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WO1999033978A1 - Nouvelles proteines receptrices du type conjugue guanosine triphosphate (gtp)-proteine de liaison - Google Patents

Nouvelles proteines receptrices du type conjugue guanosine triphosphate (gtp)-proteine de liaison Download PDF

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WO1999033978A1
WO1999033978A1 PCT/JP1998/005967 JP9805967W WO9933978A1 WO 1999033978 A1 WO1999033978 A1 WO 1999033978A1 JP 9805967 W JP9805967 W JP 9805967W WO 9933978 A1 WO9933978 A1 WO 9933978A1
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WO
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protein
receptor protein
seq
dna
coupled receptor
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005967
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English (en)
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Inventor
Hiraku Itadani
Tetsuo Takimura
Takao Nakamura
Masataka Ohta
Original Assignee
Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • GTP Novel guanosine triphosphate
  • the present invention relates to a novel guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor protein, DNA encoding the protein, and a method for screening a drug candidate compound using the same.
  • G protein conjugated guanosine triphosphate binding protein
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and molecules that regulate the functions of these living cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and physiologically active substances It plays a very important role as a target. For this reason, G protein-coupled receptor Yuichi protein has attracted much attention as a target for drug development.
  • G protein-coupled receptor proteins have been reported to be muscular phosphorus acetylcholine-receptor Yuichi Ml, M2, M3, M4 (Peralta, E. G. et al., EMBO J. 6, 3923-3929 ( 1987)), Muscarinic AcetylcholineRecept Yuichi M5 (Bonner, T. I. et al., Neuron 1, 403-410 (1988)), Adenosine 'Recep Yuichi Al (Libert, F. et al., Science 244, 569-572 (1989)), 1A Adrenoresep Yuichi (Bruno 179, 1485-1490 (1991)), ⁇ 1 adrenocept (Frielle, T.
  • terazosin hydrochloride hypertensive agent, 1-adrenocept and angiogonist
  • atenolol arrhythmic agent, 1-adrenocept
  • Yuichi.Ango gonist dicyclomine hydrochloride (antispasmodic, acetylcholine / recept yuichi / angyu gonist), ranitidine hydrochloride (peptic ulcer treatment, histamine / recept yuichi H2 / angyu gonist), trazodone hydrochloride (anti Depressants, serotonin 'Recept Yuichi 5-HT1B ⁇ Engonist, buprenorphine hydrochloride (analgesic, Obioid ⁇ Recept Yuichi ⁇ Agonist), etc. have been developed (Reference: Stadel. JM et al. , Trends Pharm. Sci. 18, 430-437 (
  • the hypothalamus which is a part of the brain, has various programs that trigger specific reactions as the center of the autonomic nervous system, and contributes to the homeostasis of the internal environment through various output systems.
  • they release hormones such as thyroid-stimulating hormone-releasing hormone, gonadotropin-releasing hormone, and growth hormone-releasing hormone, and through the action of these hormones on specific receptors expressed on target cells, endocrine systemic. Regulating the system. It is considered that such an output system in the hypothalamus involves a receptor in the hypothalamus and a substance acting on the receptor.
  • An object of the present invention is to provide a novel G protein-coupled receptor Yuichi protein expressed in the brain (particularly, the thalamus and hypothalamus). Another object of the present invention is to provide a method for screening ligands and drug candidate compounds using the receptor protein.
  • the present inventors originally extracted a highly conserved region in a known G protein-coupled receptor protein, and designed primers corresponding thereto.
  • Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed on nRNA from rat and hypothalamus.
  • clones were randomly selected from among the many clones amplified by this method, and their partial nucleotide sequences were determined.
  • the cDNA of a clone determined to encode a known G protein-coupled receptor protein by similarity search was used as a probe. Perform a colony hybridization, and do not hybridize to any probe.
  • a probe is prepared based on the nucleotide sequence of the negative clone, and a cDNA library derived from rat thalamus and hypothalamus is screened to obtain a full-length cDNA encoding rat G protein-coupled receptor protein. Successfully released.
  • the present inventors have also succeeded in isolating a human full-length cDNA corresponding to the obtained rat cDNA. Further, the present inventors have analyzed the tissue specificity of the expression of these genes by Northern blot analysis and found that these genes are specifically expressed in the brain.
  • G protein-coupled receptor proteins are expected to be very useful in screening compounds and ligands that regulate signal transduction from receptor proteins, which are expected to be used as pharmaceuticals.
  • the present invention relates to novel G protein-coupled receptor proteins expressed in the brain, DNAs encoding these proteins, and methods for screening for ligands and drug candidate compounds using these proteins.
  • a guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added in the amino acid sequence. Evening quality,
  • guanosine triphosphate binding protein-coupled receptor protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence
  • a vector comprising the DNA according to any one of (5) to (7),
  • a test compound is brought into contact with the receptor protein described in any of (1) to (4) or the partial peptide described in (5), and a compound that binds to the protein or the partial peptide is selected.
  • a ligand is brought into contact with the receptor protein according to any one of (1) to (4) or the partial peptide according to (5), and the protein or its protein is contacted.
  • step (b) comparing the binding activity detected in step (a) with the binding activity in the absence of the test compound, and selecting a compound that reduces the binding activity between the protein or partial peptide and the ligand.
  • the “G protein-coupled receptor protein” refers to a receptor protein that performs intracellular signal transduction through activation of G protein.
  • the term “ligand” refers to a natural compound capable of binding to a G protein-coupled receptor protein to induce signal transduction.
  • “agonist” refers to a compound having the same physiological activity as a ligand of a G protein-coupled receptor protein, and both a natural compound and an artificially synthesized compound are used. included.
  • the term “angi gonist” refers to a compound having the ability to suppress the physiological activity of the ligand of the G protein-coupled receptor protein, and is a natural compound or an artificially synthesized compound. Both compounds are included.
  • “protein” and “peptide” also include salts thereof.
  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of rat-derived G protein-coupled receptor protein “BG2” isolated according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of “BG2” protein is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 21 Shown in addition, the nucleotide sequence of the cDNA of human-derived G protein-coupled receptor protein “BG2” isolated by the present invention is represented by SEQ ID NO: 21 and the amino acid sequence of the “BG2” protein is represented by SEQ ID NO: 20.
  • Rat “BG2” protein is a known G protein-coupled receptor protein, muscarinic acetylcholine receptor protein M3 protein (Lee, PH et al., Biochim. Biophys. Acta 1223, 151-154 ( Et al., Neuron 1, 403-410 (1988)), murine acetylcholine receptor Yuichi M5 protein (Bonner, T.I. et al., Neuron 1, 403-410 (1988)), mouse-derived human 2A adrenoceptor (Link, R. et al.). Pharmacol. 42, 16-27 (1992)) and 26%, 25, and 29% homology. Have.
  • rat “BG2” protein retained the hydrophobic domains (seven transmembrane regions) characteristic of the G protein-coupled receptor Yuichi protein. Furthermore, the size of the coding region of the rat “BG2” cDNA was about 1.2 kb, which is almost the same as that of the known G protein-coupled receptor Yuichi protein.
  • human “BG2” protein is a known G protein-coupled receptor protein, human-derived human 2C-1 adrenocept (Regan, J. et al., Proc. Natl. Acad. Scad. USA85, 6301-6305 (1988)), mouse-derived /?-1 adrenocept (Jasper JR et al., Biochem. Biophys. Acta 1178, 307-309 (1993)), human-derived musculin Sex acetylcholine receptor Yuichi M3 (Peralta, EG et al., EMBO J. 6, 3923-3929 (1987)) and 32 ° 28% each, having a homology of 27.
  • BG2 G protein-coupled receptor family of proteins.
  • the fact that the “BG2” protein is a G protein-coupled receptor protein indicates that the ligand performs signaling through activation of the G protein.
  • the hippocampus plays an important role in memory and learning, the cerebellum controls somatic movements, and the hypothalamus is the center of the autonomic nervous system.
  • the “BG2” protein is thought to be involved in regulating these functions. Therefore, agonists and angels who can regulate the function of the “BG2” protein and its gene, and the “BG2” protein, improve memory and learning disorders, and improve the autonomic nervous system such as blood pressure, digestion, body temperature, and eating. Application to regulation is conceivable.
  • the “BG2” protein can be prepared as a natural protein or as a recombinant protein using genetic recombination technology. Natural proteins are found in tissues such as the thalamus or hypothalamus where the “BG2” protein is thought to be expressed.
  • the extract can be prepared by performing affinity chromatography using the “BG2” antibody described below.
  • a recombinant protein can be prepared by culturing cells transformed with a DNA encoding the “BG2” protein, as described later.
  • BG2 native rat ⁇ human “BG2” protein
  • SEQ ID NO: 1 native rat ⁇ human “BG2” protein
  • G protein of the present invention is also a mutant in which the amino acid sequence is mutated with respect to the natural protein due to amino acid substitution, deletion, addition, or the like, and has the same function as the natural protein. Conjugated receptor contained in protein.
  • Methods for modifying amino acids known to those skilled in the art include, for example, the Knkel method (Kunkel, TA et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)), the double primer method (Zoller, MJ and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)), cassette mutation method (Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)), megaprimer method (Sarkar, G. and So recitation er, SS, Biotechniques 8, 404-407 (1990)).
  • the number of amino acid mutations in a functionally equivalent protein is usually within 10 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 3 amino acids (eg, 1 amino acid).
  • those skilled in the art can prepare functionally equivalent proteins that are encoded by DNA that hybridizes with rat-human “BG2” cMA, and these proteins are also used in the present invention.
  • G protein-coupled receptor is included in the protein.
  • Other organisms from which functionally equivalent proteins can be isolated include, for example, mice, egrets, ovines, oaks, dogs, dogs, etc., especially brain tissues (eg, thalamus and hypothalamus, etc.) ) Are suitable for isolation.
  • MA which encodes a protein having a function equivalent to that of rat ⁇ human “BG2” protein, usually has high homology to the base sequence of rat ⁇ human “BG2” cDNA (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 21).
  • High homology refers to sequence identity of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more at the base level. Sequence homology can be determined using the FASTA program.
  • Hybridization for isolation of DNA highly homologous to rat ⁇ human“ BG2 ”cDNA Conditions for hybridization are usually 6 ⁇ SSC, 40% formamide, 25 ° C. Wash at 1X SSC, 55 ° C. As preferable conditions, hybridization is performed at “6 ⁇ SSC, 40% formamide, 37 ° C.”, and washing is performed at “0.2 ⁇ SS 55 ° C.”. As more preferable conditions, hybridization is performed at “6 ⁇ SSC, 50% formamide, 37 ° C.”, and washing is performed at “0.1 ⁇ SSC, 62 ° C.”. It should be noted that those skilled in the art can realize the same stringency hybridization conditions as those described above by appropriately selecting various conditions such as the SSC dilution ratio, formamide concentration, and temperature. .
  • the present invention also includes the partial peptides of the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention includes, for example, a partial peptide of the N-terminal region of the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the peptide can be used for preparing an antibody. it can.
  • the partial polypeptides of the present invention have a chain length of at least 15 amino acids, preferably 20 amino acids.
  • the present invention provides the G protein-coupled receptor protein of the present invention or It relates to DNA encoding the partial peptide.
  • the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein and its partial peptide of the present invention is not particularly limited as long as it can encode these proteins and peptides. CDNA, genomic DNA, and synthetic DNA Is included.
  • the cDNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention may be, for example, the cDNA of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 21 or a fragment thereof, an RNA complementary thereto, or a cDNA of the cDNA.
  • cDNA library from Screening can be carried out by hybridizing the DNA with the DNA.
  • an oligonucleotide corresponding to the nucleotide sequence of these cDNAs is synthesized, and cDNA derived from an appropriate tissue (for example, the thalamus or hypothalamus) is amplified to form type II by polymerase chain reaction and cloned.
  • an appropriate tissue for example, the thalamus or hypothalamus
  • Genomic DNA for example, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 cDNA or fragment thereof according to 1, their complementary RNA or synthetic oligonucleotides comprising a portion of sequence of the cDNA 3 2 P or the like, It can be screened by labeling and hybridizing to a genomic DNA library. Alternatively, oligo nucleotides corresponding to the nucleotide sequences of these cDNAs can be synthesized, and the genomic MA can be amplified to the type III by polymerase chain reaction and cloned.
  • an oligonucleotide having a partial sequence of the cDNA described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 21 is chemically synthesized, annealed into a double strand, and bound by DNA ligase. (Khorana, HG et al., J. Biol. Chem. 251, 565-570 (1976); Goeddel DV et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106-10 (1979)).
  • the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, the DNA described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 21) is inserted into an appropriate expression vector.
  • the transformant obtained by introducing the DNA into appropriate cells is cultured, and the expressed protein is purified.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein. Since the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a receptor protein, it can be prepared by expressing it on the cell membrane.
  • plasmid vector pET-3 Rosenberg, AH et al., Gene 56, 125-35 (198 7)
  • pGEX-1 Smith, DB and Johnson, KS, Gene 67, 31-40 (1988)
  • Transformation of E. coli is performed by the Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol.
  • the host is fission yeast Schizosaccharomyces pombe
  • the plasmid vector pESP-1 (Lu, Q. et al., Gene 200, 135-144 (1997)) or the like is used.
  • Yeast transformation is performed, for example, by the Spheroplast method (Beach, D. and Nurse, P., Nature 290, 140).
  • the host is mammalian cell, such as Chinese hamster ovary cells CH 0, when such human HeLa cells, the introduction of a recombinant DNA into c mammalian cells the vector one such pMSG (Clontech) is used, Calcium phosphate method (Graham, FL and van derEb, AJ, Virology 52, 456-467 (1973)), DEAE-dextran method (Suss thigh, DJ and Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643) (1984)), the Lipofux method (Feigner, PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
  • baculovirus vector- P BacPAK8 / 9 (Clontech) is used. Transformation of insect cells can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1980).
  • the recombinant protein expressed in a host cell can be purified by a known method. In addition, for example, it is synthesized in the form of a fusion protein in which a histidine residue tag, glutathione S-transferase (GST), etc.
  • the target protein is linked to the N-terminus, and is bound to a metal chelate resin or GST affinity resin.
  • a metal chelate resin or GST affinity resin For example, when pESP-1 is used as a vector, the target protein is synthesized as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST). Protein can be purified. In order to separate the target protein from the fusion protein, the target protein is cleaved with, for example, thrombin or blood coagulation factor Xa.
  • the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention can also be applied to gene therapy for diseases caused by the mutation.
  • retroviral vectors (Da nos, 0. and Mulligan, RC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6460-6464 (1988)) Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543 (1993)), adenovirus vector (Wickham, TJ et al., Cell 73, 309-319 (1993)).
  • adenovirus vector (Wickham, TJ et al., Cell 73, 309-319 (1993)).
  • Such a method is used.
  • bone marrow transplantation, subcutaneous injection, intravenous injection, etc. are used (Asano, S., Protein Nucleic Acid Enzyme, 40, 2491-2495 (1995)).
  • the present invention also relates to an antibody that binds to the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the antibody that binds to the G protein-coupled receptor protein of the present invention is prepared by a method known to those skilled in the art (for example, see “New Biochemistry Experiment Course 1, Protein 1, 389-406, Tokyo Chemical Dojin”). It is possible.
  • the preparation of the polyclonal antibody is performed, for example, as follows. 2.
  • Administer an appropriate amount of the above protein or peptide to immunized animals such as herons, guinea pigs, mice, and chickens.
  • Administration may be with an adjuvant (FIA or FCA) that promotes antibody production.
  • Administration is usually performed every few weeks. Multiple immunizations can raise antibody titers Wear.
  • a polyclonal antibody can be prepared by subjecting this antiserum to fractionation by, for example, ammonium sulfate precipitation or anion chromatography, and affinity purification using protein A or an immobilized antigen.
  • preparation of a monoclonal antibody is performed, for example, as follows. An immunized animal is immunized with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or its partial peptide in the same manner as described above, and after the final immunization, a spleen or lymph node is collected from the immunized animal.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells contained in the spleen or lymph nodes are fused using polyethylene glycol or the like to prepare a hybridoma.
  • the desired hybridoma is screened, cultured, and a monoclonal antibody can be prepared from the culture supernatant.
  • the monoclonal antibody can be purified, for example, by ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, or affinity purification using protein A or immobilized antigen.
  • the antibody thus prepared is used for affinity purification of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, and is also used for diseases caused by abnormal expression of the G protein-coupled receptor protein of the present invention. It can be used for antibody treatment, detection of the expression level of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, and the like.
  • human antibodies or human antibodies are preferred.
  • the human antibody is a mouse-human chimeric antibody
  • an antibody gene is isolated from a mouse cell that produces an antibody against the G protein-coupled receptor protein of the present invention, and the H chain constant region is defined as a human IgE H chain. It can be prepared by recombination into the normal gene and introduction into mouse myeloma cell J558L (Neuberger, MS et al., Nature 3, 14, 268-270 (1985)).
  • a human antibody can be prepared by immunizing a mouse whose immune system has been replaced with a human with the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the present invention relates to the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the present invention relates to a method for screening gand. This screening method includes a step of bringing a test compound into contact with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof, and selecting a compound that binds to these proteins or the peptide.
  • test compounds include, for example, acetylcholine, adenosine, adrenaline, noradrenaline, angiotensin, bombesin, bradykinin, C5a anaphylatoxin, calcitonin, canapinoid, chemokine, cholecystokinin, dopamine, endocerin, f Olmilmethionyl peptide, GABA, galanin, glucagon, glumic acid, glycopeptide hormone, hissamine, 5-hydroxytryptophan, leukotriene, melanocortin, neuropeptide Y, neurotensin, odorant , Obioid peptide, Opsin, Parathyroid hormone, Platelet activating factor, Prosthenoid, Somatosintin, Yukinin, Thrombin, Thyrotropin releasing hormone, Vasopressin, Oxytocin (Watson, S. and Arkinstal l, S., The test compounds
  • G protein-coupled receptor protein of the present invention used for screening may be, for example, a form expressed in a desired cell (including a transformant treated to express the protein) or a cell surface; May be in the form of a cell membrane fraction, or in a form bound to an affinity column.
  • the test compound used in the screening is appropriately labeled as necessary and used.
  • the label examples include, but are not limited to, radiolabels and fluorescent labels.
  • the binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and the test compound can be detected by a label attached to the compound bound to the G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, the amount
  • signal transduction into cells by binding of the test compound to the G protein-coupled receptor protein of the present invention on the cell surface for example, G protein Protein activation, Ca 2+ or cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change
  • G protein Protein activation, Ca 2+ or cAMP concentration change for example, G protein Protein activation, Ca 2+ or cAMP concentration change, phospholipase C activation, pH change
  • the literature Cell Calcium 14, 663-671 (1993), Analytical Biochemistry 226, 349-354 (1995), J.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound having an activity of inhibiting the binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and its ligand.
  • This screening method comprises the steps of ( a ) bringing a ligand into contact with a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the presence of a test compound, and reacting the ligand with the protein or its partial peptide. (B) comparing the binding activity detected in step (a) with the binding activity in the absence of the test compound, and comparing the binding activity in the absence of the test compound with the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Or a step of selecting a compound that reduces the binding activity between the partial peptide and the ligand.
  • Test compounds include, but are not limited to, proteins, peptides, non-peptidic compounds, artificially synthesized compounds, extracts of tissues and cells, and serum.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention used in the screening may be, for example, a form expressed in a desired cell (including a transformant treated to express the protein) or a cell surface; It may be in a form as a cell membrane fraction or in a form bound to an affinity column.
  • the ligand used for screening is appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include, but are not limited to, a radioactive label and a fluorescent label.
  • the binding activity between the G protein-coupled receptor protein of the present invention or its partial peptide and the ligand is determined by the G protein-coupled receptor protein of the present invention or its partial peptide.
  • the G protein-coupled receptor of the present invention on the cell surface of the test compound is analyzed.
  • Signal transduction into cells by binding to proteins eg, activation of G protein, change in Ca 2+ or cAMP concentration, activation of phospholipase C, change in pH
  • proteins eg, activation of G protein, change in Ca 2+ or cAMP concentration, activation of phospholipase C, change in pH
  • Such compounds include compounds having an activity of binding to the G protein-coupled receptor protein of the present invention to induce signal transmission into cells (agonist) and compounds having no such activity. (An evening gonist).
  • the agonist has the same physiological activity as the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, while the agonist has the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Suppresses biological activity. For this reason, these agonists and angelists are useful as pharmaceutical compositions for treating diseases caused by abnormalities in the signal transduction system via the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the present invention provides the binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand thereof, which comprises the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the present invention relates to a kit for screening for compounds that inhibit the inhibition.
  • the G protein-coupled receptor protein or its partial peptide of the present invention in the kit of the present invention can be used, for example, in a desired cell (including a transformant treated so as to express the protein) or on the cell surface.
  • a form expressed in It may be in the form of a cell membrane fraction of cells or in a form bound to an affinity column.
  • kit of the present invention include, in addition to the above-mentioned receptor protein sample, for example, ligand samples (labeled and unlabeled), It may contain a buffer solution, a washing solution, or the like.
  • ligand samples labeled and unlabeled
  • It may contain a buffer solution, a washing solution, or the like.
  • the label attached to the ligand include a radiolabel, a fluorescent label, and the like.
  • the kit of the present invention can be used, for example, according to the description in the gazette (JP-A-9-268). BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows a hydrophobicity plot of the mouse “BG2” protein.
  • the numbers 1 to 7 in the figure indicate the seven characteristic hydrophobic regions (transmembrane regions) of the G protein-coupled receptor protein.
  • the numbers at the bottom of the figure indicate the amino acid numbers of the “BG2” protein.
  • FIG. 2 shows the results of Northern plot analysis of the tissue specificity of human and mouse “BG2” gene expression.
  • FIG. 3 shows the results of analysis of the localization of mouse “BG2” gene expression in the brain by in situ hybridization.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing the localization of the expression of the mouse “BG2” gene in the spinal cord by in situ hybridization.
  • Sense was obtained by hybridization using a sense RNA probe (does not hybridize with mRNA; negative control).
  • antisense produced an antisense RNA probe (which hybridized with mRNA). The result of performing the hybridization using this method is shown.
  • G protein-coupled receptors have the structural feature of penetrating the cell membrane seven times, and the transmembrane domain and the amino acid sequence near it are often well conserved.
  • the present inventors have firstly developed mouse neuropeptide Y receptor YK GenBank Acession Number Z18280), rat Y1 (Z11504), human Y1 (M84755), and mouse neuropeptide Y, which are known G protein-coupled receptors.
  • a single-stranded cDNA was synthesized from poly (A) + RNA derived from rat (Rattus norvegicus) thalamus and hypothalamus using MA-PCR kit (Takara Shuzo), and these two primers were used.
  • Polymerase chain reaction (PCR) was performed. Specifically, poly (A) + RNA was purified from rat thalamus and hypothalamus using Fasttrack 2.0 kit (Invitrogen). According to the protocol of the RNA-PCR kit (Takara Shuzo), complementary strand DM was synthesized from 75 ng of the purified poly (A) + RNA. Amplification by polymerase chain reaction (PCR) was performed using the entire cDNA.
  • the composition of the reaction solution was 0.15 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl 2 , 0.025 U / ⁇ 1 rTaq polymerase (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ M degenerate primers Fg (SEQ ID NO: 3) and Rb ( SEQ ID NO: 4)
  • the total reaction volume was adjusted to 130 ⁇ 1 with a PCR buffer supplied with 10X enzyme, and then dispensed into 6 tubes of 201 each.
  • PCR was performed with Peltiersa-Marucycler PTC200 (MJ Research) under the conditions of 35 cycles of 94 ° C for 2 minutes, “94 ° C for 30 seconds, 48 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds” at 72 ° C for 8 minutes. Was.
  • the six reaction solutions were collected into one, and the amplified product was purified using the Wizard PCR Purification Kit (Promega) and eluted with 30/1 TE. This was cloned into the pCR2,1 vector of the T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen).
  • XL1-Blue was used as a host, and transformed with E. coli Pulsa-1 (BioRad).
  • Probes were prepared by amplifying the input fragments of each clone by PCR, purifying with the Wizard PCR purification kit (Promega), and using Prime-It II Random Primer-Labeling Kit (Stratagene). shed - with 3 2 P] of even labeled with dCTP. Colony hybridization was performed according to a conventional method (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd edn., (1989)).
  • the partial nucleotide sequences of clones negative for both coiled-coil-like protein 1 and neuropeptide Y receptor Y1 were determined.
  • Type I for nucleotide sequence determination includes: The insert was amplified from the culture solution of each clone by PCR, and DNA purified using a PCR product purification kit (Amersham) was used. Dye Primer Cycle Sequencing Kit FS was used for the enzymatic reaction, and DNA Sequencer 377 was used for electrophoresis of the reaction product.
  • the blast program of the Wisconsin Package performed a similarity search on the obtained sequence, and as a result, a clone was found that showed significant similarity to the muscular phosphorus acetylcholine receptor Yuichi M5 (GenBank Accession Number M22926). Was. This clone was deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • pEFlx is obtained by improving pcDNA3 (Invitrogen) as follows.
  • the obtained plasmid DNA is digested with Xhol, the ends are blunt-ended with Klenow enzyme (Takara Shuzo), and the DNA ligase kit (Takara Shuzo) is used. I made a self-religion and closed it.
  • the obtained plasmid DNA was digested with BamHI and HindIII, and the insert portion was recovered.
  • Plasmid pcDNA3DNA was digested with Mlul (Takara Shuzo), blunt-ended with Klenow enzyme (Takara Shuzo), self-ligated with a DNA ligation kit, and cloned.
  • the resulting plasmid DNA is digested with ⁇ (New England Biolab) and Smal (Takara Shuzo), blunt-ended with Klenow enzyme (Takara Shuzo), and then self-ligated with a DNA ligation kit. And closed.
  • the obtained plasmid DNA was digested with Bgl II (Takara Shuzo) and Hind II, and a fragment excluding a portion of the CMV promoter was recovered, and the insert fragment recovered in (1) using a DNA ligase kit was collected. Connected and cloned. Thus, pEFlx was constructed.
  • an oligonucleotide probe (SEQ ID NO: 8 / CCTTCTGCATCCCATTGTACGTACC) was synthesized from the nucleotide sequence of the cDNA fragment, and the rat thalamus prepared as described above according to the protocol of the Gentrano-1 cDNA Positive Selection System (Gibco BRL). And several clones were obtained from a cDNA library derived from the hypothalamus. Next, colony hybridization was carried out using the cDNA fragment inserted into the previously isolated clone (FERM P-16572) as a probe to obtain a positive clone. This clone was deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • Plasmid DNA was prepared using Qiaprep Midi Kit (Qiagen), and the entire nucleotide sequence was determined by the shotgun method (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd edn., (1989)). The fragmented DNA was fractionated by 2% agarose low melting gel electrophoresis using Biolab Yuichi (Tosho Denki Co., Ltd.) using a closed ultrasonic biological material processing device.
  • the fragment was purified with a gene clean spin kit (Mol01), blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo), and cloned into HincI I / BAP-treated pUC118 vector.
  • XL1-Blue was used as a host, and transformation was performed with E. coli pulsar (Bio-Rad).
  • the obtained shotgun clones were sequenced using Dye Primer Cycle Sequencing Kit FS (PerkinElmer) or Die Yu Mine One Night Cycle Sequencing Kit FS (PerkinElmer). The obtained sequence was combined and edited with DNA sequencing software, Sequencia (Hitachi Software), and the entire nucleotide sequence was determined.
  • the entire nucleotide sequence was found to be 2700 bp and encode a protein consisting of 413 amino acids (SEQ ID NO: 5). Due to the presence of a stop codon 5 'to the open' reading 'frame, this cDNA is considered to include the entire coding region (SEQ ID NO: 2). When this sequence was translated into an amino acid sequence, the first, second, third, fourth, fifth, sixth and seventh transmembrane regions were identified on the hydrophobicity plot (FIG. 1).
  • the size of the open reading frame was about 1.2 kb, which was comparable to that of the known G protein-coupled receptor Yuichi protein.
  • the G protein-coupled receptor protein has some commonality in its amino acid sequence and forms one protein family. A homologous search was performed using the amino acid sequence encoded by the isolated cDNA, and a muscarinic acetylacetylcholine receptor, a known G protein-coupled receptor protein, was identified as M3. Evening protein (Lee, PH et al., Biochim. Biophys. Acta 1223, 151-154 (1994)), human muscarinic acetylcholine receptor Yuichi M5 protein (Bonner, T. I.
  • the resulting phage clone was digested with Sacl, and three bands of one clone were subcloned. These were named II (SEQ ID NO: 11), 13 (SEQ ID NO: 12), and 15 (SEQ ID NO: 13), respectively. The sequences of these fragments were determined, and the hypothetical sequence was examined by comparison with a rat homolog.
  • PCR products were named probe 2 and probe 3, respectively. They were seeded in plates at a concentration of human hypothalamic cDNA (1.3xl0 6 phage) 150 ⁇ plates per Ri 5.6xl0 4. The obtained subpool was checked by PCR using primers YS03 and YS05. One positive subpool was screened using probe 2 in the same manner as in the screening of the genomic library. As a result, one cDNA clone containing 5, UTR was obtained from TM5 and named cDNA clone 1.
  • cDNA clone 1 was digested with SacI I and the 3.3 kb band containing the vector and 5 'end region was treated with shrimp alkaline phosphatase.
  • cDNA clone 2 was also digested with SacII and the 1.7 kb fragment was ligated to the 3.3 kb fragment from cDNA clone 1. The clone into which the ligated fragment was inserted was deposited at the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology.
  • BG2 protein is a known G protein-coupled receptor protein, human Yukihi-2C-1 adrenocept (Regan, JW et al., Proc. Natl. Acad. Scad. USA 85, 6301). -6305 (1988)), adrenocept Yuichi from mouse (Jasper JR et al., Biochem. Biophys. Acta 1178, 307-309 (1993)), human muscarinic acetylcholine receptor Yuichi M3 (Peralta, EG et al. al., EMBO J. 6, 3923-3929 (1987)) and 32 to 28, respectively, with a homology of 27%.
  • pro portion 4 In the detection of the human "BG2", pro portion 4 a 32 P ⁇ -dCTP (Amershajn, Prime It II) And used as a cDNA probe. Further, as a plotting membrane, an MTN (Human Multiple Tissue Northern) blot (Clontech) was used. After prehybridization at 68 ° C for 30 minutes in ExpressHyb solution (Clontech), the probe was hybridized to the membrane at 68 ° C for 1 hour (final probe concentration was 1.5xlO s cpm / ml) ).
  • the plot was washed with 2xSSC containing 0.1% SDS at 42 ° C for 30 minutes, and the final wash was performed with O.lxSSC containing 0.1% SDS at 50 ° C for 30 minutes. The plot was then exposed to Kodak autoradiographic film at -80 ° C for 2.5 days.
  • the probe was prepared by converting the rat “BG2” cDNA into type III, using the sense primer MF2 (SEQ ID NO: 22 / TGCATCCCATTGTACGTNCC) and antisense primer MR1 (SEQ ID NO: 24 / TGCTCTGGGACACCATCTTC). After amplification by PCR using PCR, the amplified product was purified by agarose gel electrophoresis, and prepared by labeling in the same manner as in the above human.
  • Rat MTN Multiple Tissue Northern
  • a hybridization buffer (50% formamide, 4 x SSPE, 1% SDS, 0.53 ⁇ 4 BLOTTO, 100 zg / ml salmon sperm DNA)
  • hybridize overnight at 42 ° C. went. Washing was performed at 65 ° C. in O.lxSSC containing 0.1% SDS.
  • the plot was then exposed at -80 ° C to Kodak's autoradiographic film.
  • tissue sample was embedded in paraffin wax by a conventional method, and a paraffin section having a thickness of 6 / m was prepared using a rotating microtome (Model HM 355; MICROM Laborgerate GmbH). Sections were stored in a humidified state at -20 ° C until in situ hybridization was performed.
  • the plate was incubated with a blocking reagent (buffer 2) for 30 minutes at room temperature.
  • the sections were incubated with alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody for 60 minutes at room temperature.
  • the sections were incubated with an NBT / X phosphate solution diluted with buffer 3 at room temperature for 12 to 14 hours.
  • sections were mounted in glycerol or Permount.
  • the BG2 cDNA probe strongly hybridized in the hippocampus and spinal cord.
  • the hybridization also detected moderate hybridization signals in the hypothalamus, thalamus and cerebellum.
  • a novel G protein-coupled receptor protein expressed specifically in the brain and its gene have been provided. This has enabled screening of candidate compounds for ligand / drug using the receptor protein. These candidate compounds for ligand drugs are expected to be used, for example, in the diagnosis and treatment of diseases caused by abnormalities in the signal transduction system via the G protein-coupled receptor protein of the present invention.

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Description

新規なグアノシン三リン酸 （G T P ) 結合タンパク質共役型
のレセプ夕一夕ンパク質 技術分野
本発明は、 新規なグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプ夕一タン パク質、 該タンパク質をコードする DNA、 並びにこれらを利用した医薬品候補化合 物のスクリーニング方法に関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一タンパ ク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプ夕一タンパク質の多くは 共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク質（以下、 「Gタンパク質」 と略称す る場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なつている。 このため、 このレセプ夕一タンパク質は G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質と総称され ている。 あるいは 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 7回膜貫通型レセプ夕一タンパク質とも総称されている。
Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面 に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝 達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。このた め、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質は医薬品開発の標的として非常に注 目されている。
Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質としては、 これまでにムス力リン性ァ セチルコリン · レセプ夕一 Ml、 M2、 M3、 M4 (Peralta, E . G. et al .， EMBO J. 6， 3923-3929 ( 1987)) 、 ムスカリン性アセチルコリン · レセプ夕一M5 (Bonner, T. I. et al., Neuron 1, 403-410 (1988)) 、 アデノシン ' レセプ夕一 Al (Libert, F. et al., Science 244， 569-572 (1989)) 、 ひ 1Aァドレノレセプ夕一 （Bruno, J. F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1485-1490 (1991)) 、 β 1アドレノセプ夕ー （Frielle， T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 79 20-7924 (1987)) 、 アンジォテンシン · レセプ夕一 AT\ (Takayanagi, R.， et a l.， Biochem. Biophys. Res. Commun. 183， 910-916 (1992)) 、 エンドセリン ' レセプ夕一 ETA (Adachi, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180, 12 65-1272 (1991)) 、 ゴナドトロビン放出因子レセプ夕一 （Kaker, S. S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189, 289-295 (1992)) 、 ヒスタミ ン · レセ プ夕一 H2 (Ruat, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1658-1672 (199 2)) 、 神経ペプチド Yレセプ夕一 Yl (Larhammar, D. et al., J. Biol. Chem. 26 7, 10935-10938(1992)) 、 インターロイキン 8 · レセプ夕一 IL8RA (Holmes, W. E. et al., Science 2563, 1278-1280 (1991)) 、 ドーパミン · レセプ夕一 (Mah an, L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2196-2200 (1990)) 、 代謝 型グルタミン酸レセプ夕一 mGluRl (Masu M. et al., Nature 349, 760-765 (199 1)) 、 ソマトス夕チン · レセプ夕一 SSt (Yamada Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 251-255) などが報告されている (参考文献： Watson, S. and Ar kinstall, S. , The G - Protein Linked Receptor FactsBook, Academic Press (1 994)) 。 また、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を標的とし た医薬品と しては、 塩酸テラゾシン （血圧降下剤、 ひ 1アドレノセプ夕一·アン夕ゴニス ト） 、 ァテノロ一ル （不整脈用剤、 ? 1ァドレノセプ夕一 .アン夕ゴニスト） 、 塩酸ジサイクロミン （鎮痙剤、 ァセチルコリン · レセプ夕一 ·アン夕ゴニスト） 、 塩酸ラニチジン （消化性潰瘍治療剤、 ヒスタミン · レセプ夕一 H2 ·アン夕ゴニス ト） 、 塩酸トラゾドン （抗うつ剤、 セロトニン ' レセプ夕一 5-HT1B ·アン夕ゴニ スト） 、 塩酸ブプレノルフィン （鎮痛剤、 オビオイ ド · レセプ夕一 ·ァゴニス ト） などが開発されている （参考文献： Stadel. J. M. et al., Trends Pharm. Sci . 18, 430-437 ( 1997)；医薬品要覧第 5版、 薬業時報社） 。
ところで、 脳の一部である視床下部は、自律神経系の中枢として特定の反応を引 き起こす種々のプログラムを有しており、様々な出力系を介して内部環境の恒常性 に寄与している。例えば、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放 出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモンなどのホルモンを放出し、標的細胞に発現 している特異的な受容体に対するこれらホルモンの作用を介して、 全身の内分泌 系を調節している。このような視床下部における出力系には、 視床下部における受 容体とそれに作用する物質が関与していると考えられている。 このため、 視床下 部の出力系を調節している物質と視床下部におけるその特異的レセプ夕一との関 係を明らかにすることは、内分泌異常などに起因する疾患の治療などための医薬品 開発において非常に重要な手段であるといえる。 発明の開示
本発明は、脳 （特に、 視床や視床下部など） に発現する新規な Gタンパク質共役 型レセプ夕一タンパク質を提供することを課題とする。さらに、本発明は、 該レセ プ夕一タンパク質を利用したリガンドおよび医薬品の候補化合物のスクリ一ニン グ方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、 既知の Gタンパク質共役型レセ プ夕ータンパク質において高度に保存されている領域を独自に抽出し、 これに対 応するプライマーを設計してラッ ト視床及び視床下部由来の] nRNAに対し逆転写— ポリメラーゼ連鎖反応 （RT- PCR) を行った。 次いで、 これにより増幅された多く のクローンの中から無作為にクローンを選択し、 その部分的な塩基配列の決定を 行った。 そして、 塩基配列の決定を行ったクローンの中から公知のクローンを消 去するために、 類似性検索により公知の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 をコードすると判断されたクローンの cDNAをプローブとして、 コロニ一ハイブリ ダイゼ一シヨンを行ない、 いずれのプローブにもハイブリダィズしない陰性クロ —ンを選択した。 そして、 この陰性クローンの塩基配列に基づきプローブを調製 し、 ラット視床及び視床下部由来の cDNAライブラリーのスクリーニングを行うこ とにより、 ラット Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする全長 cDN Aを単離することに成功した。 また、 本発明者等は、 得られたラット cDNAに対応す るヒト全長 cDNAを単離することにも成功した。 また、 本発明者らは、 これら遺伝 子の発現の組織特異性をノーザンブロット解析した結果、 これら遺伝子が脳に特 異的に発現することを見出した。
これら Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質は、 医薬品としての利用が期待 されるレセプ夕一からのシグナル伝達を調節する化合物やリガンドのスクリー二 ングにおいて非常に有用であると考えられる。
従って、 本発明は、 脳に発現する新規な Gタンパク質共役型のレセプ夕一タンパ ク質、 これらタンパク質をコードする DNA、 およびこれらタンパク質を利用したリ ガンドおよび医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
より具体的には、
( 1 ) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において 1も しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、 グ ァノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプ夕一夕ンパク質、
( 2 ) 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において 1 もしくは複数のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプ夕一タンパク質、
( 3 ) 配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNAにハイブリダィズする DNAが コードするタンパク質であって、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレ セプ夕一夕ンパク質、
( 4 ) 配列番号： 2 1に記載の塩基配列からなる MAにハイブリダィズする DNA がコードするタンパク質であって、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の レセプ夕一夕ンパク質、 (5) (1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質の部分ぺプ チド、
(6) (1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または (5) に記載の部分ペプチドをコードする DNA、
( 7 ) 配列番号： 2または 21に記載の塩基配列を有する （ 6 ) に記載の DNA、
(8) (5) 乃至 （7) のいずれかに記載の DNAを含有することを特徴とするベ クタ一、
(9) (8) に記載のベクタ一を保持する形質転換体、
(10) (9)記載の形質転換体を培養する工程を含む、 （1) から （4) の いずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または （5) に記載の部分ペプチドの製 造方法、
(11) (1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または (5に記載の部分べプチドに被検化合物を接触させ、 該タンパク質または部分べ プチドに結合する化合物を選択する工程を含む、 （1) から （4) のいずれかに 記載のレセプ夕一タンパク質に結合するリガンドのスクリーニング方法、
(12) (1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質とそのリ ガンドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
(a)被検化合物の存在下で （1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一夕 ンパク質または （5) に記載の部分ペプチドにリガンドを接触させ、 該夕ンパク 質もしくはその部分べプチドとリガンドとの結合活性を検出する工程、
(b) 工程 （a) で検出された結合活性を、 被検化合物非存在下での結合活性と 比較し、 該タンパク質または部分ペプチドとリガンドとの結合活性を低下させる 化合物を選択する工程、 を含む方法、
(13) (1) から （4) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または (5) に記載の部分ペプチドを含有することを特徴とする、 （1) から （4) の いずれかに記載のレセプタータンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合 物のスクリ一ニング用キット、
( 1 4 ) ( 1 ) から （4 ) のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質に結合す る抗体、 に関する。
なお、 本発明において 「Gタンパク質共役型のレセプ夕一タンパク質」 とは、 G タンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なっているレセプ夕一夕 ンパク質を指す。 また、 本発明において 「リガンド」 とは、 Gタンパク質共役型の レセプ夕一タンパク質に結合して、 シグナル伝達を誘導する能力を有する天然の 化合物を指す。 また、 本発明において 「ァゴ二スト」 とは、 Gタンパク質共役型の レセプ夕一タンパク質のリガンドと同様の生理活性を有する化合物を指し、 天然 の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。 また、 本発明にお いて 「アン夕ゴニスト」 とは、 Gタンパク質共役型のレセプ夕一タンパク質のリガ ンドの生理活性を抑制する能力を有する化合物を指し、 天然の化合物および人工 的に合成された化合物の双方が含まれる。 また、 本発明における 「タンパク質」 および 「ペプチド」 にはその塩も含まれる。
本発明は、 新規な Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に関する。 本発明等 により単離されたラット由来の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 「BG2」 の cDNAの塩基配列を配列番号： 2に、 「BG2」 夕ンパク質のァミノ酸配列を配列番 号： 1に示す。 また、 本発明等により単離されたヒト由来の Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質 「BG2」 の cDNAの塩基配列を配列番号： 2 1に、 「BG2」 タン パク質のアミノ酸配列を配列番号： 2 0に示す。
ラッ ト 「BG2」 タンパク質は、 公知の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 であるゥシ由来ムスカリン性アセチルコリンレセプ夕一 M3タンパク質 （Lee， P. H. et al .， Biochim. Biophys. Acta 1223, 151-154 ( 1994)) 、 ヒト由来ムス力 リン性アセチルコリンレセプ夕一 M5タンパク質 （Bonner, T. I . et al .， Neuron 1, 403-410 ( 1988) ) 、 マウス由来ひ 2Aアドレノセプタ一 （Link, R. et al . , M ol . Pharmacol . 42, 16-27 ( 1992)) とそれそれ 26 %、 25 、 29 %のホモロジ一を 有する。 また、 疎水性プロッ ト解析の結果、 ラット 「BG2」 タンパク質は、 Gタン パク質共役型レセプ夕一タンパク質に特徴的な疎水性ドメイン （7つの膜貫通領 域） を保持していた。 さらに、 ラット 「BG2」 cDNAのコード領域のサイズも、公知 の Gタンパク質共役型レセブ夕一タンパク質と同程度の約 1.2kbを示した。
一方、 ヒ ト 「BG2」 タンパク質は、 公知の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質であ るヒト由来ひ- 2C-1アドレノセプ夕一 （Regan, J. . et al .， Proc . Natl . Acad. S c i . U. S. A.85 , 6301-6305 ( 1988 ) ) 、 マウス由来/? - 1アドレノセプ夕ー (Jasper J. R. et al .， Biochem. Biophys. Acta 1178, 307-309( 1993 )) 、 ヒ ト由来ムス力 リン性アセチルコリンレセプ夕一 M3 (Peralta, E. G. et al .， EMBO J. 6, 3923 -3929( 1987) ) とそれそれ 32 ° 28 %、 27 のホモロジ一を有する。
これらの事実は、これら 「BG2」 タンパク質が、 Gタンパク質共役型レセプ夕一夕 ンパク質ファミリ一に属することを示している。 そして、 「BG2」 タンパク質が G タンパク質共役型レセプ夕一タンパク質であることは、 そのリガンドの作用によ り G蛋白質の活性化を通じてシグナル伝達を行っていることを示している。
また、 ノーザンプロット解析により、 これら 「BG2」 蛋白質をコードする遺伝子 が脳特異的に発現することが示された。 また、 In situハイプリダイゼーシヨンに おいて、 ラット 「BG2」 遺伝子は、 海馬および脊髄で強い発現が認められ、 視床下部、 視床および小脳においても発現が検出された。
海馬は記憶や学習に重要な役割を担い、 小脳は体性運動の制御を行い、 視床下 部は自律神経系の中枢である。 「BG2」 蛋白質はこれら機能の調節に関与している と考えられる。 従って、 「BG2」 蛋白質やその遺伝子、 「BG2」 蛋白質の機能を調 節し得るァゴニストやアン夕ゴニストは、 記憶 '学習障害の改善や、 血圧、 消化、 体温、 摂食等の自律神経系の調節への応用が考えられる。
「BG2」 タンパク質は、 天然のタンパク質の他、 遺伝子組み換え技術を利用した 組換えタンパク質として調製することができる。 天然のタンパク質は、 例えば、 「BG2」 タンパク質が発現していると考えられる視床または視床下部などの組織の 抽出液に対し、 後述する 「BG2」 抗体を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィー を行う方法により調製することが可能である。 一方、 組換えタンパク質は、 後述 するように 「BG2」 タンパク質をコードする DNAで形質転換した細胞を培養するこ とにより調製することが可能である。
また、 当業者であれば、 公知の方法を用いて天然型のラットゃヒト 「BG2」 タン パク質 （それそれ配列番号： 1、 配列番号： 2 0 ) 中のアミノ酸の置換などの修 飾を行い、 天然型のタンパク質と同等の機能 （グアノシン三リン酸結合タンパク 質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なう機能） を有する改変タンパク 質を調製することが可能である。 また、 タンパク質のアミノ酸の変異は天然にお いても生じうる。 このようにアミノ酸の置換、 欠失、 付加などにより天然型の夕 ンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、 天然型のタンパク質 と同等の機能を有するタンパク質も本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパ ク質に含まれる。 当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、 例えば、 Ku nkel法 (Kunkel, T. A. et al .， Methods Enzymol . 154, 367-382 ( 1987)) 、 ダ ブルプライマ一法 （Zoller， M. J. and Smith, M. , Methods Enzymol . 154， 329 -350 ( 1987)) 、 カセット変異法 (Wells, et al .， Gene 34， 315-23 ( 1985 )) 、 メガプライマ一法 （Sarkar, G. and So誦 er, S. S.， Biotechniques 8, 404-407 ( 1990)) が挙げられる。 機能的に同等なタンパク質におけるアミノ酸の変異数は、 通常、 全アミノ酸の 10 以内、 好ましくは 10アミノ酸以内、 さらに好ましくは 3ァ ミノ酸以内 （例えば、 1アミノ酸） である。
また、 当業者にとってはハイブリダィゼ一シヨン技術 （Hanahan， D. and Mese lson, M. , Meth. Enzymol . 100， 333-342 ( 1983)、 Benton, W. D. and Davis, R. W.， Science 196， 180-182 ( 1977) ) などを用いて、 ラットゃヒト 「BG2」 cDNA配 列 （それそれ配列番号： 2、 配列番号： 2 1 ) またはその一部を基に、 種々の他 の生物からこれと相同性の高い DNAを単離し、 さらに単離した DNAからこれら 「BG 2」 タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることも常套手段である。 即 ち、 当業者であれば、 ラットゃヒト 「BG2」 cMAとハイブリダィズする DNAがコー ドするタンパク質であって、 機能的に同等なタンパク質を調製することが可能で あり、 これらのタンパク質もまた本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク 質に含まれる。 機能的に同等なタンパク質を単離する他の生物としては、 例えば、 マウス、 ゥサギ、 ヒヅジ、 ゥシ、 ィヌ、 ブ夕などが挙げられ、 特に脳の組織 （例 えば、 視床や視床下部など） が単離に適している。
ラッ トゃヒト 「BG2」 タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする MAは、 通常、 ラットゃヒト 「BG2」 cDNAの塩基配列 （配列番号： 2、 配列番号： 2 1 ) と高い相同性を有する。 高い相同性とは、 塩基レベルで少なくとも 70%以 上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上の配列の同一性を指す。 配 列の相同性は、 FASTAプログラムを利用して決定することができる。
ラットゃヒト 「BG2」 cDNAと相同性の高い DNAを単離するためのハイブリダィゼ —シヨンの条件としては、 通常、 ハイブリダィゼーシヨンを 「6 X SSC、 40 % ホ ルムアミ ド、 25 °C」 、 洗浄を 「1 X SSC、 55 °C」 で行う。 好ましい条件としては、 ハイブリダィゼ一シヨンを 「6 X SSC、 40 % ホルムアミ ド、 37 °C」 、 洗浄を 「0. 2 X SS 55 °C」 で行う。 さらに好ましい条件としては、 ハイブリダィゼ一ショ ンを 「6 X SSC、 50 % ホルムアミ ド、 37 °C」 、 洗浄を 「0.1 x SSC, 62 °C」 で行 う。 なお、 当業者であれば、 SSCの希釈率、 ホルムアミ ド濃度、 温度などの諸条件 を適宜選択することで、 上記の条件と同様のストリンジエンシーのハイブリダィ ゼ一ション条件を実現することができる。
また、 本発明は、 上記本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の部分 ペプチドを包含する。 本発明の部分ペプチドとしては、 例えば、 本発明の Gタンパ ク質共役型レセプ夕一夕ンパク質の N末端領域の部分ぺプチドが挙げられ、 該ぺプ チドは抗体の調製に利用することができる。 本発明の部分ポリペプチドは、 少な くとも 15アミノ酸、 好ましくは 20アミノ酸の鎖長を有する。
また、 本発明は、 上記本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質または その部分べプチドをコ一ドする DNAに関する。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ 夕一タンパク質やその部分べプチドをコードする DNAとしては、 これらタンパク質 やペプチドをコードしうるものであれば特に制限はなく、 cDNA、 ゲノム DNA、 およ び合成 DNAが含まれる。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコー ドする cDNAは、 例えば、 配列番号： 2や配列番号： 2 1に記載の cDNAあるいはそ の断片、 それらに相補的な RNA、 または該 cDNAの配列の一部を含む合成オリゴヌク レオチドを3 2 Pなどで標識し、 本発明の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 が発現している組織 （例えば、 視床、 視床下部） 由来の cDNAライブラリーにハイ ブリダィズさせることによりスクリーニングすることができる。 あるいは、 これ ら cDNAの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、 適当な組織 （例えば、 視床、 視床下部） 由来の cDNAを铸型にポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅し、 クロ 一二ングすることもできる。 ゲノム DNAは、 例えば、 配列番号： 2や配列番号： 2 1に記載の cDNAあるいはその断片、 それらに相補的な RNA、 または該 cDNAの配列の 一部を含む合成オリゴヌクレオチドを3 2 Pなどで標識し、 ゲノム DNAライブラリー にハイブリダィズさせることによりスクリーニングすることができる。 あるいは、 これら cDNAの塩基配列に対応するォリゴヌクレオチドを合成し、 ゲノム MAを銪型 にポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅し、 クローニングすることもできる。 一方、 合成 DNAは、 例えば、 配列番号： 2や配列番号： 2 1に記載の cDNAの部分配列を持 つオリゴヌクレオチドを化学合成し、 アニーリングさせて二本鎖にし、 DNAリガ一 ゼで結合させることにより調製することができる （Khorana, H. G. et al .， J. Biol . Chem. 251 , 565-570 ( 1976 )； Goeddel D. V. et al .， Proc. Natl . Acad. Sci. USA 76, 106-10 ( 1979)) 。
これら DNAは、 組換えタンパク質の生産に有用である。 即ち、 上記本発明の G夕 ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする DNA (例えば、 配列番号： 2や 配列番号： 2 1に記載の DNA) を適当な発現ベクターに挿入し、 該ベクタ一を適当 な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、 発現させたタンパク質を精製するこ とにより本発明の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を組換えタンパク質と して調製することが可能である。 本発明の G夕ンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク 質はレセプ夕一タンパク質であるため、 細胞膜に発現させて調製することが可能 である。
具体的には、 宿主が大腸菌ェシエリシァ 'コリ （Escherichia coli) の場合、 プラスミ ドベクタ一 pET- 3 (Rosenberg, A. H. et al., Gene 56， 125-35 (198 7)) 、 pGEX-1 (Smith, D. B. and Johnson, K. S.， Gene 67， 31-40 (1988)) な どが用いられる。 大腸菌の形質転換は、 Hanahan法 （Hanahan, D.， J. Mol. Biol.
166, 557-580 (1983)) 、 電気穿孔法 (Dower, W. J. et al., Nucl. Acids Res.
16, 6127-6145 (1988)) などで行う。 宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス -ポ ンべ （Schizosaccharomyces pombe) の場合には、 プラスミ ドベクター pESP- 1 (L u， Q. et al., Gene 200, 135-144 (1997)) などが用いられる。 酵母の形質転換 は、 例えば、 スフエロプラスト法 （Beach, D. and Nurse, P., Nature 290, 140
(1981)) 、 酢酸リチウム法 （Okazaki, K. et al., Nucleic Acids Res. 18， 64 85-6489 (1990)) などにより行なわれる。
一方、 宿主がほ乳動物細胞、 例えば、 チャイニーズハムスター卵巣由来細胞 CH 0、 ヒト HeLa細胞などの場合、 pMSG (クロンテク社） などのベクタ一が用いられる c ほ乳動物細胞への組換え DNAの導入は、 リン酸カルシウム法 （Graham, F. L. and van derEb, A. J., Virology 52， 456-467 (1973)) 、 DEAE-デキストラン法 （S uss腿， D. J. and Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643 (1984)) 、 リ ポフエクシヨン法 （Feigner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 84,
7413-7417 (1987)) 、 電気穿孔法 (Neumann, E. et al., EMB0 J. 1, 841-845 (1982)) などで行われる。 宿主が昆虫細胞の場合には、 バキュロウィルスべクタ -PBacPAK8/9 (クロンテク社） などが用いられる。 昆虫細胞の形質転換は、 例え ば、 バイオ/テクノロジー (Bio/Technology) ，6， 47-55(1980)) などに記載の方 法に従って行なうことができる。 宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、 公知の方法により精製する ことができる。 また、 例えば、 N末端にヒスチジン残基のタグ、 グル夕チオン Sト ランスフェラ一ゼ （GST) などを結合した融合タンパク質の形で合成し、 金属キレ —ト樹脂、 GST親和性レジンに結合させることにより精製することができる （Smi th, M. C. et al .， J. Biol . Chem. 263, 7211-7215 ( 1988)) 。 例えば、 ベクタ —として pESP- 1を用いた場合、 目的のタンパク質は、 グル夕チオン Sトランスフエ ラーゼ （GST) との融合タンパク質として合成されるため、 GST親和性レジンに結 合させることより組換えタンパク質を精製できる。 融合タンパク質から目的タン パク質を分離するには、 例えば、 トロンビン、 血液凝固因子 Xaなどで切断する。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする DNAは、 また、 その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。 遺伝子治療 に用いる場合には、 ヒト細胞への遺伝子導入には、 レトロウイルスベクター （Da nos, 0. and Mulligan, R. C , Proc. Natl . Acad. Sci . U S A 85, 6460-6464 ( 1988)； Dranoff , et al .， Proc . Natl . Acad. Sci . U S A 90， 3539-3543 ( 199 3)) 、 アデノウイルスベクタ一 （Wickham, T. J. et al .， Cell 73, 309-319 ( 1 993)) などを用いる方法が用いられている。 患者への投与法としては、 骨髄移植、 皮下注射、 静脈注射などが用いられる （Asano， S.， 蛋白質核酸酵素， 40， 2491- 2495 ( 1995 ))。
また、 本発明は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に結合する 抗体に関する。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に結合する抗体 は、 当業者に公知の方法 （例えば、 「新生化学実験講座 1 ,タンパク質 1 , 389- 40 6，東京化学同人」 参照） により調製することが可能である。 ポリクロ一ナル抗体 の調製は、 例えば、 以下の如く行う。 ゥサギ、 モルモッ ト、 マウス、 ニヮトリな どの免疫動物に適量の上記タンパク質またはペプチドを投与する。 投与は、 抗体 産生を促進するアジュバント （FIAや FCA) と共に行ってもよい。 投与は、 通常、 数週間ごとに行う。 免疫を複数回行うことにより、 抗体価を上昇させることがで きる。 最終免疫後、 免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。 この 抗血清に対し、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーに よる分画、 プロティン Aや固定化抗原を用いたァフィ二ティー精製を行うことによ り、 ポリクローナル抗体を調製することができる。 一方、 モノクローナル抗体の 調製は、 例えば、 以下の如く行う。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパ ク質もしくはその部分ペプチドを、 上記と同様に免疫動物に免疫し、 最終免疫後、 この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。 この脾臓またはリンパ節に含 まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて 融合し、 ハイプリ ドーマを調製する。 目的のハイプリ ド一マをスクリーニングし、 これを培養し、 その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。 モノクローナル抗体の精製は、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンクロマ トグラフィ一による分画、 プロティン Aや固定化抗原を用いたァフィ二ティ一精製 により行うことができる。 これにより調製された抗体は、 本発明の Gタンパク質共 役型レセプ夕一タンパク質のァフィ二ティー精製のために用いられる他、 本発明 の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現異常に起因する疾患の検査ゃ抗 体治療、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現量の検出などに 利用することが可能である。
抗体治療に用いる場合、 ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。 ヒト型抗体は、 例えば、 マウス一ヒトキメラ抗体であれば、 本発明の Gタンパク質 共役型レセプ夕一タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子 を単離し、 その H鎖定常部をヒト IgE H鎖定常部遺伝子に組換え、 マウス骨髄腫細 胞 J558Lに導入することにより調製できる （Neuberger, M. S. et al .， Nature 3 14, 268-270 ( 1985 ) ) 。 また、 ヒト抗体は、 免疫系をヒトと入れ換えたマウスに 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を免疫することにより調製する ことが可能である。
また、 本発明は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に対するリ ガンドのスクリーニング方法に関する。 このスクリーニング方法においては、 本 発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドに被検 化合物を接触させ、 これらタンパク質もしくはべプチドに結合する化合物を選択 する工程を含む。 被検化合物としては、 例えば、 アセチルコリン、アデノシン、ァ ドレナリン、ノルァドレナリン、アンジォテンシン、ボムべシン、ブラジキニン、 C5a ァナフイラトキシン、カルシトニン、カナピノイ ド、ケモカイン、コレシストキニン、 ド一パミン、ェンドセリン、フオルミルメチォニルぺプチド、 GABA、ガラニン、グルカ ゴン、グル夕ミン酸、グリコぺプチドホルモン、ヒス夕ミン、 5—ヒドロキシトリプト ファン、ロイコトリエン、メラノコルチン、神経ペプチド Y、ニューロテンシン、ォド ラント、オビオイ ドペプチド、ォプシン、パラサイロイ ドホルモン、血小板活性化因 子、 プロス夕ノィ ド、ソマトス夕チン、夕キキニン、 トロンビン、サイロトロピン放 出ホルモン、バソプレシン、ォキシトシン （Watson, S. and Arkinstal l, S.， The
G - Protein Linked Receptor FactsBook, Academic Press ( 1994)) などの公知の 化合物、 その他の精製タンパク質、 遺伝子 （ライブラリーも含む） の発現産物、 リガンドが存在していることが予想される組織もしくは細胞 （例えば、 脳、 視床、 視床下部） の抽出液、 細胞培養上清などが用いられる。 スクリーニングに用いる 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質は、 例えば、 所望の細胞 （該夕 ンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む） 内または細胞表面に発現 した形態、 該細胞の細胞膜画分としての形態、 ァフィ二ティ一カラムに結合した 形態であってもよい。 スクリーニングに用いる被検化合物は、 必要に応じて適宜 標識して用いられる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識などが挙げら れるが、 これらに制限されない。 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク 質と被検化合物との結合は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に 結合した化合物に付された標識による検出 （例えば、 結合量を放射活性や蛍光強 度により検出する） のほか、 被検化合物の細胞表面上の本発明の Gタンパク質共役 型レセプ夕一タンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達 （例えば、 Gタン パク質の活性化、 Ca2 +または cAMPの濃度変化、 ホスホリパーゼ Cの活性化、 pHの変 化） を指標に検出することもできる。 具体的な方法については、 例えば、 文献 (Cell Calcium 14, 663-671( 1993)、 Analytical Biochemistry 226, 349-354( 199 5 )、 J. Biol . Chem.268, 5957-5964( 1993 ), Cell 92, 573-585( 1998), Nature 393, 2 72-273( 1998)) や公報 （特開平 9-268号公報） の記載に準じて行うことができる。 その他、 TWOハイブリヅドシステム （Zervos et al. ,Cel l 72, 223-232( 1994), Fr itz et al. , Nature 376, 530-533( 1995 )) を利用したレポーター遺伝子の活性の検 出によっても結合を検出することができる。
また、 本発明は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質とそのリガ ンドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリ一ニング方法に関する。 こ のスクリーニング方法は、 （a ) 被検化合物の存在下で本発明の Gタンパク質共役 型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドにリガンドを接触させ、 該夕 ンパク質もしくはその部分べプチドとリガンドとの結合活性を検出する工程、 お よび （b ) 工程 （a ) で検出された結合活性を、 被検化合物非存在下での結合活 性と比較し、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ぺプチドとリガンドとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程を含む。 被 検化合物としては、 タンパク質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 人工的に合成 された化合物、 組織や細胞の抽出液、 血清などが挙げられるが、 これらに制限さ れない。 スクリーニングに用いる本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク 質は、 例えば、 所望の細胞 （該タンパク質を発現するように処理した形質転換体 を含む） 内または細胞表面に発現した形態、 該細胞の細胞膜画分としての形態、 ァフィ二ティーカラムに結合した形態であってもよい。 スクリーニングに利用す るリガンドは必要に応じて適宜標識して用いられる。 標識としては、 例えば、 放 射標識、 蛍光標識などが挙げられるが、 これらに制限されない。 本発明の Gタンパ ク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドとリガンドとの結合 活性は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分ぺプ チドに結合したリガンドに付された標識による検出 （例えば、 結合量を放射活性 や蛍光強度により検出する） のほか、 被検化合物の細胞表面上の本発明の Gタンパ ク質共役型レセプ夕一タンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達 （例え ば、 Gタンパク質の活性化、 Ca2 +または cAMPの濃度変化、 ホスホリパーゼ Cの活性 化、 pHの変化） を指標に検出することもできる。 具体的な方法については、 例え ば、 文献 (Cell Calcium 14,663-671( 1993), Analytical Biochemistry 226, 349 -354( 1995 )、 J. Biol . Chem.268，5957- 5964( 1993)、 Cel l 92, 573-585( 1998), Natu re 393,272-273( 1998) ) や公報 （特開平 9- 268号公報） の記載に準じて行うことが できる。 検出の結果、 被検化合物の存在下における結合活性が、 被検化合物の非 存在下における結合活性 （対照） より低い値を示した場合には、 該被検化合物は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドとリ ガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。 このような化合物は、 本 発明の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に結合して細胞内へのシグナル伝 達を誘導する活性を有する化合物 （ァゴ二スト） および該活性を有しない化合物 (アン夕ゴニスト） などが含まれる。 ァゴニストは、 本発明の Gタンパク質共役型 レセプ夕一タンパク質に対するリガンドと同様の生理活性を有しており、 一方、 アン夕ゴニストは、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に対するリ ガンドが有する生理活性を抑制する。 このため、 これらァゴニストやアン夕ゴニ ストは、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を介したシグナル伝達 系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。 また、 本発明は、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはそ の部分ぺプチドを含有することを特徴とする、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ 夕一タンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング用キ ッ 卜に関する。 本発明のキットにおける本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一夕 ンパク質もしくはその部分ペプチドは、 例えば、 所望の細胞 （該タンパク質を発 現するように処理した形質転換体を含む） 内または細胞表面に発現した形態、 該 細胞の細胞膜画分としての形態、 ァフィ二ティ一カラムに結合した形態であって もよい。 本発明のキットの他の要素としては、 上記レセプ夕一タンパク質標品以 外に、 例えば、 リガンド標品 （標識されたもの、 および標識されていないもの） 、 リガンドとレセプタータンパク質の反応のための緩衝液、 洗浄液などが含まれて いてもよい。 リガンドに付される標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識な どが挙げられる。 本発明のキッ 卜の利用は、 例えば、 公報 （特開平 9-268号公報） の記載に準じて行うことができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス 「BG2」 タンパク質の疎水性プロットを示す。 図中の 1乃至 7の 番号は Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の特徴的な 7つの疎水性領域 （膜 貫通領域） を示す。 また、 図下の番号は 「BG2」 タンパク質のアミノ酸の番号を示 す。
図 2は、 ヒトおよびマウス 「BG2」 遺伝子の発現の組織特異性をノーザンプロ ット解析した結果を示す。
図 3は、 脳におけるマウス 「BG2」 遺伝子の発現の局在を In situハイブリダィ ゼ一シヨンにより解析した結果を示す。
図 4は、 脊髄におけるマウス 「BG2」 遺伝子の発現の局在を In situハイブリダ ィゼ一シヨンにより解析した結果を示す。 「センス」 はセンス RNAプローブ （mRNAと ハイブリダィズしない；ネガティブコントロ一ル） を用いてハイブリダィゼーショ ンを行った結果、 「アンチセンス」 はアンチセンス RNAプローブ （mRNAとハイブリダ ィズする） を用いてハイプリダイゼ一シヨンを行った結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 [実施例 1 ] ラット Gタンパク質共役型受容体遺伝子の単離
Gタンパク質共役型受容体は、細胞膜を 7回貫通するという構造上の特徴を有し、 膜貫通領域およびその近傍のァミノ酸配列はしばしばよく保存されている。本発明 者らは、まず、既知の Gタンパク質共役型受容体であるマウス神経べプチド Y受容体 YK GenBank Acession Number Z18280 ) ,ラット Y1 (同 Z11504)、ヒト Y1 (同 M84755 )、マ ウス神経べプチド Y受容体 Y4(同 1140189 )、ラット Υ4(同 Ζ68180 )、ヒト Υ4(同 Ζ66526 )、 マウス神経ペプチド Υ受容体 Υ6 (同 U58367 )において高度に保存されている第 2膜貫 通領域および第 7膜貫通領域の DNA配列の比較から、それそれ配列番号： 3で表される 新規センスプライマー、配列番号： 4で表される新規アンチセンスプライマーを合成 した。
次いで、 ラッ h (Rattus norvegicus )視床および視床下部由来ポリ（A)+RNAから、 MA- PCRキット（宝酒造社）を用いて一本鎖 cDNAを合成し、これら 2本のプライマ一を 用いて、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)をおこなった。具体的には、 ラット視床および 視床下部から、 ファストトラック 2. 0キット （インビトロジェン社） を用いてポリ (A) +RNAを精製した。 RNA— PCRキット （宝酒造社） のプロトコルにしたがって、 精製したポリ （A) +RNA 75ngから相補鎖 DMを合成した。 cDNA全量を用いて、 ポリ メラ一ゼ連鎖反応 （PCR) による増幅をおこなった。 反応液の組成は、 各 0. 15mM dNTPs、 1 .5mM MgCl 2、 0.025U/〃1 rTaqポリメラ一ゼ （宝酒造社） 、 各 0.5〃M ディジェネレートプライマー Fg (配列番号： 3) および Rb (配列番号： 4) 、 10 X酵素付属 PCRバッファ一で、 総反応液量 130〃1とした後、 20 1ずつ 6本に分注し た。 ペルティエサ一マルサイクラ一 PTC200 (MJリサーチ社） で、 94°C2分、 「94°C 30秒、 48°C1分、 72°C1分 30秒」 を 35サイクル、 72°C8分の条件で PCRをおこなった。 PCR反応後、 6本の反応液を 1本に集め、 ウイザード PCR精製キット （プロメガ社） を用いて増幅産物を精製し、 30 / 1の TEで溶出した。 このうち を、 T0P0 TAク ローニングキット （インビトロジェン社） の pCR2, lベクタ一にクローニングした。 宿主には XL1— Blueを用い、 E. coliパルサ一 （バイオラッ ド社） で形質転換した。 得られた形質転換体のうち、 白色または薄青色のコロニーを、 遺伝子ライブラリ 一作製装置バイオピック （バイオロボティックス社） を用いて、 5, 760個を無作為 に選択し、 384ゥエルプレート 15枚に分注した、 100 g/mlアンピシリン入り LB培 地に植菌した。 クローンを 37°Cで一晩培養し、 遺伝子ライブラリー複製装置バイ ォグリッド （バイオロボティックス社） を用いて、 グリセロールストック用に 10 0 /g/mlアンピシリン、 25%グリセ口一ル入り LB寒天培地に載せたフィル夕一上、 およびコロニ一ハイプリダイゼーシヨン用に 100〃g/mlアンピシリン入り LB寒天 培地に載せたフィルタ一上に、 それそれ 1枚ずつレプリカを作成した。
得られた PCRクローンの中には、 NPY受容体 cDNAが多数重複して存在すると予想さ れたため、 得られた 5， 760クローンから 80クローンを無作為に選び、 部分塩基配 列を決定した。 塩基配列決定のための錡型にはプラスミ ド自動単離装置 ΡΙ100 Σ
(倉敷紡績社） で精製したプラスミ ド DNAを、 酵素反応にはダイプライマーサイク ルシーケンシングキット FS (パーキンエルマ一社） を、 反応産物の電気泳動には DNAシーケンサ一 377 (パ一キンエルマ一社） を用いた。 ウィスコンシン 'パッケ ージ （ジェネティック 'コンビユー夕 · グループ社） の blastプログラムで、 得ら れた配列を類似性検索にかけた結果、 80個のうち 29個はコイルドコイル様タンパ ク質 1 (GenBank Accession Number U790Z4) の、 17個は神経べプチド Y受容体 Y1 同 Z11504) の cDNAであった。 そこで、 これら 2種類の cDNA断片をプローブに用いて、 それそれディジエネレート PCR増幅断片ライブラリーフィル夕一にハイブリダィズ した。 プローブは、 それそれのクローンの揷入断片を PCRで増幅し、 ウイザード P CR精製キット （プロメガ社） で精製し、 プライム一イット I Iランダムプライマ一 ラベリングキッ ト （ストラタジーン社） を用いて、 [ひ-3 2 P] dCTPで標識したも のを用いた。 コロニ一ハイブリダィゼ一シヨンは常法にしたがって行った （Samb rook et al . , Molecular Cloning: A laboratory mannual 2nd edn. , ( 1989) ) 。 コイルドコイル様タンパク質 1に対しても神経べプチド Y受容体 Y1に対しても陰性 のクローンについて部分塩基配列を決定した。 塩基配列決定のための錡型には、 各クローンの培養液から PCRで挿入断片を増幅し、 PCR産物精製用キット （アマシ ャム社） で精製した DNAを用いた。 酵素反応にはダイプライマーサイクルシ一ケン シングキット FSを、 反応産物の電気泳動には DNAシーケンサ一 377を用いた。 ウイ スコンシン ·パヅケージの blastプログラムで、 得られた配列を類似性検索にかけ た結果、 ムス力リン性ァセチルコリン · レセプ夕一 M5 (GenBank Accession Numb er M22926) と有意の類似性を示すクローンが見出された。 このクローンを工業技 術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 -
8 5 6 6 )
(口） 寄託日 （原寄託日） ：平成 9年 1 2月 2 5日
(ハ） 寄託番号 生命研条寄第 6575号 （FERM BP- 6575) 次いで、 この遺伝子の全長 cDNAを単離するために、 まず、 ラット視床および視 床下部由来の cDNAライブラリ一を構築した。 cDNAの合成は、 cDNA合成キット （ス トラ夕ジーン社） のプロ トコルに従い、 ベクタ一には pEFlx、 宿主には XU- blue MRF' (ストラタジーン社） を使用した。
なお、 pEFlxは、 pcDNA3 (インビトロジェン社） を以下のように改良したもので ある。
( 1 )ヒト EF1ひプロモー夕一 （GenBank Accession number J04617) の調製 ヒトゲノミック DNAから、 プライマー （配列番号： 6/CGAGGATCCGTGAGGCTCCGGT GCCCGT 配列番号： 7/CGGGTMGCTTCACGACACCTGAAATGGMGA) を用いて PCRを行い、 BajnHI (宝酒造社） および Hindll l (宝酒造社） で消化し、 プラスミ ドベクタ一 pU C19 (宝酒造社） にクローニングした。 得られたプラスミ ド DNAを Xholで消化、 ク レノウ酵素 （宝酒造社） で末端を平滑化した後、 DNAライゲ一シヨンキット （宝酒 造社） でセルフ 'ライゲ一シヨンし、 クロ一ニングした。 得られたプラスミ ド DN Aを BamHIおよび Hindl l lで消化し、 ィンサート部分を回収した。
(2)pcDNA3の改変
プラスミ ド pcDNA3DNAを Mlul (宝酒造社） で消化、 クレノウ酵素 （宝酒造社） で 末端を平滑化した後、 DNAライゲーシヨンキッ卜でセルフ ·ライゲ一シヨンし、 ク ローニングした。 得られたプラスミ ド DNAを ΑΠΙ Π (ニューイングランドバイオラ ボ社） および Smal (宝酒造社） で消化、 クレノウ酵素 （宝酒造社） で末端を平滑 化した後、 DNAライゲーシヨンキットでセルフ 'ライゲ一シヨンし、 クロ一ニング した。 得られたプラスミ ド DNAを Bgl l l (宝酒造社） および Hindl l lで消化し、 CMV プロモ一夕一部分を除いた断片を回収し、 DNAライゲ一シヨンキットを用いて（1 ) で回収したインサート断片と連結し、 クロ一ニングした。 これにより pEFlxを構築 した。
次いで、 cDNA断片の塩基配列からオリゴヌクレオチドプローブ （配列番号： 8/ CCTTCTGCATCCCATTGTACGTACC ) を合成し、 ジーントラッノ 一 cDNAポジティブセレク シヨンシステム （ギブコ BRL社） のプロトコルにしたがって、 上記のように調製さ れたラット視床及び視床下部由来の cDNAライブラリーから、 複数個のクローンを 得た。 次に、 先に単離したクローン （FERM P- 16572) に挿入された cDNA断片をプ ローブにしてコロ二一ハイブリダイゼーションを行い、 陽性のクローンを得た。 このクローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 -
8 5 6 6 )
(口） 寄託曰 （原寄託曰） ：平成 9年 1 2月 2 5曰
(ハ） 寄託番号 生命研条寄第 6574号 （FERM BP- 6574) このクローンの揷入断片長は 2.7kbpであった。 キアプレップミディキット （キ ァゲン社) でプラスミ ド DNAを調製し、 ショッ トガン法 （Sambrook et al .， Mole cular Cloning: A laboratory mannual 2nd edn.， ( 1989)) で全塩基配列を決定 した。 cDNAの断片化には、 密閉式超音波生物材料処理装置バイオラブ夕一（東湘 電機社） を用い、 断片化した DNAを 2%ァガロース低融解ゲル電気泳動で分画し、 0.6kbp付近の断片を、 gene clean spin kit(Mol01社) で精製、 T4 DNAポリメラ —ゼ （宝酒造社） で末端を平滑化して、 HincI I/BAP処理 pUC118ベクターにクロ一 ニングした。 宿主には XL1— Blueを用い、 E. coliパルサー （バイオラッ ド社） で形 質転換した。 得られたショットガンクローンを、 ダイプライマーサイクルシ一ケ ンシングキット FS (パーキンエルマ一社） あるいはダイ夕一ミネ一夕一サイクル シ一ケンシングキット FS (パーキンエルマ一社） でシーケンシングした。 得られ た配列を、 DNAシ一ケンシングソフト ·シーケンチヤ一 （日立ソフト社） で結合 - 編集し、 全塩基配列をした。 全塩基配列は、 2700bpで、 413アミノ酸からなるタン パク質をコードしていることが明らかになった （配列番号： 5) 。 オープン'リー ディング'フレームの 5'側に停止コドンが存在するため、この cDNAは、コード領域全 長を含むと考えられる（配列番号： 2)。この配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1、第 2、第 3、第 4、第 5、第 6および第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認された (図 1) 。
また、オープン · リーディング ·フレームのサイズも、公知の Gタンパク質共役型 レセプ夕一タンパク質と比較して同程度の約 1.2kbであつた。 Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質はそのアミノ酸配列にある程度の共通性を示し、一つのタンパ ク質フアミリ一を形成している。そこで、単離した cDNAによってコードされるアミ ノ酸配列を用いてホモロジ一検索を行なったところ、公知の Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質であるゥシ由来ムスカリン性ァセチルコリンレセプ夕一 M3夕 ンパク質 (Lee, P. H. et al .， Biochim. Biophys. Acta 1223, 151-154 ( 199 4)) 、 ヒト由来ムスカリン性アセチルコリンレセプ夕一 M5タンパク質 （Bonner, T. I . et al .， Neuron 1， 403-410 ( 1988)) 、 マウス由来ひ 2Aアドレノセプ夕ー (Link, R. et al .， Mol . Pharmacol . 42， 16-27 ( 1992 )) とそれそれ 26 25 29 %のホモロジ一を有する全く新規なレセプ夕一タンパク質であることが判明 した。
[実施例 2 ] ヒト Gタンパク質共役型受容体遺伝子の単離
得られたラットの配列を EST検索にかけたところ、 ヒトホモログの断片が見出され た （ジーンバンク NID： 946030および NID： 901756) 。 ヒト胎児脳 cDNAを特異的ブラ イマ一 IF01 (配列番号： 9/CTTCCGCCGGGCCTTCACCM) および IR02 (配列番号： 10/ ACAGACACGGCGGGGCTCAC) (プローブ 1) を用いて PCRにより増幅した。 プラークハイ プリダイゼーシヨンの標準的な方法により、 プロ一ブ 1を用いて 1.2x10δのサイズを 有する human え EMBL3 SP6/T7 genomic library (クロンテック社） をスクリ一ニン グした。 これにより 2つの陽性クロ一ンを単離した。 得られたファージクローンを Saclで消化し、 一つのクローンの 3つのバンドをサブクロ一ニングした。 これをそれ それ II (配列番号： 11) 、 13 (配列番号： 12) 、 および 15 (配列番号： 13) と命名 した。 これらの断片の配列を決定し、 仮想的な配列をラットのホモログとの比較に より検討した。 IIおよび 13は、 それそれ特異的プライマ一 YS03 (配列番号： 14 TGAACGCTTCGGGGGCGCTG) および YS05 (配列番号： 15/GAGATGGCGAGGTTGAGCAGG) 、 YS12 (配列番号： 16/GGCTCCMGCCATCGGCGTC) および YS14 (配列番号： 17/CTCA CTTCCAGCAGTGCTCC) を用いて PCR増幅し、 その PCR産物をそれそれプローブ 2および プローブ 3と命名した。 ヒト視床下部 cDNA (1.3xl06ファージ） を 150腦プレート当た り 5.6xl04の濃度でプレートに播いた。 得られたサブプールをプライマ一 YS03および YS05を用いた PCRによりチェックした。 プロ一ブ 2を用いて、 ゲノムライブラリ一の スクリーニングと同様の方法で、 一つの陽性サブプールをスクリーニングした。 こ れにより TM5から 5， UTRを含む一つの cDNAクローンを得て、 cDNAクローン 1と命名し た。
プライマ一 YS07 (配列番号： 18/GCCTCCGCACCCAGAACMC) および YS10 (配列番号 ： 19/TGCGCCTCTGGATGTTCAG) を用いた PCI こより、 cDNAクローン 1からプローブ 4を 増幅した。 プロ一ブ 3およびプロ一ブ 4を用いて、 ゲノムライブラリ一のスクリー二 ングと同様の方法で、 ヒト海馬ライブラリ一 （3xl06 pfu) のスクリーニングを行つ た。 いくつかのクローンを得て、 その中で最も長いものを cDNAクローン 2と命名して、 その配列の決定を行った。 このクローンは TM2から 3， UTRの領域を有していた。 cD NAクローン 1を SacI Iで消化し、 ベクターと 5' 端領域を含む 3.3kbバンドをシュリン プアルカリフォスファターゼで処理した。 cDNAクローン 2もまた SacIIで消化し、 そ の 1.7kbの断片を cDNAクローン 1由来の 3.3kb断片に結合させた。 この結合された断 片が挿入されたクローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5—
8 5 6 6 )
(口） 寄託日 （原寄託日） ：平成 1 0年 1 2月 1 7日
(ハ） 寄託番号 生命研条寄第 6609号 （FERM BP-6609) 決定されたヒト 「BG2」 cDNAの塩基配列を配列番号： 21に、 該 cDNAがコードする タンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 20に示す。
ヒト 「BG2」 タンパク質は、 公知の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質であるヒト由 来ひ- 2C- 1アドレノセプ夕一 (Regan, J. W. et al . , Proc. Natl .Acad. Sci .U. S.A. 85, 6301-6305( 1988)) 、 マウス由来 アドレノセプ夕一 （Jasper J. R. et a l .， Biochem. Biophys. Acta 1178， 307-309( 1993) ) 、 ヒト由来ムスカリン性ァ セチルコリンレセプ夕一 M3 (Peralta, E. G. et al . , EMBO J. 6， 3923-3929( 19 87)) とそれそれ 32 ヽ 28 、 27%のホモロジ一を有していた。
[実施例 3 ] ノーザンブロット解析
ヒト 「BG2」 の検出においては、 プロ一ブ 4を32 Pァ -dCTP (Amershajn, Prime It I I) で標識し、 cDNAプローブとして用いた。 また、 プロット膜としては、 MTN (Human Multiple Tissue Northern) ブロット （クロンテック社） を用いた。 ExpressHyb solution (クロンテック社） 中で 68°Cで 30分のプレハイブリダィゼ一シヨン後、 6 8°Cで 1時間プローブを膜にハイブリダィズさせた （最終プローブ濃度は 1.5xlOscp m/ml) 。 0.1%SDSを含む 2xSSCで 42°Cで 30分、 そのプロットを洗浄し、 最終的な洗浄 を 0.1%SDSを含む O. lxSSCで 50°Cで 30分行った。 次いで、 そのプロットを- 80°Cで 2. 5日間、 コダックのオートラジオグラフィックフィルムに暴露した。
一方、 マウス BG2の検出においては、 プローブの調製は、 ラヅト 「BG2」 cDNAを 錶型に、 センスプライマー MF2 (配列番号： 22/TGCATCCCATTGTACGTNCC) およびァ ンチセンスプライマ一 MR1 (配列番号： 24/TGCTCTGGGACACCATCTTC) を用いて PCR で増幅後、 増幅産物をァガロース電気泳動で精製し、 上記ヒトと同様に標識する ことにより調製した。
また、 プロット膜としては、 Rat MTN (Multiple Tissue Northern) ブロヅト （ク ロンテック社） を用いた。 ハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （50% ホルムアミ ド， 4 xSSPE, 1% SDS, 0.5¾ BLOTTO, 100 zg/ml サケ精子 DNA) 中で、 42°Cにて一晩のハイ ブリダィゼーシヨンを行った。 洗浄は、 0.1%SDSを含む O. lxSSCで 65°Cで行った。 次 いで、 そのプロットを- 80°Cでー晚、 コダックのオートラジオグラフィックフィルム に暴 し/こ。
その結果、 ヒトおよびラット由来の 「BG2」 遺伝子の発現は、 特に脳において強 く検出された （図 2 ) 。
[実施例 4 ] In situハイブリダイゼーション
13から 18齢の成体雄 Sprague- Dawley rats (Charles River Japan社） をェ一テル の吸入により麻酔し、 ロータリ一ポンプに接続し、 左心室に挿入した力ニューレを 通じて、 冷却した 4%パラホルムアルデヒド一リン酸緩衝液 （ρΗ7· 2) 中を注入した。 灌流後、 脳、 脳下垂体、 および脊髄を取り出し、 矢状方向にまたは冠状に切断した。 組織標本を 4°Cで夜通し、 同様の固定剤で固定した。 次の過程は RNaseの混入を避け るため、 注意して行った。 組織試料を常法にてパラフィンワックスで包埋し、 回転 ミクロト一ム （Model HM 355； MICROM Laborgerate GmbH) を用いて 6 /mの厚さのパ ラフィン切片を作製した。 切片は In situハイブリダィゼ一シヨンを実施するまで -20°Cで無湿状態で保存した。
ラット BG2センスおよびアンチセンス RNAプローブの調製のために、 センスプライ マ一 MF2 (配列番号： 22/TGCATCCCATTGTACGTNCC) およびアンチセンスプライマー MR3 (配列番号： 23/ATCATTAGGAGCGTGTANGG) を用いて MP21プラスミ ド DNAから PC R増幅した cDNA断片を pZErO- 2ベクター （インビトロジェン社） にクローニングした。 RNAプローブは、 DIG MA Labeling Kit (ベ一リンガーマンハイム社） を用いてジギ トキシゲニンで標識した。 パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、 段階的ェ 夕ノール系列で洗浄し、 蒸留水に移した。 ジギトキシゲニンで標識した MAプローブ を含まない In situハイブリダィゼーシヨン試薬としては、 In situ Hybridizatio n Reagents ( ISHR,Code No.316- 01951 ;二ツボンジーン社） を用いた。 切片は緩衝液
(PBS; ISHR1) を用いて 1分間と 10分間の 2回インキュベートした。 切片を 37°Cで 1 0分間、 プロティナ一ゼ K ( ISHR6) で処理した。 氷酢酸 （ISHR4) を含むァセチル化 緩衝液 （ISHR3) を用いてァセチル化を 15分行い、 次いで、 PBS/グリシン緩衝液
( ISHR2) を用いて室温で 20分のクェンチング後、 4xSSC ( ISHR5) で 10分間、 2回洗 浄し、 次いで、 PBS緩衝液で 10分間洗浄した。 50%ホルムアミ ド /2xSSCを用いて室 温で 30分のプレハイプリダイゼ一シヨン後、 ジギトキシゲニンで標識した RNAプ口一 ブ （l〃g/ml) を用いて 42°Cで 16時間ハイブリダィゼ一シヨンを行った。
ハイブリダィゼ一シヨン後の洗浄は、 ホルムルムアミ ド /2xSSCを用いて 42°Cで 10分間を 2回行った。 それから切片を 37°Cで 5分間、 NET緩衝液 （ISHR9) で洗浄後、 RNaseA ( ISHRIO) /NET緩衝液 ( ISHR9) を用いて 37°Cで 30分間、 RNase処理を行った。 O. lxSSC緩衝液 （ISHR11) で 20分間、 2回洗浄後、 切片を移し、 標識したジゴキシゲ ニンを、 Digoxigenin Detection Kit (ベ一リンガーマンハイム社） を用いて検出し た。 切片を lOOmM Tris-HCl , 150mM NaClを含む緩衝液 （緩衝液 1) で室温で 1分間洗 浄し、 室温下、 ブロッキング試薬 （緩衝液 2) で 30分間インキュベートした。 切片は、 アルカリフォスファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体を用いて室温で 60分間 インキュベートした。 緩衝液 1を用いて 15分間、 緩衝液 3を用いて 2分間、 室温で洗浄 後、 切片を緩衝液 3で希釈した NBT/Xリン酸溶液と室温で 12から 14時間ィンキュベ一 卜した。 緩衝液 4で洗浄後、 切片はグリセロールまたはパ一マウント （Permount) で 封入した。
その結果、 図 3および図 4に示すように、 BG2 cDNAプローブは、 海馬および脊髄 で強くハイブリダィズした。 ハイブリダィゼ一シヨンはまた、 視床下部、 視床およ び小脳においても中程度のハイプリダイゼ一シヨンシグナルが検出された。 産業上の利用の可能性
本発明により、脳特異的に発現する新規な Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパ ク質およびその遺伝子が提供された。 これにより該レセプ夕一タンパク質を利用 したリガンドゃ医薬品の候補化合物のスクリーニングが可能となった。 これらリ ガンドゃ医薬品の候補化合物は、 例えば、 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一 タンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の診断や治療など への利用が期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において 1もし くは複数のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、 グァ ノシン三リン酸結合夕ンパク質共役型のレセプ夕一夕ンパク質。
2 . 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において 1も しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有する、 グ ァノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプ夕一タンパク質。
3 . 配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNAにハイブリダイズする DNAがコ —ドするタンパク質であって、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセ プ夕ータンパク質。
4 . 配列番号： 2 1に記載の塩基配列からなる DNAにハイプリダイズする MAが コードするタンパク質であって、 グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレ セプ夕一夕ンパク質。
5 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一夕ンパク質の部分べプチド c
6 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一夕ンパク質または請求項 5 に記載の部分べプチドをコ一ドする DNA。
7 . 配列番号： 2または 2 1に記載の塩基配列を有する請求項 6に記載の DNAC
8 . 請求項 5乃至 7のいずれかに記載の DNAを含有することを特徴とするベクタ o
9 . 請求項 8に記載のベクターを保持する形質転換体。
1 0 . 請求項 9記載の形質転換体を培養する工程を含む、 請求項 1から 4のい ずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または請求項 5に記載の部分べプチドの製 造方法。
1 1 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または請求項 5に記載の部分べプチドに被検化合物を接触させ、 該タンパク質または部分ぺプ チドに結合する化合物を選択する工程を含む、 請求項 1から 4のいずれかに記載 のレセプ夕一タンパク質に結合するリガンドのスクリーニング方法。
1 2 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質とそのリガン ドとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
( a ) 被検化合物の存在下で請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一夕ン パク質または請求項 5に記載の部分べプチドにリガンドを接触させ、 該夕ンパク 質もしくはその部分ぺプチドとリガンドとの結合活性を検出する工程、
( b ) 工程 （a ) で検出された結合活性を、 被検化合物非存在下での結合活性と 比較し、 該タンパク質または部分べプチドとリガンドとの結合活性を低下させる 化合物を選択する工程、
を含む方法。
1 3 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質または請求項 5に記載の部分べプチドを含有することを特徴とする、 請求項 1から 4のいずれ かに記載のレセプ夕一タンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のス クリーニング用キッ ト。
1 4 . 請求項 1から 4のいずれかに記載のレセプ夕一タンパク質に結合する抗 体。
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