique une reconnaissance du groupement antigénique par l'un de ces anticorps (dits primaires), suivi d'une visualisation de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire provenant d'une autre espèce et marqué soit par un fluorophore, soit par la peroxydase du raifort que l'on fera consécutivement réagir avec un substrat approprié.
Ce type de marquage est particulièrement intéressant dans la mesure où il permet une sensibilité de mesure élevée qui se traduit par la détection d'une concentration de ligand de l'ordre de 10"8 M c'est-à-dire 100 fmoles dans 10 μl. L' intemalisation du complexe est visible en microscopie confocale voire même optique lorsque le récepteur est fortement exprimé et si le ligand est en concentration suffisante (minimum 10"8 M).
Cette intemalisation est de préférence détectée par microscopie confocale et/ou optique.
Enfin, avantageusement, les autres récepteurs endogènes, non marqués, présents à la surface des cellules hôtes, même s'ils sont également internalisés, ne sont pas visibles et n'interfèrent pas au niveau de la mesure. Il n'est donc noté aucun bruit de fond ce qui est particulièrement intéressant au regard de la grande sensibilité de la méthode de mesure.
De manière générale, le procédé revendiqué s'avère posséder une sensibilité suffisante pour permettre la visualisation d'une intemalisation d'un conjugué récepteur-ligand au sein de la fraction testée nonobstant la présence d'autres récepteurs endogènes et d'un grand nombre de ligands, peptidiques ou non peptidiques pour ces récepteurs endogènes annexes.
Avantageusement, le procédé de criblage revendiqué s'avère adpaté à l'étude de tout récepteur à condition que celui-ci possède la capacité de s'internaliser. Selon un mode privilégié de l'invention, le récepteur d'intérêt est couplé à une protéine G.
Le procédé revendiqué est particulièrement intéressant pour caractériser des ligands de récepteurs appartenant à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés à la protéine G, les GPCRs, à la famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire ou à la famille des récepteurs des cytokines.
Dans le cas des GPCRs, l'étiquetage des récepteurs en C- terminal présente les avantages suivants :
- la maturation post-traductionelle du récepteur n'est pas modifiée,
- la liaison des agonistes et des antagonistes ainsi que la signalisation intracellulaire sont les mêmes qu'avec le récepteur natif,
- l'intemalisation des complexes ligand-récepteurs n'est pas modifiée et
- la méthode de détection de l'expression est rapide et peut être effectuée sur des cellules vivantes non fixées.
Le récepteur à étudier est couplé à un marqueur puis exprimé à la surface d'une cellule-hôte. En ce qui concerne ces deux opérations, à savoir le marquage et l'expression dudit récepteur au niveau d'une cellule-hôte, elles relèvent bien entendu toutes deux des compétences de l'homme de l'art. Généralement, on opère de la manière suivante : La séquence de la partie codante du récepteur d'intérêt est insérée en phase, dans un vecteur d'expression, en amont ou en aval de la séquence codante de la protéine fluorescente (GFP, EGFP, EBFP, EYFP) ou d'un marqueur épitopique. Ces vecteurs d'expression (de type pGFP-N1 ou pGFP-C1 , N1 ou C1 indiquent la position du récepteur par rapport à la protéine soit en N-terminal, soit en C-terminal) contiennent déjà la séquence de ces marqueurs. Les cellules sont transfectées par une méthode classique (tels que la méthode des liposomes, phosphate de calcium), puis sélectionnées pour leur résistance à un antibiotique. Dans le cas des protéines de la famille GFP, il est possible d'effectuer un tri des cellules exprimant le récepteur couplé à la protéine fluorescente par cytométrie de flux. En ce qui concerne les cellules transformées il s'agit de cellules eucaryotes comme par exemple les cellules épithéliales de reins de singe : COS-7 ; d'ovaires de hamster : CHO ; et les cellules humaines embryonnaires de rein : HEK 293). Dans une variante du procédé revendiqué, on peut envisager d'exprimer à la surface d'une cellule, deux ou plusieurs récepteurs distincts marqués respectivement par des marqueurs différents. Les deux récepteurs sont bien entendu capables de s'intemaliser. Cette option offre ainsi la possibilité de cribler sur un même échantillon et simultanément des ligands potentiels pour plusieurs récepteurs.
Conformément au procédé revendiqué, les cellules hôtes sont mises en présence d'un ligand potentiel. Pour ce faire, on met donc en contact lesdites cellules avec soit une banque de composés peptidiques, pseudo- peptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique ou encore des fractions purifiées d'un extrait de tissus.
Cette mise en contact est effectuée dans des conditions suffisantes pour permettre l' intemalisation cellulaire du ou des complexes récepteur-marqueur-ligand. Ces conditions suffisantes sont bien entendu appréciées par l'homme du métier, en termes de température, de durée et de concentration. Il peut également être nécessaire de procéder à des expériences répétées.
En règle générale, l'internalisation de complexes ligand-récepteur dans les cellules des mammifères est optimale à 37°C. La demi-vie moyenne du processus d'internalisation (temps requis pour que 50 % des récepteurs de surface occupés soient internalisés) est de l'ordre de 10 minutes. Ainsi, des expositions au ligand de 20 à 40 minutes sont habituellement optimales pour le repérage des récepteurs internalisés, les concentrations de ligand optimales sont de l'ordre de 10 à 20 fois l'affinité du ligand pour son récepteur (Kd). On suit par microscopie confocale ou dans le cas d'une forte expression de ce récepteur marqué, par microscopie optique, l'internalisation du complexe ligand-récepteur qui se concrétise par le déplacement du marquage (fluorescent ou immunohistochimique) de la membrane de la cellule (dont l'intensité de marquage diminue) vers l'intérieur de celle-ci sous forme de vésicules.
Dans le cas d'un récepteur marqué avec une étiquette fluorescente, la visualisation s'effectue directement en observant le déplacement de la fluorescence. Dans le cas où le récepteur est marqué avec un antigène non- fluorescent, l'internalisation est visualisée en microscopie confocale après fixation des cellules et détection des épitopes antigeniques par des anticorps secondaires couplés à un fluorophore. Alternativement, les épitopes antigeniques peuvent être révélés par une réaction enzymatique, ou à l'aide d'un anticorps radioactif qui se concrétise dans les deux cas par l'accumulation de dépôts opaques visibles aussi bien en microscopie photonique qu'électronique.
Comme évoqué précédemment, l'internalisation peut être visualisée sur une dizaine de cellules et pour un volume d'incubation très faible à savoir de l'ordre du μl. Ces deux qualités sont particulièrement précieuses lorsque l'on ne dispose que d'une très faible quantité d'échantillon.
En conséquence, le procédé revendiqué s'avère tout particulièrement avantageux pour détecter et/ou identifier le ou les ligands endogènes d'un récepteur orphelin ou encore identifier de nouveaux agonistes ou antagonistes pour un récepteur connu, c'est-à-dire dont on connaît le ligand endogène. Etant basé sur l'observation directe d'un phénomène biologique qui touche la plupart des récepteurs GPCR ou tyrosine kinase, à savoir l'internalisation, cette méthode s'avère particulièrement utile pour la recherche des ligands des récepteurs orphelins et plus particulièrement des récepteurs des peptides, en utilisant des préparations biologiques telles que des extraits de tissu.
On peut également envisager d'utiliser le procédé revendiqué avec un récepteur marqué, déjà identifié et caractérisé, comme un " biosenseur" , qui permettrait de détecter dans un liquide biologique la présence même à l'état de traces d'une substance toxique ou non capable de se lier sur ce récepteur.
La présente invention s'étend également à tout ligand d'un récepteur d'intérêt, identifié à l'aide du procédé revendiqué. Les exemples et figures soumis ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
FIGURES Figures 1 : figure 1a : Visualisation par microscopie confocale du récepteur de la neurotensine de type 1 couplé à la protéine fluorescente EGFP (NTR1-
EGFP) à la surface de cellules CHO, incubées avec du tampon seul ou avec une concentration faible (1 nM) de neurotensine de rat ou de grenouille n'induisant pas d'internalisation. figure 1 b : Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1- EGFP caractérisée par la formation de nombreuses vésicules fluorescentes cytoplasmique de 0,6 μm de diamètre à l'intérieur de cellules CHO incubées avec des concentrations de neurotensine de 10 et 100 nM. Figures 2 : Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1-
EGFP avec ou sans lavage acide, en présence de : 10 nM de neurotensine (figure 2a) ou d'une fraction purifiée d'extrait de cerveaux de grenouille (figure 2b). Les conditions sont les mêmes qu'en figure 1 , et comprennent en outre un lavage acide du ligand endogène encore lié à la surface des cellules à la fin de la période de charge.
Figure 3 : Intemalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de 10 fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille.
Figure 4 : Dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille en utilisant un anticorps dirigé contre la région conservée de la neurotensine. Matériels et méthodes
1) Construction du récepteur NTR1 -EGFP La séquence codante entière du récepteur NT1 (K. Tanaka, M.
Masu and S. Nakanishi (1990) Structure and functional expression of the cloned rat neurotensin receptor. Neuron 4: 847-54) a été amplifiée par PCR en utilisant deux amorces dirigées contre les extrémités 5' et 3' de la séquence codante de cet ADNc et contenant également des sites de restriction Hindlll ou BamH1 5'-CTT AAG CTT ATG CAC CTC AAC AGC TCC GTG-3' (SEQ ID N°1 ) et 5'-TTT GGA TCC GCG TAC AGG GTC TCC CGG GT-3' (SEQ ID N°2). Après digestion par les enzymes Hindlll et BamH1 et purification, la séquence amplifiée a été insérée dans le vecteur d'expression pEGFP-N1 (Clontech) au niveau des sites Hindlll et BamH1. La construction a été vérifiée sur un séquenceur automatique AbiPrism 377 (Perkin-Elmer) en utilisant des ddNTP fluorescents.
2) Transfection stable dans les cellules CHO
Les cellules CHO-K1 (American Type Culture Collection : ATCC) ont été cultivées en atmosphère humide à CO2 5%, dans du milieu F12 supplémenté avec 7,5% de sérum de veau fœtal, 1 mM de glutamine, 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine (Boehringer
Mannheim). Pour établir la lignée stable exprimant ce récepteur, les cellules
CHO-K1 (environ 2,6x106 cellules) ont été transfectées avec 8 μg de plasmide en utilisant des liposomes cationiques (Dosper, Boehringer). Les cellules transfectées sont sélectionnées pour leur résistance à la généticine. Les clones obtenus ont été triés en utilisant la cytométrie en flux qui prend en compte l'intensité de la fluorescence de chaque cellule. Une deuxième sélection a été effectuée à l'aide d'un microscope à fluorescence, en observant le niveau de l'expression du récepteur NTR1-EGFP fluorescent, localisée à la surface membranaire des cellules de chacun des clones. 3) Prépurification de l'extrait de cerveaux de grenouille
- Collection des tissus
2541 cerveaux de grenouille verte mâle (espèce Rana ridibunda), correspondant à un poids de tissu frais de 215 g, ont été collectés au laboratoire sur des animaux fraîchement sacrifiés. Les cerveaux ont été congelés sur de la carboglace immédiatement après avoir été prélevés et conservés à -80°C.
- Extraction des tissus
Les cerveaux ont été plongés pendant 15 min dans l'acide acétique bouillant 0,5 M (2 litres), puis homogénéisés au mixeur. L'homogénat a été centrifugé à 4000 x g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant a ensuite été préfiltré sur un assemblage de 10 colonnes de Sep-Pak C18 (Waters Associates, Milford, MA) montées en série à un débit de 2 ml/min. Le matériel fixé sur les colonnes de Sep-Pak a été élue avec 20 ml d'une solution d'acétonitrile à 70%. Cette opération a été répétée 2 fois.
- Purification de l'extrait de cerveaux de grenouille par HPLC semi- préparative
Le matériel élue des colonnes de Sep-Pak a été partiellement évaporé afin d'éliminer l'acétonitrile, puis centrifugé à 13000 x g pendant 5 min. Le surnageant a été prélevé et divisé en 2. Chacun des 2 pools a ensuite été injecté sur une colonne semi-préparative Vydac C18 218TP1010 (1 x 25 cm) (The Séparations Group, Hesperia, CA) équilibrée avec une solution d'eau/acide trifluoroacétique (99,9:0,1 ; vo vol) à un débit de 2 ml/min. Le matériel peptidique fixé à la matrice a été élue en utilisant un gradient d'acétonitrile s'élevant de 14 à 42% en 40 min à un débit de 2 ml/min, puis montant de 42 à 56 % pendant 60 min à un débit de 1 ml/min. L'éluat a été collecté par fraction de 1 min et l'absorbance mesurée à 215 et 280 nm. Les fractions d'élution ont été conservées à -20°C. Avant les expériences d'internalisation, chacune des fractions a été diluée avec de l'eau, partiellement évaporée afin d'éliminer l'acétonitrile, et complétée à un volume final de 50 μl.
4) Intemalisation Les cellules sont distribuées (50 % de confluence, 20 000 cellules par puit) puis cultivées pour la nuit sur des lames multi-puits (LabTek, Nunc) prétraitées avec de la polyallylamine (0,1 mg/ml, Aldrich). Sur ces lames, le volume des incubations (sauf pour la période de charge) et des lavages est de 250 μl par puits. 90 min avant le début de l'expérience, le milieu des cellules est changé pour un milieu supplémenté avec de la cycloheximide (70 μM, Sigma). Les cellules sont ensuite préincubées pendant 15 min sur la glace dans du tampon Earle's froid (pH 7,4, contenant 140 mM NaCI, 5 mM KG, 1 ,8 mM CaCI2, 3,6 mM MgCI2, 0,1 % albumine sérique bovine, 0,01 % glucose et 0,8 mM 1 ,10-phénanthroline). Puis les cellules sont incubées pendant 30 min avec le ligand dilué dans 50 μl du tampon Earle's à 4°C (période de charge). A ce stade, un lot de cellules est soumis à un lavage acide hypertonique (0,2 M d'acide acétique et 0,5 mM de NaCI dans le tampon Earle's, pH 4 pendant 2 min à 4°C) afin de dissocier le ligand de ses récepteurs de surface. L'internalisation est provoquée par remplacement du milieu par du tampon Earle's à 37°C et incubation des lames à 37°C pendant 20 à 30 min (période de chasse). A la fin de l'incubation, les cellules sont rincées avec du tampon Earle's froid, fixées avec du paraformaldéhyde 4 % dissout dans du tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4, rincées de nouveau dans du tampon Earle's froid puis montées en utilisant du Vectashield (Vector).
5) Microscopie confocale
Les cellules sont examinées avec un microscope confocal Leica TCS NT configuré avec un microscope inversé (Leica DM IRBE) équipé avec un laser argon/krypton avec des filtres d'excitation et d'émission respectivement de 488 et 530-600 nm. Des images de 1024-1024 pixels de cellules individuelles sont obtenues en utilisant un objectif 63x à immersion à huile. 6) Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Un volume de 5 μl de chaque fraction collectée en sortie d'HPLC semi-préparative est soumis à un dosage radioimmunologique de la neurotensine. Le dosage de la neurotensine a été effectué à l'aide d'un anticorps dirigé contre le fragment C-terminal de la neurotensine de porc
(Marcos ét al., Peptides 1996, 17: 139-146).
L'anticorps est utilisé à une dilution finale de 1 :50 000, et la sensibilité du dosage est de 10 pg. Le dosage radioimmunologique est effectué à 4°C dans un tampon véronal 0,02 M (pH 8,6) contenant 4% d'albumine sérique bovine et 7000 cpm de (3-[125i] iodotyrosyl) neurotensine (Amersham, Buckingamshire, UK). Les échantillons et l'anticorps ont été incubés à 4°C pendant 48 h. La séparation de la fraction de traceur liée à l'anticorps a été réalisée par précipitation en ajoutant à chaque échantillon une solution de γ-globulines (1 % dans du tampon véronal 0,02 M) et une solution de polyéthylène glycol (20 % dans un tampon véronal 0,02 M contenant 0,1 % d'albumine sérique bovine et 0,1 % de triton X-100). Après une incubation de 20 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés (3 000 x g, 30 min) et les culots comptés dans un compteur gamma.
EXEMPLE 1 : Intemalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de neurotensine de grenouille ou de rat
1) Caractérisation du récepteur NTR1 -EGFP Le récepteur NTR1-EGFP est exprimé de façon stable dans la lignée cellulaire CHO et ses propriétés de liaison et de transmission du signal intracellulaire ont été déterminées. L'affinité de la neurotensine s'est révélée du même ordre (0,3 nM) pour le récepteur NTR1-EGFP et le récepteur NT1 sauvage. De la même façon, le récepteur marqué conduit à la production d'inositols phosphates avec une EC50 (1 nM) identique à celle obtenue pour le récepteur NT1 sauvage (résultats non présentés). 2) Intemalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de neurotensine de grenouille ou de rat
Les cellules incubées avec du tampon seul ou avec des concentrations faibles (concentrations inférieures à 1 nM) de neurotensine de rat ou de grenouille présentent une fluorescence marquée du récepteur NTR1- EGFP localisée à la membrane des cellules (Fig. 1a).
L'incubation des cellules CHO-NTR1-EGFP avec des concentrations croissantes de neurotensine (gamme commençant à 10 nM) entraîne une intemalisation des récepteurs NTR1-EGFP, indiquée par une diminution du marquage fluorescent membranaire et par la formation de nombreuses vésicules fluorescentes intracytoplasmiques de 0,6 μm de diamètre (Fig. 1 b). Ce type de marquage n'est pas détecté lorsque le ligand est préalablement dissocié des récepteurs de surface suite à un lavage acide effectué à la fin de la période de charge (Fig. 2a). Ces résultats indiquent que l'internalisation observée résulte de la fixation de la neurotensine sur les récepteurs membranaires pendant la période de charge.
EXEMPLE 2 : Intemalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Dans une première série d'expériences, 0,5 μl de chacune des 120 fractions d'élution d'un extrait de cerveaux de grenouille (prépurifié sur une colonne semi-préparative) ont été poolées par 10, donnant naissance à 12 pools de 10 fractions, chacun complété à 50 μl avec du tampon d'Earle's. Seul le pool 2 contenant les fractions 11 à 20 entraîne l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP.
Dans une seconde série d'expériences, les fractions du pool 2, c'est à dire les fractions 11 à 20 (0,5 μl de volume de fraction originale dilué à 50 μl avec du tampon d'Earle's) ont été testées individuellement. Seules les fractions 15,16,17,18 entraînent l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP (Fig. 3). Cette intemalisation n'est pas détectée si les cellules sont soumises à un lavage acide à la fin de la période de charge (Fig. 2b) indiquant que l'internalisation observée est le résultat de la fixation d'un ligand spécifique sur les récepteurs NTR1-EGFP pendant la période de charge.
EXEMPLE 3 : Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur les fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Le dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille utilisant un anticorps dirigé contre la région conservée de la neurotensine montre que le matériel immunoréactif est exclusivement contenu dans les fractions 15,16,17,18 (Fig. 4). La quantité totale apparente de neurotensine mesurée dans les fractions d'élution de l'HPLC semi-préparative est de 894 ng dans 16 ml, ce qui correspond à une valeur de 352 pg de peptide par cerveau de grenouille. Par conséquent, le matériel provoquant l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP, contenu dans les fractions 15,16,17,18 correspond à la neurotensine endogène du cerveau de grenouille.
En conclusion, le procédé d'internalisation décrit ci-dessus est un moyen direct, simple, spécifique et fiable, permettant de détecter à partir de l'observation d'une seule cellule une quantité de neurotensine aussi faible que 500 fmoles dans 50 μl. Il apparaît que cette mesure est réalisable aussi bien sur une solution pure de neurotensine que sur une fraction d'extrait de tissu contenant non seulement la neurotensine mais aussi un grand nombre d'autres neuropeptides (le nombre minimum estimé par fraction étant de 50 peptides), avec une sensibilité similaire puisque l'on arrive à détecter, d'après le dosage RIA, environ 250 fmoles.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé utile pour détecter et/ou identifier dans une banque de composés peptidiques, pseudopeptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus, un ligand d'un récepteur d'intérêt et capable de subir une intemalisation induite par la fixation dudit ligand caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant à :
- exprimer à la surface d'une cellule ledit récepteur sous une forme marquée, - mettre en présence ladite cellule avec ladite banque, l'extrait biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus et contenant au moins un composé peptidique, pseudopeptidique ou non peptidique susceptible d'être un ligand dudit récepteur, dans des conditions suffisantes pour permettre une intemalisation cellulaire dudit complexe récepteur-ligand et - visualiser cette intemalisation via la détection du marqueur associé audit récepteur.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il permet la détection d'une concentration en ligand de l'ordre de 10"®M.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le récepteur exprimé est un récepteur orphelin.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le récepteur exprimé est un récepteur dont on connaît le ligand endogène.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le récepteur est marqué par une protéine autofluorescente.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine fluorescente est une protéine de la famille de la protéine fluorescente sauvage GFP ou un de ses mutants.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine fluorescente est choisie parmi les protéines EGFP, EBFP et
EYFP.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le récepteur est marqué à l'aide d'un marqueur épitopique susceptible d'être détecté par immunohistochimie.
9 Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le marqueur épitopique est choisi parmi F hemaglutinine, la polyhistidine, les protéines myc et flag et les épitopes viraux.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'internalisation est détectée par microscopie optique et/ou confocale.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le récepteur marqué appartient à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, les GPCRs, à la famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire ou à la famille des récepteurs des cytokines.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on exprime à la surface d'une cellule, deux ou plusieurs récepteurs distincts marqués respectivement par des marqueurs différents.
13. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications précédentes pour détecter et/ou identifier le ou les ligands endogènes d'un récepteur orphelin.
14. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 pour identifier de nouveaux agonistes ou antagonistes pour un récepteur dont on connaît le ligand endogène.
15. Ligand d'un récepteur d'intérêt, identifié par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12.
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