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WO1999037750A1 - Procede et dispositif de lyse cellulaire - Google Patents

Procede et dispositif de lyse cellulaire Download PDF

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WO1999037750A1
WO1999037750A1 PCT/FR1999/000105 FR9900105W WO9937750A1 WO 1999037750 A1 WO1999037750 A1 WO 1999037750A1 FR 9900105 W FR9900105 W FR 9900105W WO 9937750 A1 WO9937750 A1 WO 9937750A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pipe
lysis
agent
flow
meeting point
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000105
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Chevalier
Original Assignee
Aventis Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur filed Critical Aventis Pasteur
Priority to AU20604/99A priority Critical patent/AU756179B2/en
Priority to EP99900963A priority patent/EP1049766A1/fr
Priority to JP2000528658A priority patent/JP2002500878A/ja
Priority to CA002319021A priority patent/CA2319021A1/fr
Priority to NZ505865A priority patent/NZ505865A/xx
Priority to US09/600,664 priority patent/US6664049B1/en
Publication of WO1999037750A1 publication Critical patent/WO1999037750A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for lysis of bacteria or eukaryotic cells, as well as extraction and purification of nucleic acids, and in particular plasmids, from bacteria or eukaryotic cells containing these plasmids.
  • plasmids of interest and in particular of plasmids into which a gene or a coding DNA sequence has been inserted, is carried out by multicopy of these plasmids in bacteria capable of producing a large number of these plasmids, and in particular in certain strains of Escherichia coli highly productive of plasmids and often already used in the laboratory or on an industrial scale.
  • the alkaline lysis technique which uses an alkaline lysis agent such as a sodium hydroxide + SDS preparation (sodium dodecyl sulfate), followed by neutralization with an acid agent, such as potassium acetate.
  • This neutralizing agent also has the effect of precipitating all of the bacterial constituents, including genomic DNA, the supernatant essentially containing plasmid DNA. The supernatant can then be separated from the precipitate by centrifugation or filtration (Birnboim Methods in Enzymology (1983) 100: 243).
  • the alkaline lysis technique is particularly recommended for lysing bacteria; but it can just as easily be used to lyse eukaryotic cells.
  • Such a method therefore implements a specific means, namely a static mixer, which replaces manual agitation of large volumes with continuous agitation over the entire length of the mixer.
  • a static mixer which replaces manual agitation of large volumes with continuous agitation over the entire length of the mixer.
  • the use of such a mixer in addition to requiring the purchase, maintenance and cleaning of the device, imposes a fixed period of contact with the lysis agent, with no practical possibility of controlling it or modulate it.
  • the stirring maintained in the mixer even if it is preferable to the poorly controlled stirring of discontinuous volumes, can cause breaks in, or degradations of cellular constituents and in particular of nucleic acids.
  • Another method also makes it possible to establish continuous lysis, but this time without using agitation means.
  • This process consists of (i) preparing a mixture of a bacterial suspension and an agent, such as lysozyme, allowing this mixture to incubate for approximately one hour in order to weaken the bacterial wall, then (ii) passing a flow of this mixture inside a pipe heated to high temperature (70-100 ° C).
  • high temperature 70-100 ° C
  • the action of heat promotes lysis.
  • the disadvantage of such a solution is that it requires heating means to 3 high temperatures and an adaptation of the temperature to the different special cases that may be encountered.
  • the present invention proposes to remedy these drawbacks and to provide a cell lysis process, applicable in particular to the extraction and purification of nucleic acids such as plasmids from bacteria or eukaryotic cells, which is capable of '' be implemented without manual intervention and under extremely economical conditions.
  • Another objective of the invention is to provide a method which makes it possible to control in an extremely precise manner the conditions and the duration of the lysis and of the extraction and this for all the cells present.
  • Another objective is to provide a method making it possible to establish substantially homogeneous lysis conditions for a population of cells.
  • Another objective is to provide a process capable of being implemented in a closed environment, free from contamination, which is an advantage for the pharmaceutical quality of the products sought, for example plasmids.
  • Another objective is to obtain a reduction in the duration of the cell / lysis agent contact, which is necessary to complete the lysis.
  • Another objective is to provide a device for implementing this method, a simple and inexpensive device.
  • Another objective is to provide on an industrial scale, plasmid preparations with a high yield and appreciably improved compared to that of the preparations which can be obtained according to the methods of the prior art.
  • the invention is based on the unexpected discovery that it is possible, by respecting a certain number of parameters, to ensure a homogeneous and controlled lysis of cells, and in particular of bacteria, by simple continuous mixing, in a usual pipe, of a suspension of cells with a lysis agent, despite the expected high viscosity, without using any of the means of the prior art such as a static mixer or high temperatures.
  • the invention therefore relates to a cell lysis process in which a liquid mixture of cells and a lysis agent is produced continuously, and 4 immediately causes this mixture to flow under a constant flow, inside a pipeline, the flow rate of this flow being adapted, as a function of the diameter and the length of the pipeline, so as to obtain a cell lysate substantially homogeneous with the outlet of said pipe. Obtaining a homogeneous lysate results in a sharp drop in turbidity and the appearance of a mixture transparent to the eye.
  • the pipeline has a small internal diameter so that the mixture forms almost instantly in a homogeneous manner, without the formation of separate liquid veins.
  • This diameter can be determined experimentally. In general, a diameter of the order of 1 cm or preferably less meets this definition, and a diameter of between 2 and 8 mm is preferred.
  • the diameter and the flow rate are elements of the process fixed in advance, it is just as possible to adapt the length of the pipe so as to obtain the desired effect. For example, for a given diameter and flow rate, it is enough to play on the length of the pipe, e.g., using a simple flexible pipe that is cut to the desired length.
  • the minimum length of the pipeline from the meeting point of the cell suspension and the lysis agent, which is necessary to travel to reach the lysis state, can be easily determined by simple observation through a pipeline transparent, from the reduction in the turbidity of the mixture until the appearance of a lysate transparent to the eye.
  • a pipe length of the order of 10 cm to a few meters is generally suitable.
  • One of the advantages of the invention consists in the homogeneity of the mixture during lysis (the duration of lysis is substantially identical for all bacteria); which ultimately allows a homogeneous lysate to be obtained. This is achieved by the appropriate choice of the parameters of the invention (diameter, and length of pipe, flow rate), without having to use stirring or heating means.
  • the mixture of cells and of lysis agent is produced by introducing, into the aforesaid pipeline, a flow of cells, for example of a 5 cell suspension, and a flow of a lysis agent solution, so that the flow of the flow of this mixture produces rapid homogenization, which is almost instantaneous, if using a reduced diameter pipeline.
  • the lysis agent can be a chemical agent, for example an alkaline agent, such as a sodium hydroxide solution + SDS, preferably a 0.2 M NaOH / 1% SDS mixture. It can also be a hypotonic solution compared to the cellular environment, intended to cause osmotic shock. In the case where the bacteria are simply transferred to a hypotonic solution, they have been treated beforehand so that their wall is weakened, by an agent such as lysozyme. Treatment with an alkaline agent is particularly suitable for bacterial lysis, while treatment with a hypotonic solution is particularly suitable for lysis of eukaryotic cells.
  • an alkaline lysis agent it is preferable to add to the lysate, a neutralizing agent. Indeed, the addition of this agent makes it possible to stop the degrading action linked to the alkaline agent, once a complete and homogeneous lysis has been obtained.
  • another advantage of the invention lies in exercising control over the period during which the cells are subjected to strongly alkaline pH conditions. This makes it possible to very easily implement the optimal duration conditions resulting in a total and homogeneous lysis while avoiding prolonging the action of the alkaline agent beyond the time necessary and sufficient to complete the lysis in order to avoid any action. deleterious in particular on DNA.
  • the neutralizing agent which is added to the lysate arriving at the end of the pipeline may preferably be sodium or potassium acetate, for example 3 M potassium acetate. It is advantageously chosen to so as to obtain a final pH close to 5.5 thanks to the addition of HCI 12N.
  • the aim pursued in fine consists eg in extracting plasmids
  • a precipitating agent sodium or potassium acetate can be used, for example 6
  • potassium acetate 3 M It is advantageously chosen so as to obtain a final pH close to 5.5 thanks to the addition of HCl 12N.
  • a precipitation agent such as sodium or potassium acetate also serves as a neutralizing agent, when the alkaline lysis technique is used.
  • the subject of the invention is also a method of extraction and / or purification of nucleic acids, in particular of plasmids, from a cell suspension, in which (i) the lysis method according to the invention in order to obtain a cell lysate and, continuously with the lysis process, (i) the cell lysate is treated with a precipitating and / or neutralizing agent, in order to obtain a preparation comprising a supernatant containing the plasmid DNA and a precipitated or flocculated phase containing the majority of cellular elements including genomic DNA.
  • a continuous mixture of a cell suspension and a liquid preparation (solution) of a lysis agent is produced, at a first determined meeting point, starting from from which a constant flow of said mixture is established in a pipe, in order to homogenize the mixture of the suspension and of the lysis agent, (ii) this mixture is maintained in this constant flow for a determined duration, and at the end of this duration (iii) adding, at a second determined meeting point, a solution of a precipitating agent; said duration being determined by the distance separating said first and second meeting points and by the speed of movement of the mixture (or linear flow) over this distance.
  • This plasmid extraction process can advantageously be implemented in the following way: (i) a flow of the cell suspension is established in a first channel;
  • a flow of the preparation obtained at the second meeting point is established, by mixing the cell lysate with the precipitation agent; and (vi) a preparation comprising a supernatant containing the plasmid DNA and a precipitated or flocculated phase containing the majority of the cellular elements including the genomic DNA is recovered at the outlet of the fifth channel.
  • step (vi) of recovery it is also possible to proceed, in any manner, with the separation of the supernatant from the precipitated or flocculated phase, preferably continuously from step (vi) of recovery.
  • the time required to obtain a complete and homogeneous lysis taking into account the usual proportions of suspension and of lysis agent, can be very substantially reduced and even less than one or more minutes, for example 5 min and even reduced to such low values. one or two seconds, contrasting with the ten minutes required in the prior art.
  • the proportion of flow rates, and therefore of mixed volumes preferably meets the following definitions: - bacterial suspension / lysis agent (for example sodium hydroxide mixture +
  • SDS between 1/4 and 3/4, and preferably of the order of 1/2
  • alkaline lysis agent / neutralizing acid agent preferably potassium acetate: between 1 and 2 and preferably of the order of 1, 3.
  • the concentration of the bacterial suspension is of the order of 170 grams (by wet weight of bacteria) / liter of a conventional buffer (for example Tris EDTA) + glucose.
  • a conventional buffer for example Tris EDTA
  • the cell suspension is stored at low temperature and directed at this same temperature in the pipe towards the meeting point with the lysis agent, this temperature preferably being of the order of 4 ° C.
  • the lysis agent can be maintained and transported at ambient temperature and the precipitating and / or neutralizing agent is preferably maintained at low temperature, such as 4 ° C. 9
  • the invention also relates to a device for implementing this process, characterized in that it comprises, from a source of cell suspension, such as a reservoir, a pipe allowing the establishment of a flow of cell suspension, from a source of a lysis agent such as a reservoir, a second line allowing the establishment of a flow of the lysis agent, said first and second lines leading to a first meeting point into which they open into one another, - a third pipe of small diameter and of determined length extending from said first meeting point, and means, such as pumping means, for the establishment of flows in said pipes; the length, the diameter and the flow rate in said third pipe being adapted so as to obtain a substantially homogeneous mixture resulting in a substantially homogeneous lysate.
  • the device may also comprise: from a source of neutralizing and / or precipitating agent, such as a reservoir, a fourth pipe leading to a second meeting point at the end of said third pipe so that the pipes open into one another, said third pipe having a length determined by the distance between said first meeting point and said second meeting point; from said second meeting point, a fifth small diameter pipe leading to recovery and / or separation means; and and means, such as pumping means, for establishing the flows in said fourth and fifth pipes.
  • a source of neutralizing and / or precipitating agent such as a reservoir
  • a fourth pipe leading to a second meeting point at the end of said third pipe so that the pipes open into one another said third pipe having a length determined by the distance between said first meeting point and said second meeting point
  • a fifth small diameter pipe leading to recovery and / or separation means and and means, such as pumping means, for establishing the flows in said fourth and fifth pipes.
  • all the pipes have small diameters as defined above.
  • the small diameters of said pipes can be identical or different.
  • the differences in diameter between pipes can be determined by the flow establishment means. 10
  • the means for establishing the flows can advantageously be pumps, preferably one or more peristaltic pumps making it possible to establish, in the various pipes, the flow rates, and therefore, taking into account the diameters of the pipes, the desired speeds.
  • the same pump for example, a peristaltic pump with several parallel channels, so as to ensure, even in the event of untimely variation of the pump flow rate , a constant proportionality between said flows.
  • the arrangement of the pipes according to the invention can be split, tripled or multiplied, preferably with flow establishment means, such as a pump, single or more pumps joined together so as to maintain, in all circumstances, a constant proportionality of the flows in each of the installations.
  • the outlet from one pipe to the other at a meeting point can be made at any angle. Generally it is preferred that one of the pipes opens substantially perpendicularly into the other but it is also possible to tilt the axes of the outlets.
  • the device according to the invention may include means for establishing and controlling temperatures so as to maintain the sources at the required temperatures.
  • the installation can be arranged so that the low temperature is maintained not only in the source but also in the first pipeline to the point where lysis begins.
  • An installation according to the invention makes it possible, for example, to treat a volume of bacterial suspension of the order of 1 to 5 liters per hour. 1 1
  • the mixture obtained downstream of the first meeting point exhibits great homogeneity throughout the duration of the treatment, as does the neutralized mixture downstream of the second meeting point, so that the separation means making it possible to separate, on the one hand , the plasmids remaining in solution, and, on the other hand, the other precipitated or flocculated cellular elements, work under constant conditions and contribute to the excellent reproducibility of the final purified plasmid preparation.
  • the bacterial suspension to be lysed is a suspension originating from a culture of an E. coli strain in which a plasmid such as the plasmid pUC18 in Tris EDTA buffer has been multiplied with a bacterial concentration of the order of 200 g (weight wet) per liter.
  • the sodium hydroxide-SDS mixture is a 0.2 M NaOH / 1% SDS mixture.
  • the potassium acetate solution used as a neutralizing agent is 3 M; pH 5.5.
  • the device shown in the figure comprises a first container 1 containing the bacterial suspension.
  • a first container 1 containing the bacterial suspension.
  • To this container are associated means for maintaining a temperature of the order of + 4 ° C. (not shown) and stirring means 2 making it possible to maintain the homogeneity of the suspension.
  • From the source 1 extends a flexible silicone pipe having an internal diameter of 2.06 mm and forming the first section of pipe 3.
  • the sodium hydroxide-SDS mixture is contained in a reservoir 4 from which extends a second pipe, 5 with an internal diameter of 3.17 mm and made of the same flexible material.
  • the pipe 3 opens perpendicularly into the pipe 5 so that at this location a mixture forms, causing rapid lysis of the bacteria.
  • From point 6 extends a third section of 12 pipe, 7 to point 8 forming the second meeting point, the length of pipe 7 being 0.8 meters.
  • This pipe 7 has an internal diameter of 7 mm (modular).
  • the potassium acetate solution is contained in a reservoir 9 from which extends a fourth pipe 10 also made of flexible material having an internal diameter of 2.79 mm opening into the pipe 7 at the meeting point 8, also perpendicular to line 7.
  • the container 9 is also associated with means for maintaining at low temperature + 4 ° C. From the second meeting point 8 extends a fifth pipe 11, formed subsequently by the pipe 7, this pipe 11 leading to a recovery tank 12.
  • diameters of the three pipes 3, 5 and 10 are in ratios such that the proportions of the internal sections of the pipes ensure, for the same speed of circulation of the liquids, the desired mixing proportions.
  • the flow rates thus obtained are respectively 160 ml / min in 7 and 244 ml / min in 11.
  • the bacteria are subjected to the action of the sodium hydroxide + SDS mixture throughout the duration of the path of the liquid in the pipe 7, between points 6 and 8. This duration, in the example chosen, is 15 sec.
  • a lysed preparation comprising two phases, namely a clear soluble phase containing the plasmids, substantially free of cellular element and an insoluble upper phase containing substantially the cellular elements. 13

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Abstract

Procédé et dispositif de lyse cellulaire dans lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de bactéries ou de cellules eucaryotes et d'un agent de lyse, et l'on fait immédiatement écouler ce mélange dans un flux constant à l'intérieur d'une canalisation (7), le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation (7), de manière à obtenir un lysat cellulaire sensiblement homogène à la sortie (8) de ladite canalisation.

Description

1
Procédé et dispositif de lyse cellulaire
La présente invention a trait à un procédé et un dispositif de lyse de bactéries ou de cellules eucaryotes, ainsi que d'extraction et de purification d'acides nucléiques, et notamment de plasmides, à partir de bactéries ou de cellules eucaryotes contenant ces plasmides.
L'obtention de plasmides d'intérêt, et notamment de plasmides dans lesquels ont été insérés un gène ou une séquence codante d'ADN, est effectuée par multicopie de ces plasmides dans des bactéries aptes à produire un grand nombre de ces plasmides, et notamment dans certaines souches d'Escherichia coli hautement productives de plasmides et souvent déjà utilisées en laboratoire ou à l'échelle industrielle.
L'une des applications qui demande une production importante d'un plasmide, à l'échelle industrielle, est la fabrication de médicaments ou vecteurs d'intérêt prophylactique ou thérapeutique à base d'un plasmide nu ou associé à des moyens de pénétration dans les cellules de l'hôte receveur. De telles applications sont décrites par exemple dans la demande de brevet WO 90/11092.
Il existe plusieurs techniques de lyse bactérienne permettant l'extraction des plasmides, suivie d'une séparation, et donc d'une purification de ces plasmides. La technique la plus couramment utilisée est la technique de lyse alcaline qui met en œuvre un agent de lyse alcalin tel qu'une préparation soude + SDS (dodécylsulfate de sodium), suivie d'une neutralisation par un agent acide, tel que de l'acétate de potassium. Cet agent de neutralisation a aussi pour effet de précipiter l'ensemble des constituants bactériens, dont I'ADN génomique, le surnageant contenant essentiellement I'ADN plasmidique. Le surnageant peut ensuite être séparé du précipitât par centrifugation ou filtration (Birnboim Methods in Enzymology (1983) 100 : 243). La technique de lyse alcaline est tout particulièrement recommandée pour lyser des bactéries ; mais elle peut tout aussi bien être utilisée pour lyser des cellules eucaryotes.
Cette technique, qui convient à l'échelle du laboratoire, est pénible à mettre en œuvre à l'échelle industrielle car le lysat résultant de l'action de l'agent alcalin sur les bactéries constitue une suspension très visqueuse, de 2 sorte que le lysat en train de se former doit être homogénéisé par agitation. De même, après neutralisation à l'acide, une homogénéisation par agitation est nécessaire.
Cette agitation est délicate et elle est effectuée généralement de façon manuelle, l'opérateur agitant doucement les bouteilles ou flacons contenant le milieu de lyse. Une agitation insuffisante procure une lyse de mauvaise qualité alors qu'une agitation excessive tend à morceler I'ADN génomique, qui se mélange par la suite aux plasmides. Dans les deux cas, on observe une diminution du rendement en ADN plasmidique. En conséquence, le tour de main de l'opérateur est un gage essentiel de réussite de l'opération.
Afin d'automatiser le procédé de lyse, on a déjà proposé, dans le document WO 97/23601, de faire passer, en continu, la suspension de cellules à lyser et une solution d'un agent de lyse à travers un mélangeur statique d'une longueur suffisante pour parachever la lyse. Le lysat qui en résulte peut ensuite être amené, par une canalisation, à un second mélangeur statique dans lequel pénètre également une solution d'un agent précipitant.
Un tel procédé met donc en œuvre un moyen spécifique, à savoir un mélangeur statique, qui remplace l'agitation manuelle de volumes importants par une agitation continue sur toute la longueur du mélangeur. L'utilisation d'un tel mélangeur, outre qu'elle demande l'achat, l'entretien et le nettoyage du dispositif, impose une durée fixe de mise en contact avec l'agent de lyse, sans possibilité pratique de la contrôler ou de la moduler. De plus, l'agitation entretenue dans le mélangeur, même si elle est préférable à l'agitation mal contrôlée de volumes discontinus, peut provoquer des cassures dans, ou des dégradations de constituants cellulaires et notamment d'acides nucléiques.
Un autre procédé, décrit par exemple dans le document WO 96/36106, permet également d'établir une lyse en continu, mais cette fois sans utiliser de moyens d'agitation. Ce procédé consiste (i) à préparer un mélange d'une suspension bactérienne et d'un agent, tel que du lysozyme, à laisser incuber ce mélange pendant environ une heure afin de fragiliser la paroi bactérienne, puis (ii) à faire passer un flux de ce mélange à l'intérieur d'une canalisation chauffée à forte température (70-100°C). L'action de la chaleur favorise la lyse. L'inconvénient d'une telle solution est de nécessiter un moyen de chauffage à 3 des températures élevées et une adaptation de la température aux différents cas particuliers que l'on peut rencontrer.
La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de lyse cellulaire, applicable notamment à l'extraction et à la purification d'acides nucléiques tels que des plasmides à partir de bactéries ou de cellules eucaryotes, qui soit susceptible d'être mis en œuvre sans intervention manuelle et dans des conditions extrêmement économiques.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé qui permet de contrôler de manière extrêmement précise les conditions et la durée de la lyse et de l'extraction et ceci pour la totalité des cellules en présence.
Un autre objectif est de fournir un procédé permettant d'établir des conditions de lyse sensiblement homogène pour une population de cellules.
Un autre objectif est de fournir un procédé susceptible d'être mis en œuvre dans un milieu fermé, à l'abri des contaminations, ce qui est un avantage pour la qualité pharmaceutique des produits recherchés, par exemple des plasmides.
Un autre objectif est d'obtenir une réduction de la durée du contact cellules / agent de lyse, qui est nécessaire pour parachever la lyse.
Un autre objectif est de fournir un dispositif pour la mise en œuvre de ce procédé, dispositif simple et peu onéreux.
Un autre objectif est de fournir à l'échelle industrielle, des préparations plasmidiques avec un rendement élevé et sensiblement amélioré par rapport à celui des préparations pouvant être obtenues selon les procédés de l'art antérieur. L'invention repose sur la découverte inattendue que l'on peut, moyennant le respect d'un certain nombre de paramètres, assurer une lyse homogène et contrôlée de cellules, et notamment de bactéries, par simple mélange en continu, dans une canalisation usuelle, d'une suspension de cellules avec un agent de lyse, malgré la viscosité importante attendue, sans utiliser aucun des moyens de l'art antérieur tel qu'un mélangeur statique ou des températures élevées.
L'invention a donc pour objet un procédé de lyse cellulaire dans lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de cellules et d'un agent de lyse, et l'on 4 fait immédiatement écouler ce mélange sous un flux constant, à l'intérieur d'une canalisation, le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation, de manière à obtenir un lysat cellulaire sensiblement homogène à la sortie de ladite canalisation. L'obtention d'un lysat homogène se traduit par une forte chute de la turbidité et l'apparition d'un mélange transparent à l'œil.
De préférence, la canalisation présente un petit diamètre interne afin que le mélange se forme presque instantanément de manière homogène, sans qu'il se forme de veines liquides séparées. Ce diamètre peut être déterminé expérimentalement. En général, un diamètre de l'ordre de 1 cm ou de préférence inférieur répond à cette définition, et l'on préfère un diamètre compris entre 2 et 8 mm.
On doit bien évidemment comprendre que si le diamètre et le débit du flux sont des éléments du procédé fixés à l'avance, on peut tout aussi bien adapter la longueur de la canalisation de manière à obtenir l'effet recherché. Par exemple pour un diamètre et un débit donné du flux, il suffit de jouer sur la longueur de la canalisation e.g., en utilisant une simple canalisation souple que l'on coupe à la longueur désirée.
La longueur minimale de la canalisation à partir du point de rencontre de la suspension cellulaire et de l'agent de lyse, qui est nécessaire de parcourir pour atteindre l'état de lyse, peut être facilement déterminée par simple observation au travers d'une canalisation transparente, de la diminution de la turbidité du mélange jusqu'à l'apparition d'un lysat transparent à l'œil. Une longueur de canalisation de l'ordre de 10 cm à, quelques mètres est en général convenable.
L'un des avantages de l'invention consiste dans l'homogénéité du mélange en cours de lyse (la durée de la lyse est sensiblement identique pour toutes les bactéries) ; ce qui permet d'obtenir in fine un lysat homogène. Ceci est réalisé par le choix convenable des paramètres de l'invention (diamètre, et longueur de canalisation, débit du flux), sans avoir recours à des moyens d'agitation ou de chauffage.
De préférence, le mélange de cellules et d'agent de lyse est réalisé en introduisant, dans la susdite canalisation, un flux de cellules, par exemple d'une 5 suspension cellulaire, et un flux d'une solution d'agent de lyse, de sorte que l'écoulement du flux de ce mélange produit une homogénéisation rapide, qui est presque instantanée, si on utilise une canalisation de diamètre réduit.
L'agent de lyse peut être un agent chimique, par exemple un agent alcalin, tel qu'une solution soude + SDS, de préférence un mélange NaOH 0,2 M / SDS 1 %. Ce peut être aussi une solution hypotonique par rapport au milieu cellulaire, destinée à provoquer un choc osmotique. Dans le cas où les bactéries sont simplement transférées dans une solution hypotonique, elles ont été traitées au préalable de manière à ce que leur paroi soit fragilisée, par un agent tel que du lysozyme. Le traitement par un agent alcalin est particulièrement adapté à la lyse bactérienne, tandis que le traitement par une solution hypotonique convient tout particulièrement pour la lyse des cellules eucaryotes.
Dans le cas où l'on a utilisé un agent de lyse alcalin, on préfère ajouter au lysat, un agent de neutralisation. En effet, l'ajout de cet agent permet d'arrêter l'action de dégradation liée à l'agent alcalin, une fois obtenue une lyse totale et homogène. Dans ce dernier cas, un autre avantage de l'invention réside dans l'exercice du contrôle de la durée pendant laquelle les cellules sont soumises à des conditions de pH fortement alcalines. Ceci permet de mettre très facilement en œuvre les conditions de durée optimales aboutissant à une lyse totale et homogène en évitant de prolonger l'action de l'agent alcalin au-delà du temps nécessaire et suffisant pour parachever la lyse afin d'éviter toute action délétère en particulier sur I'ADN. L'agent neutralisant que l'on ajoute au lysat arrivant à l'extrémité de la canalisation peut être de préférence, de l'acétate de sodium ou de potassium, par exemple de l'acétate de potassium 3 M. Il est avantageusement choisi de façon à obtenir un pH final proche de 5,5 grâce à l'addition d'HCI 12N.
D'autre part, si le but poursuivi in fine consiste e.g. à extraire des plasmides, il est souhaitable de séparer ces plasmides du reste des constituants cellulaires. Cette séparation est réalisée en précipitant ces constituants cellulaires, y compris I'ADN génomique, en ajoutant au lysat un agent précipitant ; les plasmides restant alors dans le surnageant. Comme agent de précipitation, on peut utiliser l'acétate de sodium ou de potassium, par 6
exemple de l'acétate de potassium 3 M. Il est avantageusement choisi de façon à obtenir un pH final proche de 5,5 grâce à l'addition d'HCI 12N.
Un agent de précipitation tel que l'acétate de sodium ou de potassium, sert aussi d'agent de neutralisation, lorsque l'on met en œuvre la technique de lyse alcaline.
L'invention a également pour objet un procédé d'extraction et/ou de purification d'acides nucléiques, notamment de plasmides, à partir d'une suspension cellulaire, dans lequel (i) on met en œuvre le procédé de lyse selon l'invention afin d'obtenir un lysat cellulaire et, en continu du procédé de lyse, (i) on traite le lysat cellulaire par un agent précipitant et/ou neutralisant, afin d'obtenir une préparation comportant un surnageant contenant I'ADN plasmidique et une phase précipitée ou floculée contenant la majorité des éléments cellulaires y compris I'ADN génomique. Pour ce faire, de manière avantageuse, (i) on réalise, en continu, un mélange d'une suspension cellulaire et d'une préparation liquide (solution) d'un agent de lyse, en un premier point de rencontre déterminé, à partir duquel on établit un flux constant dudit mélange dans une canalisation, pour homogénéiser le mélange de la suspension et de l'agent de lyse, (ii) on maintient ce mélange dans ce flux constant pendant une durée déterminée, et à la fin de cette durée (iii) on ajoute, en un second point de rencontre déterminé, une solution d'un agent précipitant ; ladite durée étant déterminée par la distance séparant lesdits premier et second points de rencontre et par la vitesse de déplacement du mélange (ou débit linéaire) sur cette distance. Une fois la précipitation effectuée, on procède, d'une façon quelconque, à la séparation des plasmides restés dans la surnageant d'avec le reste des éléments cellulaires précipités ou floculés.
Ce procédé d'extraction plasmidique peut avantageusement être mis en œuvre de la façon suivante : (i) on établit un flux de la suspension cellulaire dans une première canalisation ;
(ii) on établit un flux de l'agent de lyse en solution dans une deuxième canalisation qui se jette dans la première canalisation (ou vice-versa) en un premier point de rencontre pour former une troisième canalisation ; 7
(iii) on établit un flux d'un agent précipitant dans une quatrième canalisation qui se jette dans la troisième canalisation (ou vice-versa) en un deuxième point de rencontre situé en aval du premier point de rencontre, pour former une cinquième canalisation ; (iv) on établit un flux du mélange cellules/agent de lyse réalisé au premier point de rencontre, dans la troisième canalisation (comprise entre le premier et le deuxième point de rencontre) à un débit linéaire adapté en fonction du diamètre et de la longueur de la troisième canalisation, de manière à permettre l'homogénéisation du mélange et l'obtention d'un lysat cellulaire sensiblement homogène au deuxième point de rencontre ; et
(v) dans la cinquième canalisation, on établit un flux de la préparation obtenue au second point de rencontre, par mélange du lysat cellulaire avec l'agent de précipitation ; et (vi) on récupère à la sortie de la cinquième canalisation une préparation comprenant un surnageant contenant I'ADN plasmidique et une phase précipitée ou floculée contenant la majorité des éléments cellulaires y compris I'ADN génomique.
Par la suite, on peut en outre procéder, de manière quelconque, à la séparation du surnageant d'avec la phase précipitée ou floculée, de préférence en continu de l'étape (vi) de récupération.
Le tableau suivant indique à titre d'exemple diverses conditions expérimentales ( longueur de canalisation, diamètre, débit, durée de mise en contact avec l'agent de lyse alcalin) qui permettent d'obtenir une lyse bactérienne complète et homogène, par la technique de lyse alcaline. Les concentrations bactériennes et d'agent de lyse restent identiques d'un essai à l'autre. Longueur de la Diamètre Débit Durée de mise en contact Canalisation avec l'agent de lyse
28 cm 0,3 cm 160 ml/min 2 secondes
26 cm 0,7 cm 160 ml/min 15 secondes
85 cm + 0,7 cm 160 ml/min 4 minutes réservoir de 500 ml
Figure imgf000010_0001
Le temps nécessaire pour obtenir une lyse complète et homogène, compte tenu des proportions usuelles de suspension et d'agent de lyse peut être très substantiellement réduit et même inférieur à une ou plusieurs minutes, par exemple 5 min et même ramenée à des valeurs aussi faibles qu'une ou deux secondes, contrastant avec la dizaine de minutes nécessaire dans l'art antérieur.
On comprend également que l'on assure, grâce à l'invention, des conditions de lyse, de précipitation et/ou de neutralisation totalement homogènes dans le temps, sur l'ensemble de la suspension cellulaire que l'on fait couler à travers la canalisation.
La proportion des débits, et donc des volumes mélangés répond de préférence aux définitions suivantes : - suspension bactérienne / agent de lyse (par exemple mélange soude +
SDS) : comprise entre 1/4 et 3/4, et de préférence de l'ordre de 1/2,
- agent alcalin de lyse / agent acide neutralisant, de préférence acétate de potassium : comprise entre 1 et 2 et de préférence de l'ordre de 1 ,3.
De préférence la concentration de la suspension bactérienne est de l'ordre de 170 grammes (en poids humide de bactéries) / litre d'un tampon classique (par exemple Tris EDTA) + glucose.
De préférence, la suspension cellulaire est conservée à basse température et dirigée à cette même température dans la canalisation vers le point de rencontre avec l'agent de lyse, cette température étant de préférence de l'ordre de 4°C. L'agent de lyse peut être maintenu et véhiculé à température ambiante et l'agent précipitant et/ou neutralisant est de préférence maintenu à basse température, telle que 4°C. 9
L'invention a également pour objet un dispositif pour la mise en œuvre de ce procédé, caractérisé en ce qu'il comporte, à partir d'une source de suspension cellulaire, telle qu'un réservoir, une canalisation permettant l'établissement d'un flux de suspension cellulaire, - à partir d'une source d'un agent de lyse telle qu'un réservoir, une deuxième canalisation permettant l'établissement d'un flux de l'agent de lyse, lesdites première et deuxième canalisations aboutissant à un premier point de rencontre dans lequel elles débouchent l'une dans l'autre, - une troisième canalisation de petit diamètre et de longueur déterminée s'étendant à partir dudit premier point de rencontre, et des moyens, tels que des moyens de pompage, pour l'établissement des flux dans lesdites canalisations ; la longueur, le diamètre et le débit dans ladite troisième canalisation étant adaptés de manière à obtenir un mélange sensiblement homogène aboutissant à un lysat sensiblement homogène.
Le dispositif peut, en outre, comporter : à partir d'une source d'agent neutralisant et/ou précipitant, telle qu'un réservoir, une quatrième canalisation aboutissant à un second point de rencontre à l'extrémité de ladite troisième canalisation de façon que les canalisations débouchent l'une dans l'autre, ladite troisième canalisation ayant une longueur déterminée par la distance entre ledit premier point de rencontre et ledit second point de rencontre ; à partir dudit second point de rencontre, une cinquième canalisation de petit diamètre aboutissant à des moyens de récupération et/ou de séparation ; et et des moyens, tels que des moyens de pompage, pour l'établissement des flux dans lesdites quatrième et cinquième canalisations.
De préférence toutes les canalisations ont de petits diamètres tels que définis précédemment.
Les petits diamètres desdites canalisations peuvent être identiques ou différents. Les différences de diamètre entre canalisations peuvent être déterminées par les moyens d'établissement des flux. 10
Les moyens d'établissement des flux peuvent avantageusement être des pompes, de préférence une ou plusieurs pompes péristaltiques permettant d'établir, dans les différentes canalisations, les débits, et donc, compte tenu des diamètres des canalisations, les vitesses désirées. De façon avantageuse on peut utiliser, pour l'établissement de deux ou plusieurs des flux, une même pompe, par exemple, une pompe péristaltique à plusieurs canaux parallèles, de façon à assurer, y compris en cas de variation intempestive de débit de la pompe, une proportionnalité constante entre lesdits flux. Bien entendu, si les quantités à traiter sont particulièrement importantes, l'agencement des canalisations selon l'invention peut être dédoublé, triplé ou multiplié, avec de préférence, des moyens d'établissement de flux, tels qu'une pompe, uniques ou plusieurs pompes solidarisées de façon à maintenir, en toute circonstance, une proportionnalité constante des flux dans chacune des installations.
Le débouché d'une canalisation dans l'autre au niveau d'un point de rencontre peut s'effectuer selon un angle quelconque. Généralement on préfère que l'une des canalisations débouche sensiblement perpendiculairement dans l'autre mais on peut également incliner les axes des débouchés.
De préférence on ne prévoit aucun moyen particulier d'homogénéisation tel que chicane ou obstacle dans la canalisation au niveau des points de rencontre ; ni de moyen de chauffage permettant d'atteindre de fortes températures (supérieures à 60°C). De façon avantageuse, le dispositif selon l'invention peut comporter des moyens d'établissement et de contrôle des températures de façon à maintenir les sources dans les températures requises. Notamment pour la suspension cellulaire, l'installation peut être agencée de façon que la basse température soit maintenue non seulement dans la source mais également dans la première canalisation jusqu'au point où débute la lyse.
Une installation selon l'invention permet, par exemple, de traiter un volume de suspension bactérienne de l'ordre de 1 à 5 litres par heure. 1 1
Le mélange obtenu en aval du premier point de rencontre présente une grande homogénéité pendant toute la durée du traitement, de même que le mélange neutralisé en aval du deuxième point de rencontre, de sorte que les moyens de séparation permettant de séparer, d'une part, les plasmides restant en solution, et, d'autre part, les autres éléments cellulaires précipités ou floculés, travaillent dans des conditions constantes et contribuent à l'excellente reproductibilité de la préparation plasmidique purifiée finale.
Par ailleurs on améliore notablement le rendement final qui peut dépasser 50 mg de plasmide pour 100 g de bactéries. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif et se référant au dessin annexé dans lequel la figure unique représente une vue schématique d'un dispositif de mise en œuvre du procédé selon l'invention.
La suspension bactérienne à lyser est une suspension provenant d'une culture d'une souche de E. coli dans laquelle a été multiplié un plasmide tel que le plasmide pUC18 en tampon Tris EDTA avec une concentration bactérienne de l'ordre de 200 g (poids humide) par litre.
Le mélange soude-SDS est un mélange NaOH 0,2 M / 1 % SDS.
La solution d'acétate de potassium utilisée comme agent neutralisant est à 3 M ; pH 5,5.
Le dispositif représenté sur la figure comprend un premier récipient 1 contenant la suspension bactérienne. A ce récipient sont associés des moyens de maintien à une température de l'ordre de + 4°C (non représentés) et des moyens d'agitation 2 permettant de maintenir l'homogénéité de la suspension. A partir de la source 1 s'étend une canalisation souple en silicone ayant un diamètre interne de 2,06 mm et formant le premier tronçon de canalisation 3.
Le mélange soude-SDS est contenu dans un réservoir 4 à partir duquel s'étend une seconde canalisation, 5 de diamètre interne 3,17 mm et réalisée dans le même matériau souple. A l'emplacement 6 où se trouve le premier point de rencontre la canalisation 3 débouche perpendiculairement dans la canalisation 5 de sorte qu'à cet emplacement se forme un mélange provoquant la lyse rapide des bactéries. A partir du point 6 s'étend un troisième tronçon de 12 canalisation, 7 jusqu'au point 8 formant le second point de rencontre, la longueur de la canalisation 7 étant de 0,8 mètres. Cette canalisation 7 présente un diamètre interne de 7 mm (modulable).
La solution d'acétate de potassium est contenue dans un réservoir 9 à partir duquel s'étend une quatrième canalisation 10 également en matière souple ayant un diamètre interne de 2,79 mm débouchant dans la canalisation 7 au point de rencontre 8, également perpendiculairement à la canalisation 7.
Le récipient 9 est associé également à des moyens de maintien à basse température + 4°C. A partir du second point de rencontre 8 s'étend une cinquième canalisation 11 , formée par la suite de la canalisation 7, cette canalisation 11 aboutissant à un réservoir de récupération 12.
On comprend que les diamètres des trois canalisations 3, 5 et 10 sont dans des rapports tels que les proportions des sections internes des canalisations assurent, pour une même vitesse de circulation des liquides, les proportions de mélange souhaitées.
En conséquence les canalisations souples 3, 5 et 10 peuvent passer à travers une pompe péristaltique unique 13 dont la partie rotative 14 assure l'établissement des flux dans les susdites proportions dans les trois canalisations 3, 5 et 10.
L'établissement des débits dans les proportions souhaitées dans les canalisations 3, 5 et 10 détermine bien entendu la valeur des débits en aval dans les canalisations 7, et 11.
Les débits ainsi obtenus sont respectivement de 160 ml/min dans 7 et 244 ml/min dans 11.
Les bactéries sont soumises à l'action du mélange soude + SDS pendant toute la durée du trajet du liquide dans la canalisation 7, entre les points 6 et 8. Cette durée, dans l'exemple choisi, est de 15 sec.
On obtient finalement, dans le récipient de récupération 12, une préparation lysée comprenant deux phases, à savoir une phase soluble claire contenant les plasmides, sensiblement exempte d'élément cellulaire et une phase supérieure insoluble contenant sensiblement les éléments cellulaires. 13
La séparation de ces deux phases est effectuée ensuite par des techniques classiques de filtration ou de centrifugation et la purification des plasmides peut encore être poursuivie selon les méthodes usuelles.
A titre de vérification on a procédé à une électrophorèse comparative des solutions de plasmide obtenues après lyse alcaline, soit en flux continu (comme décrit dans l'exemple ci-dessus) soit par agitation manuelle pendant 10 min (les quantités de bactéries utilisées dans les deux cas étaient similaires). La révélation du gel d'électrophorèse met en évidence la supériorité du procédé en continu dans la mesure où la teneur en plasmides est accrue et celle des impuretés plus faible.

Claims

14REVENDICATIONS
1. Procédé de lyse cellulaire selon lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de cellules et d'un agent de lyse, et l'on fait immédiatement écouler ce mélange sous flux constant à l'intérieur d'une canalisation, le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation, de manière à obtenir un lysat cellulaire sensiblement homogène à la sortie de ladite canalisation.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la canalisation présente un diamètre réduit facilitant l'homogénéisation très rapide du mélange.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel ledit petit diamètre est de l'ordre de 1 cm ou inférieur.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit petit diamètre est 2 à 8 mm.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le mélange de cellules et d'agent de lyse est réalisé en introduisant, dans la susdite canalisation, un flux d'une suspension de cellules et un flux d'une solution d'agent de lyse.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'agent de lyse est de nature alcaline.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de lyse est un mélange soude/SDS.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel on ajoute un agent neutralisant au lysat cellulaire arrivant à l'extrémité de la canalisation. 15
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'agent neutralisant est de l'acétate de sodium ou de potassium.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'agent de lyse est une solution hypotonique.
11. Procédé d'extraction d'ADN plasmidique à partir de cellules contenant ledit ADN, dans lequel (i) on met en œuvre un procédé de lyse selon l'une des revendications 1 à 7 et 10 afin d'obtenir un lysat cellulaire, et en continu du procédé de lyse, (ii) on traite le lysat cellulaire par un agent précipitant et/ou neutralisant, afin d'obtenir une préparation comportant un surnageant contenant I'ADN plasmidique et une phase précipitée ou floculée contenant la majorité des éléments cellulaires, y compris I'ADN génomique.
12. Procédé d'extraction selon la revendication 1 1 , dans lequel :
(i) on établit un flux de la suspension cellulaire dans une première canalisation ;
(ii) on établit un flux d'un agent de lyse dans une deuxième canalisation qui se jette dans la première canalisation (ou vice-versa) en un premier point de rencontre pour former une troisième canalisation ;
(iii) on établit un flux d'un agent précipitant dans une quatrième canalisation qui se jette dans la troisième canalisation (ou vice- versa) en un deuxième point de rencontre situé en aval du premier point de rencontre, pour former une cinquième canalisation ;
(iv) on établit un flux du mélange cellules / agent de lyse réalisé au premier point de rencontre, dans la troisième canalisation (comprise entre le premier et le deuxième point de rencontre) à un débit adapté en fonction du diamètre et de la longueur de la troisième canalisation, de manière à permettre l'homogénéisation du mélange et l'obtention d'un lysat cellulaire sensiblement homogène au deuxième point de rencontre ; et 16
(v) dans la cinquième canalisation, on établit un flux de la préparation obtenue au second point de rencontre, par mélange du lysat cellulaire avec l'agent précipitant ; et (vi) on récupère à la sortie de la cinquième canalisation une préparation comportant un surnageant contenant I'ADN plasmidique et une phase précipitée ou floculée contenant la majorité des éléments cellulaires, y compris I'ADN génomique.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la longueur de la canalisation entre le premier et second point de rencontre est de l'ordre de 10 cm à quelques mètres.
14. Procédé selon la revendication 11 , 12 ou 13, dans lequel l'agent précipitant et/ou neutralisant est de l'acétate de sodium ou de potassium.
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, dans lequel (vii) on procède en outre à la séparation du surnageant d'avec la phase précipitée ou floculée, en continu de l'étape (vi) de récupération.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel les cellules sont des bactéries.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel les cellules sont des cellules eucaryotes.
18. Dispositif pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte, à partir d'une source de suspension cellulaire, telle qu'un réservoir, une canalisation permettant l'établissement d'un flux de suspension cellulaire, à partir d'une source d'un agent de lyse telle qu'un réservoir, une deuxième canalisation permettant l'établissement d'un flux de l'agent de lyse, lesdites première et deuxième canalisations aboutissant à 17 un premier point de rencontre dans lequel elles débouchent l'une dans l'autre, une troisième canalisation de petit diamètre et de longueur déterminée s'étendant à partir dudit premier point de rencontre, et des moyens pour l'établissement des flux dans lesdites première, deuxième et troisième canalisations ; la longueur, le diamètre et le débit dans ladite troisième canalisation étant adaptés de manière à obtenir un mélange sensiblement homogène aboutissant à un lysat sensiblement homogène.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre : à partir d'une source d'agent précipitant, telle qu'un réservoir, une quatrième canalisation aboutissant à un second point de rencontre à l'extrémité de ladite troisième canalisation de façon que les canalisations débouchent l'une dans l'autre, ladite troisième canalisation ayant une longueur déterminée par la distance entre ledit premier point de rencontre et ledit second point de rencontre, à partir dudit second point de rencontre, une cinquième canalisation de petit diamètre aboutissant à des moyens de récupération et/ou de séparation, et et des moyens pour l'établissement des flux dans lesdites quatrième et cinquième canalisations.
20. Dispositif selon la revendication 18 ou 19, dans lequel les moyens pour l'établissement des flux sont des moyens de pompage.
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