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WO1999031238A1 - Nouvelle proteine - Google Patents

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Publication number
WO1999031238A1
WO1999031238A1 PCT/JP1998/005612 JP9805612W WO9931238A1 WO 1999031238 A1 WO1999031238 A1 WO 1999031238A1 JP 9805612 W JP9805612 W JP 9805612W WO 9931238 A1 WO9931238 A1 WO 9931238A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
kdr
dna
cdna
domain
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005612
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masabumi Shibuya
Naoyuki Yabana
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to AU15065/99A priority Critical patent/AU1506599A/en
Publication of WO1999031238A1 publication Critical patent/WO1999031238A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to a protein that induces KDR in the vascular endothelial thread fflSS3 ⁇ 43 ⁇ 4a ⁇ (VEGF) receptor-KDR (kinase insert domain-containing receptor; hereinafter, referred to as KDR).
  • VEGF vascular endothelial thread fflSS3 ⁇ 43 ⁇ 4a ⁇
  • KDR kinase insert domain-containing receptor
  • VPF Vascular permeability fector
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • OVLShibuya Advances in Cancer Research, 161, 281h 995
  • VPF / VEGF is a protein consisting of homodimers and having a molecular weight of about 40,000.
  • VEGF is known to be a high-level, high-sensitivity probe for tube sex [14. N. Ferrara et al .; Biochem.
  • Blocking VEGF can also prevent water and water.
  • Rt-l farnesoiase insert domain-containing receptor
  • mice Homologs of the mouse VEGF receptor KDR in mice are Plk-1 CWMatthews et al .; Proc. Natl. Acad. ScL USA, S8, 9026 991), A-Ullich et al .; W094 11499 Priolity Nov. 13 (1992), BJMillauer 12, 835 (1993)].
  • the fflW domain consists of seven imglobulin domains, and the domain within the thread has a tyrosinki ⁇ " zedomin.
  • a quantity of 180-200-kilodaltons ( ⁇ volume ⁇ ⁇ belongs to the tyrosinkinase family! VEGF specifically binds to nt-1 and KDR / Flk-1 at KD ifi ⁇ 20pM and 75pM, respectively Flt-1 and KDR / Flk-1 ⁇ ⁇ specifically expressed on vascular endothelial cells Natl. Acad. Sd. USA Q, 7533 (1993), RLKendaU et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 2Q, 8915 (1993)].
  • KDR When KDR is expressed in the blood vessels of the porcine artery, it becomes VEGF and proliferates and proliferates in the vein of the porcine artery.
  • lk tube ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J
  • F ⁇ fSt of this tyrosine chitose-type receptor pig is ligated with its ligand; It is thought that the tyrosine is released by re-entering the tyrosine, and this protein is initiated by the receptor self-redirecting TVr through another protein via the SH2 domain. It is thought that ff ⁇ c fSS ⁇ is performed by inducing a dripping.
  • the age of KDR also causes the TVr 3 ⁇ 4S to be subjected to GF ⁇ by VEGF in vascular endosperm [J Waltenberger et al., J. Biol.
  • the SH2 domain is also white, and PLC-, GAP (ras G Pase activating protein), PI3-kinase vphosphatidylinositol 3-kinase), and Nck are affected by the intravascular intravenous play, which has been diluted with VEGF. (D. Guo et al., J. Biol. Chem., 22Q, 6729 (1995)]. However, it has been reported as a domain within the KDR thread. Not done.
  • ⁇ induces ⁇ ff «3 ⁇ 4 of KDR by ⁇ to VEGF receptor KDR, and causes abnormalities such as HffM ⁇ im, fibril formation, and ⁇ ⁇ transportation, diabetes mellitus i4WM, m, dryness, etc. in old rheumatism.
  • abnormalities such as HffM ⁇ im, fibril formation, and ⁇ ⁇ transportation, diabetes mellitus i4WM, m, dryness, etc. in old rheumatism.
  • the inventors of the present invention have been eager to elaborate and, as a result, have isolated the cDNA encoding the protein that induces (7 ⁇ ⁇ ) as the domain within the KDR thread from the ⁇ cDNA library. , The Rooster E ⁇ ij decision and led to the present invention
  • a fflM receptor (VEGF) receptor consisting of one or several amino ⁇ deletions or added amino acids in the amino acid sequence of the protein (a)
  • KDR KDR insert domain-containing receptor
  • amino deletions or additions can be identified by the method of the specialty experiment, which is a preoperative technique, and one or several amino acids can be defined as the specialty modification.
  • the amino acid that can be deleted or added by the method is is ( ⁇ .
  • Proteins consisting of amino acids J with one or several amino acids deleted or added, and having the properties of the KDL domain of KDR, are described in J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), FMFrederick et al; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), MJ.ZoUer and M.Snith; Nucleic Acids Research, IQ , 6487 (1982),
  • the protein of the present invention may be referred to as a KDR resator " ⁇ protein.
  • the second (7) description of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned protein, a DNA having a rooster seed No. 1, 2 and 27 A protein that hybridizes under the stringent cow with DNA having ⁇ Sfi ⁇ j read at the seeding number of 2 and 27, and induces KDR as a domain within the thread of VEGF receptor KDR It is a DNA that is a DNA character.
  • the DNA obtained by using a filter is prepared by using a filter immobilized with plaque-derived DNA, using a filter with immobilized DNA, 0.7 ⁇ ; under L0M Nad, 65 ° C 0.1 X to 2 X SSC (saline-sodium citrate) [1 SSC descendant night (150 mM NaCl, 15 mM que ⁇ "trim); n X is n-density n times
  • SSC saline-sodium citrate
  • the DNA of Tori Ban No. 1, 2 and 27 can be selected from the following: Can include DNA having a homolog of 95% Rii.
  • a third aspect of the present invention is an Itoh vector containing the above DNA layer.
  • the fifth invention of the present invention relates to a method for producing a protein, comprising feeding the above-mentioned S-form in a culture medium, allowing the above-mentioned protein to be added during a period of difficulty, and listening to the protein from the outside. ! T3 ⁇ 43 ⁇ 4
  • the sixth (7) description of the present invention relates to the DNA
  • the oligonucleotide having the sequence-as the oligonucleotide for example, Two and twenty-seven strengths, an oligonucleotide having the same or different as the male or female: Can be
  • a seventh aspect of the present invention is an anti-C that recognizes the above protein.
  • the eighth (7) description of the present invention is the above-mentioned [white matter ⁇ ⁇ extraction method, in which a body is used.
  • the ninth aspect of the present invention relates to the above-mentioned ligoneucle; ⁇ or iiH3 ⁇ 4t body as an extreme component, abnormal blood ⁇
  • the 10th ⁇ i above of the present invention is a disease that is caused by abnormal vascular growth or a disease caused by abnormal ff $ giSt of KDR, using a lignonucleotide or ⁇ a a body ⁇ as a mechanical component. is there.
  • a method for screening the quality of KDR which comprises using the DNA of the eleventh (Mi) of the protein of the present invention.
  • the present invention will be described in detail below.
  • the cDNA of the protein of the present invention can be prepared by a twchhy rid method.
  • Examples of the one-hybrid method include, for example, the following: the one-brid method [S. Fields et al .; Nature, Q245 (1989)].
  • the Teng-to-Brid method is a method for producing a yeast protein in which a DNA domain and a transcription domain are separated, for example, a protein capable of forming a complex with a target protein using GAL4 and tH:
  • a vector capable of expressing a protein with two domains of GAL4, that is, protein X (in the present invention, the KDR domain) is used as a DNA DNA ⁇ domain (GAL domain) and a protein.
  • a vector to be expressed by ⁇ and a protein ′ (the protein S encoded by each cDNA in the cDNA library according to the present invention) and a ffi ⁇ protein (GAL4 S14f human domain)
  • the yeast clones that interact with protein X and protein X to form multiple copies are transcribed.
  • the dangling domain takes on the form of a DNA promoter, which is transcribed, and is expressed as a reporter. Then, using the reporter HI expression as a key, the cDNA ability of the protein that interacts with the domain within the thread; screening the contained form and extracting the plasmid from the transformed form to obtain the desired cDNA Clone itf.
  • a KDR cDNA clone can be obtained from a cDNA library by performing the following steps:
  • RNA from the KDR-expressing DNA or human, for example, human moon is shown.
  • Methods for steaming all EA include the thiosian guanidine-trifluorene g ⁇ t shim method [H. Okayama et al., Methods in En2ymology J, 397], the guanidine dithiocyanate phenol. Clonal form (AGPC) method [P. Chomczynski and N. Sacchi; Analytical Biochemista, J £ 2, 156 (1987)]. Use this total RNA
  • ⁇ mENA can be transferred after using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit [Invitrogen Co., Ltd., Quick Prep mENA Purification Kit [Pharmacia Co., Ltd. Liu].
  • This mENA is converted into cDNA, and a suitable vector is introduced into Sukutadashi to produce a cDNA library.
  • Encouraging cDNA Libraries ⁇ See J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A
  • a phage vector, a plasmid vector or the like can be used as long as it can be used in the MK12 strain.
  • ZAP Express [Stratagene II, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescriptn SK (+) [NucleicAcids Research, 12, 9494 (1989)]
  • Lambda ZAP II (Stratagene Bye, gtlO, gtll [DNA Cloning, APracticalApproach, 1, 49 (1985)]
  • XTViplEx clone-tech crane, XExCeU (Fano! ⁇ Shea recitation, pT7T318U (Fano-shear crane, pcD2
  • Ruko ⁇ a can: Specifically, Escherichia mli XLl-Blue certificate F [Stratagene II, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coH CeOO [R Appleyard; Genetics, 22, 440 (1954)],
  • Sacoharomvffis visiae ability and suitable trait has a marker, for example, TRP1, LEU2, etc., and the promoter U expressed at» is a promoter of the bulcono hydrogenase (ADH) promoter, such as GAL. It is a vector that can express a DNA domain. For insertion of this ⁇ , KDR cDNA, there is an appropriate control site in the portion corresponding to the C-terminal side of the DNA binding domain, and it can also be formed with w ⁇ , -m bacteria such as fflM of vector DNA. ⁇ I 1 or the like; ⁇ traits Ma in ⁇ - is desired arbitrary one with the force scratch.
  • ADH bulcono hydrogenase
  • vectors examples include pGBT9 (Clontech ⁇ ), pASl [T. Durfee et al., Genes & Development,?, 555/993], pAS2-l (Clontech ⁇ ), and the like.
  • the domain fragment in the thread of the KDR cDNA obtained in (1-1) was purified to obtain the DNA binding domain. Insert the protein into the control site at the end so that the protein hood fits.
  • a fragment of the KDR cDNA thin domain can be cut out using an appropriate control such as Asp 8C) 6 (77i at the EamHI site based on i, or a primer from the Rooster IJ that only ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ in the intracellular domain.
  • PCR [MJMcPherson et al .; PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)] to fight “f” (2) ⁇
  • a protein library for inverting D4f human domains and a cDNA library The yeast can be made from yeast Saccha drawing vcfis occidental visiae and has a suitable marker H »5 ⁇ , such as RP1, LEU2, etc., and a promoter expressed in gfS, such as ADH promoter Yanagi, GAL4, etc. It is a vector that can express the ⁇ 14 ⁇ domain. There is a suitable site on the C-terminal side of the ⁇ , inverted ⁇ 3 ⁇ 4ttf domain, and ⁇ ⁇ ⁇ and large ⁇ bacteria, such as; ⁇ , in vector DNA, and fungi such as ampicillin ftH4 » In ⁇ what has the marker power s desired ,.
  • Such vectors include pGAD [CT, Chien et al .; Proc NatLAca ScL USASa SSTS iiggiW, pGAD424 (Clontech tt) and pACT [T. Durfee et al .; Genes & Development, 2, 555 (1993)], pACT2-l ( Black
  • KDR The protein interacting with the Dm domain is considered to be expressed in the same fflSM position as KDR. Therefore, (1-1) and! Transfer cDNA from ⁇ and insert it into the control site at the C-terminus of the! ⁇ Protein fragment conversion domain described above to save the cDNA library. Due to the orientation of the domain and the fume, the # ⁇ represents the age protein between the transgenic domain and the protein encoded by the cDNA. Zhao's library that can be used on shelves, for example, the MATCHMAKER cDNA library (Clontech) can also be used.
  • HIS3 was used as a reporter " ⁇ ", and was used as a reporter for lacZ as a reporter, when it was fed on a minimal medium without His, and lacZ was used as a reporter. Look at all the colonies.
  • the colony contains two kinds of plasmids, KDR ( ⁇ plasmid intracellular domain protein expression plasmid and protein-discovered cDNA plasmid).
  • KDR ⁇ plasmid intracellular domain protein expression plasmid and protein-discovered cDNA plasmid.
  • the method is as follows. Then, the cDNA clone is obtained by ⁇ R of the transformant based on the marker of the protein 3 ⁇ 4 cDNA plasmid, and the plasmid DNA is obtained from the obtained 3 ⁇ fungus [D. Rickwood and BDHames; DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press 995), C.-T. Chien et al .; Proc. Natl. Acad. ScL, S8, 9578 999)]).
  • KDR yarn! Use the DNA domain of the inner domain for expression of the age protein, and in the vector, the domain of the KDR thread MS When both cDNA clones are introduced into the inn, It is possible to bear that the protein encoded by the obtained cDNA specifically binds to the intracellular domain of KDR.
  • the obtained cDNA clone is left as is, and the cDNA portion is cut out with an appropriate IW3 ⁇ 4 and pUCU8 etc. (3 ⁇ 41 After subcloning into a suitable cloning vector, the salt is used for normal SIE ⁇ Zhe method, for example, Sanger Natl Acad. Sd. ⁇ JS. 24, 5463 (1977)] Alternatively, the DNA sequence is determined by using a DNA sequence 1 ⁇ from Perkin Elmer or Fanare Masia.
  • cDNA ⁇ is a new rooster
  • a homology ⁇ program such as WLAST, BLAST, etc.
  • a database such as GenBank, EMBL and DDBJ
  • the obvious homology, which is considered to be [?] In the source, can be obtained by the ⁇ f ⁇ S system.
  • Examples of the cDNA encoding the novel protein serving as an intracellular domain of KDR obtained as in m include a cDNA clone having a rooster 5 or 6.
  • KDR receptor protein DNA DNA encoding the protein that functions as the intracellular domain of KDR.
  • the cDNA of the protein of the present invention obtained in (3), and the mEA plasmid obtained in Northern blotting (4), The ⁇ which is not expected to be obtained can be used to obtain the cDNA of the protein of the present invention by the following method.
  • the novel amino translation of the protein of the present invention can be confirmed by examining amino translation databases such as GenPept, PIR and Swiss-Prot using a homology search program such as FASTA or Framesearch.
  • a homology search program such as FASTA or Framesearch.
  • a cDNA clone having a suitable roto-ban ffi «EffiE ⁇ from rooster seed Nos. 1, 2 and 27 can be mentioned.
  • the cDNA of the present invention is considered to be a protein, and the cDNA is substituted in the same manner as in (1-1), and adapters are added to both ends of the cDNA. Salts of the cDNA clones obtained in (3) PCR Perform PCR with primers in the row P. 5'-RACE and 3'-RACE
  • a primer based on fflE ⁇ of the cDNA was used to express the protein of the present invention.
  • ⁇ is considered to be the same as (1-1) and the cDNA converted to [ ⁇ ] is to be subjected to PCR [MJMcPherson et al .; PCR ⁇ ApracticalApproac Oxford University Press (1991)] as a cDNA library.
  • PCR MJMcPherson et al .; PCR ⁇ ApracticalApproac Oxford University Press (1991)] as a cDNA library.
  • DNA encoding the target protein of the present invention can be linked.
  • the DNA encoding the target protein of the present invention can be obtained by chemically synthesizing the DNA with DNA.
  • a DNA strand is used to synthesize an oligonucleotide such as an oligonucleotide and a sense oligonucleotide having a part of the rooster IJ of the DNA of the present invention using a DNA fiber.
  • an oligonucleotide such as an oligonucleotide and a sense oligonucleotide having a part of the rooster IJ of the DNA of the present invention using a DNA fiber.
  • oligonucleotide examples include a DNA having the same rooster as that of the fibrous 10 to 50 in the DNA contained in the DNA or a DNA having a rooster with the DNA. No. 1, 2 and 27
  • the rooster selected by the ⁇ ⁇ 1 1 if fi fi fi fi DNA 1 ⁇ ⁇ ⁇ DNA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ DNA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA
  • the oligonucleotide is also an oligonucleotide of the present invention.
  • oligonucleotides can also be mentioned as the oligonucleotide of the present invention.
  • Words ⁇ Conductive DNA Derivatives in which diesteno phosphate in DNA is converted to phosphoric acid carbonate ⁇ DNA, Diesteno phosphate in DNA is converted to N 3 '-P 5' phosphoamidate Derivative DNA, Derivative DNA in which ribose and riiesteno in DNA are converted to peptides, Derivative DNA in which peracyl in DNA is fiberized with C-5 propynyl peracyl, Peracyl in DNA is C_5 thiazolyl peracyl Fiber-derivative DNA, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with C-5 propynylcytosine, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with phenoxazine-modified cytosine, ribose in DNA is 2 '— O-propylribose-derived DNA, or 2'-me
  • Any lodging can be used as long as it can express the target ⁇ ⁇ , such as m.
  • an expression vector that can be used in the above-mentioned inns, or that can be used in the body, and that has a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
  • ⁇ is a protein expression vector according to the present invention.
  • Source is capable of self-organization in a nucleus, as well as a promoter and a ribosome; i ⁇ fE a DNA of the present invention; It is preferable that the vector is composed of wm & xiao ⁇ vector:
  • the promoter is ⁇ ⁇ - ⁇ .
  • expression vectors include ⁇ 233-2 (Pharmacia ft), pSE280 (Invitrogen ⁇ , pGEMEX-l [Promega tt], pQE-8 (QIAGEN) tt, pKYPIO
  • the promoter may be any promoter that can be expressed in a host such as a fungus.
  • a promoter one P ⁇ rp
  • lac_ promoter P L promoter one
  • P R promoter one coater P S E promoter, such as T7 promoter
  • promoter one terpolymer derived from ⁇ Ya fur ⁇ , SPO l promoter , SP02 promoter pen P promoter and the like.
  • artificially modified promoters such as a promoter (P ⁇ rp XS), a tail promoter, a lacT7 promoter, an let promoter, and the like, which are obtained by combining two promoters, can also be used.
  • the ribosome, ⁇ g ij may be any as long as it can be expressed in the spores of the fungus, etc., but it is necessary to divide the Shine-Dalgarno rooster E ⁇ J and the initiation codon.
  • a suitable ⁇ for example, 6 to 18 fibers of plasmid; preferred).
  • transcription is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, and transcription sia is distributed to sr of « ⁇ 3 ⁇ 4. Les ,.
  • the original organisms include those belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevipacterium, Pseudomonas, and Batinoles, such as Escherichia mliXLl-Blu Escherichia coli XL2-B1UR. Escherichia coli DHL Escherichia MC Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Esdierichia coli JM109, Escherichia coli HBim. Escherichia ooli No.49. Escherichia coli W3110. Escherichia coli NY49, Bacillus sbilis.
  • ATCC13870 Micmhac ⁇ rium ammoniaphilum ATCC1 and the like can be mentioned.
  • DNA can be introduced into the above-mentioned host cells: Method using calcium ion [S. Cohen et al .; Proc. Natl. Acad ScL US ⁇ £ 2, 2110 (1972)], arotoplast method (63-2483942), electrotrophic method, or Gene, II, 107 (1982 and Molecular & General Genetics, J £ S, Ulhi 979 ) And the like.
  • the promoter may be any one that can be expressed in a bacterial strain, or may be one that is out of alignment.
  • a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, a gal promoter, or a gal promoter may be used.
  • promoters such as heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, and CUP1 promoter.
  • S ⁇ S strains include Saocharomyces cerevisae. Schizasaccharomyces pomhe,
  • Klyveromyces lactis Trichosporon ullulans. Sdiwanniomyces aUuvius. I can do it.
  • the method As a method for introducing a delicate vector, if the method is to introduce DNA into the accessory, it can be used to adjust the displacement.
  • the electroporation I ⁇ method (DJVl. Beckerand L. Guarente; Methods. Enzymol. , 124, 182 (1990)]
  • the spheroplast method [D. Shortle et al., Proc. NatLAcai ScL USA SI. 4889 (1984)]
  • the lithium method H. Ito et al., Journal of Bacteriology 153, 163 (1983)]. Natl. Acad. Sci. US 15, 1929 (1978).
  • a spore as a host, as an expression vector, for example, pAGE107 [JP-A-3-22979; H. Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 (Paragraph 2- 227075), pCDM8 [B. Seed; Nature, 229, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogenenne, pREP4 (Invitrogen ⁇ , pAGE103 [T Mizukami et al .; Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987) )] And so on.
  • any of the promoters that can be expressed in ft «shelves can be used.
  • the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE immediate early
  • ⁇ ⁇ the promoter of the cytomegalovirus
  • the SV40 promoter One example is a metallotionin motor, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, an SR promoter, and the like.
  • the vesicles are human ⁇ , Luba (Namalwa), and monkey thread MS, COS. «, CHO thread of Chinese hamster! ⁇ , HBT5637 (Showa 63-299).
  • a method for introducing DNA into Soitoshima can be used.
  • the 7-rhd method (Parahei 2-227075), the lipofection method [P.LFelgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4, 7413h 987)]
  • ⁇ includes, for example, DR O'Reilly et al .; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987- 1997), VALuckow and
  • Proteins can be expressed by the method described in M.D. Summers; Bio Ibchnology S, 47 (1988).
  • transfection vector used in the method for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacHI (in vitro gene) and the like can be mentioned.
  • Autographa californica nuclear polyhedrosis virus which is an insect virus, such as Autographa californica nuclei polyhedrosis virus, can be used.
  • the protein of the present invention can be obtained by culturing the mia body obtained in the manner described in m: above in a culture medium, accumulating the protein of the invention in the culture medium, and recovering the medium.
  • the method of culturing the present invention in a culture medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a form obtained by using a prokaryote such as ⁇ iigfW, which is a difficult organism, as a host is a culture medium that contains charcoal, «3 ⁇ 4,» ⁇ , etc. It is a medium that can be used for any purpose.
  • the charcoal 3 ⁇ 43 ⁇ 4f may be any as long as the substance can be assimilated, such as gnorecose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch ⁇ ] ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Wt ⁇ ), ⁇ , propio: / ⁇ , Ethanol, propanono anorecono, etc. can be used.
  • ⁇ such as ammonia, ammonium chloride, ammonium, ammonium, l> m ammonium, etc. or ammonia, soya (7 ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ), along with peptone, meat extract, alongside extract, Corn steep liquor, casey ⁇ 3 ⁇ 41 ⁇ advice, lees and soybeans ⁇ ⁇ sou, each cell, and other types of bacteria can be used.
  • Examples thereof include lithium potassium, potassium dipotassium, potassium bamboosium, » ⁇ gnesium, sodium chloride, sulfuric acid ⁇ , manganese sulfate, W, calcium carbonate, and the like.
  • Culture is carried out under normal ⁇ ⁇ culture or under 3 ⁇ 4 »3 ⁇ 4 ⁇ # ⁇ * ⁇ .
  • the cultivation is preferably 15-40 ° C, and the cultivation 0 ⁇ is usually 16-96 B # ⁇ .
  • During fermentation pH should be 3.0 ⁇ 9.0.
  • the reaction is carried out using acid or alkaline, urea, calcium, ammonia, etc.
  • a substance such as ampicillin tracycline may be added to the culture medium during culture.
  • the indu When culturing the transformant using an inducible ferromotor or an expression vector, the indu may be added to the culture medium as necessary: for example, ia ⁇ ⁇ When culturing a product formed using an expression vector using a promoter, cultivate a product prepared using an expression vector using a promoter such as isobromopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside. In this case, the medium may be indolacrino.
  • the culture medium for culturing the mi ⁇ body obtained using the spores as a host is reduced to "" ⁇ .
  • RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, I22, 519 (1967)], Ea ⁇ e MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, S, 396 (1959)], 199 Culture medium [Prooeeding of the Society for Biological Medicine, 23, 1950]] or a medium in which bovine wombs are stimulated can be used for these mediums.
  • Culture is usually at pH 6-8, 30-40. C, 5% C0 2 ⁇ such as ⁇ (under cow:! Intends to 7 days.
  • a medium such as lysine or syrin may be added to the medium during the culture.
  • a TNM-FH medium called “Pharmingen”, a so-called Sf-900II SFM medium (Life Technology 3 ⁇ 4f3 ⁇ 4) And ExCell400, ExCeU405 [both JRH Bay: “Yen ⁇ ” (JRH Biosciences)) B, Grace's Insect Medium [Nature, 125, 788 (1962)] and the like can be used.
  • a substance such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • the protein of the present invention in order for the protein of the present invention to be expressed in a transgenic form in a filament, after completion of the culture, as was recovered from a distance and the aqueous system JS-screened, sonication, French press, Menton gaurine homogenase ⁇ ⁇ ", Thread 3 ⁇ 4 is crushed by Dynomino to obtain a thread-free liquid. Salting out method using ammonium sulfate, etc., 3 ⁇ 4 ⁇ method using a shelf, acetylethyl (DEAE)-Sepharose, DIAIONHPA-75 ( ⁇ it ⁇ ) using resin, etc.!
  • ⁇ T-on chromatographic method S -Sepharose FF ( ⁇ T-on chromatographic method using a resin such as Fano ⁇ Chine, ⁇ ⁇ -chromatographic method using a resin such as Butinole Faros and Phenylsepharose, a gel using a sieve Filtration method, affinity mouth chromatography One method, chromatography Focusing method, etc.
  • ⁇ Swim in the swimming island Kr & ⁇ can be used to obtain insects.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ which was expressed as a result of expression of the protein in Itoshima, was obtained by recovering the protein by a conventional method from the amount obtained by crushing and recovering the ⁇ and performing distant ⁇ The body of the protein is soluble in the protein.
  • the word ⁇ ! Melts into a sickle that does not contain protein difficulties or ugliness or that does not change the protein, but the protein does not change, or the protein is composed into a normal standing iW After this, ⁇ 12 and! I ⁇ t® to remove more! Goods can be obtained.
  • the protein in the culture supernatant can recover the derivative of the protein with a weight of 0%.
  • an article can be obtained by using the above and [ ⁇ ] from the word 141 minutes. .
  • the protein of the present invention can also be obtained by the Fmoc method (fluoreninolemethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarboninole method), etc. Also, Advanced ChemTfech, Nokinkin Eno! ⁇ 1, Fanocia, Protein Technology Instrument (Synthecell-Vega), and Protein Tfechnology Instrument. The company, PerSeptive, can also combine and combine peptides from the island's abdominal crop ff ⁇ .
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. 3 ⁇ 7 days after each administration, it is better to recommend it from ⁇ » ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 1 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1976 ⁇ E. Harlow and D. Lane: Antibodies-A W 99/31
  • the serum used in rabbits, goats, mice, rats, or hamsters showed sufficient antibody titers against the serum used for destruction.
  • Purification can be carried out using a conventional method of chromatography using ammonium salt, cabril removal, DEAE-Sepharose column, protein column or gel filtration column.
  • a mouse or rat As a medullary movement, a mouse or rat is used.
  • 8-azaguanine ⁇ us derived from BALB / c
  • 3 ⁇ 4S B »P3-X63Ag8-Ul hereinafter abbreviated as P 3—U 1 [Curr.TbpicsMiciObiol.Immunol., Ai, 1 (1978)], [Europ. J. Immunol., 511 976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 226, 269 978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J.
  • Nopridoma strain that contains a monoclonal antibody which is a protein of the present invention.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention which was obtained in (2-3), was conjugated to a monoclonal antibody.
  • Tesshi the spoon was Mausuka Agata, 3, 0 0 0 r P a solid content of 5 minutes to at m [ ⁇ to.
  • the obtained supernatant is subjected to salting out by 40 ⁇ 50% « ⁇ Chromatography using DAE-Sepharose column, Protein A-column, or column chromatography using Cell mouth Fine GSL2000 (Biochemical Chemistry Earth). I do.
  • the subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein content is calculated by the absorbance at 280 nm.
  • the DNA of the present invention can be obtained by performing Northern blot hybridization on RNA extracted as [1 ⁇ (1-1) and ( ⁇ ) from human-derived yarn using this as a probe.
  • the level of detection of the mEA of the protein of the present invention can be determined; frT can be determined. Can be.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a specific primer of the DNA of the present invention to reduce RNA extracted from human ([1] (1-1) and I ⁇ from human).
  • the mRNA of the present invention can also be detected by RT-PCR using the same DNA as that of the present invention; By using this as a probe and performing in situ hybridization on human fragments, it is possible to know a finer distribution of the oligonucleotide of the present invention, such as identification of the protein of the present invention. Can be.
  • the oligonucleotide (RAZDNA) of the present invention can be used by tranferring the transcription or mRNA of the protein of the present invention (Murakami; Chemistry, 46, 681 991), PS Universal, Bio Ifechnology. , 2, 358 (1992)], which is thought to be a potential source of VEGF-KDR ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ij ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It is possible to treat diseases that progress due to abnormal blood such as fresh blood.
  • the protein of the present invention can be obtained by using the DNA of the present invention and [2] the method of freezing.
  • screening for inhibiting the binding of the KDR intradomain to the protein of the present invention can be performed.
  • [1] use the cDNA of the KDR cell domain obtained in (1-1), and [2] use the method of language to select the domain protein in the ffl ⁇ of the KDR thread and use the protein of the present invention.
  • KDR Itoshima domain proteins in vitro After that, polyacrylamide gel electrophoresis is performed to detect a rise in the amount.
  • a cDNA clone of the obtained protein of the present invention inverted domain
  • a protein of the present invention ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ protein poor expression plasmid
  • the amount of 3 ⁇ 4 ⁇ can be aged by adding it, and it is possible to screen for destruction, and such destruction is considered to include fff ⁇ Sl of VEGF-KDR system. Therefore, it can be used to treat diseases that progress due to solid culture, inflammation in masticatory rheumatism, diabetes mellitus msm, ⁇ m, and dry abnormal blood.
  • an antibody against the protein of the present invention can be obtained by the method of [3] language.
  • the protein of the present invention can be detected by using an antibody against the protein of the present invention.
  • an antibody that inhibits the age of the protein of the present invention and KDR an antibody that inhibits the interaction between the protein of the present invention and the protein of the present invention, WTOfTOi ⁇ . It is thought that VEGF-KDR system is inhibited, so administration of such an antibody will result in solid phase ® ⁇ c occupation, »formation, littMfi rheumatism ( ⁇ ⁇ ⁇ if ⁇ , diabetes t4 S ⁇ S, ⁇ dry). Abnormal blood, etc. ⁇ It is possible to cure illness that progresses due to raw disease.
  • Figure 1 shows the KDR cDNA clone pBluescriptn KDR, KDR thread Domain 1 in MS?
  • the plasmid pAS-KDR for the no-brid method and the plasmid pAS-KDR and the cDNA library used for the two / brid method were used.
  • FIG. 2 shows the results of a northern blot for the distribution of the expression of the KDR receptor H ⁇ protein DNA1 in humans.
  • FIG. 3 shows the results of a Northern blot for investigating the distribution of KDR receptor protein DNA2 in humans.
  • FIG. 4 is a diagram showing the deletion of the K868M mutant KDR cDNA plasmid pBluescriptH KDR M-2.
  • FIG. 5 shows the result of a tuno-brid using plasmid clone # 37 and; KDR (pAS-KDR) or T ⁇ r mutant KDR.
  • Fig. 6 shows the use of plasmid clone # 2 and wild-type MKDR (pAS-KDR) or T ⁇ r mutant KDR. .
  • the fragment to be amplified in (A) is 810 bp, and since the BamHI site is located near the 5 'end and the site is located at the 3' end in the SIJ of this fragment, the DNA is cut with gi ⁇ EamHI and The DNA fragment of about 740 bp is used, and the fragment that flank in (B) is 1059 bp, and the primer is 7 ⁇ 5fe) haI site in 33 ⁇ 43 ⁇ 4.
  • ⁇ cytoca ⁇ ⁇ ⁇ near the 5 'end works in IW ⁇ Aial and hal, and a fragment of about 990bp is recovered.
  • the plasmid obtained by subcloning the KDR cDNA fragment of pBluescript ⁇ SK into pBluescript ⁇ SK was cut with BamHI and Xhal, and ligation was performed with the amHI- ⁇ al fragment of (A) and the ⁇ al-Xhal fragment of (B).
  • Primer Represents the entry made by KDR-2.
  • GAL4BD DNA ⁇ domain of GAL4
  • GAL4AD »GAL4 remains ⁇
  • KDRC KDR cDNA thread domain fragment
  • the JME ⁇ J of the obtained KDR cDNA was determined by the 'oxy method, and was determined as follows: »[BITbrman et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1S2, 1579 (1992)] (1)
  • the unknown two amino acids at the N-terminus are Mel ⁇ ATG) and Gln 2 (CAG), and the 272 bp 5 '"amino acid.
  • Val 297 (QTA) ⁇ He (ATA), Thr 7 '72 (ACG) - Ala (QCG), Gly 787 (QGG) - ⁇ Arg (CGG), Asn 835 (AAQ ⁇ I ⁇ s (AAG), Glu 848 (GAG) ⁇ Val (GTG), Thr 134 (ACG)- ⁇ SerCTCG) [S. Sawano et al .; Cell Growth & DiffercntiationJ, 213 (1996)].
  • this mutation creates one Aii l site in the fragment of the (B) increase
  • the plasmid pUC-KDRC is transformed into the Affi-primer KDR-2 (salt sequence P No. 15 ⁇ ⁇ )) K K K K K K K K K K K K K K K K K K ⁇ K ⁇ Pro Pro ⁇ 15 15 15 ⁇ ⁇ ⁇ 15 Immediately after the BamHI site ⁇ ; ⁇ Introduce one SC; cut this modified pUC-KDRC with W ⁇ EamHI and Sail; cut about 1.7 kb of the KDR cDNA fragment; cut this EamHI-Sall fragment mouth Nte Tsuno ⁇ hybrid 3 ⁇ 4 of Kkusha ⁇ 7 was subcloned between EamHI / Sall site of Kuta ⁇ pAS2-l, a plasmid pAS2-KDR and I Lou P AS2-KDR ⁇ !
  • Fig. 1 Screening method is performed according to the manual of Clonetech, which is sized for the library.
  • pAS2-KDR Sa chammvops oprpvisiae strain CG1945 (Introduced into Clonetech using the ⁇ lithium method: GAL4 binds to chromosome in CG1945 strain Downstream of EJIJ, it has histidine HIS3 and / 3 galactosidase lacZ as reporter Hfi ⁇ ", and is a strain requiring tributophan, leucine, and histidine.
  • Plasmid PAS2-KDR and KDR yarn E ⁇ The Sl form that expresses each protein of the cDNA clone of the protein that corresponds to the domain is GAL4 DNA ⁇ domain and GAL4 transgenic by the binding protein that encodes the KDR thread domain and cDNA.
  • the I4f-Dori domain is transcribed, so the HIS3 and lacZ transcripts downstream of the GAL4 DNA domain are transcribed, resulting in histidine tropism and / 3-galactosidase 3 ⁇ 43 ⁇ 41 «.
  • the ⁇ S ⁇ body was cultured in a minimal medium containing leucine and became leucine ⁇ ⁇
  • 3 ⁇ 4 ⁇ cDNA plasmid is recovered from the body, and the protein encoded by the cDNA in the recovered plasmid is DR
  • Clones # 37 and clones were identified as the clones:
  • Clones 37 forces; including cDNA salt »Row C
  • Plasmid clone # 37 which is the clone identified in (2) above, is cut with EffiRI and Egin, and a 1.9 kb fragment of cDNA 3 ⁇ 4r ⁇ * is cut into a fiber, subcloned between the HincIlZEamHI sites of the vector "pUC118" and nested deletion.
  • JME ⁇ J is the rooster No.5 ⁇ .
  • ⁇ 3 ⁇ 4H ⁇ is 1985 bp, which corresponds to the 283rd and later of the salt ij of the E ⁇ E1.
  • the homology of this ⁇ to the GenBank database was determined by BLAST search. As a result, no ⁇ 7 ⁇ MH ⁇ rooster U was found.
  • the cDNA containing clone # 37 is considered to be a novel cDNA that is known as a KDR receptor, and is named KDR receptor Hi ⁇ protein DNA1.
  • Plasmid clone # 2 which has been cloned in (2) (> ⁇ ), is cut with ECQRI and Xhol, and the cDNA 3 ⁇ 4rtj # 3 ⁇ 4 1.6 kb fragment is excised, and after ossification of * ⁇ , the vector “pUC118 Subcloning into the Hindi site of pDNA2-RX1 and pUK2-RXl, based on the nested deletion method, based on the series of cDNA deletions, and the plasmid before deletion.
  • the sequence Sl ⁇ was performed using a sequence kit from one company, DNA Inc., and DNA sequence 1 ⁇ ⁇ ABI310. ⁇ ] make a decision ⁇
  • Rooster No. 6 i The obtained; ⁇ ⁇ is 1610 bp, which corresponds to the 27th and following characters of Rooster No.1. This:
  • Homologous search was performed by BLAST search using GenBank.
  • the cDNA containing Clone # 2 is also considered to be a novel cDNA involved in the identification of KDR receptor 1 and this is named KDR receptor "protein DNA2".
  • CMSS Example 2 KDR receptor protein DNA release, cloth
  • KDR receptor protein DNA1 current distribution
  • the release of the KDR receptor protein DNA1 in humans was compared to the Multiple Tissue Northern Blot (Clontech tt), a mENA blot of human fibers ('brain, lunar disjunction, lunar, skeletal muscle, M).
  • a Northern blot By performing a Northern blot
  • the mENA of the KDR receptor “protein DNA1” has two views of 2.7 kb and 2.0 kb, and that the mRNA is not sewn; (It is considered that ⁇ 16
  • Human ⁇ ( ⁇ ⁇ (KDR receptor protein DNA2 is distributed to human fibers (I: mold, brain, lung, moon, skeletal muscle, haze); II. M thymus, anterior, testis, speaking, small intestine, colon , White rt) mRNA blots using Multiple Tissue Northern Blot I and II (Clonetech II).
  • mENA of KDR resorbu ⁇ ⁇ protein DNA2 is found to have two views, 3 kb and 6 kb. In the small intestine and colon, the crumbs were crushed, while the mRNA of 6 kb was found in the thymus, testis, and leukemia of the thymus.
  • a 2.2 kb target ECQRI fragment was a vector "" ECQR of pUCU9 [Subcloned into the site and obtained plasmid pUK137-Rl and pOKl37-Rl by EmRt and ⁇ 7: ®f ⁇ Fight U3 ⁇ 453 ⁇ 40.61 * wr and subcloning between pucii9 * ⁇ ⁇ Do ⁇
  • Escherichi cdiDH5ii which is a bacterium containing PUK137-R1) UKl37-Rl November 1997
  • the KDR receptor "" ⁇ protein DNA1 is linked to # 3 ⁇ 41 ⁇ 2, so KDR C 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 j j j ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the KDR receptor obtained in Step 1 is the cDNA of protein DNA2. Since the mENA was 0 ft, which became evident in Step 2, it does not encode cDNA i ⁇ length. Since it has Hft ⁇ ', the cDNA rfeftiD clone Make it! ⁇
  • a clone containing the longest cDNA of about 3.0 kb was selected from the positive clones obtained from Bracno and Ibridice. This clone was subjected to ECQRI, subcloned into the ECQEI site of the vector pUC119 ( ⁇ ⁇ -), and the plasmid pUK102-Rl was subcloned with the cDNA (I ECQR [fragment 3.0 kb]. The 3kb 1111 ⁇ (13 ⁇ 4 was considered to be the full-length cDNA clone corresponding to the above.
  • the KDR receptor protein DNA2 of pUK102-Rl was subjected to 5 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and the # 2 KDR receptor pig obtained in 3 ⁇ 4 ⁇ 1 was obtained.
  • ⁇ Synthetic protein DNA2 cDNA CD3 ⁇ 43 ⁇ 4S ⁇ J is 5bp 27 bp longer than 5 ⁇ »J KDR receptor of P UK102-R1"
  • Protein DNA2 cDNA is about 1.4kb longer than # 2 cDNA, but 5 ' It is considered to be a clone, not 3 ' ⁇ , but it is considered to be a clone.
  • the novelty of this amino translation is achieved by performing homology t ⁇ on the amino translation database Genpept :, PIR, Swiss-Prot, PRF, and PDB by Blast search.
  • a human leukocyte cDNA library (Clontech; vector, gtlO) was screened for a DNA2 clone from the human isolated cDNA library. Screening was performed in the same manner as the ning.
  • the human leukocyte cDNA library was again screened with plaqueno and hybridization, and the obtained clone: 1.8 kb from the eve clone cDNA ⁇ tf clone This clone was subjected to ECQRI and corresponds to cDNA.
  • Lys 868 which neutralizes the kinase activity of KDR, has difficulty in Met (hereinafter referred to as the K868M mutation).
  • ⁇ was introduced into the DRcDNA clone used in Zongyin 1 to encode KDR.
  • A Primer K14N «1 Ban No. 16) and Primer KMR-2 ® ⁇ No. 17
  • B Primer KMN-2 (Tori ⁇ I Ban No. 18) and Primer K3R 3 ⁇ 4 1 PCR No. 19) Perform PCR with two sets of primers ⁇ :
  • KNR-2 and KMN-2 are mutually exclusive primers with K868M variation 3 ⁇ 4K ⁇ . ⁇ IX the two combined DNA fragments and mix them.3 ⁇ 4 Next, use primers 2 and 5 used in Example 1 for PCR! The 0.8 kb cDNA fragment encoding KDR was used (Fig. 4).
  • the fragment is restricted with gg ⁇ EamHI and: Ikil
  • EamHI-fragment K868M mutation 3 ⁇ 4 ⁇ ,
  • an approximately 5.2 kb oil-EamHI fragment obtained by ligating pBluescriptll KDR with EamHI and 1, and pBluescriptn KDR was digested with: Ikgl and oil About 1.5 kb: Ikj fctl fragment with ligation ® ⁇ , ⁇ 868 ⁇ mutant KDR cDNA ⁇ l ⁇ t plasmid pBluescriptn KDR M-2
  • the language is 2% glucose and 5mM 3-aminotriazole ⁇ ⁇ , leucine, histidine, tryptophan 3 ⁇ 4 ⁇ manale, combined / ⁇ 3 ⁇ 4 Lb, 30 days at 30 C C, histidine dwarfism
  • Figure 5 shows the results of using plasmid claw # 37.
  • KDR and KDR receptor pig H ⁇ protein DNA1 and KDR receptor protein DNA2 have Lys 868 , which means that tyrosine chitase activity of KDR is necessary.
  • KDR receptor "KDR site which is ⁇ protein"
  • KDR resator " ⁇ In order to examine the power of a protein to KDR, we used a mutant of KDR and carried out the yeast two-hybrid method: A modified version of rnm l (l) with one base inserted immediately below the EamHI site! pUC-KDRC (7 "Main strand 3 ⁇ 4 ⁇ Using male primer 1 (1) and ⁇ The Tr on the C «side of the kinase domain of KDR was replaced with Phe by mutation introduction. The primer used was YF12 [Tyr (1136 YF13 [Tyi 1175)-Phe], YF14 with iffi IJ of Toriban No.
  • the warrior TVr mutant 7 was combined with the mutation ⁇ :, as multiple mutants of T r were mutated, YF12 + 14 [Tyr (1136, 1214) ⁇ Phe], YF12 + 13 + 14 [1 ⁇ 1136, 1175, 1214) ⁇ Phe], YF14 + 15 [1Vr (1214, 1223) ⁇ Phe], YF14 + 16 [1 ⁇ (1214, 1305) ⁇ Phe], YF1G -17 [ TVr (1305, 1309) ⁇ Phe] and YF12 + 14 + 16 [1Vr (1136, 1214, 1305) ⁇ Phe]: ⁇ The introduction of each mutation
  • the Hi Tr mutant KDR plasmid thus obtained was digested with EamHI and Sail, inserted between EamHlZSaJI of PAS2-1, and a plasmid in which Tr-transformed KDR was inserted into these pAS2-l. Introduced into strain HCG1945, cultured in Leu, His, rp 3 ⁇ 4r ⁇ Mana ⁇ ⁇ with 2% glucose and 80 mM 3-aminotriazole for 4 days at 30 ° C for 4 days, Check whether or not His
  • the iyr mutant plasmid of Arthropod magna 7 views in the TO ⁇ KI ⁇ body, KDR TVr (1305) was changed to Phe (YF16) On the other hand, a decrease in growth in a medium containing His was observed. On the other hand, the TVr mutation ⁇ ⁇ ⁇ 'in the other 6 views was a completely unrecognized force under the union ⁇ A mutant in which multiple Tyrs were transferred to Phe Nyaray, even a mutant of TVr (1305)
  • the abnormal blood t ⁇ f such as »flame, m, ⁇ m.

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Description

明 細 書
新 «白質 謹
本発明は、 血管内皮糸 fflSS¾¾a÷(VEGF)リセプタ一 KDR (kinase insert domain-containing receptor；以下、 KDRと略 内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白質 に I る。
血 «生は、 ^« ^の胎 ^期における循^ ¾系 成^^く の に βな^ jを 果たすとともに、 成棚体 (M) においても'觀期 ける黄体形成、 子宮内 ^性 殖、 月應成等に鎌に関与する。 さらに、 ^態としては、 固开 増殖、 率 形成、 m . 'ι蕭 リュウマチ 態形 鍵に血簡^ く関与している
〔J.Folkmanら； J. BioL C em., 221, 10931 (1992)〕 。 血簡生は、 血簡細子が分泌され ることが引き金となり、 旁にある既^血管の内戯 ¾からプロテアーゼカ s分必され、 as 膜、 間質力'囊され、 織、て血管内 ¾ («¾、 it¾ ^はじまり、 ts¾^形成されることで 血管力 S新生される よりなる 〔J.Folkmanら； J. Biol. Chem., 2βΙ, 10931 (1992)〕 。 血管 新生を誘導する因子としては、 Vascular permeability fector (VPF)A¾scular endothelial growth factor (VEGFが上記発生 における血 1¾ί生およ t)«3な状態における iflL^ff生に ぉレヽて最も; figな因子として知られてレ、る OVLShibuya; Advances in Cancer Research, 161, 281ひ 995)〕 。 VPF/VEGFはホモダイマ一よりなる分子量約 4万の蛋白であり、 1983年に血 ^¾l4iJ©S因 V scular permeability fkctor VPi として 〔D.R.Sengerら； Science, 212， 983 (1983)] 、 1989年に血管内 ascular endothelial growth factor VEGF)と し " ¾ϊζ:した として されたが 〔N.Ferraraら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 851 (1989)〕 、 cDNAクローニングの結果、 は同一 、あることが明らカとなった
[D.W.Leun ら； Science, 246, 1306 (1989)、 P.J.Keckら； Science, 24β, 1309 (1989)〕 （以 下 VEGFと垂 c VEGFの¾¾としてはこれまでに、 血管内 J¾WSに対し、 増殖 iSiStt
0ED5O = 2 ~ 3pM) [N.Ferraraら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 231, 851 (1989)〕 、 遊^ 生 E.Kochら； J. Immunology, 152， 4149 (1994)〕 、 メタロブ口テア一ゼ分泌促 〔E.N.Unemoriら； J. Cell Physiol., 153, 557 (1992)〕 、 ゥロキ^""ゼ、 tPA分泌ィ ®1¾ 性 CM.S.Pepperら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 1S1, 902 (1991)〕 を示し、 in vivoにおレ、 て ttlilLi¾f生 iStStt [T^saharaら； Circulatior^ 22 suppl Π， 365 (1995)〕 、 血 足
〔0. 8611§61«ら；801611∞, 212，983ひ983)〕 が艦されている。 VEGF 管内戯 に極めて特¾14の高レ、増 ¾S子であることが されている 〔N.Ferraraら； Biochem.
Biophys. Res. Comm., 161, 851ひ 989)〕 。
血菌生を伴う疾患の中で、 増殖、 車 形成、 m . 慢 リュウ マチ (^態 Jf城に VEGF力 ¾く関与していること力 s酷されている。 @¾月鶴にっレ、ては、 こ れまでに腎癌 CA.Takahashiら； Cancer Research, 54, 4233ひ 994)〕 、 fl^ [L.F.Brownら； Human Pathology 26, 86ひ 995)〕 、月 ¾S鶴 [RABerkmanら； J. Clinical Investigation^ 21, 153 (1993)〕 、 消ィ I ^癌 [LEBrownら； Cancer Research 53， 4727 (1993)〕 、
[TAOlsonら； Cancer Research, , 276 (1994)) < 多くのヒト月麵職にぉレ、て VEGF 力；胜されてレ、ること力 S酷されてレ、る。 ¾ ^につレ、ては VEGFと患者の予後との「关 が樹 され 果、 VEGF敲溯鶴は、 低発溯鶬に比べ、 鹏血鶴 であり生裤カ氐 いことが明ら力となっている CM Ibiら； Japanese J. Cancer Research, S5, 1045 (1994)] 。 ま た、 ヌードマウスにヒト ®¾を皮 ¾¾したゼノグラフトモデル において、 抗 VEGFモ ノクローナル抗体 効果を^ Tこと力 S されてレ、る [J. Kmら； Nature, 362, 841 (1993)] 。 さらに、 ヌードマウスにおけるヒト モデルにおいて、 抗 VEGFモ ノク口一ナル抗体は ¾ ^を嫌 IJできることが酷されてレ、る (OMelnykら； Cancer Research, 56, 921 (1996)3 。 従って、 VEGF活性を卿 Jすることができれば癌患者における腫 m< im. 繊形成を できるものと搬される。 また、 ヒト 隱水、 献中に高 « の VEGF力 s検出されることから、胸水、 の な因子である可能 14も示され
[S.Kondoら； Biochimica et BiophysicaActa, 1221, 211 (1994)] 、 VEGFをブロックするこ とで¾»水、 «の Ρί¾を防ぐことも柳寺される。
Figure imgf000004_0001
ヽては、 異常な血 生により纏剥离 硝 出血をおこして細にレ、 たるが、 糖尿病 における血 生と .¾¾¾艮¾^1の VEGFレベルが正相 ること力報 告されている 〔L.RAielloら； New England J. Medicine, 331, 1480 (1994)] 。 また、 サル 離モデル ί レ、て抗 VEGF中和モノク口一ナル抗体の眼 F¾¾与により VEGF活生を 喇す ると血 が 劇されること力;報告されてレ、る A.RAdamisら： Arch OpthalmoL, 114, 66 (1996)] 。 従って、 應 IJに ¾ ^される VEGF ¾½を することで糖尿^ Μ^ί:^ΰける血 魏生を 嘛できること力^^される。
爾挪リュウマチの 態 «S (骨、 軟骨 纏 に d fc鶴生を伴うが、 嫩 TOリュゥマチ患者の «液中には VEGFカ高 «で含まれてレ、ること、 Γ*¾ίί中のマクロファ - ¾5 VEGFを することが酷されてレ、る CA.E.Kochら； J. ImmunoL, 152, 4149 (1994)、 RAFavaら； J. Exp. Med., 1SQ, 341ひ 994)〕 。 廳に¾ ^される VEGF？ Sttを清 ijすること で 炎 ί ける血 ff生を 鋼できること力 される。
ヒ卜の VEGFリセプタ一としてはこれまでに Rt-l(fins-like tyrosine kinase) CM.Shibuya ら； On∞gene, 5， 519ひ 990)、 C.Vriesら； Science, 255, 989 (1992)) および KDI¾kiiiase insert domain-containing receptor) [B.I.Tbrmanら； W092/14748, Priolity Feb.22ひ 991)、 B.I.Tfermaiiら； Biochem. Biophys. Res. Comm., IS2, 1579ひ 992)〕 の 2觀が酷されてレ、 る。 ヒ卜の VEGFリセプター KDRのマウス〖 けるホモログは Plk-1 CWMatthewsら； Proc. Natl. Acad. ScL USA, S8, 9026ひ 991)、 A-Ullichら； W094 11499 Priolity Nov. 13 (1992)、 BJMillauerら； 12, 835 (1993)] と命名されてレ、る。 Flt-1および KDR/FTk-1は
»とも糸 fflWドメィンは 7個のィムノグロブリ ¾ドメインよりなり、 糸鹏内ドメィンには チロシンキ^"ゼドメィンを有する 量 180-200キ口ダルトン (^容 ί ^チロシンキナ一ゼ ファミリ一に属する!^白である。 VEGFは nt-1および KDR/Flk-1にはそれぞれ KD ifi^ 20pMおよび 75pMで特¾½に結合する。 Flt-1および KDR/Flk-1 ί ίΐ管内皮細胞に特異的に 発現してレ、ると酷されてレ、る [T.P.Quinnら； Proc. Natl. Acad. Sd. USA Q, 7533 (1993)、 RLKendaUら； Proc. Natl. Acad. ScL USA 2Q, 8915 (1993)] 。
様々なヒト 砉、における KDR 現につレ、ては、 ヒト臟麵職の鶴血管内 鹏
[E.Hatvaら； American J. Pathology, 146， 368, (1995)〕 、 ヒト消ィ 観の ffl¾血管内皮 糸鹏 [LEBrownら； Cancer Research, 53, 4727 (1993)] ( レ、て ίϋΕ 職の血管内戯鹏 に比べ KDRの mRNAレベル ¾ ^上昇していることが酷されている。 これらの結果は、 月鶴血魏生にぉレ、て VEGF-VEGF プタ一 KDR系が fi ^な體 iJを果たしてレ、ることを強 く るものである。 さらに、 慢 ttKSfiリュゥマチ唐者の f の血管内皮糸 ¾におレ、ても in situ hybridizationにより KDR mRNA ^認められることが酷されており [RAFava ら； J. Exp. Med.，120, 341，（1994)〕 、 リュウマチにおける VEGF-VEGF Hrプタ一 KDR系の '|·生を 変してレヽる:
3 VEGF ブター KDR/Flk-1の につレ、ては、 ブタ動脈の血管內^ に KDRを発現さ せると VEGFに し増殖、 i ¾すること力ゝら、 VEGFの雜な の中で KDR i lk管內皮 糸 «殖、 艇に関与すると船されてレ、る [J. Waltenbergerら； J. BioL Chem., 2fi2, 26988 (1994)] 。 また、 マウス型 flk-1遺^ "を赚した flk-1ノックアウトマウス ίΐβ!熟した 血管内皮,栖包が全く認められず、 卵難の血島も形成されず、 子宫内で死亡したことから、 動 tifS体にぉレ、ても KDR/flk-1 ί ίίιι管内皮糸鹏の増殖、 分化に関与することが艦されてレ、る 〔F, Shalabyら； Nature, 326, 62 (1995)〕 。
こチロシンキトゼ型リセブタ一のf^fStは、 リガンドとの；^により自己のチロシ ンキナーゼカ¾+¾匕され、 自己およ 也^？"のチロシン をリ はることで寸 t¾ist 力;開始されると考えられている。 この 、 リセブターの自己リ 匕 TVrに SH2 ドメイン介 して別の蛋白質 が し、 こ^ ^力也 (¾Η·と したり瞧 をおこすことにより ff^c fSS^なされていくと考えられている。 KDRの齢も、 血管内戯 «において、 VEGF との により自己の TVr ¾Sがリ 1 ^匕を受けること 〔J. Waltenbergerら； J. Biol. Chem., 269, 26988 (1994)] 、 フォスフォリノくーゼ C- γ (PLC-y) の TVr リ ^(匕力 SIされること、 MAPキナーゼカ活|¾ t "ること力 S酷されてレ、る (T.T¾kahashiら； On∞gene, 14, 2079 (1997)] 。 また、 KDE FTk-lと Flt-1を Egi}¾rf VEGFによる†f$SiSiとして見た^ \ VEGFで τΤることにより、 糸 に^ Sしてレ、る蛋白質である pl25 focal adhesion kinaseおよび paxillinが TVrリ ^匕を受けるとレ、う酷 [ Abediら； J. Biol. Chem, 222, 15442 (1997)] や、 VEGFで朿 I微したゥシ血管内戯鹏で、 SH2ドメインをも 白として PLC- 、 GAP (ras G Pase activating protein) 、 PI3-kinase vphosphatidylinositol 3- kinase) 、 Nckがリ ^ヒを受けること力 されてレ、る (D.Guoら； J. Biol. Chem., 22Q, 6729 (1995)] 。 ただし KDRの糸 ¾内ドメインと してレ、る につレ、てはこれまで報 告されていなレ、。
Flk-1 内チロシンキナーゼドメィンを した^ S†¾の Flk-1ミュ一タントを用レ、、 ウィルスべクタ一により内戯 に導入する方法が^^たところ、 稀醒 Flk-1ミュータン トウィルスと を混合して K 鹏 t^!Sすると fifiS^翻 «fJされること力 ¾ ^さ れており 〔B. Millauerら； Nature, Z, 576ひ 994)〕 、 Flk-1の个颜¾§を阻害することで腫 瘍増鶴 «ijされること力;示されてレ、る。
のこと力 、 ヒト型 VEGF受容体 KDRの 縫を阻害できれば、 ヒトにおける師 » ^殖、 繊形成、 1蕭 リュウマチ ί ける κίίί炎、 糖尿病 ffi«s、 ^ mm^. ¾ι縛の異常な血 t=tf生により病態が進 i る疾患の治療に有用であることカ^^される。 発明の開示
本発明の! ^は、 VEGFリセブター KDRへの^によって KDRの†ff«¾を誘導し、 HffM < im, 繊形成、 1舊 リュウマチにおける「关搬、 糖尿病 i4WM、 m , 乾鮮 等の異常な血魏生を起こす原因物質 糊することにある。
本発明者らは上言 欲すべき鋭意職を重ね 結果、 ヒ ^^cDNAライブラリ一よ り KDRの糸»内ドメインと^してそ (7 Τ^ββ¾を誘導する蛋白質をコードする cDNAを単 離し、 その酉 E^ij決定をして、 本発明を¾^るに至つ
即ち、 本発明の第 1 ( ^明は、
以下の (a) または (b) の蛋白質：
(a) 酉 墦号 3、 4および 2 8力 選 る酉 墦号に言凍のァミノ翻 Jからなる蛋白質
(b) (a)の蛋白質の有するアミノ翻 リにおいて 1若しくは数個のアミノ^^欠失、 し くは付加されたアミノ豳 S ^からなり、 力つ血管内戯 fflM麵子 (VEGF) リセプター
KDR(kiiiase insert domain-containing receptor)の糸趣内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白 g-eある。
上記のァミノ 欠失、 m しくは付加は、 前周 M術である細 特驗変廳発法 により ¾¾することができ、 また、 1若しくは数個のアミノ酸とは、 細立特 »変難発法に より欠失、 しくは付加できる禾 is (^のァミノ酸を魏する。
力かる 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 しくは付加されたァミノ翻 Jからなり、 力 KDRの糸鹏内ドメインと する性質を有する蛋白質は、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 F.M.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、 MJ.ZoUer and M.Snith； Nucleic Acids Research, IQ, 6487 (1982)、
CDalbadie-McFarlandら； Proc. NatL Acad. Sci., USA^ 12， 6409(1982)、 JAWellsら； Gene, M, 315 (1985), P.Carterら； NucleicAdds Researc 13, 4431 (1985)、 TAKunkelら； Proc. NatLAcad. Sci USA, S2, 488 (1985)等に言激の: ^去に準じて讓することができる：
以下、 本発明の蛋白質を KDRリセァタ" ^蛋白質と呼ぶこともある. 本発明の第 2 (7 ¾明は、 上記蛋白質をコードする DNA、 酉 播号 1、 2および 2 7力 選ば れる酉 墦^!こ«の^ ¾ 』を有する DNA、 また ί¾ 播号 1、 2および 2 7力ゝら週 る 播号に読の ^Sfi^jを有する DNAとストリンジヱントな 牛下でハイプリダイズし、 力 つ VEGFリセァター KDRの糸鹏内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白質を コ一ドする DNAカゝらなる DNAである。
上記の 「ストリンジェン卜な^ ί牛下でノ ブリダィズし、 力つ VEGFリセプタ一 KDRの細 胞内ドメィンに して KDR cot颜 Siを誘導する蛋白質をコ一ドする DNA」 と 酉 噃 号 1、 2および 2 7から選 る酉 噃号に鐘の ¾¾ 〗を有する DNAをプローブとして、 コロニー · ノ^ブリダイゼーシヨン法、 プラーク · , ^ブリダイゼーシヨン法あるレ、は ~1 'ン プロットノ^ブリダイゼ一ション？ を用レヽることにより得られる DNAを Ε¾し、 具 ίΦ½には、 コ口ニーあるレ、はプラーク由 DNAを固定化したフィルターを用レ、て、 0.7〜； L0Mの Nad 下、 65°Cでノ ブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1 X〜2 X SSC (saline-sodium citrate) [ 1 SSC裔夜 (150mM NaCl、 15mMクェ^^"トリゥム） ； n Xは n倍濃 度の灘を^ Τ。 〕 を用レ、、 65°C^f牛下でフィルターを赚することにより同^?きる DNA をあげることができる。 ノ ブリダィゼーシヨンは、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressひ 989)、
FM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John WHLey & Sons (1987-1997)、 DM.Glover and B.D.Hames； DNA Clonin 1: Core Ifechniques, A
Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の纖書に言凍されて レ、る方法に準じて行うことができる。 ノ^プリダイス可能な DNAとして具鹏には、 酉 潘号 1、 2および 2 7力 選 i る酉 墦号に言凍の ^SE^Jと少なくとも 80%以上の相 生を有 する DNA、 好ましくは 95%Riiの相同生を有する DNAをあげることができる。
本発明の第 3 明は、 上記 DNA ¾ ^有する糸藤えべクタ一である。
本発明の第 4 i 上言 s»えべクターを宿 ϋ鹏に導入して得られる形 s^freあ る。
本発明の第 5の発明は、 上言 S ^体を培地 咅養し、 ±咅難中に上記蛋白質を«^ させ、 咅麵力ゝら該蛋白質を聽することを稱教とする該蛋白質の! ¾t¾¾である
本発明の第 6 (7 ¾明は、 上記 DNA
Figure imgf000008_0001
列を有するオリゴヌクレオチドである- 該オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 酉 潘号 1、 2および 2 7力、ら る酉 墦号に雄の ¾¾ 冲(¾ ^した 5 ~€0 ¾S、 好ましくは 10 50歹»75；^ 1〗と同じ または W½な: を有するオリゴヌクレオチドをあ げることができる。
本発明の第 7 明は、 上記蛋白質を認識する抗^ Cある。
本発明の第 8 (7 ¾明は、 上言¾ [体を用いることを赚とする、 上！ ^白質 ^ ^出法 である。
本発明の第 9 明は、 上言 リゴヌクレ; ^ドまた iiH¾t体を極成分とする、 異常な 血 «生により病 ¾|が進 frTる疾巒、または KD R(Z«6e¾の異常に起因する疾崈、の治纏で ある。
本発明の第 10 < i 上言 リゴヌクレオチドまた {让言 a¾体を械成分とする、 異常な 血管渐生により が進行する疾害、または KD Rの ff$giStの異常に起因する疾患の で ある。
本発明の第 11 ( Mi 上記蛋白 K¾た ί!±記 DNAを用レ、ることを とする、 KDRの 質のスクリーニング法である。 以下、 本発明を詳細に説明する。
[1] 本発明の DNAの «
本発明の蛋白質 の cDNAは、 プリッド （twchhy rid) 法により するこ と力 sできる。
ッ一ハイプリッド法としては、 例えば、 賺ッ一 ^ブリッド法 〔S.Fieldsら； Nature, Q 245 (1989)〕 をあげることができる。
騰ツー ^ブリッド法は、 DNA ドメインと転 匕ドメインが別々に するよう な酵母の転 Η子、 例えば GAL4を利用して目的蛋白質と複^:を形成できる蛋白質およ tH:
Figure imgf000009_0001
まず、 GAL4の 2つのドメインとの 蛋白質をそれぞれ 発現しうるようなべクタ一、 即ち、 目 白質 X (本発明 ί いては、 KDRの細納ドメイ ン） を DNA ¾^ドメイン (GAL ドメイン） と 蛋白 (^で発現させるベクタ一と、 蛋白質 ' （本発明にぉレ、ては cDNAライブラリ一中の各 cDNAがコードする蛋白 S) を転雜 ffi匕ドメィン (GAL4 S14fヒドメイン） との ΐ ^蛋白 (^で発現させるべクターの両者で酵母を 形 ¾ί云換すると、 蛋白質 Xと蛋白質 Υカ湘互作用して複^本を形成した酵母クローンは、 転写 匕ドメインが DNAのプロモータ ~¾分に^する形となって転写カ¾¾{匕され、 リポ一タ ~¾ 力 現する。 そして、 リポータ HI 現を鍵として、 糸 内ドメインと相互 作用する蛋白質の cDNA力;含まれている形 体をスクリ一ニングし、 形 ®¾換体からブラ スミドを^ ることにより目的とする cDNAをクローン itfる。
以下、 上言 法による本発明の蛋白質 の cDNAのクローニングを具^]に説明する。
(1) DNA ドメインと KDR 鹏内ドメインとの 蛋白発現プラスミドの
(1-1)糸 内ドメィン½¾ KDR cDNAの讓
糸 内ドメィン¾ ^む KDR cDNAの讓は、
(i) KDRの cDNA ¾r^t ^®^体 (ATCC740931, ATCC40975) 力も 法により cDNAを 含むプラスミド DNAを »する、
(ii) RT(reverse txanscription)-PCR [MJMcPhersonら； PCR2, A practical ½proach， Oxford University Press (1995)〕 により KDRの DNAを ± ^畐する、
(iii) cDNAライブラリ一から KDRcDNAクローンを^ f る、 のレ、ずれかにより行うことがで きる。
(ii)による は、 まず、 KDR力 現している «あるいはネ鹏、 例えばヒト月 ゝら全 RNAを麵する。 全 E Aを蒸する方法としては、 チォシァ グァニジン一トリフルォロ g^tシゥム法 〔H.Okayamaら； Methods inEn2ymologyJ ，3ひ 987)〕 、 ¾¾チオシアン 酸グァニジン.フエノール.クロ口ホルム （AGPC) 法 〔P.Chomczynski andN.Sacchi； Analytical Biochemista , J£2, 156 (1987)] 等力'挙げられる。 この全 RNAを用レヽて
J.oambrookり； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), EM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology Supplement 〜 38， John Wiley & Sons (1987-1997)、 DJVLGlover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^proach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に言凍の方法で の を行レ、、 RNA中の mENAを cDNAに変換する。 ま た Sft、には、 Superscript Preamplification System 〔ライフテクノ口シース (Life
Tfechnologies) 社 $S 等のキットを用いてもよい。 この cDNAを,にして、 KDRの cDNA の に基づいたブライマ一を用いて PCR MJMcPhersonら； PC¾ A practical Approach, Oxford University Pi¾ss (1991)] を行レ、、 KDRの cDNA断片を増幅する： また、 以下に述べる cDNAライブラリ一がある はライブラリ一 DNAを,にしてもょレ \ (iii) による^は、 まず、 （ii)と [^にして KDRカ 現している «あるい ίお m ^ら全 RNAを纏し、 全 RNAカゝらポリ (A)+ RNAとして mRNAを讀する。 謹去としては、 ォ リゴ (dT)セルロースを用いる方法 [J.Sambrookら； Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 等力 げられる。 あるいは、 Fast Track mRNA Isolation Kit 〔インビトロジェン （Invitrogen) 社 、 Quick Prep mENA Purification Kit 〔ファノレマシア （Pharmacia) 社劉 等のキットを 用レ、て から赚 mENAを譲することもできる。 この mENAを cDNAに変換し、 適当なべクター〖 且み)^、 宿 田胞に導入することにより cDNAライブラリ一をィ樓する。 具励な cDNAライブラリ ~ 去としては、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition, Com spring Harbor Laboratory Press (1989)、
EM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38， John Wiley & Sons (1987-1997)、 D JVLGlover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に言 Ξ¾された； ¾去、 あ るレヽは TfJSSのキット、 ^ijえは' Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (ライフ.テクノロ^ズ謂 や ZAP^cDNA Synthesis Kit 〔ストラタジーン
(Staratagene)a ] を用いる方縛が挙げられる。
cDNAライブラリ一を^ Tるためのクローニングべクタ一としては、 M K12株中で自 ¾S できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミドベクタ一等レ、ずれでも できる。 具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン ¾ 、 Strategies, 5, 58 (1992)] 、 pBluescriptn SK (+) [NucleicAcids Research, 12, 9494 (1989)] 、 Lambda ZAP Π (ストラタジーン卞 、 え gtlO、 gtll [DNA Cloning, APracticalApproach, 1, 49 (1985)] 、 XTViplEx (クローンテ ック鶴 、 XExCeU (ファノ!^シァ誦 、 pT7T318U (ファノ シァ鶴 、 pcD2
(H.Okayama and RBerg； MoL Cell. Biol., 3， 280 (1983)〕 等を挙げることができる c 宿 «物としては、 大腸菌 Escherichia coliに属する微牛物であれば 、ずれも用レ、るこ^カ できる： 具体的には、 Escherichia mli XLl-Blue證 F 〔ストラタジーンぉ 、 Strategies, 5, 81 (1992)〕 、 Escherichia coH CeOO [R Appleyard； Genetics, 22, 440 (1954)] 、
Es herichia mli Y1088 〔RAA'oung and R.W.Davis ; Science, 222, 778ひ 983)] 、 Escherichia O)liYl090 [RAYoung and RW.Davis； Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia ml丽 522
CJAGough and N.E.Murray； J. Mol. Biol., Ιββ, 1 (1983)] 、 Escherichia m]j K802 1
[W.B.Wood ； J. Mol. BioLOe, 118 (1966)] および Escherichia mli JM105 [L.JJ¾eha- Krantz； Gene, 38， 275 (1985)〕 等が用いられる。
あるいは、 クロ一ンテックネ の βの cDNAライブラリ一を購入してもよレ、： i:のよ うに讓した cDNAライブラリ一に対してコロニーノ^ブリダイゼーションある！/、はプラーク ノ ^ブリタ ゼ——ンョン [J.aambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory ivlanual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 FJMFrederickら； Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、 D.M.Glover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^proach, Second Edition, Oxford University Press (1995)] を行うことより KDRの cDNAクローンを得ることができる。 プロ —ブとしては、 DNA合 βによりィ匕学合成した KDR cDNAの" ^の ^をもつォリゴヌ クレオチド^ (ii) 示した RT-PCRにより増幅した KDRの cDNA断片を、 32P等で した ものを用いることができる。
ひ- 2) DNA ドメインとの 蛋白発現ブラスミドの »
(1-1)で «した KDRcDNAを組み込む "Sil^蛋白発 べクターとしては、 »
Sacoharomvffis visiae 能であり■ 適当な形質 «マーカ一遺 、 例えば TRP1、 LEU2等のァミノ^^遺 をもち、 »で発現するプロモータ Uえはブルコーノ ヒドロゲ^-ゼ (ADH) プロモーターの で、 GAL 等の DNA ドメインを発現でき るようなベクターである。 この^、 KDRの cDNA挿入のため、 DNA結合ドメインの C末側 に相当する部分に適当な制 サイトがあり、 また、 ベクター DNAの fflM等の w±、 -m 菌でも でき、 了ンピシリン耐 Ιίϋ^ϊ1等の;^悬菌での形質 マ—力一をもつものが望ま しい。 このようなベクタ一としては pGBT9 (クローンテックネ±) 、 pASl 〔T.Durfeeら； Genes & Development,?, 555ひ 993)〕 、 pAS2-l (クローンテック±) 等が挙げられる。
(1-1) で讓した KDR cDNAの糸 内ドメィンの断片を戦隹し、 DNA結合ドメインの。末 側の制 サイ卜に蛋白のフ ムが合うように挿入する。 KDRcDNAの細^]ドメィンの 断片は、 適当な制 例えば Asp8C)6 (7«iに據する EamHIサイトで切り出したり、 細 胞内ドメィンのみ ¾τ¾Φ畐するような酉 IJのプライマ一を用レ、た PCR [MJMcPhersonら； PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)〕 を行うことにより戦 t"f"る。 (2) 耘 ¾14|匕ドメインとの 蛋白発 ecDNAライブラリ一の
転 D4fヒドメインとの 蛋白発 ¾ cDNAラィブラリ一を するため クターとし ては、 酵母 Saccha画 vcfis隱 visiae 製可能であり 適当 マーカ H»5÷、 例 えば RP1、 LEU2等の のアミノ^ 等をもち、 gfSで発現するプロモーター、 例えば ADHプロモーターの柳 ίΡΤで、 GAL4等の転^ ¾14ί匕ドメィンを発現できるようなべ クターである。 この^、 転 ¥¾ttf匕ドメィンの C末側に相当する部分に適当 サイ トがあり、 また、 ベクター DNAの;^等の «±、 大 β昜菌でも でき、 アンピシリン ftH4» 等の刘昜菌で ^マーカーをもつもの力 s望ましレ、。 このようなべクターとしては pGAD 〔C.T,Chienら； Proc NatLAca ScL USASa SSTS iiggiW 、 pGAD424 (クローン テック tt) や pACT 〔T.Durfeeら； Genes & Development, 2， 555 (1993)〕 、 pACT2-l (クロ
—ンテックネ 等カ举げられる。
KDR (D mドメインと相互作用する蛋白質は KDRと同じfflSM職で発現していると考 えられる。 従って (1-1) と! ^にして、 KDR力^ §現していると考えられる »^鹏から cDNAを譲し、 前述の!^蛋白発画 クターの転 f¾ttf匕ドメィンの C末側の制 サイトに挿入することにより、 cDNAライブラリ一をィ懐する。 この:^、 cDNAと転^ Stt 化ドメィンの方向およびフームがあってレ、た # ^には、 転 ヒドメインと cDNAがコー ドする蛋白質との齢蛋白カ 現することになる。 あるレ、¾S#Sッ一ノ^ブリッド法に棚で きる趙のライブラリー、 例えば MATCHMAKER cDNAライブラリー （クローンテック卒±) を利用することもできる。
(3) 麵ツーハイブリッド法による cDNAのスクリ一二ング
(1)およ ΐ (2) で脑した KDR (^贿内ドメイン St^蛋白発現プラスミドと 蛋白発画 cDNAライブラリーを導入する隨としては、 SaccharomyoRS cerevisiaeに属する酵母であつ て、 ίのッ一ノ^ Tブリット、用のプラスミドを導入でき、 さらに （i)導入するプラスミド 質 繊マ一カー 、 およびツーノ ブリッド法の DNA ^ドメィンおよ 生ドメィ ンに用レ、た転写因子の遺ィ 力次^変異により発現できなレ、こと、 （ϋ) 適当なリポ一タ ~¾ のプロモータ ϋに、 ツーハイプリッド法で用いた DNA¾^ドメインカ¾^1^寻るよう な ¾¾ |〗力 入してあることが必要である。 この^のリポ一タ ~¾ としては、 相互作 用により転写が開始された:^に検出力;容易なもの、 例えば HIS3等のァミノ ^^^遺
(この 、 ッ一ノ^ブリツド用のブラスミド ®f激マ一カーとは異なるものを用いる） 、 昜菌の /3ガラク
Figure imgf000013_0001
等が用いられる。 例 ば Sac hammvffis rRvHsiae CG1945株 （クローンテック卞±) 、 Y153株 [TDurfeeら； Genes & Development. I, 555 (1993)] 、 CGY1::171株 〔G.Gill and M tashne ; Celt ^L, 121 (1987)〕 等があげられる。 この宿 »Sに (1)およ t (2) でィ樓した KDRの糸赚内ドメイン 蛋白発現プラスミドと 1 ^蛋白発 ¾ cDNAライブラリ一の両方を導入し、 リポータ Hl^c ¾現を鍵にして KDRの; ilSS内ドメインと する蛋白質をコ一ドする cDNAを^ 体を繊する。 例えば、 HIS3遺 をリボータ "¾β÷とした は、 Hisを含まない最小培地で咅養したと きに生育するコ口ニーを、 lacZ遺 をリポーターとした:^は X-galを作用さ く ¾feす るコロニーを顧する。
顧した形 体コロニー力 S4 ^蛋白発 cDNAブラスミドを^ f る。 コロニーに は KDR (^田胞内ドメイン 蛋白発現プラスミドと 蛋白発觀 cDNAプラスミドの 2種 類のプラスミドが含まれているので、 方法としてはコロニーからプラスミド^ ii DNAを職 し、 昜菌を形 し、 蛋白 ¾ cDNAプラスミドの方のマーカ を基に形質 体を ¾Rすることにより、 cDNAクローンを;^し、 ¾ した 3昜菌からプラスミド DNA を ¥ ""る 〔D.Rickwood and B.D.Hames； DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Pressひ 995)、 C.-T.Chienら； Proc. Natl. Acad. ScL, S8, 9578ひ 991)〕 。
(4) cDNAク口ーン (^晰
(4-1) KDRの細胞内ドメインとの ^の検証
«した 蛋白発 cDNAクローンと KDRの糸細包内ドメィン 蛋白発現プラスミド の f¾ を宿 «母に導入し、 リボータ ~¾ (7 ¾現を 、することにより、 10)11の細»ド メインとの;^を できる。
また、 KDRの糸！^内ドメィンの DNA ドメインとの齢蛋白発現に用レ、たべクターに、 KDRの糸 MS内ドメィン (^弋わりに別 を挿入した齢蛋白発現ブラスミドを ί樓し、 こ のプラスミドと,した 蛋白発 cDNAク口一ンの両者を宿 に導入したときには リ
Figure imgf000014_0001
した cDNAがコードする蛋白 が KDRの細胞内ドメインと特 ¾½に¾ ^することを ¾|忍できる。
Figure imgf000014_0002
得られた cDNAクローンをそのまま、 あるレ、は cDNA部分を適当な IW¾によって切り出 して pUCU8等 (¾1当なクローニングべクターにサブクローニングした後、 通常用レ、られる塩 SIE^ 浙方法、 例えば Sangerらのジデォキシ法 [Prcc. NatL Acad. Sd. \JS. 24, 5463 (1977)] あるいはパーキン'ェノレマー (Perkin Elmer) 社やファノレマシア社等の DNAシーク ェ 1 ^を用レ、ることにより決定する。
cDNAの ^が新規な酉 リかどう Wま、 BLAST等の相同^^プログラムを用レ、て、 GenBank, EMBLおよび DDBJ等の;^ 1 一タベースを; t ^Tることにより、 データべ —ス中の既 ^遺 の; ^ ]と ると考えられるような明らかな相同性を^ f^S己 歹リがなレヽことにより ¾I、できる。
m:のようにして得られた、 KDRの糸 ¾内ドメインと^する新規な蛋白質をコ一ドする cDNAとして、 例えば、 酉 Ξ ^潘号 5または 6 を有する cDNAクローンをあげる ことができる。
以下、 KDRの細胞内ドメインと^する蛋白質をコードする DNAを KDRリセプタ 蛋白質 DNAと呼ぶこともある。
(4-3) ^gcDNAの譲
(4-2) の;^ 晰ぉよび、 後記 [4]のノーザンブロットノ ブリダィゼ一シヨンで得ら れた mE A ¾さ ゝら、 (3) で得られた本発明の蛋白質 の cDNAが では ないと予測される ^は、 以下の方法で本発明の蛋白質遺 cDNAを »することが できる。
(4-3-1) cDNAライブラリ一のスクリ一二ング
(2) で IHi ^した 蛋白発 ¾の cDNAライブラリー、 あるい ii*発明の蛋白質カ 現して レ、ると考えられる糸職また (お から (1-1) と赚にし XI ^した cDNAライブラリーに対し て、 （3) で得られた cDNA全体あるいは ~ ^をプローブとして (1-1) の雄のようにコロニーノヽ イブリダイゼーシヨンやプラークハイブリダィゼ一シヨンを行レヽ、 ポ、: ^イブクローンの中か ら本発明の蛋白質遺^"の cDNA^Sと考えられる長さの cDNAクローンを蒙する。 得ら れた cDNAクローンにつレ、て (Φ2) と曜にして ifflS^Jを決定することにより、 本発明の蛋 白質遺 β÷の cDNA全体の iffiE ^および、 本発明の蛋白質全体のァミノ醚 を明ら力 4こす ることができる。
本発明の蛋白質のァミノ翻 ϋが新規であることは、 FASTA、 Framesearch等の相同隨 索プログラムを用いて、 GenPept、 PIR、 Swiss-Prot等のアミノ翻 データベースを検^ ることにより、 データべ一ス中の既 ^ァミノ麵 〗と一 grTると考えられるような明らかな 相同 を ァミノ麵 リがなレ、ことにより ¾mできる = このようにして得られた^ ScDNAクローンとして、 例えば、 酉 播号 1、 2および 2 7力 ら適 る酉 潘号 ί ¾«ffiE ^を有する cDNAクローンをあげることができる。
(4-3-2) RACE (rapid amplification ofcDNA ends)
本発明の蛋白質カ 現してレヽると考えられる糸職あるレ、はネ から (1-1) と同様にして cDNA を讓し、 その cDNAの両端にアダプタ一を付加し、 このアダプタ—の と (3)で得られ た cDNAクローンの塩 ¾¾P.列に某づレ、たプライマーで PCRを行う 5'-RACEおよび 3'-RACE
CMAFrohmanら； Proc. Nad. Acad. ScL USA, S5, 8998 (1988)] により、 （3)でクローン化さ れた cDNAよりも 5'端則および 3'端則の cDNAを得ることができる。 得られた cDNAの驢 酉 IJを (Φ2) と にして決定し、 この; M IJをもとにして、 得られた cDNAと (3)で得られ た cDNAクローンとをつなぎあ ることにより^ と考えられる本発明の蛋白質遺 の cDNAを ¾ί等することもできる。
また、 RJのようにして麟された ^ScDNAの ^が明らカ^なつた後は、 該 cDNA の; fflE ^に基づレ、たプライマーを ¾し、 本発明の蛋白質力 現してレ、ると考えられる β あるレ、はネ から (1-1) と [^にし した cDNAあるレ、は cDNAライブラリ一 とし て、 PCR [MJMcPhersonら； PCR^ApracticalApproac Oxford University Press (1991)〕 を行うことにより目的とする本発明の蛋白質をコ一ドする DNAを聯导することができる。 また決定された DNAの; Μ ϋに基づレヽて、 DNA合膽で化学合财ることによって目的 とする本発明の蛋白質をコードする DNAを讓することもできる。
。^合«としては、 チ《スフアイト法を利用した島津製作所 の DNA合 Λ フォ スフオアミダイト法を利用したパ一キン 'エノ！^一 tt^ DNA合 )¾¾mo d e 1 3 9 2等をあ げることができる。
該 DNAおよび DNA断片を用レ、て、 維あるレ、は DNA合纖により、 本発明の DNAの一 部の酉 IJを有するアン «ンス ·オリゴヌクレオチド、 センス 'オリゴヌクレオチド等のオリ ゴヌクレオチドを I ^することができる。
該ォリゴヌクレオチドとしては、 上記 DNAの有する 〗中の纖した 1 0〜5 0¾¾と 同じ酉 を有する DNAまたは該 DNAと な酉 リを有する DNAをあげることができ、 具 鹏には、 酉 潘号 1、 2および 2 7力ゝら選 る酉 噃号で表される iffiE^j中 した 1 0〜5 0塩某^同じ西?.列》有する DNAまたは該 DNAと W½な ^を有する DNAをあげ ることができる： W /31238
該ォリゴヌクレオチド ίま本発明のォリゴヌクレオチドである。
更に、 これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとしてあげること ができる。 言 ^導体 DNAとしては、 DNA中のリン酸ジエステノ ^がホスフォ口チォェ一ト ^に変換された誘導体 DNA、 DNA中のリン酸ジエステノ^^が N 3 ' — P 5 ' ホスフォア ミデート に変換された誘導体 DNA、 DNA中のリボースとリ ジエステノ がぺプチ ド に変換された誘導体 DNA、 DNA中のゥラシルが C— 5プロピニルゥラシルで纖 された誘導体 DNA、 DNA中のゥラシルが C_ 5チアゾ一ルゥラシルで纖された誘導体 DNA、 DNA中のシトシンが C— 5プロピニルシトシンで された誘導体 DNA、 DNA中の シトシンがフェノキサジン シトシン （phenoxazine-modified cytosine)で^^された誘導体 DNA、 DNA中のリボースが 2 ' — O—プロピルリボースで ¾された誘導体 DNA、 あるいは DNA中のリボースが 2 ' —メトキシエトキシリボースで された誘導体 DNA等をあげるこ とができる 学， 1β, 1463 (1997)〕 。
[2]本発明の蛋白質の ¾
上記 [1〗に言 Ξ¾の 去により制辱し:^:発明の DNAを宿主細胞中で発現させるために、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)や Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38，（1987- 1997)等に言識された方法を用レヽることができる。
即ち、 本発明の DNAを適当な発現べクターのプロモータ一下流に挿入し 纖えべクタ一 を作成し、 それを宿 ϋ鹏に導入することにより、 本発明の蛋白質を発現する形 激体を得 ることができる。
宿 としては、 m. 麵、 麵鹏、 昆 ^iraa等、 目的とする遺 βτ·を発現できるも のであればいずれも用いることができる。
発現べクターとしては、 上記宿 におレ、て自 可能なレ、しは 体中^)艇が可 能で、 本発明の DNAを転写できる位置にプロモーター 有してレヽるものが用いられる。
糸鹏等の赚生物を宿 贿として用いる：^は、 本発明の蛋白質遺 発現べクタ一 ί源 核生物中で自立纏可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム; i^fE 本発明の DNA、 w-m & より構成され 蕭ぇベクタ一であることが好ましい： プロモーターを趟 ίρ-τ る遺 含まれてレ、てもょレ、
発現べクタ—としては、 例えば、 ρΚΚ233-2 (フアルマシア ft) 、 pSE280 (インビトロジェ ン卒±) 、 pGEMEX-l 〔プロメガ (Promega)tt] 、 pQE-8 (キアゲン (QIAGEN)tt) 、 pKYPIO
(糊昭 58^110600) 、 pKYP200 [T.Nishiら； Agricultural Biological Chemistry, 4S, 669 (1984)] 、 pLSAl 〔HMiyajiら； Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕 、 pGELl [S.Sekine ら； Proc. Natl. Acad. Sd. JSA, S2, 4306ひ 985)〕 、 pBluescript Π SK (-) (ストラタジーン ft) 、 pGEX (ファノ シァ ¾h) 、 pET-3 (ノバジヱン ¾) 等を挙げることができる。
プロモータ一としては、 昜菌等の宿 中で発現できるものであ ヽかなるものでも よい。 例えば、 プロモータ一 （P^rp) 、 lac_プロモーター、 PLプロモータ一、 PRプロモ 一ター、 PSEプロモーター、 T7プロモーター等の、 昜菌ゃファー^に由来するプロモ一 ター、 S P O lプロモーター、 S P 0 2プロモーター、 pen Pプロモーター等をあげることがで きる。 また を 2つ 1 ^させたプロモーター （P^rp X S ) 、 tailプロモーター、 lacT7プロ モータ一、 let lプロモーターのように人為的に設言†¾変されたプロモーター等も用いることが できる。
リボソーム,^ g ijとしては、 昜菌等の宿 田胞中で発現できるものであればいかなるも のでもよレヽが、 シャイン一ダルガノ （Shine-Dalgarno) 酉 E^Jと開始コドンとの間を適当な β (例えば 6〜1 8繊 に讓したプラスミツドを用いること力;好ましい。
本発明の§mえべクタ一 ί レ、ては、 本発明の DNAの発現には転写 msia ^は必ずしも必要 ではなレヽが、 «ϋ¾ の srに転写 «s ijを配 ること力 子ましレ、。
原孩生物としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属、 シユードモナス属、 バチノレス属等に属する 物、 例えば、 Escherichia mliXLl-Blu Escherichia coli XL2-B1UR. Escherichia coli DHL Escherichia coli MCIOOO. Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485、 Esdierichia coli JM109、 Escherichia coli HBim . Escherichia ooli No.49. Escherichia coli W3110. Escherichia coli NY49、 Bacillus s b ilis. Bacillus amvloliquefadnRs. Brevibacterium ammoniagenes. Brevibacterium
immariophilmn ATCC14068, Brevihart^r】m saccharolvticum ATCC14066- Corynebacterium glutamicum ATCC14067 、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Cnrvnpbartfirium glntami im ATCm.S0.S9. Corynebacterium acetoaridophilum
ATCC13870、 Micmhac ^rium ammoniaphilum ATCC1 等を挙げることができる 糸 えべクタ一の導入; W去としては、 上記宿 細胞へ DNAを導入する:^去であれば 、ずれ も用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 〔S. Cohenら； Proc. Natl. Acad ScL US^ £2, 2110 (1972)] 、 ァロトプラスト法 （糊昭 63-2483942) 、 エレク トロポ "ション法、 または Gene, II, 107 (1982や Molecular & General Genetics, J£S, Ulひ 979) 等を挙げることができる。
隨菌株を宿 ±鹏として用いる には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13
(ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 PHS19、 pHSl5等を 用いることができる。
プロモーターとしては、 »菌株中で発現できるものであ ま 、ずれのものを用レヽてもよく、 例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロ ΐ~タ一、 gal lプロモーター、 gal lOプロモーター、 ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MFa l プロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
S^S困株としては、 Saocharomyces cerevisae. Schizasaccharomyces pomhe,
Kl yveromyces lactis、 Trichosporon ullulans. Sdiwanniomyces aUuvius あけ。こと力 できる。
繊えべクターの導入方法としては、賺に DNAを導入する方法であれば 、ずれも用レ、る こと力でき、 例えば、 エレクトロポ I ^シヨン法 (DJVl.BeckerandL.Guarente； Methods. Enzymol., 124, 182 (1990)] 、 スフエロプラスト法 〔D.Shortleら； Proc. NatLAcai ScL USA SI.4889 (1984)〕 、 赚リチウム法 〔H. Itoら； Journal of Bacteriology 153， 163 (1983)〕 、 Proc. Natl. Acad. Sci. US 15, 1929 (1978)等をあげることができる。
田胞を宿主として用レ、る には、 発現ベクターとして、 例えば、 pAGE107 〔特開平 3- 22979 ; H. Miyajiら、 Cytotechnology, 3, 133，（1990)〕 、 pAS3-3 (欄平 2-227075) 、 pCDM8 [B. Seed； Nature, 229, 840, (1987)] 、 pcDNAI/Amp (インビトロジェンネ通 、 pREP4 (インビトロジェン¾^¾ 、 pAGE103 〔T Mizukamiら； Journal of Biochemistry, 101， 1307 (1987)] 等が用レ、られる。
ァロモーターとしては、 ft«棚包中で発現できるものであ ま'いずれも用いることができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺 β ^のプロモータ一、 SV40のネ應プロモータ一あるレ、はメタロチォネィンのブ口モーター、 レトロウィルスのプロモ 一タ一、 ヒートショックプロモータ一、 S Rひブロモータ一等をあげることができる： また、 ヒト CMVの IE遺 のェンハン ^をプロモーターと共に用いてもよレ\
田胞としては、 ヒト 鹏である ルバ (Namalwa) 糸瑚包、 サルの糸 MSである COS «、 チャイニーズ'ハムスターの である CHO糸!^、 HBT5637 昭 63-299) 等をあ げることができる。
繊えべクタ一の導入方法としては、 睡糸嶋に DNAを導入する方法であ ίΐΐ、ずれも用レ、 ることができ、 例えば、 エレクトロポ シヨン法 CHMyajiら； Cytotechnology，3, 133 (1990)] 、 リ «7ルシゥム法 （欄平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法 [P.LFelgnerら； Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4， 7413ひ 987)〕 、 Virology, 52, 456 (1973)に言 £¾の¾？縛をあげ ることができる。
昆^！^を宿主として用いる:^には、 例えば D.R O'Reillyら； Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, (1987-1997)、 VALuckow and
M.D.Summers； Bio Ibchnology S, 47 (1988)等に された方法によって、 蛋白質を発現する ことができる。
即ち、 «;t¾i5i導入べクターおよびバキュ口ウィルスを昆 闹包に^^入して昆^ 培養上清中:¾§mえウイノレスを得た後、 さら えウィルスを昆 させ、 蛋白質 を発現させることができる。
言 法 ( いて用いられる遺 導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacHI (ともにインビトロジェンネ» 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 昆虫 ίΟ^Τるウィルスであるアウトグラフ ァ 'カリフォルニ力 'ヌクレア一 ·ポリへドロシス ·ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。 昆虫糸 しては. Spodoptera frugiperda の嶋齙である Sf9 、 S£21 〔D.R O myら； Baculovirus Expression Vectors, A
Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New ork (1992)] 、 nchoplusia の である High 5 (インビトロジヱン 等を用いることができる。
糸 えウィルスを!^するための、 昆 細胞への上言 asm^fe 導入べクターと上言 くキ ュロウイノレスの ^入方法としては、 例えば、 リ ルシゥム法 平 2-227075) 、 リポ フエクショ >Ϋ去 [P.L.Felgnerら； Proc. Natl. Acad. Sd. USA M, 7413 (1987)] 等をあげるこ とができる。
遺 O¾¾ ^去としては、 に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manua Second Edition (1989)に言 E¾されてレ、る方 に準じて、 分^ S、 蛋白質発現等を行う W / 1 3
ことができる。
, 隱、鹏または昆 *j齙により発現さ wこ には、 糖あるい 付加された蛋 白質を得ること力できる。
m:のようにして得られる形 mia 体を培地 咅養し、 培 «ti中 発明の蛋白質を «蓄 積させ、 咅難カゝら ることにより、 本発明の蛋白質を ることができる。
本発明 ^体を培地 咅養する方法は、 宿主の培養に用レヽられる通常の方法に従って 行うことができる。
驄等の原核生物あるレヽ iigfWの難生物を宿主として得られた形 体を培養する 培地としては、 言姓物が資化 L る炭颜、 «¾、 » ^等 有し、 形 体の培養 を¾«に行える培地であ ま ^ t咅地、 合 咅地のレ、ずれを用レ、てもよレ、。
炭 ¾¾f、としては、 言 物が資化し得るものであればよく、 グノレコース、 フラクトース、 スク ロース、 これら ½有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプ^] πτΚ^ί^の^ Wt^)、 赚、 プロピオ:/^の ¾«、 エタノール、 プロパノーノ のァノレコーノ 等が用を用いることが できる。
^^、としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 赚アンモニゥム、 アンモニゥム、 リ >mアンモニゥム等の^ «もしくは アンモニゥ Λ¾、 そ Of也 (7 ^¾¾化^)、 並 びに、 ペプトン、 肉エキス、 隨エキス、 コーンスチープリカー、 カゼィ ^¾1^^勸、 粕および細助 ΠτΚ 漱、 各 菌体、 およ の消ィ を用いることができる。
としては、 リ ^—カリウム、 リ ¾二カリウム、 リ ^グネシゥム、 »^ グネシゥム、 塩化ナトリウム、 硫^^^、 硫酸マンガン、 W、 炭酸カルシウム等を用い ることができる。
培養は、 通^^咅養また ¾»¾^#咅*^の好^]剁牛下で行う。 培養 は 15〜 40°Cがよく、 培養 0 ^は、 通常 16〜96 B#^である。 ±咅養中 pHは 3.0~9.0に る。 pHの 雄は、 議または機の酸、 アルカリ赚、 尿素、 ルシゥム、 アンモニア等を用いて 行う。
また、 培養中 要に応じて、 ァンピシリン トラサイクリン等の 物質を培地に'励口し てもよいつ
ァロモータ—として誘導性のァロモータ一を用レ、た発現べクターで形 換しだ 物を培 養するときには、 要に応じてインデュー を培地に '励□してもよい： 例えば、 ia ァロ ΐ~ ターを用レヽた発現べクタ一で形 Κΐ ^した 物を培養するときにはィソブロピル一 β—D— チォガラクトピラノシド等を、 ブロモータ一を用レヽた発現ベクターで形 S»した敝物を 培養するときにはィンドールァクリノ を培地に してもよい。
議田胞を宿主として得られた形 mi^体を培養する培地としては、 ""^に細されている
RPMI1640培地 [The Journal of the American Medical Association,I22, 519 (1967)] 、 Ea^e の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)] 、 DMEM培地 [Virology, S, 396 (1959)] 、 199培 地 〔Prooeeding of the Society for the Biological Medicine, 23, 1ひ 950)〕 またはこれら培地に牛 胎 ¾k?靜を'励口した培地等を用レヽることができる。
培養は、 通常 pH6〜8、 30〜40。C、 5 %C02據下等の^ (牛下で：！〜 7日 う。
また、 培養中必要に応じて、 力 イシン、 シリン等 霞を培地に励 Dしてもよ レ、。
昆 ϋ田胞を宿主として得られた形 体を培養する培地としては、 ~ ^に謂されている TNM-FH培地 〔ファーミンジェン （Pharmingen) 謂 、 Sf-900II SFM培地 （ライフ .テ クノロジーズ ¾f¾ 、 ExCell400, ExCeU405 〔いずれも JRHバイ: "ィエン^ "ズ （JRH Biosciences) ¾ B 、 Grace's Insect Medium [Nature, 125, 788 (1962)] 等を用いることがで きる。
培養、 通常 pH6〜7、 25〜30。C等の餅下で 1〜 5日 う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の 物質を培地に'励 Qしてもよい。
上言 sia^体の培鎌から、 上言 により発現させた蛋白質を 製するためには、 通常の瞧の輔、 精嶽を用いればよい。
例えば、 本発明の蛋白質が、 糸鹏内に翻狱態で発現した には、 培養終了後、 asを遠 により回収し水系 JS»蔽にけん 、 超音波破 ¾ 、 フレンチプレス、 マントンガウリ ンホモゲナイ→ ~"、 ダイノミノ により糸 ¾を破砕し、 無糸 出液を得る。 該無細繊出液 を遠' ることにより得られた上清から、 通常の赚の輕膽去、 即ち、 出法、 硫安等による塩析法、 法、 棚讓による ¾ ^法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セ ファロース、 DIAIONHPA-75 (≡ it ± ) 等レジンを用いた!^ Tオン クロマトダラ フィ一法、 S-Sepharose FF (ファノ^シァネ 等のレジンを用いた^ Tオン クロマトグ ラフィ一法、 ブチノレ ファロ一ス、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた ¾τ性クロマト グラフィ一法、 篩を用レ、たゲルろ過法、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法、 クロマト フオーカシング法、 等鬣 ¾ 泳嶋の 泳 Kr&^の雜を 虫あるレ、fぉ且み合; tて用レ、、 精 品を得ることができる。
また、 該蛋白質が糸嶋内に 体 城して発現した ¾ ^は、 [^に を回収後破砕し、 遠' 隹を行うことにより得られた 分より、 通常の方法により該蛋白質を回収後、 該蛋 白質の 体を蛋白 ΚΜ¾ϋで可溶ィ る。 言^!溶 夜を、 蛋白難、醜を含まないあるいは 蛋白觀隨の献が蛋白質が変 しない離に希薄な鎌に機、 あるい ί«ίし、 該蛋白 質を正常な立 iW に構成さ ¾こ後、 ±12と ! I^^t®去により精^！品を得ることがで きる。
本発明の蛋白質あるレヽはその の誘導体が糸 β¾こ分泌された ¾ ^には、 培養上清 に該蛋白質あるレヽはその謹付力 0^の誘導体を回収することができる。 即ち、言 咅難を上 記と ^の 去により鍵することにより可溶圏分を取得し、 言^«14 1分か ら、 上記と [^の を用いることにより、 品を得ることができる。
また、 本発明の蛋白質は、 Fmoc法 （フルォレニノレメチルォキシカルボニル法） 、 tBoc法 ( t—ブチルォキシカルボ二ノレ法） 等 ( f匕学合戯によっても i ることができる。 また、 ァドバンスト ·ケムテック （Advanced ChemTfech) 社、 ノ一キン ·エノ! ^一社、 ファノ シァ 社、 プロティン.テクノロジー .ィンストウルメント （Protein Tfechnology Instrument) 社、 シ ¾セル.ベガ （Synthecell-Vega) 社、 パーセプティブ (PerSeptive) 社、 島'腹作ff ^の ぺプチド合細を禾拥し化学合 ることもできる。
[3]本発明の蛋白 ®¾I抗体の »
(1)ポリクローナル抗体の »
上記 [2】に言 の方法により制导した蛋白質 (^Sまたは部優片精鶴品 を 50〜 100 /gZ匹ほど、 ゥサギ、 ャギまたは 3〜20週令のラット、 マウスもしくはノヽムスターの皮下、 |» または β内に、 適当なアジュバント 〔例えば、 フロインドの完全アジュバント
(Complete Freund's Adjuvant) または、 水^ ίヒアルミニウムゲルと百日 «ワクチ 〕 と ともに投与する。
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜； 10回行う。 各投与後、 3〜7日目 に^ »薦より馳し、 言她清が艘に用レ、た赚と RJ、することを §1^5測定法 赚 髓測定法 （ELISA法） ：医学纖刊 1976 ^ E.Harlow and D.Lane： Antibodies-A W 99/31
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)] 等で ¾ ^、する。
滅に用いた ¾ 、に対し、 言她清が充分な抗体価を示したゥサギ、 ャギ、 マウス、 ラットま たはハムスターより血清を制尋し、 言她清より、 40〜50%颇 Πβアンモニゥムによる塩圻法、 カブリル俊 去、 DEAE—セファロースカラム、 プロテイン Α—カラムあるいはゲルろ過力 ラム等を用レヽたクロマト' ¾ ^の常法を用レヽて精 $¾ΐ体を することができる。
(2)モノク口—ナル抗体の讓
(2-職体 の讓
上 |¾1)ί レ、て、 無に用いた に対し、 その血清が +^な抗体価を示したラットを抗体 として る。
言紙体価を示したラットに ¾¾¾物質を最½¾与した後 3〜 7日目に、 3幢を摘出する。
言刻? I を ΜΕΜί咅地 (B7 m± )中で細断し、 ピ^ットでほぐし、 1， 200 r pm で 5 ^¾1' «した後、 上清を捨てる。
得られた 分の脾糸 をトリス一塩化ァンモニゥム Hit腋 (ρΗ7. 65) で:!〜 2分 間艇し赤«を した後、 ΜΕΜί咅地で 3回洗浄し、 得られた腌細胞を抗体 ¾¾鹏とし て用いる。
(2-2) Hffl«の譲
髓動 としては、 マウスまたはラットから取得した を する。 たとえば、 8- ァザグァニン ΗΦ ウス （BALB/c由来) ¾S B»P3-X63Ag8-Ul (以下、 P 3— U 1と略 [Curr.TbpicsMiciObiol.Immunol.,ai, 1 (1978)] 、 [Europ.J.Immunol.， 511ひ 976)] 、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 226, 269ひ 978)] 、 P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunol, 123, 1548(1979)] 、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256， 495ひ 975)] 等を用いることができる。 これ ら fflKは、 8—ァザグァニ 咅地 〔RPMI— 1640培地にグルタミン （1. 5mM) 、 2_メルカブトエタノ一ノレ （5X 10—5M) 、 ジェンタマイシン （l O gZml) およ 胎¾&清 (FCS) (CSL確、 10%) を加えた培地 （以下、 正常培地という） に、 さら に 8—ァザグァニン （15//gZml) を力 []えた培 ¾) で糸 tTる力;、 糸 の 3〜4日前 に正常培地で培養し、 I ^には言 ¾；田胞を 2 X 107個 R fflレ、る。
(2-3)ハイプリ ドーマの
(2-1)で制辱した抗体 ¾¾M包と (2-2)で取得した を ME i咅地または P B S (リン 酸ニナトリウム 1. 83g、 リ / カリウム 0. 21 g、 ：¾¾7. 65g、 蒸留水 1リット ノレ、 pH7. 2) でよく辭し、 糸 ffl«^、 抗体 :fl¾MS=5〜l 0： 1になる よう混合し、 1, 200 r pmで 5 ¾¾1'1 ^|した後、 上清を捨てる。
得られた 分の糸 をよくほぐし、 に、 辦しながら、 37°Cで、 108抗 体 豳あたり、 ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド （DM SO) 0. 7mlを混合した灘を 0. 2〜lml ¾¾)Πし、 更に：！〜 2分間毎に ΜΕΜί咅地 1〜 2 m 1を数回 '励する。
励啦、 MEMJ:咅地を加えて^ ft^5 Om 1になるように讓する。
を 900 r pmで 5^fB¾I'l «、 上清を捨てる。
得られた «画分の糸 ¾を、 ゆる 4こほぐした後、 メスピペットによる吸 、 吹出しで ゆる^^に HAT培地 〔正常培地にヒポキサンチン （10— 4M) 、 チミジン （1. 5 X 10"5 M) およひアミノプテリン （4X 10-7M) をカ卩えた培 ±ta 100ml中に » る。
言雄源夜を 96 咅養用プ!^卜に 100 1 Z穴ず 注し、 5%C02インキュベータ —中、 37 °Cで 7〜 14日『 咅養する。
培 «¾、 ±咅養上清の をとりァンチボディィズ [Antibodies, A Laboratoiy manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Chapterl4(1988)) 等に述べられてレ、る 測定法により、 老 ィ 啷 片ポリぺプチドに特異的に反応するノ 'ブリドーマ ¾する。
^^測定法の具 として、 以下の方法をあげることができる。
の際、 、に用いた本発明の蛋白質の ^または部 W^^品を適当なプ 卜に コ一トし、 ノ^ブリドーマ培養上清もしく の (2-4)で得られる ^^体を第一抗体として させ、 さらに第二抗体としてピオチン、 »、 化«»@あるい 謝匕^^で標 識した抗ラットイムノグロブリ 体を させた後に S ®に応じた を行なレ、、 本発 明の蛋白質に特勸に するものを本発明の蛋白質に るモノクローナル抗体を^ rる ノ^ブリドーマとして顧する。
該ノ プリドーマを用いて、 限界職法によりクローユングを 2 り返し 〔1回目は、 H T培地 （HAT培聯らァミノブテリンを除レヽた培 ¾) 、 2回目は、 正常培地を難する〕 、 安定して強レ^ [体価の認められたものを本発明の蛋白質に *Η "るモノクローナル抗体を るノ プリドーマ株として舰する。
(2-4)モノクローナル抗体の
アリスタン処理 〔2, 6, 10， 14ーテトラメチ ンタデカン （P r i s t a n e) 0. W 99/31238
5 m lを腹！^ ¾与し、 2週間 する〕 した 8〜 1 0週令のマウスまたはヌ一ドマウスに、
(2-3)で ¾mした本発明の蛋白質に るモノクローナル抗体を^ るノ ^プリドーマ糸嶋 5
〜20 X 1 06糸 匹を緩内に ai る。 1 0-2 1日間でソ プリドーマ ί»Κ癌ィは る。
匕したマウスカ 縣を撤し、 3, 0 0 0 r P mで 5分 して固形分を [^する。
得られた上清を、 4 0〜5 0% «^ァンモニゥムにょる塩析法、 カプリ ^法
Figure imgf000026_0001
、 D AE—セ ファロースカラム、 プロテイン A—カラムあるいはセル口ファイン GSL2000 (生化学ェ 土 ) を用いたカラムクロマト ¾ ^を用いて、 I g Gあるレ、は I gM 分 め、 モノクロ ーナノレ抗体として する。
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノ クローナル抗体タイピングキットを用レ、て行う。 蛋白質量は、 口一リー法あるレ、は 2 8 0 nm での吸 より算出する。
[4] 本発明の DNA、 蛋白 た ί¾ΐ体の利用
本発明の DNAは、 これをプローブとして用いて、 ヒト ヒト由来の糸«から [1〗（1-1) と (^にして抽出した RNAにつレ、てノ一ザンブロットノ ブリダイゼーションを行うことによ り、 その における本発明の蛋白質遺 の mE Aを検出あるレヽは定; frTることがで きる。 各種 (^職でその mRNA を赚することにより本発明の蛋白質の糸職発現分布 を知ることができる。
また、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 本発明の DNAの特異的プライマ一として用いて、 ヒト (¾§»>ヒト由 から [1] (1-1) と I ^にして抽出した RNAにつレヽて RT-PCRを行 うことによっても mRNAの検 ¾ϋ量を行うことができる。 本発明の DNAあるレ、 亥 DNAの~¾の；^ S IJと同じ;^ SS?i〗または相補的な^ ^ リを有するオリゴヌクレオチドは、 これをプローブとして用いて、 ヒト 片に対して in situハイプリダイゼーシヨンを行う ことにより、 での本発明の蛋白質 の特定等のより細かレ 現分布を知ること ができる。
これらの方法によって得られる、 本発明の蛋白質がどのような で発現してレ、るか
Figure imgf000027_0001
trるかとレ、う†t¾は、
VEGF-KDR系の f翻 ¾i ^冓 こ役立つ。
また、 本発明のオリゴヌクレオチド （R AZDNA) は、 本発明の蛋白質遺 の転写もし くは mRNAの麵を猶 IJすることにより 〔村上；化学、 46, 681ひ 991)、 P.S遍 er； Bio Ifechnology, 2, 358 (1992)]、 VEGF-KDR系の'麵 ¾ό養 ijされると考えられること力 ら、 増殖、 |¾形 慢 ¾raリュウマチ ί ける 炎、 糖尿病 ffiM£、 » MI^M、 乾鮮等の異常な血 ff生により病態 進 i? る疾砉、を治療に謂できる。
さらに、 本発明の DNAを用レヽ、 [2]言凍の方法により本発明の蛋白質を することができ る。
本発明の蛋白質または DNAを用レヽて、 KDRの糸 内ドメィンと本発明の蛋白質の結合を阻 害する のスクリ一ニングを行うことができる。 例えば、 [1] (1-1) で取得した KDRの細胞 內ドメィンの cDNAを用レ、て、 [2] 言 ¾feの方法により KDRの糸 ffl^内ドメィン蛋白質を »し、 本発明の蛋白質と KDR糸嶋内ドメイン蛋白質を in vitroで?！^後、 ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を行い、 好量の上昇し を検出する。 この系に たレ靈を動卩し、 の量を しなレ、： ^と]:附ることにより、 ：の量を させるような^且 を スクリ一二ングできる。 あるレヽ ί鉢発明の蛋白質遺ィ のクローニングに用レヽた麵ツー/^ ブリッド¾«系で、 cDNAライブラリ一のかわりに、 得られた本発明の蛋白質遺 の cDNA クローン （転^ 3¾{匕ドメインと本発明の蛋白質との ΐ ^蛋白貧発現プラスミド） で蒙を形 しリボータ Htfeiの転写量を見る系に、 たレ靈を劂口し、 リボータ "¾ の 転写量を励 Qしなレ、 と):附ることにより ¾ ^^の量を齢させるような;^且害滅を スクリ一ユングできる。 このような^且害 は VEGF-KDR系の fff^Slを 片ると考 えられることから、 固形 殖、 聿 形 リュウマチにおける 炎、 糖尿病 msm, ^m , 乾^異常な血 生により病態 進 i る疾 を治療に でき る。
また、 本発明の蛋白質を として用い、 [3] 言識の方法により本発明の蛋白質に财る抗 体を^^ることができる。
本発明の蛋白質に ¾- る抗体を用いて、 本発明の蛋白質を検出することができる。 具 に はマイクロタイタ一ブレートを用レヽる ELISA法、 去による細避
¾fe、 ゥエスタンブロット'^を用レ、た検出法をあげることができる c また、 本発明の蛋白質に财る抗体の中で、 本発明の蛋白質と KDRの齢を阻害する抗体 や、 本発明の蛋白質と本発明の蛋白質 W†fTOi ^との相互作用を阻害する抗^ {ま VEGF-KDR系の を阻害すると考えられるので、 このような抗体を投与することによ り、 固形月 ®¾c職、 »形成、 littMfiリュウマチ ( ける ¾if^、 糖尿病 t4 S^S、 规 乾鮮等異常な血！ ^生により病態 進 ίΤΤる疾害、を治 »ることができる。 図面の簡職説明
第 1図は、 KDRの cDNAクローン pBluescriptn KDR、 KDRの糸 MS内ドメィン½1？ッ —ノ ブリッド法用のプラスミド pAS-KDRの ί樓法、 およびツー/ ブリッド法に用いたプ ラスミド pAS-KDRと cDNAライブラリ一の «itを である。
第 2図は、 KDRリセプタ H ^蛋白質 DNA1のヒト «^ ける発現分布を るため のノ一ザンブロッ卜の結果を¾¾"| 1]である。
第 3図は、 KDRリセプタ 蛋白質 DNA2のヒト^ ける発 ¾^布を調べるため のノ一ザンブロッ卜の結果を である。
第 4図は、 K868M変異型 KDR cDNAプラスミド pBluescriptH KDR M-2のィ 去を^ 図である。
第 5図は、 プラスミドクロ一 #37と野; ¾ KDR (pAS-KDR) あるいは T^r変異型 KDR とを用いたツーノ^ブリッド 結果、 出現した形 コロニーを ^ Ilである。
第 6図は、 プラスミドクロー #2と野^ MKDR (pAS-KDR) あるいは T^r変異型 KDRと を用 ヽたッ一ノ ブリッド? 結果、 出現した开^ ^コ口ニーを^ τΠΙである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の魏例を
瞧例 1〕 ッ一ノ、ィブリッド法による、 KDRの糸 MS内ドメインと する のスクリ一 ニング
( 1 ) KDR 内ドメィン¾^¾ッ一ノ ブリッド法ブラスミドのィ徵
まず、 KDRの cDNAを単離するため、 Bruce L Tbnnan博士 (American Cyanamid ¾) 力 ^された KDRcDNA [B.I.Tfermanら； Biochem.Biophys. Res. Commun., IS2, 1579 (1992)] の 0.7kbの断片 （上言 £1侖文の cDNAの 5'端から ΗώάΠΙサイ卜までに相当） をブロー ブとして、 プラークノ ブリダィゼーシヨンによりヒト月继 cDNAライブラリ一 OVL Shibuya ら； On∞gene， 5, 519 (1990)] をスクリ一二ング L† スクリ一ニングの具励方法は
W.D.Bentonと R.W.Davis の方法 [Science, 126, 180 (1977)] に従っ スクリーニングの結 果、 約 2.7kbの KDRcDNAのクローンが^!され cDNAクロ一ンをライブラリーのクロ —ニングサイトである制 pgg^EcoR [で切断し、 約 2.7kbの cDNA部分を^ H、 この cDNA 断片を制 W Eamffl (この cDNA断片の 3'端のすぐ近くに BamHIサイトカ' 在する。 ) でさらに麵し職し こ 2.7kb の cDNA断片をべクタ ~T>Bluesoipt n SK (ストラタ ジーン tt) の EmRI/ amHIサイト間に挿入し
cDNAライブラリーから得られた KDRcDNAは、 BamHIサイト < f立動ゝらみて赚翻 域の直後までしかなく、 糸鹏内ドメインに相当する部分がほとんどないものだったので、 cDNA 中の BamHIサイトよりも 3惻«分を RT-PCRにより ^t ることにし ヒト月继
mENA (M. Shibuyaら； On∞gene, 5， 519 (1990)] から DM.Glover and B.D. Hames ； DNA Cloning 1, A Practical Approach, Core Tfechniques, Second Edition (1995) に言 B¾の方法 に基づき、 ランダムプライマーを用いて cDNAを合成し この cDNAを铸型として、 すでに 酷されている KDRcDNAの;^ ¾ リ [Genbank accession No. X61656, B.I. rmanら； Biochem.Biophys. Res. Commun., 127, 1579 (1992)〕 を基にしてプライマー 1〜 8
Figure imgf000029_0001
をそれぞ； 潘号 7〜： 14 示した） を合成し、 (A) プライマ一 1とプライマ一 6で^:、後、 を翻にしてプライマ一 2とプライマー 5で 、 (Β) プライマー 3とプライマー 8 で 後、 S ^夜 ¾ ^にしてプライマー 4とプライマー 7で の 2組のプライマ一 (¾且み 合: で nestedPCR [M.J.MacPhersonら； PCR A Practical ApproachJRL Press
(1991)〕 を行い DRcDNA ¾rt 幅し
(A) で增幅する断片は 810bpであり、 この断片の ¾S IJ中には 5'端の近くに BamHIサ ィト、 3'端 くに サイトが するので、 畐 DNAを制gi^EamHIおよび で切断し約 740bpの DNA断片を職し (B) で墻畐する断片は 1059bpであり、 3¾¾に はプライマ一 7由 5fe ) haIサイ卜が する。 またこの断片の ί^Ξ^中には 5'端の近くに ΔΪΕΙサイトカ^ ¾するので、 制 IW^Aialおよび halで働し、 約 990bpの断片を戦佳し ナ 上記で ί懐した 2.7kbの KDR cDNA断片を pBluescript Π SKにサブクローニングしたプ ラスミドを BamHIと Xhalで切断し、 （A) の amHI-^al断片と、 （B) の^ al-Xhal断 片とともにライゲ一ション を行レヽ、 pBluescnpt n SKに KDRcDNAの カ 入された プラスミド pBluescriptn KDRを難した 1図） c
尚、 第 1図中の記号が表 i ¾〖¾rf o lりである。
π ：制！^^ Hindiサイト
A ：制 IW^ サイト
H ：制 IW^Hi dinサイト
B ：制 IW^EamHIサイト
E ：制 W^ ECQRIサイト
X ：制I^¾XhaIサイト
S ： イト
Bg ：
Figure imgf000030_0001
サイト
Xh ：制 PS« hQlサイト
TM ： KDR の鶴
：プライマ一 KDR-2 によって行った 入を表わす。
2 μοή ：瞻 2μ爾始点
TRP1 ：瞻トリブトファン合脇遺ィ
a : £1ファージ (7^ ¾台点
CYH2 ：酵母シク口へキシミド耐■ffiliSi
P ：麵アルコーノ ヒドロ^ t遺 ^プロモーター
GAL4BD ： GAL4遺 の DNA ^ドメイン
GAL4AD : »GAL4遺^ "の転^ gftf匕ドメイン
KDRC ： KDR cDNAの糸 内ドメィン 片
TADH:L ： «アルコ—ノげ、ヒドロ ゼ遺 ターミネーター
ColEl ori ： 驢コリシン E1因子 始点
Ampr ：ァンピシリン耐 14¾^?·
得られた KDRcDNAの JME^Jを、 'ォキシ法により決定したところ、 » [B.I.Tbrman ら； Biochem.Biophys. Res. Commun., 1S2, 1579 (1992)] の塩薪列と i |¾して、 （ 1 ) 不明 であった N末の 2アミノ酸は Mel^ATG) 、 Gln2(CAG)であり、 272bp の 5' "或 んでい ( 2) 6ケ所の IJが異なっているため、 アミノ翻 IJも 6ケ所異なってい すなわち、 Val297(QTA)→He(ATA)、 Thr7'72(ACG)— Ala(QCG)、 Gly787(QGG) -→ Arg(CGG)、 Asn835(AAQ →I^s(AAG)、 Glu848(GAG)→Val(GTG), Thr134 (ACG)-→ SerCTCG)の 6ケ所である [S.Sawanoら； Cell Growth & DiffercntiationJ, 213 (1996)〕 。 な お、 この変異により、 （B) の増 ||1離片中に一ヶ所 Aii lサイトができるが、 pBluescripffl KDR 際に挿入した^ al-Xhal断片ではこの サイトは切断されてレ、なかつ
このようにして得られた KDR cDNAクローン pBluescriptn KDRを制限 S^EamHIおよ び Xhal i:«し、 糸 内ドメインをコードしている部分^^む 1.7kbの断片を^!し この EamHI-Xhal断片を、 ベクタ" pUC118 (¾¾造翻 の E mHlXSbalサイト間にサブクロ —ニングし、 プラスミド pUC-KDRCを作製した。
後で述べるツーノ^ブリッ クタ一に導入したとき、 ¾^蛋白のフ^""ムを合 ¾：る ため、 このプラスミド pUC-KDRCに対して、 変 ¾¾Affiプライマ一 KDR-2 (塩 列 P列 番号 15 ί し^ ) を用いて、 Kunkelの方法 (Proc. NatL Acad. Sd. USA, S2, 488 (1985)) に基づレ、て 立特異 然変 入を行レヽ、 サブクローニングした KDR断片の； BamHIサイ トの直後〖；^ SCを 1個導入し この改変型 pUC-KDRCを制 W^EamHIおよび Sailで 切断し、 «した KDR cDNA断片約 1.7kbを職し この EamHI-Sall断片をク口ーンテ ック社のツーノヽイブリッド¾<7 クタ ~pAS2-lの EamHI/Sallサイト間にサブクローニング し、 プラスミド pAS2-KDRをィ樓し PAS2-KDR ί!«マーカ一としてトリプトファン合 ィ S^TRPlを有し、 赚 Saocharomyoes o revisiae のァノレコー Λ ^、ヒドロ ^^"^ゼ遺伝 子 ADHのプロモーターを麵して、 転写 卸因子である GAL4の DNA；1¾^ドメインと KDR の糸 ¾内ドメインと力 ¾ ^蛋白 (^で発現される申 ffi をもつプラスミドである。
( 2 ) ッ一ノ ^ブリツド法によるスクリーニング
クローンテック社のッ一 "ブリッド法用ライブラリ一である MATCHMAKERヒト fl继 cDNAライブラリ一に対してスクリ一二ングを行つ;^ この cDNAライブラリ一はべクタ一 pACT2の EmRI Xhfll間に ΙΕ¾·向になるように cDNA力挿入されてレヽるものであり、 i¾マー カーとしてロイシン合; ¾¾¾i^f" LEU2をもち、 ADHプロモータ一を して、 GAL4の転 化ドメインと cDNAのコードする蛋白とが!^蛋白 で発現する形になってレヽる i
1図） スクリ一二ングの具^]方法はライブラリ一に' 寸されたクローンテック社のマニュ アルに従って行っ すなわち、 ツーノ^ブリツド '翻のヒト月離 cDNAライブラリ一と
( 1 ) で した pAS2-KDR Sa chammvops oprpvisiae CG1945株 (クローンテック に麵リチウム法を用いて導入した:. CG1945株は、 染色体中に、 GAL4が結合する EJIJの下流にヒスチジン合 遺 HIS3と /3ガラクトシダ一ゼ遺 lacZをレポータ Hfi ^"として持っており、 トリブトファン、 ロイシン、 ヒスチジン要求性の株である。 プラスミ ド PAS2-KDRと KDRの糸 E ^内ドメインと^する蛋白の cDNAクローンの しそ れぞれの 蛋白を発現する形 Sl^体は、 KDRの糸鹏內ドメインと cDNAのコ一ドする結 合蛋白の により GAL4 DNA ^ドメインと GAL4転雜 I4f匕ドメィンが碰するため、 GAL4 DNA ^ドメィンカ¾ ^する の下流の HIS3遺^および lacZ遺 転写 カ¾¾{匕されるため、 ヒスチジン艘求性、 /3—ガラクトシダーゼ¾¾1«となる。 2 X 106 個 ^体を 2 %グルコースおよび 5 mM 3- アミノトリアゾ一ル¾ ^み、 口ィシン、 ヒス チジン、 トリプトファン¾ ^まなレ ：咅社で、 30°Cで 5日 咅養し、 増殖するコ口二一を し 舰された各形^^体の ]3—ガラクトシダーゼ活性の検出をフィルタ一アツセィ
[KBreeaen and Nasmyth ； Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 50· 643ひ 985)〕 によって行い、 /3—ガラクトシダ一ゼ翻易 体をさらに繊し このように蒙された形歸激体から、 クローンテック社のマニュアルに従って全 DNA 色体 DNAとプラスミド DNA力 S混合しているもの） を譲し、 この DNAを Gene Pulser Π
(ノ Wオラット» を用レ、てエレクトロポ^ "シヨン法により、 ロイシン要求性で、ある;^昜 菌 HB101株に導入し、 形 をし エレクトロポ シヨンの具鹏方法はノ^オラッ ド社の膨に従つ
言^^ S ^体をロイシンを含まなレ、最小培地で培養し、 ロイシン ^求十生になった:^
¾ ^体から cDNAプラスミドを回収し 回収したプラスミド中の cDNAがコードする蛋白 質の；^が KDR »内ドメィン特勸であることを ¾|gするため、 KDRとは別のプロティ ンキナーゼである酵母の SNF1遺伝子をプラスミド pASlに挿入したプラスミドである pAS/SNFl [Stephen. J. EUedge博士より ^され T urfeeら； Genes & Development, 2, 555 (1993)) と、 回収した各 cDNAプラスミドを上記と同様にして CG1945株に導入し、 ヒ スチジン要求性と /3—ガラクトシダーゼ ¾†生を測定し cDNAのコ一ドする蛋白質と SNF1 蛋白質が しなレ、ため、
Figure imgf000032_0001
—ガラクトシダ一 ゼ ¾ttもみられないプラスミドクローンを、 その cDNAがコードする蛋白質が KDRの細« ドメィン特 1^してレヽるものとして iSRした：
該クローンとしてクロ一ン #37およびクローン を; i¾ した：
( 3) クロ一ン = 37力;含む cDNAの塩»列 C 斤 ( 2) で ¾ されたクローン ί ~· であるプラスミドクローン #37を EffiRIと Eginで切断 し、 cDNA ¾r^*勺 1.9kbの断片を纖し、 ベクタ" pUC118の HincIlZEamHIサイト間に サブクローニングし nested deletion法 〔DM.Glover and B.D. Hames ； DNACloning l, A Practical Approach, Core Tbchniques, Second Edition (1995) 〕 ^S 、て cDNAの^^ らの欠^:のシリーズを «し、 欠失前のブラスミドぉょ 欠^:シリーズのブラスミドに 対し、 ノ《一キン ·エノ 一社の、 ~クエンス 用キットにより、^"クエンス を行い、 DNAシークェ
Figure imgf000033_0001
ことに より、 #37の cDNA (½¾¾^iJを決定し
得られた JME^Jを酉 号 5〖 し^ この: ^¾H^は 1985bpであり、 E ^墦号 1の塩 翻 ijの 283番目以降に相当する。 この ^について、 ； データベース GenBank に対して BLAST searchにより相同 を行つたところ、 既 <7¾MH^には一 ¾rTる酉 U はなかった。
クローン #37力含む cDNAは、 KDRリセプターに し に『关 する新規な の cDNAであると舰され、 こ を KDRリセプタ Hi ^蛋白質 DNA1と名付け
(4)クローン #2力 cDNA
Figure imgf000033_0002
(2) で »されたクローン ( >~ であるプラスミドクローン # 2を ECQRIおよび Xholで 切断し、 cDNA ¾r tj#¾ 1.6kbの断片を輔し、 *¾を 骨化した後、 べクタ" pUC118の Hindiサイトにサブクローニングし、 pUK2-RXlをィ懷し pUK2-RXlについて、 nested deletion法に基づレヽて cDNAの«からの欠 »のシリーズを條し、 欠失前のプラスミドぉ よ υ¾·欠 ^^シリーズのプラスミドに対し、 ノヽ。一キン'エノ 一社のシークェンス 用キッ トによりシークェンス Sl^を行レヽ、 DNAシークェン 1^~ABI310 (パ一キン · エノ 一謂 を用レ、、 cDNAの ^^ 】の決定を行つ ^
得られた を酉 噃号 6 i 示し 得られたこの;^ ^ リは 1610bpであり、 酉 噃 号 1の麵 の 27番目以降に相当する。 この: Μ リについて、
Figure imgf000033_0003
GenBankを用レ、て BLAST searchにより相同赚索を行ったところ、 既存の ^^ 』には一 る酉 リはな力ゝっ o
クローン # 2力;含む cDNAも、 KDRリセプタ一に しす識¾1に関与する新規な の cDNAであること力 され、 こ^子を KDRリセァタ "^蛋白質 DNA2と名付け^ CMSS例 2〕 KDRリセプタ 蛋白質 DNAの発 、布
( 1 ) KDRリセプタ 蛋白質 DNA1 ( ¾現分布
ヒ卜の における KDRリセプタ 蛋白質 DNA1の発 布を、 ヒトの繊 （'« 脳、 月離、 月巿、 月直 骨格筋、 M) の mENAブロットである Multiple Tissue Northern Blot (クローンテック tt ) に対してノーザンブロットを行うことにより
プローブとして、 クロ一ン #37の KDRリセプタ H ^蛋白質 DNA1の Hindin-HincII断 片約 1.4kbを雄例 1と赚にして32 P職したもの用レヽ、 ^ブリタ"イス'および洗^)餅 はク口一ンテック社の に従っ^
結果を第 2図 i し^
第 2図〖 されるように、 KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA1の mENAには 2.7kbと 2.0kb の 2觀あることがわかつ mRNAはレ、ずれの糸職； レ、ても発? ¾0 され、 多く (^鹏 で ¾1的に^ 16していると考えられ
( 2 ) KDRリセプタ 蛋白質 DNA2 D¾現分布
ヒトの^ «( ける KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の発 ¾ 布を、 ヒトの繊 ( I ： 黴 脳、 肺、 月徵 骨格筋、 霞 瞧； II. m 胸腺、 前 、 精巣、 喋、 小 腸、 結腸、 白 rt) の mRNAブロットである Multiple Tissue Northern Blot Iおよび II (ク ローンテック ¾ ) に対してノーザンブロットを行うことにより
プローブとしては pUK2-K lの KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA2の BamHI断片約 1.5kbを難例 1と赚にして 32P したものを用レ、、 ブリダィズおよび洗 ί牛は クローンテック社の に従っ
結果を第 3図 示し
第 3図〖 されるように、 KDRリセブタ Η ^蛋白質 DNA2の mENAには 3kbと 6kbの 2觀あることがわかっ 3kbのものは、 Ά » Wi«こ顕著な発 ¾6聽され、 また 前通、 小腸、 結腸においても鶴され 一方 6 kbの mRNAは、 M 胸腺、 精巣、 白血 : mされ、 また他の繊にぉレ、ても低レベルで発 ¾ ^見られ
[^例 3〕 ^ScDNAのクローン化
( 1) KDRリセプタ "^蛋白質 DNA1の^ AcDNAのクローン化
¾SS例 1で得られた KDRリセ 7タ 蛋白質 DNA1の cDNAは 例 2で明ら力 こなつ た mR A COftさから、 cDNAC½長をコードしていない可 fgi^あるため、 cDNA全長をク ローン化し KDRリセブタ" "^蛋白質 DNA1のコードする蛋白質 （以下、 ^^蛋白質 1と呼 ぶ） の^ Όアミノ^ ^を明らかにすることにし
え tlOをベクターとするヒト! ^cDNAライブラリ一 [M Shibuyaら； On∞gene，5，519 (1990)) に対してプラークハイプリダイゼーションによリ KDRリセプタ一 ^蛋白質 DNA1 の cDNAクローンをスクリーニングし プローブとしては #37のブラスミドを Hindlllおよ び ΙϋηοΙΙて «した約 1.4kbの cDNA断片を [ -32P] dCIPを用 、てランダムプライ厶法 (ATSambrookら； Molecular Qoning;ALaboratory Manual, Second Edition (1989) 〕 によ リ 32P職し、 プローブとし ブラ一クノ^ブリダイセ'一シヨンの具删な方法 した メンブレン （Hybond-N；アマシャム謂 に謝されたマニュアルに従つ
プラークノ、イブリダイセ'一シヨンに得られたポジティブクローンから、 約 2_2kb と最も長い cDNAを含むクローンを選択し #37の KDRリセブタ" ^蛋白質 DNA1の cDNA さと J ^して、 このクローンの KDRリセプタ ""^蛋白質 DNA1の cDNAは 5'側に約 0.2kb 帳して ヽると考えられたため、 このクローンを ECQRI T-WU CDNA全長 (：!目当する ECQRI新片 2.2kbをべクタ"" pUCU9 の ECQR [サイトにサブクローニングし、 プラスミド pUK137-Rlを條し pOKl37-Rlを EmRtおよび ΜΠΙて七: ®fして得 ¾ U¾5¾0.61* wrを戦し、 pucii9の 間にサブクローニンク *υた後 ^^を し
1で得られた #37の KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA1の cDNAの ^と、 こ こて得られた KDRリセプタ HS^蛋白質 DNA1の cDNAの 5β1(Ό¾β ^を組み合;^る ことによリ、
Figure imgf000035_0001
1に示した、 2267bpからなる KDRリセプタ 蛋白質 DNA1の
Figure imgf000035_0002
PUK137-R1を含む^菌である Escherichi cdiDH5ii )UKl37-Rl 平成 9 年 11月
19日付けでェ 命工学ェ 漏麵（日 *a茨 ¾mつくば mm ι丁目 ι番 3号）に
FERMBP>6168として寄託されている。
Figure imgf000035_0003
1140bp力らなるオープンリーディングフレーム （ORF) 力、 'あり、 380 アミノ^)ゝらなる蛋白質 KDRリセプタ H¾ ^蛋白質 DNA1をコードすること力わかつ ま たこの ORFの尸开¾ ^コドン ATGの 6bp上流には ATGと同じフレームでストップコドンである TGA力あるため、 この ATGを『 コドンとした。
このアミノ麵 リ崎脆 ァミノ データベース Genpep PIR, Swiss-Prot, PRF、 PDBに対し Blastsearchにより相[« ^を行うことにより鶴し
¾M2に ように、 KDRリセプタ" "^蛋白質 DNA1はど にも #¾½に¾¾し ているので、 KDR C ¾ ^みら ¾血管内 j£«においても、 リン斷匕した KDRと して、
«内シグナノ wsiに,してレ、ると考えら ¾。
( 2 ) KDRリセプタ ""^蛋白質 DNA2 CO± . cDNAのクローン化
1で得られた KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAは¾« 2で明ら力になつ た mENA 0 ftさから、 cDNA i ^長をコードしていない可 Hft^'あるため、 cDNA rfeftiDク ローン化を!^
え tlOをベクターとするヒト cDNAライブラリ一 CM Shibuyaら； Oncogene, 5, 519 (1990)) に対して ¾SS^J 1と赚にしてプラークハイプリダイセ'ーションによリ KDRリセブタ ■ ^蛋白質 DNA2の cDNAクローンをスクリ一二ングし ブローブとしては^ S例 2と同 様に pUK2-RXlの KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAの BamHT断片約 l.5kbを 32P観したものをプローブとし プラークハイプリダイゼーションの具鹏な方法 ί翻 したメンブレン （Hybond-N；アマシャム; に'謝されたマ二ユアノレに従つ
ブラ一クノ、イブリダイセ'一シヨンにより得られたポジティブクローンから、 約 3.0kbと最も 長い cDNAを含むクローンを した。 このクローンを ECQRIて し、 cDNA (I¾当する ECQR [断片 3.0kbをベクター pUC119 (^ ^Μ- ) の ECQEI部位にサブクロ一ニングし、 プ ラスミド pUK102-Rlを ί した。 このクローンは ¾ iJ 2で見られた 3kbの 1111^ (1¾当 する全長 cDNAクローンと考えられた。 pUK102-Rlの KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の cDNAの 5β Όϋ¾δ を^したところ、 ¾Μ 1で得られた # 2の KDRリセブタ"^ 合蛋白質 DNA2の cDNA CD¾¾S^Jよリも 5βに 27bpだけ長 »Jであつ PUK102- R1の KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAは # 2の cDNAに比べ約 1.4kb長 、が、 5' 側でなく 3'ί勝賺觸 力 ¾レ、クローンであると考えられ ここで得られた DRリセ プタ 蛋白質 DNA2の cDNAの 5βの ¾¾@ ^を # 2の cDNA COl^S Jと組み合わ せることにより、 号 2に示した、 1637bpカゝらなる KDRリセプタ^ ^蛋白質 DNA2 の cDNAの igffl^を得 PUK102-R1を含む «菌である Ksriierirhia cdi DH5
/PUK102-R1 平成 9年 11月 19日付けでェ ^1¾命工学ェ 醫麵 （日 *Θ茨 つくばtJ¾ l丁目 1番 3号） に FEEMBP"6167として されている。
この 己列中には 861bp力、らなるオーブンリーディングフレーム (ORF) カ リ、 287 7 ミノ ゝらなる KDRリセプタ 蛋白質 （以下、 ^蛋白 2と呼ぶ） をコードすることがわ 力 ^ (ここで诵始コドンは cDNA上で量初に出現する Metとし/^ )
このアミノ翻 」の新規性は、 アミノ翻 Ξ ^データベース Genpept：、 PIR、 Swiss-Prot, PRF、 PDBに対し Blast searchにより相同 t¾ ^を行うことにより し
雄例 2でみられた 3kbの mRNAはこの cDNAと ¾iSするものと考えられるので、 月離、 Wfl ¾どでは、 こ f氐 量の!^蛋白 2カ 現し、 糸 fflSS内' として 4¾½ 機能を担ってレヽると鍵リされる。
—方、 6 kbの mENA f¾Woよび白«などの«系 職で it^高レ ¾ ^見られて レ、るので、 6kbの mRNAがコ一ドする^^蛋白 2も«系における に βな 機能をもつものと, れる。
そこで、 6kbの mRNAに相当する cDNAを有する DNA2クローンを得るため、 ヒト白 球 cDNAライブラリー （クローンテック社；ベクターえ gtlO) に対して、 ヒト月離 cDNAライブ ラリ一からの DNA2クローンのスクリ一ニングと同様にしてスクリ一二ングを行った。
プラークノ^ブリダィゼ一シヨンにより得られたポ、: ^イブクローンから、 約 4.3kbと最も 長い cDNA ^ fクローン ¾S し;^ このクロ一ンを ErnRIで働し、 cDNAに相当する ECQRI断片 4.3kbをべクタ ~TUC119の ECQR [維にサブクロ一ニングし、 プラスミド PUK201-R1を讓し o pUK201-Rlの cDNAは、 6kbとレ、う mRNA ( ^さから考えて全 長 cDNAではなレ、と考えられたので、 このクローンの cDNAの 5' 分に相当する部分 ¾r^¾ Sail -EamHI断片約 0.8kbを PUC119の Sall EamHI間にサブクローニングして pUK202- BS1を讓し^ この PUK202-BS1の cDNA部分 ¾r^t?XhaI断片 0.3kbをプローブとして 用いて、 再度ヒト白血球 cDNAライブラリーをプラークノ、イブリダィゼーシヨンによりスクリ —ニングし、 得られたポ、: ^イブクローンから、 1.8kbの cDNA ^tfクロ一ン¾¾¾し このクローンを ECQRI で し、 cDNAに相当する ECQRI断片 1.8kbをべクタ ~pUC119の ECQRI 立にサブクローニングし、 プラスミド pUK301-R5を體し pUK301-R5の cDNAの 分 む Xhal 断片 1.6kbを PU 201-R1の halサイトに挿入することによ り、 DNA2の 6 kbの mRNAに相当すると考えられる cDNA全体^ クローン pUK401-R2 を しナ pUK202-BSlおよび pUK301-R5の cDNAの塩辦.列を卜 iポと曜 ίこして決定し、 PUK102-R1の cDNAの^ ¾Ξ ^と組み合 ることにより、 酉 ^播号 2 7 示した、 3505bp からなる KDRリセァタ "^蛋白質 DNA2の cDNAの JME^Jを得た： この ^^ 冲には 2541bp力、らなる^ "プンリーディングフ^"ム （ORF) があり、 847 アミノ^)ゝらなる KDRリセプタ" ^蛋白質 （以下、 ^蛋白 3と呼ぶ） をコート"することが わかった !潘号 28) 。 またこの ORFの開始コドン ATGの 169 71bp上流には ATGと同 じフレームでストップコドンである TAGがあるため、 この ATGを開始コドンとし^
このアミノ¾1 〗の新規性は、 アミノ麵 データベース Genpept、 PIR、
Swiss-Prct, PRF、 PDBに対し Blastsearchにより相同,索を行うことにより ¾ ^、し 結 合蛋白 2と^蛋白 3のアミノ廳 IJを i»Tると、 ^^蛋白 2の 9番め （Glu) 以降と!^蛋 白 3の 5 6 8番め （Glu) 以降のァミノ鹏 IJは同一だった力 それより N末側のァミノ翻 】 は異なっていた。
〔鍵例 4〕 KDRとの相互作用 (^晰
( 1 ) KDR活性中' C/変異体との相互作用
KDRのキナーゼ活性中 立にあたる Lys868が Met に難した （以 K868M変異 と言 る。 ) KDRをコードするように、 鍾例 1で用いた DRcDNAクローンに颜を導 入し すなわち雄例 1で讓した pBluescriptll KDRを讓にして、 (A) プライマー K14N « 1潘号 16) とプライマー KMR-2 ® 噃号 17) (B) プライマー KMN-2 (酉^ I潘 号 18) とプライマ一 K3R ¾ 1墦号 19) の 2組のプライマ一O み^:で PCRを行つ
KNR-2と KMN-2はそれぞれ K868M変 ¾K ^をもつ互いに相 なプライマ一である。 聯畐 した二つの DNA断片を ©IXし、 両者を混合したもの ¾ ^として次に ¾¾例 1で用レヽたプライ マー 2とプライマ一 5を用!/、て PCRを行レ、、 Κ868Μ変異 KDRをコ一ドする cDNA断片 0.8kbを職した 4図） 。 この:^、 (A) の 3'«と （B) の 5'*¾まプライマー KNR- 2 と KMN-2 由 共通の 22bpの K^IJがあるので、 (A) 巾離片のセンス鎖と （B) の 増 >|1斷片のアン^^ンス ;この共適 E^ijを介してァニーリングした 、 PCRの により それぞれ (Zm ^プライマ一となって （A) と （B) カ¾ ^し、 K868M変異 ^の断片 カ 幅する。 こ 續片に対しては、 プライマ一 2とプライマー 5により 0.8kbの断片 幅できる。 次にこ^ 片を制gg^EamHIおよび: Ikilで «し、 約 0.2kbの EamHI- 断片 (K868M変異 ¾^、） を戦隹し、 pBluescriptll KDRを EamHIと 1で切隨 雜した約 5.2kbの oil-EamHI断片、 および pBluescriptn KDRを: Ikglと oilで切赚 戦隹し 約 1.5kbの: Ikj fctl 断片とともにライゲーシヨン ® ^を レ、、 Κ868Μ変異 KDR cDNA ^l^tプラスミド pBluescriptn KDR M-2を†線し^
尚、 第 4図中の記号が表す ¾f¾A下の通りである。
E ：制限 S ^ ECQMサイト
T ：制 PSil^Ikalサイト
B ：制 pg^EamHIサイト
N ：制 PS^Notlサイト
ΎΜ ： KDRの麟
• ： K868M変異を表わす
変異の導 正しく行われていることは、 ： Μ IJを決定して薦し こ (^変異型プラス ミ ド pBluescriptn KDRM-2を BamHIと Xhal "C¾DrU 糸鹏内ドメィン½^勺 1.7kbの 断片を職し、 ベクタ" UC118の EamHIXXhal間に挿入し/^ 蛋白にしたときのフレ 一ムを合 ^るため、 雄例 1と繊にしてプライマー KDR-2を用レ、て、 w
導入法により EamHI に 1 ¾¾Cを挿入し この プラスミドを制 PB^EamHI および Sailで消化して pAS2-lの EamfflZSall間に挿入することにより pAS-KDR-KMを作 製し pAS-KDR-KMをプラスミドク口一 #37またはプラスミドクロー^ #2ととも CG1945株に導入し形 し
言鄉 を 2%グルコースおよび 5mM 3- アミノトリアゾール ¾ ^み、 ロイシン、 ヒス チジン、 トリプトファン ¾ ^まなレ、合/^咅 ¾Lbで、 30CCで 5日 咅養し、 ヒスチジン矮求性 かどうかを
プラスミドクロー #37を用レ、た時の結果を第 5図 ί しナ
野！^の KDRの糸 内ドメィンを^ pAS-KDRの:^と！： して、 His 頃求 c ¾質 繊体の数は、 プラスミドクロー #37、 プラスミドクロー レ、ずれを用レ、た ¾ ^にも、 著 しく低下してい:/ " o
この結果は KDRと KDRリセブタ H ^蛋白質 DNA1および KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の には Lys868、 つまり KDRのチロシンキトゼ活 要であることカ^ fl変さ れ
( 2 ) KDRリセプタ "^蛋白質と^する KDR部位 晰
KDRリセァタ "^蛋白質が KDRのど 或と する力を調べる目的で、 KDRの変異 体を用いて、 酵母ツーハイブリッド法により角浙した： 具鹏に ί¾下の 去で解析し ^ rnm l ( l ) で作製した、 EamHIサイトの直下に 1塩基を挿入した改^! pUC-KDRC (7 "本鎖¾^として以下 7觀のプライマーを用いて、 雄例 1 ( 1 ) と赚にして «特 ¾6 ^然変異導入により KDRのキナーゼドメインよりも C«側の T rを Pheに置換した。 用いたプライマーは、 酉 播号 20の:^ fflE^jを有する YF12 [Tyr(1136)→Phe； ( )内 ^(まァミノ »ί立置を 。 以下同じ。 〕 、 酉 潘号 21の を有する YF13 [Tyi 1175) - Phe] 、 酉 潘号 22の iffi IJを有する YF14 [Tyr(1214)→Phe] 、 酉 S l墦号 23の 己 列を有する YF15 [TVr(1223)→Phe] 、 酉 潘号 24の;^ リを有する YF16 [TVr(1305)→ Phe] 、 酉 潘号 25
Figure imgf000040_0001
を有する YF18 [TVr(1319)→Phe] の 7觀である。
変異体としては、 それそ 戦虫の TVr変異体 7觀と、 変異を組み合^:、 複数の T rを 変異させたものとして、 YF12+14 [Tyr(1136, 1214)→Phe] 、 YF12+13+14 〔1^1136, 1175, 1214)→Phe] 、 YF14+15 [1Vr(1214, 1223)→Phe] 、 YF14+16 [1^(1214, 1305)→Phe] 、 YF1G -17 [TVr(1305, 1309)→Phe] 、 YF12+14+16 [1Vr(1136, 1214, 1305)→Phe] の 6觀 を讓し：^ それぞれの変異の導入は、
Figure imgf000040_0002
このようにして ¾した Hiの T r変異型 KDRプラスミドを EamHIおよび Sailで切断し、 PAS2-1の EamHlZSaJI間に挿入し これらの pAS2-lに T r変翻 KDRを挿入したプラ スミド¾# 2とともにそれぞ; H CG1945株に導入し 2 %グルコースおよび 80mM 3- ァミノトリァゾール んで、 Leu, His, rp ¾r ^まなレ洽 咅¾±で、 30°Cで 4日 離 換体を培養し、 His 求性であるかどうかを鹏し
まず職虫の iyr変異型プラスミド 7觀それぞ; T O^KI^体の中では、 KDRの TVr(1305) を Pheに した変異 (YF16)
Figure imgf000040_0003
Hisを含まなレヽ培地での増殖の低下が見 られ これに対し他の 6觀の TVr変異 ^Τ'は、 聯 氐下は全く鹏されな力 ^ また 複数の Tyrを Pheに譲した変異体にぉレ、ても TVr(1305)の変異 んだ変異体に
殖能は低下し、 この TVr(1305)¾Sが KDRリセプタ 蛋白質との相互作用に ijを 果たすことが^変された 6図） 。 産 !!±の利用可
本発明により得られる、 KDRリセブタ H ^蛋白質 DNAを用いることにより、 VEGFリセ ブタ一 KDR
Figure imgf000040_0004
'ι¾¾¾?ίリュウマチに おける »炎、 m , ^m .乾鮮等の異常な血 t¾f生により « ^進 ί τ る疾 の治療が可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の (a)または (b)の蛋白質。
(a) 酉 潘号 3、 4および 2 8力 選〖 る酉 潘号に鐘のアミノ翻 ijからなる蛋白質
(b) (a)の蛋白質の有するァミノ翻 E ^におレ、て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 し くは付加されたァミノ翻 リからなり、 力つ血管内戯 fflM麵子 (VEGF) リセプター KDR(kinase insert domain^conteiningreceptor)の糸 E¾S内ドメィンに!^して KDRの十 ff^St を誘導する蛋白質
2. 請求項 1言 の蛋白質をコードする DNん
3. 以下の (a)または (b)の DNAからなる DNん
(a) 酉 幡号 1、 2および 2 7から選 i る酉 噃号に総の: ffl IJを有する DNA
(b) (a)の DNAとストリンジェントな餅下でノ、ィブリダイズし、 力つ血管內戯 β¾麵 子 （VEGF) リセプター KDR 内ドメインに して KDRの'^ δβ¾を誘導する蛋白質 をコードする DNA
4. 請求項 2または 3に!^の DNA ^有する えべクター。
5. 請求項 4 の繊えべクタ一を宿主ネ鹏に導入して得られる形 Μ^Φ
6. 請求項 5諫 露 体を培地 咅養し、 培勤中に蛋白質を させ、 言 咅勸 カ 該蛋白質を ることを糊教とする請求項 1言凍の蛋白質の S^ ^fe
7. 酉 潘号 1、 2および 2 7から選【 る酉^ I潘号に言凍の ¾¾ 冲(¾ ^した 1 0〜5 0 と同じ酉 SJljまたは な酉 IJを有するオリゴヌクレオチド。
8. 請求項 l lEifeの蛋白質を認識する抗
9. 請求項 8諫の抗体を用いることを赚とする、 請求項 1纖の蛋白質 ^S^ 出 '
10.請求項 715*feのォリゴヌクレオチドを械成分とする、 異常な血籠生により病態 進行 する疾崈および KD Rの†t$S{Siの異常に起因する疾崈、の治薩
11.言青求項 8言 ¾fe¾t体を ¾ r力成分とする、 異常な血 i¾f生により病態が進 m~る疾崈ぉよひ
D R(†t$Si3iの異常に起因する疾 βの治
12.異常な血鶴生により病態 進 frrる疾崈、が、 m w .. 率 形成、 t4Msnリュ ゥマチにおける 炎、 糖尿病! ¾¾ME, または乾 τある、 請求項 1 0また は 1 1 の治織
13. KDRの†f$g^tの異常に起因する疾崈、が、 癌または白血病である、 請求項 1 0または 1
1雄の治
14.請求項 7纖のオリゴヌクレオチドを被力成分とする、 異常な血籠生により病態 衝亍 する疾崈および KD R f^Siの異常に起因する疾患の
15.請求項 8鐘 «体を被力成分とする、 異常な血籠生により病態 進 frfる疾崈および KD 颜¾1の異常に起因する疾砉、の^ ¾
16.異常な血鶴生により病態 進 m~る疾 が、 mmm< im. ^ 慢 リュ ゥマチにおける M^、 糖尿病 ttws、 ^ m, または乾魚 eある、 請求項 1 4また は 1 5練の診隨
17. KDR(Z TfTOiの異常に起因する疾 が、 癌または白 である、 請求項 1 4または 1 5
18.請求項 1言凍の蛋白質を用レ、ることを赚とする、 KDRの个編連且 のスクリ一二 ング
19.請求項 2または 3言識の DNAを用レ、ることを糊数とする、 KDRの'^ β¾Ρ且害 ¾Kのス クリーニング
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