WO1999038991A1

WO1999038991A1 - Procede relatif au transfert de gene dans des cellules germinales

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Publication number: WO1999038991A1
Application number: PCT/JP1999/000177
Authority: WO
Inventors: Mitsuhiro Ueno; Haruko Konishi; Mio Morishita; Atsushi Yuki; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1998-01-28
Filing date: 1999-01-20
Publication date: 1999-08-05
Also published as: EP1050586A1; CN1289370A; KR20010033162A; EP1050586A4; TW542856B

Description

明細書生殖細胞への遺伝子導入法発明の分野

本発明は、生殖細胞への遺伝子導入法、さらに詳しくは、医学、薬学、畜産分野等において有用な、脊椎動物生殖細胞への遺伝子導入方法および該方法によつて得られた遺伝子導入生殖細胞を用いたトランスジエニック動物の作成方法に関する。発明の背景

近年の遺伝子工学的技術の発展は、外来遺伝子の導入や特定の遺伝子の欠失といった遺伝子の修飾が施された動物、すなわち、トランスジエニック動物の作成を可能にした。トランスジエニック動物作成技術は遺伝子の機能を解明するための実験手法として使用される他、医薬品の性能評価に使用するための病態モデル動物や優れた形質を有する家畜類を得るための手段として使用される。

トランスジエニック動物の作成方法としてもっとも一般的なものは、マイクロマニュピレーター等を使用して受精卵に直接 D N Aを注入し、この受精卵を仮親に移植して成長した個体を取得するというものである [ゴードン（Gordon, J. H. ) ら、プロシーディングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンシーズ ·ォブ 'ザ · U S A (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第 77卷、第 7380〜7384頁（1980) ] 。この方法は生体外での受精卵の取り扱いに加えて、受精卵への D N A注入という極めて精密な作業を要し、熟練した研究者の手によつてのみ成功が期待される。また、注入された D NAは積極的に染色体 D NAに組み込まれることはないため、外来遺伝子を保持した個体が得られる割合は低い。

したがって、確実に目的を達成するためには数多くの受精卵について処理を行わなければならず、作業的な負担、受精卵を採取するための動物の購入コストといった問題を有している。このため、以下に述べるような種々の方法が考案され、試られてきた。外来遺伝子を効果的に染色体上に組み込ませるために、レトロウィルスべクタ一を用いて外来遺伝子を初期胚へ導入しょうという試みが報告されている [ボウェン（Bowen, R. A. ) ら、モレキュラー' リプロダクション 'アンド 'デベロプメント（Molec. Reprod. Dev. ) 、第 40卷、第 386〜390頁（1995) ] 。

さらに、妊娠中の雌マウスに、塩基性ポリアミンとプラスミドとの混合物を静脈注射することにより胎児に外来遺伝子を導入しょうとする試みも報告されている [寺田ら、ネイチヤー ·ジエネテイクス（Nature Genetics) 、第 9卷、第 243 〜248頁 (1995) ] 。

—方、まず遺伝子的に修飾された精子を作成し、これを用いて受精卵を作成するという原理に基づいたトランスジエニック動物の作成法も試みられている。例えば、精巣内細胞を物理的もしくは化学的処理により死滅させ、その後、遺伝的に修飾した精原細胞を精細管に移植するという方法が報告されている [プリンスター（Brinster, R. し）ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 91巻、'第 11303〜11307頁（1994) 、ネィチヤ一 'メディシン（Nature Med. ) 、第 2卷、第 693〜696頁 Q996) ] 。

'また、外来遺伝子を含有する環状または直鎖状プラスミド D NAを、リン酸力ルシゥムにて共沈させた後、これをリボソーム法によって精巣内に投与し、精巣内幹細胞や精子に外来遺伝子を導入しょうという試みも行われている [多田ら、アニマノレ .バイオテクノロジー（Animal Biotechnol. ) 、第 5卷、第 19〜31頁 (1994) 、高橋ら、日本畜産学会要旨、 2x- 8、 (1996) ] 。

上記の「ブリンスターら」、「ボウェンら」等の方法は高い効率で遺伝子的に修飾された個体を得ることを主眼としたものである。し力しながら、これらの技術は初期胚の維持、ウィルスによる遺伝子導入、精巣内精細管への細胞移植といつた高水準な実験技術とそれを可能とするだけの高価な設備とを要するため、通常の実験設備をもつて実施することは不可能である。

さらに、「多田ら」「高橋ら」「寺田ら」の方法は上記のような設備を必要としない簡便な方法ではあるが、投与された外来遺伝子が標的である生殖細胞の染色体上に積極的に組み込まれることはなく、したがって一過性にその存在は確認されることはあっても、子孫に伝達する可能性はほとんどない。すなわち、生物学的に機能的な目的遺伝子が組み込まれた生殖細胞や、該細胞を起源とするトランスジエニック動物の取得法には適さない。発明の目的

本発明は、目的とする外来遺伝子が組み込まれた生殖細胞、および該細胞を保持する脊椎動物を取得するための簡便な方法を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、上記の生殖細胞あるいは脊椎動物を利用した、遺伝子的に新しい脊椎動物系統を作成するための方法を提供することにある。発明の概要

本発明者らは、脊椎動物の精巣に組換えゥィルスを接種する精巣内細胞への遺伝子導入において、ウィルスの接種と、精巣内の細胞数を減少させるような処理とを組み合わせることにより、簡便かつ効率よく遺伝子導入された精巣内細胞を取得できることを見い出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の第一の発明は脊椎動物精巣内細胞への遺伝子導入方法に関し、精巣内細胞数を減少させる工程と、外来遺伝子を有する組換えウィルスを精巣中に接種する工程とを包含することを特徴とする。精巣内細胞を減少させる方法としては化学的方法、物理的方法、生物学的方法等が使用でき、特に、アルキル化剤を使用する化学的方法が好適である。また、好ましくは組換えウィルスは精巣内細胞の回復期に精巣内に接種される。

本発明に使用される組換えウイルスには染色体組み込み能を有する組換えゥィルスを使用することができ、好ましくは組換えレトロウイルスを使用することができる。

本発明の第二の発明は、その精巣内細胞に外来遺伝子を導入された脊椎動物に関し、第一の発明の方法により外来遺伝子を導入されていることを特徴とする。本発明の第三の発明は、外来遺伝子を導入された精巣内細胞に関し、第二の発明の脊椎動物から得られることを特徴とする。

さらに、本発明の第四の発明は外来遺伝子を導入された脊椎動物に関し、第二の発明の脊椎動物の交配、あるいは第三の発明の精巣内細胞を用いた人工受精によって得られることを特徴とする。発明の詳細な説明

本発明の精巣内細胞への遺伝子導入方法は、組換えウィルスをベクターとして使用する。本発明に使用できるウィルスベクターは目的遺伝子を標的細胞の染色体上に,袓み込む能力を有するものが好ましく、特に限定するものではないが、例えば、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウィルス（H I V) ベクタ一、ァデノ随伴ウィルスベクター等を使用することができる。さらに、本発明のウィルスベクターは無制限な感染を繰り返さないよう、複製能を欠損したものであることが好ましい。

本発明の遺伝子導入方法には、公知の複製能欠損レト口ウィルスベクターを使用することができる。特に限定するものではないが、例えば、 MFG (ATCC

No. 68754) 、 α-SGC (ATCC No. 68755) 、 pLRNL

[ウイロロジー（Virology) 、第 171卷、第 331頁（1989) ] 、 pBa b e [ヌクレイツク ♦ァシッズ' リサーチ（Nucleic Acids Research) 、第 18巻、第 3587

〜3596頁（1990) ] 等のレトロウイルスベクター、またはこれらを改変したべクターを使用することができる。また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、 PG 13 (ATCC CRL— 10686) 、 PG 13/LN c 8 (ATCC CRL— 10685) 、 PM317 (ATCC CRL— 90 78) 、 GP + E— 86 (ATCC CRL 9642) 、 GP+e nvAm— 1

2 (ATCC CRL 9641) 等の細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウィルス粒子を含有するウィルス上清液を調製することができる。

本発明の方法により生殖細胞に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、導入を望まれる任意の遺伝子であってよい。例えば、酵素やその他の蛋白質をコードする遺伝子、アンチセンス核酸やリボザィム、デコイのような機能的な核酸分子をコードする遺伝子等を導入することができる。これらの遺伝子の起源にも特に限定はなく、該遺伝子が導入される生殖細胞と同種の生物由来のもの、異種生物由来のもの、化学的に合成されたもの、さらにはこれらの組み合わせであってもよい。また、これらの遺伝子はその発現を調節するための適当なプロモーター、ターミネータ一、ェンハンサーといった調節要素を付加されていてもよい。これらの遺伝子は上記のウィルスベクターに組み込まれて本発明に使用される。

本発明の遺伝子導入方法は、導入しょうとする外来遺伝子を含有する,祖換えゥィルスを精巣に接種する工程を含む。ウィルス接種は開腹等の外科的手術を行わず、例えば、麻酔下に注射器を使用して精巣内に注入する。

細胞へのウィルス感染においては標的細胞数とウィルス粒子数、すなわち、ゥィルスのタイターとの比が感染効率を大きく左右する因子となることが知られてレ、る。例えば、本発明者らは外来遺伝子を組み込んだレトロウイルス（I X 1 0⁴ cfu/ml) を両精巣に 5 0 1ずつ注入した雄マウス 1 0匹を用い、 8週齢の正常雌マウスと毎週月曜日から金曜日まで 1対 1で同居させる自然交配を 5 週間にわたり行った。この雌マウス 5 0匹から得られた産子計 5 3 4匹について P C R法にて遺伝子解析を行つたところ、使用した外来遺伝子を保持した産子は認められなかった。

この問題を解決するためには、高いタイターの組換えウィルスを接種することが望ましいが、組換えウィルスのタイターは該ウィルスを産生するプロデューサ一細胞により決定される。実際には高タイターのレトロウィルスべクターを産生するプロデューサー細胞の構築は容易なことではない。本発明の遺伝子導入方法では、精巣内細胞の数を減少させる工程を組み合わせることにより、この問題を解決した。

本明細書に記載の精巣内細胞とは、精巣内に存在する生殖細胞をいう。例えば、精原細胞、精母細胞、精細胞、精子等の精巣内細胞が本発明の方法により遺伝子導入される。

精巣内細胞を減少させる方法としては、化学的方法、物理的方法、生物学的方法を単独で、または組み合わせて使用することができる。化学的方法とは化学物質の投与による精巣内細胞の減少方法をいい、例えば、 D NA合成阻害剤、 R N A合成阻害剤、 D N Aポリメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、避妊薬等を使用することができる。物理的方法としては、例えば、エックス線ゃガンマ一線の照射を使用することができる。また、生物学的方法としては、例えば、細胞の増殖、複製に関与する蛋白質等を利用することができる。上記の種々の方法により精巣内細胞数を減少させることができるが、本発明では特別な装置、操作を必要とせず、また、作用のコントロールが容易である化学的方法により精巣内細胞を減少させることが好ましい。

化学的に精巣内細胞を減少させる方法としては、例えば、アルキル化剤を使用する方法がある。本発明の方法に使用可能なアルキル化剤としては、例えば、マイトマイシン C、ナイトロジェンマスタード一 N—オキサイド、 T E S P A、メルファラン、カルボクウオン、ニトロソゥレア誘導体、サイクロフォスフアミド、ブサルファン等が挙げられる。

本発明の遺伝子導入方法は、処理前の状態に回復可能な程度に精巣内細胞を減少させる工程を含む。上記の精巣内細胞数減少処理により精巣内では成熟細胞の枯渴が起こるが、その後、残存する精原細胞が活発に分裂、増殖を始め、一定の期間を経て処理前の状態に細胞数が回復する。このことは上記のような精巣内細胞減少処理を行った動物個体について、経時的に精巣の観察、精巣の組織切片の顕微鏡観察、 F A C S (Fluorescence Activated Cell Sorting) による細胞周期の解析および in vivo 交配実験等を実施することにより確認することができる。すなわち、こうした実験により、実施された精巣内細胞減少処理と、細胞数の減少〜回復との相関を詳細に知ることができる。

このようにして細胞数を減少させた精巣に外来遺伝子を含有する糸且換えウィルスを接種すれば高効率で精巣内細胞へのウィルス感染が起こり、さらに精巣内細胞数の回復にともなって外来遺伝子の導入された精原細胞、精母細胞、精細胞、精子が精巣内に蓄積される。好ましくは、ウィルスは残存する細胞が活発に増殖を行っている回復期を選んで投与される。細胞への遺伝子導入にベクタ一として多用されるレトロウィルスは分裂期の細胞に好んで感染することが知られており、この回復期は該ゥィルスの感染にとって特に良好な環境にある。

高いタイターの組換えウィルスを接種することにより、さらに遺伝子導入の効率を上げることが可能である。これは、例えば、高タイタ一ウィルス産生能を有するパッケージング細胞を選択してウィルス上清液を調製することにより達成することができる。また、適当な方法で濃縮したウィルスを使用してもよい。例えば、シユードタイプと呼ばれるレトロウイルスベクターである V S V— Gベクタ一 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 90卷、第 8033〜8037頁（1994) ] は遠心分離法によりウィルス粒子の濃縮が可能である。

本発明は、外科的手術、生体外での生殖細胞の取り扱いを伴わない簡便な脊椎動物生殖細胞への外来遺伝子導入法を提供するものである。本発明を使用することにより、外来遺伝子を導入された生殖細胞を保持する雄の脊椎動物個体を取得することができる。さらに、得られた雄の脊椎動物個体を雌の個体と交配させることによって、遺伝子導入された生殖細胞由来の受精卵、さらには該受精卵より発生した脊椎動物個体を得ることができる。なお該受精卵の取得には、交配以外の方法も使用することができる。例えば、上記の雄の脊椎動物個体より精巣内細胞、例えば、精子を採取し、これを試験管内で卵子と受精させる人工受精により、受精卵を作成することもできる。人工受精により作成された受精卵はこれを適当な仮親に移植することにより、動物個体として発生させることができる。

こうして得られた動物個体にはその細胞中の一方の染色体上に外来遺伝子の導入、すなわち、遺伝子の修飾を受けたもの（ヘテロ個体）が含まれている。このような個体は、公知の方法、例えば、 P C R法やハイブリダィゼーシヨン法によつてその遺伝子中に外来遺伝子が含まれているかどうかを調べ、選択することができる。この個体どうしの交配を行って得られる子孫よりホモの個体、すなわち、両染色体上の遺伝子が修飾されたものを選択することにより、導入された遺伝子、およぴ該遺伝子に由来する形質を安定に保持したトランスジエニック動物を得ることができる。

なお、本発明はヒト以外の動物のあらゆる種に適用することができ、例えば、研究用として使用されることの多いげつ齒動物（例えばマウス、ラット等）の他、家畜や家禽類（例えば乳牛、肉牛等の畜牛、馬、豚、鶏等の鳥類等）にも応用可能である。本発明の方法を使用することにより、実験動物として有用な、あるいは家畜として優れた形質を有したトランスジヱニック動物を簡便、安価に作成することが可能となる。

また、本発明の方法によってその精巣内細胞に目的の外来遺伝子が導入された雄の脊椎動物個体は、該遺伝子をその染色体上に組み込まれた精子を産生する。したがって、該方法は、例えば、高付加価値の仔牛、仔馬を生産するための種牛、種馬の作成手段として期待される。この雄を用いた交配により、該遺伝子を保持する子孫を産生させることができる。図面の簡単な説明

図 1はブサルファン投与マゥスの精巣内細胞の F A C Sによる解析データを示す。図中 A、 B、 Cはそれぞれブサルファン投与後 1、 3、 5週後の精巣内細胞についての解析結果を示す。

図 2はブサルファン投与雄マウスの生殖能力を示す。図中の妊娠率は妊娠した雌マウスの割合を表す。また図中 Aは対照、また B、 Cはそれぞれ 20、 30、 40 mgZkgのブサルファンを投与されたマゥスにつレ、ての結果を示す。

図 3はプラスミド pGL2に含有される、被感染細胞染色体に組み込まれる V G L 2ウィルス遺伝子の領域を示す。図中 LTRはモロニ一マウス白血病ウィルス由来の LTR (Long Terminal Repeat) を、 SDはスプライスドナ—部位を、（/>はパッケージングシグナルを、 CMVはサイトメガロウィルス由来初期ェンハンサプロモーターを、 GF Pはグリ一ンフノレオレツセンスプロティン遺伝子を、 SAはスプライスァクセプター部位を、 Ne oはネオマイシンホスフオトランスフェラーゼ遺伝子を、 S V4 Ooriは S V40由来複製開始点を、 p BR322oriは pBR322由来複製開始点をそれぞれ示す。

図 4は vGL 2ウィルスを接種されたマウスの精巣内細胞中での GFPの発現を F A C Sで解析した結果を示す。

図 5は vGL 2ウィルスを接種されたマウスの精巣上体より採取した精子での GFPの発現を F A C Sで解析した結果を示す。実施例

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

ブサルフ了ン腹腔内投与によるマウス精巣内細胞の変動 (1) 精巣重量へ及ぼす影響

4週齢の MCH (I CR) 雄マウス（日本クレア社）に、 5mg/kg、 1 Omg/ kg、 2 Omg/kg, 4 OmgZkgのブサルファン（1， 4—ブタンジォーノレジメタンスルフォネート、和光純薬社製）を腹腔内投与した。投与後 1週目、 2週目、 3 週目、 4週目および 5週目にマウスの精巣を摘出してその重量を測定し、対照として用レ、た生理食塩水投与マゥスの精巣の重量と比較した。

その結果、表 1に示すように、 2 Omg/kgおよび 4 Omg/kgのブサルファンを投与したマウスにおいてその重量の低下が観察された。さらに、 S Omg/kg投与マウスでは投与後 5週目にその重量が回復する傾向が認められた。

ブサルファン投与のマウス精巣重量への影響

(2) 体重へ及ぼす影響

4週齢の MCH (I CR) 雄マウスに、 1 OmgZkg 2 Omg/kg、 3 Omg/kg および 4 Omg/kgのブサルファンを腹腔内投与し、投与後 7週目までの体重変化を測定し、生理食塩水を投与した対照マウスの体重と比較した。なお、各投与群、対照群にはそれぞれ 1群 5匹のマゥスを使用した。

その結果、表 2に示すように、これらの範囲の投与量においてブサルファンはマウスの体重に全く影響を及ぼさなかった。また、マウスの外見にも変化は見られなかった。表 2

ブサルファン投与のマウス体重への影饗

1群 5匹の平均体重 ±標準偏差（単位： g) で表示した ·

( 3 ) 精巣および精巣上体組織切片の顕微鏡による観察結果

4週齢の MC H ( I C R) 雄マウスに、 2 OmgZkg、 3 0 mg/kg および 4 0 mgZkgのブサルファンを腹腔内投与し、投与後 1 0週目にマウスの精巣、および精巣上体を摘出して組織切片を作成した。この切片を H E染色（へマトキシリン —ェォジン染色）した後に顕微鏡観察を行い、組織、細胞の状態を生理食塩水を投与した対照マウスと比較した。なお、各投与群、対照群にはそれぞれ 1群 5匹のマウスを使用した。

その結果、表 3に示すように、 2 0 mg/kg および 3 0 mg/kg投与群では精巣、精巣上体ともにほぼ対照マウスと同様の状態まで回復していた。表 3 ブサルファン投与マウスの精巣および精巣上体組織切片の顕微鏡観察結果

1群 5匹の精巣および精巣上体組織切片の顕微銃観察結果をもとに判定した，

( 4 ) ブサルファン腹腔内投与による精巣内細胞集団の F A C Sによる解析 1群 6匹の 4週齢 MCH (I CR) 雄マウスに、 2 OragZkg、 30 mg/kgのブサルファンを、また、対照群に生理食塩水を腹腔内投与した。投与後 1週目、 2 週目、 3週目、 4週目、 5週目おょぴ 6週目に各群のマウス 1匹ずつから精巣を摘出し、下記の操作にしたがって精巣内細胞を処理した。まず精巣の外皮を除いた後、終濃度 1 mg/mlのコラゲナーゼ I (ギブコ社製）を加えて 37 °Cで 15分間処理し、洗浄し、さらに 0. 25%トリプシン/ /EDTA (ギブコネ ±$¾ lml を用いて細胞塊を分離させた。ついで、 100ミクロン以上の細胞塊をフィルタ一で除去した後、 1%パラホルムアルデヒドによって固定、続いて 70%ェタノールによって固定を行った。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS) で洗浄した後、 PBSに懸濁し、 2mg/mlの RN a s e A (シグマ社製）処理を行った後、 0. 0 SmgZmlのプロビジゥムアイオダイド（シグマ社製）により DNAの染色を行った。測定直前に 30ミクロンのメッシュで細胞塊を除き、 FACSVa n t a g e (べクトン'ディッキンソン社製）を使用し、励起波長 488nm、測定波長 564〜606 nmで細胞中の DN A含量の解析を行った。

F A C S解析により D N A量が 4 nである G 2期、 M期にある精原細胞および一次精母細胞、 DNA量が 2 nである G 1期にある精原細胞および二次精母細胞、 D NA量が nである精細胞および精子、そして、これらよりも D NA量が少ないアポトーシスを起こしている細胞数を求めることができる。表 4にこの解析データより求めた値を示した。また、図 1には代表例としてブサルファン 2 0 mg/kg 投与マウスの 1、 3、および 5週後の精巣細胞について得られた F A C Sのデータを示した。

図 1は、投与後 3週目には大部分の精巣内細胞がアポトーシスを起こしているのに対し、 5週目には 2 nの細胞数の割合が増加していることを示している。また、表 4に示す結果より、精巣内の全細胞数はブサルファン投与から約 4週後にもっとも少なくなり、その後に細胞の再生が開始されること、ならびに細胞の再生過程ではまず 2 nの細胞からその数が増加していくことが明らかとなった。

表 4

ブサルファン改控内投与後のマウスの精巣内細胞種の変動

結果は 2匹のマウスについての各細胞致の平均値を示した.

η ：精細胞および/または精子

2η： G1期铕展細胞および/または二次精母細胞

4η： G2,M期の铕原細胞および/または一次精母細胞 ( 5 ) ブサルファン腹腔內投与による雄マウスの生殖能力の減少と回復時期の決定

1群 6匹の 4週齢 MCH (I CR) 雄マウスに、 2 Omg/kgおよび 3 OmgZkg のブサルファンを腹腔内投与し、投与後 1週目から 10週目まで、月曜日から金曜日まで 5日間毎週異なる雌マウスと自然交配させた。この雌マウスの妊娠率を調べることにより、ブサルファンを投与された雄マウスと、対照である生理食塩投与群の生殖能力を比較した。

その結果、図 2に示すように、 2 Omg/kg および 3 OmgZkg腹腔内投与群において、生殖能力の低下（ブサルファン投与後 4〜7週目）とその回復（ブサルファン投与後 8週目）が認められた。マウスでは精原細胞から精母細胞を経て精細胞となり成熟精子になるまでおよそ 3〜 6週間を要するとされている。上記の実施例 1一（3) 、（4) に示された組織切片の顕微鏡観察結果、および F AC Sによる精巣内細胞集団変化の解析結果では、ブサルフ了ン投与後の精巣内細胞の回復は薬剤投与後 5週目より観察される。それより 3週間遅れて雄マウスの生殖能力の回復が認められたことは、精原細胞から成熟精子が形成されるまでに要する時間とよく一致するものであった。

実施例 2

マゥス精巣内細胞への外来遺伝子の導入と発現

(1) 組換えレトロウイルスの構築

コドンがヒト用に至適化され、かつ N末端から 65番目にコードされるァミノ酸がセリンからスレオニンに置換された（S 65T) グリーンフルォレツセンスプロテイン（GFP) をコードする遺伝子を含有するプラスミド pGreen

Lantern- 1 (ライフテックオリエンタルネ±$¾ を S s p l (宝酒造社製）で消ィ匕し、 1 %ァガロースゲルを用いて電気泳動した後、約 1. 9kbに相当する DNA 断片を回収した。一方、プラスミド pZIP- NeoSV(X)I [セル（Cell) 、第 37卷、第 1053〜1062頁（1984) ] を BamH I (宝酒造社製）で消化し、末端を DNAブランティングキット（宝酒造ネ; t ) を使用して平滑化した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化した。このプラスミド DNAと上記の約 1. 9kbDNA断片とを混合してライゲ一シヨンを行った後、ィ一 'コリ JM 109 (宝酒造社製）に導入した。得られた形質転換体に保持されているプラスミドを調べ、上記約 1. 9 kb断片 1分子のみが含まれているものを選んで、プラスミド p G L 2と命名した。該プラスミド由来のウィルス粒子は、細胞に感染することにより被感染細胞の染色体上に G F P遺伝子を組み込むことができる。プラスミド pGL 2に含まれている、被感染細胞染色体に,袓み込まれるレトロウイルスの遺伝子の領域を図 3に示す。

(2) vGL 2ウィルス上清液の調製

プラスミド pGL 2由来のウィルスは vGL 2ウィルスと命名されており、該ウィルスを含む上清液はパッケージング細胞である BO S C 23細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. . USA, 第 90巻、第 8392〜8396頁（1993) ] を使用して調製した。すなわち、 10 cm径のゼラチンコート細胞培養用デイツシュ（岩城硝子社製） 1枚当たりに 1 X 10⁷個の B O S C 23細胞を含む 10 %ゥシ胎児血清 (FCS、大日本製薬ネ；ならびに 50単位/ mlのペニシリンおよび 50 μ g/mlのストレプトマイシン（共にギブコ社製）を含有する 1 Omlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、岩城硝子社製）中で一晚培養した（なお、以降の操作に使用した DMEMはすべて 50単位/ mlのぺニシリンおよび 50 μ g/mlのストレプトマイシンを含んだものである）。培地を新しいもの（10ml) に交換した後に、 5 O gの上記のプラスミド pGL 2を用いてリン酸カルシウム法によるトランスフエクシヨンを行った。 8時間後に培地を新鮮なもの 10mlに、続いて 24時間後に培地を新鮮なもの 5 mlに交換し、さらに 24時間培養を継続した後に培養上清を採集した。採集した培地上清を 0. 45ミクロンのフィルター

(ミリポアネでろ過して vGL 2ウィルス上清液ストックとし、使用するまで一 80 °Cで保存した。

(3) 上清液の力価の測定

上清液のタイターの測定は N I H/3T3細胞（ATCC CRL— 165

8) を使用して標準的な方法 [ (ジャーナル ·ォブ ·ウイロロジー（J.

Vilol.) 、第 62卷、第 1120〜1124頁 (1988) ] に従って測定した。すなわち、 6 ゥェルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の 1ゥェル当たりに 2000個の NI HZ3T3細胞を含む 10%仔ゥシ血清（CS、ギブコ社製）を含有する D MEMを添加し、一晩培養した後、系列希釈したウィルス上清液と終濃度 7. 5 μ g/ralのへキサジメトリン ·ブロミド（ポリブレン：アルドリツチ社製）とを各ゥェルに加えた。これを 37 °Cで 24時間インキュベートした後、培地を終濃度 0. 75mgZmlの G418 (ギブコネ土製）と 10 %の C Sとを含有する DMEM と交換してさらにインキュベートを続けた。 10〜12日後に生育した G418 耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、その数を記録した。ゥエルあたりのコロ二一数にウィルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清 1 ral当たりに含まれる感染性粒子数（cfuZml) 、すなわち、ウィルス上清液のタイターを算出し、このタイターをもとに以降の実験におけるウィルス上清液の使用量を決定した。

(4) マウス精巣内細胞への外来遺伝子 GFPの導入

1群 4匹の 4週齢 MCH (I CR) 雄マウスに、 3 Omg/kgのブサルファンを腹腔内投与し、投与後 14日目、 17日目および 20日目の 3回ウィルスを接種する群（グループ 1) 、投与後 21日目、 24日目おょぴ 27日目の 3回ウイルスを接種する群（グループ 2) 、投与後 28日目、 31日目および 34日目の 3回ウィルスを接種する群（グループ 3) および投与後 35日目、 38日目およぴ 41日目の 3回ウィルスを接種する群（グループ 4) にわけてウィルスの接種を実施した。ウィルスの接種は、 1 X 10⁴ cfuZmlの vGL 2ウィルス上清液 50 1ずつを両方の精巣内に接種するという方法で行った。ウィルス最終接種後 4日目、 1 1日目、 18日目、および 25日目にそれぞれの群のマウス 1匹ずつから精巣を摘出して精巣内細胞標品を調製し、 P CR法による細胞内 G F Ρ遺伝子の検出、ならびに F AC Sによる GF Ρ遺伝子産物の蛍光測定を行った。

( 5 ) マウス精巣内細胞での G F P遺伝子発現の F A C Sによる解析実施例 2— （4) で摘出されたマウス 1匹分の精巣より外皮を取り除き、ホモジナイザーを用いて組織をバラバラにした。ここに lmlの 0.25%トリプシン ZEDT A溶液を加えて細胞塊を解離させ、 30ミクロンのメッシュを用いて残つた細胞塊を除いて精巣内細胞標品を調製した。こうして得られた精巣内細胞標品を F ACSによる解析に供し、 GFP遺伝子の発現を調べた。解析には F AC SVa n t a g eを使用し、励起波長 488nm、測定波長 515〜545nmで G F P由来の蛍光の測定を行った。

グループ（3) のウィルス接種後 25日目の精巣内細胞標品を解析した結果、および対照として解析したブサルファン投与後ウィルスを接種しなかった同週齢のマウスの精巣内細胞標品についての結果を図 4に示す。ウィルスが接種されたものでは対照には見られない GFP由来の蛍光を示す領域（図面の横軸に示した GFPの相対蛍光強度 30〜100の領域）が存在しており、導入された GFP 遺伝子が精巣内細胞中で発現されていることが確認された。

(6) マウス精巣内細胞に導入された GFP遺伝子の検出

実施例 2— (5) で調製された精巣内細胞標品のうちのいくつかを選び、染色体 DNAを調製した。上記の精巣内細胞標品より約 1 X 10⁶個の細胞をとり、 DNA抽出液（l OmM トリス— HC l (pH8. 0) 、 10 Om Na C l、 1 OmM EDTA、 39mM DTT、 2% SDS) 700 zlに懸濁した。この懸濁液に 35 /zlのプロティナーゼ K (10mg/ml、メノレタネ： fc ) を加えて 3 7 °Cで一晚保温した後、 2 μ 1のリボヌクレアーゼ A ( 2 Omg/m シグマ）を加え、さらに 37°C、 2時間保温した。フエノールークロロホルム抽出により反応を停止した後、エタノール沈殿を行って DNAを回収し、 100/ lの TE 緩衝液 (1 OmM トリス一 HC l (pH8. 0) 、 ImM EDTA) に溶かして染色体 DNA溶液とした。

vGL 2ウィルスが細胞に感染し、 GFP遺伝子が染色体に組込まれていることは、 PCR法により確認した。上記の染色体 DNAと、 GFP遺伝子の配列をもとに合成したォリゴヌクレオチド G F P— 13および G F P— 16 R (配列表の配列番号 1、 2にそれぞれォリゴヌクレオチド G F P— 13および G F P— 1 6 Rの塩基配列を示す）を含む PC R反応液を調製し、 94° (：、 1分の処理の後、 94°C、 30秒〜63°〇、 30秒〜72°〇、 30秒を 1サイクルとした 30サイクルの反応を行った。なお PCRには TaKa Ra T a q (宝酒造社製）を使用し、添付の反応用緩衝液を使用して反応液を調製した。また、 vGL2ウイノレスが感染した N I HZ3T3細胞、およびブサルファン投与後ウィルスを接種しなかった同週齢のマウスの精巣内細胞標品から上記同様の操作で調製した染色体 DN A溶液をそれぞれポジティブコントロール、ネガティブコントロールとして使用した。

その結果、表 5に示すように、グループ 2のウィルス最終接種後 1 8日目、グループ 3のウィルス最終接種後 4および 2 5日目、グループ 4のウィルス最終接種後 4および 1 8日目の精巣内細胞より調製した染色体 D NAについて G F P遺伝子由来の 2 3 4 bpの D N A断片の増幅が認められた。

以上の結果より、ブサルファン投与後 4週目から 5週目にかけて、もしくは 5 週目から 6週目にかけてウィルスを接種された群において、高い効率で外来遺伝子、すなわち、 G F P遺伝子が染色体上に組み込まれることが示された。したがつて、実施例 1に示された予備実験より明らかになった、減少した精巣内細胞の回復時期であるブサルファン投与後 5週目を中心に数回のウィルス接種を行うことが重要である事が明らかになった。

実施例 2— ( 4 ) 〜（6 ) の結果は、 in vivoにおいて目的遺伝子を精巣内細胞の染色体に組み込むには、目的遺伝子を組み込み能力を有するベタターに導入し、これを精巣内細胞が薬剤による障害から回復する時期に接種することが重要であることを示している。

表 5

?じにょる0??遣伝子の検出

+ : 234 bp断片の増幅あり

- : 234 bp断片の増幅なし

実施例 3

マウス精巣上体内精細胞への G F P遺伝子の導入と発現

(1) マウス精巣上体内精細胞への GFP遺伝子の導入

16匹の4週齢1\ 。1"1 (I CR) 雄マウスに 3 Omg/kgのブサルファンを腹腔内投与し、投与後 28日目、 31日目および 34日目に 1 X 10⁴ cfu/mlの v GL2ウィルス上清液 50 μ 1ずつを両精巣内に接種した。ウィルス接種後 28 日目、 35日目、 42日目および 49日目にマウス 4匹ずつより精巣上体を摘出して精子画分を調製し、 F ACSによる GFP遺伝子産物の蛍光測定と蛍光陽性画分細胞の収集、ならびに蛍光陽性画分細胞について P C R法による G F P遺伝子の検出を行った。

(2) マウス精巣上体内精細胞中の GFP遺伝子発現の解析

実施例 3— (1) 記載のマウス精巣上体を 2%ペニシリン Zストレブトマイシン中でハサミによって細断した後、 ₃0ミクロンのメッシュで細胞塊を除いて精子画分を調製した。この精子画分につき、実施例 2— (5) 記載の方法にしたがつて、 F ACSによる GFP遺伝子発現の確認を行った。また、この際に GFP 由来の蛍光が陽 1"生の細胞画分を分取した。

ウィルス接種後 42日目のマウス由来精子画分についての解析結果、ならびに対照として解析したブサルファン投与後ウィルスを接種しなかつた同週齢のマゥスの精巣內細胞標品についての結果を図 5に示す。図に示されるようにウィルス接種後 42日目のマウスの精巣上体中に GFPを発現する精子（図面の横軸に示した G F Pの相対蛍光強度 8〜 20の領域）が存在することを確認できた。

(3) マウス精巣上体内精細胞の GFP遺伝子の検出

実施例 3— (2) で FACSにより分取された GFP蛍光陽性の精子画分より約 1 X 10⁵個相当の細胞をとり、 DNA抽出液（1 OmM トリスー HC 1 (p H8. 0) 、 10 OmM NaC l、 1 OmM EDTA、 39mM DTT、 2% SDS) 7 OO/x 1に懸濁した。この懸濁液に 35 tlのプロティナ—ゼ K ( 1 Omg/ml) を加えて 37 °Cでー晚保温した後、 2 / 1のリボヌクレア一ゼ A

(2 Omg/ml) を加え、さらに 37°C、 2時間保温した。フエノール一クロロホルム抽出により反応を停止した後、エタノール沈殿を行って DN Aを回収し、 3 0 μΐの TE緩衝液に溶かして染色体 DNA溶液とした。

この染色体 DN Α溶液について実施例 2— (5) 記載の方法により、 GFP遺伝子の検出を行った。この結果、表 6に示すようにウィルス投与後 42、 49日目の精子から調製された染色体 DN Aについて GFP遺伝子の存在を示す 234 bpの DN A断片の増幅が認められた。表 6

PCRによる GFP遣伝子の検出

+ : 234 bp断片の増幅あり

一： 234bp断片の増幅なし

Claims

請求の範囲

1 . 精巣内細胞数を減少させる工程と、外来遺伝子を有する組換えウィルスを精巣中に接種する工程とを包含することを特徴とする脊椎動物精巣内細胞への遺伝子導入方法。

2 . 精巣内細胞数を減少させる工程を、化学的方法、物理的方法および生物学的方法から選択される方法により行なう請求項 1記載の遺伝子導入方法。

3. アルキル化剤を使用する請求項 2記載の遺伝子導入方法。

4. 組換えウィルスの精巣中への接種を、精巣内細胞の回復期に行なう請求項 1〜 3レ、ずれか 1項に記載の遺伝子導入方法。

5 . 染色体組み込み能を有する組換えウィルスを接種する請求項 1〜 4いずれか 1項に記載の遺伝子導入方法。

6 . 糸且換えウィルスが複製能を欠損したウィルスベクターを用いたものである請求項 5記載の遺伝子導入方法。

7 . 組換えレトロウイルスを接種する請求項 5または 6記載の遺伝子導入方法。

8 . 請求項 1〜 7いずれか 1項記載の方法により精巣内細胞に外来遺伝子を導入された脊椎動物。

9 . 請求項 8記載の脊椎動物から得られる、外来遺伝子を導入された精巣内細胞。

1 0 . 精原細胞、精母細胞、精細胞および精子より選択される請求項 9記載の精巣内細胞。

1 1 . 請求項 8記載の脊椎動物の交配によって得られる、外来遺伝子を導入された脊椎動物。

1 2 . 請求項 9または請求項 1 0記載の精巣内細胞を用いて人工的に作成された受精卵より得られる、外来遺伝子を導入された脊椎動物。