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WO1999027135A3 - Procede d'identification et d'inhibition de molecules fonctionnelles d'acide nucleique dans des cellules - Google Patents

Procede d'identification et d'inhibition de molecules fonctionnelles d'acide nucleique dans des cellules Download PDF

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Abstract

L'invention concerne deux méthodologies. Dans la première, un moyen pour identifier rapidement et efficacement des gènes fonctionnels et essentiels est prévu. Dans la deuxième, un moyen pour produire des molécules nucléiques biologiquement actives (ribozymes, séquences guides externes et antisens) qui peuvent être utilisées pour l'inactivation de gènes fonctionnels. Dans le premier procédé, une banque de séquences guides externes (EGS) à base de toutes les compositions possibles connues est préparée. Dans un mode de réalisation préféré, les EGS constituent douze ou treize mères pour cibler l'RNase bactérien pour le clivage d'un substrat. Cette banque est ajoutée à des cellules contenant les gènes à cribler, par exemple, E. coli. Les cellules dans lesquelles EGS provoque une perte de viabilité, ou d'autre phénotype, sont identifiées. La ou les EGS responsables de la perte de viabilité sont analysées, et l'information relative à la séquence résultante est utilisée pour l'identification du gène dans des séquences génomiques connues. Dans le deuxième procédé, les molécules nucléotidiques ayant une activité biologique optimale, par exemple, dirigeant le clivage d'un gène particulier par RNase P, sont rapidement identifiées au moyen d'un vecteur comprenant deux gènes reporters, le premier en phase avec le gène en question et le deuxième permettant de vérifier que le vecteur est présent dans une cellule ou facilitant la sélection de cellules contenant le vecteurs. Les cellules dans lesquelles le gène en question est clivé par la molécule oligonucléotidique fonctionnelle peuvent ensuite être identifiées en fonction du gène reporter 1. Les molécules oligonucléotidiques fonctionnelles responsables sont ensuite isolées et caractérisées. Lesdits procédés constituent des outils puissants pour l'identification de gènes essentiels dont la séquence est connue seulement comme faisant partie intégrante d'un génome à fonction inconnue, ainsi que des moyens d'identification de molécules oligonucléotidiques fonctionnelles, utiles comme réactifs diagnostiques et comme agents thérapeutiques.
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