WO1999007350A2

WO1999007350A2 - Chemoprotektion

Info

Publication number: WO1999007350A2
Application number: PCT/EP1998/004679
Authority: WO
Inventors: Manfred Kubbies
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-07-25
Publication date: 1999-02-18
Also published as: AU9156498A; WO1999007350A3

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen sowie ein extrakorporeales Verfahren zur selektiven Protection von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen.

Description

Chemoprotektion

Die Erfindung betrifft die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen sowie ein extrakorporeales Verfahren zur selektiven Protektion von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen.

Maligne Tumoren stellen ernsthafte Erkrankungen dar, die häufig nicht auf einen Ort beschränkt bleiben. Durch Metastasenbildung kann es zu einem Befall von verschiedenen Geweben und Organen eines Körpers kommen. Maligne Erkrankungen vermindern nicht nur in erheblicher Weise die Lebensqualität eines Patienten, sondern sie nehmen sehr häufig einen tödlichen Ausgang. Es werden deshalb seit vielen Jahren große Anstrengungen unternommen, um verbesserte Arzneimittel und Behandlungsmethoden zu entwickeln, die die Mortalitätsrate verringern oder zumindest die Lebensqualität verbessern und die Lebenserwartung erhöhen.

Die Chemotherapie ist eine häufig angewendete Therapieform zur Behandlung von malignen Erkrankungen. Die heute bekannten Zytostatika umfassen Substanzklassen wie beispielweise Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Naturstoffe, Antibiotika und Hormone. Häufig verwendete Substanzen sind Alkylierungsmittel, die auch als Klastogene bezeichnet werden und zu einer DNA-Quervernetzung fuhren, wie beispielsweise Cis-Platin (CDDP) oder Carbo-Platin.

Obwohl diese Therpeutika eine hohe Zytotoxizität für Tumorzellen aufweisen, können sie oftmals aufgrund der mit ihrer Anwendung verbundenen erheblichen Nebenwirkungen nur in einer therapeutisch suboptimalen Dosierung verabreicht werden. Die Nebenwirkungen sind auf die oft nicht ausreichend spezifische Wirkungsweise dieser Mittel zurückzuführen. So werden bei ihrer Anwendung nicht nur maligne Zellen angegriffen und unschädlich gemacht, sondern es werden auch gesunde Zellen geschädigt. Darüber hinaus kann es nach einer derartigen Therapie zu chronischen Folgeerkrankungen, wie z.B. Niereninsuffizienz, kommen. Selbst Chemotherapie-induzierte maligne Erkrankungen, wie beispielsweise Leukämien werden beobachtet. Dies hat zur Folge, daß eine vollständige Bestätigung von Tumoren in vielen Fällen nicht gelingt. Insbesondere stellt die hämatopoietische Toxizität vieler Chemotherapeutika bei der Chemotherapie den Dosis-limitierenden Faktor dar (Civin, C. L, Csore, S.D., J. Hematotherapy 2 (1993) 137-144).

Die für die Blutbildung wichtigen Zellen sind die hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark. Nur etwa jede hunderttausendste Zelle im Knochenmark ist eine undifferenzierte hämatopoietische Stammzelle, die in der Lage ist, sich zu duplizieren und Tochterzellen zu generieren, die sich in hämatopoietische Linien differenzieren. Eine Schädigung dieser Zellen durch Chemotherapeutika ist somit besonders gravierend für den Organismus.

Cis-Platin ist ein für verschiedene maligne Tumore verwendetes Zytostatikum, das wie praktisch alle Chemotherapeutika erhebliche Nebenwirkungen aufweist. Kubbies, M., et al, Br. J. Cancer 64 (1991) 847-849, konnten zeigen, daß die zytotoxische Wirkung des Cis-Platin auf das Eingreifen in die Gi/S-Phase des Zellzyklus zurückzuführen ist. Bei Studien an peripheren Blutlymphozyten (PBL) konnte gezeigt werden, daß diese Wirkung durch die Anwendung von Glutathion teilweise aufgehoben werden kann.

Neben der klassischen systemischen Behandlung eines Patienten mit Chemotherapeutika, verwendet man heute auch extrakorporeale Behandlungsmethoden. Dabei wird dem Körper maligne Zellen enthaltendes Gewebe bzw. Zellen entnommen. Das entnommene Präparat wird dann in einem weiteren Verfahrensschritt mit zytotoxischen Substanzen inkubiert, um die malignen Zellen zu eliminieren. Die gesunden Zellen werden abgetrennt und gegebenenfalls kultiviert, um eine größere Anzahl von gesunden Zellen zu erhalten, die dann in den Körper reimplantiert werden. Dieses Verfahren wird beispielsweise bei Knochenmarkstumoren angewendet und als "purging" bezeichnet. Auch bei derartigen Verfahren kommt es jedoch zu den oben genannten Nebenwirkungen bei der Verabreichung zytotoxischer Substanzen und folglich zu einer Schädigung gesunder Zellen.

Somit bestand das Bedürfnis, Mittel zu finden, die die Nebenwirkungen bekannter den Zelltod maligner Zellen induzierender Stoffe vermindern, ohne die Wirksamkeit dieser Mittel zu reduzieren. Es bestand des weiteren das Bedürfnis, Mittel bereitzustellen, die es ermöglichen, zytotoxische Substanzen in erhöhten Dosen anzuwenden, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Mittel zur selektiven Chemoprotektion von humanen Zellen, insbesondere von humanen Knochenmarksvorläuferzellen und Stammzellen bereitzustellen, mit dem es möglich wird, gesunde Zellen vor den schädigenden Nebenwirkungen zytotoxischer Mittel zu schützen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen.

Es war überraschend, daß die erfindungsgemäße Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon die negativen Nebenwirkungen von Mitteln zur Induktion des Zelltods maligner Zellen reduziert, jedoch keinen hemmenden Einfluß auf deren Wirkung bei der Induktion des Zelltods maligner Zellen hat. Insbesondere bei der Durchführung von ex vivo Behandlungen zeigt die erfindungsgemäße Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon eine starke Verminderung der durch chemotherapeutische Mittel verursachten Schädigungen nichtmaligner Zellen. Das erfmdungsgemäße Verfahren hat nicht nur den großen Vorteil, daß die zytotoxischen Schädigungen nichtmaligner Zellen vermindert werden, gleichzeitig kann es zu einem synergistischen Effekt mit dem verwendeten Mittel zur Induktion des Zelltods maligner Zellen kommen. Dabei schützt das erfindungsgemäß verwendete Mittel vorzugsweise nicht nur die nichtmalignen Zellen, sondern es kann sogar ihre Proliferation verbessern. Dadurch kann die Anzahl an nichtmalignen Zellen nach dem Abtöten der malignen Zellen gesteigert werden.

Insbesondere bei Zelltypen, die nur in geringem Anteil in einem Gewebe vorhanden sind, wie beispielweise Knochenmarksvorläufer-/Stammzellen, kann bei einer ex vivo Behandlung die Zahl an nichtmalignen Zellen signifikant erhöht werden, die in einen Patienten reimplantiert werden können. Durch das Reimplantieren einer größeren Menge an gesunden Zellen wird wiederum die Wahrscheinlichkeit für einen erfolgreichen Behandlungsverlauf erhöht.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen eine Chemotherapie. Es kommen jedoch auch andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in Betracht, wie beispielsweise intermittierende Chemotherapie, Stoßtherapie, niedrigdosierte Dauertherapie, Hypertheπnie, Strahlentherapie oder nuklearmedizinische Methoden. Besonders bevorzugt umfaßt die Therapie die Verabreichung eines Zytostatikums aus der Gruppe der Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Cyclophosphamid, Trofosfamid, Ifosfamid, Chlorambucil, Melphalan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Busulfan, Cisplatin, insbesondere der DNA-Crosslinker. Am meisten bevorzugt verwendet man als Zytostatikum Cis-Platin oder/und Carbo-Platin. Die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung enthält vorzugsweise L-Cystein als Wirkstoff. Des weiteren kann die pharmazeutische Zusammensetzung physiologisch wirksame Derivate von L-Cystein enthalten, zu denen N-modifizierte Derivate wie etwa N-Acylverbindungen, wie z.B. N-Acetyl-L-Cystein, Carboxyl-modifizierte Derivate, wie etwa Ester oder Amide oder S-modifizierte Derivate, wie etwa S-alkylierte Verbindungen gehören. Vorzugsweise liegt die SH-Gruppe frei vor. Zu Derivaten von L- Cystein gehören auch Precursorsubstanzen, die im Organismus bzw. in der extrakorporealen, zu behandelnden Zellen enthaltenden Flüssigkeit umgesetzt werden und L-Cystein oder/und ein physiologisch wirksames Derivat davon bilden oder freisetzen.

L-Cystein wird in der Niere reabsorbiert und steht dem Körper wieder zur Verfügung. Bevorzugt sind deshalb Wirkstoffe, die sich bezüglich ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften ähnlich wie L-Cystein verhalten. Vorteilhaft ist somit bei einer korporealen Behandlung, daß die Dosis der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen aufgrund dieses "natürlichen Rezyklisierungsprozesses" gering gehalten werden kann. Dies stellt eine Möglichkeit der Kostenreduzierung dar.

Zur korporealen Behandlung eines Organismus kann die pharmazeutische Zusammensetzung in verschiedene galenische Formen gebracht werden, wie beispielsweise Tabletten, Dragees, Lösungen zur Injektion oder Infusionen. Die Verabreichung erfolgt je nach den Erfordernissen systemisch oder lokal. Die Dosis der erfindungsgemäß verwendeten Verbindung wird so eingestellt, daß es zu einer optimalen Wirkung des Chemotherapeutikums bei bestmöglichem chemoprotektiven Schutz durch das erfindungsgemäße Mittel kommt.

Vorzugsweise beträgt die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung von 0,1 bis 1000 mg L-Cystein oder ein physiologisch wirksames Derivat davon pro kg Körpergewicht, besonders bevorzugt von 1 bis 400 mg/kg Körpergewicht.

Die Dosierung des Zytostatikums wird jeweils speziell eingestellt und richtet sich im allgemeinen nach dem verwendeten Zytostatikum, dem Anwendungsgebiet und der verwendeten Therapieform. Durch die Verwendung des L-Cysteins oder eines physiologisch wirksamen Derivats davon können die bei einer üblichen Dosierungshöhe des Zytostatikums auftretenden Nebenwirkungen vermindert oder weitestgehend vermieden werden. Überraschenderweise wird es darüber hinaus möglich, die Dosis des Zytostatikums und damit seine Wirksamkeit zu erhöhen, ohne eine gleichzeitige Erhöhung der Nebenwirkungen in Kauf nehmen zu müssen.

Bei verschiedenen Zytostatika vermindert sich ihre Wirksamkeit bei längerer Anwendung. Um einer Wirkungsreduzierung entgegenzuwirken, muß deshalb mit fortschreitender Behandlung die verwendete Dosis erhöht werden. Dieser Dosiserhöhung stehen jedoch die genannten Nebenwirkungen entgegen. Somit kann die verwendete Dosis nur bis zu einer bestimmten Höchstgrenze gesteigert werden. Durch die erfindungsgemäße Verwendung des Mittels kann überraschenderweise die Dosis des Zytostatikums erhöht werden. Dadurch können die malignen Zellen wirksamer eliminiert werden und dem zeitbedingten Wirkungsverlust des Zytostatikums kann entgegengewirkt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Therapie eine extrakorporeale Behandlung von Zellen. Das verwendete Zystostatikum wird in geeigneten Dosen verwendet, um eine optimale Induktion des Zelltods in malignen Zellen zu erreichen. Vorzugsweise wird Cis-Platin oder/und Carbo-Platin in einer Konzentration von 0,3 bis 30 μg/ml in eine zu behandelnde Zellen enthaltende Suspension eingesetzt.

Der erfindungsgemäß verwendete Wirkstoff wird in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 4 mg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt. Dabei wird als Wirkstoff vorzugsweise L-Cystein in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 3 mg/ml, besonders bevorzugt von 0,1 mg/ml bis 1,5 mg/ml und am meisten bevorzugt von 0,2 mg/ml bis 1 mg/ml eingesetzt. Das als Wirkstoff verwendete N-Acetyl-L-Cystein wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 4 mg/ml, besonders bevorzugt von 0,5 mg/ml bis 2 mg/ml am meisten bevorzugt von 0,9 mg/ml bis 1,5 mg/ml eingesetzt.

Die erfindungsgemäße Zugabe des Wirkstoffs kann vor, während oder/und nach der Zugabe des den Zelltod induzierenden Mittels stattfinden. Die extrakorporeale Behandlung der Zellen kann bei der erfindungsgemäßen Verwendung der selektiv-protektiven pharmazeutischen Zusammensetzung bei jeder geeigneten Temperatur erfolgen, vorzugsweise wird die Behandlung bei einer Temperatur von 20°C bis 42°C, vorzugsweise bei 37°C durchgeführt.

Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff bei Therapieverfahren zur Induktion des Zelltods maligner Zellen jeden bekannten Zelltyps verwendet werden, vorzugsweise werden die zu behandelnden Zellen ausgewählt aus peripheren Blutlymphozyten, Knochenmarkszellen, Subpopulationen davon oder/und hämatopoietischen Stammzellen, vorzugsweise aus Knochenmark. Vorzugsweise stammen die zu behandelnden Zellen aus einem humanen Patienten mit einer malignen Erkrankung. Nach einer extrakorporealen Behandlung können die Zellen dem Patienten reimplantiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Verwendung des Wirkstoffs bei einer Behandlung unter sterilen Bedingungen in Plastikgefäßen, insbesondere in einem oder mehreren flexiblen Plastikgefäßen wie etwa Blutbeuteln durchgeführt. Die Plastikgefäße sind vorzugsweise geschlossen und besitzen mindestens eine Öffnung z.B. ein Ansatzstück für die Verbindungsschläuche. Über diese Verbindungsschläuche, die vorzugsweise aus verschweißbarem Plastikmaterial bestehen, ist mit einem geeigneten Gerät das Verbinden und Trennen von Beuteln auf solche Weise möglich, daß immer ein geschlossenes System erhalten bleibt. Dies führt dazu, daß die Handhabung mit biologischen Substanzen wie beispielsweise Zellen, Viren oder Vektoren unter einem erheblich reduzierten Kontaminationsrisiko möglich ist und sogar auf die Verwendung steriler Werkbänke verzichtet werden kann.

Dadurch wird es möglich, daß einem Patienten über Schlauchverbindungen beispielsweise Blut unter sterilen Bedingungen entnommmen wird und alle extrakorporealen Behandlungsschritte der Zellen in diesem System stattfinden. Diese Behandlungsschritte umfassen Inkubieren, Kultivieren, Einbringen und Entnehmen von Flüssigkeiten oder Zellen aus dem Plastikgefäß sowie gentechnologische Verfahrensschritte. Gegebenenfalls kann das Plastikgefäß mit einem weiteren Lösungen, Zellen, Vektoren etc. enthaltenden Plastikgefäß gekoppelt werden und so die beiden Volumina vereinigt werden. In diesem vereinigtem Volumen können dann Reaktionen, wie beispielsweise eine Transduktion ablaufen. Nach Abschluß der extrakoφorealen Behandlung können die Zellen durch Zentrifugation konzentriert werden und in eine zur Reimplantation geeignete Lösung, die gegebenenfalls gepuffert sein kann, überführt werden. Die so erhaltende Zellsuspension kann wiederum über Schlauchverbindungen steril dem Patienten^' zugeführt werden. Bezüglich der Plastikgefäße und ihrer Verwendung wird ausdrücklich auf die WO 98/07829 hingewiesen.

Darüber hinaus kann die extrakoφoreale Behandlung weiterhin gentherapeutische Verfahrensschritte umfassen. Dazu gehören z.B. eine Transduktion der Zellen, z.B. mit retro- viralen Vektoren, eine Stimulierung der Zellen, eine Kultivierung der Zellen oder/und eine Gewinnung von Zellsubpopulationen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen bei einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in einem Lebewesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Lebewesen eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend L-Cystein oder/und Derivate davon in einer für die selektive Protektion von nichtmalignen Zellen wirksamen Mengen verabreicht.

Die folgenden Beispiele, Publikationen und die Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.

Die Abbildungen stellen folgendes dar:

Abb. 1 Proliferationshemmende und chemoprotektive Wirkung der Verbindungen

Glutathion (GSH), L-Cystein (L-CYS) und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) auf PBL (periphere Blutlymphozyten) nach Aktivierung mit PHA (Phythämagglutinin) und 72 h Inkubation. CDDP Konzentration: 3μg/ml. Der y-Achsen Nullwert repräsentiert die CDDP -Kontrolle. Die Werte für die relative Proliferation errechnen sich aus den Quotienten von proliferie- renden Zellen zu nicht proliferierenden Zellen (BrdU/Hoechst Zell- zyklusanalyse).

Abb. 2 De novo Wirkung bzw. chemoprotektiver Effekt der Verbindungen GSH,

NAC und L-CYS auf CD34⁺ Knochenmarkszellen (KM)-Zellen sortiert nach CD38⁺ und CD38^". Anfangszellzahl 100. Die Verbindungen werden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml bzw. 1 mg/ml zugegeben. CDDP Konzentration: 3 μg/ml.

Abb. 3 Schutzwirkung der Verbindungen GSH, NAC und L-CYS (1 mg/ml) nach zeitverzögerter Zugabe zu CDDP (3 μg/ml) behandelten KM-Zellen. Der y- Achsen Nullwert repräsentiert die CDDP-Kontrolle. Die CD34⁺ KM-Zellen wurden nach 14 Tagen Kultur mittels digitaler Bildanalyse und Trypan- blaufärbung ausgezählt. Ausgangszellzahl: 100 Zellen/Well. Beispiele

Zum Nachweis der Schutzwirkung von L-CYS und NAC wird ihre chemoprotektive und proliferationshemmende bzw. proliferationssteigernde Wirkung auf, auf periphere Blutlymphozyten (PBL) und auf Knochenmarkszellen (CD34⁺) und auf Subpopulationen davon (CD34⁺CD38⁺ und CD34⁺CD38^") untersucht. GSH wird als Vergleichssubstanz verwendet.

Zu den Zellinien werden zum Zeitpunkt der Toxifϊzierung mit 3 μl/ml CDDP die Testsubstanzen GSH, L-CYS bzw. NAC in den Konzentrationen 0,1, 0,5 und 1,0 mg/ml zugegeben und 24 h inkubiert. Die für die Proliferationsanalytik verwendete Brdü/Hoechst-Zell- zyklusanalyse erbrachte die in den folgenden Beispielen dargestellten Ergebnisse.

1. Material und Methoden

1.1 Zellen

1.1.1 Humane periphere Blutlymphozyten

Humane PBL's werden aus frischem, heparinisiertem Vollblut gesunder, erwachsener Spender mittels gebräuchlicher Ficoll-Isolierung gewonnen. Das gewonnene Pellet wird in 1 ml Kulturmedium RPMI 1640; 15% FKS; 1% autologes Spendeφlasma; 2 raM Glutamin; nichtessentielle Aminosäuren (jede 0,1 mM); 1 mM Natriumpyruvat; 2-10^"5 alpha-Thio- glycerol; Aktivierung mit 5 μg/ml PHA zur Brdü/Hoechst Zellzyklusanalyse supplementiert mit 8-10^"5 M Desoxycytidin und 8-10^"5 M Brdü resuspendiert und die Zellzahl mittels Tyφanblau- Vitalfärbung bestimmt.

1.1.2 Humane Knochenmarkszellen

Als Ausgangsmaterial dient humanes Knochenmark aus Sternalpunktaten von Spendern im Alter zwischen 20 und 60 Jahren. Das Knochenmark wird nach Aufarbeitung, Ficoll- Isolierung und Resuspendierung in Einfriermedium Isove's DMEM; 10% FKS, 10% DMSO; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin bei -196°C in flüssigem Stickstoffgelagert. Kultivierung der Knochenmarkzellen

Die CD34+ Knochenmarkpopulationen werden nach dem Auftauen mit einer Zellzahl von 50 bzw. 100 Zellen in 96-Well-Rundbodenplatten mit vorgelegten 100 μl Iscove's Kulturmedium (Iscove's DMEM; 20% humanes AB-Plasma oder 20% FKS; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin) mittels Cellsorter sortiert. Das Medium der KM- Zellen wird mit einem Zytokincocktail (IL3 250 U/ml; IL6 1000 U/ml; EPO 5 U/ml; GM- CSF 100 U/ml; SCF 10 U/ml) supplementiert. Nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C und 7% CO₂ werden die Zellen mit 50 μl Iscove's Kulturmedium, supplementiert mit dem Zytokincocktail, gefüttert.

1.2 Reportermoleküle

Es werden die DNA-spezifische Fluorchrome und die an monoklonale Antiköφer (MAK) gekoppelten Fluorchrome der Tabelle 1 verwendet.

Tabelle 1

MAK (anti-humane Maus Antikörper) konjugiert mit Fluorochrom und deren hauptsächliche Zellspezifität

Tabelle 2

Geräte und Filterkombination für die verwendeten, durchflußzytometrischen Verfahren

Software zur Analyse der Ergebnisse: Lysis2 (Becton Dickinson) MPLUS (Phoenix Flox Systems) Excel 5.0 (Microsoft)

1.3 Nachweisverfahren

1.3.1 BrdU/Hoechst-Zellzyklus- Analyse

Differentielle Zellzyklusanalysen von bis zu drei aufeinanderfolgenden Zellzyklen werden mit Hilfe der BrdU/Hoechst Technik durchflußzytrometrisch bestimmt. Die Analyse wird gemäß den Herstellerangaben und wie in Kubbies, M. (1992), High-resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85 beschrieben, durchgeführt.

1.3.2 Proliferationsstudien humaner, peripherer Blutlymphozyten

Periphere Blutlymphozyten (PBL) befinden sich proliferativ in einer Ruhepase (Go-Phase). Die Lymphozyten werden mit PHA (Phytohämagglutinin) stimuliert und beginnen asynchron nach ca. 30-40 h in die S-Phase des ersten Zellzyklus zu proliferieren. Die Lymphozyten werden mit einer Zelldichte von 3-10⁵ Zellen pro ml BrdU-Medium RPMI 1640, 15% FKS, 1% autologes Spendeφlasma (Vollblut 10 min. bei 400xg zentrifugiert), 2-10^"5M alpha-Thioglyerol, 8-10^"5 M BrdU, 8-10^"5 M Desoxycytidin in 24- Well Platten mit 2 ml Medium pro Well eingesät. Das dem Medium zugesetzte alpha-Thioglycerol dient der Proliferationsverbesserung der PBL (Kubbies, M. et al., Lymphokine Res., 9 (1990), Improvement of human lymphocyte proliferation and alteration of IL-2 secretion kinetics by alpha-thioglycerol, 95-101). Desoxycytidin verhindert mögliche Störungen des Nukleotid- stoffwechsels, welche durch BrdU hervorgerufen werden können.

Nach Zugabe des Chemotherapeutikums und der erfindungsgemäßen Substanz bzw. der Vergleichssubstanz GSH werden die Zellen mit 5 μg/ml PHA stimuliert. Bei den Zeitverzögerungsversuchen werden die Testsubstanzen zu einem späteren Zeitpunkt zugegeben.

Die so behandelten Zellen werden 72 h inkubiert, dann bei 250xg, 10 min zentrifugiert und anschließend gefärbt.

1.3.3 Hoechst/PI (Propidiumiodid)-Färbung

Die bei -20°C tiefgefrorenen Proben werden aufgetaut und bei 250xg 10 min zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 μl RNAse A 1000 U/ml resuspendiert. Dies degradiert die RNA, welche sonst von PI mitgefärbt werden würde. Die resuspendierten Zellen werden nun in 1 ml DNA-Färbepuffer 100 mM Tris 7,4, 154 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 0,2% BSA, 0,1% NP40 mit 1 μg/ml HO33258 aufgenommen und für 15 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert (ca. 0,5 - 1,0- 10⁶ Zellen/ml). Nachfolgend werden 2 μg/ml PI hinzugegeben und nochmals 15 min bei 4°C inkubiert. Die so gefärbten Proben können bei einer Lagerung im Dunkeln, bei 4°C innerhalb von 8 h gemessen werden.

1.3.4 Auswertung

Die Auswertung erfolgt mit Hilfe des Programms MPLUS, wie in Kubbies, M. (1992), High- resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85, beschrieben.

Der Grad der Proliferationshemmung wird aus dem Quotient der Anzahl von proliferieren- den, durch die Anzahl der nicht-proliferierenden Zellen ermittelt (siehe Formeln). Von jedem Ergebnis wird der Wert der Cis-Platin-Kontrolle subtrahiert, so daß diese den y- Achsen Null- Wert darstellt. Die Ergebnisse werden mit dem Normierungsfaktor (für PBL im Versuch "CDDP (Cis-Platin)-Protektion" = 5,5, im Versuch "Zeitverzögerung" = 1,35) so normiert, daß die Kontrolle den relativen Proliferationswert 10 erhält (> 10 = Stimulation; < 10 = Hemmung). Die Größe des Nominierungsfaktors läßt eine Aussage über den prohferativen Zustand der Zellen zu. Je kleiner der Wert, desto mehr Zellen befinden sich nach Ende der Kulturdauer in einem prohferativen Stadium. Bei den PBL zeigt der Wert die spenderabhängige Stimulierbarkeit der Zellen durch PHA an. Je kleiner der Wert desto höher die Anzahl der durch PHA stimulierbaren Zellen.

Formeln:

Synchrone Zellpopulationen Asynchrone Zellpopulationen

RP: relative Proliferation; CP: für die Cis-Platin-Kontrolle ermittelter Wert; %Rx: Prozent der Zellen in dieser Region, alle Regionen zusammen => 100%. NF: Normierungsfaktor.

1.3.5 Färbung des Knochenmarks

Nach dem Auftauen und der Übernachtkultur in 24-Well-Platten werden die Knochenmarkszellen gepoolt und die Zellzahl der mononukleären Zellen mittels Trypanblau- Vitalfärbung bestimmt. Für die Bestimmung der Autofluoreszenz werden 1-5-10⁵ Zellen abgenommen und die restlichen Zellen gefärbt. Dazu werden die Zellen bei 250xg, 10 min zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand verworfen und die Zellen in 100 μl sterilfiltriertem Färbemedium (Waschmedium mit Antiköφer, Iscove's DMEM; 10% FKS; 2 mM Glutamin; 100 IU/ml Penicillin; 1 mg/ml Streptomycin) pro 10⁶ Zellen resuspendiert und 20 min ohne direkte Lichteinstrahlung mit den fluoreszenzmarkierten MAK (Antiköφer: pro 10 Zellen werden 100 μl supplementiert mit 20 μl <CD34>-FITC, 20 μl <CD38>-PE und 5 μl <HLA- DR>-TC) bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wird 10 min bei 250xg zentrifugiert und das Pellet mit Waschmedium gewaschen. Die Zellen werden in einer Dichte von ca. 10 Zellen/ml in Waschmedium aufgenommen und sortiert.

1.3.6 Sortierung der Knochenmarkszellen

Die Sortierung der Zellen erfolgt mit einem Streulicht- und Antiköφer Gates. So wird das erste Gate im Streulichtbild so gesetzt, daß nur lebende Zellen sortiert werden. Mit einer logischen UND Verknüpfung werden im zweiten Schritt im 2-dimensionalen Fluoreszenzbild der FITC- und PE-Fluoreszenzen die Gates so gesetzt, daß die <CD34⁺> KM-Zellen in <CD38⁺> oder <CD38 Populationen sortiert werden können. In einem dritten Bild werden die <CD34⁺> Zellen auf ihre <HLA-DR> Eigenschaften hin analysiert, jedoch nicht nach diesem sortiert.

1.3.7 Digitale Bildanalyse

Die in den 96-Well-Platten mit Rundboden kultivierten KM-Zellen werden mit einem Inversmikroskop und dem Bildanalysesystem Quantimet 570 (Cam-bridge Instruments, Leica) IM (Zeiss) gezählt.

2. Ergebnisse

2.1. Chemoprotektion humaner peripherer Blutlymphozyten

Als Modell für normale, diploide, hämatopoietische Zellen werden humane PBL verwendet. GSH, NAC und L-CYS weisen als solche bei den verwendeten Dosen von 0,1 mg/ml, 0₃5 mg/ml und 1 mg/ml keine proliferationsinhibierende Wirkungen auf. Die gleichzeitige Anwendung von CDDP als Zytostatikum und 0,1 mg/ml GSH, L-CYS bzw. NAC führt nur bei GSH zu einer leichten Protektion mit einer relativen Proliferation von ca. 25% des Kontroll wertes. Bei einer Dosis von 0,5 mg/ml bzw. 1 mg/ml zeigen L-Cys und NAC deutlich bessere CDDP-Protektion als die Vergleichssubstanz GSH. Die protektive Wirkung von L-Cys bei 0,5 mg/ml ist signifikant höher als die von GSH.

Bei einer Konzentration von 1 mg/ml liegen die Werte der relativen Proliferation zwischen 55% (NAC) und 82% (L-CYS) der Kontrollwerte (vgl. beispielhaft Abb. 1). 2.2. Chemoprotektion humaner CD 34⁺-KnochenmarksprogenitorzeIlen

Um den chemoprotektiven Schutz der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen auf die heterogene Population der CD34⁺-KM- Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden diese in zwei phänotypische Populationen nämlich in CD38⁺- und CD38^"-KM-Zellen sortiert. Die CD34⁺/CD38^"-Zellpopulation stellt dabei kaum differenzierte, sehr frühe KM- Vorläuferzellen/Stammzellen dar. Die CD34⁺/CD38⁺-Zellpopulation enthält hauptsächlich CFU-Zellen (colony forming units) und unter anderem schon Myeloblasten, Erythroblasten und Lympho- blasten (Terstappen, W. M. M., et al., Blood 77 (1991) 1218-1227).

Um eine weitere analytische Differenzierung der sortierten Zellen vornehmen zu können, wird zusätzlich noch das Vorhandensein des aktivierungskorrelierten Histokompatibilitäts- antigen HLA-DR durchflußzytometrisch bestimmt. Der Anteil der CD34⁺-Zellen an der Gesamtheit der mononukleären Zellen betrug durchschnittlich 1,2% (± 0,3, n=6). Hiervon betrug der Anteil der CD38⁺, HLA-DR⁺ Zellen durchschnittlich 73% (±7,0), der CD38⁺, HLA-DR^" Zellen 4% (±1,1), der CD38^", HLA-DR⁺ Zellen 20% (± 5,5) und der CD38^", HLA- DR^" Zellen 3% (± 0,7).

Es wird eine Zellzahl von 50 oder 100 KM-Zellen in 96- Well Rundbodenplatten sortiert und anschließend L-CYS, NAC bzw. die Vergleichsverbindung GSH und CDDP gleichzeitig ins Kulturmedium gegeben. Bei einer Kultivierungsdauer von 14-16 Tagen erfolgt die Zellzählung mit Hilfe digitaler Bildanalyse und zusätzlich mittels Trypanblau- Vitalfärbung und Zählkammer.

Abb. 2 zeigt die Ergebnisse der Zeilproliferation und Chemoprotektion von Zellen eines repräsentativen KM Spenders. Bei unterschiedlichen Spendern ist im allgemeinen eine leichte Variation der Proliferation zu erkennen.

Ein Vergleich der Zellzahlen am Tag 15 nach Beginn der Behandlung veranschaulicht die unterschiedliche Wirksamkeit der Testsubstanzen am deutlichsten.

KM CD34⁺ CD38⁺ Zellen:

Die Vergleichssubstanz GSH kann weder bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml noch bei 1 mg/ml die KM-Zellen vor der zytotoxischen Wirkung von CDDP schützen. Sogar die Gabe von GSH alleine ohne CDDP führt zu einer Reduzierung der Zellzahl auf ca. die Hälfte (0,5 mg/ml GSH) bzw. einer Zellzahl, die nahezu der Negativkontrolle (CDDP) entspricht.

L-CYS hat dagegen bei einer Konzentration von 1 mg/ml eine starke protektive Wirkung. Die Zellzahl bei gleichzeitiger Gabe von CDDP und L-CYS (1 mg/ml) beträgt ca. 70% des Kontrollwertes. L-Cys alleine führt zu keiner signifikanten Reduzierung der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollwert. NAC zeigte dagegen keine protektive Wirkung.

KM CD34⁺ CD38 Zellen:

Die Vergleichssubstanz GSH zeigt in diesem Fall geringe protektive Wirkung gegenüber CDDP. Bei einer gleichzeitigen Gabe von CDDP und GSH sind lediglich ca. 15% (1 mg/ml GSH) bzw. ca. 25% (0,5 mg/ml GSH) der Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle vorhanden. Die Gabe von GSH alleine ohne CDDP führt zu einer Reduzierung der Zellzahl auf ca. die Hälfte (0,5 mg/ml GSH) bzw. einer Zellzahl, die nahezu der Negativkontrolle (CDDP) entspricht.

Dagegen beträgt die Zellzahl bei einer Gabe von 0,5 mg/ml NAC, 1 mg/ml NAC bzw. 1 mg/ml L-CYS eine erhöhte Zellzahl um 50%o, die gleiche Zellzahl bzw. eine Erhöhung um ca. 100%) im Vergleich zur Kontrolle. Sowohl NAC als auch L-CYS zeigen bei gleichzeitiger Gabe mit CDDP in allen verwendeten Konzentrationen eine starke protektive Wirkung gegenüber CDDP. Bei den unterschiedlichen verwendeten Konzentrationen der Wirksubstanzen werden ca. 70 bis 55% der Zellen vor der zytotoxischen Wirkung des CDDP geschützt.

2.3. Chemoprotektion bei zeitverzögerter Zugabe der Schutzsubstanzen

Mit der zeitverzögerten Zugabe der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen L-CYS und NAC zu CDDP behandeten Zellen konnte gezeigt werden, daß die chemoprotektive Wirkung nicht auf einer direkten Reaktion mit CDDP im Kulturmedium beruht (vgl. Abb.3).

Bei den getesteten Knochenmarkszellen ist schon bei den Substanzkontrollen eine starke Wachstumsverbesserung durch L-CYS zu beobachten, während GSH und NAC auf die CD34⁺ KM-Progenitorzellen inhibierend wirken. Bei der Zugabe von GSH und NAC ist nur ein leichter Schutz der Zellen beim 0 h Wert erkennbar und bei 14 h ist kein signifikanter Schutz im Vergleich zu der CDDP Kontrolle erkennbar. L-CYS zeigt dagegen bei 0 h, 1 h und 4 h eine gute Schutzwirkung (noch ca. 60% der Zellzahl der Kontrolle bei einer Zugabe nach 4 h). Selbst bei einer L-CYS Gabe nach 14 h können noch ca. 25% der Zellen vor der zytotoxischen Wirkung von CDDP geschützt werden.

Tabelle 3 Zusammenfassung der chemoprotektiven Effekte der Testsubstanzen

* kein Gegenstand der Erfindung ++ guter bis vollständiger Schutz + leichter Schutz — kein Schutz

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Untersuchungen nochmals zusammengefaßt. Daraus ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen NAC und L-CYS sowohl proliferationssteigemde als auch chemoprotektive Eigenschaften bei der Behandlung von KM-Zellen und peripheren Blutlymphozyten (PBL) zeigen.

Es zeigt sich weiterhin eine Überlegenheit in der proliferationssteigernden und chemoprotektiven Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen NAC und L-CYS im Vergleich zu der aus dem Stand der Technik bekannten Substanz GSH.

Referenzliste

Civin, C. L, Csore, S.D., J. Hematotherapy 2 (1993) 137-144

Kubbies, M. (1992), High-resolution cell cycle analysis: the flow cytometric bromodeoxyuridine-hoechst quenching technique, in: A. Radbruch (Hrsg.): Flow cytometry and cell sorting, Springer Verlag, Berlin, S. 75-85

Kubbies, M. et al., Lymphokine Res., 9 (1990)

Kubbies, M., et al., Br. J. Cancer 64 (1991) 847-849

Terstappen, W. M. M., et al., Blood 77 (1991) 1218-1227

WO 98/07829

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von L-Cystein oder/und Derivaten davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie eine Chemotherapie umfaßt.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie die Verabreichung eines Zytostatikums aus der Gruppe der Alkylierungsmittel, insbesondere der DNA-Crosslinker umfasst.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zytostatikum Cis- Platin oder/und Carbo-Platin verwendet.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung L-Cystein oder/und N-Acetyl-L-Cystein als Wirkstoff enthält.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie eine extrakoφoreale Behandlung von Zellen umfaßt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Cis-Platin oder/und Carbo-Platin in einer Konzentration von 0,3 bis 30 μg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 4 mg/ml in eine die zu behandelnden Zellen enthaltende Suspension eingesetzt wird.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff L-Cystein in einer Konzentration von 0,01 mg/ml bis 3 mg/ml, vorzugsweise von 0,1 mg/ml bis 1,5 mg/ml, besonders bevorzugt 0,2 mg/ml bis 1 mg/ml eingesetzt wird.

10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff N-Acetyl-L- Cystein in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 4 mg/ml, vorzugsweise von 0,5 mg/ml bis 2 mg/ml am meisten bevorzugt von 0,9 mg/ml bis 1,5 mg/ml eingesetzt wird.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einer Temperatur von 20°C bis 42°C, vorzugsweise bei 37°C erfolgt.

12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnden Zellen ausgewählt werden aus peripheren Blutlymphozyten, Rnochenmarkszellen, Subpopulationen davon oder/und hämatopoietischen Stammzellen, vorzugsweise aus Knochenmark.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnden Zellen aus einem humanen Patienten mit einer malignen Erkrankung stammen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen nach der Behandlung dem Patienten reimplantiert werden.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung unter sterilen Bedingungen in einem oder mehreren flexiblen Plastikgefäßen durchgeführt wird.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die extrakoφoreale Behandlung weiterhin gentherapeutische Verfahrensschritte umfaßt. .

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die gentherapeutischen Verfahrensschritte eine Transduktion der Zellen umfassen.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit viralen Vektoren transduziert werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die gentherapeutischen Verfahrensschritte eine Stimulierung oder/und Kultivierung der Zellen umfassen.

20. Extrakoφoreales Verfahren zur selektiven Protektion von nichtmalignen Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods von malignen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß vor, während oder/und nach der Therapie der Zellen L-Cystein oder/und ein Derivat davon zugegeben wird.

21. Verfahren zur selektiven Protektion nichtmaligner Zellen während einer Therapie zur Induktion des Zelltods maligner Zellen in einem Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Lebewesen eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend L- Cystein oder/und Derivate davon in einer für die selektive Protektion nichtmaligner Zellen wirksamen Menge verabreicht.