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WO1999037328A1 - Composes destines a la prevention/au traitement du sida - Google Patents

Composes destines a la prevention/au traitement du sida Download PDF

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Publication number
WO1999037328A1
WO1999037328A1 PCT/JP1999/000231 JP9900231W WO9937328A1 WO 1999037328 A1 WO1999037328 A1 WO 1999037328A1 JP 9900231 W JP9900231 W JP 9900231W WO 9937328 A1 WO9937328 A1 WO 9937328A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
fas
fas ligand
aids
apoptosis
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/000231
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norio Nakamura
Kamon Shirakawa
Tomokazu Matsusue
Shigekazu Nagata
Man Sung Co
Maximiliano Vasquez
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Osaka Bioscience Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka Bioscience Institute filed Critical Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Publication of WO1999037328A1 publication Critical patent/WO1999037328A1/ja

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
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    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to a substance Fas antagonist which suppresses apoptosis induced by a Fas-Fas ligand system, and particularly to a prophylactic and therapeutic agent for AIDS comprising an anti-Fas ligand antibody as an active ingredient.
  • Fas is a monoclonal antibody obtained by immunizing mice with human fibroblasts, such as Fas antibody (Yonehara S.), J. Exp. Med. 747-1756, 1989) and is a cell surface antigen that transmits apoptotic signals to cells.
  • Human Fas ligand is a polypeptide reported by Nagata et al. As a biomolecule that induces apoptosis in cells that express Fas (Tomo niro Takanashi et al. mmu nology, Volume 6, pp. 157-757, pp. 157, 1991). Human Fas ligand is a type II membrane protein with a molecular weight of about 40 kD belonging to the TNF family, and is thought to form a trimer in vivo, similar to TNF (Masato Tanaka et al.). , EMBO Journal, Vol. 14, Vol. 11, pp. 119-195, pp. 1995).
  • Human Fas ligand is rat Fas ligand (Takashi Suda et al., Ce 11, 75, 1169—11178, 1993) and mouse Fas ligand (Tomo hiro Takaha shi et al., Cell, 76 Vol., 969-976, 1994) and has a high homology in the extracellular region, and human Fas ligand recognizes not only human Fas but also mouse Fas and induces apoptosis. I can do it. Conversely, rat and mouse Fas ligands can also recognize human Fas and induce apoptosis.
  • AIDS Acquired immunodeficiency syndrome
  • HCV human immunodeficiency virus
  • AIDS is a term for HIV infection because it is the last symptom of HIV infection, followed by a period of asymptomatic symptoms, followed by a series of immunodeficiency symptoms.
  • reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors are used to suppress the growth of the virus, but vomiting, nausea, loose stool, diarrhea, liver damage, liver disorders, bone marrow suppression, especially Side effects such as anemia and leukopenia are frequent, and their side effects may be severe. Viruses resistant to these drugs May appear during treatment, making it difficult to treat HIV infection.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-237953 discloses an anti-Fas antibody (agonist anti-Fas antibody) that binds to cell surface Fas and induces apoptosis. It reports that it suppresses the growth of infected cell lines, and has proposed a therapeutic agent for AIDS containing an agonist anti-Fas antibody.
  • W0971, 263, and 32 should promote apoptosis by using Fas ligand or agonist anti-Fas antibody to treat HIV and simple herpes virus 2 virus infections. Is stated.
  • Apoptosis of HIV-infected cells by agonist anti-Fas antibody Induction of HIV simultaneously induces apoptosis of Fas-positive CD4-positive T lymphocytes that are not HIV-infected, and may further reduce the number of CD4-positive T-lymphocytes in HIV-infected individuals and exacerbate the condition.
  • W09531329 EP67520
  • W9632930 are used for the treatment of AIDS, hepatitis, rheumatism, etc. by suppressing apoptosis by anti-Fas ligand antibody. is suggesting.
  • W097202900 PCT / JP96Z01820
  • autoimmune diseases rheumatism, SLE, Diabetes, viral infections (influenza, AIDS), hepatitis, rejection of organ transplantation, graft host disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, etc. It proposes to suppress apoptosis by the system.
  • Fas-Fas ligand system in HIV infection should be enhanced as a mechanism for eliminating HIV-infected cells, or whether it should be suppressed because it is a mechanism of T lymphocyte cell death.
  • No specific reports have been reported on the efficacy of anti-Fas ligand antibodies against HIV infection.
  • Yasushi Okumura et al. FY1996 AIDS Drug Development Promotion International Research Grant Program Research Report, 113-122 (19997)
  • Mechanisms other than as-Fas ligands have also been suggested.
  • JP-A Japanese Patent Application Laid-Open
  • Hei 8—5 1 1 6 9 2 WO 952 7 7 3 5
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-500 3 6 7 2 WO 9 5 1 0 5 4 0
  • Interleukin-2 is known to have the effect of proliferating peripheral blood lymphocytes of HIV-infected individuals in the mouth.
  • Ko V acs, J. A., et al. show that HIV Attempts to administer monoleukin-2, with some showing an increase in CD4-positive T cells Most patients have enhanced viral activation, no immunological improvement, and no side effects. In vivo results were not as expected from the results obtained in. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a preventive / therapeutic agent for HIV infection and a method for preventing / treating the same by preventing a decrease in the number of lymphocytes by suppressing apoptosis mediated by the Fas antigen. More specifically, the present invention seeks to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for AIDS containing an anti-Fas ligand antibody as an active ingredient.
  • the present inventors have intensively studied the role of Fas antigen and Fas antigen-mediated apoptosis in HIV infection.
  • the present inventors have found that they are suppressed by an antagonist, particularly by an anti-Fas ligand antibody, and completed the present invention. That is, the present invention provides a prophylactic and / or therapeutic agent for AIDS comprising a Fas antagonist as an active ingredient.
  • the Fa antagonist suppresses apoptosis of lymphocyte cells in HIV infection
  • the Fa antagonist is any one of a Fas derivative, an anti-Fas antibody, or an anti-Fas ligand antibody
  • the Fas antagonist is an anti-Fas ligand antibody
  • the anti-Fas ligand antibody is a humanized anti-Fas ligand antibody.
  • the present invention relates to a novel use of an anti-Fas ligand antibody as a preventive and / or therapeutic agent for HIV infection, particularly an AIDS preventive and / or Z or therapeutic agent, a method for preventing these diseases using the same, and a method for preventing such diseases. Or provide a method of treatment.
  • the present invention relates to a prophylactic agent Z and / or a therapeutic agent for a disease in which T lymphocytes, more specifically CD4-positive T lymphocytes, is reduced, and particularly for the prevention of diseases in which CD4-positive T lymphocytes are reduced and immunocompromised
  • the present invention provides a novel use of an anti-Fas ligand antibody as an agent and / or a therapeutic agent, that is, the use of an anti-Fas ligand antibody for a prophylactic / therapeutic agent for AIDS and for the production of a prophylactic / therapeutic agent for AIDS.
  • the Fas antagonist is a substance having an inhibitory or inhibitory action, and more specifically, it inhibits the biological action of the Fas / Fas ligand system, in particular, apoptosis of cells via the Fas antigen. It is a substance that suppresses or inhibits.
  • the Fas antagonists described herein block in some way the generation or transmission of signals by the Fas antigen, and the biological action of the Fas ZFas ligand system, particularly In particular, as long as it inhibits apoptosis via the Fas antigen, particularly apoptosis via the Fas antigen by the Fas ligand, it is not particularly limited, and those which inhibit the action or function of the Fas ligand or the Fas antigen, Interacts with the Fs ligand cell domain or Fs antigen extracellular domain, inhibits the interaction of the Fs ligand with the Fs antigen, between the Fs antigen intracellular domain and the intracellular factor that interacts with it Or cytoplasmic factors involved in the signaling of apoptosis via the Fas antigen (eg, ICE (.I nter 1 e uk in— 1 Conv erti ngEnzyme) And those having various mechanisms of action, such as those that inhibit the activity of i).
  • Fas antigen
  • Fas antagonists described in the present specification include Fas antigen derivatives, anti-Fas ligand antibodies, and antagonist anti-Fas, which have an action of suppressing apoptosis mediated by the Fas antigen.
  • Fas antigen derivatives include an antibody, an antisense oligonucleotide to the gene of the Fas antigen or Fas ligand or mRNA, a substance interacting with the intracellular region of the Fas antigen, or an ICE inhibitor.
  • the Fas antigen and the Fas ligand are preferably of human origin.
  • the Fas antagonist described in the present specification can express the Fas antigen in a suitable Atsei method described in International Patent Application Publication No. WO 9513293 (EP 67520) or the like. Those that suppress cell apoptosis are preferred.
  • the antibodies isolated and purified other than those naturally occurring used in the present invention may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the molecular species of the antibodies used in the present invention is not particularly limited. What, It may be a normal form of the antibody molecule, or a fragment of the antibody, for example, Fab, F (ab ') 2, Fv, as long as it binds to the antigen and inhibits apoptosis via the Fas antigen.
  • a single chain FV (sc Fv) in which the Fvs of the H chain and the L chain are linked by a suitable linker to form a single chain can also be used.
  • immunoglobulins classified into any class, subclass and isotype may be used.
  • These antibodies are not particularly limited as long as they have a function of inhibiting the biological action of the FassZFass ligand system, particularly the function of inhibiting apoptosis via the Fass antigen, by binding to the Fass ligand or the Fass antigen.
  • the Fas antagonist is preferably a Fas antigen derivative, an antagonist anti-Fas antibody, or an anti-Fas ligand antibody, which has an action of suppressing apoptosis via the Fas antigen.
  • an anti-Fass ligand antibody is particularly preferred.
  • the anti-Fas ligand antibody used in the present invention may be of any origin, type (monoclonal or polyclonal) and production method, but is preferably a mammalian-derived monoclonal antibody.
  • the animal species of the cells producing the monoclonal antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal, and may be derived from a human or a non-human mammal.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal other than human a monoclonal antibody derived from a heron or rodent is preferable. Rodents are particularly restricted However, mouse, rat, hamster and the like are preferably exemplified.
  • the monoclonal antibody recognizes an antigen by a common immunological means such as a radioimmunoassay (RIA :), an enzyme immunoassay (EIA, ELISA), and a fluorescent antibody method (Immunofluorescence Analysis).
  • a radioimmunoassay RIA :
  • an enzyme immunoassay EIA, ELISA
  • a fluorescent antibody method Immunofluorescence Analysis
  • the inhibitory activity on the apoptosis of cells expressing the Fas antigen is measured by an appropriate Atsey method described in International Patent Application Publication No.W095 13293 (EP 675200), W09702290, etc. Is mentioned.
  • one 3 measuring method shall be the free indicators 51 C r according to the (51 C rreleaseassay), preferably apoptosis suppression rate of 50% or more, more preferably 90% The anti-Fas ligand antibody. ,is there.
  • Radioactivity of target group-Radioactivity of antibody-added group Apoptosis suppression rate (%) X100 Radioactivity of control group More specifically, 1 ⁇ 8 111 and more than 50% at 0.3 ⁇ g / m1 It is an anti-Fas ligand antibody showing an apoptosis-suppressing rate.
  • Tsukuba, Ibaraki Japan, 1-chome, Higashi 1-Chome Ichiban No.
  • mice F919-9-9-1 produced by the hybridoma F919-9-18 which was transferred from the original deposit to the international deposit on May 9, 1996 (Accession No. FERM BP-5535) Eight antibodies are a particularly preferred example. Antibodies that inhibit the binding of the Fas ligand to the mouse F919-9-18 antibody, particularly the same epitope that the mouse F919-9-1-8 antibody recognizes Antibodies that recognize a ligand are also examples of suitable anti-Fas ligand antibodies.
  • the anti-Fas ligand used in the present invention is more preferably a chimeric antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans.
  • a chimeric antibody comprising a variable region of a monoclonal antibody of a mammal other than a human, such as a mouse, and a constant region of a human antibody can be used. It can be produced using a production method, in particular, a genetic recombination technique.
  • reshaped (reshaped) human antibodies can be used in the present invention. This is the result of replacing the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, with the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the reshaped human antibody (humanized antibody) useful in the present invention include a mouse antibody F919-9-18 antibody CD disclosed in WO9720290.
  • An example of the antibody is a human antibody F910 antibody having R. Hu F 9 19 G 1.V 1, Hu F 9 19 G 1.v 2, Hu F 9 19 G 4.1 described in WO 97/0 2290 1 9 G 4.
  • v 2 is a specific example.
  • amino acids in the framework (FR) region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • the anti-Fas ligand antibody used in the present invention can be obtained, for example, by the method described in WO9513293 (EP 675200), WO9702290, and the like. Can be manufactured.
  • a monoclonal antibody When a monoclonal antibody is used in the present invention, it is prepared using a known technique. For example, a Fas antigen or a Fas ligand or a partial peptide thereof is used as a sensitizing antigen, and immunized according to a usual immunization method. It can be prepared by fusing with a known parent cell by a fusion method and screening monoclonal antibody-producing cells by a usual screening method.
  • the sensitizing antigen is a human Fas ligand
  • the gene sequence of the human Fas ligand the gene sequence is inserted into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, and then the target cell is extracted from the host cell or the culture supernatant.
  • the Fas ligand protein is purified, and the purified Fas ligand protein is used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is preferably selected from mice, rats, hamsters, and the like. ⁇ Egrets can be used.
  • Suitable methods can be used to immunize animals with the sensitizing antigen. After immunization in this manner and confirming that the level of the desired antibody in the serum increases, immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion. Preferred immune cells include splenocytes, in particular. No.
  • the other parent cell fused with the immune cell is not particularly limited, but may be any of various known myeloma cell lines such as mammals, particularly mice, for example, X63.653 (P3X63Ag8). . 6 53) (J. Immno l. 1 2 3: 1 5 48, l 2 197 8) and the like are preferably used.
  • Cell fusion between the immune cells and myeoma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Mi1stein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1). 9 8 1) etc. can be performed.
  • the hybridoma is cultured according to a conventional method, and the hybridoma is obtained from the culture supernatant.
  • a method of transplanting the hybridoma into a mammal that is compatible with the hybridoma and proliferating the hybridoma and obtaining the hybridoma from ascites may be employed.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the monoclonal antibody used in the present invention obtained by the above method may be purified to a high purity by using a known purification method such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • a known purification method such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to a method using a hybridoma, but can also be prepared using a method using antibody-producing cells immortalized by EBV or the like, or a method using genetic engineering.
  • the therapeutic agent for AIDS prophylaxis is characterized in that it contains a Fas angianist, particularly preferably contains an anti-Fas antibody, and comprises at least one pharmaceutical carrier or a medium such as sterilized water or the like.
  • compositions such as injections and oral preparations in the form of injections and oral preparations by appropriately combining with an inhibitor, a stabilizer, a preservative, a humectant, an antioxidant, a buffer, a tonicity agent, a soothing agent and the like. Can be taken.
  • the agent for preventing or treating AIDS of the present invention is preferably administered parenterally, for example, systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc., and rapidly or continuously. be able to.
  • the dose of the agent for preventing and treating AIDS of the present invention to humans varies depending on the condition, age and administration method of the patient, but it is necessary to select an appropriate amount as appropriate. For example, an appropriate fractionation volume can be selected in the range of approximately 1-100 OmgZ patients.
  • the use of the agent for preventing and treating AIDS of the present invention is not limited to these administration methods and dosages. Further, a plurality of Fas antagonists may be used in combination, or may be used in combination with other drugs.
  • the agent for preventing or treating AIDS of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • injectable preparations are obtained by dissolving a purified anti-Fas ligand antibody in a solvent, for example, a saline solution, a buffer, or the like, and adding an anti-adsorption agent as necessary.
  • a solvent for example, a saline solution, a buffer, or the like
  • it may be lyophilized for reconstitution before use, and a common excipient for lyophilization can be used.
  • the agent for preventing and treating AIDS of the present invention when administered to a patient with HIV infection, suppresses the reduction of lymphocytes, particularly the reduction of lymphocytes with enhanced expression of Fas, and reduces the immune function of HIV infection. Has the effect of suppressing the progress of
  • the target of the AIDS prevention and treatment agent of the present invention is that HIV antibodies are positive.
  • the number of CD4 cells is mildly reduced, which is different from that of healthy individuals.
  • An asymptomatic carrier (AC) that maintains a healthy state.
  • AIDS-related syndrome (ARC) which indicates insufficiency, and prevention, suppression, and treatment of various AIDS-related diseases such as severe immunodeficiency associated with malignant tumors such as opportunistic infections and cystic sarcomas.
  • mice Male, 8-week-old, DBA / 1J mice and C3HZHe mice (Nippon Charl Sliver) were used.
  • the anti-mouse Fas ligand antibody described in PCT / JP97 / 03978 was administered via the tail vein at a dose of 10 Omg / 3 OmlZkg.
  • the control group received saline (Otsuka Pharmaceutical) at a dose of 30 ml / kg via the tail vein.
  • N 3 in each group for both strains.
  • the observation period was set to 7 days, and body weight measurement, hematology (red blood cells, white blood cells, platelets), blood biochemical tests (GOT, GPT, urea nitrogen), and visual necropsy were performed.
  • SH IV a chimeric virus of simian immunodeficiency virus (S IV) and human immunodeficiency virus (HIV) —89.6 p strain (purchased from the United States Virus Research Institute, J. Viroloy, 7 Vol. 0, p. 6922-6928 (1996)) diluted the stock solution 1000-fold and inoculated 1 mL intravenously.
  • Humanized F919 antibody was treated with citrate buffer (2 OmM citrate, 120 mM sodium chloride, 0.01% Tween 80, pH 6.0). The rhesus monkeys were divided into two groups of 5 animals by body weight, which were used as a control group and a humanized F919 antibody administration group, respectively. The humanized F919 antibody was intravenously administered at a dose of 10 mg / kg simultaneously with the inoculation of the SHIV-88.9p strain (Day 1). In the control group, the same amount of the vehicle alone was intravenously administered. The administration was performed every week. (3) Blood collection and FACS analysis
  • the animals were anesthetized with an intramuscular injection of ketamine hydrochloride at 1 Omg / kg, and venous blood was collected in the presence of EDTA. Blood collection was performed before inoculation of the SHIV-89.6p strain and immediately before drug administration of Day 8 and Day 15.
  • 100 / L of OKT4a antibody (Ortho, Inc.), which specifically recognizes CD4 + T cells, was added to 100 L of EDTA-supplemented blood, and left in place for 10 minutes, followed by lysis for FACS. 2 mL of the solution (Becton 'Dickinson) was added and left at room temperature for another 10 minutes.
  • the cells were washed with a minimum essential medium containing 5% of fetal calf serum and fixed in 0.5% formaldehyde. Specimens were analyzed by FACS canT (Becton Dickinson), and the ratio of CD4-positive T cells to the total lymphocyte count in peripheral blood () was calculated as 7 o.
  • the average values of the percentage of CD4-positive T cells in the control group and the humanized F919 antibody-administered group were 29.7% and 28.7%, respectively, in the pre-inoculation value, but in the control group, After 8 days, it showed a decreasing trend of 26.5%, and after 15 days, it showed a sharp decrease of 6.9%, whereas in the group to which the humanized antibody F919 antibody was administered, it decreased by 26.5%. 9.2% and 14.1% after 15 days showed a clear suppression effect on the ratio of CD4-positive T cells compared to the control group. No remarkable toxicity was observed due to administration of the humanized F919 antibody.
  • Ratio of CD4-positive T cells 8 days before inoculation 15 days after inoculation Treatment group 28.7% 29.1% 14.1% Control group 29.7% 26.5% 6.9% or more Indicates that the agent for preventing and treating AIDS of the present invention has an excellent effect. Further, the agent for preventing or treating AIDS of the present invention does not show significant toxicity. Therefore, the agent for preventing and treating AIDS containing the anti-Fas ligand antibody of the present invention as an active ingredient blocks the generation or transmission of a signal by the Fas antigen, and inhibits the biological action of the Fas-Fas ligand system. As long as lymphocyte cell death due to apoptosis mediated by as antigen is suppressed, it is effective in treating HIV infection involving this. Industrial applicability
  • the prophylactic / therapeutic agent for AIDS comprising the anti-Fas ligand antibody of the present invention as an active ingredient suppresses the biological action of the Fas-Fas ligand system, particularly the death of lymphocyte cells due to apoptosis mediated by the Fs antigen. And has a therapeutic effect on HIV infection. Therefore, the prophylactic and therapeutic agent for AIDS containing the anti-Fas ligand antibody of the present invention as an active ingredient is one of the prophylactic and therapeutic agents for AIDS in HIV infection in which apoptosis reduces lymphocyte count.

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Description

明 細 書 エイズ予防 ·治療剤 技術分野
本発明は F a s -F a sリガンド系により誘導されるアポトーシスを抑制する 物質 F a sアンタゴニスト、 特に抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ 予防，治療剤に関する。 背景技術
F a sは、 ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体で ある F a s抗体 （ヨネハラ S. (Yon e h a r a S. ) 等、 J. Exp. Me d. . 1 6 9卷、 1 747— 1 756頁、 1 989年） によって認識され、 アポトーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。
ヒ ト F a s リガン ドは、 F a sを発現する細胞に対してアポ ト一シスを 誘導する生体内分子として、 長田等により報告されたポリべプチドである (Tomo n i r o Ta k a n a s h i等、 I n t e r n a t i o n a l I mmu n o l o g y、 6巻、 1 5 6 7— 1 5 7 4頁、 1 9 9 4年） 。 ヒ ト F a s リガンドは、 TNFフアミ リ一に属する分子量約 4 0 k Dの I I型 膜蛋白質で、 TNFと同様に、 生体内で 3量体を形成すると考えられてい る （Ma s a t o T a n a k a等、 EMBO J o u r n a l , 1 4巻、 1 1 2 9— 1 1 3 5頁、 1 9 9 5年） 。 また、 ヒ ト F a s リガンドはラッ ト F a sリガンド （T a k a s h i S u d a等、 C e 1 1、 75巻、 1 169— 1 1 7 8頁、 1 9 9 3年） やマウス F a s リガン ド （Tomo h i r o Takaha s h i等、 Ce l l、 76卷、 969— 976頁、 1994年） と 細胞外領域において高いホモロジ一を有しており、 ヒ ト F a sリガンドはヒ ト F a sのみでなくマウス F a sをも認識し、 アポトーシスを誘導することがで きる。 逆に、 ラッ ト F a sリガンド及びマウス F a sリガンドも、 ヒト F a sを 認識してアポトーシスを誘導することができる。
また、 F a sを介するアポトーシスの細胞内シグナル伝達の機序に関し ても研究が進んでおり、 F a sの細胞内領域、 特にデスドメイン （De a t h doma i n) と呼ばれる領域と相互作用して、 シグナルを伝達または抑制する 因子の同定及びクローニングが報告されている他、 インタ一ロイキン— 1変換酵 素 （I CE) 関連チオールプロテアーゼが F a sを介するアポトーシスのシグナ ル伝達に寄与している可能性が示唆されている。
後天性免疫不全症候群 （エイズ） はヒ ト免疫不全ウィルス （H I V) が CD 4 陽性 Tリンパ球を標的とし感染し、 これを破壊して高度の免疫不全を引き起こし た状態である。 エイズは H I V感染の末期症状であること、 その前に無症状の時 期、 次いで一連の免疫不全症状を経過することから、 これらを総称して、 HIV 感染症と呼ばれている。
従来、 エイズ発症にいたる CD 4陽性 Tリンパ球の破壊は H I Vの感染増殖に よる直接的な細胞破壊であると予想されていたが、 近年アポトーシスと CD 4陽 性 Tリンパ球の減少とに関係があることが示唆され始めている。 小林信之 （実験 医学、 Vo l.. 13、 No. 16、 1981— 1988 (1995) ) は HIV 感染者の末梢血リンパ球の F a s発現率は健常人のそれより上昇しており、 F a sの刺激を介してより短時間のうちにアポト一シスが誘導されることを報告 している。 また、 岡本実佳ら （医学検査、 Vo 1. 45、 No. 12、 1693 - 1 6 9 8 ( 1 9 9 6 ) ) は H I V感染による T細胞の減少について非感 染 CD 4陽性 Τ細胞が活性化され F a sを発現しこれに H I V感染単球 'マクロ ファージの F a sリガンドが作用することによりアポトーシスが誘導される メカニズムを提案している。 し力、し、 中西義信 （実験医学、 Vo l. 1 5、 No. 1 9 (増刊） 、 2449— 2453 (1997) ) は、 HI Vの感染した ヒ ト末梢血 Tリンパ球がマクロファージの非存在下でもアポト一シスを起こすと 報告している。
さらに、 Es t aqu i e r, J. 等 （B l ood, Vo l. 87， No. 1 2， 4959— 4966 (1996) ) は、 HI V感染者の末梢血リンパ球から 分離された CD 4陽性 T細胞あるいは CD 8陽性 T細胞に可溶性 F a sリガンド を作用させて誘導したアポト一シスをアンタゴニス卜抗 F a s抗体あるいは F a s— F c融合蛋白質で抑制できることを示しており、 Yan g, Y. 等 (B l o o d, Vo l. 89， No. 2, 5 50 - 557 ( 1 9 97 ) ) ら は H I V感染者の末梢血リンパ球のインビト口における自発的な細胞死を F a s 一 F c融合蛋白質で抑制できることを報告している。
H IV感染症の治療は、 ウィルスの増殖をおさえる、 逆転写酵素阻害剤やプロ テアーゼ阻害剤が用いられているが、 嘔吐、 吐き気、 軟便、 下痢、 肝障害、 脬障 害、 骨髄抑制、 特に貧血、 白血球減少等の副作用の頻度が高く、 また、 その副作 用も重篤である場合がある。 また、 これらの薬剤に対する耐性を有するウィルス が治療中に出現することもあり、 H I V感染症の治療を困難にしている。
これらの逆転写酵素阻害剤やプロテア一ゼ阻害剤が H I V感染者の Tリンパ球 細胞の減少の機構である F a s _ F a sリガンド系のアポト一シスを抑制する作 用についての示唆はされていない。
さらに、 H I V感染症の治療には特表平 3— 5 0 4 5 5 6号 （WO 8 8 0 9 1 8 1 ) 、 特開平 6— 2 1 7 7 9 1号 （WO 9 3 1 9 7 8 5 ) および特表平 9— 5 0 5 4 6 6号 （W0 9 5 1 1 3 1 7 ) 等に H I Vを中和する抗体が提案されてい る。 ウイルス中和抗体は感染細胞から放出されたウイルスに結合しウイルスの感 染カを中和すると期待されており、 H I Vからの感染防御には有効であるこ と力く、 特開平 6— 2 1 7 7 9 1号 （WO 9 3 1 9 7 8 5 ) のチンパンジーへの感 染実験において示されている。 しかし、 H I Vに対する中和抗体では感染 Tリ ン パ球の除去には向かないと考えられ、 また、 ウィルスの表面抗原が変異し抗体と の結合性が低下することも知られている。 そして、 H I Vを中和する抗体につい ても、 H I V感染者の Tリンパ球の減少の機構の一つである F a s— F a s リガ ンド系のアポトーシスを抑制する作用についての示唆はされていない。.
また、 特開平 2 - 2 3 7 9 3 5号には、 細胞表面の F a sと結合してアポト一 シスを誘導する抗 F a s抗体 （ァゴニスト抗 F a s抗体） 力く、 インビトロの実験 において H I V感染細胞株の増殖を抑制することを報告し、 ァゴニスト抗 F a s 抗体を含有するエイズ治療剤を提案している。 さらに、 W0 9 7 1 2 6 3 2には H I V、 単純へルぺスウィルス 2型のウィルス感染症の治療に F a s リガンドぁ るいはァゴニスト抗 F a s抗体を使用しアポト一シスを促進することが述べられ ている。 しカヽし、 ァゴニスト抗 F a s抗体による H I V感染細胞へのアポトーシ ス誘導は、 同時に H I V非感染の F a s陽性 C D 4陽性 Tリンパ球のアポトーシ スを誘導し、 H I V感染者の C D 4陽性 Tリンパ球数を一層低下させ病態を悪化 させる可能性がある。
一方、 W0 9 5 1 3 2 9 3 ( E P 6 7 5 2 0 0 ) および W〇 9 6 2 9 3 5 0は、 抗 F a s リガンド抗体によるアポトーシス抑制によりエイズ、 肝炎、 リウ マチ等の治療について提案している。 また、 本出願の親出願である W0 9 7 0 2 2 9 0 ( P C T/J P 9 6 Z 0 1 8 2 0 ) は、 アポトーシス亢進が予想される疾 患である自己免疫疾患 （リウマチ、 S L E、 糖尿病） 、 ウィルス感染症 （インフ ルェンザ、 エイズ） 、 肝炎、 臓器移植の拒絶、 移植片宿主病、 潰瘍性大腸炎、 ク ローン病等において、 抗 F a sリガンド抗体を用いて F a s— F a sリガンド系 によるアポトーシスを抑制することを提案している。
しかし、 H I V感染症における F a s— F a s リガンド系の役割は H I V感染 細胞の除去の機構として働き亢進することが望ましいのか Tリンパ球細胞死の機 構であり抑制されるのが望ましいのか明確にされておらず、 H I V感染症に対す る抗 F a sリガンド抗体の有効性について具体的な報告はない。 さらに、 奥村康 ら （平成 8年度 エイズ医薬品等開発推進事業 国際研究グラント事業 研究報 告書、 1 1 3— 1 2 2 ( 1 9 9 7 ) ) は H I V感染者由来 C D 4陽性 Tリンパ球 あるいは C D 8陽性 Tリンパ球を抗 C D 3抗体で刺激することにより誘導される アポトーシスを、 抗 F a sリガンド抗体によって抑制することはできないと報告 しており、 H I V感染患者の Tリンパ球のアポトーシスは F a s— F a s リガン ド系以外の機構も示唆されている。
また、 抗 F a s リガンド抗体以外に F a s - F a sリガンド系によるアポトー シスを抑制する物質として、 特表平 8— 5 1 1 6 9 2 (WO 9 5 2 7 7 3 5 ) 、 特表平 9 - 5 0 3 6 7 2 (WO 9 5 1 0 5 4 0 ) に活性の欠如した F a sリガン ドアナログ、 アンタゴニスト抗 F a s抗体が述べられている。 しかし、 これらに も H I V感染症について具体的に記載はない。
エイズ予防 ·治療剤の効果の判定はィンビト口の実験だけでは行うことができ ない。 例えばィンタ一ロイキン— 2は H I V感染者の末梢血リンパ球をインビト 口で増殖させる効果があることが知られている。 K o V a c s， J . A. 等 (N E n g l J M e d , V o l . 3 3 2 , N o . 9， 5 6 7 - 5 7 5 ( 1 9 9 5 ) ) は H I V感染者にィン夕一ロイキン— 2の投与を試み、 一部 に C D 4陽性 T細胞の増加が認められた力 大半の患者にはウイルスの活性化が 増強されかつ免疫学的な改善はなく副作用もみられ、 インビト口での結果から予 想される成績をインビボで得ることはできなかった。 発明の開示
本発明の目的は、 F a s抗原を介するアポトーシスを抑制することによりリン パ球数の減少を防止することによる H I V感染症予防 ·治療剤および予防 ·治療 方法を提供することである。 より詳しくは、 本発明は抗 F a sリガンド抗体を有 効成分とするエイズ予防 ·治療剤を提供しょうとする。
本発明者らは、 F a s抗原及び F a s抗原を介するアポト一シスの H I V感染 症における役割を鋭意研究してきたが、 H I V感染におけるリンパ球細胞数の減 少がアポト一シスを阻害する F a sアンタゴニストにより、 特に抗 F a s リガン ド抗体により抑制されることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は F a sアンタゴニストを有効成分とするエイズ予防 '治療 剤を提供する。 ここで、 該 F a sアンタゴニストが H I V感染症においてリンパ 球細胞のアポトーシスを抑制し、 該 F a sアンタゴニス卜が F a s誘導体、 抗 F a s抗体、 又は抗 F a s リガンド抗体のいずれか一つであり、 好ましくは該 F a sアンタゴニストが抗 F a sリガンド抗体であり、 特に該抗 F a sリガンド 抗体がヒ ト化抗 F a sリガンド抗体であることが好ましい。 また、 該 H I V感染 症の進行過程においてリンパ球数の減少する状態の予防および治療に本発明のェ ィズ予防 ·治療剤を用いることが好ましい。 本発明は、 H I V感染症の予防剤お よび Zまたは治療剤、 特にエイズ予防剤および Zまたは治療剤としての抗 F a s リガンド抗体の新規な用途およびこれを用いたこれらの疾患の予防方法および z または治療方法を提供する。
また、 本発明は Tリンパ球、 より詳しくは C D 4陽性 Tリンパ球が減少する疾 患に対する予防剤 Zおよびまたは治療剤、 特に C D 4陽性 Tリンパ球が減少し免 疫不全となる疾患に対する予防剤および/または治療剤としての抗 F a s リガン ド抗体の新規な用途、 すなわち抗 F a s リガンド抗体のエイズ予防 ·治療剤への 使用およびエイズ予防 ·治療剤の製造への使用を提供する。
なお、 本発明において F a sアンタゴニストとは、 抑制または阻害作用を有す る物質であり、 より詳しくは、 F a s / F a s リガンド系の生物作用、 特 に、 F a s抗原を介する細胞のアポトーシスを抑制または阻害する物質であ る。
本明細書記載の F a sアンタゴニストは、 F a s抗原によるシグナルの発生又 は伝達を何らかの形で遮断し、 F a s Z F a s リガンド系の生物作用、 特 に、 F a s抗原を介するアポトーシス、 特に F a sリガンドによる F a s抗原を 介するアポトーシスを阻害するものであれば、 とくに限定されず、 F a sリガン ドもしくは F a s抗原の作用もしくは機能を阻害するもの、 F a sリガンド細胞 領域もしくは F a s抗原細胞外領域と相互作用するもの、 F a sリガンドと F a s抗原の相互作用を阻害するもの、 F a s抗原細胞内領域とそれと相互 作用する細胞内因子との間の相互作用に影響するもの、 または F a s抗原を 介するアポトーシスのシグナル伝達に関与する細胞質内因子 （例えば I CE (.I n t e r 1 e uk i n— 1 Co nv e r t i ngEn z yme) 様プ口テ ァ一ゼ） の活性を抑制するもの等の様々な作用機序を有するものが含まれる。 ま た、 タンパク質性の高分子物質および低分子の化合物のいずれもが含まれる。 具 体的には、 本明細書記載の F a sアン夕ゴニストとしては、 F a s抗原を介する アポト一シスを抑制する作用を有する、 F a s抗原誘導体、 抗 F a sリガンド抗 体、 アンタゴニスト抗 F a s抗体、 F a s抗原もしくは F a sリガンドの遺伝子 もしくは mRN Aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 F a s抗原の細胞 内領域と相互作用する物質、 または I CE阻害剤等が挙げられる。 ここで、 F a s抗原及び F a sリガンドは好ましくはヒト由来のものである。 また、 本発 明明細書記載の F a sアンタゴニストは、 国際特許出願公開番号 WO 95 1 3 2 9 3 (E P 6 7 5 2 0 0 ) などに記載されている適当なアツセィ法において F a s抗原発現細胞のアポトーシスを抑制するものが好ましい。
なお、 米国出願 08ノ 6 4 9 1 0 0および本明細書において引用する国際特許 出願公開番号 WO 95 1 3293、 WO 9702290、 WO 9 0 078 6 1及 び W〇92 1 1 0 1 8をここに引用し、 これらの記載をもって本明細書の一部と 成す。
本発明で用いられる天然に存在するもの以外の単離精製された抗体はポリ クローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、 また、 本発明に 使用される抗体の分子種は特に限定されな 、。 通常の形態の抗体分子であつても よいし、 さらには抗原に結合し、 F a s抗原を介するアポト一シスを阻害するか ぎり抗体の断片、 たとえば、 F ab、 F (a b' ) 2、 Fv、 又は H鎖と L鎖の F vを一本鎖となるよう適当なリンカーで連結させたシングルチヱイン F V (s c Fv) も使用することができる。 また、 いずれのクラス、 サブクラス及び ィソタイプに分類される免疫グロプリンであってもよい。 これら抗体は F a sリ ガンド又は F a s抗原と結合することにより、 F a sZF a sリガンド系の生物 作用、 特に、 F a s抗原を介するアポトーシスを阻害する機能を有するものであ れば特に限定されない。
F a sアンタゴニストとしては、 F a s抗原を介するアポトーシスを抑制する 作用を有する、 Fa s抗原誘導体、 アンタゴニスト抗 F a s抗体、 又は抗 F a s リガンド抗体が好ましい。 本発明では、 とくに抗 F a s リガンド抗体が好ま しい。
本発明で使用される抗 F a s リガンド抗体はその由来、 種類 （モノクロー ナル、 ポリクローナル） 及び製法を問わないが、 哺乳動物由来のモノクローナル 抗体が好ましい。 本発明に用いるモノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳 類であれば特に制限されず、 ヒト由来またはヒト以外の哺乳動物由来であってよ い。 ヒ ト以外の哺乳動物由来のモノ クローナル抗体としては、 ゥサギあるい はげつ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。 げっ歯類としては、 特に制限 されないが、 マウス、 ラット及びハムスターなどが好ましく例示される。 これら の動物を用いるとモノ クローナル抗体作製が簡便だからである。 また、 該 モノクローナル抗体としては、 放射免疫測定法 （R I A：) 、 酵素免疫測定法 (E I A, E L I S A) 、 蛍光抗体法 （ I mmu n o f l u o r e s c e n c e An a l y s i s) 等の通常の免疫学的手段により抗原を認識し、 また、 国際特 許出願公開番号 W095 1 3 293 (E P 6 7520 0 ) , W09702290 などに記載されている適当なアツセィ法により F a s抗原を発現する細胞のアポ トーシスに対する抑制活性が測定されるものが挙げられる。 例えば、 W09 7 0229 0の実施例 1一 3に記載の51 C rの遊離を指標とす る測定方法 （51C r r e l e a s e a s s a y) で、 好ましくはアポトーシ ス抑制率が 50 %以上、 より好ましくは 90 %以上である抗 F a sリガンド抗体 。、ある。 対象群の放射活性一抗体添加群の放射活性 アポトーシス抑制率（％)= X100 対照群の放射活性 より具体的には、 1〃8 111し 特に0. 3〃 g/m 1において 5 0 %以上の アポトーシス抑制率を示す抗 F a sリガンド抗体である。 これらのうちでも平成 7年 6月 2 2日付で日本国茨城県つくば巿東一丁目 一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P— 1 5 0 02 ) 、 さらに平成 8年 5月 9日付で原寄託から国際寄託に移管した （受託番 号 FERM BP- 5535 ) ハイブリ ドーマ F 9 1 9 -9 - 1 8により産生さ れるマウス F 9 1 9— 9— 1 8抗体が特に好ましい例である。 また、 F a sリガンドとマウス F 9 1 9 -9 - 1 8抗体との結合を阻害する抗 体、 特にマウス F 9 1 9 - 9 - 1 8抗体の認識するェピトープと同一のェピトー プを認識する抗体も好適な抗 F a s リガンド抗体の例である。
また、 本発明で用いる抗 F a s リガンド扰体は、 ヒ卜に対する異種抗原性を低 下させること等を目的として人為的に改変したキメラ抗体がより好ましい。 例え ば、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒ ト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、 このようなキメ ラ抗体は、 既知のキメラ抗体の製造方法、 特に遺伝子組換技法を用いて製造する ことができる。
さらに好ましくは、 再構成 （r e s h a p e d) したヒト抗体を本発明に用い ることができる。 これはヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定 領域 (CDR) をヒト抗体の相補性決定領域へ置換したものである。 本発明に有 用な再構成ヒト型抗体 （ヒト化抗体） の好適な例としては、 WO 9 7 0 2 2 9 0 に開示されているマウス抗体 F 9 1 9— 9— 1 8抗体の CD Rを有するヒ 卜 ィ匕 F 9 1 9抗体が挙げられる。 WO 9 7 / 0 2 2 9 0に記載の H u F 9 1 9 G 1. V 1 , Hu F 9 1 9 G 1. v 2， Hu F 9 1 9 G 4. 1ぉょび^? 9 1 9 G 4. v 2が具体例として挙げられる。
なお、 必要に応じ、 ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成 するように抗体の可変領域のフレームワーク （FR) 領域のアミノ酸を置換して もよい。
本発明で用いる抗 F a s リガン ド抗体は、 例えば、 WO 9 5 1 3 2 9 3 (EP 6 7 5 2 0 0) , WO 9 7 0 2 2 9 0などに記載されている方法を用いて 作製することが出来る。
本発明においてモノクロ一ナル抗体を用いる場合は、 公知技術を使用して作製 してもよく、 例えば、 F a s抗原もしくは F a sリガンド又はそれらの部分ぺプ チド等を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常の スクリーニング法により、 モノクロ一ナルな抗体産生細胞をスクリーニングする ことによって作製できる。
より具体的には、 感作抗原が、 ヒ ト F a sリガンドの場合、 T a k a h a s h i T. ( I n t e r n a t i o n a l I mmu n o l o g y、 り 巻、 1 5 67— 1 574頁、 1 9 94年） に開示されたヒト F a sリガンドの遺 伝子配列を用い、 該遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細 胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清中から目的の F a sリ ガンドタンパク質を精製し、 この精製 F a sリガンドタンパク質を感作抗原とし て用いるのが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ゥサギ等が使用できる。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法を用いることが出来る。 このよう に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物か ら免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付されるが、 好ましい免疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 特に限定されないが、 哺乳 動物、 特にマウス等の公知の種々のミエローマ細胞株、 例えば、 X 6 3. 6 5 3 (P 3 X 63 Ag 8. 6 53 ) (J. Immno l. 1 2 3 : 1 5 48, l 2 1 97 8 ) 等が好適に使用される。 前記免疫細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合 は基本的には公知の方法、 たとえば、 ミルスティンらの方法 （Mi 1 s t e i n ら、 Me t ho d s En z ymo l. 73 ： 3 - 46, 1 9 8 1 ) 等に準じて 行うことができる。
次いで、 公知の方法により、 目的とする本発明で用いる抗体を産生するハイブ リ ドーマのスクリ一ニング及び単一クローン化が行われる。
このようにして作製される、 本発明で用いるモノクローナル抗体を産生するハ イブリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイブリ ドーマを通 常の方法にしたがい培養し、 その培養上清から得る方法、 あるいはハイプリ ドー マをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、 その腹水から得る方法な どが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
さらに、 前記の方法により得られる本発明に用いるモノクローナル抗体は、 塩 析法、 ゲル漉過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法等の公知の精製手段を 利用して高純度に精製してもよい。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマを用いる方法に限 られず、 EBV等によって不死化した抗体産生細胞を用いる方法、 遺伝子工学的 に作製する方法を用いて作製することもできる。
本発明に用いるヒ ト化抗体を製造するには、 リーチマンら、 ネーチヤ一、 33 2 : 323 (1 988) 及びョ一口ツバ特許公開第 0 2 39400号公報、 クイーンら、 P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA, 86 : 1 00 2 9 ( 1 9 89 ) 、 国際特許出願公開公報 WO 9 00786 1及び WO 92 1 1 0 1 8、 Co等、 P r o c. Na t l . A c a d. S c i. USA, 8 8， 2 8 6 9 (1 9 9 1) 、 C o及び Q u e e n、 Na t u r e、 3 5 1巻、 50 1頁、 1 9 9 1年、 ならびに、 コ一ら、 J. Immuno l. 1 48 : 1 149 ( 1992 ) 等に開示されている方法を用いることができる。 これらの 文献をここに引用し、 これらの記載をもって本明細書の一部と成す。
本発明のエイズ予防'治療剤は、 Fa sアン夕ゴニストを含有すること、 特に 好ましくは抗 Fa s抗体を含有することを特徴とし、 少なくとも一種の医薬用担 体または、 媒体、 例えば滅菌水や生理食塩水、 植物油、 鉱油、 高級アルコール、 高級脂肪酸、 無害性有機溶媒等、 さらには必要に応じて賦形剤、 着色剤、 乳 化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 吸着防止剤、 安定化剤、 保存剤、 保湿 剤、 酸化防止剤、 緩衝剤、 等張化剤、 無痛化剤等と適宜組み合わせて注射剤や経 口剤などの医薬組成物ゃキッ 卜の形態をとることができる。 本発明のエイズ 予防 ·治療剤は、 好ましくは非経口的に、 たとえば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身あるいは局部的に、 ならびに急速もしくは持 続的に投与することができる。 本発明のエイズ予防 ·治療剤のヒトに対する投与 量は患者の病態、 年齢あるいは投与方法により異なるが、 適宜適当な量を選択す ることが必要である。 例えば、 およそ 1— 100 OmgZ患者の範囲で適当な分 割容量を選択することができる。 しかしながら、 本発明のエイズ予防 ·治療剤の 使用はこれらの投与方法および投与量に制限されるものではない。 さらに、 複数 の F a sアンタゴニストを組み合わせて使用したり、 他の薬剤と併用しても よい。 また、 他の作用機構を有する H I V感染症治療薬と併用してもよい。 本発明のエイズ予防 ·治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。 た とえば、 注射用製剤は、 精製された抗 F a sリガンド抗体を溶剤、 たとえば、 生 理食塩水、 緩衝液などに溶解し、 それに、 必要に応じて吸着防止剤などを加えた ものであり、 または、 使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであって もよく、 凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明の抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療剤の効果を 確認するために、 ァカゲザル AD I Sモデルによるインビボの実験を行った。 サ ル類の持っている H I V類似ウィルスとしてサル免疫不全ウィルス （S I V) が 知られている。 Re imann, K. A. 等 （J. V i r o l. ， Vo l. 70, No. 10， 6922 - 6928 (1996) ) は、 HIVと S I Vのキ メラウィルス SH I Vの接種がァカゲザルに CD 4陽性 T細胞の減少とエイズ様 な衰弱と日和見感染をもたらすことを報告している。 本発明の抗 F a sリガンド 抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療剤を、 SH I Vを接種したァカゲザルに 投与したところ CD 4陽性 T細胞の減少が抑制され、 インビボでの効果が確認さ れた。
本発明のエイズ予防 ·治療薬は、 H I V感染症患者に投与することにより、 リ ンパ球の減少、 特に F a sの発現が増強したリンパ球の減少を抑制し、 H I V感 染症の免疫機能低下の進行を抑制する効果を有する。
また、 H IV感染の進行に伴う、 発熱、 咽頭痛、 リンパ節腫脹、 下痢、 体重減 少、 倦怠感、 盗汗 （寝汗） 、 脳神経症状等を軽減する効果、 および日和見感染、 力ポジ肉腫等の悪性腫瘍、 エイズ痴呆症候群を予防または治療する効果を有 する。
本発明のエイズ予防 ·治療薬の対象となるのは、 H I V抗体が陽性であ るが C D 4細胞の減少が軽度であり健常人と変わりな 、健康状態が続く無症候性 キャリア （AC) 、 さらに CD 4細胞の減少が続き徐々に免疫機能が低下してさ まざまな免疫不全状態を示すエイズ関連症候群 （ARC) 、 日和見感染や力ポジ 肉腫等の悪性腫瘍が伴う重篤な免疫不全状態等のエイズに関連する各種疾患の予 防 ·発病抑制 ·治療である。
また、 H I V抗体陽性ではないが、 H I Vと接触する可能性がある場合の予防 や、 H I V陽性が陰性に転じた後の再発防止の予防等も対象となる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定され るものではない。
(実施例 1 ) 抗マウス F a sリガンド抗体の毒性試験
(1) 方法
雄性、 8週齢、 DBA/1 Jマウスおよび C 3 HZHeマウス （日本チヤール スリバー） を用いた。 PCT/J P 97 / 03978に記載の抗マウス F a sリ ガンド抗体を 1 0 Omg/3 OmlZkgの用量で尾静脈から投与した。 またコ ントロール群には生理食塩水 （大塚製薬） を 30 m 1 /k gの用量で尾静脈から 投与した。 2種の系統ともに各群 n= 3とした。 観察期間を 7日間とし、 体重測 定、 血液学的検査 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査 （GOT、 G PT、 尿素窒素） 、 肉眼による剖検を行った。
(2) 結果
抗マウス F a sリガンド抗体投与群の投与後の体重増加、 血液学的検査値 （赤 血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査 （GOT、 GPT、 尿素窒素） はコ ントロール群と比べて差を認めなかった。 また、 肉眼による剖検所見においても 抗マウス F a sリガンド抗体投与群に異常は認められなかった。 (実施例 2 ) ァカゲザル A I D Sモデルにおけるヒト型化抗ヒト F a sリガンド 抗体の C D 4陽性 T細胞減少抑制効果
(1) A I DSモデルの作製
実験動物として、 雄性のァカゲザル （体重 2. 4 kg〜2. 9 kg) 10頭を 用いた (Or e gon Re g i ona l Pr ima t e Re s e a r ch C e n t e rより購入） 。 常法に従い、 6週間の検疫で異常が無いことを確認し た。 サル免疫不全ウィルス （S IV) とヒト免疫不全ウィルス （HIV) のキメ ラウィルスである SH I V— 89. 6 p株 （米国 V i ru s Re s e a r ch I n s t i t u t eより購入、 J. V i r o l o y, 7 0卷、 頁 6922 一 6928 ( 1996年） ） は、 ストツク液を 1000倍希釈した後、 1 mLを 静脈内に接種した。
( 2 ) 抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療薬の投与 ヒト化 F 919抗体をクェン酸緩衝液 （2 OmMクェン酸、 120 mM塩化ナ トリウム、 0. 01 %Twe e n 80、 pH 6. 0) 中に溶解して用いた。 ァカ ゲザルは体重で 5頭ずつの 2群に分け、 それぞれ対照群、 ヒト化 F919抗体投 与群とした。 ヒト化 F 9 1 9抗体は、 SH I V— 8 9. 6 p株の接種と同時 に 10mg/kgを静脈内投与した （Day 1) 。 対照群には、 溶媒のみを同量 静脈内投与した。 投与は、 1週間毎に行った。 (3) 採血並びに F ACS解析
動物にケタミ ン塩酸 1 Omg/k gを筋肉内注射して、 麻酔をかけた後、 静脈 からの採血を EDT A存在下で行った。 採血は、 SH I V— 8 9. 6 p株の接種 前および D a y 8と D a y 1 5の薬物投与の直前に行った。 採血した EDTA加 血 1 0 0 Lに CD 4陽性 T細胞を特異的に認識する OKT 4 a抗体 （オル ソ社） を 1 0 /zL加え、 1 0分間喑所に放置した後、 FACS用溶解液 （べク ト ン 'ディッキンソン社） を 2mL加え、 更に 1 0分間室温に放置した。 その後、 ゥシ胎児血清 5 %を含む最小必須培地で洗浄して、 0. 5%のホルムアルデヒド 中に固定した。 検体は、 FACS c a nT (べク トン 'ディッキンソン社） で解 析し、 末梢血中の全リンパ球数に対する CD 4陽性 T細胞の割合 （ ） を算出し 7 o
(4) 結果
対照群、 ヒト化 F 9 1 9抗体投与群の CD 4陽性 T細胞の割合の平均値は、 接 種前値ではそれぞれ 2 9. 7 %と 2 8. 7 %であつたが、 対照群では、 8日後で 2 6. 5 %と減少傾向を示し、 1 5日後では 6. 9 %と急激な減少を示したのに 対し、 ヒ ト化 F 9 1 9抗体投与群では、 8 日後で 2 9. 2 %、 1 5 日後で 1 4. 1 %と、 対照群に比べ明らかな C D 4陽性 T細胞の割合の減少抑制効果を 示した。 また、 ヒ ト化 F 9 1 9抗体投与による著しい毒性は認められなかつ た。 C D 4陽性 T細胞の割合 接種前 8日後 1 5日後 投与群 2 8 . 7 % 2 9 . 1 % 1 4 . 1 % 対象群 2 9 . 7 % 2 6 . 5 % 6 . 9 % 以上の結果は、 本願発明のエイズ予防 ·治療剤が優れた効果を有することを示 すものである。 また、 本発明のエイズ予防 ·治療剤は、 著しい毒性を示さない。 従って、 本発明の抗 F a s リガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療 剤は、 F a s抗原によるシグナルの発生又は伝達を遮断し、 F a s— F a sリガ ンド系の生物作用、 特に、 F a s抗原を介したアポ一シスによるリンパ球細胞の 死が抑制される限り、 これが関与する H I V感染症の治療に有効である。 産業上の利用可能性
本発明の抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療剤は F a s —F a sリガンド系の生物作用、 特に、 F a s抗原を介したアポ一シスによるリ ンパ球細胞の死を抑制し、 H I V感染症の治療効果を有する。 したがって、 本発 明の抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療剤は、 アポトーシ スよるリンパ球数の減少が関与する H I V感染症におけるエイズ予防 ·治療剤と して期待される。

Claims

請求の範囲
1. 抗 F a sリガンド抗体を有効成分とするエイズ予防 ·治療剤。
2. 前記抗 F a sリガンド抗体が H I V感染症におけるリンパ球細胞のアポ トーシスを抑制することを特徴とする請求項 1に記載のエイズ予防 ·治療剤。
3. 前記抗 F a sリガンド抗体が F a sリガンドに対する中和抗体である請 求項 2に記載のエイズ予防 ·治療剤。
4. 前記抗 F a sリガンド抗体が、 ハイプリ ドーマ F 9 1 9-9 - 1 8 (受 託番号 FERM BP- 5535 ) より産生されるマウス F 9 1 9抗体の認識す るェピトープを認識する抗体である請求項 1ないし 3のいずれかに記載のエイズ 予防 ·治療剤。
5. 前記抗 F a sリガンド抗体がヒト化抗 F a sリガンド抗体であることを 特徴とする請求項 4に記載のエイズ予防 ·治療剤。
6. 前記抗 F a sリガンド抗体がヒト化 F 9 1 9抗体である請求項 5に記載 のエイズ予防 ·治療剤。
7. 抗 F a sリガンド抗体のエイズ予防 ·治療剤への使用。
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