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WO1999009189A1 - Gene codant pour l'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies - Google Patents

Gene codant pour l'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies Download PDF

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WO1999009189A1
WO1999009189A1 PCT/FR1998/001814 FR9801814W WO9909189A1 WO 1999009189 A1 WO1999009189 A1 WO 1999009189A1 FR 9801814 W FR9801814 W FR 9801814W WO 9909189 A1 WO9909189 A1 WO 9909189A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
sequence
androctonine
nucleic acid
plants
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001814
Other languages
English (en)
Inventor
Georges Freyssinet
Richard Derose
Jules Hoffmann
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agro
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CA002301978A priority patent/CA2301978A1/fr
Priority to NZ502951A priority patent/NZ502951A/en
Priority to IL13460998A priority patent/IL134609A0/xx
Priority to AU90766/98A priority patent/AU751263B2/en
Priority to JP2000509852A priority patent/JP2001514898A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a DNA sequence coding for androctonine, a vector containing it for the transformation of a host organism and the method of transformation of said organism.
  • the invention relates more particularly to the transformation of plant cells and plants, the androctonine produced by the transformed plants giving them resistance to diseases, in particular of fungal origin.
  • bactericidal or fungicidal properties in particular against the fungi responsible for plant diseases.
  • the problem consists in finding such substances which can not only be produced by transformed plants, but also conserve their bactericidal or fungicidal properties and confer them on said plants.
  • bactericide or fungicide means both the bactericidal or fungicidal properties proper as well as the bacteriostatic or fungistatic properties.
  • the androctonines are peptides produced by scorpions, especially of the species Androctonus australis. An androctonine and its preparation by chemical synthesis is described by Ehret-Sabatier & coll., As well as its antifungal and antibacterial properties in vitro.
  • genes androctonines could be inserted into a host organism, especially a plant to express a androctonin as for the preparation and isolation of this androctonin as to give the said host organism with properties of resistance to fungal diseases and diseases of bacterial origin, providing a particularly advantageous solution to problem stated above.
  • the subject of the invention is therefore firstly a nucleic acid fragment coding for an androctonine, a chimeric gene comprising said fragment coding for an androctonine as well as regulatory elements in the heterologous 5 ′ and 3 ′ position which can function in an organism host, in particular in plants and a vector for the transformation of host organisms containing this chimeric gene, and the transformed host organism. It also relates to a transformed plant cell containing at least one nucleic acid fragment coding for an androctonine and a plant resistant to diseases containing the said cell, in particular regenerated from this cell. Finally, it relates to a process for growing transformed plants according to the invention.
  • Xaa represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid
  • Xab represents a peptide residue of 5 amino acids
  • Xac represents a peptide residue of 5 amino acids
  • Xad represents a peptide residue of 3 amino acids
  • Xae represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid.
  • Xab and / or Xad and / or Xae comprise at least one basic amino acid, preferably 1.
  • basic amino acids is meant according to the invention the amino acids chosen from lysine, aspargine or homoaspargine.
  • amino acids chosen from lysine, aspargine or homoaspargine Preferably,
  • Xaa represents the peptide sequence Xaa '-Val, in which Xaa' represents NH2 or a peptide residue comprising at least 1 amino acid, and / or Xab represents the peptide sequence -Arg-Xab'-Ile, in which Xab 'represents a residue peptide of 3 amino acids, and / or
  • Xac represents the peptide sequence -Arg-Xac'-Gly-, in which Xac 'represents a peptide residue of 3 amino acids, and / or Xad represents the peptide sequence -Tyr-Xad'-Lys, in which Xad * represents a peptide residue of 1 amino acid, and / or
  • Xae represents the peptide sequence -Thr-Xae ', in which Xae " represents COOH or a peptide residue comprising at least 1 amino acid. More preferably,
  • Xaa represents the peptide sequence Arg-Ser-, and / or
  • Xab represents the peptide sequence -Gln-Ile-Lys-, and / or
  • Xac represents the peptide sequence -Arg-Arg-Gly-, and / or
  • Xad ' represents the peptide residue -Tyr-, and / or Xae' represents the peptide sequence -Asn-Arg-Pro-Tyr.
  • androctonine is represented by the 25 amino acid peptide sequence described the sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO 1) and the homologous peptide sequences.
  • homologous peptide sequences any equivalent sequence comprising at least 65% homology with the sequence represented by the sequence identifier No. 1, it being understood that the 4 cysteine residues and the number of amino acids separating them remain identical , certain amino acids being replaced by different but equivalent amino acids on sites which do not induce a substantial modification of the antifungal or antibacterial activity of the said homologous sequence.
  • the homologous sequences comprise at least 75% of homology, more preferably at least 85% of homology, even more preferably 90% of homology.
  • the NH2-terminal residue of androctonine may have a post-translational modification, for example acetylation. whereas the C-terminal residue can present a post-translational modification. for example an amidation.
  • peptide sequence essentially comprising the peptide sequence of general formula (I) is meant not only the sequences defined above, but also such sequences comprising at one or the other of their ends, or both, residues peptides necessary for their expression and targeting in a host organism, in particular a plant cell or a plant.
  • the peptide fused to androctonine can be a signal peptide or a transit peptide which makes it possible to control and direct the production of androctonine in a specific way in a part of the host organism, in particular of the plant cell or of the plant, such as, for example, the cytoplasm, the cell membrane, or in the case of plants in a particular type of cell or tissue compartment or in the extracellular matrix.
  • the transit peptide can be a chloroplastic or mitochondrial addressing signal, which is then cleaved in the chloroplasts or the mitochondria.
  • the signal peptide can be an N-terminal signal or “prepeptide”, optionally in combination with a signal responsible for the retention of the protein in the endoplasmic reticulum, or an addressing peptide vacuolar or "propeptide".
  • the endoplasmic reticulum is the place where the "cellular machinery" is responsible for the processing of the protein produced, such as for example the cleavage of the signal peptide.
  • the transit peptides can be either single or double, and in this case optionally separated by an intermediate sequence, that is to say comprising, in the direction of transcription, a sequence coding for a transit peptide of a plant gene coding for a plastid localizing enzyme, part of the sequence of the mature N-terminal part of a plant gene coding for a plastid localizing enzyme, then a sequence coding for a second transit peptide of a plant gene coding for a enzyme with plastid localization, as described in application EP 0 508 909.
  • transit peptide useful according to the invention include in particular the PR-l ⁇ tobacco gene signal peptide (WO 95/19443), represented with its coding sequence by the sequence identifier No. 2 (SEQ ID NO 2) and fused to androctonine by sequence identifier No. 3 (SEQ ID NO 3), in particular corresponding to the fusion protein corresponding to bases 12 to 176 of this sequence, in particular when androctonine is produced by plant or plant cells, or the precursor of the factor Mat l when androctonine is produced in yeasts.
  • the present invention therefore firstly relates to a fragment of nucleic acid, in particular DNA, coding for l 'androctonine defined above.
  • nucleic acid fragment is intended to mean a nucleotide sequence which may be of DNA or RNA type, preferably of DNA type. in particular cDNA, in particular double strand.
  • the nucleic acid fragment encoding androctonin is the DNA sequence described by the sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO 1), a homologous sequence or a sequence complementary to said sequence, more particularly the coding part of this SEQ ID NO1, corresponding to bases 1 to 75.
  • homologous is meant according to the invention a fragment of nucleic acid having one or more sequence modifications relative to the nucleotide sequence described by the sequence identifier No. 1 and encoding androctonin. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques, or alternatively by choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. In view of the multiple combinations of nucleic acids which may lead to the expression of a same amino acid, the differences between the reference sequence described by the sequence identifier No. 1 and the counterpart can be significant, especially since it is a question of a DNA fragment size of less than 100 nucleic acids, synthetically feasible.
  • the degree of homology will be at least 70% compared to the reference sequence, preferably at least 80%, more preferably at least 90%. These modifications are generally neutral, i.e. they do not affect the primary sequence of the resulting androctonine.
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) comprising a coding sequence as well as heterologous 5 'and 3' regulatory elements capable of functioning in a host organism, in particular plant cells or plants, linked operably linked to said coding sequence, said coding sequence comprising at least one DNA fragment encoding the androctonine as defined above (including the fusion peptide "androctonine peptide” or “androctonine-peptide”).
  • host organism is meant any mono or multicellular organism. lower or higher, wherein the chimeric gene of the invention can be introduced, for the production of androctonine.
  • These are in particular bacteria, for example E. coll. yeasts, in particular of the genera Saccharomyces or Kluyveromyces, Pichia, fungi, in particular Aspergillus, of a bacylovirus, or preferably plant cells and plants.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant according to the invention means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco, cotton, etc.
  • the regulatory elements necessary for expression of the DNA fragment encoding the androctonin are well known to the skilled person depending on the host organism. They notably include promoter sequences, transcription activators, transit peptides, terminator sequences, including start and stop codons. The means and methods for identifying and selecting the regulatory elements are well known to the skilled person.
  • the regulatory elements are well known to those skilled in the art, and in particular include promoter sequences, trancription activators, transit peptides, terminator sequences and start codons. and stop.
  • a DNA fragment coding for heliomycin is integrated into a shuttle vector which comprises the following elements:
  • an expression cassette made up (1) a promoter regulation sequence
  • yeasts of the species S. cerevisiae are transformed with the expression plasmid by the lithium acetate method (Ito et al., 1993, J. Bacteriol, 153, pp 163-168).
  • the invention relates more particularly to the transformation of plants.
  • promoter regulatory sequence in plants use may be made of any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter of bacterial, viral or plant origin such as, for example, that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit or a plant virus gene such as, for example, that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or a promoter inducible by pathogens like tobacco PR-la, any known suitable promoter that can be used.
  • a promoter of bacterial, viral or plant origin such as, for example, that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit or a plant virus gene such as, for example, that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or a promoter inducible by pathogens like tobacco PR-la, any known suitable promoter that can be used.
  • a promoter of bacterial, viral or plant origin such
  • a promoter regulatory sequence which promotes the overexpression of the coding sequence in a constitutive manner or induced by the attack of a pathogen, such as for example, that comprising at least one histone promoter as described. in application EP 0 507 698.
  • promoter regulatory sequence other regulatory sequences which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators (“enhancer”), such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington & Freed.
  • transcription activators such as for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington & Freed.
  • any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the terminator nos dAgrobacterium tumefaciens, or of plant origin, such as for example a histone terminator as described in the application, can be used.
  • the chimeric gene can also be associated with a selection marker adapted to the transformed host organism. Such selection markers are well known to those skilled in the art. It could be an antibiotic resistance gene, or a herbicide tolerance gene for plants.
  • the present invention also relates to a cloning or expression vector for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene as defined above.
  • This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, at least one origin of replication, and if appropriate an appropriate selection marker.
  • This vector can consist of a plasmid, a cosmid. a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention.
  • transformation vectors as a function of the host organism to be transformed are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the subject of the invention is also a method of transforming host organisms, in particular plant cells by integration of at least one nucleic acid fragment or a chimeric gene as defined above, a transformation which can be obtained by any appropriate known means widely described in the literature and in particular the references cited in this application, especially by the vector of the invention.
  • a series of methods involves bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid at Agrobacte ⁇ um tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods can be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
  • the present invention also relates to host organisms, in particular plant cells or plants, transformed and containing an effective amount of a chimeric gene comprising a coding sequence for androctonine defined above.
  • the present invention also relates to plants containing transformed cells, in particular plants regenerated from transformed cells.
  • the regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to the transformed plants resulting from the culture and / or the crossing of the regenerated plants above, as well as the seeds of transformed plants.
  • the plants thus transformed are resistant to certain diseases, in particular certain fungal or bacterial diseases. Therefore, the DNA sequence encoding androctonin can be integrated with the main objective for producing plants resistant to the said diseases, androctonine being effective against fungal diseases such as those caused by Cercospora, in particular Cercospora beticola ,
  • Cladosporium in particular Cladosporium herbarum, Fusarium, in particular Fusarium culmorum or Fusarium gr amine arum, or by Phylophlhora, in particular Phytophtora cinnamomi.
  • the chimeric gene may also be associated, and advantageously, with at least one selection marker, such as one or more herbicide tolerance genes.
  • the DNA sequence coding for androctonine can also be integrated as a selection marker during the transformation of plants with other sequences coding for other peptides or proteins of interest, such as, for example, herbicide tolerance genes. .
  • the cells and plants transformed according to the invention can comprise, in addition to the sequence coding for androctonine, other heterologous sequences coding for proteins of interest such as other complementary peptides capable of conferring on the plant resistance to other bacterial diseases or fungal, and / or other sequences coding for herbicide tolerance proteins, in particular defined above and / or other sequences coding for insect resistance proteins, such as Bt proteins in particular.
  • the other sequences may be integrated by means of the same vector comprising the chimeric gene according to the invention, which comprises a sequence encoding the androctonine, and comprising at least another gene comprising another sequence encoding another peptide or protein of interest.
  • Plants according to the invention can also be obtained by crossing parents, one carrying the gene according to the invention encoding the androctonine, the other carrying a gene encoding at least one other peptide or protein of interest.
  • the present invention finally relates to a method for culturing transformed plants according to the invention, the method comprising pianter seeds of said transformed plants in an area of a culture medium, in particular a field appropriate for the cultivation of said plants, to apply an agrochemical composition to said surface, without substantially affecting said seeds or said transformed plants, then harvesting the cultivated plants when they reach the desired maturity and possibly separating the seeds from the harvested plants .
  • agrochemical composition comprising at least one active product having one of the following activities, herbicidal, fungicidal, bactericidal, virucidal or insecticidal.
  • the agrochemical composition comprises at least one active product having at least one fungicidal and / or bactericidal, more preferably exhibiting an activity complementary to that of produced by the androctonine transformed plants according to the invention.
  • product having an activity complementary to that of androctonine is understood according to the invention a product having a spectrum of complementary activity, it is to say a product which will be active against attacks of contaminants (fungi, bacteria or viruses) insensitive to androctonin. or alternatively a product whose activity spectrum covers that of the androctonine. totally or in part, and whose application rate will be decreased substantially due to the presence of the androctonin produced by the transformed plant.
  • the present invention therefore also relates to a process for preparing the androctonine, comprising the steps of culturing the transformed host organism comprising a gene encoding androctonin as defined above in a suitable culture medium, and then the total and partial extraction and purification of the androctonine obtained.
  • pRPA-MD-P Creation of a plasmid containing the peptide signal of the tobacco PR-la gene.
  • the two complementary synthetic oligonucleotides Oligo 1 and Oligo 2 below are hybridized at 65 ° C for 5 minutes and then by slowly decreasing the temperature to 30 ° C for 30 '.
  • Oligo 1 5 'GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'
  • Oligo 2 5 'TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 • After hybridization between Oligo 1 and Oligo 2, the single stranded DNA serves as a template for the klenow fragment of E. coli polymerase 1 (under the standard conditions recommended by the manufacturer (New ⁇ ngland Biolabs)) for the creation of the double-stranded oligonucleotide from the 3 'end of each oligo.
  • E. coli polymerase 1 under the standard conditions recommended by the manufacturer (New ⁇ ngland Biolabs)
  • the double-stranded oligonucleotide obtained is then digested with the restriction enzymes Sac11 and Nael and cloned into the plasmid pBS II SK (-) (Stratagene) digested with the same restriction enzymes.
  • a clone is then obtained comprising the region coding for signal peptide of the PR-1a gene from tobacco (S ⁇ Q ID NO 2).
  • pRPA-PS-PRla-andro Creation of a sequence coding for androctonine fused to the signal peptide PR-la without region not transcribed in 3 '.
  • Oligo 3 5 'AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG
  • GTGG 3 'Oligo 4 5' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG
  • a clone is then obtained comprising the region coding for the PR-la-androctonine fusion protein located between the Ncol restriction sites at the N-terminal end and Seal, Sacll and BamHI at the C-terminal end (S ⁇ Q ID NO 3).
  • pRPA-RD-238 Creation of an expression vector in plants comprising the sequence coding for the fusion protein PR-la-androctonine.
  • Plasmid pRTL-2 GUS derived from plasmid pUC-19, was obtained from Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. Not described).
  • This plasmid contains the duplicated CaMV 35S promoter isolated from the cauliflower mosaic virus (CaMV 2x35S promoter; Odell & al., 1985) which directs the expression of an RNA containing 5 'untranslated sequence of the tobacco etch virus (TEV 5'UTR; Carrington & Freed. 1990), the ⁇ -glucuronidase gene from E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) followed by the polyadenylation site of TARN 35S from CaMV (CaMV polyA; Odell & al., 1985).
  • the plasmid pRTL-2 GUS is digested with the restriction enzymes Ncol and BamHI and the large DNA fragment is purified.
  • the plasmid pRPA-PS-PRla-andro is digested with the restriction enzymes Ncol and BamHI and the small DNA fragment containing the region coding for the fusion protein PR-la-androctonine is purified.
  • the two purified DNA fragments are then linked together in an expression cassette in plants which synthesizes a fusion protein PR-la-androctonine.
  • the schematic structure of this expression cassette is represented in FIG. 2.
  • "PR-la-androctonine" represents the coding region for the PR-la-androctonine fusion protein of pRPA-RD-230. Androctonine is transported to the extra-cellular matrix of the plant by the action of the signal peptide PR-la.
  • pRPA-RD-195 Creation of a plasmid containing a modified multiple cloning site.
  • Plasmid pRPA-RD-195 is a plasmid derived from pUC-19 which contains a modified multiple cloning site.
  • the complementary synthetic oligonucleotides Oligo 5 and Oligo 6 below are hybridized and made double stranded according to the procedure described for pRPA-MD-P.
  • Oligo 5 5 'AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3' Oligo 6: 5 'CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGACTCTC AGAG
  • the double-stranded oligonucleotide obtained is then linked in pUC-19 which has been previously digested with the restriction enzymes EcoRI and HindIII and made ends up. Frank using the klenow fragment of DNA polymerase 1 from E. coli.
  • a vector is obtained containing multiple cloning sites to facilitate the introduction of the expression cassettes into a vector plasmid grAgrobacterium tumefaciens. The schematic structure of this multiple cloning site is shown in Figure 3.
  • pRPA-RD-233 Introduction of the PR-la-androctonine expression cassette from pRPA-RD-230 into pRPA-RD-195.
  • the plasmid pRPA-RD-230 is digested with the restriction enzyme HindIII.
  • the DNA fragment containing the PR-la-androctonine expression cassette is purified.
  • the purified fragment is then linked in pRPA-RP-195 which was previously digested with the restriction enzyme HindIII and dephosphorylated with intestinal phosphatase from calves.
  • pRPA-RD-174 Plasmid derived from pRPA-BL-150A ( ⁇ P 0 508 909) containing the bromoxynil tolerance gene from pRPA-BL-237 ( ⁇ P 0 508 909).
  • the bromoxynil tolerance gene is isolated from pRPA-BL-237 by gene amplification by PCR. The fragment obtained is blunt-ended and is cloned into the EcoRI site of pRPA-BL-150A which has been blunt-blown by the action of the klenow polymerase under standard conditions.
  • An Agrobacterium tumefaciens vector is obtained which contains the bromoxynil tolerance gene near its right border, a kanamycin tolerance gene near its left border and a multiple cloning site between these two genes.
  • FIG. 4 The schematic structure of pRPA-RD-174 is shown in Figure 4.
  • nos represents the polyadenylation site of nopaline synthase from Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983).
  • NOS pro represents the promoter of the nopaline synthase of Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983),
  • NPT II represents the gene for the neomycin phosphotransphérase of the transposon Tn5 of E.
  • coli (Rothstein & coll., 1981)
  • 35S pro represents the 35S promoter isolated from the cauliflower mosaic virus (Odell & al., 1985)
  • BRX represents the nitrilase gene isolated from K. o ⁇ aenae (Stalker & al., 1988)
  • RB and "LB” respectively represent the right and left borders of the sequence of a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens.
  • pRPA-RD-184 Addition of a new, unique restriction site in pRPA-RD-174.
  • the complementary synthetic oligonucleotides Oligo 7 and Oligo 8 below are hybridized and made double stranded according to the procedure described for pRPA-MD-P.
  • Oligo 7 5 'CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3'
  • Oligo 8 5 'CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
  • the hybrid double-stranded oligonucleotide (95 base pairs) is purified after separation on an agarose gel (3% Nusieve, FMC). Plasmid pRPA-RD-174 is digested with the restriction enzyme Xmal, and the large DNA fragment is purified. The two DNA fragments obtained are then linked.
  • a plasmid derived from pRPA-RD-174 is obtained comprising other restriction sites between the bromoxynil tolerance gene and the selection marker kanamycin gene.
  • the schematic structure of the plasmid pRPA-RD-184 is shown in Figure 5 where the terms "nos", “NPT II”. "NOS pro”, “35S pro”, “BRX gene”, “RB” and “LB” have the same meaning as in FIG. 4.
  • pRPA-RD-236 Creation of a DAgrobacterium tumefaciens vector containing the construction of the gene coding for androctonine directed towards the extracellular matrix.
  • the plasmid pRPA-RD-233 is digested with the restriction enzymes Pmel and Ascl and the DNA fragment containing the gene for PR-la-androctonine is purified.
  • the plasmid pRPA-RD-184 is digested with the same restriction enzymes.
  • the DNA fragment containing the PR-la-androctonine expression cassette is then linked in pRPA-RD-184. This gives an Agrobacterium tumefaciens vector containing the sequence coding for the PR-la-androctonine fusion protein which leads to the expression of androctonine in the extracellular matrix of the plant.
  • Example 2 Tolerance to herbicides in processed tobacco.
  • the vector pRPA-RD-236 is introduced into the Agrobacterium tumefaciens EHA101 strain (Hood & al., 1987) carrying the cosmid pTVK291 ( Komari & al., 1986).
  • the transformation technique is based on the procedure of Horsh & coll. (1985).
  • the regeneration of PBD6 tobacco (from SEITA France) from leaf explants is carried out on a Murashige and Skoog (MS) base medium comprising 30 g / l of sucrose as well as 200 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the leaf explants are taken from plants cultivated in a greenhouse or in vitro and regenerated according to the technique of leaf discs (Horsh & coll., 1985) in three successive stages: the first comprises the induction of shoots on a medium supplemented with 30 g / 1 of sucrose containing 0.05 mg / 1 of naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 15 days.
  • ANA naphthylacetic acid
  • BAP benzylaminopurine
  • the shoots formed during this stage are then developed for 10 days by culture on an MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but containing no hormone. Then take developed shoots and cultivate them on an MS rooting medium with half content of salts, vitamins and sugar and containing no hormone. After about 15 days, the rooted shoots are put in the ground.
  • MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but containing no hormone. The shoots formed during this stage are then developed for 10 days by culture on an MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but containing no hormone. Then take developed shoots and cultivate them on an MS rooting medium with half content of salts, vitamins and sugar and containing no hormone. After about 15 days, the rooted shoots are put in the ground.
  • an MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but containing no hormone.
  • MS rooting medium with half content of salts, vitamins and sugar and containing no hormone. After about 15 days, the rooted shoot

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Abstract

La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour l'androctonine, un vecteur la contenant pour la trasnformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation. L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, la drosomycine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.

Description

Gène codant pourl' androctonine, vecteur le contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour l'androctonine, un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, l'androctonine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies.
On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques. Les androctonines sont des peptides produits par les scorpions, en particulier de l'espèce Androctonus australis. Une androctonine et sa préparation par synthèse chimique est décrite par Ehret-Sabatier & coll., de même que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro.
On a maintenant identifié les gènes des androctonines, et on a également trouvé qu'ils pouvaient être insérés dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer une androctonine tant pour la préparation et l'isolation de cette androctonine que pour conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine, un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour une androctonine ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des organismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé. Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule, en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention.
Par androctonine, on entend selon l'invention tout peptide pouvant être produit et isolé des scorpions, en particulier de l'espèce Androctonus australis ces peptides comprenant au moins 20 acides aminé, de préférence au moins 25, et 4 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure. De manière avantageuse, l'androctonine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante :
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae
(I) dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xac représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et
Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xae comprennent au moins un acide aminé basique, de préférence 1. Par acides aminé basique, on entend selon l'invention les acides aminés choisis parmi la lysine, l'aspargine ou l'homoaspargine. De manière préférentielle,
Xaa représente la séquence peptidique Xaa' -Val, dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou Xab représente la séquence peptidique -Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xac' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad* représente un reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou
Xae représente la séquence peptidique -Thr-Xae', dans laquelle Xae" représente COOH ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. De manière plus préférentielle,
Xaa' représente la séquence peptidique Arg-Ser-, et/ou
Xab' représente la séquence peptidique -Gln-Ile-Lys-, et/ou
Xac' représente la séquence peptidique -Arg-Arg-Gly-, et/ou
Xad' représente le reste peptidique -Tyr-, et/ou Xae' représente la séquence peptidique -Asn-Arg-Pro-Tyr.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'androctonine est représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues.
Par séquences peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° 1, étant entendu que les 4 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques, certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 75 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 85 % d'homologie, encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.
Le résidu NH2-terminal de l'androctonine peut présenter une modification post traductionnelle, par exemple une acétylation. alors que le résidu C-terminal peut présenter une modification post traductionnelle. par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus, mais également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à leur expression et ciblage dans un organisme hôte, en particulier une cellule végétale ou une plante.
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-androctonine » ou
« androctonine-peptide », avantageusement « peptide-androctonine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de l'androctonine, définie ci-dessus. Le peptide fusionné à l'androctonine peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'androctonine de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante, comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909.
Comme peptide de transit utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-lα du tabac (WO 95/19443), représenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO 2) et fusionné à l'androctonine par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), en particulier correspondant à la protéine de fusion correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence, en particulier lorsque l'androctonine est produite par des cellules végétales ou des plantes, ou le précurseur du facteur Mat l lorsque l'androctonine est produite dans des levures.. La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour l'androctonine définie ci-dessus. Il peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Androctonus australis, ou encore un fragment dérivé, adapté pour l'expression de l'androctonine dans l'organisme hôte où le peptide sera exprimé, le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel & coll. Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN. en particulier ADNc, notamment double brin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO1, correspondant aux bases 1 à 75.
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par l'identificateur de séquence n° 1 et codant pour l'androctonine. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par l'identificateur de séquence n° 1 et l'homologue peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure à 100 acides nucléiques, réalisable par synthèse. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de l'androctonine résultante.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végéales ou les plantes, liés de manière fonctionnelle à ladite séquence codante, ladite séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus (y compris le peptide de fusion « peptide- androctonine » ou « androctonine-peptide »). Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire. inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'androctonine. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coll. de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences. On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc. Les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN codant pour l'androctonine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries, les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop. Pour diriger l'expression et la sécrétion du peptide dans le milieu de culture de la levure, un fragment d'ADN codant l'héliomycine est intégré dans un vecteur navette qui comprend les éléments suivants :
- des marqueurs permettant de sélectionner les transformants,
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans la levure.
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans E. coli,
- une cassette d'expression constituée ( 1 ) d'une séquence de régulation promotrice,
(2) d'une séquence codant pour un peptide signal (ou prépeptide) en association avec un peptide d'adressage (ou propeptide,
(3) d'une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation. Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al., 1992,
Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al, 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10 .
De manière préférentielle, on transforme des levures de l'espèce S. cerevisiae avec le plasmide d'expression par la méthode à l'acétate de lithium (Ito et al., 1993, J. Bacteriol, 153, pp 163-168). L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos dAgrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes. La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication, et le cas échéant un marqueur de sélection approprié. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide. un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention. Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti àAgrobacteήum tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour l'androctonine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187.073, EP 267,159, EP 604 662, EP
672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US
5,489.520, US 5.510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486
234. EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128. La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut être intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, l'androctonine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola,
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium gr aminé arum, ou par Phylophlhora, en particulier Phytophtora cinnamomi.
Le gène chimère pourra également être associé, et de manière avantageuse, à au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides. La séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 1 15 673, WO 87/04181, EP 337 899,
WO 96/38567 ou WO 97/04103. Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour l'androctonine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique, et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides, notamment définies ci-dessus et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes, comme les protéines Bt notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant le gène chimère selon l'invention, lequel comprend une séquence codant pour l'androctonine, et comprenant au moins un autre gène comprenant une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour l'androctonine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer celle codant pour la drosomicine, décrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et par Fehlbaum & coll. (1994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 091 15 déposée le 24 juillet 1997.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procède consistant à pianter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un champ, approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine produite par les plantes transformées selon l'invention.
Par produit présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine. on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité complémentaire, c'est à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons, bactéries ou virus) insensibles à l'androctonine. ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de l'androctonine. totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de l'androctonine produite par la plante transformée.
Enfin, la culture des organismes hôtes transformés permet de produire de l'androctonine à large échelle. La présente invention concerne donc également un procédé de préparation de l'androctonine, comprenant les étapes de culture de l'organisme hôte transformé comprenant un gène codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de l'androctonine obtenue.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour l'androctonine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformées. Les figures 1 à 5 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & coll.
pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac. Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo 2 ci- après, sont hybrides à 65 °C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
Oligo 1 : 5 ' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3 '
Oligo 2: 5 ' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 • Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New Εngland Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et Nael et cloné dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR- 1 a du tabac (SΕQ ID NO 2).
pRPA-PS-PRla-andro: Création d'une séquence codant pour l'androctonine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 3 et Oligo 4 selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.
Oligo 3: 5' AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG
GTGG 3 ' Oligo 4: 5 ' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG
GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 3 '
Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New Εngland Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de l'androctonine (SΕQ ID NO 1) est ensuite cloné directement dans le plasmide pRPA-MD-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction Nael. L'orientation correcte du clone obtenu est vérifiée par séquençage. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine située entre les sites de restriction Ncol à l'extrémité N-terminale et Seal, Sacll et BamHI à l'extrémité C-terminale (SΕQ ID NO 3).
pRPA-RD-238: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine.
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll., 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed. 1990), le gène de la β-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadénylation de TARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PRla-andro est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-androctonine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. « PR-la- androctonine » représente la région codante pour la protéine de fusion PR-la-androctonine de pRPA-RD-230. L'androctonine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide signal PR-la.
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 5 et Oligo 6 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.
Oligo 5: 5 ' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3 ' Oligo 6: 5 ' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3 '
L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et HindIII et rendu bouts francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur άAgrobacterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 3.
pRPA-RD-233: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-androctonine de pRPA-RD-230 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction HindIII. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction HindIII et déphosphorylé avec la phosphatase intestinale de veau.
pRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (ΕP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (ΕP 0 508 909). Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRI de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur dAgrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadénylation de la nopaline synthase dAgrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983). "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase dAgrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. o∑aenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti dAgrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-184; Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD- 174.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.
Oligo 7: 5 ' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3 '
Oligo 8 : 5 ' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3 '
L'oligonucléotide double brin hybride (95 paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme de restriction Xmal, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection. La structure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 5 où les termes "nos", "NPT II". "NOS pro", "35S pro", "BRX gène", "RB" et "LB" ont la même signification que pour la figure 4.
pRPA-RD-236: Création d'un vecteur DAgrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour l'androctonine dirigée vers la matrice extracellulaire.
La plasmide pRPA-RD-233 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et Ascl et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-androctonine est purifié. Le plasmide pRPA-RD-184 est digéré avec les même enzymes de restriction. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est ensuite liée dans pRPA-RD- 184. On obtient ainsi un vecteur dAgrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine qui conduit à l'expression de l'androctonine dans la matrice extracellulaire de la plante. Exemple 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2.1- Transformation
Le vecteurs pRPA-RD-236 est introduit dans la souche dAgrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll. (1985).
2.2- Régénération
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 200 μg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et régénérées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0,05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/ 1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. 2.3- Tolérance au bromoxynil
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-236. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de l'androctonine par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une androctonine.
2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN.
3. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'androctonine est constituée par un peptide pouvant être produit et isolé des scorpions, en particulier de l'espèce Androctonus australis, ledit peptide comprenant au moins 20 acides aminés, de préférence au moins 25 acides aminés, et 4 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure.
4. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendication 1 à 3. caractérisé en ce que l'androctonine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante : Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae
(I) dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de 5 acides aminés. Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
5. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que Xab et/ou Xad et/ou Xae comprennent au moins un acide aminé basique.
6. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce que les acides aminés basiques sont choisis parmi la lysine, l'aspargine ou l'homoaspargine.
7. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que,
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Val, dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou
Xab représente la séquence peptidique -Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xac' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xad représente la séquence peptidique -Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou
Xae représente la séquence peptidique -Thr-Xae', dans laquelle Xae' représente COOH ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce que Xaa' représente la séquence peptidique Arg-Ser-, et/ou
Xab" représente la séquence peptidique -Gln-Ile-Lys-, et/ou Xac' représente la séquence peptidique -Arg-Arg-Gly-, et/ou Xad' représente le reste peptidique -Tyr-, et/ou
Xae' représente la séquence peptidique -Asn-Arg-Pro-Tyr.
9. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'androctonine est représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues.
10. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est représenté par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO1, correspondant aux bases 1 à 75.
1 1. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d* acide nucléique codant pour un peptide de fusion « peptide-androctonine » ou « androctonine-peptide », avantageusement « peptide-androctonine », l'androctonine étant définie selon l'une des revendications 1 à 9.
12. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 11, caractérisé en ce que le peptide fusionné à l'androctonine est être un peptide signal ou un peptide de transit.
13. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 12, caractérisé en ce que le peptide de transit est être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial.
14. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 12, caractérisé en ce que le peptide signal est un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ».
15. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 14, caractérisé en ce que le peptide signal est le peptide signal du gène PR-lα du tabac.
16. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 15, caractérisé en ce que le peptide de fusion « peptide-androctonine » est représenté par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3).
17. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence codante est représentée par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou une séquence complémentaire, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO 3, correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence.
18. Protéine de fusion « peptide-androctonine » ou « androctonine-peptide », de préférence « peptide -androctonine », caractérisée en ce qu'elle est définie selon les revendications 11 à 16.
19. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végéales ou les plantes, liés de manière fonctionnelle à ladite séquence codante, caractérisé en ce que ladite séquence codante comprend au moins un fragment d'ADN codant pour l'androctonine tel que défini selon les revendications 1 à 17.
20. Gène chimère selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, et les cellules végétales et les plantes.
21. Gène chimère selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il est associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé.
22. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène chimère tel que défini selon les revendications 19 à 21.
23. Procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis dans les revendications 19 à 21,
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le gène chimère est intégré au moyen du vecteur selon la revendication 22.
25. Procédé selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, et les cellules végétales et les plantes.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale.
27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'on régénère des plantes à partir des cellules végétales transformées.
28. Organisme hôte, en particulier cellule végétale ou plante, transformé caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère défini selon l'une des revendications 19 à 21.
29. Organisme hôte selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, et les cellules végétales et les plantes.
30. Plantes caractérisé en ce qu'elles comprennent des cellules végétales transformées selon la revendication 29.
31. Plante selon la revendication 30. caractérisé en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules végétales transformées.
32. Plante, caractérisée en ce qu'elle est issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 31.
33. Plante selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz. la canne à sucre, la betterave, le tabac et le coton.
34. Plante selon l'une des revendication 30 à 33, caractérisée en ce qu'elle est résistante aux maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinnamomi.
35. Graines de plantes selon l'une des revendications 30 à 34.
36. Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 30 à 34. ou obtenues par le procédé selon la revendication 27, le dit procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un champ, approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur ladite surface une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les grains des plantes récoltées.
37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide.
38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que le produit actif présente une activité complémentaire de celle de l'androctonine produite par les plantes transformées.
39. Procédé de préparation de l'androctonine définie selon l'une des revendications 1 à 18, comprenant les étapes de culture de l'organisme hôte transformé défini selon l'une des revendications 28 ou 29 dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de l'androctonine obtenue.
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