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WO1999035269A2 - Procede de controle de la division et/ou de l'elongation de cellules eucaryotes - Google Patents

Procede de controle de la division et/ou de l'elongation de cellules eucaryotes Download PDF

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WO1999035269A2
WO1999035269A2 PCT/FR1999/000021 FR9900021W WO9935269A2 WO 1999035269 A2 WO1999035269 A2 WO 1999035269A2 FR 9900021 W FR9900021 W FR 9900021W WO 9935269 A2 WO9935269 A2 WO 9935269A2
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tonneaul
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protein
type
gene
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PCT/FR1999/000021
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David Bouchez
Philippe Nacry
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Institut National De La Recherche Agronomique - Inra
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to the cloning and expression of genes making it possible to act on the architecture, growth or fertility of plants.
  • the architecture of a higher plant is determined essentially by the control of cell divisions and elongation.
  • the cells of the roots, leaves, stems, and flowers of the plant initially form in the meristems.
  • the conversion of organ drafts to mature organs requires precise control of the elongation of these cells.
  • the organs are present, but have a modified size and shape.
  • the cotyledons smaller in size than those of the wild type, have an increased thickness.
  • the hypocotyle and the root very short and of large diameter, elongate little during development. Numerous root hairs, secondary roots and small, scaly, fleshy leaves appear. After 8 to 10 weeks of cultivation in vi tro, a flower stalk develops with sterile flowers strongly modified, as well as secondary ramifications.
  • the cytoskeleton is involved in cell elongation and the establishment of the division plane.
  • the microtubules organize themselves to form a structure called: "preprophase ring", which will precisely determine the location of the division plane, where the phragmoplast will be formed and the future wall constructed.
  • Microtubule polymerization inhibitors also block cell lengthening processes, revealing their role in this process.
  • the inventors studied the organization of the cytoskeleton in wild seedlings of Arabidopsis thaliana and in seedlings of the tonl mutant. Thanks to immuno-archings performed using tubulin-specific antibodies, they have thus shown that at interphase, the cortical microtubules of wild plant cells are arranged perpendicular to the elongation axis of the cell, while they are distributed randomly in the mutant cells. In mutant cells, the achromatic spindle is correctly positioned but the preprophase ring is never present, which results in a random orientation of the division plane [TRAAS et al., Publication cited above]. The Inventors have now isolated at
  • TONNEAUl gene whose mutation is responsible for the “TONNEAU” phenotype described above. They also identified homologs of this gene in other plants, in particular rice, and found that it was very conserved in higher plants (we observe for example 77% identity between the TONNEAUl gene of Arabidopsis and that of rice, and 36 contiguous amino acids identical in the two proteins).
  • the sequence of a genone DNA clone of Arabidopsis thaliana containing 2 copies of the TONNEAUl gene, called TONla and TO-Vlb, is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1.
  • the sequences of the proteins TONla and TONlb are respectively represented under the numbers SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the sequence coding for a TONNEAU1 protein from rice and the corresponding peptide sequence are respectively represented under the numbers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the subject of the present invention is a method for controlling the process of division and / or elongation of eukaryotic cells, and in particular of plant cells, characterized in that the expression and / or activity of a TONNEAUl type protein in said cells.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid sequence derived from all or part of the sequence of a TONNEAUl type gene for obtaining a product making it possible to modify the expression and / or the activity of a TONNEAUl type protein in eukaryotic cells, and in particular plant cells.
  • TONNEAUl type protein means not only one of the proteins (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5) encoded by the TONNEAUl d genes. 'Arabidopsis or rice represented in figure 3, and in the list of sequences in the appendix, but also all the homologous proteins, which includes in particular the TONNEAUl proteins encoded by genes orthologous from other plants.
  • sequence of a TONNEAUl gene is understood to mean not only the sequence of any of the TONNEAUl genes from Arabidopsis or rice represented in FIG.
  • nucleic acid sequences derived from all or part of the sequence of the TONNEAU1 gene include in particular:
  • the modification of the expression and / or the activity of proteins of the TONNEAUl type in plant cells makes it possible, by acting on their development, to control the morphology and architecture of said plants, and in particular to change the size of the plant or that of some of these organs.
  • a TONNEAUl protein in a plant or in certain organs thereof, a reduction in the size of said plant or of said organs will be induced; on the contrary, if one overexpresses or activates the TONNEAUl protein, one will induce an increase in the size of the plant or organs concerned.
  • the expression and / or the activity of the TONNEAUl type protein is modified by mutagenesis of the gene coding for said protein.
  • This mutagenesis can be carried out by any suitable means, known in itself; it is possible, for example, to delete all or part of the TONNEAUl gene, and / or to insert an exogenous sequence; it is also possible to introduce one or more point mutations, to interrupt or shift the reading frame, or else to obtain a mutant TONNEAUl protein, more or less active than the wild-type protein; non-functional TONNEAU1 counterparts with a dominant antagonistic effect can also be produced.
  • the present invention also encompasses nucleic acid sequences capable of being obtained by mutagenesis from the sequence of a gene of TONNEAUl type as defined above, and in particular nucleic acid sequences capable of being obtained by introduction of a mutation capable of modifying the expression and / or the activity of the TONNEAUl protein.
  • the expression of the TONNEAUl protein is modified by associating a sequence derived from the sequence of a TONNEAUl gene with appropriate sequences for controlling transcription. For example, to regulate the expression level of a protein of the TONNEAUl type, it is possible to replace the natural promoter of this protein with a strong promoter, or on the contrary associate it with sequences of the silent type.
  • TONNEAUl protein it is also possible to inhibit the expression of the TONNEAUl protein at the post-transcriptional level, by co-suppression or antisense suppression, by introducing into the cells recombinant DNA constructs producing in these cells sense or antisense transcripts derived from the cDNA. of this protein.
  • the present invention also encompasses the recombinant DNA constructs making it possible to regulate the level of expression of a protein of TONNEAUl type, and containing at least one sequence derived from all or part of the sequence of a gene of TONNEAUl type, under transcriptional control of an appropriate promoter.
  • the invention also encompasses recombinant vectors carrying the recombinant DNA constructs defined above, as well as cells and multicellular organisms transformed by these constructs; the present invention encompasses in particular plant cells or plants transformed by recombinant DNA constructs defined above.
  • At least one product that inhibits or activates the TONNEAU1 protein is used.
  • TONNEAU1 inhibitor or activator products can also be selected on the basis of their selective affinity for this protein. These products can for example be screened on plant cells cultivated in vi tro, in which TONNEAUl is necessary for elongation, or on heterologous systems (bacteria, yeast) in which the TONNEAUl protein is expressed, or on acellular systems, by research of TONNEAUl interactions with various ligands.
  • TONNEAUl protein for example, to obtain a reduction in the size of a plant, it is possible, as indicated above, to inhibit the production of the TONNEAUl protein therein, by implementing conventional techniques such as antisense suppression, or co-suppression, or else inhibit the activity of TONNEAUl by the production of non-functional homologs of this protein with a dominant antagonist effect, or by the production of antibodies directed against TONNEAUl.
  • the expression or the activity of TONNEAUl can be blocked thanks to the use of an inducible promoter, in order to induce a phenomenon of dwarfism controlled over time, or else a selective inhibition can be obtained in the tissues.
  • desired targets eg stem, leaf petiole, floral organs
  • tissue-promoters eg stem, leaf petiole, floral organs
  • the modification of the expression and / or the activity of TONNEAUl can also make it possible to modify the floral architecture to induce a male sterility (by reduction of the size and blocking of the dehiscence of the anthers), to remove the petals (for example to produce apetal colza allowing better resistance to cryptogamic diseases, and better photosynthesis), or inducing female sterility of ornamental species in order to increase the flowering period.
  • tissue-specific inhibition of the expression and / or activity of the TONNEAU1 gene can also relate to the root system, for example to control its development in pots in the case of ornamental plants.
  • homologous proteins present in animal or plant eukaryotic cells can also be modified by means similar to those mentioned above for TONNEAUl. By acting on these proteins, it is thus possible, for example, to envisage controlling the multiplication of cells, their dispersion in the organism, and thus inhibiting, for example, the development of tumors.
  • a tone-water phenotype mutant was identified during the screening of the collection of insertion mutants from INRA-Versailles.
  • This mutant (ACL4) carries an insertion of a DNA fragment carrying a marker for resistance to anamycin.
  • Out of 2256 seeds harvested from a heterozygous plant for the kanamycin resistance marker 1710 descendants were normal, and 546 had the barrel phenotype. All mutants were resistant to kanamycin, indicating a close link between the tonneaul, nuclear recessive mutation and the inserted T-DNA fragment. Subsequently, a second T-DNA insertion, devoid of a functional kanamycin resistance marker, was identified.
  • the inventors produced a genomic library of the mutant ACL4, because the sequences flanking the T-DNA could not be isolated by methods based on PCR. .
  • the mapping of the sequences flanking the two insertions highlights the presence of chromosomal rearrangements: a reciprocal translocation involving the bottom of chromosomes 2 and 3 (bearing approximately on 20 centiMorgans) and an inversion bearing on 40 centiMorgans corresponding to the central part of chromosome 2
  • the results of mapping the mutation go in the same direction since markers of chromosome 2 and chromosome 3 are closely linked to the mutation, and recombinations are blocked on a large part of chromosome 2.
  • FIG. 1 The clone BAC 2F19 from the TAMU library, and largely covering the region of the T-DNA insertion site was used for the various analyzes; and SalI lXhoI and Sall l PvuII fragments were subcloned, partially sequenced and used for functional complementation analyzes.
  • the 7.1 kbp sequence isolated from BAC 2F19 was compared with the sequences flanking the T-DNA insertions in the ton1 mutants. ACL4.
  • an amplification product of 330 bp was obtained in the mutant type plants, and two amplification products of 330 and 430 bp for the wild type sequences.
  • the sequencing of these fragments of 330 and 430 bp shows that they have an identity of 95.1% and 93.5% at their terminal regions, while this identity decreases sharply in the central part.
  • Analysis of other sequences obtained from this region fragment amplified by the primers TIAf and T2Br has shown that the two conserved regions correspond to two fragments of exons flanking an intron.
  • EXAMPLE 3 ISOLATION AND SEQUENCING OF TON1 GENES
  • the wild type genomic region a been cloned and sequenced.
  • Preliminary hybridization and amplification analyzes did not reveal any significant difference between the plant genomic DNA (type S) and the DNA extracted from the selected BACs (ColO), the 7.1 kb fragment DNA isolated from BAC 2F19 was used for cloning and sequencing. This fragment was subcloned into the plasmid pBSIISK (STRATAG ⁇ NE) and sequenced.
  • PCR primers labeled “PRISM Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing Kit” (APPLIED BIOSYSTEMS) are then separated on denaturing polyacrylamide gel and analyzed using an automatic sequencer (APPLIED BIOSYSTEMS; Model 373A DNA Sequencing System).
  • FIGS. 2 and 3 The structure and the sequence of the TONNEAU1 genes of Arabidopsis are represented in FIGS. 2 and 3. Caption of FIG. 2:
  • Figure 2 shows schematically the structure of the 2 TONNEAUl genes; the 1.4 kbp deletion at the T-DNA insertion point in the tonl mutant is represented by a double black arrow.
  • the two genes TONla and TONlb are represented by black arrows. These 2 genes are separated by 220 bp.
  • Exons are represented by black boxes. The hatched areas correspond to the untranslated transcribed sequences. The location and size of introns and exons is very conserved, except for the sixth intron of the TONla gene which is absent in the TONlb gene.
  • the positions of the donor and acceptor splice sites are represented by square brackets.
  • the associated figures correspond to the probability that the detected sequence is a splicing site.
  • the arrowheads indicate the position of the different primers used during the characterization of the ton1 mutants.
  • the black arrowheads correspond to the defined primers and the gray arrowheads correspond to the sequences homologous to the defined primers.
  • the sizes of the corresponding amplification fragments are also indicated.
  • the cDNA sequences isolated from the Arabidopsis library, the rice cDNA (S1091), and the 3 'RACE PCR product sequences isolated from the primers P5 and P8 are indicated in bold, respectively. characters highlighted in gray, and in italics.
  • the underlined sequences correspond to the different PCR primers.
  • the primers whose name is shown in italics correspond to the sequences homologous to the primers defined from the sequence.
  • the boxes correspond to the polyadenylation sites of the cDNAs.
  • the hatched boxes correspond to the beginning and the end of the deletion induced by the insertion of T-DNA.
  • the results presented in FIGS. 2 and 3 show that the two genes TONla and TONlb are positioned in direct tandem and separated by 220 bp.
  • the TONla gene consists of 8 exons with an average size of 98 nucleotides; the average size of the introns is 168 bp.
  • the TO ⁇ lb gene consists of 7 exons with an average size of 110 nucleotides; the average size of the introns is 214 bp.
  • the comparison of the wild type and mutant type sequences shows that the deletion induced by the insertion of AD ⁇ -T affects the two genes TO ⁇ la and TO-Vlb. It induced the disappearance of the C-terminal part of the TO ⁇ la protein (corresponding to the last 97 amino acids) and the ⁇ -terminal part of the TO ⁇ lb protein (corresponding to the first 29 amino acids). Furthermore, the comparison between the sequences flanking the AD ⁇ -T insertions and the region containing the TONNEAU1 genes confirms that the insertion (and the associated chromosomal rearrangements) did not induce other changes in the nucleotide sequence.
  • RACE PCR reactions were carried out. This method makes it possible to isolate by PCR amplification the 3 ′ or 5 ′ parts of a transcript (even if weakly expressed) from a primer internal to the gene of interest and from a primer positioned on an adapter ligated at the ends. synthesized cDNA. The amplifications were carried out on cDNAs produced from messenger RNA isolated from seedlings of the S ecotype 5 days old. The 3 'RACE reactions were carried out using primers P5 and P8. The 3 'part of the two genes was thus obtained. The 3 'part of the TON 1a gene was isolated by amplification from the primer P8 while that of the TON1b gene was obtained from the primer P5.
  • the amplifications thus obtained demonstrate that the two genes TO-vla and TONlb are expressed in seedlings 5 days old.
  • the different sequences corresponding to RACE PCR products, to rice and Arabidopsis cDNAs, and the sequences deduced from the genomic sequence were compared. The results of these alignments are shown in Figure 4.
  • the sequence alignment analyzes were performed using the Pileup function of the GCG software. (isconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Inc. (GCG) Madison Wisc, USA).
  • the homology searches were established by SeqVu 1.1 software (The Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia) using the GES method.
  • the gray boxes represent the identical amino acids
  • the white boxes inside the blocks represent the homologous amino acids.
  • the translated sequences correspond respectively to the cDNA isolated in rice (tonlriz .p), to the sequences deduced from the genomic sequence of 1 Arabidopsis (tonla .p and tonlbg.p) and the cDNA isolated in the bank of 'Arabidopsis (tonlbc .p).
  • FIG. 5 represents the comparison of the protein sequences deduced from the TONNEAU1 genes, from the orthologous gene in rice, and from several ESTs homologous to mammals or parasites (identified as described in Example 3).
  • the mutants were complemented by the introduction of a wild type copy of the TONNEAU1 gene.
  • pZPHYG This plasmid is derived from the vector PZP200 [HAJDUKIEWICZ et al. , Plant Mol. Biol. , 25, 989-994 (1994)] into which the gene coding for hygromycin B phosphotransferase (HPT) has been introduced.
  • Constructions 1 and 2 contain the 12 kbp (Sall / Xhol) and 7.2 kbp (Sall PvuII) genomic fragments isolated from BAC 2F19 and corresponding respectively to the two TONla and TONlb genes or to the TONla gene. These TONNEAU1 genes are represented in Figure 6 by black arrows.
  • Construction 1 contains the two TONla and TONlb genes (Sall-Xhol fragment) while construction 2 contains only the TONla gene (Sali-PvuI I fragment).
  • Construction 3 was carried out from the cDNA of the full-length TONlb gene from the Arabidopsis library. This cDNA was cloned between the double promoter of the cauliflower mosaic virus (Prom70 CAMV) and the terminator of the cauliflower mosaic virus (Ter CAMV) derived from the plasmid pJIT60 [GUERINEAU et al., Plant Mol . Biol. 18 (4), 815-818 (1992)].
  • a negative complementation control (binary vector only) was also used to evaluate the effect of infiltration on the segregation frequencies of the TONNEAUl mutation and thus to obtain mutants carrying the gene for resistance to hygromycin.
  • constructs were introduced into the Agrobacterium tumefaciens C58C1 strain, pMP90 [KONCZ and SCHELL, Mol. Gen. Genêt, 204, 383-396 (1986)] by electroporation.
  • the recombinant strains were used to transform plants of Arabidopsis heterozygous for the ton1 mutation.
  • the seedlings showing resistance to the two selection agents were transplanted in the greenhouse.
  • the progeny of these plants were used for genetic complementation analyzes.
  • wild type plants were treated according to this same protocol (except for the selection of transformants which is done only on hygromycin).
  • the Tl seedlings selected in a fraction (1/8) of the progeny of infiltrated plants are distributed as follows: 22 and 31 for constructions 1 and 2, 43 for construction 3, and 15 for the construction 4.
  • the different seedlings transferred to the greenhouse had a wild phenotype during transplanting, except for one of them (obtained from construction 3).
  • allelic structure for the ton1 mutation was tested by PCR amplifications in these plants. Amplifications carried out using a specific primer located inside the deletion and a primer outside the deletion show that the seedlings are of mutant genotype.
  • T-DNA insertions carrying the TON1b cDNA was also tested by PCR amplification.
  • the primers P5 and P10 amplify in these plants a fragment of 950 bp corresponding to the size expected for amplification from a TON1 cDNA.
  • a fragment of identical size was also amplified from the DNA of the different transformants obtained by infiltration with the bacterial strain containing the construction 3. These plants with an intermediate phenotype therefore correspond to a partial restoration of the tone phenotype.
  • Certain plants of wild phenotype have a homogeneous kanamycin-resistant progeny, they carry a T-DNA insertion at the TON locus in the homozygous state, however in their progeny plants of the ton phenotype are observed. These plants are mutants restored by the presence of a functional TON gene which confirms the nature of the two identified candidate genes, targets of the mutation.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour contrôler la division et/ou l'élongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, en modifiant l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAU1 dans lesdites cellules. Ce procédé permet en particulier d'agir sur la taille des plantes, ou de leurs organes. La modification de l'expression et/ou de l'activité d'une protéine TONNEAU1 peut, par exemple, être effectuée par l'intermédiaire du gène codant pour cette protéine, ou des séquences contrôlant son expression, ou par l'utilisation d'inhibiteurs ou d'activateurs de ladite protéine.

Description

PROCÉDÉ DE CONTRÔLE DE LA DIVISION ET/OU DE L'ELONGATION
DE CELLULES EUCARYOTES .
La présente invention concerne le clonage et l'expression de gènes permettant d'agir sur l'architecture, la croissance ou la fertilité des plantes .
L'architecture d'une plante supérieure est déterminée essentiellement par le contrôle des divisions et de l'elongation cellulaires. Les cellules des racines, des feuilles, des tiges, et des fleurs de la plante se forment initialement dans les méristèmes. La conversion des ébauches d'organes en organes matures nécessite un contrôle précis de l'allongement de ces cellules.
Des mutations affectant le contrôle de l'elongation aboutissent à des modifications importantes de l'aspect des plantes. Ainsi, chez Arabidopsis thaliana , on a observé des mutants dénommés : « tonneau », qui présentent un phénotype très affecté par rapport au type sauvage. Ces plantes sont capables de générer les primordia racinaires, foliaires et floraux, sans pouvoir les faire grandir et leur donner une forme mature appropriée. Elles présentent un fort raccourcissement des racines, des tiges et des pétioles de feuille, ainsi que des organes floraux et reproducteurs.
Tous les organes sont présents, mais ont une taille et une forme modifiée. Les cotylédons, de taille plus réduite que ceux du type sauvage, ont une épaisseur accrue. L'hypocotyle et la racine, très courts et de fort diamètre, s'allongent peu au cours du développement. De nombreux poils racinaires, des racines secondaires et de petites feuilles en forme d'écaillés et charnues apparaissent. Après 8 à 10 semaines de culture in vi tro, se développe une hampe florale portant des fleurs stériles fortement modifiées, ainsi que des ramifications secondaires . Des études de développement de l'embryon effectuées par l'équipe des Inventeurs sur des mutants tonneaul (tonl) d' Arabidopsis thaliana , ont montré que le zygote était affecté dès la première mitose par une modification de l'orientation du plan de division [TRAAS et al., Nature, 375, 676-677, (1995)]. Cette altération se poursuit aux stades ultérieurs par une perturbation des divisions cellulaires entraînant une modification de la forme et de la taille des cellules par rapport au type sauvage.
Il est généralement admis que le cytosquelette intervient dans l'elongation cellulaire et la mise en place du plan de division. Lors de la division cellulaire, les microtubules s'organisent pour former une structure dénommée : « anneau de préprophase », qui déterminera précisément l'emplacement du plan de division, où le phragmoplaste sera constitué et la future paroi construite. Les inhibiteurs de polymérisation des microtubules bloquent aussi les processus d'allongement cellulaire, ce qui révèle leur rôle dans ce processus.
Les Inventeurs ont étudié l'organisation du cytosquelette chez des plantules sauvages d' Arabidopsis thaliana et chez des plantules du mutant tonl . Grâce à des immuno arquages effectués à l'aide d'anticorps spécifiques des tubulines, ils ont ainsi montré qu'à 1 ' interphase, les microtubules corticaux des cellules de plantes sauvages sont disposés perpendiculairement à l'axe d'élongation de la cellule, alors qu'ils se répartissent aléatoirement dans les cellules mutantes. Dans les cellules mutantes, le fuseau achromatique se met correctement en place mais l'anneau de préprophase n'est jamais présent, ce qui se traduit par une orientation aléatoire du plan de division [TRAAS et al., publication précitée] . Les Inventeurs ont maintenant isolé chez
Arabidopsis thaliana , un gène TONNEAUl { TON1 ) dont la mutation est responsable du phénotype « TONNEAU » décrit ci-dessus. Ils ont en outre identifié des homologues de ce gène chez d'autres plantes, en particulier le riz, et ont constaté qu'il était très conservé chez les plantes supérieures (on observe par exemple 77% d'identité entre le gène TONNEAUl d' Arabidopsis et celui du riz, et 36 acides aminés contigus identiques chez les deux protéines) .
La séquence d'un clone d'ADN génonique d' Arabidopsis thaliana contenant 2 copies du gène TONNEAUl , dénommées TONla et TO-Vlb, est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1. Les séquences des protéines TONla et TONlb sont respectivement représentées sous les numéros SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO :3. La séquence codant pour une protéine TONNEAUl de riz et la séquence peptidique correspondante sont respectivement représentées sous les numéros SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5.
La présente invention a pour objet un procédé pour contrôler le processus de division et/ou d'élongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAUl dans lesdites cellules. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl pour l'obtention d'un produit permettant de modifier l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAUl dans des cellules eucaryotes, et en particulier des cellules végétales.
Au sens de la présente invention, on entend par : « protéine de type TONNEAUl », non seulement l'une des protéines (SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :5) codées par les gènes TONNEAUl d' Arabidopsis ou du riz représentés sur la figure 3, et dans la liste de séquences en annexe, mais également toutes les protéines homologues, ce qui inclut en particulier les protéines TONNEAUl codées par des gènes orthologues d'autres plantes. De même, on entend par : « séquence d' un gène de type TONNEAUl », non seulement la séquence de l'un quelconque des gènes TONNEAUl d' Arabidopsis ou du riz représentés sur la figure 3 ou dans la liste de séquence en annexe, mais également les séquences de gènes homologues, et en particulier celles des gènes orthologues d'autres organismes, et en particulier d'autres plantes supérieures. Ces gènes peuvent être aisément identifiés et clones sur la base de leur homologie avec le gène TONNEAUl d' Arabidopsis ou son orthologue du riz. Des « séquences d'acide nucléique dérivées de tout ou partie de la séquence du gène TONNEAUl », comprennent en particulier :
- les séquences d'ADNc de protéines de type TONNEAUl ou des portions de ces séquences d'ADNc, ainsi que leurs produits de transcription ; il peut s'agir par exemple de la totalité d'une séquence codant pour une protéine de type TONNEAUl, ou d'une portion de cette séquence codante, et/ou de tout ou partie des régions 5' et 3' non-traduites . Ces séquences peuvent être utilisées en orientation sens ou antisens ; - des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par mutagenèse à partir de la séquence d'un gène de type TONNEAUl tel que défini ci- dessus .
La modification de l'expression et/ou de l'activité de protéines de type TONNEAUl dans des cellules de plantes permet, en agissant sur le développement de celles-ci, de contrôler la morphologie et l'architecture desdites plantes, et en particulier de modifier la taille de la plante ou celle de certains de ces organes. Par exemple, en inhibant, totalement ou partiellement l'expression ou l'activité d'une protéine TONNEAUl dans une plante ou dans certains organes de celles-ci, on induira une réduction de la taille de ladite plante, ou desdits organes; au contraire, si l'on surexprime ou si l'on active la protéine TONNEAUl, on induira une augmentation de la taille de la plante ou des organes concernés.
Selon un mode de misé en œuvre préféré de la présente invention, on modifie l'expression et/ou l'activité de la protéine de type TONNEAUl en effectuant la mutagenèse du gène codant pour ladite protéine.
Cette mutagenèse peut être effectuée par tout moyen approprié, connu en lui même ; on peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie du gène TONNEAUl , et/ou à l'insertion d'une séquence exogène ; on peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles, pour interrompre ou décaler le cadre de lecture, ou bien pour obtenir une protéine TONNEAUl mutante, plus ou moins active que la protéine sauvage ; on peut également produire des homologues non- fonctionnels de TONNEAUl à effet antagoniste dominant.
La présente Invention englobe également des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par mutagenèse à partir de la séquence d'un gène de type TONNEAUl tel que défini ci-dessus, et en particulier des séquences d'acide nucléique susceptibles d'être obtenues par introduction d'une mutation propre à modifier l'expression et/ou l'activité de la protéine TONNEAUl. Selon un autre mode de mise en œuvre de la présente invention, on modifie l'expression de la protéine TONNEAUl en associant une séquence dérivée de la séquence d'un gène TONNEAUl avec des séquences appropriées de contrôle de la transcription. Par exemple, pour réguler le niveau d'expression d'une protéine de type TONNEAUl, on pourra remplacer le promoteur naturel de cette protéine par un promoteur fort, ou au contraire l'associer à des séquences de type silenceur.
On peut également inhiber l'expression de la protéine TONNEAUl au niveau post-transcriptionnel, par co-suppression ou suppression antisens, en introduisant dans les cellules des constructions d'ADN recombinant produisant dans ces cellules des transcrits sens ou antisens dérivés de l'ADNc de cette protéine. La présente invention englobe également les constructions d'ADN recombinant permettant de réguler le niveau d'expression d'une protéine de type TONNEAUl, et contenant au moins une séquence dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl , sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Avantageusement, on pourra, si on le souhaite, utiliser un promoteur inductible, et/ou tissu-spécifique.
L'invention englobe également des vecteurs recombinants portant les constructions d'ADN recombinant définies ci-dessus, ainsi que des cellules et des organismes pluricellulaires transformés par ces constructions ; la présente invention englobe en particulier des cellules végétales ou des végétaux transformés par des constructions d'ADN recombinant définies ci-dessus.
Selon encore un autre mode de mise en œuvre de la présente invention, on utilise au moins un produit inhibiteur ou activateur de la protéine TONNEAUl.
On peut par exemple, pour inhiber l'activité de TONNEAUl, utiliser des anticorps dirigés contre cette protéine ; il peut s'agir en particulier d'anticorps recombinants produits dans la plante concernée, ou dans certains tissus de celle-ci.
On peut également sélectionner des produits inhibiteurs ou activateurs de TONNEAUl sur la base de leur affinité sélective pour cette protéine. Ces produits peuvent par exemple être criblés sur des cellules végétales cultivées in vi tro, chez lesquelles TONNEAUl est nécessaire à l'elongation, ou sur des systèmes hétérologues (bactérie, levure) dans lesquels on exprime la protéine TONNEAUl, ou sur des systèmes acellulaires, par recherche d'interactions de TONNEAUl avec divers ligands .
Du fait du rôle essentiel joué par la protéine TONNEAUl dans le processus d' élongation, la modification de son expression et/ou de son activité trouve de nombreuses applications dans le domaine des productions végétales.
Par exemple, pour obtenir une réduction de la taille d'une plante, on peut comme indiqué ci-dessus, inhiber dans celle-ci la production de la protéine TONNEAUl, en mettant en œuvre des techniques classiques telles que la suppression antisens, ou la co-suppression, ou bien inhiber l'activité de TONNEAUl par la production d'homologues non-fonctionnels de cette protéine à effet antagoniste dominant, ou par la production d'anticorps dirigés contre TONNEAUl.
Avantageusement, l'expression ou l'activité de TONNEAUl pourront être bloquées grâce à l'emploi d'un promoteur inductible, afin d'induire un phénomène de nanisme contrôlé dans le temps, ou bien une inhibition sélective pourra être obtenue dans les tissus-cibles souhaités (ex : tige, pétiole de la feuille, organes floraux) grâce à l'emploi de promoteurs tissu- spécifiques . Ceci permet de modifier sélectivement l'architecture de la plante et d'obtenir par exemple une réduction de taille de la tige chez les céréales, de l'encombrement latéral, et la hauteur chez les hybrides, en particulier les hybrides de maïs, de colza et de tournesol. Cette réduction de taille permet par exemple d'augmenter l'indice de récolte, et/ou d'obtenir une meilleure résistance aux aléas climatiques (verse) .
La modification de l'expression et/ou de l'activité de TONNEAUl peut également permettre de modifier l'architecture florale pour induire une stérilité mâle (par réduction de la taille et blocage de la déhiscence des anthères) , supprimer les pétales (par exemple pour produire des colzas apétales permettant une meilleure résistance aux maladies cryptogamiques, et une meilleure photosynthèse) , ou induire la stérilité femelle d'espèces ornementales afin d'accroître la période de floraison.
L'inhibition tissu-spécifique de l'expression et/ou de l'activité du gène TONNEAUl peut également porter sur le système racinaire, par exemple pour contrôler son développement en pot dans le cas de plantes ornementales .
Chez les ligneux on peut aussi obtenir une amélioration de la qualité des fibres et de la qualité mécanique du bois en réduisant l'elongation des cellules, ou au contraire en l'augmentant, par surexpression de TONNEAUl .
On peut également modifier par des moyens similaires à ceux mentionnés ci-dessus pour TONNEAUl, l'activité de protéines homologues, présentes dans des cellules eucaryotes animales ou végétales. En agissant sur ces protéines on peut ainsi, par exemple, envisager de contrôler la multiplication des cellules, leur dispersion dans l'organisme, et d'inhiber ainsi, par exemple, le développement de tumeurs.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'identification, le clonage, et l'expression de gènes TONNEAUl . EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DU (DES) GÈNE (S) TONNEAUl
Un mutant de phénotype ton-ieau a été identifié au cours du criblage de la collection de mutants d'insertion de l' INRA-Versailles . Ce mutant (ACL4) porte une insertion d'un fragment d'ADN porteur d'un marqueur de résistance à la anamycine . Sur 2256 graines récoltées à partir d'une plante hétérozygote pour le marqueur de résistance à la kanamycine, 1710 descendants étaient normaux, et 546 avaient le phénotype tonneau . Tous les mutants se sont révélés résistants à la kanamycine, indiquant une étroite liaison entre la mutation tonneaul , nucléaire récessive et le fragment d'ADN-T inséré. Par la suite une seconde insertion d'ADN- T, dépourvue de marqueur de résistance à la kanamycine fonctionnel, a été identifiée.
Afin d'analyser plus précisément les sites des insertions de l'ADN-T, les Inventeurs ont réalisé une banque génomique du mutant ACL4 , car les séquences flanquant l'ADN-T n'avaient pu être isolées par des méthodes basées sur la PCR. La cartographie des séquences flanquant les deux insertions met en évidence la présence de réarrangements chromosomiques : une translocation réciproque impliquant le bas des chromosomes 2 et 3 (portant environ sur 20 centiMorgans) et une inversion portant sur 40 centiMorgans correspondant à la partie centrale du chromosome 2. Par ailleurs, les résultats de cartographie de la mutation vont dans le même sens puisque des marqueurs du chromosome 2 et du chromosome 3 sont étroitement liés à la mutation, et les recombinaisons sont bloquées sur une grande partie du chromosome 2.
Des analyses moléculaires réalisées sur des plantules mutantes individuelles ont mis en évidence que 30% des mutants possédaient un chromosome 2 transloqué et un chromosome 2 de type sauvage, et 70% 2 chromosomes 2 transloqués. Par ailleurs tous les mutants testés présentent 2 copies transloquées pour le chromosome 3.
Ces éléments ont conduit les Inventeurs à analyser la région du bas du chromosome 3, proche des marqueurs cdc2B et BGLl [LISTER et DEAN Weeds World, 4(i), 1-10 (1997)] impliquée dans l'insertion d'ADN-T afin d'identifier le gène causant le phénotype ton . Deux banques de chromosomes bactériens artificiels (BAC = Bacterian Artificial Chromosome) , la banque « TAMU » accessible à l'adresse : http://aims.cps.msu.edu/aims/ et la banque « IGF » accessible à l'adresse : http://www.rzpd.de/ ont été criblées sur la base des séquences flanquant les insertions d'ADN-T du mutant ACL4. Cinq clones BAC ont été isolés et une carte de restriction a permis de les positionner les uns par rapport aux autres. Ces clones et la carte de restriction correspondante sont représentés sur la Figure 1. Le clone BAC 2F19 issu de la banque TAMU, et recouvrant largement la région du site d'insertion de l'ADN-T a été utilisé pour les diverses analyses ; et des fragments SalI lXhoI et Sall l PvuII ont été sous-clonés, partiellement séquences et utilisés pour les analyses de complémentation fonctionnelle. Légende de la figure 1 :
Les séquences flanquant les insertions d'ADN- T isolées qui ont été utilisées comme sondes pour cribler les deux banques génomiques de type BAC sont représentées par une bande noire. Les cinq clones BACs isolés sont représentés par des bandes hachurées. La position des fragments SalI lXhoI et Sall l PvuII du clone BAC 2F19 qui ont été isolés et utilisés pour les analyses de complémentation fonctionnelle des mutants est indiquée au bas de la figure. Une portion de 7,1 kpb du fragment SalI lXhoI qui a été sous-clonée et séquencée est représentée par une double flèche hachurée. Les hybridations moléculaires de type Southern et les analyses par PCR ont mis en évidence une duplication des gènes TONNEAUl { cf . exemple 2 ci-dessous) . Ces 2 gènes sont représentés par les flèches noires. EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION DE DEUX GÈNES HOMOLOGUES PRÉSENTS AU LOCUS TONNEAUl
Afin de détecter d'éventuels remaniements ou délétions dans le fragment clone, la séquence de 7,1 kpb isolée à partir du BAC 2F19 (cf. Figure 1) a été comparée aux séquences flanquant les insertions d'ADN-T chez les mutants tonl ACL4.
Cette comparaison a mis en évidence, chez ces derniers, une délétion de 1,4 kpb au point d'insertion de l'ADN-T. Des amplifications par PCR ont ensuite été réalisées à partir de l'ADN génomique du mutant tonl ACL4, et du l'ADN du BAC 2F19, en utilisant différentes amorces. La position de ces amorces est indiquée sur la Figure 2 et sur la Figure 3. La première amplification a été effectuée avec les amorces P5 (localisées dans la délétion chez les mutants tonl) et P6. Aucune amplification n'était attendue chez les plantes de type mutant alors que la taille attendue du fragment amplifié était de 430 pb dans les séquences génomiques de type sauvage. Or, de façon surprenante, un produit d'amplification de 330 pb a été obtenu chez les plantes de type mutant, et deux produits d'amplification de 330 et 430 pb pour les séquences de type sauvage. Le séquencage de ces fragments de 330 et 430 pb montre qu'ils présentent une identité de 95,1% et 93,5% au niveau de leur régions terminales, alors que cette identité diminue fortement dans la partie centrale. L'analyse d'autres séquences obtenues à partir de cette région (fragment amplifié par les amorces TIAf et T2Br) a montré que les deux régions conservées correspondent à deux fragments d'exons encadrant un intron. Ces résultats indiquent la présence, au niveau de la séquence affectée chez les mutants tonl, d'un second gène présentant une homologie avec le premier. EXEMPLE 3 : ISOLEMENT ET SEQUENÇAGE DES GÈNES TONl Afin d'analyser les régions affectées par la délétion chez les mutants tonl, et d'établir le degré d'identité entre les deux gènes homologues affectés par cette mutation, la région génomique de type sauvage a été clonée et séquencée. Des analyses préliminaires d'hybridation et d'amplification n'ayant pas mis en évidence de différence notable entre l'ADN génomique végétal (de type S) et l'ADN extrait des BACs sélectionnés (ColO), le fragment de 7,1 kb de l'ADN isolé à partir du BAC 2F19 a été utilisé pour le clonage et ce sequençage. Ce fragment a été sous-cloné dans le plasmide pBSIISK (STRATAGÈNE) et séquence. Les brins d'ADN synthétisés à partir d'amorces PCR marquées « PRISM Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing Kit » (APPLIED BIOSYSTEMS) sont ensuite séparés sur gel dénaturant de polyacrylamide et analysés grâce à un séquenceur automatique (APPLIED BIOSYSTEMS ; Model 373A DNA Sequencing System) .
La séquence obtenue a été comparée avec des banques d' "EST" (Expressed Séquence Tag) , Cette comparaison a permis d'identifier différentes EST présentant des similitudes de séquence avec les protéines TONl, et en particulier une EST isolée chez le riz (numéro d'identification : D39592) homologue de ces séquences. Le clone correspondant (S1091) fourni par MAFF DNA Bank (1-2, 2-chome, Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305, JAPON), s'est avéré correspondre après sequençage, à un ADNc complet de 1083 pb, codant pour une protéine de 261 acides aminés.
La position des introns et des exons a été définie d'une part grâce au logiciel NETPLANTGENE [HEBSGAARD et al . , Nucleic Acids Res . , 24, 3439-3452 (1996)] et d'autre part grâce à des comparaisons avec les séquences d'ADNc isolés à partir d'une banque d ' Arabidopsis [QUAEDVLIEG et al . , Plan t Cel l , 7, (1) , 117-129 (1995)] et les séquences de produits de 3 ' RACE PCR isolés (cf exmple 4 ci-dessous) à partir des amorces P5 et P8 (Marathon cDNA amplification Kit ; CLONTECH) .
La structure et la séquence des gènes TONNEAUl d' Arabidopsis sont représentés sur les figures 2 et 3. Légende de la figure 2 :
La Figure 2 schématise la structure des 2 gènes TONNEAUl ; la délétion de 1,4 kpb au point d'insertion de l'ADN-T chez le mutant tonl est représentée par une double flèche noire. Les deux gènes TONla et TONlb sont représentés par des flèches noires. Ces 2 gènes sont séparés de 220 pb.
Les exons sont représentés par des boîtes noires. Les zones hachurées correspondent aux séquences transcrites non traduites. La localisation et la taille des introns et des exons est très conservée, excepté pour le sixième intron du gène TONla qui est absent dans le gène TONlb .
Les positions des sites donneurs et accepteurs d'épissage sont représentés par des crochets. Les chiffres associés correspondent à la probabilité que la séquence détectée soit un site d'épissage.
Les pointes de flèches indiquent la position des différentes amorces utilisées au cours de la caractérisation des mutants tonl. Les pointes de flèches noires correspondent aux amorces définies et les pointes de flèches grises correspondent aux séquences homologues aux amorces définies. Les tailles des fragments d'amplification correspondants sont également indiquées.
La séquence du fragment de 7,1 kpb isolé à partir du BAC 2F19 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1, ainsi que sur la Figure 3 (3a à 3k) . Légende de la figure 3 :
Les acides aminés correspondant aux exons sont figurés en capitales.
Les séquences d'ADNc isolés à partir de la banque d ' Arabidopsis, l'ADNc de riz (S1091) , et les séquences de produits de 3 ' RACE PCR isolés à partir des amorces P5 et P8 sont respectivement indiquées en caractères gras, en caractères surlignés en grisé, et en caractères italiques.
Les séquences soulignées correspondent aux différentes amorces PCR. Les amorces dont le nom est représenté en italique correspondent aux séquences homologues aux amorces définies à partir de la séquence. Les boites correspondent aux sites de polyadénylation des ADNc. Les boites hachurées correspondent au début et à la fin de la délétion induite par l'insertion d'ADN-T.
Les résultats présentés sur les Figures 2 et 3, montrent que les deux gènes TONla et TONlb sont positionnés en tandem direct et séparés par 220 pb. Le gène TONla se compose de 8 exons d'une taille moyenne de 98 nucléotides ; la taille moyenne des introns est de 168 pb. Le gène TOΝlb se compose de 7 exons d'une taille moyenne de 110 nucléotides ; la taille moyenne des introns est de 214 pb.
La comparaison des séquences de type sauvage et de type mutant montre que la délétion induite par l'insertion d'ADΝ-T affecte les deux gènes TOΝla et TO-Vlb. Elle a induit la disparition de la partie C- terminale de la protéine TOΝla (correspondant aux 97 derniers acides aminés) et de la partie Ν-terminale de la protéine TOΝlb (correspondant aux 29 premiers acides aminés) . De plus, la comparaison entre les séquences flanquant les insertions d'ADΝ-T et la région contenant les gènes TONNEAUl confirme que l'insertion (et les remaniements chromosomiques associés) n'ont pas induit d'autres modifications de la séquence nucléotidique .
EXEMPLE 4 : EXPRESSION DES GÈNES TON1A ET TON1B
L'organisation génomique de la région affectée par l'insertion d'ADN-T chez les mutants tonneaul est singulière puisqu'elle contient un gène dupliqué en tandem direct. La question de la fonctionnalité et de l'expression simultanée (ou non) de ces gènes se pose. Le criblage d'une banque d'ADNc (environ 500 000 clones) a permis d'isoler quatre clones indépendants. Après analyse et sequençage, tous les quatre se sont avérés correspondre au gène TO lb.
Parallèlement au criblage de cette banque, des réactions de RACE PCR ont été effectuées. Cette méthode permet d'isoler par amplification par PCR les parties 3' ou 5 ' d'un transcrit (même faiblement exprimé) à partir d'une amorce interne au gène d'intérêt et d'une amorce positionnée sur un adaptateur ligué aux extrémités de l'ADNc synthétisé. Les amplifications ont été réalisées sur des ADNc produits à partir d'ARN messagers isolés à partir de plantules de l'écotype S âgées de 5 jours. Les réactions de 3' RACE ont été effectuées à partir des amorces P5 et P8. La partie 3' des deux gènes a ainsi pu être obtenue. La partie 3' du gène TON la a été isolée par amplification à partir de l'amorce P8 alors que celle du gène TONlb a été obtenue à partir de l'amorce P5. Les amplifications ainsi obtenues démontrent que les deux gènes TO-vla et TONlb sont exprimés chez les plantules âgées de 5 jours. Les différentes séquences correspondant aux produits de RACE PCR, aux ADNc de riz et d ' Arabidopsis , et les séquences déduites à partir de la séquence génomique ont été comparées . Les résultats de ces alignements sont reportés sur la Figure 4. Les analyses d'alignement de séquence ont été réalisées grâce à la fonction Pileup du logiciel GCG ( isconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Inc. (GCG) Madison Wisc, USA). Les recherches d'homologie ont été établies par le logiciel SeqVu 1.1 (The Garvan Institute of Médical Research, Sydney, Australia) à partir de la méthode GES . Les cases grisées représentent les acides aminés identiques Les cases blanches à l'intérieur des blocs représentent les acides aminés homologues .
Les séquences traduites correspondent respectivement à l 'ADNc isolé chez le riz { tonlriz .p) , aux séquences déduites à partir de la séquence génomique d 1 Arabidopsis ( tonla .p et tonlbg.p) et de l'ADNc isolé dans la banque d ' Arabidopsis ( tonlbc .p) .
Ces résultats montrent que les séquences isolées par RACE PCR (écotype WS) sont parfaitement identiques à celles déduites de la séquence nucléotidique isolée à partir du BAC (écotype ColO) . Les séquences protéiques correspondant aux gènes TO-Vla et TOWlb présentent un fort taux d'identité (80%). Le niveau d'identité atteint 96% sur les trois premiers exons. Un fort niveau d'identité (67%) et d'homologie (79%) est également obtenu entre les séquences protéiques correspondant au gène TOItfla et à l'ADNc isolé chez le riz. Ces niveaux d'identité et d'homologie sont légèrement inférieurs dans le cas de la protéine TONlb.
La figure 5 représente la comparaison des séquences protéiques déduites des gènes TONNEAUl , du gène orthologue chez le riz, et de plusieurs EST homologues de mammifères ou de parasites (identifiées comme décrit à 1' exemple 3) .
EXEMPLE 5 : COMPLÉMENTATION DES MUTANTS TON!
Pour confirmer la relation directe entre l'insertion d'ADN-T et le phénotype mutant ton! on a procédé à la complémentation des mutants par introduction d'une copie de type sauvage du gène TONNEAUl . Pour ce faire, plusieurs constructions ont été réalisées en utilisant comme vecteur le plasmide binaire pZPHYG. Ce plasmide dérive du vecteur PZP200 [HAJDUKIEWICZ et al . , Plant Mol . Biol . , 25, 989-994 (1994)] dans lequel a été introduit le gène codant pour 1 ' hygromycine B phosphotransférase (HPT) . Ce gène, sous contrôle des promoteurs et terminateurs de la nopaline synthase issu du plasmide pGDW32 [WING et al ., Mol . Gen . Genêt . , 219, 9-16, (1992)] confère aux plantes la résistance à 1 ' hygromycine . Ces constructions sont représentées sur la
Figure 6.
Les constructions 1 et 2 contiennent les fragments génomiques de 12 kpb ( Sall /Xhol ) et de 7,2 kpb ( Sall PvuII ) isolés à partir du BAC 2F19 et correspondant respectivement aux deux gènes TONla et TONlb ou au gène TONla. Ces gènes TONNEAUl sont représentés sur la Figure 6 par des flèches noires.
La construction 1 contient les deux gènes TONla et TONlb (fragment Sall-Xhol ) alors que la construction 2 ne contient que le gène TONla (fragment Sali- PvuI I ) .
La construction 3 a été réalisée à partir de l'ADNc du gène TONlb pleine longueur issu de la banque d ' Arabidopsis . Cet ADNc a été clone entre le promoteur doublé du virus de la mosaïque du chou-fleur (Prom70 CAMV) et le terminateur du virus de la mosaïque du chou- fleur (Ter CAMV) issus du plasmide pJIT60 [GUERINEAU et al., Plant Mol . Biol . 18(4), 815-818 (1992)].
Un témoin négatif de complémentation (vecteur binaire seul), a également été utilisé afin d'évaluer l'effet de l'infiltration sur les fréquences de ségrégation de la mutation TONNEAUl et ainsi obtenir des mutants portant le gène de résistance à 1 ' hygromycine.
Ces constructions ont été introduites dans la souche d' Agrobacterium tumefaciens C58C1, pMP90 [KONCZ et SCHELL, Mol . Gen . Genêt , 204, 383-396 (1986)] par électroporation. Les souches recombinantes ont été utilisées pour transformer des plantes d ' Arabidopsis hétérozygotes pour la mutation tonl.
Deux séries d'infiltrations (transformation in planta ) [BECHTOLD et al.., C. R . Acad. Sci . Paris , 316, 1194-1200, (1993)] portant sur 75 plantes hétérozygotes pour la mutation tonneaul et 50 plantes de type sauvage ont été réalisées pour chacune des constructions. Les plantes (TO) ont été récoltées et les transformants primaires (Tl) semés in vi tro . Les graines issues de plantes hétérozygotes pour la mutation TONNEAUl ont subi une double sélection. Ainsi, les semis ont été effectués sur hygromycine (75 μg/ml) , et après une semaine de culture, les plantules résistantes ont été repiquées sur milieu contenant de la kanamycine (100 μg/ml) . Les plantules présentant une résistance aux deux agents de sélection ont été repiquées en serre. La descendance de ces plantes (T2) a été utilisée pour les analyses génétiques de complémentation. Parallèlement, des plantes de type sauvage (WS) ont été traitées suivant ce même protocole (excepté pour la sélection des transformants qui ne se fait que sur hygromycine) .
Les plantules Tl sélectionnées dans une fraction (1/8) de la descendance de plantes infiltrées (plantes hétérozygotes pour la mutation tonl ) se répartissent ainsi : 22 et 31 pour les constructions 1 et 2, 43 pour la construction 3, et 15 pour la construction 4. Les différentes plantules transférées en serre présentaient un phénotype sauvage lors du repiquage excepté pour l'une d'entre elles (obtenue à partir de la construction 3) .
Après quelques semaines de culture en serre, deux plantes présentant un défaut de développement ont été isolées parmi les plantes ayant un phénotype sauvage lors du repiquage. Ces transformants obtenus à partir de la construction 3, présentaient un accroissement du diamètre et une forte réduction de l'elongation des hampes florales ainsi qu'un "gaufrage" des feuilles. Lors de la floraison, les premières fleurs et les premières siliques mises en place semblaient peu affectées ; cependant, les fleurs produites ultérieurement présentaient un phénotype de plus en plus affecté aboutissant à des fleurs quasiment identiques aux fleurs de type tonneau (réduction de la taille des organes floraux, déformation et raccourcissement de plus en plus important des siliques) . A la différence des fleurs, les pédoncules floraux n'étaient que très peu affectés. Après deux mois de culture, les hampes florales présentaient des blessures (éclatement des tiges) et un accroissement du diamètre dans la partie apicale. Ces plantes présentant une altération du développement ont été isolées dans la descendance des plantes hétérozygotes pour la mutation tonl et transformées avec la construction 3. Aucune plante présentant un phénotype semblable n'a été observée parmi les transformants obtenus avec les autres constructions ou dans la descendance des plantes de type sauvage (même transformées avec la construction 3) .
La structure allélique pour la mutation tonla été testée par des amplifications par PCR chez ces plantes. Les amplifications réalisées à partir d'une amorce spécifique localisée à l'intérieur de la délétion et une amorce à l'extérieur de la délétion montrent que les plantules sont de génotype mutant.
La présence d'insertions d'ADN-T portant l'ADNc TONlb a également été testée par amplification par PCR. Les amorces P5 et P10 amplifient chez ces plantes un fragment de 950 pb correspondant à la taille attendue pour une amplification à partir d'un ADNc TON1. Un fragment de taille identique a également été amplifié à partir de l'ADN des différents transformants obtenus par infiltration avec la souche bactérienne contenant la construction 3. Ces plantes à phénotype intermédiaire correspondent donc à une restauration partielle du phénotype ton . Certaines plantes de phénotype sauvage ont une descendance homogène kanamycine-résistante, elles sont porteuses d'une insertion ADN-T au locus TON à l'état homozygote, cependant dans leur descendance des plantes de phénotype ton sont observées. Ces plantes sont des mutants restaurés par la présence d'un gène TON fonctionnel ce qui confirme la nature des deux gènes candidats identifiés, cibles de la mutation.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour contrôler la division et/ou l'elongation de cellules eucaryotes, et en particulier de cellules végétales, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAUl dans lesdites cellules.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression et/ou l'activité de ladite protéine par mutagenèse d'un gène de type TONNEAUl .
3) Séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue par mutagenèse de la séquence d'un gène de type TONNEAUl .
4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression de ladite protéine de type TONNEAUl en exprimant au moins une séquence dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl sous contrôle transcriptionnel de séquences appropriées. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence codant pour une protéine de type TONNEAUl.
6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence antisens.
7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence dérivée est une séquence mutante selon la revendication 3.
8) Utilisation d'une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl pour l'obtention d'un produit permettant de modifier l'expression et/ou l'activité d'une protéine de type TONNEAUl dans des cellules eucaryotes . 9) Construction d'ADN recombinant contenant au moins une séquence d' acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
10) Construction d'ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit promoteur est un promoteur inductible, et/ou tissu-spécifique.
11) Cellule transformée par une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl .
12) Cellule selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.
13) Plante transgénique, transformée par une séquence d'acide nucléique dérivée de tout ou partie de la séquence d'un gène de type TONNEAUl .
14) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on modifie l'expression de la protéine de type TONNEAUl en utilisant au moins un produit inhibiteur ou activateur de ladite protéine.
15) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre pour contrôler la taille d'une plante, ou d'au moins un organe de celle- ci.
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