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WO1999036561A1 - Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus - Google Patents

Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus Download PDF

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WO1999036561A1
WO1999036561A1 PCT/FR1999/000016 FR9900016W WO9936561A1 WO 1999036561 A1 WO1999036561 A1 WO 1999036561A1 FR 9900016 W FR9900016 W FR 9900016W WO 9936561 A1 WO9936561 A1 WO 9936561A1
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WO
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envelope glycoprotein
proline
retroviral envelope
retroviral
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PCT/FR1999/000016
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François-Loîc COSSET
Dimitri Lavillette
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Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C12N2810/6054—Retroviridae

Definitions

  • the subject of the invention is the use of a proline-rich sequence to increase the fusogenic character of retrovirus envelopes.
  • a retrovirus The entry of a retrovirus into a target cell depends on the recognition of a specific surface protein, called a receptor, by the surface subunit (SU) of the viral envelope, followed by the fusion of membranes which is mediated. by the fusion peptide located at the amino terminal end of the transmembrane sub-unit (TM) (29). Both a pH-dependent pathway and an independent pathway have been described for retroviruses (13), but the determinants and process involved in activation of fusion following recognition of the receiver remain unknown. The identification of these stages is essential for understanding the mechanism which modulates infection as well as gene transfer by retroviruses.
  • SU surface subunit
  • TM transmembrane sub-unit
  • the retroviral envelope glycoproteins which assemble in trimer are a complex comprising a surface subunit (SU) and a transmembrane component (TM) (10).
  • SU surface subunit
  • TM transmembrane component
  • the initial interactions of this glycoprotein with the cellular receptor (s) lead to conformational rearrangements of the envelope necessary for the exposure of the fusion peptide (30).
  • the determinants of the envelope and the sequence of events causing these conformational changes are well detailed for orthomyxoviruses that require the acidic environment of endocytosis vesicles for their entry (24).
  • amphotropic envelope receptor Pit-2 for murine leukemia viruses 14, 28
  • the functional receptors for ecotropic envelopes are limited to rat and mouse cells ( 19).
  • the recognition of one or the other of these receptors influences the fusion efficiency, but the ecotropic envelope induces cell-cell fusion and syncytia formation more easily, as tested with XC rat cells, than amphotropic envelopes (17).
  • the structural domains shared by the Moloney ecotropic envelope (MoMLV) and the amphotropic envelope (MLV-4070A) include: (i) an amino-terminal receptor binding domain (denoted BD) of approximately 200 amino acids (aa ) (3, 7); (ii) the proline-rich region from 45 to 59 a.a long, identified by PRO in the chimeric constructions described below (27); (iii) a carboxy-terminal sequence of SU (denoted C) of 160 a.a. involved in the interaction with TM; (iv) an ectodomain of the 134 a.a.
  • TM designated herein by TM, carrying a potential amino-terminal fusion peptide identified by sequence analogy to the fusion peptides of other envelope proteins of enveloped viruses (11); (v) a membrane anchoring peptide of 28 a.a. and (vi) a cytoplasmic tail containing the small carboxy-terminal peptide R whose late cleavage in virions, increases the fusogenicity of the envelope (20). While the amino-terminal BD and PRR domains of the ecotropic and amphotropic envelope share only 33% and 43% a.a. of homology, respectively, all the other domains have more than 80% similarity (Fig. 1A).
  • One of the objects of the invention is to provide proline-rich sequences which increase the fusogenic character of retrovirus envelopes.
  • One of the objects of the invention is to provide chimeric or mutated proteins whose fusogenic character is improved.
  • the subject of the invention is the use of a proline-rich sequence for improving the fusogenic character of a protein comprising a retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or a retroviral envelope glycoprotein of a GALV or a retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or a retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, which sequence is rich in proline corresponds to: - either the proline-rich sequence of the retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV, or . of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF,. of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 1OA1, of the retroviral envelope glycoprotein of a GALV, or of the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV, or
  • retroviral envelope glycoprotein of an FeLV and comprises at least one mutation such that there is suppression of at least one ⁇ -turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence
  • the proline-rich region is probably organized into a poly-proline helix, a secondary structure made up of "beta-turns" which are folds of the peptide chain by 180 °, most often including a proline.
  • These curvatures are arranged differently between the PRO regions (proline-rich region) of the ecotropic and amphotropic envelopes.
  • the latter contains 11 regularly arranged "beta-turns", including 4 in its N-terminal end and 7 in its C-terminal end.
  • the PRO region of the ecotropic envelope contains only 7 beta-turns, of which only 2 are at its N-terminal end.
  • proline is advantageously replaced by isoleucine, valine or alanine.
  • strain MLF MCF 247 As suitable strains of MLV MCF, mention may be made of the strain MLF MCF 247 (9).
  • the expression “improving the fusogenic character” means that the "improved" retroviral envelope of the invention has a measurable capacity, relative to the parental envelope, to better accomplish the post-binding stages of the viral entry process and consisting ultimately of the molecular fusion of viral and cellular membranes.
  • the proline-rich sequence of a retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV is that shown in FIG. 7.
  • the proline-rich sequence of a glycoprotein of the retroviral envelope of an amphotropic MLV is that represented in FIG. 8.
  • the proline-rich sequence of a glycoprotein of the retroviral envelope of an MLV MCF is that represented in FIG. Figure 9.
  • the proline-rich sequence of a glycoprotein of the retroviral envelope of a GALV is that shown in FIG. 10.
  • the proline-rich sequence of a glycovote from the retroviral envelope of an MLV 10A1 is that shown in FIG. 11.
  • the proline-rich sequence of a glycoprotein of the retroviral envelope of a xenotropic MLV is that shown in FIG. 12.
  • proline-rich sequence of a glycoprotein of the retroviral envelope of an FeLV is that represented in FIG. 13.
  • proline-rich sequence of a retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV is also meant that comprising mutations, deletion or addition of amino acids such that there is no modification of the sequence of ⁇ -burn
  • the invention relates to the use as defined above of a proline-rich sequence in association with a functional domain of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV ecotrope chosen from: the binding domain, the C domain, or the domain of the transmembrane subunit.
  • the term “functional domain” means any polypeptide sequence that is structurally individualized and capable of performing a determined biological function.
  • binding domain is defined the functional domain carried by the N-terminal part of the SU subunit of the MLV retroviral envelope and capable of binding to the retroviral receptor. It is shown in Figure 6 as extending from position 31 to 237 of the peptide sequence of the amphotropic envelope glycoprotein MLV.
  • domain C we define the functional domain carried by the C-terminal part of the SU subunit of the MLV retroviral envelope and capable of interacting with the TM subunit. It is shown in Figure 6 as extending from position 300 to 458 of the peptide sequence of the amphotropic envelope glycoprotein MLV.
  • TM domain we define the domain carried by the ectodomain of the TM subunit of the MLV retroviral envelope and capable of interacting with the SU subunit and of achieving fusion between viral and cellular membranes during of the retroviral entry process. It is shown in Figure 6 as extending from position 459 to 592 of the peptide sequence of the amphotropic envelope glycoprotein MLV.
  • the binding domain, the C domain, or the domain of the transmembrane subunit can be modified so as to alter their functional capacities with a view to: - interacting with other molecules, such as surface molecules
  • the invention relates in particular to the use as defined above, of a proline-rich sequence corresponding to the proline-rich sequence of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV, in association with a functional domain of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV chosen from: the binding domain, the C domain, or the domain of the transmembrane subunit.
  • the invention relates to the use of a proline-rich sequence for improving the fusogenic character of a protein comprising a glycovote of retroviral envelope of an MLV, which proline-rich sequence corresponds to:
  • retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV comprises at least one mutation such that there is suppression of at least one ⁇ -turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence
  • the invention also relates, as a new product, to a proline-rich sequence in which the amino acid sequence and the secondary structure correspond to that of the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or of the MLV 10 A1 retroviral envelope glycoprotein or MLV MCF retroviral envelope glycoprotein or GALV retroviral envelope glycoprotein or xenotropic MLV retroviral envelope glycoprotein or of the retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, and comprising at least one mutation on the side of the C-terminal part such that there is suppression of at least 1 ⁇ -turn in the polyproline helix of the rich sequence in proline.
  • the “C-terminal part” defines the amino acid sequence corresponding to the second half of the proline-rich region.
  • the invention also relates to a proline-rich sequence in which the amino acid sequence and the secondary structure correspond to that of the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein of an MLV.
  • N-terminal such that there is suppression of at least 1 ⁇ -turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence.
  • the “N-terminal part” defines the amino acid sequence corresponding to the first half of the proline-rich region.
  • the invention also relates to the mutated proteins containing a proline-rich sequence and in the chain of which the proline-rich sequence is mutated so that there is suppression of at least one ⁇ -turn.
  • the invention relates to a mutated protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, in which the proline-rich domain contains at least one mutation such that 'there is suppression of at least one ⁇ -turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence.
  • This mutated protein has, with respect to the corresponding non-mutated protein, the property of more easily inducing the formation of syncytia or better infecting the cells expressing a limiting amount of retroviral receptors, relative to the parental envelope from which it is derived.
  • the invention also relates to the chimeric proteins containing a proline-rich sequence in the chain of which the proline-rich sequence is replaced by the proline-rich sequence homologous to the retroviral glycoprotein of an ecotropic MLV. More specifically, the invention relates to a chimeric protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the glycoprotein of the retroviral envelope of a MLV MCF or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, in which the domain rich in proline is replaced by the proline rich domain of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV.
  • This chimeric protein has, relative to the corresponding protein of origin, the property of more easily inducing the formation of syncytia or better infecting the cells expressing a limiting quantity of retroviral receptors, relative to the parental envelope from which it is derived.
  • the invention relates to a chimeric protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of a
  • Amphotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of an FeLV in which:
  • proline-rich domain is replaced by the proline-rich domain of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV
  • This chimeric protein has the property of inducing more easily the formation of syncytia or of better infecting the cells expressing a limiting quantity of retroviral receptors, relative to the parental envelope from which it is derived.
  • the invention relates to a chimeric protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of a Amphotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, in which:
  • the proline-rich domain comprises at least one mutation such that there is suppression of at least one ⁇ -turn (in the polyproline helix of the proline-rich sequence),
  • This chimeric protein has the property of inducing more easily the formation of syncytia or of better infecting the cells expressing a limiting quantity of retroviral receptors, relative to the parental envelope from which it is derived.
  • One of these tests is the formation of syncytia between target cells and cell lines previously transfected with an expression vector for one of the above chimeric or mutated proteins of the invention (and capable of recognizing a retroviral receptor located on said target cells).
  • target cells cells from SCI mice, Mus Duni, human TE671 cells, as well as rat XC cells can be used.
  • the cell lines used may or may not produce particles
  • Gag-Pol from MLV.
  • the cell lines may or may not produce Gal-Pol particles of MLV or of other mammalian type C retroviruses, in particular the Moloney MLV virus or of other retroviruses such as lentiviruses, for example HIV-1.
  • Another test for characterizing mutated or chimeric proteins of the invention consists in infecting target cells expressing a retroviral receptor capable of being recognized by a chimeric or mutated protein of the invention, via viral particles containing these proteins chimeras or mutated.
  • the XC and XC-A-ST rat cells can be used, the latter being derived from XC cells by transfection of a plasmid expressing the binding domain of the amphotropic retroviral envelope capable of occupying the retroviral receptor amphotropic.
  • viral particles there may be used those produced by MLV retroviruses or other mammalian type C retroviruses, in particular Moloney MLV virus or other retroviruses such as lentiviruses, for example HIV-1.
  • This infection is carried out under limiting conditions, that is to say such that the density of the receptor (that is to say the number of receptors available on the cell surface allowing the attachment of the viral particle) decreases by at least 100 times the infectious titer of virus comprising an envelope mutated or chimeric glycoprotein and by less than 100 times the infectious titer of virus comprising a mutated or chimeric envelope of the invention corresponding to the said envelope neither mutated, nor chimera.
  • the comparison is made with respect to the infectious titre of viruses comprising a non-chimeric and non-mutated envelope or a chimeric or mutated envelope on target cells such as XC cells.
  • This infection is comparatively carried out on two cell types, the second being directly derived from the first and has the effect of reducing the number of retroviral receptors available, that is to say such that the decrease in the surface expression of the receptor decreases by at least 100 times the infectious titre of the virus containing the parental envelope, neither mutated nor chimeric.
  • the A 2 sequence involves the suppression of the second ⁇ -turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in syncytia test.
  • the A 3 sequence involves the suppression of the third ⁇ -turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in the syncytia test.
  • the A 3 Mo sequence involves the suppression of the third ⁇ -turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in infection test. as defined above.
  • the sequence A 4 involves the suppression of the fourth ⁇ -turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in infection test such as defined above.
  • the sequence A 4 involves the suppression of the fourth ⁇ -turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in infection test such as defined above.
  • Amphotropic MLV the C 2 sequence includes the deletion of ⁇ -turns 9 to 13 which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in infection test as defined above.
  • the C 3 sequence involves the deletion of ⁇ -turns 11 to 13 which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in test for infection as defined above.
  • the C 4 sequence includes the deletion of the last ⁇ -turn (13 °) which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test. infection as defined above.
  • the C 5 sequence includes the deletion of the 11 ° and 12 ° ⁇ -turns which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test. infection as defined above.
  • Advantageous chimeric proteins according to the invention correspond to one of the following sequences:
  • the PROMO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV (Moloney strain).
  • the PRO FR sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV (Friend strain).
  • the BD PRO MO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV and in which the binding domain has been replaced by the homologous binding domain of the ecotropic MLV .
  • the PRO CMO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV and in which the C domain has been replaced by the C domain homologous to the ecotropic MLV.
  • the PRO TM MO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV and in which the TM domain has been replaced by the TM domain homologous to the ecotropic MLV.
  • the PRO CTM MO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the proline-rich region homologous to the ecotropic MLV and in which the respective C and TM domains have been replaced by the C and TM domains respectively. counterparts of the ecotropic MLV.
  • Advantageous chimeric proteins according to the invention comprise one of the proline-rich sequences corresponding to one of the following sequences: A 2 A 3 A 3 Mo
  • PRR proline-rich region
  • MMV murine leukemia viruses
  • BD, PRO, C and TM are exchanged with their counterpart of the ecotropic envelope (Fig 1B).
  • the resulting envelopes are then identified according to the substituted ecotropic domain (s).
  • Cell-to-cell fusion is evaluated by the formation of syncytia after a 24-hour coculture between different target cells (indicator cells) and cell lines, whether or not producing Gag-Pol particles of MLV (5), previously transfected with one either of the envelopes.
  • the level of expression on the cell surface of the parental envelopes and chimeras are similar (Fig. 4A)
  • two different cell-cell fusion phenotypes are observed.
  • the CMO and TMMO envelopes like the wild MLV -4070 A envelope, weakly induce syncytia.
  • the BDMO, PROMO and PROFR envelopes strongly induce the formation of syncytia, similar to those induced by the ecotropic envelope.
  • Proline proline-induced "beta-turn” is less entangled in the part amino-terminal than in the carboxy-terminal end. So each of the four
  • the potential "beta-turn" of the 4070A envelope could be removed individually by substitution of a proline with a valine, an alanine or an isoleucine, giving the mutants Al, A2, A3, A3MO and A4 (Fig. 3C).
  • a second amino acid was substituted in the mutants A2 and A3 in order to avoid the formation of a potential alpha helix or beta sheet, originally absent in the PRR structure predictions of MLV
  • Envelopes A1 and A4 for which the first or fourth amino terminal "beta-turn” respectively have been mutated, retain a regular repeat of three contiguous "beta-turn” and do not induce increased syncytia formation (Table 1).
  • the A2 and A3 envelopes in which the continuity of these "beta-turn" is interrupted are very fusogenic (Table 1), thus demonstrating the critical importance of the adjoining "beta-turn" of PRR in the "mediation" of the fusion following the recognition of the receptor.
  • cell-virus fusion was examined by comparing the infectivity of virions carrying the parental or chimeric envelope.
  • the titers are equivalent on the XC rat (Table 1), mouse, human and CHO cells transfected with the Pit-2 receptor expression gene.
  • the highly fusogenic PROMO and PROFR chimeras, as well as the point mutants A2 and A3 led to undetectable or significantly reduced titers on all the cells tested.
  • the other envelopes confer titers in a range of 10e6-10e7 infectious units per ml (ui / ml) on the XC cells, similar to those obtained with the two parental envelopes 4070 A and MO.
  • PRR seems to play a critical role in the SU / TM association and the conformation of the envelope.
  • BD as for the BDPROMO envelope (Fig. 1C), increases the stability, as estimated with the loss of SU (not shown) (Fig. 1).
  • PRR is a key determinant of changes in the conformation of the envelope and of membrane fusion.
  • retroviral vectors derived from type C retroviruses, mammals or lentiviruses comprising: . mutated or chimeric envelope glycoproteins as described in the invention
  • mutated or chimeric envelope glycoproteins as described in the invention as well as a peptide or a protein domain capable of redirecting the binding of the retroviral vector to a specific molecular target.
  • Figs. 1A, 1B, 1C and 1D Schematic representation of the chimeric envelopes and their properties.
  • Fig. 1A The empty boxes are sequences derived from the amphotropic MLV, the filled boxes are sequences from the Moloney ecotropic MLV (black) or the Ecotropic MLV from Friend (gray) and the hatched boxes are sequences common to these two MLVs.
  • BD receptor binding domain
  • PRO proline-rich region
  • TM SU terminal carboxy domain
  • TM ectodomain
  • anchoring domain of the TM sub-unit.
  • percentage of identity as well as the first four N-terminal amino acids, are indicated.
  • a premature stop codon (vertical arrow) is introduced into the cytoplasmic tail of the TM subunit of amphotropic MLV to generate the fusogenic ARless fusogenic envelope glycoprotein.
  • Fig. 1B Simple substitution mutants.
  • Fig. 1 C The substitution mutants combined.
  • Fig. 1D The results of cell-cell fusion tests: (-), absence of syncytia; (+), presence of syncytia only in a coculture with XC cells; (+ +), presence of syncytia both in a coculture with rat cells
  • TE671 cells transfected with the expression vectors of the chimeric envelope glycoproteins indicated are cocultivated with XC indicator cells for 24 hours. Magnification x250.
  • Figs. 3A, 3B, 3C and 3D Mutagenesis of the region rich in amphotropic proline 4070A.
  • Fig. 3 A Alignment of the PRR of the MLV of Moloney (Mo), of Friend (Fr) and 4070A (A).
  • Fig. 3B Point mutants (amino acids in small bold type) or deletion (dashes) of the C-terminal end of the PRR of MLV 4070A.
  • Fig. 3C Point mutants of the C-terminal end of the PRR of MLV 4070A. Amino acids changed or inserted are highlighted in small bold type.
  • Fig. 3D, 3E, 3F, 3G Probability profiles of the beta-turn of the PRRs of MLV 4070 A (4070A), Moloney (Moloney) and point mutants of the PRR of MLV 4070A including the second (A2) or third ( A3) beta turn has been removed.
  • the y-axis values represent the probability of beta-turn p (turn) * 10e-4 for each residue of the peptide (on the x-axis).
  • the beta-mrn analysis was carried out using PC / Gene software (Version 6.26, IntelliGenetics, Belgium).
  • Fig. 4 Immunoblots of amphotropic envelope glycoproteins whose fusogenicity is increased.
  • the cells were transfected with the envelopes indicated in FIGS. 1 and 3 and the expression of their SU and of their envelope precursor (PR) is estimated (cell lysates).
  • PR envelope precursor
  • the instability of the envelope is shown by the decreased surface expression of the SU relative to the PR (membrane preparations), its release of the SU (shedding) increased in the culture medium (supernatant) and in the virions. Protein transfers (western blots) were revealed with the antibodies indicated.
  • Fig. 5 it represents the sequence of the retroviral envelope glycoprotein of ecotropic MLV (BD, PRO, C and TM domain) (Moloney strain).
  • Fig. 6 it represents the sequence of the amphotropic MLV retroviral envelope glycoprotein (BD, PRO, C and TM domain) (strain 4070 A).
  • Fig. 7 it represents the proline-rich region of the glycovote of the retroviral envelope of Mo MLV (Moloney MLV).
  • Fig. 8 it represents the proline-rich region of the glycovote of the retroviral envelope of MLV-4070A.
  • Fig. 9 it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of MLV-MCF (strain 247).
  • Fig. 10 it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of GALV, strain Seato.
  • Fig. 11 it represents the proline-rich region of the glycovote of the retroviral envelope of MLV 10A1.
  • Fig. 12 it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of xenotropic MLV, strain NZB.1.V6.
  • Fig. 13 it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of FeLV A.
  • Fig. 14 it represents the sequence of A 2 .
  • Fig. 15 it represents the sequence of A 3 .
  • Fig. 16 it represents the sequence of A 3 Mo.
  • Fig. 17 it represents the sequence of A 4 .
  • Fig. 18 it represents the sequence of C 2 .
  • Fig. 19 it represents the sequence of C 3 .
  • Fig. 20 it represents the sequence of C 4 .
  • Fig. 21 it represents the sequence of C 5 .
  • Fig. 22 it represents the sequence of PROMO.
  • Fig. 23 it represents the sequence of PRO FR.
  • Fig. 24 it represents the BD PRO CMO sequence.
  • Fig. 25 it represents the sequence of PRO CMO.
  • Fig. 26 it represents the sequence of PRO CTM MO.
  • Fig. 27 it represents the sequence of PRO TM MO.
  • envelope melt index was expressed on the surface XC XC-A-ST
  • NS syncytia containing more than 20 nuclei
  • S number of syncytia
  • T total number of nuclei
  • b untransfected cells.
  • c syncytia containing more than 20 nuclei
  • d syncytia containing less than 4 nuclei
  • e syncytia containing more than 40 nuclei with XC cells and less than 10 nuclei with XC A-ST cells.
  • TELacZ cells contain the retroviral vector MFGnlsLacZ (25) responsible for the expression of a nuclear beta-galactosidase.
  • the cell line
  • TELCeB ⁇ (5) is derived from the TELacZ line and was obtained by transfection of a plasmid expressing the gag and pol proteins of MoMLV. These cells therefore produce non-infectious retroviral particles, since they lack envelopes, carrying the marker gene nlsLacZ.
  • TELCEB6, XC, RD and CEAR13 cells (12) are cultured in medium
  • DMEM fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • CEAR13 culture medium is additionally supplemented with proline (Sigma) at 10 ⁇ g / ⁇ l.
  • the NIH3T3 line (ATCC CRL 1658) is cultivated in DMEM medium (Life-Technologies) supplemented with 10% newborn calf serum (Life-Technologies).
  • the XC-A-ST cells were obtained by stable transfection into the XC cells of the plasmid pA-ST (5) expressing the N-terminal fragment of the SU of the MLV-4070A virus capable of binding and blocking the amphotropic receptor.
  • FBMOSALF Moloney ecotrope
  • FB3 Friend C57 ecotrope
  • the envelope genes are under the control of the LTR (5) of the Friend FB29 MLV.
  • these plasmids contain the phleo marker gene, allowing selection by phleomycin.
  • Moloney-MLV (MO) and Friend-MLV (FR), with an Apal site and a Kpnl site created at the beginning and at the end of this region were generated thanks to the nucleotides: Up MO Apal 5 '-CC A ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG and Low MO Kpnl 5'-AAC GTG GTA CCC GCC GGT GGA AGT TGG G for PCR on the plasmid FBMOSALF; Up FRA pal GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG and Low FR Kpnl GAA
  • Apal / Kpnl fragments are cloned between the Apal (position 653) and BamHI (position 802) sites of the 4070A envelope using a Kpnl / BamHI adapter fragment generated by PCR on the plasmid FBASALF using oligonucleotides Up A Kpnl 5 '-T ATGCGGTACCGG AGATAGACTACT AGCTC and Low A BamHI
  • the other chimeric envelopes were generated using the envelopes described above by subcloning of different fragments.
  • the plasmid FBASALF was opened in Xhol-Clal and this DNA was used to clone the fragments: (i) XhoI-Dra ⁇ l of the PROMO envelope and the Dra ⁇ l-Clal fragment of the MO envelope, generating the PROCTMMO envelope; (ii) Ncol-ClaI of the MO envelope, co-ligated with an Xhol-Ncol adapter fragment of the A envelope, generating the TM MO envelope; (iii) Xhol-Ncol from the MO envelope thanks to an Ncol-ClaI fragment of the envelope A, generating the PROCMO chimera.
  • the PROTMMO construct was obtained by subcloning the XhoI-BamHI fragment of the PROMO envelope into the vector carrying the TMMO envelope digested with the same enzymes.
  • the BDPROMO chimera was made by co-ligating the DralII-Clal fragment of the PROMO envelope in the plasmid FBMOSALF, digested with the BamHI-ClaI enzymes, with a BamHI-DralII fragment of the MO envelope.
  • I of envelope 4070A (at position 594) (16) was used in combination with oligonucleotides providing various restriction sites (specified in parenthesis and whose site is underlined in the sequence of the oligonucleotide) and inserting the mutation desired (nucleotides that do not match are indicated by a lowercase letter)
  • oligonucleotides providing various restriction sites (specified in parenthesis and whose site is underlined in the sequence of the oligonucleotide) and inserting the mutation desired (nucleotides that do not match are indicated by a lowercase letter)
  • ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C
  • Each fragment is co-ligated with a KpnI-BamHI fragment, originating from the PROMO envelope, in the vector FBASALF digested into XhoI-BamHI.
  • the plasmids expressing the envelopes are transfected by the calcium phosphate precipitate method (22) in the TELCeB ⁇ line.
  • the transfected cells were selected with phleomycin (50 ⁇ g / ml) and the resistant clones were mass trypsinized.
  • the confluence cells were used on the one hand to recover viral supernatants after an overnight incubation in normal medium, and on the other hand to make cell lysates.
  • the viral supernatants are used for infection tests, receptor binding tests, and the rest is subjected to ultracentrifigation to obtain virus pellets analyzed by immunoblot.
  • the virus-producing cells are lysed for 10 minutes at 4 ° C. in a Tris-HCl buffer (pH 7.5), containing 1% TritonXIOO, 0.05% SDS, deoxycholate 5 mg / ml, 150 mM NaCl and a cocktail. protease inhibitor (1 mM PMSF, 6 mM Leupeptin, 0.3 mM Aprotinin). These lysates are centrifuged for 10 minutes at
  • Antibodies (Quality Biotech Inc., USA) from goat antiserum directed against Rausher Leukemia Virus (RLV) gp70-SU or RLV p30-CA were used at dilutions of 1: 2000 and 1: 10000 respectively .
  • the "blots" were revealed by the use of a conjugated antibody, coupled to peroxidase, of rabbit or goat origin directed against the immunoglobulins of goat or rabbit, respectively (Dako, UK), using a chemiluminescence kit (Amersham Life Science).
  • the target cells are rinsed with PBS and peeled off by a 10-minute incubation at 37 ° C. in 0.02% versene in PBS.
  • the cells are rinsed in PBA (PBS containing 2% of FCS (fetal calf serum) and 0.1% of sodium azide which makes it possible to block the membrane endocytosis).
  • 10 6 cells are then incubated for 1 hour at 37 ° C. with the various viral supernatants (2 ml) containing the soluble SU. These supernatants are discharged from the precipitated viral particles by ultracentrifigation or not.
  • the cells are incubated in the presence of monoclonal antibody, rat or mouse, directed against SU (83A25) (6) or against TM (MAb2), respectively, for 45 minutes at 4 ° vs.
  • the cells are washed twice in PBA and then incubated in the presence of fluorescent conjugate antibodies directed against rat (Cayla, F) or mouse (Dako, UK) immunoglobulins, for 45 minutes at 4 ° C.
  • the dead cells are then counter-stained with propidium iodide (20 ⁇ g / ml) for 5 minutes at 4 ° C.
  • the fluorescence of the living cells is analyzed by fluorometry, FACSCalibur, Beckton Dickinson).
  • the cells carrying the envelopes are washed, detached and rinsed in the same manner as the target cells of the binding test. 10 ° cells are then incubated directly with the anti-SU rat antibody (83A25) for 1 hour at 4 ° C.
  • the cells Once the cells have been fixed with a 0.5% solution of glutaraldhéhyde bridging agent in PBS, they are stained using a substrate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Beta- D- galactopyranoside or X-Gal, for 12 hours.
  • the viral titers are reported in number of positive colonies per ml of viral supernatant (LacZ i.uJml).
  • a box of confluent cells with a diameter of 35 mm is rinsed once with DMEM medium (Eagle's medium modified by Dubelcco) without metionine or cysteine, supplemented with 10% of fetal calf serum dialyzed in order to remove the amino acids, then incubated for 1 h 30 at 37 ° C in this same medium. After labeling for 45 minutes with methionine and cysteine S35 (100 mCi / ml; TranS35-Label,
  • the cells are washed and then incubated at 37 ° C in culture medium (hunting).
  • the cells are lysed at different times in a 0.5% NP40 solution, 150 mM NaCl, 20 mM HEPES supplemented with 1 mM PMSF for 20 minutes at 4 ° C.
  • the lysate is centrifuged at 10,000 g and the supernatant frozen at -80 ° C. These supernatants are clarified using non-immune goat serum (1/100) and
  • Protein A-Sepharose (6MB, Pharmacia) at 4 ° C for 2 hours or overnight. After centrifugation, the supernatants are incubated with a goat antiserum directed against gp70-SU of Rausher Leukemia Virus (RLV) at 1/100 th for 1 hour at 4 ° C.
  • RLV Rausher Leukemia Virus
  • Protein A-Sepharose 40% in RIPA buffer 150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% Deoxycholate, 1% TritonlOOX, 0.1% SDS
  • RIPA buffer 150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% Deoxycholate, 1% TritonlOOX, 0.1% SDS
  • the effector cells carrying the envelope are seeded at 20% confluence. Three to four hours later, three times more target cells are added.
  • the coculture is incubated for 24 hours at 37 ° C. and then fixed with a 0.5% solution of glutaraldhéhyde in PBS.
  • the nuclei are firstly colored using a May-Griinwald solution (Sigma diagnostics, USA) and then the cytoplasms with Giemsa (Merk, D) diluted to 1/20. The number of syncytia on a square centimeter is reported or relativized between the envelopes.
  • amphotropic and ecotropic murine leukemia virus envelope TM subunits are equivalent mediators of direct membrane fusion: implications for the role of the ecotropic envelope and
  • An amphotropic virus receptor is a second member of the gibbon ape leukemia virus receptor family. Proc Natl Acad Sci USA. 91: 1168-1172.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond: soit à la séquence riche en proline; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, ou, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV; ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope; ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV; et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline; soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

Description

UTILISATION D'UNE SEQUENCE RICHE EN PROLINE POUR AUGMENTER LE CARACTERE FUSOGENIQUE D'ENVELOPPES DE RETROVIRUS
L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour augmenter le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
L'entrée d'un rétrovirus dans une cellule cible dépend de la reconnaissance d'une protéine de surface spécifique, appelé récepteur, par la sous unité de surface (SU) de l'enveloppe virale, suivi par la fusion des membranes qui est médiée par le peptide fusion localisé à l'extrémité amino terminale de la sous unité transmembranaire (TM) (29). Une voie d'entrée dépendante du pH et une voie d'entrée indépendante ont l'une et l'autre été décrites pour les rétrovirus (13), mais les déterminants et le processus impliqués dans l' activation de la fusion suite à la reconnaissance du récepteur restent inconnus. L'identification des ces étapes est essentielle pour la compréhension du mécanisme qui module l'infection ainsi que transfert de gènes par les rétrovirus.
Les glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales qui s'assemblent en trimère, sont un complexe comprenant une sous unité de surface (SU) et une composante transmembranaire (TM) (10). Pour tous les virus enveloppés, les interactions initiales de cette glycoprotéine avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) conduisent à des réarrangements conformationnels de l'enveloppe nécessaires à l'exposition du peptide fusion (30). Les déterminants de l'enveloppe et la séquence des événements causant ces changements conformationnels sont bien détaillés pour les orthomyxovirus qui nécessitent l'environnement acide des vésicules d'endocytose pour leur entrée (24).
Pour les rétrovirus, pour lesquels une voie indépendante du pH a aussi été décrite, les déterminants précis et les étapes, menant de la reconnaissance du récepteur à l' activation de la fusion, restent non élucidés. Le récepteur Pit-2 de l'enveloppe amphotrope des virus de leucémie murine (14, 28) est présent dans la plupart des espèces incluant l'homme, alors que les récepteurs fonctionnels des enveloppes écotropes sont limités aux cellules de rat et de souris (19). La reconnaissance de l'un ou l'autre de ces récepteurs influence l'efficacité de fusion, mais l'enveloppe écotrope induit plus facilement la fusion cellule-cellule et la formation de syncytia, comme testé avec les cellules de rat XC, que les enveloppes amphotropes (17).
Les domaines structuraux partagés par l'enveloppe écotrope de Moloney (MoMLV) et l'enveloppe amphotrope (MLV-4070A) comprennent : (i) un domaine amino-terminal de liaison au récepteur (noté BD) d' approximativement 200 acides aminés (a.a.) (3, 7); (ii) la région riche en proline de 45 à 59 a.a. de long, identifiée par PRO dans les constructions chimériques décrites ci-après (27) ; (iii) une séquence carboxy-terminale de la SU (noté C) de 160 a.a. impliquée dans l'interaction avec la TM; (iv) un ectodomaine de la TM de 134 a.a. désigné ici par TM, portant un peptide fusion amino-terminal potentiel identifié par analogie de séquences aux peptides fusions d'autres protéines d'enveloppe de virus enveloppés (11) ; (v) un peptide d'ancrage à la membrane de 28 a.a. et (vi) une queue cytoplasmique contenant le petit peptide R carboxy-terminal dont le clivage tardif dans les virions, augmente la fusogénicité de l'enveloppe (20). Alors que les domaines amino-terminal BD et PRR de l'enveloppe écotrope et amphotrope ne partagent que 33% et 43% a.a. d'homologie, respectivement, tous les autres domaines ont plus de 80% de similitude (Fig. 1A).
L'un des objets de l'invention est de fournir des séquences riches en prolines qui augmentent le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus. L'un des objets de l'invention est de fournir des protéines chimères ou mutées dont le caractère fusogénique est amélioré.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond : - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 1OA1, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope, ou
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,
- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
On a constaté de façon inattendue qu'il y a une augmentation du caractère fusogénique d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou d'un MLV MCF ou d'un MLV 1OA1 ou d'un GALV ou d'un MLV xénotrope ou d'un FeLV dans les cas suivants : - soit par remplacement de leur séquence riche en proline par la séquence riche en proline homologue d'un MLV écotrope,
- soit par mutation ponctuelle de la séquence riche en proline dudit MLV amphotrope ou dudit MLV MCF ou dudit MLV 1OA1 ou dudit GALV ou dudit MLV xénotrope ou dudit FeLV telle qu'il y ait suppression d'au moins un β- turn.
La région riche en proline s'organise probablement en hélice poly-proline, une structure secondaire constituée de « béta-turns » qui sont des repliements de la chaîne peptique de 180°, incluant le plus souvent une proline. Ces courbures sont agencées différemment entre les régions PRO (région riche en proline) des enveloppes écotrope et amphotrope. Cette dernière contient 11 « béta-turns » agencés régulièrement, dont 4 dans son extrémité N-terminale et 7 dans son extrémité C-terminale. La région PRO de l'enveloppe écotrope ne contient que 7 « beta-turns », dont 2 seulement dans son extrémité N-terminale.
L'expression « mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline » signifie :
- délétion des 4 acides aminés formant le β-turn, ou - mutations ponctuelles d'un ou plusieurs de ces 4 acides aminés, , notamment mutation de la proline responsable du repliement à 180° de la chaîne polypeptidique, telles que la probabilité d'avoir un β-turn est inférieure à 0.8 selon l'algorithme de Chou et Fassman. A titre d'exemple, la proline est avantageusement remplacée par l'isoleucine, la valine ou l'alanine.
Comme souches appropriées de MLN écotrope, on peut citer la souche Moloney MLV, Friend MLV (23).
Comme souches appropriées de MLV amphotrope, on peut citer la souche 4070A (16).
Comme souches appropriées de MLV MCF, on peut citer la souche MLF MCF 247 (9).
Comme souches appropriées de GALV, on peut citer la souche Seato (Delassus ét al , 1989, Virology 173 :205-213). Comme souches appropriées de MLV xénotrope, on peut citer la souche
ΝZB.IU.6 (15).
Comme souches appropriées de FeLV, on peut citer FeLV-C-SARMA FSC (21).
Comme souches appropriées de MLV 10A1, on peut citer (Ott et al. , 1990 (16)).
L'expression "améliorer le caractère fusogénique" signifie que l'enveloppe rétrovirale « améliorée » de l'invention possède une capacité mesurable, par rapport à l'enveloppe parentale, à mieux accomplir les étapes post-liaison du processus d'entrée viral et consistant in fine à la fusion moléculaire des membranes virales et cellulaires.
L'amélioration du caractère fusogénique peut se mesurer selon l'un ou l'autre des deux tests suivants :
- test de formation de syncytia après co-culture entre des cellules cibles, exprimant le récepteur retroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, et des lignées cellulaires préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines, - test d'infection de cellules cibles, exprimant le récepteur retroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ces récepteurs (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale non mutée et par moins de 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale chimère ou mutée ; ces valeurs étant données comparativement au titre infectieux des virus comportant les enveloppes parentales et parentale chimère ou mutée sur des cellules XC dans des conditions définies dans le tableau IB de l'exemple.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope est celle représentée à la figure 7.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope est celle représentée à la figure 8. La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF est celle représentée à la figure 9.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un GALV est celle représentée à la figure 10.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 est celle représentée à la figure 11.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope est celle représentée à la figure 12.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un FeLV est celle représentée à la figure 13. Par séquence riche en proline d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, on entend également celle comportant des mutations, suppression ou addition d'acides aminés telle qu'il n'y ait pas modification de l'enchaînement des β-burn
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation telle que définie ci-dessus d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Par « domaine fonctionnel », on définit toute séquence polypeptidique individualisée sur le plan structural et capable d'accomplir une fonction biologique déterminée.
Par « domaine de liaison », on définit le domaine fonctionnel porté par la partie N-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable de se lier au récepteur retroviral. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 31 à 237 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.
Par « domaine C », on définit on définit le domaine fonctionnel porté par la partie C-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d' interagir avec la sous-unité TM. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 300 à 458 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.
Par « domaine TM », on définit le domaine porté par l' ectodomaine de la sous-unité TM de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d' interagir avec la sous-unité SU et d'accomplir la fusion entre membranes virales et cellulaires lors du processus d'entrée retroviral. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 459 à 592 de la séquence peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope.
Le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous-unité transmembranaire peuvent être modifiés de manière à altérer leurs capacités fonctionnelles en vue : - d' interagir avec d'autres molécules, telles que des molécules de surface
(antigènes, récepteurs de facteurs de croissance, etc.), par le biais de l'insertion de peptides ou de domaines proteiques présentant une affinité pour ces molécules,
- de renforcer la stabilité de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale, - d'augmenter la capacité fusiogène de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale. L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, laquelle séquence riche en proline correspond :
- soit à la séquence riche en proline
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,
- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
L'invention concerne également, à titre de produit nouveau, une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10 Al ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie C-terminale » la séquence d'acides aminés correspondant à la deuxième moitié de la région riche en proline. L'invention concerne également une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie
N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie N-terminale » la séquence d'acides aminés correspondant à la première moitié de la région riche en proline. L'invention concerne également les protéines mutées contenant une séquence riche en proline et dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en proline est mutée de telle sorte qu'il y a suppression d'au moins un β-turn.
Plus précisément, l'invention concerne une protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
Cette protéine mutée présente par rapport à la protéine non mutée correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
L'invention concerne également les protéines chimères contenant une séquence riche en proline dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en proline est remplacée par la séquence riche en proline homologue de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV écotrope. Plus précisément, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente par rapport à la protéine d'origine correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée. Dans les groupes respectifs des protéines mutées ou chimères telles que défîmes ci-dessus, il peut également y avoir remplacement de l'un au moins de leurs domaines fonctionnels par le domaine fonctionnel homologue de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un
MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle :
* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope,
* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle :
* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline),
* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
Les protéines mutées ou chimères de l'invention présentent avantageusement l'une au moins des propriétés suivantes :
- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur retroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou des lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines de l'invention,
- il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur retroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère de l'invention, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur (c'est-à- dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée de l'invention, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC, dans les conditions d'infection telles que définies dans les exemples et notamment à propos du tableau 1B ci-après.
On dispose donc notamment de deux tests permettant de caractériser les protéines mutées ou chimères de l'invention.
L'un de ces tests est la formation de syncytia entre des cellules cibles et des lignées cellulaires préalablement transfectées par un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines chimères ou mutées de l'invention (et susceptibles de reconnaître un récepteur retroviral situé sur lesdites cellules cibles).
Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de souris SCI, Mus Duni, les cellules humaines TE671, ainsi que les cellules de rat XC. Les lignées cellulaires utilisées peuvent produire ou non des particules
Gag-Pol de MLV.
Les lignées cellulaires peuvent produire ou non des particules Gal-Pol de MLV ou d'autres rétrovirus de mammifères de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-1. Un autre test de caractérisation des protéines mutées ou chimères de l'invention consiste à infecter des cellules cibles exprimant un récepteur retroviral susceptible d'être reconnu par une protéine chimère ou mutée de l'invention, par l'intermédiaire de particules virales contenant ces protéines chimères ou mutées. Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de rat XC et XC-A-ST, ces dernières étant dérivées des cellules XC par transfection d'un plasmide exprimant le domaine de liaison de l'enveloppe rétrovirale amphotrope capable d'occuper le récepteur retroviral amphotrope.
Comme particules virales, on peut utiliser celles produites par les rétrovirus MLV ou autres rétrovirus de mammifères de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-1. Cette infection est effectuée dans des conditions limitantes, c'est-à-dire telles que la densité du récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une glycoprotéine d'enveloppe ni mutée, ni chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe mutée ou chimère de l'invention correspondant à la susdite enveloppe ni mutée, ni chimère.
La comparaison est effectuée par rapport au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non chimère et non mutée ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles telles que des cellules XC.
Cette infection est comparativement effectuée sur deux types cellulaires, le deuxième étant directement dérivé du premier et a pour effet de réduire le nombre de récepteurs rétroviraux dispombles, c'est à dire telle que la diminution de l'expression de surface du récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale ni mutée, ni chimère.
On compare alors cette valeur à celle obtenue pour des virus comportant l'enveloppe chimère ou mutée. Une diminution de moins de 100 des titres infectieux des virus comportant la susdite enveloppe chimère ou mutée entre les deux types cellulaires indique donc une amélioration du caractère fusogénique de cette dernière.
Des séquences riches en proline avantageuses selon l'invention correspondent à l'une des séquences suivantes : A2
A3 A3Mo
A4 C2 C3 C4 C5
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A2 comporte la suppression du deuxième β-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A3 comporte la suppression du troisième β-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A3Mo comporte la suppression du troisième β- turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A4 comporte la suppression du quatrième β-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut. Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un
MLV amphotrope, la séquence C2 comporte la délétion des β-turns 9 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C3 comporte la délétion des β-turns 11 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C4 comporte la délétion du dernier β-turn (13°) qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C5 comporte la délétion des 11 ° et 12° β-turns qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut. Des protéines chimères avantageuses selon l'invention, correspondent à l'une des séquences suivantes :
- PROMO
- PRO FR - BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO
La séquence PROMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Moloney).
La séquence PRO FR correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Friend).
La séquence BD PRO MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine de liaison a été remplacé par le domaine de liaison homologue du MLV écotrope. La séquence PRO CMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine C a été remplacé par le domaine C homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO TM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine TM a été remplacé par le domaine TM homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO CTM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle les domaines respectifs C et TM ont été remplacés respectivement par les domaines C et TM homologues du MLV écotrope. Des protéines chimères avantageuses selon l'invention comportent l'une des séquences riches en proline correspondant à l'une des séquences suivantes : A2 A3 A3Mo
A4 C2 C3 c4 C5
et sont telles que l'un au moins de leurs domaines fonctionnels suivants : domaine de liaison, domaine C, domaine transmembranaire, est remplacé par le domaine homologue de MLV écotrope. On montre dans le cadre de la présente invention que la région riche en proline (PRR) de l'enveloppe des virus de leucémie murine (MLV), localisée entre le domaine de liaison au récepteur de la partie amino terminale de la SU et le domaine d'interaction avec la TM de la partie carboxy-terminale de la SU, sert d'intermédiaire dans les changements de conformation de l'enveloppe et dans l' activation de la fusion. De plus, on montre que les beta-tura potentiels de la région riche en proline déterminent la stabilité de l'association SU-TM et le seuil d' activation de la fusion cellule-cellule et de la fusion virus-cellule.
Afin d'identifier la (ou les) région(s) responsable(s) de la plus grande fusogénicité de l'enveloppe écotrope des MLVs, on a généré une série d'enveloppes chimères dans lesquelles les domaines d'enveloppes amphotropes
BD, PRO, C et TM sont échangés avec leur homologue de l'enveloppe écotrope (Fig 1B). Les enveloppes résultantes sont alors identifiées selon le(s) domaine(s) écotrope(s) substitué(s). La fusion cellule à cellule est évaluée par la formation de syncytia après une coculture de 24 heures entre différentes cellules cibles (indicatrices) et des lignées cellulaires, produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (5), préalablement transfectées avec l'une ou l'autre des enveloppes. Bien que le niveau d'expression à la surface cellulaire des enveloppes parentales et chimères soient similaires (Fig. 4A), deux phénotypes différents de fusion cellules-cellules sont observés. Les enveloppes CMO et TMMO, tout comme l'enveloppe sauvage MLV -4070 A, induisent faiblement des syncytia. Cependant, les enveloppes BDMO, PROMO et PROFR induisent fortement la formation de syncytia, similaires à ceux induits par l'enveloppe écotrope. (Fig
2). La formation de syncytia n'est pas affectée par la présence ou le manque de particules Gag-Pol (données non montrées), montrant que la fusion mesurée dans ce test se produit par des contacts directs cellules-cellules plutôt que des contacts cellulaires médiés par les particules virales. Des comptes rendus antérieurs indiquent que la fusogénicité élevée de l'enveloppe BDMO est due principalement à sa capacité à interagir avec le récepteur écotrope (18). Cependant, une importante fusogénicité est également observée avec les chimères portant le domaine BD amphotrope (Figs. 1 et 2) avec tous les types cellulaires utilisés, incluant les cellules cibles de rat, de souris et d'homme, présentant en plus ou non le récepteur écotrope (données non montrées). Ainsi, les différences observées, lors de la formation de syncytia, entre les enveloppes amphotropes parentales et chimériques sont dues à des nouvelles propriétés, différentes de l'interaction du BD avec le récepteur.
Comme décrite pour les virus de leucémie féline (8) et comme suggérée par l'étroite apparenté avec les MLV, la répétition régulière de proline dans la PRR entraîne peut-être son repli en hélice poly-proline à "beta-turn » (27), une structure secondaire qui exerce des forces "élastomériques", pouvant remplir la fonction de
"ressort moléculaire" (26). A cause de la localisation critique de la PRR, entre les domaines BD et C qui influencent tous deux la fusion, son rôle dans la fusion a été évalué directement. Des différences dans le nombre et l'arrangement des "beta-turn" prédits dans la PRR des enveloppes 4070A, par rapport à celle du MoMLV, laissent prévoir un ressort plus réactif pour ce dernier ce qui pourrait expliquer la fusogénicité accrue du PROMO. Les mutants ponctuels ou de délétion, C2, C3, C4 et C5, conçus pour supprimer certains des sept "beta-turn" carboxy -terminaux de la PRR amphotrope, ont été testés dans le test de fusion cellule-cellule XC. Ils se sont avérés faiblement fusogéniques comme l'enveloppe parentale amphotrope (Fig. 3B). Les
"beta-turn" induits par les prolines de la PRR sont moins entremêlés dans la partie amino-terminale que dans l'extrémité carboxy terminale. Ainsi, chacun des quatre
"beta-turn" potentiel de l'enveloppe 4070A ont pu être supprimés individuellement par substitution d'une proline par une valine, une alanine ou une isoleucine, donnant les mutants Al, A2, A3, A3MO et A4 (Fig. 3C). Un second acide aminé a été substitué dans les mutants A2 et A3 afin d'éviter la formation d'hélice alpha ou de feuillet beta potentiels, absent à l'origine dans les prédictions de structure de la PRR des MLV
(non montré). Les enveloppes Al et A4, pour lesquelles, respectivement, le premier ou le quatrième "beta-turn" amino terminal a été muté, conservent une répétition régulière de trois "beta-turn" contigus et elles n'induisent pas une formation de syncytia augmentée (Table 1). Par opposition, les enveloppes A2 et A3 dans lesquelles la continuité de ces "beta-turn" est interrompue (Figs. 3C et 3D), sont très fusogéniques (Tableau 1), démontrant ainsi l'importance critique des "beta-turn" contigus de la PRR dans la "médiation" de la fusion suite à la reconnaissance du récepteur. Dans le but de tester si cette fusogénicité accrue était due à un besoin inférieur en molécule Pit-2, on a comparé la fusion cellule-cellule en utilisant des cellules XC ou XC-A-ST. Dans ces dernières, l'expression constitutive de BD amphotrope réduit la quantité de récepteur Pit-2 fonctionnel (Tableau 1).
L'interférence est efficace envers l'enveloppe MLV-4070A alors qu'une fusogénicité élevée est toujours observée avec les enveloppes PROMO, PROFR, A2 et A3. Néanmoins, la fusion est toujours dépendante de Pit-2 puisque des cellules CHO n'exprimant pas Pit-2 fusionnent seulement après l'expression de novo de Pit-2 (non montré). Ainsi, des mutations dans les "beta-turn" de la PRR semblent abaisser le seuil d' activation de la fusion prenant part après la reconnaissance du récepteur.
Après la fusion cellule-cellule, on a examiné la fusion cellule-virus en comparant l'infectivité des virions portant l'enveloppe parentale ou chimère. Les titres sont équivalents sur les cellules de rat XC (Tableau 1), de souris, d'homme et sur les CHO transfectées avec le gène d'expression du récepteur Pit-2. De manière surprenante, les chimères hautement fusogéniques PROMO et PROFR, ainsi que les mutants ponctuels A2 et A3 ont conduit à des titres indétectables ou significativement réduits sur toutes les cellules testées. Les autres enveloppes, confèrent des titres dans une gamme de 10e6-10e7 unités infectieuses par ml (u.i./ml) sur les cellules XC, similaires à ceux obtenus avec les deux enveloppes parentales 4070 A et MO. Bien que l'infectivité des virions générés avec l'enveloppe amphotrope parentale soit dramatiquement réduite sur les cellules XC-A-ST, tous les mutants de la PRR infectieux, à l'exception du Al, sont significativement moins sensibles à l'interférence (Tableau 1). Le fait que les mutants de la partie carboxy -terminal de la PRR n'exhibent pas de modification dans la fusogénicité cellule-cellule mais montrent néanmoins une augmentation de l'infectivité (fusion virus-cellule), démontre que les motifs amino, mais aussi carboxy terminaux, influencent la fusogénicité. Les tests de liaisons aux récepteurs, effectués en utilisant un anticorps dirigé contre la SU, montrent que l' affinité Pit-2/SU n'est pas significativement altérée pour ces enveloppes (non montré). L'infection de CHO transfectées exprimant Pit-2, par opposition au défaut d'infection des CHO parentales, confirme la nécessité de Pit-2 pour l'entrée des virions.
Puisque la faible infectivité des virions portant les enveloppes mutantes fusogènes en tests cellules-cellules est due à une perte de SU accrue (Fig. 4), la PRR paraît jouer un rôle critique dans l'association SU/TM et la conformation de l'enveloppe. Le relargage accru de SU, pour les mutants PROMO, PROFR, A2 et A3, suggère que la PRR exerce sa fonction de régulation de la fusion en interagissant avec des régions adjacentes, et que la destruction de ces interactions stimule la fusion. La combinaison de PRR écotropique avec des régions homologues avales, comme dans les chimères PROCMO, PROTMMO et PROCTMMO, ou avec le domaine amont
BD, comme pour l'enveloppe BDPROMO (Fig. 1C), augmente la stabilité, comme estimé avec la perte de SU (non montré) (Fig. 1).
Finalement, on démontre qu'après la reconnaissance du récepteur, PRR est un déterminant clef des changements de conformation de l'enveloppe et de la fusion membranaire. De plus, l'arrangement caractéristique des "beta-turn" de la PRR en association avec les domaines avals C et TM, confère des propriétés distinctes entre ces enveloppes MLV.
Les applications potentielles de l'invention sont les suivantes :
- thérapie génique ex vivo ou in vivo pour le transfert de gène dans des cellules exprimant un nombre limité de récepteurs rétroviraux, par les vecteurs rétroviraux dérivés des rétrovirus de type C, mammifères ou des lentivirus comportant : . des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites dans l'invention,
. des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites dans l'invention, ainsi qu'un peptide ou un domaine protéique capable de rediriger la liaison du vecteur retroviral vers une cible moléculaire spécifique.
I. Légendes des figures
Figs. 1A, 1B, 1C et 1D : Représentation schématique des enveloppes chimères et de leurs propriétés.
Fig. 1A. Les boites vides sont des séquences dérivées du MLV amphotrope, les boites remplies sont des séquences issus du MLV écotrope de Moloney (noire) ou MLV écotrope de Friend (grise) et les boites hachurées sont des séquences communes à ces deux MLV. BD, domaine de liaison au récepteur; PRO, région riche en proline;
C, domaine carboxy terminal de la SU; TM, ectodomaine et domaine d'ancrage de la sous unité TM. Pour chaque domaine, leur pourcentage d'identité, ainsi que les quatre premiers acides aminés N-terminaux, sont indiqués. Un codon stop prématuré (flèche verticale) est introduit dans la queue cytoplasmique de la sous unité TM du MLV amphotrope pour générer la glycoprotéine d'enveloppe mutante fusogénic ARless.
Fig. 1B. Les mutants de simple substitution. Fig. 1C. Les mutants de substitution combinés.
Fig. 1D. Les résultats des tests de fusion cellule-cellule: (-), absence de syncytia; (+), présence de syncytia seulement dans une coculture avec les cellules XC; (+ +), présence de syncytia à la fois dans une coculture avec des cellules de rat
XC mais aussi avec des cellules interférentes XC A-ST. Les résultats des tests d'infection: (-), moins de 10e2 lacZ u.iJml; (+) et (+ +), plus de 10e2 lacZ u.i./ml; (+ +); enveloppes avec un seuil d'activation de la fusion réduit, capables d'efficacement infecter les cellules interférentes XC-A-ST avec un titre supérieur à 10e2 lacZ u.iJml. Fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21 : Tests de fusion des mutants de simple substitution avec des cellules XC.
Des cellules TE671 transfectées avec les vecteurs d'expression des glycoprotéines d'enveloppe chimères indiquées (Fig 1) sont cocultivées avec des cellules indicatrices XC pendant 24 heures. Grossissement x250.
Figs. 3A, 3B, 3C et 3D : Mutagenèse de la région riche en proline amphotrope 4070A.
Fig. 3 A : Alignement de la PRR du MLV de Moloney (Mo), de Friend (Fr) et 4070A (A).
Fig. 3B : Mutants ponctuels (acides aminés en petits caractères gras) ou de délétion (tirets) de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A.
Fig. 3C : Mutants ponctuels de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A. Les acides aminés changés ou insérés sont mis en évidence en petits caractères gras.
Fig. 3D, 3E, 3F, 3G : Profils de probabilité des "beta-turn" des PRR des MLV 4070 A (4070A), Moloney (Moloney) et des mutants ponctuels de la PRR du MLV 4070A dont le deuxième (A2) ou troisième (A3) bêta turn a été supprimé. Les valeurs de l'axe y représente la probabilité de beta-turn p(turn)*10e-4 pour chaque résidus du peptide (sur l'axe x). L'analyse des beta-mrn a été effectué grâce au logiciel PC/Gene (Version 6.26, IntelliGenetics, Belgium).
Fig. 4 : Immunoblots des glycoprotéines d'enveloppe amphotrope dont la fusogénicité est augmentée. Les cellules ont été transfectées avec les enveloppes indiquées dans les Figs 1 et 3 et l'expression de leur SU et de leur précurseur d'enveloppe (PR) est estimée (cell lysates). L'instabilité de l'enveloppe est montrée par l'expression de surface diminuée de la SU relativement au PR (préparations de membrane), son relargage de la SU (shedding) accru dans le milieu de culture (surnageant) et dans les virions. Les transferts de protéine (western blots) ont été révélés avec les anticorps indiqués. Fig. 5 : elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV écotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche Moloney).
Fig. 6 : elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV amphotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche 4070 A).
Fig. 7 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de Mo MLV (Moloney MLV).
Fig. 8 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-4070A.
Fig. 9 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-MCF (souche 247).
Fig. 10 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de GALV, souche Seato.
Fig. 11 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV 10A1.
Fig. 12 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV xénotrope, souche NZB.1.V6.
Fig. 13 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de FeLV A.
Fig. 14 : elle représente la séquence de A2.
Fig. 15 : elle représente la séquence de A3.
Fig. 16 : elle représente la séquence de A3Mo. Fig. 17 : elle représente la séquence de A4.
Fig. 18 : elle représente la séquence de C2.
Fig. 19 : elle représente la séquence de C3.
Fig. 20 : elle représente la séquence de C4.
Fig. 21 : elle représente la séquence de C5.
Fig. 22 : elle représente la séquence de PROMO.
Fig. 23 : elle représente la séquence de PRO FR.
Fig. 24 : elle représente la séquence de BD PRO CMO.
Fig. 25 : elle représente la séquence de PRO CMO.
Fig. 26 : elle représente la séquence de PRO CTM MO.
Fig. 27 : elle représente la séquence de PRO TM MO.
Tableau 1 :
A. Résultats des tests de fusion cellule-cellule.
enveloppe index de fusionaexprimée à la surface XC XC-A-ST
_b 0,02+0,01 0,02+0
MOc 15±2 14±1
Ad 0,2+0,1 0,05+0,02
ARLesse 74 ±4 0,85+0,03
PROMOc 17+3 16+3
PROFRc 18±3 23 ±6
A2C 13 ±1 17±1
A3C 14±1 17+3
a : index de fusion calculé selon la formule :
(N-S)/T (N, nombre de noyaux dans les syncytia ; S, nombre de syncytia ; T nombre total de noyaux) b : cellules non transfectée. c : syncytia contenant plus de 20 noyaux d : syncytia contenant moins de 4 noyaux e: syncytia contenant plus de 40 noyaux avec les cellules XC et moins de 10 noyaux avec les cellules XC A-ST.
B. Résultats des tests d'infection.
enveloppe Titres infectieuj ,a exprimée sui niveau les virions XCXC-A-ST d'interférence
MO 7.1xl06 6.1x10° 1
A lxlO7 6.4xl03 1,369
PROMO 2.2x10' 1x10' na
PROFR « lxlO1 < 1x10' na
Al 8.4xl06 2.3xl03 3,138
A2 < lxlθ' < 1x10' na
A3 7.8x10' 3x10' na
A3MO 1.2xl07 3.3xl04 302
A4 5.7xl06 8.1xl03 605
C2 7.6xl06 5.7X105 11
C3 5 4xl06 4.7xl05 10
C4 2.4xl06 1.7X105 12
C5 9.4xl06 2.7x10" 299
a : lacZ unités infectieuses par ml (u.iJml) b : les mveaux d'interférence sont calculés selon la formule (titre(XC]/titre [XC.A.s-π) X (titre MO (XC-A titre M0 ιχc])- na : non applicable
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Lignées cellulaires.
Les cellules TELacZ contiennent le vecteur retroviral MFGnlsLacZ (25) responsable de l'expression d'une Beta-galactosidase nucléaire. La lignée cellulaire
TELCeBό (5) dérive de la lignée TELacZ et a été obtenue par transfection d'un plasmide exprimant les protéines gag et pol de MoMLV. Ces cellules produisent donc des particules rétrovirales non infectieuses, car dépourvues d'enveloppes, véhiculant le gène marqueur nlsLacZ. Les cellules TELCEB6, XC, RD et CEAR13 (12) sont cultivées en milieu
DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS, Life-Technologies). Le milieu de culture des CEAR13 est de plus supplémenté avec de la proline (Sigma) à 10 μg/μl. La lignée NIH3T3 (ATCC CRL 1658) est cultivée en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau- né (Life-Technologies).
Les cellules XC-A-ST ont été obtenues par transfection stable dans les cellules XC du plasmide pA-ST (5) exprimant le fragment N-terminal de la SU du virus MLV-4070A capable de lier et bloquer le récepteur amphotrope.
II.2. Plasmides et construction des mutants.
Les plasmides codant pour les enveloppes amphotrope 4070A (FBASALF)
(5), écotrope de Moloney (FBMOSALF) et écotrope de Friend C57 (FB3) permettent l'expression de l'enveloppe. Les gènes d'enveloppe sont sous le contrôle du LTR (5) du MLV de Friend FB29. De plus ces plasmides contiennent le gène marqueur phléo, permettant la sélection par la phléomycine.
Pour générer les diverses constructions d'enveloppes mutantes, une technique de mutagenèse par PCR a été utilisé.
Pour la construction Rless (20), un fragment d'ADN a été obtenu par PCR
(amplification par polymérase en chaîne) sur l'enveloppe MOMLV (23) au moyen des oligonucléotides OURLess 5 '-TTC TAT GCG GAC CAC ACA GGA et OLRLess 5'-
ATC TCA GTA GTC CAG GCT TTA TGA TAG TCG ACA TGC AT. Après digestion par les enzymes Spel et AccI, ce fragment a été sous-cloné entre les sites Spel et Clal du plasmide FBMOSALF. Un fragment Ndel/Clal a alors été retiré de ce dernier plasmide, et a été remplacé par Ndel/Clal provenant du vecteur FBASALF. Il en résulte un vecteur d'expression pour une enveloppe amphotrope contenant un codon stop prématuré quelques nucléotide en amont du codon stop normal. Cette modification réduit la longueur de la partie cytoplasmique de la glycoprotéine amphotrope et suffit à la rendre très fusogénique et inductrice de syncytia en culture cellulaire (20).
Pour la construction des enveloppes chimères PROMO et PROFR, un fragment PCR correspondant à la région riche en proline des enveloppes des virus
Moloney-MLV (MO) et Friend-MLV (FR), avec un site Apal et un site Kpnl créés au début et à la fin de cette région ont été généré grâce aux nucléotides : Up MO Apal 5' -CC A ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG et Low MO Kpnl 5'-AAC GTG GTA CCC GCC GGT GGA AGT TGG G pour la PCR sur le plasmide FBMOSALF; Up FRA pal GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG et Low FR Kpnl GAA
TGC GGT ACC TGC TGG CGG GGG CTG AGT GGG pour la PCR sur le plasmide FB3. Les fragments digérés Apal/Kpnl sont clones entre les sites Apal (position 653) et BamHI (position 802) de l'enveloppe 4070A à l'aide d'un fragment adaptateur Kpnl/BamHI généré par PCR sur le plasmide FBASALF à l'aide des oligonucléotides Up A Kpnl 5 ' -T ATGCGGTACCGG AGATAGACTACT AGCTC et Low A BamHI
5 ' -GGTAGTAGG ATCCTGAGCCGG . Les autres enveloppes chimères ont été générées à l'aide des enveloppes décrites ci dessus par sous clonage de différents fragments. Le plasmide FBASALF a été ouvert en Xhol-Clal et cet ADN a été utilisé pour cloner les fragments : (i) XhoI-Draϋl de l'enveloppe PROMO et le fragment Draïïl-Clal de l'enveloppe MO, générant l'enveloppe PROCTMMO; (ii) Ncol-Clal de l'enveloppe MO, co-ligué avec un fragment adaptateur Xhol-Ncol de l'enveloppe A, générant l'enveloppe TM MO; (iii) Xhol-Ncol de l'enveloppe MO grâce à un fragment Ncol-Clal de l'enveloppe A, générant la chimère PROCMO. La construction PROTMMO a été obtenue en sous clonant le fragment XhoI-BamHI de l'enveloppe PROMO dans le vecteur portant l'enveloppe TMMO digéré par les mêmes enzymes.
Enfin, la chimère BDPROMO a été faite en co-ligant le fragment DralII-Clal de l'enveloppe PROMO dans le plasmide FBMOSALF, digéré par les enzymes BamHI- Clal, avec un fragment BamHI-DralII de l'enveloppe MO.
Les mutants de la région riche en proline amphotrope ont été générés par la méthode de mutagenèse par PCR. Un oligonucléotide codant ou « sens » (« upper ») 805 Fc (5 '-TCC AAT TCC TTC CAA GGG GC), localisé juste en amont du site Xho
I de l'enveloppe 4070A (à la position 594) (16) a été utilisé en combinaison avec des oligonucléotides fournissant divers sites de restriction (précisés entre parenthèse et dont le site est souligné dans la séquence de l' oligonucléotide) et insérant la mutation souhaitée (les nucléotides ne s 'appariant pas sont indiqués par une lettre minuscule) A2 UpA2 5'-CGA GTC CCC ATA GGG ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C
(Agel), A3MO LowA3MO 5'- GCCCAACCCAGTGCTAGCCGACCAAAGAC (Nhel), A3 P249I/Q251V 5'-CCA GTA TTA atC GAC ptc AGA CTC CCT TC (Aat II); A4 P254I 5'-GAC CAA AGA CTg ata TCC TCA CCA A (EcoRV); C5 P286I/P289L 5' -CTC AAC CTC Cat TAC tAG TCt AAG TGT CCC AC (Spel). Les oligonucléotides complémentaires de ces amorces (LowA2 GGT CGG GTA ATA
CCG GTT GGA TCC CTA TGG GGA CTC G; Low A3 GAA GGG AGT CTg acG TCG atT AAT ACT GG; LowA3MO GTC TTT GGT CGG CTA GCA CTG GGT TGG GC; Low A4 TTG GTG AGG Ata tcA GTC TTT GGT C; Low C5 GGC TGT GGG ACA CTT aGA CTa GTA atG GAG GTT GAG GGT G) ont été utilisés avec l'amorce Low ABamHI s'hybridant au niveau du site BamHI (position 802) de l'enveloppe 4070 A. Les deux fragments générés pour chaque mutant sont digérés avec les enzymes adéquates et ils sont ligaturés dans le plasmide FBASALF, digéré en XhoI-BamHI.
La même stratégie a été utilisé pour les mutants de délétion C2, C3 et C4. L' oligonucléotide 805Fc, s'hybridant en amont du site Xhol, a été utilisé avec les oligonucléotides LowA-C4 Kpnl: ATC TCC GGT ACC GAC ACT TGG ACT TGT AGG GGA GGT TGA GGG, LowA-C3 Kpnl: ATC TCC GGT ACC TGG GGG AGG GGA GGT TGA GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG, et LowA-C2 Kpnl: ATC TCC GGT ACC TGG GGG GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG GGG GTA ACT GGT générant, après digestion, des fragments Xhol-Kpnl. Chaque fragment est co-ligué avec un fragment Kpnl-BamHI, issu de l'enveloppe PROMO, dans le vecteur FBASALF digéré en XhoI-BamHI. Les plasmides exprimant les enveloppes sont transfectés par la méthode de précipité au phosphate de calcium (22) dans la lignée TELCeBό. Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec de la phléomycine (50 μg/ml) et les clones résistants ont été trypsinés en masse. Les cellules à confluence ont été utilisées pour d'une part récupérer des surnageants viraux après une nuit d'incubation dans du milieu normal, et d'autre part pour faire des lysats cellulaires. Les surnageants viraux sont utilisés pour des tests d'infection, des tests de liaison au récepteur, et le reste est soumis à une ultracentrifiigation pour obtenir des culots de virus analysés par immunoblot.
II.3. Immunoblot.
Les cellules productrices de virus sont lysées pendant 10 minutes à 4°C dans un tampon Tris-HCl (pH 7,5), contenant du TritonXIOO 1 %, SDS 0,05%, deoxycholate 5mg/ml, NaCl 150 mM et un cocktail d'inhibiteur de protéases (PMSF 1 mM, Leupeptin 6 mM, Aprotinin 0,3 mM). Ces lysats sont centrifugés 10 minutes à
10 000 g afin de culotter tous les organites, et les surnageants sont congelés à -80 °C jusqu'à l'analyse. Les échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifiigation de surnageants viraux (6 ml) dans un rotor SW41 Beckman (30000 rpm, 1 heure, 4°C). Les culots sont resuspendus dans 80 μl de PBS froid (Phosphate Buffered Saline) (tampon phosphate salin), Life-Technologies) et congelés à -80°C. Les échantillons
(30 μg de lysats cellulaires ou 20 μl de virus purifiés) sont mélangés dans rapport de 5:1 (v/v) à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant 6% de SDS (sodium dodécyl sulfate), 30% beta-mercaptoéthanol, 10% glycérol et 0,06% de bleu de bromophénol, puis dénaturés 3 minutes à 95 °C et analysés sur gel dénaturant d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose, le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris Base Saline (tampon Tris), pH 7,4) en présence de lait écrémé (5%) et de Tween 0,1 % . Les anticorps (Quality Biotech Inc., U.S. A.) provenant d'antisérum de chèvre dirigés contre la gp70-SU de Rausher Leukemia Virus (RLV) ou la p30-CA de RLV ont été utilisés aux dilutions de 1 :2000 et 1 : 10000 respectivement. Un anticorps provenant d'un antisérum de lapin dirigé contre la pl5E-TM a été utilisé à la dilution de 1: 1000. Les "blots" ont été révélés par utilisation d'un anticorps conjugué, couplé à la peroxydase, d'origine lapin ou chèvre dirigé contre les immunoglobulines de chèvre ou de lapin, respectivement (Dako, U.K.), grâce à un kit de chimioluminescence (Amersham Life Science).
II.4. Tests de liaison au récepteur.
Les cellules cibles sont rincées au PBS et décollées par une incubation de 10 minutes à 37 °C dans du versène 0,02% dans PBS. Les cellules sont rincées dans du PBA (PBS contenant 2% de FCS (sérum de veau foetal) et 0,1 % de sodium d'azide qui permet de bloquer l'endocytose membranaire). 106 cellules sont alors incubées pendant 1 heure à 37 °C avec les différents surnageants viraux (2 ml) contenant la SU soluble. Ces surnageants sont déchargés des particules virales précipitées par ultracentrifiigation ou non. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubées en présence d'anticorps monoclonal, de rat ou de souris, dirigés contre la SU (83A25) (6) ou contre la TM (MAb2), respectivement, pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules subissent deux lavages dans du PBA puis sont incubées en présence d'anticorps conjugués, fluorescents, dirigés contre les immunoglobulines de rat (Cayla, F) ou de souris (Dako, U.K.), pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules mortes sont ensuite contre colorées avec de l'iodure de propidium (20 μg/ml) 5 minutes à 4°C. Après deux rinçages dans du PBA, la fluorescence des cellules vivantes est analysée par fluorométrie, FACSCalibur, Beckton Dickinson).
II.5. Test de marquage cellulaire.
Les cellules portant les enveloppes sont lavées, décollées et rincées de la même manière que les cellules cibles du test de binding. 10° cellules sont alors incubées directement avec l'anticorps de rat anti SU (83A25) pendant 1 heure à 4°C.
Les étapes de lavages, d'incubation avec l'anticorps secondaire couplé au FITC et d'analyse au FACS sont identiques au test de binding.
II.6. Tests d'infection. Les cellules cibles NIH3T3 sont ensemencées la veille dans des plaques,
24 puits à une densité de 5.104 cellules par puits. Les cellules sont incubées avec 1 ml de différentes dilutions du stock viral en présence de polybrène à 8 μg/ml (un polycation, inhibiteur des répulsions électrostatiques entre les particules virales et les cellules). Après 3 à 5 heures d'incubation à 37°C, les surnageants sont remplacés par du milieu frais et les cellules sont incubées 2 jours à 37°C. Une fois les cellules fixées avec une solution de glutaraldhéhyde, agent pontant, à 0,5% dans du PBS, elles sont colorées à l'aide d'un substrat, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Beta-D- galactopyranoside ou X-Gal, pendant 12 heures. Les titres viraux sont rapportés en nombre de colonies positives par ml de surnageant viral (LacZ i.uJml).
II.7. Immunoprécipitation.
Une boite de cellules confluantes de diamètre 35 mm est rincé une fois avec du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dubelcco) sans mét ionine, ni cystéine, supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal dialyse afin d'enlever les acides aminés, puis incubée 1 h 30 à 37°C dans ce même milieu. Après un marquage de 45 minutes grâce à la méthionine et la cystéine S35 (100 mCi/ml; TranS35-Label,
ICN Pharmaceuticals), les cellules sont lavées, puis incubées à 37 °C dans du milieu de culture (chasse). Les cellules sont lysées à différents temps dans une solution à 0,5% NP40, 150 mM NaCl, 20 mM HEPES supplémenté avec 1 mM PMSF pendant 20 minutes à 4°C. Le lysat est centrifugé à 10 000 g et le surnageant congelé à -80°C. Ces surnageants sont clarifiés grâce à du sérum de chèvre non immun (1/100) et de la
ProtéineA-Sepharose (6MB, Pharmacia) à 4°C pendant 2 heures ou sur la nuit. Après centrifugation, les surnageants sont incubés avec un antisérum de chèvre dirigé contre la gp70-SU de Rausher Leukemia Virus (RLV) à 1/100 ième pendant 1 heure à 4°C. La protéine A-Sepharose 40% dans du tampon RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 % Deoxycholate, 1 % TritonlOOX, 0,1 % SDS) est ajouté pour 1 heure à 4°C et les complexes sont précipités par centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes. Après trois lavages dans du tampon RIPA, les immunoprécipitats sont séparés sur gel d'acrylamide-12%/SDS. Les protéines sont fixées dans une solution à 25% d'isopropanol et 10% d'acide acétique dans de l'eau et la révélation se fait grâce à un écran P32 Phospholmager (Biorad). II.8. Tests de Fusion.
Deux jours après leur transfection, les cellules effectrices portant l'enveloppe sont ensemencées à 20% de confluence. Trois à quatre heures après, trois fois plus de cellules cibles sont ajoutées. La coculture est incubée 24 heures à 37°C puis fixée avec une solution de glutaraldhéhyde à 0,5% dans du PBS. Les noyaux sont tout d'abord colorés grâce à une solution de May-Griinwald (Sigma diagnostics, USA) puis les cytoplasmes avec du Giemsa (Merk, D) dilué au l/20ème. Le nombre de syncytia sur un centimètre carré est rapporté ou relativisé entre les enveloppes.
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Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation d'une séquence riche en proline poui améliorer le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
2. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond :
- soit à la séquence riche en proline
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, ou
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ,
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope, ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline,
- soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope
3. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire
4. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire .
5. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, laquelle séquence riche en proline correspond : - soit à la séquence riche en proline
. de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
6. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline
7. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
8. Protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
9. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
10. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle :
* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope,
* et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
11. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle :
* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un β-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline), * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
12. Protéine mutée ou chimère selon l'une des revendications 8 à 11 , possédant l'une au moins des propriétés suivantes :
- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur retroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de
MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou de lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines,
- il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur retroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée ou non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe ni mutée, ni chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC.
13. Séquence riche en proline selon la revendication 6 ou 7, correspondant à l'une des séquences suivantes : A2
A3
A3Mo A4 C2 C3
C5
14. Protéines mutées en chimère selon l'une des revendications 8, 9, ou 10, correspondant à l'une des séquences suivantes :
- PROMO
- PRO FR
- BD PRO MO
- PRO C MO - PRO TM MO
- PRO CTM MO
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