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WO1999002730A1 - Procede de detection d'adn au moyen d'une sonde de pna - Google Patents

Procede de detection d'adn au moyen d'une sonde de pna Download PDF

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WO1999002730A1
WO1999002730A1 PCT/JP1998/003077 JP9803077W WO9902730A1 WO 1999002730 A1 WO1999002730 A1 WO 1999002730A1 JP 9803077 W JP9803077 W JP 9803077W WO 9902730 A1 WO9902730 A1 WO 9902730A1
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WO
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dna
pna
probe
nucleotide sequence
target nucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/003077
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English (en)
French (fr)
Inventor
Isao Karube
Shinya Sawata
Ryohei Nagata
Original Assignee
Dai Nippon Printing Co., Ltd.
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Filing date
Publication date
Application filed by Dai Nippon Printing Co., Ltd. filed Critical Dai Nippon Printing Co., Ltd.
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Publication of WO1999002730A1 publication Critical patent/WO1999002730A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting DNA using PNA (peptide nucleic acid) as a probe.
  • PNA peptide nucleic acid
  • probe DNAJ The complementary DNA used to detect the target DNA is called “probe DNAJ or simply“ probe ”.
  • Detection of target DNA using probe DNA is used for detection of pathogenic bacteria, gene cloning, and the like.
  • a decrease in DNA detection sensitivity is observed due to a decrease in salt in the hybridization solution.
  • the hybridization had to be performed in a buffer solution with a certain salt concentration.
  • preparation of such a buffer solution involves complicated operations, which has been one of the factors that hinder simplification of this detection method.
  • the present inventors have now found that the use of the probe PNA instead of the probe DNA significantly improves the detection sensitivity of the DNA detection method by the hybridization method.
  • the decrease in the detection sensitivity of DNA in the hybridization method is caused by the negatively charged phosphorus atom and the like in the DNA molecule.
  • the DNA force ⁇ It appears that electrical repulsion occurs between the target DNA and the hybridization of both DNAs, preventing detection sensitivity.
  • the significant improvement in detection sensitivity appears to be due to the lack of electrical repulsion between the target DNA and the probe PNA.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleotide sequence using a probe whose detection sensitivity has been significantly improved.
  • the method for detecting a target nucleotide sequence comprises hybridizing a target nucleotide sequence with a PNA complementary to a part or all of the target nucleotide sequence, and measuring the degree of hybridization.
  • Figure 1 shows the chemical structures of DNA and PNA.
  • 7 cartridge block
  • 71 measuring cell
  • 72 measuring cell
  • 72 measuring cell
  • 72 measuring cell
  • 73 flow path
  • 8 light source
  • 80 incident light
  • 9 detection!
  • ⁇ 90 reflected light
  • 10 measuring chip.
  • FIG. 2 shows a surface plasmon resonance biosensor.
  • 1 transparent substrate
  • 2 metal film
  • 3 organic material layer
  • 4 avidin
  • 5 biotin
  • 6 probe PNAo
  • Figure 3 shows a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor.
  • FIG. 4 shows the DNA sequence encoding the type II vector of pathogenic E. coli 1-157.
  • FIG. 5 shows the relationship between the amount of the amplification product and the resonance signal when the chain length of the sample DNA is 143 bp. ⁇ Indicates 10 cycles, ⁇ indicates 20 cycles, ⁇ indicates 25 cycles, ⁇ indicates 30 cycles, and ⁇ indicates 40 cycles.
  • FIG. 6 shows the relationship between the amount of amplification product and resonance signal when the chain length of the sample DNA is 256 bp.
  • FIG. 7 shows the relationship between the amount of amplification product and the resonance signal when the length of the sample DNA is 284 bp.
  • Figure 8 shows the amount of amplification product and resonance signal when the chain length of the sample DNA was 391 bp. This shows the relationship between files.
  • FIG. 9 shows the relationship between the chain length of the sample DNA and the resonance signal.
  • FIG. 10 shows a surface plasmon resonance biosensor.
  • PNA is a mimic of DNA. Like DNA, PNA has nucleobases such as adenine, guanine, cytosine, and thymine in its molecule, and specifically hybridizes with nucleotide sequences having complementary nucleobases. Thus, PNA is functionally very different from DNA, but its structure is completely different.
  • PNA has a basic skeleton consisting of N- (2-aminoethyl) glycine as a unit (Fig. 1), and contains no sugar or phosphorus atom in the molecule. Therefore, it is electrically neutral and does not charge even under salt-free conditions. Nucleobases are linked to the polyamide backbone via methylene carbonyl ( Figure 1).
  • PNA can be synthesized by the Fmoc-type peptide solid-phase synthesis method, the tBoc-type peptide solid-phase synthesis method, or the like, like the peptide. Also, it is custom-made by commission.
  • target nucleotide sequence that can be detected by the detection method of the present invention is not particularly limited as long as at least a part of the sequence is known.
  • target nucleotide sequences include DNA encoding the pathogenic Escherichia coli verotoxin, DNA encoding the HIV outer coat protein gp120, and the specific nucleotide sequence of various 16S rRNAs.
  • cDNA DNA derived from a substance such as DNA encoding a substance-binding protein of methicillin-resistant staphylococcus (MRSA), and DNA related to a human genetic disease.
  • MRSA methicillin-resistant staphylococcus
  • the target nucleotide sequence may contain contaminants.
  • a heat-treated product of pathogenic Escherichia coli may be used as a detection sample as it is.
  • the target nucleotide sequence is detected by the surface plasmon resonance biosensor described below. If it is detected, it is desirable to amplify the target nucleotide sequence by polymerase chain reaction (PCR) after detection.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR conditions are not particularly limited. If the concentration of the nucleotide sequence in the sample is too low, a sufficient resonance signal cannot be detected, and if the concentration of the nucleotide sequence in the sample is too high, Also, the strength of the resonance signal detected by the interaction between nucleotide sequences decreases. Therefore, the cycle of PCR is preferably set to 20 to 25.
  • the method for detecting DNA of the present invention can take any form as long as hybridization between the probe PNA and the target nucleotide sequence is used.
  • a preferred embodiment is a detection method using a surface plasmon resonance biosensor.
  • a surface plasmon resonance biosensor used in the method for detecting a target nucleotide sequence of the present invention and a measurement chip used therefor will be described.
  • FIG. 2 shows an example of a surface plasmon resonance biosensor used in the present invention.
  • This surface plasmon resonance biosensor has a cartridge block 7, a light source 8, and a detector 9, and is used by installing a measurement chip 10 having a probe PNA 6 fixed on the cartridge block 7. .
  • a concave portion is provided on the upper surface of the cartridge block 7, and the concave portion and the measuring chip 10 are constituted by a measuring cell 71.
  • the measurement cell 71 communicates with the outside of the force cartridge block 7 through the flow paths 72 and 73, and the sample flows into the measurement cell 71 through the flow path 72 and is used for measurement. It is discharged to the outside through 73.
  • a reflected light intensity curve that forms a valley for a certain incident angle ⁇ is obtained.
  • the valley in the reflected light intensity curve is due to surface plasmon resonance. That is, when light is totally reflected at the interface between the transparent substrate of the measurement chip 10 and the outside, a surface wave called an evanescent wave is generated on the interface, and a surface wave called a surface plasmon is also generated on the metal film. Occurs. When the wave numbers of these two surface waves match, resonance occurs, which is used to excite a partial surface plasmon of the light energy, and the intensity of the reflected light decreases.
  • Heni bM angle of incidence ⁇ is said resonance signal, representing a 1 0 4 Heni spoon as 1 RU.
  • the measurement chip 10 may be any one that has a transparent base and a metal film necessary for surface plasmon resonance and can fix the probe PNA on the metal film.
  • a measurement chip for BIA c0re20000 manufactured by Shea Biosensor Co., Ltd. can be used, it is preferable to use a measurement chip having a structure as shown in FIG.
  • a metal film 2 and an organic material layer 3 are formed on a transparent substrate 1, on which avidin 4 is immobilized, and on which a probe PNA 6 labeled with biotin 5 is attached. Fixed.
  • the transparent substrate 1 is not particularly limited as long as it is used for a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor.
  • a material that is transparent to laser light such as glass, polyethylene terephthalate, and polycarbonate, can be used strongly, and a material that does not show anisotropy to polarized light and has excellent workability is desirable. Its thickness may be on the order of 0.1 to 20 mm.
  • the metal film 2 is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur.
  • the types of metals that can be used for this metal film include gold, silver, copper, aluminum, platinum, and the like. These can be used alone or in combination.
  • an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the transparent substrate 1 and a layer made of gold, silver, or the like.
  • the thickness of the metal film 2 is preferably in the range of 100 to 200 angstroms, and particularly preferably in the range of 200 to 600 angstroms. If it exceeds 300 ⁇ , the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected.
  • the thickness of the intervening layer is preferably 5 to 50 angstroms.
  • the metal film 2 may be formed by a conventional method, for example, a sputtering method, a vapor deposition method, a ion plating method, an electroplating method, an electroless plating method, or the like. Among these methods, the sputtering method is preferably used.
  • the organic substance layer 3 is a layer composed of a substance capable of binding to both metal atoms and avidin molecules.
  • the thickness of the organic material layer 3 is preferably from 10 to 200 angstroms, and particularly preferably from 10 to 50 angstroms.
  • the probe PNA may be immobilized on the organic substance layer 3 using a covalent bond such as an ester bond or an amide bond other than the avidin-biotin bond.
  • the organic material layer 3 can be formed using a silane coupling agent, a compound having a mercapto group and another organic functional group (hereinafter, simply referred to as a “thiol compound”), and an LB (Langmuir project). ) It can also be formed by the method.
  • the film formed by the LB method has a weak point that the bonding ability to the metal film is weaker than the film formed by the silane coupling agent / thiol compound, but it can be applied to a wide range of substances.
  • Another advantage is that the number of avidins 4 to be bound per unit area can be increased because they can be formed.
  • Examples include rimethoxysilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethyl silane, 3-mercaptopropyl trimethoxysilane, and dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane.
  • thiol compounds include mercaptoaminomethane, 2-mercapto-111-aminoethane, 3-mercapto-1-aminopropane, 4-mercapto-1-1-aminobutane, 1,1,1-triamino-2-mercaptoethane, and mercapto acid , 2-mercaptopropionic acid, 3-mercaptobutyric acid, 4-mercaptovaleric acid, 1,1,1-triamino-3-mercaptopropane, etc., among which are polyfunctional substances and the binding site to avidin It is preferable to use 1,1,1,1-triamino-12-mercaptoethane, 1,1,1,1-triamino-3-mercaptopropane, etc.
  • Substances applicable to the LB method include 21-aminodocosanoic acid, stearylamine, and polylysine.
  • a method of forming an organic substance layer using a silane coupling agent a method in which a metal film is exposed to saturated vapor of a silane coupling agent for a predetermined time (saturated vapor method), a method in which a solution containing a silane coupling agent is used.
  • saturated vapor method a method in which a metal film is exposed to saturated vapor of a silane coupling agent for a predetermined time
  • a method in which a solution containing a silane coupling agent is used.
  • Immersion method immersion method using spin coater (spin coating method), method using gravure printing machine (gravure method), etc.
  • organic substances using thiol compounds As a method for forming the layer 3, a saturated vapor method, an immersion method, a spin coating method, a gravure method, or the like can be used.
  • the immobilization of avidin 4 on the organic substance layer 3 is achieved by bringing a predetermined amount of avidin 4 into contact with the organic substance layer 3 for a predetermined time.
  • a transparent substrate 1 on which an organic material layer 3 is formed is placed on a flow cell type surface plasmon resonance biosensor, and a constant flow rate of avidin 4 is flowed for a predetermined time (a predetermined amount). It is.
  • Avidin 4 and the probe PNA 6 labeled with biotin 5 examples include the ink jet method and the microdispenser method.
  • the ink jet method is advantageous in that a droplet containing the probe PNA6 can be accurately ejected to an extremely small area, and the immobilized probe PNA6 can be used effectively.
  • the measurement can be performed by installing a measurement chip on a flow cell type surface plasmon resonance biosensor and flowing a predetermined probe PNA 6 for a predetermined time (a predetermined amount).
  • This immobilization method is advantageous in that avidin 4 and probe PNA6 can be immobilized by a series of operations.
  • As a method of labeling the probe PNA6 with biotin 5 a method in which the PNA chain is extended to biotin by a solid phase peptide synthesis method is used.
  • Detection of DNA by the surface plasmon resonance biosensor is performed by flowing a sample containing the target DNA into a measurement cell of the sensor. At this time, it is strongly preferable that the DNA concentration in the sample is 0.1 to 1.
  • the salt concentration is 150 to 30 OmM in order to detect DNA with higher sensitivity than that in which no salt is present in the sample and DNA can be detected even under the conditions. The power is good.
  • the target nucleotide sequence is not limited to one type, and may be two or more types. Detection of two or more target nucleotide sequences can be performed by immobilizing multiple PNAs on a single chip or by immobilizing multiple chips on a sensor. By detecting two or more types of target nucleotide sequences in this manner, the accuracy of detection can be improved.
  • the surface plasmon resonance biosensor to be used is preferably of a type capable of freely moving the measurement chip in the horizontal direction. By using such a sensor, the signal of the sample on the chip can be measured with the optical system fixed.
  • a 5% avidin solution was poured into a measurement cell of a commercially available surface plasmon resonance biosensor (Biacore 2000, manufactured by Pharmacia Biosensor) at a flow rate of 5 ⁇ 1 / min for 7 minutes, and avidin was fixed to the measurement chip.
  • a commercially available surface plasmon resonance biosensor (Biacore 2000, manufactured by Pharmacia Biosensor) at a flow rate of 5 ⁇ 1 / min for 7 minutes, and avidin was fixed to the measurement chip.
  • the following PNA which is complementary to a part of the DNA encoding type II beta H ((SEQ ID NO: 1, FIG. 4) and has biotin bound at the 5 ′ end, was synthesized (Nippon PA. The synthesis was commissioned to Septive Co., Ltd.)
  • the solution (10 zM) containing the probe PNA was poured into the measurement cell of the biosensor at a flow rate of 11Z for 50 minutes, and the probe PNA was immobilized on the measurement chip via avidin. After that, 5 OmM NaOH was poured into the measuring cell and washed.
  • CAGTTATACCACTCTGCAACG (SEQ ID NO: 3)
  • Sense primer 1 GCCGGGTTCGTTAATACGGCA (l ⁇ ij number 4) (Sequence list free text: It is the same as the DNA sequence of Nos. 301 to 321 of SEQ ID No. 1)
  • Sense primer 5 CTGTGCCTGTTACTGGGTTTT ( ⁇ ⁇ number 5) (Free text in the sequence listing: identical to the D D sequence at positions 28 to 48 of SEQ ID NO: 1)
  • Antisense primer GAACGTTCCAGCGCTGCGACA (S ⁇ ij No. 6) (Sequence Listing Free Text: Complementary to SEQ ID NO: 423-443 DNA sequence)
  • Genome of pathogenic Escherichia coli 0-157 used as these primers and type I Genome of pathogenic Escherichia coli 0-157 used as these primers and type I
  • Sense primer 1 GCCGGGTTCGTTAATACGGCA (l ⁇ ij number 4) (Free text in the sequence listing: identical to the DNA sequence of Nos. 301 to 321 of SEQ ID No. 1)
  • Sense primer 2 TTAACCACACCCCACCGGGCA
  • Sense primer 3 TCTCAGGGGACCACATCGGTG (E ⁇ J number 8) (Free text in the sequence listing: identical to the DNA sequence of Nos. 160 to 180 of SEQ ID NO: 1)
  • Sense primer 4 CGGTATCCTATTCCCGGGAGT
  • Antisense primer GAACGTTCCAGCGCTGCGACA (12 ⁇ table free text: complementary to the DNA sequence of Nos. 423 to 443 of SEQ ID NO: 1)
  • the PCR was performed after initial denaturation (95 ° C, 3 minutes), denaturation (61 ° C, 1 minute), annealing (72 ° C, 1 minute), and elongation (94 ° C, 1 minute). The cycle was varied from 10 to 40.
  • FIG. 5 shows the relationship between the amount of the PCR product and the resonance signal when the sample DNA chain length is 143 bp. As shown in this figure, a larger resonance signal is detected as the number of cycles increases. However, when the number of cycles is large, the resonance signal starts to decrease when the amount of the PCR product exceeds 301.
  • FIG. 6 shows the relationship between the amount of the PCR product and the resonance signal when the chain length of the sample D was 256 bp. As shown in this figure, unlike Fig. 5, the number of cycles is 25 In this case, the largest resonance signal is detected.
  • FIG. 7 shows the relationship between the amount of the PCR product and the resonance signal when the chain length of the sample DNA is 28.4 bp. As shown in this figure, the detection pattern of the resonance signal is almost the same as in FIG.
  • the resonance signal is a value when the amount of the PCR product is 40 ⁇ 1. The result is shown in FIG.
  • the symbols in the figures are the same as in FIGS.
  • the resonance signal does not always increase corresponding to the length of the chain of DN N. This is considered to be due to the fact that, as described above, the chain length or 'lengthening' increased the probability that the shape would become three-dimensionally unable to hybridize with the probe.
  • a layer made of chromium and then a layer made of gold are formed on a 13 mm x 18 mm, 0.3 mm thick blue plate glass (made by Matsunami Glass Co., Ltd.) by sputtering, and used for surface plasmon resonance biosensors.
  • a measurement chip was prepared. Sputtering was performed at 100 W for 30 seconds for chromium and 100 W for 150 seconds for gold. The thickness of the obtained chromium layer was 32.2 angstroms, and the thickness of the gold layer was 474 angstroms.
  • the measurement chip was immersed in an 11 mM ethanol solution of 11-mercaptundecanoic acid for 24 hours to form an organic thin film layer on the metal layer. Next, 500% 5% avidin solution was dropped at three places on the same chip, and avidin was added. An amide bond was formed between the molecule and ⁇ on the organic thin film layer, and avidin was immobilized.
  • Tdh1, tdh2, and trh2 have sequences complementary to some of the three genes.
  • Sequence A (t dhl) AAGTTATTAATCAAT J No. 10) Inversion B (t dh 2) TTTTTATTATATCCG (SEQ ID No. 11) Sequence C (tr h2) CCCAGTTAAGGCAAT (SEQ ID No. 12) 30 ⁇ 1 was dropped at the dropping position, and PNA was immobilized on the measurement chip via an avidin-biotin bond.
  • the measurement chip with the PNA fixed was mounted on a surface plasmon resonance biosensor (Electrified ⁇ tt device: SPR-20 type sensor head, modified supply and drainage) ( Figure 10).
  • a surface plasmon resonance biosensor Electrode-based ⁇ tt device: SPR-20 type sensor head, modified supply and drainage
  • the measurement chip can be moved freely in the horizontal direction, so it is possible to measure the resonance signals of multiple samples on the chip while keeping the optical system fixed.
  • the DNA to be detected was amplified to 300 b fragment by PCR (25 cycles).
  • the solution containing the amplified DNA was poured into the measurement cell of the biosensor, and the resonance signal at M101 was measured. Table 6 shows the results.
  • Example 4 In the same manner as in Example 4, a metal layer and an organic thin film layer were formed on a blue sheet glass, and four measurement chips were produced. Next, a 50 / i 1 5% avidin solution was dropped at two places on the four chips (total of eight places) to immobilize the avidin molecule.
  • Sequences A, B, and C are PNII sequences that are complementary to a part of each of t dhl, t dh2, and trh 2 of Vibrio parahaemolyticus, and sequence D is 18S of Salmonella enteritidis (Salmonella).
  • sequence F is cholera # 3 ⁇ 4 of Vibrio chorera (cholera)
  • sequence G is vesicular toxin 1 of Escherichia coli 0-157
  • sequence H is It is a PNA with a sequence that is complementary to Escherichia coli 0-157.
  • Sequence A AAGTTATTAATC AAT (SEQ ID NO: 10)
  • Ver. B TTTTTATTATATC CG (SEQ ID NO: 11)
  • the measurement chip on which the PNA was immobilized was set on the surface plasmon resonance biosensor used in Example 4.
  • the DNA which was a product, was amplified by PCR in the same manner as in Example 4.
  • Four types of DNA were used: DNA prepared from Escherichia coli 0-157, Vibrio parahaemolyticus, and Salmonella, and a mixture of DNA prepared from Escherichia coli 0-157 and DNA prepared from Salmonella.
  • the solution containing the amplified DNA was poured into the measurement cell of the biosensor, and the resonance signal at a flow rate of 101 was measured. Table 7 shows the results.
  • signals of about 300 RU were obtained for various microorganisms when positive and 30 RU or less for negative microorganisms.

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Description

明 TO プローブ PN Aによる DNAの検出法 発明の背景
発明の分野
本発明は、 PNA (peptide nucleic acid) をプローブとする D N Aの検出方 法に関する。
背景技術
標的 DN Aを検出するために、 その DN A配列と相補的な DN Aを用いること は従来から行われてきた。 標的 D N Aを検出するために用いる相補的 D N Aは、 「プローブ DNAJ または単に 「プローブ」 と呼ばれる。
プローブ DNAを用いた標的 D N Aの検出は、 病原菌の検出や遺伝子のクロー ニングなどに利用されている。 しかしな力 ら、 幾つかの未解決な問題が存在する。 例えば、 D N Aの検出感度の低下は、 ハイブリダイゼーション溶液の塩 の 低下により観察される。 このため、 ハイブリダィゼ一シヨンは一定の塩濃度の緩 衝液中で実施する必要があった。 一般にこのような緩衝液の調製は煩雑な操作を 伴い、 これがこの検出方法の簡便化を妨げる一つの原因となっていた。
発明の概要
本発明者らは、 今般、 プローブ DNAの代わりにプローブ PNAを用いること により、 ハイブリダィゼーシヨン法による D N Aの検出法の検出感度が著しく改 善されることを見いだした。
以下の理論に拘束されるわけではないが、 ハイプリダイゼーション法における DN Aの検出感度の低下は、 DNA分子中のリン原子等が負に荷電していること に起因するものと思われる。 具体的には、 DNA力 <荷電するとプローブ DNAと 標的 DN Aとの間に電気的反発力が生じ、 両 DN Aのハイブリダィゼーシヨンが 妨げら その結果、 検出感度が低下すると思われる。 検出感度の著しい改善は、 標的 D NAとプローブ PNAとの間で電気的反発力が生じなかったことによるも のと思われる。
本発明は、 検出感度が著しく改善されたプロ一ブを用 L、た標的ヌクレオチド配 列の検出法の提供をその目的とする。
本発明による標的ヌクレオチド配列の検出法は、 標的ヌクレオチド配列と、 標 的ヌクレオチド配列の一部又は全部と相補的な P N Aとをハイブリダイズさせ、 ハイブリダイズの程度を測定することを含むものである。
図面の簡単な説明
図 1は DNAと PNAの化学構造を示す。 7 ：カートリッジブロック、 71 : 測定セル、 72, 73 :流路、 8 ：光源、 80 ：入射光、 9 ：検出!^ 90 ：反 射光、 10 ：測定チップ。
図 2は表面プラズモン共鳴バイオセンサ一を示す。 1 ：透明基板、 2 ：金属膜、 3 ：有機物質層、 4 ：アビジン、 5 ： ピオチン、 6 ： プローブ PNAo
図 3は表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップを示す。
図 4は病原性大腸菌〇一 157の II型べ口 をコードする DN A配列を示す。 図 5は試料 DN Aの鎖長を 143 b pとした場合の增幅産物の量と共鳴シグナ ルの関係を示す。 ·は 10サイクル、 ▲は 20サイクル、 驪は 25サイクル、 〇 は 30サイクル、 △は 40サイクルの P CRを行った場合を示す。
図 6は試料 DN Aの鎖長を 256 b pとした場合の増幅産物の量と共鳴シグナ ルの関係を示す。
図 7は試料 DNAの鎖長を 284 b pとした場合の増幅産物の量と共鳴シグナ ルの関係を示す。
図 8は試料 DN Aの鎖長を 391 b pとした場合の増幅産物の量と共鳴シグナ ルの関係を示す。
図 9は試料 DN Aの鎖長の長さと共鳴シグナルの関係を示す。
図 10は表面プラズモン共鳴バイオセンサーを示す。
発明の具体的説明
PNAは、 DN Aの模倣物質である。 PNAは、 D N Aと同様にその分子中に アデニン、 グァニン、 シトシン、 チミンといった核酸塩基を有し、 これに相捕的 な核酸塩基を有するヌクレオチド配列と特異的にハイブリダィズする。 このよう に P N Aは機能的には D N Aとほとんど変わりな 、が、 その構造は全く異なる。
PNAは、 N— （2—アミノエチル） グリシンを単位とするポリアミ ドを基本 骨格としており （図 1) 、 分子中に糖やリン原子を含まない。 このため、 電気的 に中性であり、 塩の存在しない条件下でも荷電することはない。 核酸塩基は、 メ チレンカルボニルを介してポリアミ ド骨格に結合している （図 1)。
PNAは、 ぺプチドと同様に Fmo c型ぺプチド固相合成法および t B o c型 ペプチド固相合成法などにより合成することができる。 また、 委託合成すること ちでさる。
本発明の検出法により検出できる標的ヌクレオチド配列は、 配列の少なくとも 一部が知られているものであれば特に制限はない。 標的ヌクレオチド配列として は、 病原性大腸菌のベロ毒素をコードする DNA、 H I Vの外殻タンパク質 gp 120をコードする DNA、 各種 物の 16 S r RN Aの特異的塩基配列部分
(c DNA) 、 メチシリン耐性ブドウ球菌 （MRSA) の 物質結合タンパク 質をコードする DNAのような 物由来の DNA、 ヒ卜の遺伝病に関係する D N Aが挙げられる。 標的ヌクレオチド配列は、 夾雑物を含んでいてもよい。 例え ば、 ベロ毒素をコードする DNAを検出する場合、 病原性大腸菌の加熱処理物を そのまま検出試料としてもよい。
後述する表面プラズモン共鳴バイオセンサ一により標的ヌクレオチド配列を検 出する場合には、 検出に ち、 標的ヌクレオチド配列をポリメラ一ゼ連鎖反応 (P C R) 法により増幅させておくのが望ましい。 P C Rの条件は特に限定され ないが、 試料中のヌクレオチド配列の濃度が低すぎる場合には十分な共鳴シグナ ルを検出することができず、 また、 試料中のヌクレオチド配列の濃度が高すぎる 場合にもヌクレオチド配列同士の相互作用により検出される共鳴シグナル力低下 する。 このため、 P C Rのサイクルは 2 0〜2 5とするの力好ましい。
本発明の D N Aの検出方法は、 プローブ P N Aと標的ヌクレオチド配列とのハ イブリダイゼーションを利用する限りどのような態様をもとり得る。 好ましい態 様としては、 表面プラズモン共鳴バイオセンサ一を用いた検出法が挙げられる。 以下、 本発明の標的ヌクレオチド配列の検出法に使用する表面プラズモン共鳴バ ィォセンサー及びそれに用いる測定チップについて説明する。
本発明に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一例を図 2に示す。 こ の表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、 カートリッジブロック 7と、 光源 8と、 検出器 9とを有し、 カー卜リッジブロック 7の上にプローブ P N A 6を固定した 測定チップ 1 0を設置して使用する。 カートリツジブロック 7の上面には凹部が 設けられており、 この凹部と上記測定チップ 1 0とで測定セル 7 1力く構成される。 測定セル 7 1は、 流路 7 2、 7 3により力一トリッジブロック 7の外部に連通し ており、 試料は流路 7 2を通じて測定セル 7 1中に流れ込み、 測定に供された後 流路 7 3を通じて外部に排出される。
光源 8からは、 測定チップ 1 0の透明基板に向かって単色光が照射され （入射 光 8 0 ) 、 測定チップ 1 0の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光 9 0 が、検出器 9に入光する。 検出器 9では、 反射光 9 0の強度を検出することがで きる。
図 2の構造によって、 ある入射角 Θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得 られる。 反射光強度曲線における谷は、 表面プラズモン共鳴によるものである。 即ち、 光が測定チップ 1 0の透明基板と外との界面で全反射するときに、 その界 面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、 一方、 金属膜にも表面ブラズモ ンといわれる表面波が生じる。 この 2つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こ り、 光のエネルギーの一部力表面プラズモンを励起するために使用され、 反射光 の強度が低下する。 表面プラズモンの波数は、 金属膜表面のごく近くにある媒質 の屈折率の影響を受けるため、 標的ヌクレオチド配列とプローブ P N Aとの相互 作用により媒質の屈折率が変化すると、 表面ブラズモン共鳴が生じる入射角 Θが 変化する。 従って、 反射光強度曲線の谷のずれによって、 標的ヌクレオチド配列 の濃度の変化を検知することができる。 入射角 Θの変ィ bMは共鳴シグナルといわ れ、 1 0— 4の変ィ匕を 1 R Uとして表す。
測定チップ 1 0は、 表面プラズモン共鳴に必要な透明基 び金属膜を有し、 プローブ P N Aを金属膜上に固定できるものであればどのようなものでもよく、 市販の測定チップ （例えば、 フアルマシアバイオセンサ一社製、 B I A c 0 r e 2 0 0 0用測定チップ） を使用することもできるが、 図 3に示すような構造を有 する測定チップを使用すること力好ましい。 この測定チップは、 透明基板 1上に 金属膜 2、 有機物質層 3力形成されており、 その上にアビジン 4が固定されてお り、 このアビジン 4にピオチン 5で標識されたプローブ P N A 6が固定される。 透明基板 1としては、 通常表面ブラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップ に使用されるものであれば特に限定されない。 一般的にはガラス、 ポリエチレン テレフタレート、 ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な材料からな るもの力く使用でき、 偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ま しく、 その厚さは 0 . 1〜2 0 mm程度であってもよい。
金属膜 2としては、 表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限 定されない。 この金属膜に使用することのできる金属の種類としては、 金、 銀、 銅、 アルミニウム、 白金等が挙げられ、 それらを単独で又は組み合わせて使用す ることができる。 また、 上記透明基板 1への付着性を考慮して、 透明基板 1と金、 銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
金属膜 2の膜厚は、 1 0 0〜2 0 0 0オングストロームであるの力好ましく、 特に 2 0 0〜6 0 0オングストロームであるのが好ましい。 3 0 0 0オングスト ロームを超えると、 媒質の表面ブラズモン現象を十分検出することができない。 また、 クロム等からなる介在層を設ける場合、 その介在層の厚さは、 5〜5 0ォ ングストロームであるの力好ましい。
金属膜 2の形成は常法によって行えばよく、 例えば、 スパッタ法、 蒸着法、 ィ オンプレーティング法、 電気めつき法、 無電解めつき法等によって行うことがで きる。 これらの方法の中でもスパッタ法を用いるの力く好ましい。
有機物質層 3は、 金属原子とァビジン分子の両者と結合することができる物質 力、らなる層である。 有機物質層 3の厚さは、 1 0〜2 0 0オングストロームであ るの力く好ましく、 特に 1 0 ~ 5 0オングストロームであるの力好ましい。 また、 アビジン—ピオチン結合以外にも、 エステル結合やアミ ド結合のような共有結合 を利用してプローブ P N Aを有機物質層 3に固定化してもよい。
有機物質層 3は、 シランカップリング剤、 メルカプト基と他の有機官能基を有 する化合物 （以下、 単に 「チオール化合物」 という） 用いて形成させることがで き、 また、 L B (ラングミュア · プロジェッ ト） 法によっても形成させること力く できる。 L B法によって成膜した場合、 シランカップリング剤ゃチオール化合物 によって成膜した場合に比べ、 金属膜との結合能が弱いという短所があるが、 広 範な物質に適用でき、 また、 凝集膜を形成できるので単位面積当たりに結合させ るアビジン 4の数を增加させることができるという長所もある。
有機物質層形成に使用できるシランカツプリング剤としては、 3—ァミノプロ ピルトリエトキシシラン、 3—ァミノプロビルトリメ トキシシラン、 3—ァミノ プロピルジェトキシメチルシラン、 3— （2—アミノエチルァミノプロピル） ト リメ トキシシラン、 3— （2—アミノエチルァミノプロピル） ジメ トキシメチル シラン、 3—メルカプトプロビルトリメ トキシシラン、 ジメ トキシー 3—メルカ ブトプロピルメチルシランなどが挙げられる。 また、 チオール化合物としては、 メルカプトアミノメタン、 2—メルカプト一 1一アミノエタン、 3—メルカプト —1ーァミノプロパン、 4—メルカプト一 1—アミノブタン、 1 , 1 , 1—トリ アミノー 2—メルカプトエタン、 メルカプト酔酸、 2—メルカプトプロピオン酸、 3—メルカプト酪酸、 4—メルカプト吉草酸、 1 , 1 , 1—トリアミノー 3—メ ルカプトプロパンなどが挙げられ、 これらの中でも多官能物質であり、 アビジン との結合部位が多い 1 , 1 , 1—トリアミノ一 2—メルカプトエタン、 1 , 1 , 1—トリアミノー 3—メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。 L B法に 適用できる物質としては、 2 1—アミノ ドコサン酸、 ステアリルァミン、 ポリリ ジンが挙げられる。
シランカップリ ング剤を用 、て有機物質層を形成する方法としては、 シラン力 ップリング剤の飽和蒸気中に金属膜を一定時間暴露する方法 （飽和蒸気法） 、 シ ランカップリング剤を含む溶液中に金属膜を一定時間浸漬する方法 （浸漬法） 、 スピンコ一タを用いる方法 （スピンコーティング法） 、 グラビア印刷機を用いる 方法 （グラビア法） などを用いることができ、 チオール化合物を用いて有機物質 層 3を形成する方法としては、 飽和蒸気法、 浸漬法、 スピンコーティング法、 グ ラビア法などを用いることができる。
有機物質層 3にァビジン 4を固定することは、 所定量のァビジン 4を有機物質 層 3に所定時間接触させることにより達成される。 具体的な方法としては、 フロ —セル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有機物質層 3を形成させた透明 基板 1を設置して一定流量のアビジン 4を所定時間 （所定量） 流す方法が挙げら れる。
ァビジン 4に、 ピオチン 5で標識したプローブ P N A 6に固定化する方法とし ては、 インクジエツ 卜法、 マイクロディスペンサー法など力く挙げられる。 インク ジエツ ト法は、 極めて狭い領域に精度よくプローブ PNA6を含む液滴を発射で きるので、 固定化するプローブ PNA6を有効利用できるという点で有利である。 また、 フロ一セル型の表面ブラズモン共鳴バイオセンサ一に測定チップを設置し て一定 のプローブ PN A 6を所定時間 （所定量） 流すことによつても固定ィ匕 できる。 この固定化方法によれば、 アビジン 4及びプローブ PNA6の固定を一 連の操作で行うことができるという点で有利である。 プローブ PNA6をビォチ ン 5で標識する方法としては、 ピオチンにぺプチド固相合成法により PNA鎖を 延長している方法が挙げられる。
表面プラズモン共鳴バイオセンサーによる DN Aの検出は、 目的とする DN A を含む試料を該センサ一の測定セル中に流し込むことにより行う。 このとき、 試 料中の DNA濃度は 0. 1~1 とするの力く好ましい。 また、 本検出方法では、 試料中に全く塩が存在しな L、条件下でも D N Aの検出を行うことができるカ^ よ り高感度で DNAを検出するためには塩濃度を 150〜30 OmMとするの力好 ましい。
標的ヌクレオチド配列は 1種類だけでなく、 2種類以上であってもよい。 2種 類以上の標的ヌクレオチド配列を検出するには、 一つのチップに複数の PN Aを 固定するか、 センサーに複数のチップを固定することにより行い得る。 このよう に 2種類以上の標的ヌクレオチド配列を検出することにより、 検出の精度を向上 させることができる。
例えば、 ある 物の持つ特異的な D N Aと相補的な P N Aを二つ以上チップ に固定することにより、 その »物に由来する D N Aが試料中に含まれているか どうかをより高い精度で判別することができる。 また、 固定化する DN Aの中に 目的の DN Aとは結合しない PN A (陰性プローブ） を含ませておくことによつ ても精度を向上させることができる。 さらに、 固定化する PN Aの選択を適切に 行えば、例えば、 試料中にベロ毒素が含まれるかどうかということだけでなく、 そのべ口毒素が I型なのか II型なのかまで判別できる。
2種類以上の P N Aを固定する場合、 する表面ブラズモン共鳴バイオセン サーは、測定チップを水平方向に自由に移動可能なタイプのものが好ましい。 こ のようなセンサーを^すれば、 光学系を固定したままチップ上の^ ¾の試料の シグナルを測定できる。
実 施 例
例 1〕
市販の表面ブラズモン共鳴バイォセンサー （フアルマシァバイオセンサー社製、 B IAco r e2000)の測定セルに 5 %ァビジン溶液を流速 5 β 1 /分で 7 分間流し込み、 測定チップにアビジンを固定した。 一方、 II型べ口 H¾をコード する DNA (配列番号 1、 図 4) の一部と相補的であり、 かつ 5' 末端にビォチ ンを結合させた下記の PN Aを合成し （日本パ一セプティブ株式会社に合成を委 託） 、 プロ一；/ PNAとした。
TGCAGAGTGGTATAACTG (副番号 2)
(配列表フリ一テキスト：配列番号 1の 402〜419番の DN A配列と相補 的である）
このプローブ PNAを含む溶液 （10 zM) を前記バイオセンサーの測定セル に流速 1 1Z分で 50分間流し込み、 プローブ PNAをアビジンを介して測定 チップ上に固定した。 その後、 5 OmMの NaOHを測定セルに流し込み、洗浄 し i 。
次に、 プローブ P N Aと相補的な下記の一本鎖 D N Aを合成した。
CAGTTATACCACTCTGCAACG (配列番号 3)
(配列表フリ一テキスト：配列番号 1の 402〜422番の DN A配列と同一 である） 0 この D N Aを含み、 塩- ®¾が異なる下記の fiSgの溶液を調製した c
Figure imgf000012_0001
塩^の異なるこれらの溶液を測定セルに流速 5m 1/分で 10分間流し込み、 それぞれの共鳴シグナルを測定した。 この結果を表 2に示す。 表 2
Figure imgf000012_0002
表 2に示すように、 DNAをプローブとした場合、 塩濃度が OmMのときには 全く共鳴シグナルを検出できなかったカ、 PN Aをプローブとした場合には共鳴 シグナルを検出することができた。 この結果から PNAをプローブとした場合に は DNAをプローブとした場合ほど、 検出感度が塩濃度の影響を受けないことが 示された。 従って、 PN Aをプローブとして用いれば PCR ^物を脱塩するだ けで標的 D N Aの検出力可能である。 瞧例 2〕
図 4に示す病原性:^菌 0— 157のゲノム D N Aを基に以下の 2種類のセン スプライマーと 1種類のアンチセンスプライマーを合成した。 センスプライマー 1： GCCGGGTTCGTTAATACGGCA (l^ij番号 4) (配列表フリーテキスト ：配列番号 1の 301〜321番の DN A配列と同一 である）
センスプライマー 5： CTGTGCCTGTTACTGGGTTTT (ΙΞ^番号 5) (配列表フリ一テキスト ：配列番号 1の 28〜48番の D Ν Α配列と同一であ る）
アンチセンスプライマー： GAACGTTCCAGCGCTGCGACA (S^ij番号 6) (配列表フリーテキスト ：配列番号 1の 423〜443番の DN A配列と相補 的である）
これらのプライマー及び铸型として用いる病原性大腸菌 0—157のゲノム
D N Aを含む以下の ¾¾¾の P C R用溶液を調製した。
Figure imgf000013_0001
PCRは、 初期変性 (95°C、 3分） を行った後、 変性 (61°C、 1分） 、 ァ ニーリング （72°C、 1分） 、 伸長 （94°C、 1分） を 40サイクル行った。
この P CRにより 143b p又は 416b pの:！^:鎖 D N Aを含む 2觀の増 幅産物を得た。 各々の増幅産物 30 u 1にホルムァミ ド 10 ί 1を加え、 95°C 2 で 10分間加熱した。 この熱変性させた増幅産物を、 例 1と同様の方法でプ ローブ PNAを固定した測定セルに流速 5 1ノ分で 10分間流し込み、 それぞ れの共鳴シグナルを測定した。 また、 対照として PCR産物 30 μ 1の代わりに トリス緩衝液 （ρΗ 7. 4) 3 1を用いて、 共鳴シグナルを測定した。 この 結果を表 4に示す。
表 4
Figure imgf000014_0001
表 4に示すように、 この P CRの条件でも ΡΝΑをプローブとした場合には十 分な共鳴シグナルを検出できたが、 DNAプローブとした場合にはほとんど共鳴 シグナルを検出できなかった。 この結果から、 プローブ ΡΝΑはプローブ DNA よりも試料 DN Αにハイブリダィズしゃすいことが示された。
試料 DN Aの鎖長が 416 b pの方力 143b pよりもより大きな共鳴シグナ ルが検出されている。 しかし、 共鳴シグナルは、 プローブと結合する物質の分子 量が大きくなるほど、 それに従って大きくなる。 その点を考慮すると、 この共鳴 シグナルの値は予想される値ほど大きくない。 つまり、 鎖長 416 b pの DN A は、 鎖長 143 b pの DNAよりもプローブ PNAへのハイブリダィズの効率が よくないと言える。 これは、 鎖長が長くなることにより、 立体的にプローブとハ イブリダィズできないような形状 （例えば、 球状） になる確立が高くなつたため と考えられる。 3 例 3〕
図 4に示す病原性: «菌0— 157のゲノム DNAを基に以下の 4種類のセン スプライマーと 1種類のアンチセンスプライマーを合成した。
センスプライマー 1 ： GCCGGGTTCGTTAATACGGCA (l^ij番号 4) (配列表フリ一テキスト ：配列番号 1の 301〜321番の DN A配列と同一 である）
センスプライマー 2： TTAACCACACCCCACCGGGCA
Figure imgf000015_0001
(E^J表フリ一テキスト ：配列番号 1の 188〜208番の DN A配列と同一 である）
センスプライマー 3： TCTCAGGGGACCACATCGGTG (E^J番号 8) (配列表フリ一テキスト：配列番号 1の 160〜180番の DN A配列と同一 である）
センスプライマー 4： CGGTATCCTATTCCCGGGAGT
Figure imgf000015_0002
(le^J表フリーテキスト ：配列番号 1の 53〜73番の DN A配列と同一であ る）
アンチセンスプライマー： GAACGTTCCAGCGCTGCGACA
Figure imgf000015_0003
(12^表フリーテキスト ：配列番号 1の 423〜443番の DN A配列と相補 的である）
これらのプライマー及び铸型として用いる病原性大腸菌 0—157のゲノム DNAを含む以下の の P C R用溶液を調製した。 4 表 5
Figure imgf000016_0001
P CRは、 初期変性 （95°C、 3分） を行った後、 変性 (61°C、 1分） 、 ァ ニーリング （72°C、 1分） 、 伸長 （94°C、 1分） のサイクルを 10〜40の 範囲で変化させて行った。
この P CRi;より 143 b p、 256 b p、 284 b p、 又は 391 b pの二 本鎖 DNAを含む 4種類の増幅産物を得た。 各々の増幅産物 1 0 1、 20 1、 30 1、 40 60 ^ 1、 80 β ϊにホルムァミ ド 10 1を加え、 95 °Cで 10分間加熱した。 この熱変性させた増幅産物を、 例 1と同様の方法で プローブ PNAを固定した測定セルに流速 5m lZ分で流し込み、 10分後の共 鳴シグナルを測定した。 この結果を図 5、 図 6、 図 7及び図 8に示す。
図 5は、 試料 DNAの鎖長を 143 b pとした場合の P C R産物の量と共鳴シ グナルの関係を示す。 この図に示すように、 サイクル数が多いほど大きな共鳴シ グナルが検出されている。 但し、 サイクル数が多い場合には P C R産物の量が 30 1を超えると共鳴シグナルが低下しはじめる。
図 6は、 試料 D Ν Αの鎖長を 256 b pとした場合の P C R産物の量と共鳴シ グナルの関係を示す。 この図に示すように、 図 5とは異なり、 サイクル数が 25 の場合において最も大きな共鳴シグナルが検出される。
図 7は、 試料 D N Aの鎖長を 2 8 4 b pとした場合の P C R産物の量と共鳴シ グナルの関係を示す。 この図に示すように、 共鳴シグナルの検出パターンは、 図 6とほぼ同様である。
図 8は、 試料 D N Aの鎖長を 3 9 1 b pとした場合の P C R産物の量と共鳴シ グナルの関係を示す。 この図に示すように、 共鳴シグナルの検出パターンは、 図 6とほぼ同様である。
上記図 5〜 8から D N Aの鎖長の長さと共鳴シグナルの関係を調べた。 共鳴シ グナルは、 P C R産物の量が 4 0 β 1の場合の値である。 この結果を図 9に示す。 図中の記号は図 5 ~ 8と同様である。
一般にプローブと結合する物質の 量 （D N Aの鎖長） が大きくなれば、 そ れだけ共鳴シグナルも大きくなる。 しかし、 図 9では、 必ずしも D N Αの鎖長の 長さに対応して共鳴シグナルも増加していない。 これは、 前記したように、 鎖長 か'長くなるこ.とにより、 立体的にプローブとハイプリダイズできないような形状 になる確率力高くなつたためと考えられる。
C 施例 4〕
1 3 mm X 1 8 mm、 厚さ 0. 3 mmの青板ガラス （松浪硝子ェ H¾製） 上に スパッタリングによりクロムからなる層、 次いで金からなる層を形成し、 表面プ ラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを作製した。 スパッタリングは、 ク ロムについては 1 0 0W、 3 0秒間、 金については 1 0 0 W、 1 5 0秒間行った。 得られたクロム層の厚さは 3 2. 2オングストロームであり、 金層の厚さは 4 7 4オングストロームであった。 この測定チップを 1 1一メルカプトゥンデカン酸 の I mMエタノール溶液に 2 4時間浸漬し、 金属層上に有機薄膜層を形成させた。 次いで、 5 0 1の 5 %アビジン溶液を同一チップ上の 3箇所に滴下し、 ァビジ 6 ン分子と有機薄膜層上の^^との間にアミ ド結合を形成させ、 アビジン を固 定化した。
次に、 5' 末端にピオチンを結合させた下記の 3種類の PN Aを合成した （日 本バーセプティブ社に合成を委託） 0 これらの PNAは、 産生菌 Vibrio parahaemolvticus (腸炎ビブリオ） の毒性の要因となる t dh 1、 t dh2、 t r h 2の 3種類の遺伝子の一部と相補的な配列を持つ。
配列 A (t dhl) AAGTTATTAATCAAT J番号 10) 翻 B (t dh 2) TTTTTATTATATCCG (配列番号 11) 配列 C (t r h2) CCCAGTTAAGGCAAT (配列番号 12) 上記 PNAを含む溶液 (10^ 1) をアビジン溶液を滴下した位置に 30^ 1 滴下し、 P N Aをァビジン ·ピオチン結合を介して測定チップ上に固定ィ匕した。
P N Aを固定ィ匕した測定チップを表面ブラズモン共鳴バイオセンサー （電気化 ^tt器ネ: の SPR— 20型のセンサーへッド、 給排液を改造したもの） に設置 した （図 10) o このバイオセンサーでは、 測定チップを水平方向に自由に移動 させることができるので、光学系を固定したままチップ上に存在する複数の試料 の共鳴シグナルを測定することが可能である。
被検出物である DNAは、 PCR (25サイクル） で 300 b の断片に 増幅させた。 増幅させた DNAを含む溶液を、 バイオセンサーの測定セルに流し 込み、 Ml 0 1における共鳴シグナルを測定した。 結果を表 6に示す。
Figure imgf000018_0001
表 6に示すように配列 A、 B、 および Cのいずれも 300RU (換算値） 前後 のシグナルが得られた。 D N Aの結合がな L、場合 （陰性） のシグナルが 10〜 7
2 ORU (換算値） であることを考慮すると、 固定した 3種類の PNAに DNA 力結合したもの （陽性） と考えられる。 讓例 5〕
実施例 4と同様に青板ガラス上に金属層、 有機薄膜層を形成させ、 4枚の測定 チップを作製した。 次いで、 50 /i 1の 5%のアビジン溶液を 4枚のチップ上の 2箇所に滴下し （合計 8箇所） 、 アビジン分子を固定化した。
次に、 5' 末端にピオチンを結合させた下記の 8種類の PNAを合成した （日 本バーセプティブ社に合成を委託） 。 配列 A、 B、 および Cは、 Vibrio parahaemolyticusの t dhl、 t dh2、 t r h 2遺 のそれぞれの一部と相 捕的な配列を持つ PN Αであり、配列 Dは Salmonella enteritidis (サルモネラ） の 18 S rRNA、
Figure imgf000019_0001
は Borderella pertussis (百日咳菌） の百日咳 ¾¾、 配列 Fは Vibrio chorera (コレラ） のコレラ #¾、配列 Gは Escherichia coli 0-157 ( 原性^菌 0—157) のべ口毒素 1、配列 Hは Escherichia coli 0-157のべロ識 IIと相補的な配列を持つ PNAである。 配列 A： AAGTTATTAATC AAT (配列番号 10)
翻 B： TTTTTATTATATC CG (配列番号 11)
C： CCCAGTTAAGGCAAT (配列番号 12)
Figure imgf000019_0002
番号 13)
配列 Ε： CCAAAGTATTTCCCT (配列番号 14)
F ·· AATTCGGGTTAATTG (麵番号 15)
： GGGCGTTATGC CGTA (配列番号 16)
配列 H： TGCAGAGTGGTATAA (IS^j番号 17)
上記 PN Aを含む溶液 (10^ 1) をアビジン溶液を滴下した位置に 30 μ 1 8 滴下し、 PNAをアビジン ·ピオチン結合を介して測定チップ上に固定ィ匕した。
PNAを固定化した測定チップを 例 4で使用した表面ブラズモン共鳴バイ ォセンサーに設置した。 出物である DN Aは、 実施例 4と同様に P CRで增 幅させた。 DNAは、 大腸菌 0—157、 腸炎ビブリオ、 サルモネラのそれぞれ から調製した DNAと、 大腸菌 0—157から調製した DNAとサルモネラから 調製した DNAの混合物の 4種類使用した。 増幅させた DN Aを含む溶液を、 バ ィォセンサーの測定セルに流し込み、 流量 10 1における共鳴シグナルを測定 した。 結果を表 7に示す。
表 7
Figure imgf000020_0001
表 7に示すように、各種微生物に対して陽性の場合 300RU程度、 陰性の場 合 30 R U以下のシグナルが得られた。

Claims

9 請求の 範囲
1. 標的ヌクレオチド配列と、 標的ヌクレオチド配列の一部又は全部と相捕 的な P N A (peptide nucleic acid) とをハイブリダィズさせ、 そしてハイプリ ダイゼ一ションの程度を測定することを含む、 標的ヌクレオチド配列の検出法。
2. 標的ヌクレオチド配列と P N Aとをハイブリダィズさせる工程の前に、 標的ヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する工程を更に含む、 請求項 1に記載の検出法。
3. ハイプリダイズの程度を表面プラズモン共鳴バイオセンサーにより測定 する、 請求項 1に記載の検出法。
4. P N Aが表面ブラズモン共鳴ノ ィォセンサ一の測定チップに固定された、 請求項 3に記載の検出法。
5. 二 TO以上の標的ヌクレオチド配列を検出する、 請求項 1に記載の検出 法。
6. ヌクレオチド配列が D N A配列である、 請求項 1に記載の検出法。
PCT/JP1998/003077 1997-07-09 1998-07-09 Procede de detection d'adn au moyen d'une sonde de pna WO1999002730A1 (fr)

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