WO1999030161A1 - Test de laboratorio para medir anticuerpos incompletos en brucelosis y equipo para realizarlo - Google Patents
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- G01N2333/23—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Brucella (G)
Definitions
- the laboratory test of the present invention (Brucellacapt) is used to measure incomplete antibodies in cases of brucellosis, and can be applied to both humans and animals.
- Brucellosis or Malt Fever is a serious disease caused by infection with Brucella abortus or Brucella elitensis that is endemic to the countries of the Mediterranean basin, affecting both humans and goats, sheep and cows (Young EJ. Clin Infect Dis , 1995; 21: 283-290).
- the ELISA technique for measuring antibodies is not quantifiable at a single serum dilution, so a qualitative result is obtained that in endemic areas such as Spain has little value due to the frequency of people with antibodies.
- the complement fixation reaction is a quantitative test that is not very sensitive and therefore less useful in the initial stages of the disease and in addition to difficult execution, so only some laboratories perform it regularly (Sánchez-Sousa A, Torres C, Ca pello MG, Garcia C, Parras F, Cercenado E, Baquero F. J Clin Pathol, 1990; 43: 79-81).
- the Coombs test is the most appropriate test to measure this type of antibody, but it has two serious drawbacks: first it takes at least 24 hours in
- TUCI ⁇ N RULE 26 its execution and secondly it is very laborious to execute. If microtechnics are not used, the titration of a serum leads to the use of 8-12 tubes that have to be washed by centrifugation. It is easy to understand that the realization of a high number of sera is practically unfeasible, since for example analyzing 24 sera by this technique requires it to be used from 192 to 288.
- zone effect Another problem frequently encountered in classical agglutination tests is the appearance of the so-called zone effect, which is that at high concentrations of positive sera the reaction is canceled by excess antibodies and is interpreted as negative.
- An object of the present invention is a test that demonstrates, with little manipulation, both complete and incomplete brucellosis antibodies.
- Another object of the invention is a test technique that incorporates an acid solution specially designed to prevent the occurrence of the zone phenomenon, which greatly facilitates the reading and correct identification of the results.
- Another object of the invention is a test technique that incorporates a solution with a high molecular weight component in which the preparation of the bristle suspension incorporating the equipment is carried out and whose purpose is the stabilization thereof.
- the object of the invention is also a test that is capable
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) to differentiate between the antibodies presented by a sick individual and a healthy individual who passed the disease, but which is currently cured. Due to the pH of the diluent used in the technique of the invention, only high affinity antibodies are determined. With the data available, it can be affirmed that the test of the invention is able to differentiate between the antibodies presented by vaccinated animals from those presented by diseased animals. Finally, the object of the invention is also the equipment necessary to perform the test described above.
- the rationale for the test of the invention is based on the attachment to the wells of a microplate of the type used in ELISA tests of goat antibodies antilgG and human antilgA (or in the case of tests intended for use in animals of the corresponding antiglobulins antioveja, anticabra, antivaca) (Desmonts G, Naot Y, Remington JS. J Clin Microbiol, 1981; 14: 486-491; Ong LY, Pang T, Lim SH, Tan EL, Puthucheary SD. J Med Microbiol, 1989; 29: 195-198; Cubel RCN, Ensign ACR, Cohen BJ, J Clin Microbiol, 1994; 32: 1997-1999).
- the sera of the patients are added and subsequently a Brucella suspension is added. After leaving the plate in incubation at 37 ° C for 24 hours, the test is read with the naked eye without the need for any type of equipment.
- the test of the invention for measuring incomplete antibodies in brucellosis is based on the addition to ELISA type wells of antilgG antibodies and Human and animal antilgia adequately blocked.
- the kits include - positive and negative controls, Brucella abortus or Brucella mellitensis antigens, and buffer solution for sample dilution.
- 96-well ELISA plates or 8-well strips or 12-well strips are used, so that 12 sera and 8 dilutions or 8 sera and 12 serum dilutions can be analyzed per plate.
- the contents of the equipment or kit necessary for carrying out the test of the invention have reagents to quantitatively investigate incomplete antibodies against Brucella abortus or mellitensis in 16 samples if 12 dilutions of each sample or 24 samples are analyzed if 8 dilutions are analyzed of each sample. It consists of the following:
- a precision pipette to dispense 5 ⁇ l and a multichannel precision pipette to dispense 50 ⁇ l must be provided.
- the execution of the technique is simple, since it is based on the addition of 50 ⁇ l of dilution buffer in each of the wells and the serial dilution of the sera of the patients using a multichannel pipette; After this operation, the addition of a 50 ⁇ l multichannel antigen pipette and incubation until the next day to proceed with its reading is sufficient.
- the interpretation of the results is as follows: The test is positive when an agglutination is observed that occupies most of the well (*). A test is negative when a bacterial button is observed in the center of the well (* *). A titer equal to or greater than 320 is strong evidence of brucellosis, but the other clinical tests should always be evaluated together before issuing a diagnosis. In endemic areas of the disease it is common to find positive results at titers below 320.
- Dilute dilutions are used, that is, each time it is diluted twice.
- the numbers that appear in the table represent until that dilution of the sera that these were positive in each of the techniques, that is, after diluting the patient's serum x times in its corresponding diluent, that the result continues to be positive in this dilution and Don't be when it is diluted once more.
- test of the invention is capable of pointing out infected animals and that they have manifested symptoms, discriminates vaccinated animals that resist infection and finally indicates vaccinated animals that do not resist infection.
- test of the invention was compared with the Coombs test using microtechnics. For this, samples of patients with brucellosis were used at the beginning of the symptoms of the disease (first sample) and when they were cured of it (final sample).
- test is very effective for the diagnosis of the disease at the beginning of the same and what is more important that is able to differentiate when it is cured, because while the Coombs test continues to be positive in 6 of the thirteen patients, the test of the invention is only positive in two of them to titles over 320.
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Abstract
La prueba o test de laboratorio se caracteriza porque en una serie de pocillos tipo ELISA se adiciona un tampón de pH 5, adicionando después cada uno de los sueros en el primer pocillo, procediendo después a una doble dilución pasando líquido de cada pocillo al siguiente, y añadiendo finalmente en cada pocillo una cierta cantidad de la suspensión bacteriana estabilizada. Se procede después a una incubación en estufa durante 24 horas a 37 °C, en cámara húmeda en la oscuridad. Posteriormente se puede leer el resultado con ayuda de un lector de placas de aglutinación. Se describe también el equipo necesario para realizar el test. El test de la invención se usa para medir anticuerpos incompletos en casos de brucelosis, pudiéndose aplicar tanto a humanos como a animales.
Description
TEST DE .LABORATORIO PARA .MEDIR .ANTICUERPOS INCOMPLETOS EN
BRUCELOSIS Y EQUIPO PARA REALIZ.ARLO.
El test de laboratorio de la presente invención (Brucellacapt) se usa para medir anticuerpos incompletos en casos de brucelosis, pudiéndose aplicar tanto a humanos como a animales.
La brucelosis o Fiebre de Malta es una enfermedad grave provocada por la infección por Brucella abortus o Brucella elitensis que es endémica de los paises de la cuenca del Mediterráneo, afectando tanto a humanos como a cabras, ovejas y vacas (Young EJ. Clin Infect Dis, 1995; 21:283-290).
En humanos, la enfe.rmedad es muy frecuente en España y provoca enfermedad a un gran número de personas anualmente. Conlleva además graves complicaciones como endocarditis, meningitis, orquitis, osteomielitis, artritis, etc (CoJjnenero JD, Reguera JM, Fernández-Nebro A, Cabrera-Franquelo F. .Ann Rheu Dis, 1991; 50:23-26). Las secuelas de la enfermedad ocasionan unos perjuicios económicos enormes pues provocan invalidez en un número elevado de personas. Las pruebas más empleadas en su diagnóstico serológico, son la aglutinación (Bettelheim KA, Mas ill WJ, Pearce J, J Hyg Camb, 1983; 90:33-39), el Rosa de Bengala, la Reacción de Fijación del Complemento, el test de Coombs y las pruebas de ELISA (Alton GG, Jones LM, Pietz DE. Laboratory techniques in brucellosis. 2nd ed. World Health Organization monograph ser. No 55. Geneva. World Health Organization. 1975; Bau M, Zamir 0, Bergan-Rios R, Katz E, Beider Z, Cohén A, Banai M,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
J Clin Microbio!, 1995; 33: 2166-2170) . Mientras que en las formas menos evolucionadas de la enfermedad todas las pruebas serológicas son sensibles para el diagnóstico de la enfermedad, en las fases más evolucionadas aparecen anticuerpos incompletos que son incapaces de aglutinar a las brúcelas, por lo que para poder poner de manifiesto este tipo de anticuerpos, es necesario emplear técnicas como las de ELISA (Goldbaum FA, et al. J Clin Microbiol 1992; 30: 604- 607; Goldbaum FA, Leoni J, Wallach JC, Fossati CA. J Clin Microbiol, 1993; 31: 2141-2145), reacción de fijación del complemento o Test de Coombs (Foz A, Garriga J. Rev Immunol, 1954; 18:288-298; Ariza J. Med Clin (Barc) , 1992; 98:494- 496) .
Estas técnicas presentan los siguientes inconvenientes: La técnica de ELISA para medir anticuerpos no es cuantificable a dilución única de suero por lo que se obtiene un resultado cualitativo que en zonas endémicas como es España presenta poco valor por la frecuencia de personas con anticuerpos. La reacción de fijación del complemento es una prueba cuantitativa que es poco sensible y por tanto menos útil en los estadios iniciales de la enfermedad y además de difícil ejecución, por lo que sólo algunos laboratorios la realizan de forma habitual (Sánchez-Sousa A, Torres C, Ca pello MG, Garcia C, Parras F, Cercenado E, Baquero F. J Clin Pathol, 1990; 43:79-81).
El test de Coombs es la prueba más adecuada para medir este tipo de anticuerpos, pero presenta dos serios inconvenientes: en primer lugar lleva al menos 24 horas en
TUCIÓN REGLA 26
su ejecución y en segundo lugar es muy laboriosa de ejecutar. Si no se emplea microtécnica la titulación de un suero lleva al empleo de 8-12 tubos que tienen que ser lavados mediante centrifugación. Es fácil comprender que la realización de un número de sueros elevado es prácticamente inviable, pues por ejemplo analizar 24 sueros por esta técnica obligarla al empleo de 192 a 288. Como el proceso de lavado tiene que se repetido en tres ocasiones esto produce una manipulación enorme que la hace casi inviable lo que ha llevado a pesar de su utilidad a que no sea realizada todo lo ampliamente que deberia, por lo que muchos casos de brucelosis pueden quedar sin diagnosticar (Maravi-Poma E, Murie M, Gamboa J, Diaz R, Rivero-Puente A. Rev Clin Esp, 1982; 166:101-105; Ariza J, Pellicer T, Pallares R, Foz A, Gudiol F. Clin Infect Dis, 1992; 14:131-140) . f La brucelosis es endémica de paises con baja tecnología y en los que la ejecución de alguna de las técnicas anteriormente descritas es difícilmente aplicable.
Otro problema frecuentemente encontrado en las pruebas de aglutinación clásicas, es la aparición del llamado efecto de zona, que consiste en que a concentraciones altas de sueros positivos la reacción queda anulada por exceso de anticuerpos y es interpretada como negativa.
Con las técnicas serológicas para la brύcelosis disponibles hasta el momento no es posible diferenciar entre un individuo enfermo de brucelosis y una persona ya curada de la enfermedad pero que todavía mantiene anticuerpos a
Brucella, lo que dada la frecuente aparición de recaidas en esta enfermedad dificulta mucho el manejo de estos enfermos.
En todas las enfermedades infecciosas se ha demostrado la presencia de anticuerpos de diferente afinidad en las diferentes fases de la enfermedad. Al inicio aparecen anticuerpos con baja afinidad, anticuerpos que se unen a los antígenos reaccionantes débilmente, con posterioridad son sustituidos por otros que presentan una gran afinidad por el antigeno y cuando no se producen nuevos estímulos antigénicos, los anticuerpos que se detectan vuelven a ser de baja afinidad, tal como ocurría al principio de la infección.
En animales la enfermedad afecta tanto a ganado vacuno, como caprino y aviar, ocasionando graves perdidas económicas por la frecuente aparición de abortos en el ganado afectado. Considerando nada más el ganado ovino en España se dedican anualmente mas de 2.500 millones de pesetas al saneamiento del ganado infectado por Brucella, sin considerar los gastos ocasionados por la vacunación de los animales (Alonso- Urmeneta B, Moriyón I, Díaz R, Blasco JM. J Clin Microbiol, 1988; 26:2642-2646.; Delgado S, Fernández M, Cármenes P. J Vet Diagn Invest 1995; 7: 206-209; Díaz-Aparicio E, et al. J Clin M.icrobiol 1994; 32:1159-1165).
Las pruebas de laboratorio empleadas en el diagnóstico en animales son la prueba del Rosa de Bengala y la Reacción de Fijación del Complemento (Díaz R, Levieux D. C R Acad Sci
Ser D, 1972; 274D: 1593-1596). El mayor problema diagnóstico
que aparece en animales estriba en que la mayor parte de los rebaños están vacunados frente a este microorganismo y esto ocasiona la aparición de anticuerpos que son indistinguibles de los que aparecen tras la enfermedad. Cuando se realizan campañas de detección es necesario sacrificar muchos animales que dan las pruebas de laboratorio positivas, pero que sólo están vacunados y no infectados. Una prueba capaz de diferenciar entre los anticuerpos que presentan los an ales vacunados y los de los enfe.rmos sería de enorme utilidad pues ahorraría un gran número de sacrificios innecesarios (Sutherland SS. J Clin Microbiol 1985; 22:44-47; Debbarh H, Cloeckaert A, Zyg unt M, Dubray G. Vet. Microbiol. 1995; 44: 37-48; Gómez-Miguel MJ, Moriyón I, Alonso-Urmeneta B, Riezu- Boj JI, Díaz R. Infec I mun 1988; 56:716-718).
Es un objeto de la presente invención un test que consigue poner de manifiesto, con poca manipulación tanto los anticuerpos completos como los incompletos de brucelosis.
Es otro objeto de la invención una técnica de ensayo que incorpora una solución acida especialmente diseñada para evitar la aparición del fenómeno de zona, lo que facilita enormemente la lectura y correcta identificación de los resultados.
Es otro objeto de la invención una técnica de ensayo que incorpora una solución con un componente de alto peso molecular en el que se realiza la preparación de la suspensión de brúcela que incorpora el equipo y que presenta como finalidad la estabilización del mismo.
Es también objeto de la invención un test que es capaz
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
de diferenciar entre los anticuerpos que presenta un individuo enfermo y uno sano que pasó la enfermedad, pero que en la actualidad está ya curado. Debido al pH del diluyente usado en la técnica de la invención, tan sólo son determinados los anticuerpos de alta afinidad. Con los datos que se tienen se puede afirmar que el test de la invención es capaz de diferenciar entre los anticuerpos que presentan los animales vacunados de los que presentan los animales enfermos. Es por último, también objeto de la invención el equipo necesario para realizar el test anteriormente descrito.
El fundamento de la prueba de la invención se basa en la unión a los pocilios de una microplaca del tipo de las empleadas en las pruebas de ELISA de anticuerpos de cabra antilgG y antilgA humana ( o en el caso de pruebas destinadas al uso en animales de las antiglobulinas correspondientes antioveja, anticabra, antivaca) (Desmonts G, Naot Y, Remington JS. J Clin Microbiol, 1981; 14:486-491; Ong LY, Pang T, Lim SH, Tan EL, Puthucheary SD. J Med Microbiol, 1989; 29:195-198; Cubel RCN, Alférez ACR, Cohén BJ, J Clin Microbiol, 1994; 32:1997-1999). Los sueros de los enfermos son añadidos y posteriormente se añade una suspensión de Brucella. Tras dejar la placa en incubación a 37 °C durante 24 horas, la prueba se lee a simple vista sin necesidad de ningún tipo de aparataje.
Como se ve, el test de la invención para medir anticuerpos incompletos en brucelosis está basado en la adición a los pocilios tipo ELISA de anticuerpos antilgG y
antilgA humana y animal adecuadamente bloqueados. En los equipos se incluyen -sueros controles positivos y negativos, antígenos de Brucella abortus o Brucella mellitensis, y solución tampón para la dilución de las muestras. Se utilizan placas de ELISA de 96 pocilios o tiras de 8 pocilios o tiras de 12 pocilios, de forma que por placa se pueden analizar 12 sueros y 8 diluciones o bien 8 sueros y 12 diluciones por suero.
El contenido del equipo o kit necesario para la realización del test de la invención tiene reactivos para 'investigar de forma cuantitativa anticuerpos incompletos frente a Brucella abortus o mellitensis en 16 muestras si se analizan 12 diluciones de cada muestra o 24 muestras si se analizan 8 diluciones de cada muestra. Consta de lo siguiente:
96 pocilios de fondo en U especialmente tratadas para capturar inmunoglobulinas.
12 mi de suspensión bacteriana de Brucella abortus o
Brucella mellitensis coloreada y muerta por calor y tratamiento con formaldehído al 0,5% en solución salina con 1% de dextrano.
14 mi de diluyente para sueros compuesto por una solución salina de acetatos 100 mM..
100 μl de suero control positivo con 0,1% de azida sódica.
100 μl de suero control negativo con 0,1% de azida sódica.
Este material debe conservarse a 4-8 °C y comprobar la fecha de caducidad.
Como material necesario, pero no contenido en el equipo debe de tenerse una pipeta de precisión para dispensar 5 μl y una pipeta de precisión multicanal para dispensar 50 μl.
La ejecución de la técnica es sencilla, pues se basa en la adición de 50 μl de tampón de dilución en cada uno de los pocilios y la dilución seriada de los sueros de los enfermos empleando una pipeta multicanal; tras esta operación basta con la adición empleando también una pipeta multicanal de 50 μl de antígeno y la incubación hasta el día siguiente para proceder a su lectura.
Debe hacerse constar que otras formas secundarias para la modificación de la prueba que no signifiquen modifica- ciones sustanciales quedan también cubiertas por la presente invención.
El procedimiento detallado del ensayo es el siguiente:
1. Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Sacar las tiras de pocilios necesarios para el número de sueros que se van a procesar, más una tira para los controles positivo y negativo.
2. -Añadir 50 μl de diluyente en el pocilio A [Fase a) de la figura 1] .
3. Añadir 50 μl de diluyente en los pocilios de A a H [Fase b) de la figura 1] .
4. Poner 5 μl de cada uno de los sueros y de los controles positivo y negativo en el pocilio A. [Fase c) de la
figura 1] .
5. Doblediluir tomando 50 μl de cada pocilio desde A hasta H [Fase d) de la figura 1] .
6. Añadir 50 μl de la suspensión bacteriana, previamente agitado para ho ogeneizarlo, a todos los pocilios utilizados [Fase e) de la figura 1] .
7. Tapar mediante un plástico adhesivo e incubar en estufa durante 24 horas a 37 °C, en cámara húmeda en la oscuridad, puesto que la suspensión bacteriana una vez mezclada con el diluyente de los sueros cambia de coloración, si se lo somete a una exposición prolongada a la luz.
8. Leer el resultado con la ayuda de un lector de placas de aglutinación, teniendo en cuenta que los títulos obtenidos serán 1/40 para la fila A, 1/80 para la fila B, '1/160 para la fila C, 1/320 para la fila D, 1/620 para la fila E, 1/1280 para la fila F, 1/2560 para la fila G y de 1/5120 para la fila H.
La interpretación de los resultados es la siguiente: La prueba es positiva cuando se observa una aglutinación que ocupa la mayor parte del pocilio (*) . Una prueba es negativa cuando se observa un botón de bacterias en el centro del pocilio ( * * ) . Un título igual o superior a 320 es una fuerte evidencia de brucelosis, pero debe siempre evaluarse conjuntamente las demás pruebas clínicas antes de emitir un diagnóstico. En zonas endémicas de la enfermedad es frecuente encontrar resultados positivos a títulos inferiores a 320.
Para una evaluación de la prueba se estudiaron internamente 206 sueros de humanos, 85 pertenecientes a controles sanos, y el resto a enfermos de brucelosis en diferentes estadios de la enfermedad, comparándose los (+ ) (Posición 1 de la figura 2) (++) (Posición 2 de la figura 2) resultados obtenidos con el test de la invención y los obtenidos empleando el test de Coombs, utilizando para ello microtécnica. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla I. Es preciso primero aclarar, que en las pruebas serológicas se determina de forma cuantitativa la presencia de anticuerpos por dilución de los sueros en un diluyente adecuado, es decir cuando se indica que un suero es positivo a 320, quiere decir que poniendo una parte de suero en 319 de diluyente la prueba es positiva. Se emplean diluciones dobladas, es decir que en cada ocasión se diluye al doble. Los números que aparecen en la tabla representan hasta aquella dilución de los sueros que estos fueron positivos en cada una de las técnicas, es decir tras diluir el suero del enfermo x veces en su correspondiente diluyente, que el resultado continúe siendo positivo en esta dilución y no lo sea cuando se diluye una vez más.
TABLA I
Para otra evaluación de la prueba se estudiaron internamente 53 sueros de oveja vacunadas con B. melitensis y analizadas 'a los días 0, 30 y 360 de la vacunación. Estos animales y otros fueron infectados con B. melitensis y analizados al día 1, 28, 70 y 336 de la infección. Los resultados pueden verse en la tabla II
TABLA II
** NO APLICABLE; R.B. PRUEBA DEL ROSA DE BENGALA; P: POSITIVO; N: NEGATIVO; DÍAS P.V. : DÍAS POST VACUNACIÓN; DÍAS P.I.: DÍAS POST INFECCIÓN.
Los resultados obtenidos indican que la prueba de la invención es capaz de señalar los animales infectados y que han manifestado síntomas, discrimina animales vacunados que resisten la infección y por último señala animales vacunados que no resisten la infección.
En una prueba externa realizada por el Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad
de Navarra (Catedrático Dr. D. Ramón Díaz) con sueros procedentes de humanos, se compararon el test de la invención con el test .de Coombs empleando microtécnica. Para ello se emplearon muestras de enfermos de brucelosis al inicio de los síntomas de la enfermedad (primera muestra) y cuando ya estaban curados de ella (muestra final) .
TA.BLA III
En estos resultados puede observarse que la prueba es muy eficaz para el diagnóstico de la enfermedad al inicio de
la misma y lo que es más importante que es capaz de diferenciar cuando esta está curada, pues mientras que el test de Coombs, continua siendo positivo en 6 de los trece enfermos, la prueba de la invención sólo es positivo en dos de ellos a títulos mayores de 320.
Claims
1. Test de laboratorio para medir anticuerpos incompletos de brucelosis, aplicable tanto en humanos como en animales, caracterizado porque en una serie de pocilios de tipo ELISA se adicionan 50 μl de un tampón de dilución, adicionando después 5 μl de cada uno de los sueros en el primer pocilio, y procediendo a continuación a una doble dilución poniendo en cada pocilio 50 μl del pocilio anterior, añadiendo entonces en cada pocilio 50 μl de una suspensión bacteriana homogenei∑ada de Brucella abortus o B. melitensis, agitando e incubando finalmente en cámara húmeda y en la obscuridad, procediendo después a leer el resultado con ayuda de un lector de placas de aglutinación.
2. Test de laboratorio, según la reivindicación 1, ca- racterizado porque el tampón de dilución es una solución de acetato sódico 100 mM con un pH de 5.
3. Test de laboratorio, según la reivindicación l caracterizado porque la suspensión de Brucella abortus o B. melitensis está coloreada y muerta por calor y tratamiento con formaldehído al 0,5% y suspendida con 1.% de Dextrano.
4. Test de laboratorio, según la reivindicación 1, caracterizado porque la fase de incubación se realiza, en cámara húmeda y obscura, durante 24 horas a 37 °C.
5. Equipo o it de laboratorio usado para realizar el test descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque consta de: 24 tiras de 8 pocilios de fondo en U o de 12 tiras de 16 pocilios de fondo en U, o de una placa de 96 pocilios de fondo en U, especialmente tratadas para
capturar inmunoglobulinas; 12 mi de suspensión bacteriana de Brucella abortus o B. melitensis coloreada y muerta por calor y tratamiento con formaldehido al 0,5%; 14 mi de diluyente para sueros; 100 μl de suero control positivo con 0,1 % de azida sódica; 100 μl de suero control negativo con 0,1 % de azida sódica.
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|---|---|---|---|
| AU14359/99A AU1435999A (en) | 1997-12-09 | 1998-12-02 | Laboratory test for assaying incomplete antibodies in brucellosis and equipment for carrying out such test |
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| ES9702551A ES2131032B1 (es) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | Test de laboratorio para medir anticuerpos incompletos en brucelosis y equipo para realizarlo. |
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| PCT/ES1998/000327 WO1999030161A1 (es) | 1997-12-09 | 1998-12-02 | Test de laboratorio para medir anticuerpos incompletos en brucelosis y equipo para realizarlo |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2018186731A1 (es) * | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Maroun Cortez Victoria | Kit para prueba de elisa indirecto a base de hapteno nativo crudo y controles liofilizados para diagnóstico confirmatorio de brucelosis bovina en suero sanguíneo y leche por animal y de tanque. |
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- 1997-12-09 ES ES9702551A patent/ES2131032B1/es not_active Expired - Fee Related
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1998
- 1998-12-02 AU AU14359/99A patent/AU1435999A/en not_active Abandoned
- 1998-12-02 WO PCT/ES1998/000327 patent/WO1999030161A1/es active Application Filing
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1435999A (en) | 1999-06-28 |
| ES2131032B1 (es) | 2000-02-01 |
| ES2131032A1 (es) | 1999-07-01 |
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