WO1999003493A1

WO1999003493A1 - Medicaments contenant midkine en tant principe actif ou inhibiteurs desdits medicaments

Info

Publication number: WO1999003493A1
Application number: PCT/JP1998/003161
Authority: WO
Inventors: Tohru Takada; Kazuhiro Toriyama; Hisako Muramatsu; Takashi Muramatsu
Original assignee: Meiji Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 1999-01-28
Also published as: DE69835016T2; CA2296409C; KR20010021814A; JP2010215673A; KR100571010B1; EP0998941A4; EP0998941B9; DE69835016D1; CN1306435A; EP0998941A1; US20030072739A1; CN1287852C; CA2296409A1; US7390491B2; AU8131098A; AU756279B2; ATE330620T1; EP0998941B1

Description

ミッドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤技術分野

本発明は、好中球の機能を調節するための、ミツドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤に関する。これら薬剤は、好中球機能異常症や炎症性疾患などの好中球に関連した疾患の治療などに利用される。背景技術

好中球は、顆粒球の一つであり、遊走能、貪食能、殺菌能などの機能を有し、細菌や真菌などの感染から生体を防御するという重要な役割を担っている。好中球に関連して、いくつかの疾患が知られている。

好中球において上記の一つ又は複数の機能が障害されている好中球機能異常症としては、例えば、好中球遊走不全症であるなまけもの白血球症候群（lazy- leu kocyte syndrome/走化性欠損白血球症候群ともいう）が知られている。この疾患では、好中球は骨髄中に正常に存在するが、末梢血中では好中球が顕著に減少しており、好中球の遊走能の低下がみられる。しかしながら、好中球機能異常症については、その患者数が非常に少なく、現在この疾患に適用されるような薬剤は流通していない。

また、他の好中球が関連した疾患としては、炎症性疾患が挙げられる。炎症反応は、起炎刺激（細菌などの異物や物理化学的刺激など）により生じた組織障害に対する生体防御反応である。炎症反応は、基本的には生体から有害な刺激を排除し、局所の構造、機能を回復させる反応であるが、この場合に活性化されるシステムは正常な組織、細胞にとっても障害性のあるものであり、強く発現された炎症反応は病的現象として治療の対象となる。炎症反応は、 1 ) 感染部位への血液供給量の増大、 2 ) 血管内皮細胞の反応による血管透過性の亢進、 3 ) 白血球、特に好中球や一部のマクロファージの毛細血管から組織中への移行および感染部位への遊走、という 3つの主要な過程からなり、結果として好中球やマクロファージの集積、浸潤を呈する。このため好中球の機能の抑制は、炎症反応を制御するための有力な手段であると考えられている

抗炎症薬は、非特異的抗炎症薬（ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬）と特異的抗炎症薬（抗リウマチ薬、抗痛風薬、免疫抑制薬など）に分類され、様々な薬剤が開発されている。慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis, R A)においては、薬物治療は、鎮痛 ·抗炎症剤 (non-steroidal anti-inf lammator y drugs, NSAIDs) を第 1選択薬とし、抗リウマチ薬 (disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs) 、ステロイド剤などを用いて行われている。しかし、 NSAIDs投与による急性胃粘膜病変（acute gastric mucosal lesions, AGML) の発現が問題となり、 AGMLを回避する目的でプロドラッグ化される場合が多い。

近年、 13kDaのへパリン結合性タンパクであり、レチノイン酸応答性遺伝子の産物として、ミツドカイン（M K ) が発見された。ミツドカインの機能として、胚の神経の生存維持、分化及び神経突起の伸張を促進すること、特定のセルラインに対して分裂を促進すること（Muramatsu，H. et al . , Biochem. Biophys.Res. Co 腿 un. 177 ： 652-658 ， 1991 ; Michikawa,M. et al . , J.Neurosci .Res. 35 ： 53 0-539 , 1993; Muramatsu,H. et al . , Dev. Biol . 159 ： 392-402 , 1993) 、胚発生の制御に関与していること (Kadomatsu,K. et al . , J. Cel l . Biol . 110 ： 607 -616 ， 1990; Mitsiadis et al . , Development 121 ： 37-51 , 1995) 、抗ミツドカイン抗体がインビトロにおいて歯芽の分化を阻害すること（Mitsiadis，T.A. et al . , J. Cell . Biol . 129 ： 267-281 , 1995 )などが示されている。

さらに、組織の修復や疾患におけるミツドカインの重要性も、徐々に明らかになってきている。多くのヒトの癌でミヅド力インの発現が調べられた結果、胃癌、大腸癌、膝臓癌、肺癌、胸部癌、及び肝臓癌のような様々な癌においてミツドカインの発現が増強していることが判明した（Tsutsui，J. et al., Cancer Res. 53

： 1281-1285 ， 1993; AridomeJ. et al., Jap. J. Cancer Res. 86 ： 655-661, 1995; Garver,R.I. et al., Cancer 74 ： 1584-1590 , 1994)。また、ミツドカインの高レベルの発現は神経芽細胞腫の患者の予後不良と相関があり（Nakagawara, A. et al., Cancer Res. 55 ： 1792-1797 ， 1995)、ほとんどのアルツハイマー病の老人斑にミツドカインが集積しており（Yasuhara，0. et al., Biochem. Biophy s. Res.Commun. 192 ： 246-251 , 1993)、脳梗塞の初期の段階の浮腫領域にミツドカインが発現する（Yoshida，Y. et al, Dev. Brain Res. 85: 25-30 , 1995)ことなどが明らかになつている。これらの知見により、ミツドカインが、組織の修復及び疾患を引き起こす組織の異常性に関連している可能性が高まった。発明の開示

本発明は、好中球の機能を調節するための新規な薬剤、特に好中球機能異常症の治療、好中球の走化性及び走触性の増加、炎症性疾患の治療のための新規な薬剤を提供することを課題とする。

最近になって、ミッドカインが血管内皮細胞のプラスミノーゲンァクチべ一夕一の活性を高めること、そして炎症部位への細胞の移動、癌の浸潤及び血管新生での細胞の移動に重要である線維素溶解活性を高めることが明らかとなった（Koj ima,S. et al., J.BioLChem. 270 ： 9590-9596 , 1995)。そして、ミツドカインが炎症の最初の段階、すなわち白血球動員の引き金になることも示されている（Τ imothy,A.S., Cell 76 ： 301-314 , 1994)。ミツドカインに関するこれらの知見に刺激されて、本発明者らは、慢性関節リウマチ (rheumatoid arthritis: R A) や変形性関節症（osteoarthritis: OA) に関連した炎症像においてミツドカインの発現を解析した。その結果、ミツドカインが好中球が深く関与する炎症状態において高いレベルを示すことを見出した。また、本発明者らは、好中球の遊走に対するミッドカインの効力を検討し、基質結合型のミッドカインが好中球の遊走を刺激することを見出した。

さらに、本発明者らは、このようにミツドカインと好中球の遊走との密接な関係、およびミツドカインと炎症との密接な関係が見出されたことから、ミツドカイン若しくはその阻害剤を利用して好中球の機能を調節することにより、好中球の機能に関連した疾患、例えば、好中球機能異常症や炎症性疾患の治療を行うことが可能であることを見出した。

即ち、本発明は好中球の機能を調節するための、ミツドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤に関し、より具体的には、

( 1 ) ミツドカインを有効成分として含む、好中球の走化性を刺激するための薬剤、

( 2 ) 好中球の走化性が走触的機構によるものである、（ 1 ) に記載の薬剤、

( 3 ) ミツドカインを有効成分として含む、好中球機能異常症治療剤、

( 4 ) ミツドカインに対する阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患治療剤、

( 5 ) 炎症性疾患が慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、（4 ) に記載の炎症性疾患治療剤、

( 6 ) ミツドカインに対する阻害剤が抗ミツドカイン抗体である、（4 ) に言己載の炎症性疾患治療剤、

( 7 ) ミツドカインに対する阻害剤がミツドカインアン夕ゴニス卜である、 ( 4 ) 記載の炎症性疾患治療剤。に関する。

なお、本発明において「好中球機能異常症治療剤」とは、好中球機能異常症を治療するための薬剤の他、好中球機能異常症の増悪を軽減するための薬剤も含むまた、本発明において「炎症性疾患治療剤」とは、炎症性疾患を治療するための薬剤の他、炎症性疾患の増悪を軽減するための薬剤も含む。

本発明のミッドカインを有効成分として含む薬剤は、好中球の走化性を刺激することができる。走化性（化学走性）とは、好中球をはじめとする白血球が、走化性因子の濃度勾配に伴って、炎症部位（感染部位）に遊走し集合する過程をいう。好中球は、この遊走の後、細菌などの微生物を吸着し、取り込んで（食菌）、様々な機構によりそれを殺菌する。このように、走化性は、好中球がその機能を発揮するための重要な過程である。またさらに、遊走の機構としては、走化的機構および走触的機構が考えられる。走化的機構においては、化学誘因物質は、それが産生される場所、すなわちその濃度が最も高い場所から拡散できる液性因子であり、細胞は化学誘因物質の濃度が増大する方向へ遊走するのに対して、走触性機構においては、化学誘因物質は、血管内皮細胞又は細胞外マトリックスに付着しており、細胞は化学誘因物質の密度が最も高い領域に向かって遊走する。本発明者らによって、ミツドカインは走化的機構ではなく、走触的機構により作用することが示された。

また、本発明のミツドカインを有効成分として含む薬剤は、好中球機能異常症を治療するために用いることができる。好中球の機能は遊走能、貪食能、殺菌能に大別されるが、好中球機能異常症とは、これらの一つ又は複数の機能が障害されている状態をいう。その例としては、好中球遊走不全症であるなまけもの白血球症候群（lazy- leukocyte syndrome/走化性欠損白血球症候群ともいう）が挙げられる。上記のように本発明者らによって、ミツドカインが、好中球の遊走を刺激することが見出された。従って、機能、特に遊走能が不全となった好中球にミッドカインを作用させることにより、本来の機能を回復させることができると考えられる。

好中球機能異常症を治療するための本発明の薬剤は、好中球の機能を増大させることができる他の因子と組み合わせて使用することも可能である。そのような因子としては、例えば G— C S F (顆粒球コロニー刺激因子）、 G M— C S F (顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、 I L— 8 (イン夕一ロイキン一 8 ) 、 M - C S F (マクロファージコロニ一刺激因子）が挙げられる。

本発明の薬剤において使用されるミツドカインは、ヒト由来（特開平 9- 95454号公報、実施例参照）、マウス由来 (Kadomatsu, K. et al .， Biochem. Biophys. Res. Co匪 un.， 151, 1312-1318, 1988) 、又はラット由来など哺乳動物由来のものであれば何れでも良い。また、本発明において使用されるミツドカインは、ミッドカインもしくはその生物活性を発現するミツドカインの部分べプチドの一部のアミノ酸が置換、欠失した誘導体又は類縁体をも包含する。さらにまた、本発明のミツドカインは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。

一方、本発明のミツドカインに対する阻害剤を有効成分として含む薬剤は、炎症性疾患の治療に適用することができる。本発明者らにより、ミツドカインは炎症性疾患において高濃度に存在することが示された。当技術分野において周知の通り、炎症には好中球の遊走が深く関与している。このため、ミヅド力インに対する阻害剤は、好中球の遊走の抑制効果により、炎症を治療することができると考えられる。炎症性疾患とは、炎症が原因と考えられるか、結果として炎症を併発するか、つまり、病態として炎症症状を随伴する疾患である。高等動物の炎症は刺激に対応する一連の微小循環系の反応により特徴づけられる。すなわち、通常の炎症では、微小循環系は一過性に収縮した後、拡大し、通常は閉じている毛細血管床が開き、血流量が増加する。さらに、細静脈領域の内皮細胞間隙が開くことにより、この間隙を通じて血漿成分が組織間質へ滲出する血管透過亢進現象が起こる。この血管透過亢進は普通 2相性に起こり、第 1相はヒスタミンまたはセロトニンによって起こる弱い反応であり即時型透過と呼ばれ、第 2相の遅延型透過が炎症における血管透過の主体をなす。引き続いて、多核白血球、単球（組織内に遊出したあとはマクロファージと呼ばれる）、リンパ球などが、やはり細静脈領域から組織間質へと放出する。これらの血漿成分、細胞成分によって生成される活性因子系の作用が組織細胞の増殖を促し、修復へと導く。この一連の過程は古くから発赤（rubor) 、疼痛（dolor) 、発熱（calor) 、腫脹（tumor) として記載されてきた。基本的には炎症は局所の防衛反応であるが、組織傷害作用をも示しうるので、機能障害も炎症の主徴に加えられる。炎症反応は局所組織、細胞の変性、循環障害、増殖が組み合わさった複合反応であり、その動的過程全体をさす。このような種々の側面のうち、どの様相が強いかにより、変質性炎、滲出性炎、増殖性炎に分類され、その経過により、急性炎、慢性炎に分類される。炎症性疾患の例として、慢性関節リウマチ（R A ) や変形性関節症（O A) が挙げられる。

本発明において好適に使用されるミッドカインに対する阻害剤としては、例えば、適当な濃度のへパリン（Kaneda,N. et al .， J. Biochem. 119， 1150-1156

( 1996 )参照）、ミッドカインの結合部位を奪って活性を抑えるヒト · リュードカン (Human Ryudocan) (Koj ima, T. ,Katsumi ,A. ,Yamazaki, T. ,Muramatsu,T. ,Naga saka，T. , 0hsumi，K.， and Saito，H.， J. Biol . Chem. 271， 10, 5914-5920( 1996 )参照）が挙げられるが、抗ミツドカイン抗体が最も好ましい。抗ミツドカイン抗体は、ポリクロ一ナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。

ポリクロ一ナル抗体は、以下のような方法により作成することができる。適当な方法で生産した組換えヒト型ミツドカインをフロイントの完全アジュバント

(FCA) と等量混合し、均一な乳濁液（ェマルジヨン）を得る。これをゥサギ（二ュ一ジ一ランドホワイト、 2500〜3000gr. ) の 70%アルコール綿で消毒した皮下 1 0ケ所程度に注入し、初回免疫とする。 2回目以降の免疫には、アジュバントとしてフロイントの不完全アジュバント（FIA) を使用する。免疫は、 2週間に 1回の割合で行い、 3回目の免疫終了後、 1週間経過したところで、予備採血を行う。得られた血液を 4°C、 1600回転で遠心し、血清を得る。この血清中のヒトミッドカインに対する抗体価を測定する。抗体価の充分な上昇が確認されたら、計 4〜5 回の免疫終了後、全採血を実施する。得られた血液は、同様に 4°C、 1600回転で遠心し、血清とする。この血清をプロテイン Aを利用して精製する。プロテイン A 製後、ヒトミツドカイン夕ンパクを固相化したァフィ二ティ一精製用カラムを利用して、抗血清のァフィ二ティー精製を行う。このような過程でゥサギ抗ミツド力インポリク口一ナル抗体の作製は行われる。但し、免疫動物は、ゥサギに限定されるものではなく、同様な手法で様々な動物に免疫して抗体を得ることが可能である。

また、モノクローナル抗体は、ケ一ラーとミルスタインの方法（Kohler, G. a nd C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) によって作成できる。

さらに、抗ミツドカイン抗体には、ヒト化抗体（野ロ浩、東隆親：抗体工学によるキメラ抗体の作製とその応用、 Medical Immunol. 22 ： 628-638 , 1991、野ロ浩：キメラ抗体 · ヒト型化抗体の原理と臨床応用、医学のあゆみ 167 :457-4 62 ， 1993、中谷知右、野ロ浩：抗体のヒト化、フアルマシア 33 ： 24-28 ， 19 97参照) 、ヒト抗体（Chothia， et al Nature, 324, 877( 1989), Roguska,M.L. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. ,91,969(1994)、 Winter, G. et al.,Annu.Re v.I腿 unol.，12,433(1994)、 Lonberg,N. et al.，Nature，368, 856(1994)参照）、又はキメラ抗体 (Morrison, S.L. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.，81, 6851(198 4)、野ロ浩、東隆親、 Medical I誦 unology, 22,628(1991)参照）も含まれる。

抗ミッドカイン抗体の作製において用いられるミヅドカインは、ヒト由来（特開平 6- 217778号公報参照) 、マウス由来 (Kadomatsu, . et al., Biochem. Bio phys. Res. Co腿 un.， 151, 1312-1318, 1988) 、又はラット由来など哺乳動物由来のものであれば何れでも良い。また、抗ミツドカイン抗体の作製において用いられ抗原としては、ミツドカインの生物活性を発現するミッドカインの部分ぺプチドであってもよく、また、ミツドカインまたはその部分ペプチドの一部のアミノ酸が置換、欠失した誘導体又は類縁体であってもよい。さらに、抗原として用いるミツドカインは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。

また、ミツドカインアン夕ゴニストは、例えば、好中球の活性化に重要であるアミノ酸配列を同定し、該配列を欠失させることにより、作製することができる。本発明の薬剤の有効成分であるミッドカインまたはその阻害剤を、好中球の走化性を刺激するため、好中球機能異常症を治療するため、または炎症性疾患の治療を行うために投与する場合の投与量は、患者の性別、体重、症状などにより変化するが、一般に、一日当たり 0.；！〜 lOOOmgであり、 1回から数回に分けて投与することができる。投与形態としては、水溶液で、又は薬学的に許容される担体と混合して、静脈内注射、皮下注射、又は筋肉注射により投与することが好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、滑液中の Kの酵素免疫測定の結果を示すグラフである。当アツセィにおける MKの検出限界は 9pg/mLであった。便宜上、検出限界以下の場合には、図の一番下にプロッ卜することとした。

図 2は、変形関節炎（RA) の活動性の炎症性の滑液を持った患者の炎症を起こした滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す顕微鏡写真である。 Aは滑膜内細胞と新生血管の間の領域の染色を示し、 Bは滑膜の管壁細胞の染色を示し、 Cは新生血管の血管内皮細胞の染色を示す。顕微鏡の倍率は、 Aについては 104倍、 Bおよび Cについては 208倍であった。

図 3は、滑膜組織の抽出物のウエスタンプロット解析を示す写真である。レーン 1は OA患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン 2は RA患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン 3は非活動性の滑膜炎の組織、レーン 4は人工関節への置換を行った患者から得られた組織学的に重大な炎症を伴わない滑膜組織に関する。

図 4は、 MK反応性の好中球移動の程度を示すグラフである。 MKは表示された濃度で下方のゥエルに加えられた。 MKと共に 3時間ィンキュベ一トした後フィル夕一の下側表面に移動した好中球の数をプロットした。結果は、測定野当たりの移動した細胞数の平均値として表されている。なお、斜線は、濃度勾配のない測定視野当たりの細胞数の平均値を示す。

図 5は、 MKによる好中球遊走のチェッカ一ボード解析の結果を示す図である。デ一夕は 1視野当たりの移動した細胞数の平均値土標準偏差（n = 4 ) で表した。図 6は、走触的機構のアツセィにおける好中球移動の濃度反応曲線を示す図である。走触性のアツセィ（白四角）ではフィル夕一の下側の表面を予め MKでコ一トし、走化的機構のアツセィ（黒菱形）では、フィル夕一の両側を予め MKでコ一卜し、陰性コントロール（白丸）としては、フィル夕一の上側の表面を予め MKでコ一トした。 30分間のィンキュベ一シヨンの後フィル夕一の下側の表面に移動した好中球の数をプロットした。結果は測定野当たりの移動した細胞数の平均値として表した。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施例を記載するが、本実施例は本発明を制限するものではない。

実施例 1 E L I S Aによるミッドカイン（以下、「M K」と称する）の検出滑液を、 OA又は RAの炎症性滑膜炎のヒト患者（26〜72歳、平均年令 52歳）から吸引によって採取し、 ELISA法によって、滑液中の MKを検出した（Muramatsu,H. et al .， J. Biochem. 119 ： 1171-1175 ， 1996)。 3名の健常人の滑液中には、 MK は検出されなかったが、 6名の RA患者全ての滑液中に MKが検出され（図 1、 62〜 10000pg/ml )、 6名の OA患者中 4名の滑液中にも有意な量の MKが含まれていた (図 1、検出限界以下〜 1225pg/ml) 。従って、本発明者らは、滑液中の MKの存在と、滑膜炎の炎症状態とは有意に関連した現象であると結論づけた。

実施例 2 免疫組織化学による M Kの検出

滑膜の組織を、 3人の RA患者及び 2人の OA患者の全膝部分から採取した。全ての生検標本は過形成の炎症骨膜組織を含んでいた。それは、滑膜内層細胞の増殖、リンパ球及びマクロファージの広範囲にわたる浸潤、そして多数の血管新生によつて組織学的に特徴づけられるものであった。免疫組織化学をムラマツらの方法 (Muramatsu,H. et al . , Dev. Biol . 159 ： 392-402， 1993) に従って行った。まず、標本を、中性緩衝ホルマリン液で固定し、ついでパラフィン中に包埋し、固定した標本を 5龍の厚さにスライスした。次に、切片を、 0.2%牛血清アルブミンと 2%正常ャギ血清を含む PBSに溶解した抗ヒト MK抗体（15mg/fflL) とともに 4 °Cで一晩インキュベートした。なお、抗ヒト MK抗体は、ペプチド研究所から購入した化学合成ヒト MKを用いて、ムラマツらの方法（Muramatsu，H. et al .， J. Biochem. 119 ： 1171-1175 ， 1996参照）に従ってゥサギで作製した。コントロールの切片は、 2%になるように牛血清を添加した PBSか又は正常ゥサギ血清とともにィンキュペートした。ついで切片を、ピオチン化ャギ抗ゥサギ抗体（希釈、 1 : 250/P BS) とともにインキュベートした後洗浄し、アビジン-ピオチン-ペルォキシダ一ゼ複合体（ベクター 'ラボラトリーズ In 、 Burlingame,U. S.A. ) とともにインキュペートした。ペルォキシダーゼを、 1 %過酸化水素を含む 3-ァミノ- 9-ェチルカルバゾ一ル（AEC) とともにインキュベートすることによって発色させた。

2名の RA患者から得られた標本においては、滑膜管壁細胞と新生血管との間の領域が、抗 MK抗体によって広範囲に染色された（図 2 A) 。興味深いことに、滑膜の管壁細胞（図 2 B) 及び毛細血管内皮細胞（図 2 C) が MKで強く染色されることが見出された。 RA患者の 1名では、染色性が他の患者の場合ほど強くなかったが、それは病状が活発な状態でなかったためであると考えられる。 OA患者の炎症性滑膜の 2例では、抗 MK抗体での免疫染色性は、 RA患者の炎症性滑膜の染色性とほぼ同様であった。健常人の滑膜は解析のために入手することができなかったため、人工関節置換の、炎症性の滑膜の症状のない患者の生検材料を調べた。その結果、これらの標本では免疫染色性は検出されなかつた。

実施例 3 ウエスタンブロット解析による M Kの検出

さらに、滑膜組織抽出物のウエスタンプロット解析を行った。サンプルをレムリィーの方法 (Laemmli,U.K. , Nature 227 ： 680-685 ， 1970) に従って SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ゲル中のタンパク質をトーウィンらの方法 (Towin,H. et al .， Proc. Natl . Acad. Sci . USA. 76 ： 4350-4354 ， 1979) に従つてニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、スキムミルクを 5%になるように添加したダルベッコのリン酸緩衝液（phosphate- buffered saline : PB S) 中で 4 °C一晩インキュベートした後、室温で 2時間、希釈した抗ヒト MK抗体

(5%スキムミルク溶液で 20mg/mLに調製）とともにインキュベートした。ニトロセルロース膜を 0.1%トウィーン 20を含む PBSで洗浄した後、西洋ヮサビペルォキシダーゼを結合したァフィ二ティ一精製抗ゥサギ IgG (ジャクソン ·ィムノリサ一チ 'ラボラトリーズ Inc.、ボルチモア、アメリカ合衆国）とともにインキュベー卜し、ついで 4-クロ口- 1-ナフトールで染色した。

OA患者の活動性の炎症滑膜炎症例の抽出物中に高いレベルの MKが検出された

(図 3、レーン 1 ) 。 RA患者の活動性の滑膜炎の炎症部位の MKレベルは中程度であった（図 3、レーン 2 ) が、当該患者の活動性でない炎症性部位の MKレベルは低かった（図 3、レーン 3 ) 。人工関節の患者及び炎症性の滑膜炎でない患者の滑膜には MKは検出されなかった（図 3、レーン 4 ) 。従って、免疫反応性の物質は、 MKであることが確証された。さらに、免疫組織化学で観察された MKの発現の強さが炎症の激しさに相関するという傾向は、ウエスタンブロット解析においても観察された。

実施例 4 ヒト好中球の遊走に対する MKの効力

炎症反応の初期の段階での白血球の動員における MKの役割を評価するために、好中球に対する MKの走化性を調べた。健常人の末梢血から好中球を分離するために、末梢血を Ficoll-Hypaque比重遠心法によって分画した (VenailleJ. J. et a 1. , Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54 ： 385-391， 1994) 。細胞を RPMI1640培養液で洗浄した後、ヒト AB型血清を 10%濃度で補充した RPMI 1640培養液で 2.5χ10^β細胞/ mLの細胞濃度に調製した。 MKによって誘導される好中球の遊走は、上方のチャンバ一として用いたケモ夕キシセル（( 1^111(^& 611/クラボゥ( 0. (1.大阪、日本）で測定した。このケモ夕キシセルは、ポリカーボネィトフィルタ一を装着したボイデンチヤンバーと全く同一のものである。下方のチャンバ一として、 24ゥエル（穴）のプレート（3047、ファルコン J を使用した。 MKを 10%AB型血清を含んだ RPMI1640培養液で希釈し 24ゥエルプレートに加え、ついで同培養液中の好中球（5xl0⁵個）をケモ夕キシセルに加えた。チャンバ一を、 5%C0₂インキュベータ一中、 37°Cの湿潤下 3時間インキュベートした。 5〃mのフィルターを通って移動した細胞を、 100%エタノールで固定し、染色し、それからカウントした。カウントは各々のアツセィで 10視野（ォリンパス AX80マイクロスコープ、拡大 400倍）行つた。また、各々のサンプルは 3連でアツセィを行った。データは平均土標準偏差として表現した。下方のチャンバ一に入れられた MKは上方のチャンバ一に入れられた好中球の遊走を刺激することが判明した（図 4 ) 。好中球を誘引する MKの至適濃度は 10ng/mL (危険率 pく 0.01) であった（図 4 ) 。

さらに、 MKに応答する好中球の遊走能が走化性因子の濃度勾配を認識して方向性をもって移動する運動（走化性）であるか、又は方向性を持たずに無秩序に動きまわる運動（化学運動性）であるかを判別するためにチェッカーボード解析を実施した (Zigmond, S.H. , and Hirsch,J. G. , J. Exp. Med. 137 ： 387-410 , 197 3) 。その結果を図 5に示す。

図から、上方チャンバ一から下方チャンバ一に向かって、 M Kの濃度勾配が高くなる場合に、細胞数が増加していることが明らかであり、このことから M Kが走化活性を有すると判断される。

実施例 5 M Kの走化性の機構

細胞の運動性は接着依存的結果 (Timothy,A. S.， Cell 76 ： 301-314 ， 1994) であり、 Kは、細胞表面へパラン硫酸プロテオグリカン（EleniusJ. et al. , J. Cell. Biol . 114 ： 585-595 , 1991) のファミリ一であるシンデカン（Mitsiadis, T.A. et al . , Development 121 ： 37-51 ， 1995; o ima, T. et al. , J.Biol, C hem. 271， No.10 : 5914-5920 ( 1996)) と強く結合するので、基質結合型 MKが好中球の移動を促進する能力についても検討した。すなわち、 MKが溶解性型（走化的機構）又は基質結合型（走触的機構）のいずれで機能するかを決定するために、ロット (Rot, A. , Eur. J. Immunol . 23 ： 303-306 , 1993) の記載に従い、走触的のアツセィを行った。

第一段階として、走触的機構のアツセィ系においては、下方のゥエルに MK ( In g/mLから 100ng/mL) を満たすことにより、膜の下側の表面を MKでコートし、そして対応する上方のゥヱルには RPMI1640培養液を満たすことにより、 MKの正の勾配 ^positive haptotactic gradients; を確立した。

陰性コントロールとしては、もう一つのセッ卜の上方のゥエルを K (lngから 1 OOng/mL) で満たすことにより膜の上側の表面を MKでコートし、、対応する下方のゥエルを RPMI1640培養液で満たすことによって負の勾配（negative haptotactic gradients) を確立した。

M Kの走化的機構のアツセィ系においては、上方と下方の両方のゥエルを RPM1 1640培養液で満たした（chemotactic gradients) 。

それそれを 37°Cで 20分間ィンキュペートした後、上方のチヤンバーとポリ力一ボネートフィル夕一からなるケモ夕キシセルを、フィル夕一に結合していない MK (溶解性型の MK) を除去するために、 RPMI溶液で入念に洗浄した。

第 2段階として、走触的機構のアツセィ系および陰性コントロールでは、 10% AB血清を含む RPMI溶液で、上下のゥエルを満たした。一方、走化的機構のアツセィ系では、底のチャンバ一において K ( Ing/mL〜： lOOng/mL) を添加した。

好中球（5xl0⁵ ) を、第 2段階の各上方のゥルに入れ、好中球の移動度について、 37°C、 30分間のインキュベーションの間にフィル夕一を通して移動した細胞の数をカウントすることによって計測した。カウントは各アツセィで 10視野ずつ、各サンプルは各々 3連でアツセィした。全ての結果は、好中球の数士標準偏差として表した。

その結果、走触的機構のアツセィにおいては、フィル夕一に結合した MKは低濃度（Ing/mL (危険率 pく 0.01 )) においてさえ、わずか 30分のインキュベーションの後、好中球の遊走を刺激した（図 6、白四角）。走化的機構のアツセィにおいては、 30分のインキュベーションの後、好中球の遊走の刺激は検出されなかった (図 6、黒菱形）。遊走の刺激は、陰性コントロールでも検出されなかった（図 6、白丸）。これにより、ミツドカイン刺激による好中球の遊走は、走触的機構によるものであることが示された。産業上の利用の可能性

本発明により、ミツドカインまたはその阻害剤を有効成分とする、好中球の機能を調節するための新規な薬剤が提供された。これにより、好中球の遊走を刺激して、好中球機能異常症の治療を行ったり、また、好中球の遊走を抑制して炎症性疾患の治療を行うことが可能となった。

Claims

請求の範囲

1 . ミツドカインを有効成分として含む、好中球の走化性を刺激するための薬剤。

2 . 好中球の走化性が走触的機構によるものである、請求項 1に記載の薬剤。

3 . ミッドカインを有効成分として含む、好中球機能異常症治療剤。

4 . ミツドカインに対する阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患治療剤。

5 . 炎症性疾患が慢性関節リゥマチまたは変形性関節症である、請求項 4に記載の炎症性疾患治療剤。

6 . ミツドカインに対する阻害剤が抗ミツドカイン抗体である、請求項 4記載の炎症性疾患治療剤。

7 . ミツドカインに対する阻害剤がミツドカインアン夕ゴニストである、請求項 4記載の炎症性疾患治療剤。