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WO1999002729A1 - Method of dna sequencing - Google Patents

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WO1999002729A1
WO1999002729A1 PCT/JP1998/003039 JP9803039W WO9902729A1 WO 1999002729 A1 WO1999002729 A1 WO 1999002729A1 JP 9803039 W JP9803039 W JP 9803039W WO 9902729 A1 WO9902729 A1 WO 9902729A1
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WO
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rna polymerase
amino acid
mutant
reaction
sequence
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Application number
PCT/JP1998/003039
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French (fr)
Inventor
Yoshihide Hayashizaki
Original Assignee
The Institute Of Physical And Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Institute Of Physical And Chemical Research filed Critical The Institute Of Physical And Chemical Research
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Priority to DE69826458T priority patent/DE69826458T2/de
Priority to US09/254,352 priority patent/US6365350B1/en
Priority to EP98929853A priority patent/EP0978569B1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a nucleotide sequence of DNA.
  • the present invention relates to a method for determining a DNA base sequence using a mutant RNA polymerase.
  • the present invention relates to a method for determining the nucleotide sequence of DNA using a novel 3 ′ deoxyribonucleotide derivative as one of the fluorescently labeled terminators.
  • the present invention relates to a method for determining the nucleotide sequence of DNA using inorganic pyrophosphatase in combination with a nucleic acid transcription production reaction. Background art
  • PCR polymerase chain reaction
  • the direct sequence method has two major problems.
  • There are various methods for purifying PCR products for example, electrophoresis, ethanol precipitation, gel filtration, and HPLC purification [for example, Dorit R. L et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11 ".
  • both methods are complicated.
  • the second problem is the rapid renaturation of the PCR product-when the PCR product regenerates into double-stranded DNA, it no longer has a single-stranded template (type II). Hampers alignment between the primer and the single-stranded template. Methods for minimizing regeneration include, for example, quenching after denaturation and piotilation of one primer.
  • This method uses an RNA polymerase such as T7 RNA polymerase and a terminator for the RNA transcription reaction (for example, 3 'doxyribonucleoside 5' triphosphate, 3 'd NTP s).
  • RNA polymerase such as T7 RNA polymerase and a terminator for the RNA transcription reaction (for example, 3 'doxyribonucleoside 5' triphosphate, 3 'd NTP s).
  • This is a direct transcription sequence method.
  • the nucleotide sequence of the DNA product amplified by the polymerase chain reaction is compared with the primers and 2'-deoxyribonucleotide 5, triphosphate (2'-dNTPs). Can be used for the sequence without having to remove it.
  • the denaturation itself is not performed at all, the problem of rapidly regenerating PCR products can be avoided, which is an extremely excellent method.
  • RNA polymerase such as T7 RNA polymerase comprises ribonucleoside 5, triphosphophosphates comprising ATP, GTP, CTP, and UTP or derivatives thereof, and The reaction is performed in a mixture of at least one 3 'doxyribonucleotide consisting of 3' dATP, 3 'dGTP, 3' dCTP, 3 'dUTP or a derivative thereof.
  • a ribonucleotide and a deoxyribonucleotide having a base corresponding to the type I sequence are sequentially incorporated into the ribonucleotide sequence, whereby a polyribonucleotide is synthesized.
  • an object of the present invention is to produce a long-chain transcript using an RNA polymerase that has little or no bias with respect to the incorporation ability depending on the type of nucleotide. It is an object of the present invention to provide a method for determining the nucleotide sequence of a DNA which can obtain more accurate sequence data with less variation in the signal from the obtained deoxyribonucleotide.
  • amino acid residue uses the one-letter notation conventionally used.
  • the only amino acids appearing in the text are phenylalanine (F), tyrosine (Y), proline ( ⁇ ;), leucine ( ⁇ ), and histidine ( ⁇ ), for the sake of understanding.
  • the number from the end of the polymerase protein is described, for example, F667. This indicates that the amino acid residue at position 667 of this polymerase is F, and the description of F 667Y means that the amino acid residue F at position 667 has been replaced with ⁇ .
  • T7 DNA polymerase Y (tyrosine) 526; 2′-dNTP and 2 ′ 3′-ddNTP is a low cause.
  • F (phenylalanine) 762 of E. coli DNA polymerase I and the F (phenylalanine) 667 of the Thermus aquaticus DNA polymerase (commonly referred to as Taq DNA polymerase); T7 DNA polymerase It is a homologous amino acid residue of Y526, which is described as changing the amino acid residue to F762Y (tyrosine) and F667Y (tyrosine), respectively, to reduce the uptake bias.
  • RNA polymerase has not been used in the sequence method so far, and the difference in ribonucleotide incorporation itself did not pose a problem. Furthermore, under such circumstances, Nevertheless, a mutant RNA polymerase that resolved the difference in incorporation was not known. In fact, JP-A-8-205874 does not disclose an example of modification of T7 RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase contains the ⁇ -type, type-I and DNA-dependent RNA polymerases of DNA polymerase (T7 RNA polymerase) in motif B shown in Protein Engineering, 3: 461-467, 1990. It is thought that this corresponds to a region consisting of the conserved amino acid ⁇ and 9 to 10 amino acid residues sandwiched between YG. F (phenylalanine) at amino acid residue 762 of Escherichia coli DNA polymerase or amino acid residue 667 of Taq DNA polymerase, previously discussed with DNA polymerase, is classified as type I DNA. It is observed in many of the polymerases.
  • T7 RNA polymerase does not have F (feralalanine) at residues 631-640 corresponding to the above region, It turned out that the suggestions in the above publication could not be implemented as they were.
  • the present inventor has investigated the modification of amino acid in the region corresponding to this region in T7 RNA polymerase at the position of F762 of Escherichia coli DNA polymerase I in helix 0 of the finger subdomain. did. However, the helix Z in T7 RNA polymerase, which corresponds to helix 0 of Escherichia coli DNA volimerase I, from the three-dimensional structure shown in the literature of Sousa et al. (Nature, 364: 593-599, L993). Also F (phenylalanine) was absent.
  • RNA polymerase having an increased ability to incorporate 3′-deoxyribonucleotide or a derivative thereof by modifying a part of the amino acid of wild-type RNA polymerase was found, and the base of the DNA of the present invention was found.
  • the sequencing method was completed.
  • mutant RNA polymerase used in the present invention is a site which is not suggested or taught in the above-mentioned JP-A-8-205874. This time, something completely new has been discovered.
  • a further object of the present invention is to provide a method for reading a base sequence more accurately from a more practical point of view, by eliminating bias on incorporation even when fluorescently labeled 3′-deoxyribonucleotides are used.
  • the present invention relates to a method for preparing ATP, GTP, ⁇ and 11 in the presence of an RNA polymerase and a DNA fragment containing a promoter sequence for the RNA polymerase.
  • ribonucleosides 5, triphosphates and 3, dATP Nucleic acid transcription by reacting one or more 3 'deoxyribonucleoside 5' triphosphates (hereinafter referred to as 3 'dNTP derivatives) consisting of 3, dGTP, 3' dCTP, 3 'dUTP and their derivatives
  • 3 'dNTP derivatives consisting of 3, dGTP, 3' dCTP, 3 'dUTP and their derivatives
  • a nucleic acid transcription product obtained by separating the obtained nucleic acid transcription product and reading the nucleic acid sequence from the obtained separated fraction, wherein the RNA polymerase has a capability of a corresponding wild-type RNA polymerase.
  • the present invention relates to the method for determining a nucleotide sequence of DNA, wherein the 3 ′ dNTP derivative is a 3 ′ deoxyribonucleotide derivative represented by the following general formula [I].
  • the present invention relates to the above-described method for determining the nucleotide sequence of DNA, wherein the nucleic acid transcription production reaction is performed in the presence of an inorganic pore phosphatase.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence (first half) of the T7 RNA polymerase encoded with the T7 RNA polymerase gene on the T7 phage genome.
  • the upper row shows the nucleotide sequence, and the lower row shows the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number at the right end is the DNA sequence for the base sequence Indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in the GeneBank database.
  • the amino acid numbers are 883, with the first M (methionine) of the T7 RNA polymerase as 1 Indicates that it consists of amino acid residues.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of T7 RNA polymerase (second half), which is encoded by the T7 RNA polymerase gene on the T7 phage genome.
  • the upper row shows the nucleotide sequence, and the lower row shows the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number at the right end indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in the DNA sequence database GeneBank in the case of a nucleotide sequence, and the amino acid number is the first number of the T7 RNA polymerase.
  • M a (methylcarbamoyl Onin) as 1, c indicating that it is from a full-length 883 amino acid residues
  • Figure 3 compares the amino acid sequences of the phage-derived RNA polymerases currently reported (first half). Based on the T7 RNA polymerase at the top, indicates that the amino acid is the same as that of the T7 RNA polymerase, one is missing, and * at the bottom is an amino acid that is common to all polymerases. Show.
  • Figure 4 shows a comparison of the amino acid sequences of the phage-derived RNA bolimase currently reported (second half). Based on the top T7 RNA polymerase, indicates that the amino acid is the same as T7 RNA polymerase, one indicates deletion, and the bottom * indicates an amino acid that is common to all the polymerases .
  • FIG. 5 is a detailed diagram of a site where a mutation site is introduced into T7 RNA polymerase. Open characters indicate that the amino acid has been mutated.
  • Figure 6 compares the amino acid sequences of T7 RNA polymerase and T3 RNA polymerase (first half). Based on the top T7 RNA polymerase, ⁇ indicates the same amino acid,-indicates deletion, and * at the bottom indicates that the amino acid is common to the two polymerases. You.
  • Figure II compares the amino acid sequences of RNA polymerase 7 and T3 RNA polymerase (second half). Based on T7 RNA polymerase at the top, 'indicates the same amino acid,-indicates deletion, and * at the bottom indicates an amino acid common to the two polymerases.
  • FIG. 8 shows the sequences before and after residues 641-667 of T7 RNA polymerase, and the corresponding regions of T3 RNA polymerase, K11 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase amino acid sequences.
  • T7 RNA polymerase all residues are shown, but for the corresponding T3, KlI, SP6, the same residues as T7 are indicated by a dot (dot).
  • FIG. 9 is a construction diagram of pT7R, a plasmid that expresses wild-type T7 RNA polymerase.
  • FIG. 10 shows the construction of pT7RF644Y, a plasmid that expresses the mutant T7 RNA polymerase F644Y.
  • FIG. 11 shows the construction of pT7R-Xho, an improved plasmid of pT7R, having a restriction enzyme Xhol site in the T7 RNA polymerase gene.
  • FIG. 12 is a construction diagram of a plasmid, PT7RL665P / F667Y, which expresses a mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y.
  • FIG. 13 is a construction diagram of a plasmid, pT7R F644Y / L665P / F667Y, which expresses a mutant T7 RNA volimerase F644Y / L665P / F667Y.
  • FIG. 16 shows carboxyrhodamine X-labeled 3′-dexoxytidine-5′-triphosphate obtained in Synthesis Example 14 (V is one C ⁇ C one in the general formula (I) and n 5 shows the results of measuring the ultraviolet-visible absorption spectrum of the compound of formula (6).
  • FIG. 17 shows the carboxyrhodamine 6G-labeled 7-deza-3′-dexoxyadenosine-5′-triphosphate obtained in Synthesis Example 23 (where V is one C ⁇ in the general formula [I]).
  • FIG. 20 shows carboxy rhodamine 110-labeled 7-deaza-3′-dexoxyguanosine-5′-triphosphate obtained in Synthesis Example 39 (where V is 1 C in the general formula [I]).
  • FIG. 29 shows the improvement of the uptake rate of dye terminator by mutant T7 RNA polymerase.
  • Rox-3 'dCTP was used as the die terminator.
  • FIG. 30 shows the improvement in the uptake rate of the dye terminator by the mutant T7 RNA polymerase F644Y.
  • Rox-3 'dCTP was used as the dye terminator, and displayed as an electrogram.
  • FIG. 31 shows the improvement of the uptake rate of the diamine stimulator by the mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y.
  • Rox-3 'dCTP was used as the die terminator and displayed as an electrogram.
  • Wild-type T7 RNA polymerase (WT) mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y (F667Y).
  • FIG. 32 shows an example of a sequence reaction using wild-type T7 RNA polymerase (WT), mutant T7 RNA polymerase F644Y (F644Y), and mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y (F667Y). Both have the same sequence pattern, but with wild-type T7 RNA polymerase (WT) (top row), base calls do not function properly, and the base intervals are narrowed (base indications overlap). You can see that the sequence has not been completed.
  • WT wild-type T7 RNA polymerase
  • F644Y mutant T7 RNA polymerase F644Y
  • F667Y mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y
  • Fig. 33 shows a comparison of sequence results using T7 RNA polymerase using mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y and a dye terminator having a different linker length.
  • FIGS. 34 (1) and (2) show the sequence results when a vector having a T7 promoter was used as type II.
  • FIG. 35 shows the sequence results when the PCR product was used for type I.
  • Figure 36 (1) and (2) show the results of the sequencing reaction using mutant T7 RNA polymerase. The results of a sequence showing the effect of the addition of inorganic pyrophosphatase (no addition and 0.425 unit addition) are shown.
  • Fig. 37 (1) and (2) show the sequence results showing the effect of adding inorganic pyrophosphatase on the sequencing reaction using mutant T7 RNA polymerase (0.0425 units added and 0.0004 25 added). (Unit addition).
  • FIG. 38 shows the sequence results showing the effect of adding inorganic pyrophosphatase on the sequence reaction using the PCR product as type I.
  • FIG. 39 shows the results of a sequence performed on hTSH-
  • the read nucleotide sequence was compared with the previously reported hTSH-jScDNA.
  • FIG. 40 shows the results of a sequence of hTSH-] 3 cDNA with the addition of inorganic pyrophosphatase.
  • the read nucleotide sequence was compared with the previously reported hTSH-] 3 cDNA.
  • FIG. 41 (1) to (4) show the results of improvement in the uptake rate of the dye terminator 1 by the mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y as an electrogram.
  • Figure 42 shows the termination 'pattern (A) obtained using TMR_3'dUTP (n4) as the terminal in Reference Example 8 and TMR-Ally 3'dUTP (n4) as the terminator. ) Shows a termination pattern (B) obtained by using the above method.
  • the method for determining the nucleotide sequence of DNA comprises the steps of: (a) providing a DNA fragment containing an RNA polymerase and a promoter sequence for the RNA polymerase; ) Derivatives, especially fluorescent substances And a 3'dNTP derivative having a linker inserted between it and 3, deoxyribonucleotide, and reading the sequence of the nucleic acid from the pattern of the separated fraction of the nucleic acid transcription product obtained. It is characterized by using mutant RNA polymerase as RNA polymerase.
  • the mutant RNA polymerase used in the present invention may have at least one of the wild-type RNA polymerase so as to increase its ability to incorporate a dNTP derivative as compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase.
  • one of the amino acids are those which are modified, the term "wild type RNA polymerase” refers to any RNA polymerase Ichize naturally occurring.
  • wild-type RNA polymerase is a wild-type RNA polymerase that has an increased ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase.
  • RNA polymerase obtained by artificially modifying a wild-type RNA polymerase for a purpose other than the above is also included in the “wild-type RNA polymerase”.
  • amino acid substitution, insertion, or deletion is performed within a range that maintains the activity as RNA polymerase.
  • wild-type RNA polymerase examples include RNA polymerase derived from T7 phage, T3 phage, SP6 phage, and K11 phage. However, it is not limited to these RNA polymerases. Further, in the present invention, “wild-type RNA polymerase” refers to naturally occurring heat-resistant RNA polymerase and naturally occurring RNA polymerases that have been artificially modified to be thermostable (ie, by substitution, insertion or deletion of amino acids). However, it is appropriate that the modification for imparting heat resistance has been performed within a range that maintains the activity as an RNA polymerase.
  • mutant RNA polymerase of the present invention using a heat-resistant RNA polymerase as the “wild-type RNA polymerase” also becomes heat-resistant.
  • T7 RA polymerase is known as a very specific promoter monospecific RNA polymerase.
  • the nucleotide sequence and production method of T7 RNA polymerase are described in Da ⁇ loo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: 2035-2039 (1984). Further mass production has already been described in Zawadzki et al., Nucl. Acids Res., 19: 1948 (1991).
  • this phage-derived RNA polymerase can perform a transcription reaction using only a single polypeptide (Chamberlin et al., Nature, 228: 227-). 231, 1970). Therefore, it has become an excellent source for analyzing the transcription mechanism, and many mutants have been isolated and reported.
  • Sousa et al. Nature, 364: 593-599, 1993 describes the results of crystal analysis.
  • T3 phage that infects Escherichia coli, SP6 phage that infects Salmonella, and K11 phage-derived RNA polymerase that infects Klebsiella pneumoniae are also well known as three highly specific promoter-specific RNA polymerases. Have been. The four types of RNA polymerases are very similar in amino acid primary structure, promoter sequence, and the like, as described later.
  • the mutant RNA polymerase used in the present invention has an increased ability to incorporate 3, deoxyribonucleotide or a derivative thereof as compared to the ability of the corresponding wild-type RNA polymerase. It is. As described above, the wild-type RNA polymerase had a lower incorporation of 3'-deoxyribonucleotides than ribonucleotides, which hindered its use in nucleotide sequencing. In contrast, the mutant RNA polymerase has been modified to increase its incorporation capacity for 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives, preferably at least twice as much as the wild-type.
  • RNA polymerase can also improve incorporation of such 3, deoxyribonucleotide derivatives.
  • the ribonucleotide means ribonucleoside 5 ′ triphosphates composed of ⁇ , GTP, CTP and UTP or derivatives thereof
  • 3 ′ deoxyribonucleotide is 3 ′ dATP, 3 ′ dGTP, 3 ′ dCTP and 3 ′ dUTP, and derivatives thereof mean compounds in which these 3 ′ deoxyribonucleotides are, for example, fluorescently labeled.
  • RNA polymerase of the present invention is obtained by modifying at least one amino acid of the corresponding wild-type RNA polymerase. This will be described in detail below.
  • RNA polymerase mutants with little or no bias in incorporation efficiency depending on the type of ribonucleotides in T7 RNA polymerase.
  • the present inventors first constructed an expression plasmid PT7R into which a T7 RNA polymerase gene was inserted, and then constructed a mutant of a T7 RNA polymerase based on the expression plasmid pT7R. That is, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, and F882Y, which are mutant T7 RNA polymerases in which the F (phenylalanine) residue of T7 RNA polymerase was changed to a Y (tyrosine) residue, were constructed. The incorporation ability of the mutants was compared. Furthermore, literature ((Sousa, EMBO J., 14 :.
  • the amino acid sequence of the wild-type T7 RNA polymerase is determined by the nucleotide number of the T7 phage DNA sequence (39,937 base pairs) of accession No. V01148 J02518 X00411 from GeneBank, a gene sequence database. It is based on the sequence encoded in 3171-5822 (see Figures 1 and 2). The upper part of the sequence shown in Figs. 1 and 2 The lower row of the column is the amino acid sequence corresponding to that sequence.
  • the number on the right end indicates the number of the T7 phage genome (Locus T7CG, 39, 937 base pairs) registered in GeneBank, and the amino acid number is the first M (methionine) of T7 RNA polymerase. ) Is 1 to indicate that it consists of 883 amino acid residues in total length.
  • amino acid sequence is the same as the amino acid sequence reported in Moffatt et al., J. Mol. Biol., 173 (2): 265-269, 1984.
  • the amino acid sequence of the wild-type 7 RNA polymerase gene and the number assigned to each amino acid in the present specification are the sequences and numbers shown in FIGS. 1 and 2.
  • the wild-type 7 RNA polymerase may further have an amino acid substitution, insertion or deletion other than the modification intended in the present invention.
  • the wild-type RN ⁇ volimerase to be mutated to increase its ability to incorporate 3 'deoxyribonucleotides or their derivatives is one in which another mutation has been introduced into the wild-type T7 RNA polymerase.
  • the amino acid number changes according to the insertion or deletion, and the amino acid number differs from the number shown in FIGS. 1 and 2.
  • T7 RNA polymerases with such insertions or deletions will also have the ability to take up 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives, as long as they retain T7 RNA polymerase activity. Included in the category of wild-type T7 RNA polymerases that introduce mutations for the purpose of increasing.
  • the amino acid sequence numbers for RNA polymerases other than T7 RNA polymerase are determined based on the sequence listings shown in FIGS. Further, it may further have amino acid substitution, insertion or deletion other than the modification intended in the present invention. You. Therefore, these amino acid sequences and their numbers are the same as in the case of T7 RNA polymerase, and when there is a mutation due to insertion or deletion of an amino acid, the amino acid number described above is changed according to such insertion or deletion.
  • the wild-type T7 RNA polymerase which introduces a mutation for the purpose of increasing the ability to incorporate 3'-deoxyribonucleotides or their derivatives in the present invention is also a wild-type RNA polymerase having such a partial mutation. It is included in the category of Z.
  • the T7 RNA volimerase gene is a primer specific to the N-terminal amino acid region upstream of the T7 RNA polymerase gene (T7Rpol-N: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3 ') and a primer specific to the downstream of the C-terminal amino acid region (T7Rpol-C: 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G -3') It can be used to amplify and express expression vector PT7R using PCR (see Reference Example 1). Transformation of Escherichia coli DH5a using this expression vector and addition of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) will result in the expression of a large amount of ⁇ 7 RNA polymerase protein.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • RNA polymerase gene Comparison of the amino acid sequence of the RNA polymerase gene with the amino acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 revealed that both sequences were completely identical.
  • the wild-type RNA polymerase based on the mutant RNA polymerase of the present invention is obtained by substituting amino acids other than the modifications targeted in the present invention with respect to the sequences shown in FIGS. 1 and 2.
  • T7 RNA polymerase purified from Escherichia coli having the expression vector pT7R had sufficient RNA synthesis activity in vitro in the presence of DNA containing the T7 promoter. Based on this expression plasmid pT7R, Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, and F882Y were constructed as mutant T7 RNA polymerases, and these mutants were tested for their uptake ability. A comparison was made.
  • mutant T7 RNA polymerase having the F644Y mutation in addition to the mutation for F644, a mutation in which L665 near F644 was set to P according to the report of Grachev et al. Described above was also introduced. That is, a mutation was introduced as F644Y / S665P, and the effect of L665P was examined.
  • mutant T7 RNA polymerase having the F667Y mutation also introduced a mutation in which L665 near F667 was changed to P in accordance with the report of Grachev et al., In addition to the mutation for F667. That is, the mutation was introduced as 665P / F667Y.
  • F644Y, F644Y / H665P, L665P / F667Y and F644Y / L665P / F667Y sufficiently maintain RNA synthesis activity, and 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP, 3' Significant improvement in the uptake of dUTP or their derivatives was seen.
  • the uptake ability of the F644Y / L665P mutant was equivalent to that of the F644Y mutant.
  • the results show that substitution of 665 for leucine with proline has no effect on the incorporation of 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP, 3' dUTP or their derivatives.
  • Table 1 shows only the results of the L665P / F667Y mutant, and the F667Y mutant had the same uptake ability as the L665P / F667Y mutant. In addition, the F644Y / L665P / F667Y mutant had the highest uptake ability. Although not shown in Table 1, the uptake capacity of the F644Y / F667Y mutant was almost equivalent to that of the F644Y / L665P / F667Y mutant.
  • the F782Y mutant retained the RNA synthesis activity and also slightly improved the ability to take in 3 ′ dATP, 3 ′ dGTP, 3 ′ dCTP, 3 ′ dUTP or derivatives thereof.
  • the F733Y mutant showed a slight improvement in the incorporation of 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP, 3' dUTP or their derivatives, although the RNA synthesis activity was slightly reduced.
  • the F646Y mutant retained RNA synthesis activity, it did not show any improvement in the uptake ability of 3 ′ dATP, 3 ′ dGTP, 3 ′ dCTP, 3 ′ dUTP or their derivatives.
  • F882Y did not show the results in Table 1 because the RNA synthesis activity was significantly reduced.
  • the Y639F mutant of T7 RNA polymerase which corresponds to Y526 of T7 DNA polymerase, retains RNA synthesis activity, but has 3 'dATP, 3' dGTP, 3 'dCTP, and 3' dUTP. Alternatively, no improvement in the uptake ability of those derivatives was observed.
  • the mutant RNA polymerase in particular, is modified at least one amino acid present in the “nucleotide binding site” of the polymerase Such modifications can increase the ability of the corresponding ribonucleotide to incorporate 3, deoxyribonucleotides or other ribonucleotide analogs.
  • nucleotide binding site is, for example, the amino acid in the loop between helix Y and helix Z of wild-type RNA polymerase and the amino acid in the loop between Z or helix Z and helix AA.
  • helix Z (Corresponding to amino acid residues 625 to 634 of T7 RNA volimerase) and helix Z (corresponding to amino acid residues 649 to 658) (corresponding to amino acid residues 635 to 647), helix Z and helix AA
  • the loop (corresponding to amino acid residues 659 to 684) sandwiched between (corresponding to amino acid residues 685 to 699) is considered to be a part of the ribonucleotide binding site located very close to the nucleotide .
  • the F residue present in 644, 646, 667 of the region corresponding to this loop was actually replaced with a Y residue (see FIG. 5).
  • the F residues 733, 782 and 882 are present in a region other than the region corresponding to the loop, and are thought to face the inside of the kraft in the polymerase molecule. Even these F residues were actually substituted with Y residues.
  • the present invention relates to an RNA polymerase which is modified at an amino acid in a region selected from the region corresponding to amino acid residues 641-667 of the RNA polymerase derived from T7 phage.
  • Amino acid residue of RNA polymerase from T7 phage The region corresponding to groups 641-667 corresponds to the aforementioned “nucleotide binding site”.
  • the four RNA polymerases are very similar in amino acid primary structure, promoter sequence, and the like. 3 and 4 show the amino acid sequences of the above-described four phage-derived RNA polymerases in comparison. This comparison indicates that RNA polymerases from T7, T3, and K11 are very similar. In particular, as shown in FIGS.
  • T7 and T3 phage-derived RNA polymerases have very high similarity. Both T7 and T3 phages are phage that infect E. coli, which is very similar in nature. Furthermore, the promoter sequences recognized by these two RNA polymerases are similar, but their recognition specificity is known to be extremely high. Thus, it is relatively easy to adapt the results obtained in T7 RNA polymerase to other RNA volimases with similar amino acid sequences.
  • the region corresponding to amino acid residues 641-667 of T7 phage-derived RNA polymerase in RNA polymerase other than T7 phage-derived RNA polymerase is derived from T3 phage.
  • RNA polymerases from T7, ⁇ 3, and K11 are very similar, and adapting the results for T7 RNA polymerase to other RNA polymerases with similar amino acid sequences. (See Figure 8).
  • the RNA polymerase is, for example, an RNA polymerase derived from T7 phage, which has a tyrosine at amino acid residue 644 or 667. NA polymerase can be mentioned. Further, an RNA polymerase which is a T3 phage-derived RNA polymerase and has a tyrosine at amino acid residues 645 or 668 can also be exemplified. Furthermore, an RNA polymerase derived from the K11 phage and having a tyrosine between amino acid residues 664 to 669 or 690 can also be exemplified.
  • RNA polymerase derived from SP6 phage which has a tyrosine between amino acid residues 633-638 or 670, can also be exemplified.
  • amino acid modifications can be insertions or deletions, as well as amino acid mutations.
  • the amino acid mutation is, for example, replacing at least one of the naturally occurring amino acids with tyrosine.
  • the naturally occurring amino acid to be substituted can be, for example, phenylalanine.
  • the substitution is not limited to phenylalanine, but may be any amino acid substitution that can increase the ability of the corresponding liponucleotide to incorporate 3'-deoxyribonucleotides or other liponucleotide analogs.
  • the mutant T7 RNA polymerases F644Y, L644P / F667Y and F644Y / L665P / F667Y have sufficient RNA synthesis activity, and further have a significantly improved 3 ′ dNTPs incorporation ability, and have a wild-type
  • the strong bias observed in was significantly reduced.
  • the mutant T7 RA polymerase F644Y, L665P / F667Y or F644Y / L665P / F667Y having such excellent properties, the bases of the transcription products can be used at a practical level beyond the DNA sequencing method using DNA polymerase. The sequencing method becomes possible.
  • Escherichia coli pT7RF644Y (DH5) that produces mutant T7 RNA polymerase F644Y and 665P / F667Y ⁇ ) and pT7RL665P / F667Y (DH5a) have the International Research Depository Nos. 5998 (FERM-BP-5998) and 5999 (FERM-BP-5999) on July 2, 1997, respectively.
  • Escherichia coli pT7RF644Y / L665P / F667Y (DH5a) that produces type T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y was designated as Life Science Research Depositary No. 6364 (FERM-BP-6364) on May 20, 1998. It has been deposited with the Research Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-0046, Japan).
  • the mutant RNA polymerase prepares a nucleic acid molecule encoding an RNA polymerase and amplifies the nucleic acid molecule so as to mutate one or more bases at one or more sites in the nucleotide base sequence. It can be produced by mutating and then recovering the modified RNA polymerase expressed by the mutated nucleic acid molecule. Preparation of a nucleic acid molecule encoding an RNA polymerase, introduction of a mutation into the nucleic acid molecule, and recovery of the modified RNA polymerase can all be performed using a known method.
  • the mutant T7 RNA polymerase can be constructed, for example, by the following method. Using an expression vector containing the T7 RNA polymerase gene as a type III gene, the region between the restriction enzymes HpaI and NcoI corresponding to the C-terminal side of the T7 RNA polymerase gene was mutated using PCR. Construct an expression plasmid into which is introduced. Then, the expression plasmid is used to transform Escherichia coli DH5, and when isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is added, a large amount of the mutant T7 RNA polymerase protein can be expressed. it can.
  • IPTG isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside
  • a DNA fragment containing a promoter sequence can be a DNA product amplified by polymerase chain reaction.
  • a nucleic acid transcription production reaction can be performed.
  • the polymerase chain reaction for DNA amplification a method widely used as a PCR method can be used as it is.
  • the DNA fragment containing the promoter sequence can be a DNA fragment obtained by ligating the promoter sequence and the DNA fragment to be amplified and then cloning using an appropriate host. That is, in the present invention, there are no particular restrictions on the DNA sequence to be amplified, the primers, the conditions for amplification, and the like.
  • a polymerase chain reaction reaction system for amplifying a DNA fragment containing a promoter sequence 10 to 50 ng of genomic DNA or 1 pg of cloned DNA, ⁇ ⁇ ⁇ of each primer, 200 ⁇
  • the DNA polymerase can be carried out, for example, using Taq polymerase or the like as a DNA polymerase in a volume of 20 ⁇ l containing each 2′-deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • the inserted DNA must contain a promoter sequence for the RNA polymerase described below.
  • a primer having a phage promoter sequence in one of two types of primers is used, or a phage promoter sequence is included in the amplified inserted DNA.
  • the resulting PCR product can be subjected to in vitro transcription using an RNA polymerase that works by its promoter.
  • the promoter sequence for RNA polymerase can be appropriately selected depending on the type of RNA polymerase used.
  • a nucleic acid transcript such as an RNA transcript is synthesized from a DNA fragment containing a promoter sequence. Since the DNA fragment contains a promoter sequence for RNA polymerase, this promoter sequence activates the above-mentioned mutant RNA polymerase to synthesize a nucleic acid transcript such as an RNA transcript.
  • RNA transcripts such as RNA transcripts
  • a ribonucleoside 5 ′ triphosphate composed of ATP, GTP, CTP and UTP or a derivative thereof.
  • 3 ′ d NTP derivatives are used herein as a generic term for 3 ′ dATP, 3 ′ d GTP, 3 ′ d CTP, 3 ′ d UTP, and derivatives thereof.
  • NTPs ribonucleoside 5 'triphosphates
  • at least four compounds with different bases are required for the synthesis of transcripts, even when some of them are derivatives such as ATP. . However, two or more compounds containing the same base can be used.
  • a 3 'd NTP derivative is attached to the 3' end of the RNA or nucleic acid that is a transcription product.
  • RNA or nucleic acid fragments of various lengths whose 3 'end is a 3' d NTP derivative are obtained.
  • Such ribonucleoside analogs are obtained for each of the four types of 3 ′ d NTP derivatives having different bases. By preparing four types of this ribonucleoside analog, it can be used for determination of RNA or nucleic acid sequence [Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723].
  • One or more 3 ′ d NTP derivatives can be used in one nucleic acid transcription reaction.
  • the nucleic acid transcription reaction is performed four times, resulting in four different bases of the 3' dNTP derivative at the 3 'end.
  • a transcription product is obtained, which is a mixture of various RNAs or nucleic acid fragments having the same 3 ′ d NTP derivative at the 3 ′ end and different molecular weights.
  • the obtained four transcription products can be independently subjected to separation and sequence reading described below. It is also possible to mix two or more of the four types of transcription products and subject the mixture to separation and sequence reading.
  • RNA is based on four types of ribonucleoside 5 '
  • RNA polymerase in the presence of triphosphates and terminated by a 3 'dNTP derivative.
  • an RNA or nucleic acid ladder is generated for the sequence.
  • nucleic acid transcription is carried out in the presence of four types of ribonucleoside 5 'triphosphates having different bases, which are separated and the sequences of the four types of bases are read at once (simultaneously). Is preferred.
  • RNA or nucleic acid transcription products are separated.
  • This separation can be appropriately performed by a method capable of separating a plurality of product molecules having different molecular weights contained in the transcription product according to the molecular weight.
  • An example of such a separation method is electrophoresis.
  • HPLC and the like can be used.
  • the sequence of RNA or nucleic acid can be read from the band (RNA or nucleic acid ladder) obtained by subjecting the transcription product to electrophoresis.
  • the reading of the RNA or the nucleic acid ladder can be performed by labeling ribonucleoside 5 'triphosphates (NTPs), which are terminators used in the transcript reaction.
  • NTPs ribonucleoside 5 'triphosphates
  • the reading of RNA or nucleic acid ladder can also be performed by labeling a 3 ′ d NTP derivative used for a transcript reaction. Examples of the label include a radioactive or stable isotope or a fluorescent label.
  • the sequence of the transcription product can be read by measuring the mass of each transcription reaction product separated by electrophoresis or the like with a mass spectrometer.
  • a labeled 3 ′ dNTP derivative more specifically, a labeled
  • the transcription product is subjected to electrophoresis and the radioactive or stable isotope or the fluorescence of the band obtained is detected.
  • the sequence of the transcription product can be read.
  • the 3 ′ d NTP derivative By labeling the 3 ′ d NTP derivative in this way, there is no variation in the radioactive intensity or the fluorescent intensity between any of the bands, and the measurement is facilitated. Further, detection of radioactive or stable isotopes or ladders that generate fluorescence can be carried out, for example, by appropriately using an apparatus used for a DNA sequence sink.
  • transcription is also generated by detecting the radioactive or stable isotope or fluorescence of the band obtained by electrophoresis using radioactive or stable isotope or fluorescently labeled ATP, GTP, CTP and UTP.
  • the sequence of the object can be read.
  • 3 'dATP, 3' d GTP, 3 'd CTP and 3' dUTP labeled with different fluorescence are used, and the ends are 3 'dATP, 3' d GTP, 3 'd CTP or 3' dUTP.
  • a mixture of various transcription product fragments labeled differently can be subjected to electrophoresis to detect the four types of fluorescence of the band obtained, thereby allowing the sequence of RNA or nucleic acid to be read.
  • 3 ′ deoxyribonucleotide derivative As the fluorescently labeled 3 ′ dNTP, it is preferable to use a 3 ′ deoxyribonucleotide derivative shown below.
  • 3 ′ dNTP derivative used in the nucleotide sequence determination method of the present invention it is preferable to use a 3, deoxyribonucleotide derivative represented by the following general formula [I]. This is because the 3'-deoxyribonucleotide derivative represented by the general formula [I] is easily incorporated into a sequence in a polymerase chain reaction by RNA polymerase.
  • Q represents a 3′-deoxyribonucleotide residue
  • n represents an integer of 4 or more
  • R has fluorescence.
  • n in the general formula [I] represents an integer of 4 to 10.
  • R in the general formula [I] is preferably represented by the following general formula [VII].
  • the 3′-deoxyribonucleotide derivative represented by the general formula [I] of the present invention comprises: (a) a 3′-deoxyribonucleotide residue: Q,
  • the 3′-deoxyribonucleotide residues represented by Q include 7-dazapurine nucleotide residues represented by the following general formulas ( ⁇ ) and (III), and the following general formulas (IV) and (V) And a pyrimidine nucleotide residue represented by
  • R 3 one P 0 3 H 2: - P 2 0 6 H 3: - P 3 0 9 H 4 or an salt thereof, of such a salt
  • alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, and lithium salt
  • alkaline earth metal salts such as barium salt
  • ammonium salts such as triethylammonium salt and pyridine salt.
  • Organic amine salts are preferred.
  • the linker represented by the above general formula [VI] is a linker for bonding a 3′-deoxyribonucleotide residue represented by Q to a fluorescent group.
  • one terminal of the carbon atom forming the double bond or triple bond of the linker is the 5'-position of the pyrimidine nucleotide residue among the 3'-deoxyribonucleotide residues Q as described above.
  • the 7-dazapurine nucleotide residue is bonded to the 7-position, respectively, and the amino group of the linker is bonded to the carboxyl group on the fluorescent dye group to form a 3 ′ — Form a compound having a deoxyribonucleotide residue and a fluorescent dye group.
  • examples of the methylene chain in which n is 4 or more include a methylene chain in which n is 4 or more.
  • a tetramethylene group a pentamethylene group, Hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, nonamethylene group, decamethylene group and the like.
  • n is a force that is an integer of 4 or more, preferably n is an integer of 4 to 10, more preferably n is an integer of 4 to 8, and further preferably n is 4 or 6
  • the group having fluorescence may be directly bonded to the 1 N H- group, or may be bonded to the 1 N H- group via some kind of linker.
  • the group having fluorescence is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of fluorescence intensity, fluorescence wavelength, ease of incorporation by RNA polymerase, and the like.
  • the fluorescent group is a fluorochrome group that produces a detectable luminescent emission following stimulation by energy absorption from a suitable source such as an argon laser.
  • fluorescent group R examples include a group represented by the following general formula [VII].
  • Fluorescent groups of the general formula [VI I] are, in particular, fluorescent dye groups which, following stimulation by absorption of energy from a suitable source such as an argon laser, produce a detectable luminescent emission. It is.
  • W represents a carboxyl group
  • X represents one O—, one S—, —NR′— (where R ′ represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, an aralkyl group or an aryl group) or —CH 2 — represents one of ring A and ring B
  • Y represents OH or one NR, R 2 (wherein and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group, or both R, and R 2 represent a trimethylene group ( However, the other end of each of the two trimethylene groups is any one of carbon atoms on the ring to which the nitrogen atom having the two trimethylene groups is bonded, which is adjacent to the carbon atom bonded to the nitrogen atom. Is connected to each other)))),
  • X represents a bond at a position corresponding to the structure of ring A and ring B, and the benzene ring having rings A, B, C, and W further has a substituent.
  • the lower alkyl group represented by R ′ in one NR′— represented by X may be any of linear, branched or cyclic.
  • Examples thereof include an alkyl group having 16 carbon atoms, specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a pentyl group, an isopentyl group, Examples include a tert-pentyl group, a 1-methylpentyl group, an n-hexynole group, an isohexyl group, a cyclopropynole group, a cyclopentynole group, and a cyclohexyl group.
  • the aralkyl group represented by R ′ is, for example, an aralkyl group having 720 carbon atoms. Specific examples include benzyl, funetyl, phenylpropyl, methylbenzyl, methylphenethyl, ethylbenzyl, and naphthylmethyl. And a naphthylethyl group. Examples of the aryl group include a phenyl group, a tolyl group, a xylyl group, and a naphthyl group.
  • the part of the fluorescent dye group in the 3′-deoxyribonucleotide derivative of the present invention can take any state of the following formula.
  • the carboxyl group may be, for example, an alkali metal salt such as a sodium salt, a potassium salt or a lithium salt; an alkaline earth metal salt such as a barium salt; an ammonium salt such as an organic amine salt such as a trienium salt or a pyridine salt. Even if salt is formed
  • a ring A or in the substituent 2 ⁇ 1 ⁇ 13 ⁇ 4 2 to the ring B, and when Y is an N Ri R 2, and R 2 are both a trimethylene group And the other end of each of the two trimethylene groups is the number of carbon atoms on the ring to which the nitrogen atom having the two trimethylene groups is bonded, on both sides of the carbon atom bonded to the nitrogen atom.
  • ring C The wavy line in the above means a bond at a position corresponding to the structure of the ring A and the ring B. This is specifically shown as follows, for example.
  • ring A is In the case of, the position of the bond in ring c is as shown below.
  • ring B is If, the position of the bond at ring c is as follows:
  • the ring A (or ring B) and the ring C can take any of the following states.
  • the benzene ring having rings A, B, C and W in the above general formula [VII] may further have a substituent, and examples of such a substituent include an alkyl group, an alkoxy group, And a halogen atom.
  • the alkyl group may be linear, branched, or cyclic, and may have a double bond. Examples thereof include an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. And a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, ventil, isopentyl, tert-bentyl, 1-methylbenzyl, Preferred examples include an n-hexyl group, an isohexyl group, a cyclopropyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • a lower alkoxy group for example, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • the halogen atom include fluorine, chlorine, bromine, and iodine.
  • examples of the fluorescent dye group represented by the general formula [VII] include 5
  • TMR carboxytetramethylrhodamine
  • XR carboxyrhodamine
  • R 6 G carboxyrhodamine 6G
  • R 110 carboxy rhodamine 110
  • R 110 carboxyfluorescein, 5 (or 6) carboxy 2 ', 7'-diclofluorescein, 5 (or 6) carboxy 2 ', 4', 5 ', 7'-te
  • the 3′-deoxyribonucleotide derivative represented by the general formula [I] can be easily synthesized, for example, according to the following synthesis scheme.
  • R4 represents a fluorescent dye group as described above.
  • the formal names used in the following synthesis schemes are as follows.
  • NPETFA 5-trifluoroacetamide 1-pentyne
  • NHETF A 6—Trifluoroacetamide 1—Hexin
  • NHT f a trifluoroacetamide
  • Tris (TBA) PP tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate
  • TEAB Triethylammonium bicarbonate buffer
  • TCD I 1, 1'-thiocarbonyldiimidazole
  • a I B N 2, 2'-azobis (isobutyronitrile),
  • nBu 4 NF Tetrabutylammonium fluoride
  • a c 20 acetic anhydride
  • HMP A Hexamethylphosphoramide
  • MC P B A m—black mouth perbenzoic acid
  • R 4 -OS u imidyl succinate of fluorescent dye group.
  • the 3′-deoxyribonucleotide derivative represented by the above general formula [I] can be used as a terminator for RNA elongation reaction in the DNA base sequencing by the chain termination method using the mutant RNA polymerase of the present invention.
  • the use of these makes it possible to more reliably determine the nucleotide sequence of DNA.
  • the type I DNA whose nucleotide sequence is to be determined is identified by the promoter of each RNA polymerase.
  • ribonucleotides of adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and peracyl (U), and different fluorescent dyes represented by the general formula [I] corresponding to the ribonucleotides Stop reaction of RNA polymerase at each base site in the presence of four 3'-deoxyribonucleotide derivatives modified with, and mix the products in one lane. After electrophoresis, the DNA base sequence can be determined sequentially by spectroscopy of the fluorescence wavelength caused by laser excitation.
  • the combination of the fluorescent dye and the four types of 3'-deoxyribonucleotides is particularly effective when the four types of sequences are determined in one lane in parallel.
  • fluorescent dyes used in Examples of the present invention: 5-carboxy-X-rhodamine succinate imidoester (XR), 5-carboxyrhodamine 6G imidester succinate (R6G), 5-carboxytetramethylrhodamine succinate Acid imidoester
  • TMR 5-force norboxoxy mono-damine 110-bis-trifnoreo-acetate conjugated imidoxy ester
  • the following combinations and amounts of the fluorescent terminators are used in the examples of the present invention.
  • Examples of preferable combinations of a fluorescent dye and four types of 3′-deoxyribonucleotides when using T7R RNA polymerase and its mutants are shown below. However, these are merely examples, and if the fluorescent dye changes, the preferable combination also changes. Examples of combinations of fluorescent dyes and bases
  • nucleic acid transcription production reaction in the presence of inorganic pyrophosphatase
  • the nucleic acid transcription production reaction is carried out in the presence of inorganic pyrophosphatase.
  • the difference in peak height (signal strength) obtained for each labeled ribonucleotide is reduced. This is preferable from the viewpoint that the accuracy of reading the sequence is improved and more accurate sequence data can be obtained.
  • Pyrophosphorolysis is caused by an increase in pyrophosphate generated by DNA synthesis, and serves to promote the reaction in a direction in which the synthesized DNA product is degraded. As a result, pyrophosphorolysis will inhibit sequencing in dideoxy sequencing using DNA polymerase. In contrast, when inorganic pyrophosphatase is used in the dideoxysequencing method using DNA polymerase, it is known that pyrophosphorolysis is inhibited and stable sequence data is obtained [ JP-A-4-5006002]. However, it was not known how pyrophosphorolysis works in the sequencing method using RNA polymerase. Therefore, as a result of the study by the present inventors, it has been found that more stable sequence data can be obtained by performing the nucleic acid transcription production reaction in the presence of inorganic pyrophosphatase in the method of the present invention.
  • Inorganic pyrophosphatase (EC. 3.6.1.1.1) is available as a commercial product, and is commercially available, for example, as INORGANIC PYROPHOSPHATASE from Sigma and as pyrophosphatase from Beelinger.
  • the amount of inorganic pyrophosphatase used depends on the degree of activity of inorganic pyrophosphatase and RNA polymerase.
  • RNA polymerase 57 Depending on, for example, it is suitably in the range of 10- 6 to 10- 2 units for 1 unit of RNA polymerase.
  • the DNA sequence used as transcription type II can be determined.
  • the RNA or nucleic acid sequence information obtained from the four types of ladders can be combined to determine the DNA sequence used as the ⁇ type of transcription.
  • the RNA or nucleic acid sequence information obtained from each ladder is integrated.
  • the transcription of RNA or nucleic acid sequence information obtained from one ladder is determined.
  • the DNA sequence used as type ⁇ can be determined.
  • sequence method of the present invention can also be used as various kits.
  • the corresponding 3′-deoxyribonucleotide or a derivative thereof is less likely to be incorporated into the polyribonucleotide sequence, or the 3′-deoxyribonucleotide in the ribonucleotide and the 3′-deoxyribonucleotide are more difficult to incorporate into the polyribonucleotide sequence.
  • the nucleotide sequencing method of the present invention is more than the nucleotide sequencing method using DNA polymerase.
  • the DNA base sequence of the PCR product can be directly determined without purifying the PCR product. This is due to the characteristic of RNA polymerase that the 2 'dNTP remaining in the reaction mixture is not consumed as a reagent in the RNA transcription reaction in the presence of 3' d NTP for sequencing. Things. Furthermore, in the method of the present invention, since the transcription reaction of RNA is used, there is no need to use a single-stranded template DNA as in a normal DNA sequencing method, nor is there a need for a primer. There is no need for a transformation step for a single hybridization.
  • the nucleotide sequence of DNA can be easily determined without being affected by regeneration of the PCR product. Further, in the method for determining a nucleotide sequence of a DNA of the present invention, when a mutant RNA polymerase having thermostability is used as the RNA polymerase, it can be used together with the step of performing the PCR method. It is possible to determine the nucleotide sequence of DNA more quickly.
  • 0D is measured over time, and when 0D drops sharply, by centrifugation, the bacterial residue is removed, and NaCl and polyethylene glycol 6000 are added to the final concentrations of 0.5M and 10%, respectively. It added to a, and allowed to stand well after stirring overnight at 4 e C, a precipitate formed. The precipitate was collected by centrifugation, SM buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7. 5, 10 mM MgS0 4,
  • the suspension was suspended in 50 mM NaCl, 0.01% gelatin). This concentrated solution of T7 phage is then placed on a CsCl solution of different density carefully layered on a centrifuge tube.
  • phage protein was denatured by phenol treatment of the phage solution, and T7 phage genomic DNA was purified.
  • the T7 RNA polymerase gene is encoded in this genomic DNA at positions 39 to 5822 out of 39,937 base pairs. [The complete nucleotide sequence of the T7 genomic gene has already been reported by Dunn et al. ( 1983, J. Mol. Biol., 166 (4): 477-535). However, there is a minor correction (see T7 phage DNA sequence in GeneBank, accession No. V01148 J02518 X00411)]. Using this genomic DNA as type I, it was amplified by PCR and cloned into the expression vector as shown below (see Fig. 9). That is, the restriction enzyme Nco
  • T7Rpol-N5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA containing the cleavage site and upstream of the N-terminal amino acid region of the T7 RNA volimerase gene
  • 60 PT7R which overexpresses T7 RNA polymerase, was constructed by ligating with the expression vector pTrc99a (Pharmacia's Biotech) digested and dephosphorylated with I. Plasmid pT7R, which expresses wild-type T7 RNA polymerase, is transformed into Escherichia coli DH5a, Escherichia coli that is resistant to the antibiotic ampicillin is cultured, IPTG is added to the culture solution, and the expression vector-pT7R The included Trc promoter was activated.
  • the pT7R into which the wild-type ⁇ 7 RNA polymerase gene is inserted is transformed into ⁇ -type, and the region flanked by the restriction enzymes HpaI and NcoI corresponding to the C-terminal side of the T7 RNA polymerase gene is mutated using PCR. Introduced. More specifically, the primer to which the mutation is introduced is divided into left and right sides with the base to which the mutation is to be introduced as a boundary.
  • F646Y (+) (5, -GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC-3 '), F646Y (-) (5'-one GTC
  • Each DNA fragment was amplified. These DNA fragments have complementary parts, and by repeating denaturation, annealing, and extension reactions, DNA fragments into which the desired mutation was introduced were produced. This DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis by excising only the DNA fragment of the desired size, and this was used as a ⁇ -type to re-amplify using primers T7RNAP-HpaI-N and pTrc99a_PstI-C, and Cut at Hpa I and Pst I. This DNA was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, separated, and the desired DNA fragment was excised and purified.
  • Mutation is introduced by replacing this DNA fragment with the HpaI and PstI DNA fragments of pT7R, transformed into Escherichia coli DH5, and the plasmid with the mutation is selected, and finally the nucleotide sequence is confirmed. As a result, it was confirmed whether the mutation was introduced at the target position. Then, an expression plasmid pT7RF644Y for producing a mutant T7 RNA polymerase F644Y was obtained. The production of mutant T7 RNA polymerase F644Y from this plasmid could be induced by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, similar to the production of wild-type T7 RNA polymerase. .
  • mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y was carried out in the same manner as the construction of F644Y described above, based on the PCR method as follows.
  • the restriction enzyme Xhol was introduced into the T7 RNA polymerase gene region in the pT7R expression vector containing the wild-type T7 RNA polymerase gene to facilitate the mutagenesis operation.
  • telomere pT7R The amplified DNA fragment reacts with the restriction enzymes Apal and Xhol, and the latter amplified DNA fragment reacts with the restriction enzymes Aflll and Xhol.
  • the expression vector pT7R is treated with Apal and Aflll beforehand, and all of the T4 DNA is amplified. Ligation was used to bind. This reaction was transformed into Escherichia coli DH5a, and several colonies growing on agar plates containing the antibiotic ampicillin were obtained. Select some of these colonies, culture them, extract plasmid DNA,
  • a plasmid pT7R-Xho in which a restriction enzyme Xhol site was created in the T7 RNA polymerase gene region was obtained (see FIG. 11).
  • the Xhol site can be cleaved by treatment with the restriction enzyme Xhol, and the nucleotide sequence of DNA can be determined to confirm its presence.
  • PCR was performed using a combination of GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3 ') and Brimer-AflllR. Using this PCR product directly as type III, determine the base sequence of DNA,
  • mutant T7 RNA polymerase 665P / F667Y from this plasmid can be induced by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, as in the production of wild-type T7 RNA polymerase. there were.
  • mutant T7 RNA vomerase protein introduced into E. coli was purified.
  • the wild type of this protein has already been described in Chamberl in, M et al. Nature,
  • E. coli cells are collected by centrifugation, and typically 10 g of wet weight E. coli can be obtained from two liters of the culture solution. If the E. coli cells are not used immediately, they can be stored in a freezer below -20 ° C. After this step, all steps of enzyme purification are carried out at a temperature below room temperature, preferably 0-5 ° C, unless otherwise specified. At this time, the E. coli was washed with a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTANa2 at 25 ° C) 10 times the cell weight.
  • a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTANa2 at 25 ° C
  • the cells are sonicated for 80W for minutes to disrupt the cells and reduce the viscosity. Then, 12,000x g ,
  • Centrifugation was performed at 4 ° C for 10 minutes to remove cell debris. While stirring the obtained supernatant, 10% streptomycin sulfate was slowly added dropwise to a final concentration of 2.0%, and then stirring was continued for another 30 minutes. 12,000xg. Centrifuge at 4 ° C for 10 minutes to remove the precipitate, stir while adding powdered sulfuric acid, and form a precipitate. In this case, the precipitate is first collected with 30% ammonium sulfate (30% ammonium sulfate precipitation), and the supernatant is further added with stirring ammonium sulfate to 60% saturated ammonium sulfate to form a precipitate again (30-60%).
  • the eluate is collected by fractionating an appropriate amount into a test tube, immediately performing SDS-acrylamide gel electrophoresis, analyzing the protein, and finding that the protein exists near the molecular weight that is considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. Inspect the fractions. A typical example should be found near 0.4M NaCl. Collect fractions containing this protein,
  • the eluate is collected by fractionating an appropriate amount into a test tube, immediately performing SDS-acrylamide gel electrophoresis, analyzing the protein, and determining whether the protein exists near the molecular weight that is considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. Inspect the picture. A typical example should be found near 0.24M NaCl.
  • the fractions containing this protein are collected and dialyzed against 500 ml of a storage buffer (50% glycerol, 20 mM KP04 > ⁇ 7.7, 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 ⁇ g / ml PMSF) for 16 hours. Store at -20 ° C until use.
  • test for in vitro RNA synthesis activity or contaminating ribonuclease activity As an example of this method, for in vitro RNA synthesis activity, a plasmid containing the T7 promoter was used as type II, and a commercially available wild-type T7 RNA polymerase (BRL Gibco) was used as a standard. An RNA synthesis reaction was performed using the enzyme dilution method, and the approximate titer was estimated by agarose electrophoresis of the synthesized RNA. At this time, since the degree of degradation of the synthesized RNA is also observed, a simple assay for contaminating ribonuclease is possible at the same time.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y is based on PCR in the same manner as the construction of the expression plasmid that produces the mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y (see Reference Example 2). The procedure was as follows.
  • the expression plasmid which produces 665P / F667Y by mutating T7 RNA polymerase is designated as ⁇ , and the primers Xho-F and T7-D0UBLE-R (21mer: 5, -CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3 ' ) And primers T7-DOUBLE-F (29mer: ⁇ '-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3 ') and the primer ⁇ R-R, respectively.
  • ⁇ The expression plasmid which produces 665P / F667Y by mutating T7 RNA polymerase
  • primers Xho-F and T7-D0UBLE-R 21mer: 5, -CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3 '
  • primers T7-DOUBLE-F 29mer: ⁇ '-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3 '
  • the primer ⁇ R-R respectively.
  • a DNA fragment of the desired size was purified.
  • the two purified DNAs are mixed, PCR is performed using primers Xho-F and ⁇ -R as type I, and the amplified DNA fragment is subjected to restriction enzyme mapping and DNA base sequence analysis to obtain the desired fragment.
  • an enzymatic reaction was performed using the restriction enzymes Xhol and ⁇ ⁇ ⁇ , and this was ligated to the plasmid PT7RL665P / F667Y previously treated with the restriction enzymes Xhol and Aflll using the T4 DNA polymerase.
  • This reaction was transformed into Escherichia coli DH5a to obtain several colonies growing on agar plates containing the antibiotic ampicillin.
  • the mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y could be purified by the same method as described in Reference Example 3. As a typical example, 1,000,000 units of the mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y protein was purified from 1 liter of the culture solution. The obtained RNA polymerase was almost a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and RNase was not detected in this sample.
  • 3'-Doxycytidine (compound 5: 3.0 g, 13.2 mraol) was suspended in a mixed solution of 1,4-dioxane (300 tnl) and ethanol (30 ml), cooled to 10 ° C, and then cooled to silver trifluoroacetate. (7.0 g, 31.7 mmol) and iodine (8.04 g, 31.7 ol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the precipitate was filtered off through celite, washed with 1,4-dioxane, and the filtrate and the washing solution were combined and concentrated to give 3′-doxy-5-hydroxy-cytidine.
  • Tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate obtained in Synthesis Example 4 was added to a DMF solution (3.6 ml) containing 0.5 M, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, a mixture of triethylamine and water (5 ml) was added, and the mixture was allowed to stand overnight. Then, 25% aqueous ammonia (20 ml) was added and the mixture was allowed to stand for 4 hours. The reaction mixture is washed with ether and concentrated to dryness.
  • the obtained XR-3 'd CTP (n 3) was measured for UV-visible absorption spectrum using a DU 640 UV-visible spectroscopy system (manufactured by Beckman Co., Ltd.) (measurement wavelength: 700 to 200 nm, control: distilled water) is shown in FIG.
  • Trifluoroacetamide (8.99 g, 79%) was added to a solution of sodium hydride (60% oil; 2.55 g, 63.6 mol) in DMF (50 ml). 6 ol) was added in about 10 parts under ice-cooling. Next, a solution of 6-node-1-hexine (3.31 g, 15.9 ol) in DMF (15 ml) was added. The reaction solution was stirred at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was extracted with saturated aqueous ammonium chloride (100 ml) and ether (100 ml). The ether layer was dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • the obtained XR-3 'd CTP (n4) was measured for its UV-visible absorption spectrum using a DU 640 UV-visible spectroscopy system [manufactured by Beckman Co., Ltd.] (measurement wavelength: 700-200 nm, control: distilled water) is shown in FIG.
  • a suspension of lithium acetylide ethylenediamine complex (manufactured by Aldrich Co .; 11.3 g, 122.5 mmol) and dimethyl sulfoxide (50 ml) was cooled to 5 to 10 ° C, and 1-bromo-6-tetrahydro- Pyranyloxyhexane (Sigma; 25 g, 94.3 ol) was added dropwise over 2 hours. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Water (10 ml) was added to the reaction solution, stirred for 10 minutes, poured into water (150 ml), and extracted with ether (300 ml).
  • 6-chloro-9- (3'-Doxy-ribofuranosyl) -7-dazapurine (Compound 15: 1.47 g, ⁇ .45 mmol) was dissolved in pyridine (15 ml), and acetic anhydride (5 ml) was added. The mixture was stirred at room temperature. After completion of the reaction, the mixture was cooled to 0 ° C., methanol (5 ml) was added, the mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in chloroform, washed with 0.5N hydrochloric acid and saturated saline.
  • Et represents an ethyl group
  • Me represents a methyl group
  • This reaction solution was added to a DMF solution (4.8 ml) of 0.5 M-tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate cooled to 120 ° C., and stirred at room temperature for 3 hours. After the reaction was completed, a mixture of triethylamine and water (15 ml) was added, and the mixture was allowed to stand overnight. After that, 25% aqueous ammonia (20 ml) was added and the mixture was allowed to stand for 4 hours. The reaction mixture was washed with ether, concentrated and dried, and the residue obtained was concentrated to dryness.
  • 6-Trifluoroacetamide-1-hexyne obtained in Synthesis Example 7 was added to a solution of 3'-deoxy-5-odouridine (Compound 2: 805 mg, 2.27 mmol) in DMF (12 ml) under a nitrogen stream. 1.31 g, 6.80 tnmol), copper (I) iodide (86.3 mg, 0.453 mmol), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (262 mg, 0.227 marl ol) and triethylamine (0.663 ⁇ 1,4.53 mmol) ) And reacted at room temperature for 4 hours.
  • tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (226 mg, 0.20 mmol) and triethylamine (0.56 ml) , 4. Orrnnol) was added and reacted at room temperature for 1 hour. .
  • the reaction solution was added to a DMF solution (3.6 ml) containing 0.5 M of tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate cooled to 120 ° C., and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Thereafter, a mixture of triethylamine and water (4 ml) was added, and the reaction mixture was washed with ether.
  • DEAE-Toyopearl ion exchange column chromatography (1.7 X 30 cm; eluent: triethylammonium bicarbonate buffer (pH 7.5)) Purification was performed using a 0M ⁇ 0.6M linear concentration gradient (total volume: 2L). 20 ml) and allowed to stand for 1 hour.
  • Rl10-labeled 7-daza-3'-dexoxyguanosine-5'-triphosphate represented by the following formula [V is one in the general formula [I].
  • a compound where C ⁇ C and n 4. Hereinafter, it is abbreviated as Rl10-3'dGTP (n4). 3.38 / imol was obtained (42.3% yield) 0
  • N-propargyl trifluoroacetamide (0.47 ml) obtained in Synthesis Example 40 was placed in a DMF (6.7 ml) solution of 7-odo-3'-deoxy-7-dazaadenosine (compound 18: 0.5 g, 1.33 mmol) in a nitrogen stream. 1), copper (I) iodide (51 mg, 0.266 mmol), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (154 mg, 0.133 mol) and triethylamine (0.37 ml, 2.66 mmol). The reaction was performed at room temperature for 30 minutes.
  • N-propargyltri obtained in Synthesis Example 40 in a solution of 3'-deoxy-7-iod-7-deazaguanosine (compound 30: 0.65 g, 1.7 mmol) in DMF (8.5 ml) under a nitrogen stream.
  • the mixture was added to a DMF solution (3.6 ml) containing 0.5 M and stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, a mixture of triethylamine and water (4 ml) was added, and the reaction solution was washed with ether.
  • This reaction solution was added to a DMF solution (3.6 ml) containing 0.5 M of tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate cooled to 120 ° C., and stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, a mixture of triethylamine and water (15 ml) was added, and the mixture was allowed to stand overnight. After washing the reaction solution with ether, DEAE-Toyopearl ion exchange column chromatography (1.7 ⁇ 40 cm; eluent: triethylammonium bicarbonate buffer ( ⁇ 7. ⁇ ) 0 ⁇ ⁇ 0.3 ⁇ linear concentration gradient ( Purified in a total volume of 1 L)).
  • TMR-Allyl-3 'dUTP (n4) was measured for its UV-visible absorption spectrum using a DU 640 UV-visible spectroscopy system (manufactured by Beckman Co., Ltd.). : 700 nm to 200 nni, symmetry: distilled water) is shown in FIG. Synthesis Example 62
  • the product was purified by DEAE-Toyopearl ion exchange column chromatography (1.7 ⁇ 40 cm; eluent: triethylammonium hydrogen carbonate buffer (pH 7.5) 0M ⁇ 0.3M linear concentration gradient (total volume 1 L)). To this, 17% aqueous ammonia (60 ml) was added, the mixture was allowed to stand at 5 ° C for 15 hours, and concentrated under reduced pressure.
  • This reaction solution was added to a DMF solution (3.6 ml) containing 0.5 M of tris (tri-n-butylammonium) pyrophosphate cooled to 120 ° C., and stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, a mixture of triethylamine and water (5 ml) was added, and the mixture was left standing overnight. After washing the reaction mixture with ether, DE AE-Toyopearl ion exchange column chromatography
  • Et represents an ethyl group
  • Me represents a methyl group
  • reaction mixture methylene chloride - diluted with methanol mixture (40 ml), ion-exchange resin AG1X8 (Biola de Co., HC0 3 - type; 2.96 g) was stirred for 30 minutes added. After filtration, the residue obtained by concentrating the filtrate is subjected to silica gel column chromatography (eluent; methylene chloride-metachloride).
  • the UV-visible absorption spectrum of the obtained R110-Allyl-3 'd ATP (n4) was measured using a DU 640 UV-visible spectroscopic analysis system (manufactured by Beckman Co., Ltd.). The measurement results (measurement wavelength: 700 nm to 200 nm , symmetry: distilled water) are shown in FIG.
  • the plasmid vector p BluescriptKS (+) (Stratagene) having the T7 promoter was reacted with the restriction enzyme PvuII or Seal, and the linearized version was used as type II.
  • mutant T7 RNA polymerase F644Y or L665P / F667Y were added, and the reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour in a total reaction volume of 10 il.
  • the transcript is purified by a gel filtration method using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech). The mixture was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator. According to the ABI PRISM 377 DNA Sequencing System Instruction Manual Ver. 1.0 of PerkinElmer Japan, Inc., this dried reaction product is dissolved in formamide / EDTA / Blue dextran loading buffer 6 ⁇ 1?
  • FIG. 30 shows the peak intensity of the sequence ladder obtained using the mutant T7 RNA polymerase F644Y in comparison with the peak intensity obtained using the wild-type T7 RNA polymerase. Further, FIG. 31 shows the peak intensity of Sequence Ladder obtained using the mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y in comparison with the peak intensity obtained using the wild-type T7 RNA polymerase. From these comparisons, the peak height of the mutant enzyme has less variation compared to the wild type,
  • the sequence reaction by the dye terminator method was compared between the purified mutant T7 RNA polymerase F644Y and L665P / F667Y and the wild-type T7 RNA polymerase as follows.
  • the method exemplified in Example 1 and shown by Melton, DA (1984, Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056) was used. More specifically, the plasmid vector pBluescriptKS (+) having the T7 promoter was reacted with the restriction enzyme PvuII or Seal, and the linearized version was used as the ⁇ -type, which was used as a 3 ′ dNTP derivative.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour by adding 25 units of Polymerase F644Y to a total reaction volume of 10 / il.
  • the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech). Was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator. ABI PRISM 377 of PerkinElmer Japan Co., Ltd.
  • plasmid vector pBluescriptKS (+) (Stratagene) having a T7 promoter was reacted with a restriction enzyme PvuII, and a linearized version was used as type II, and 0.25 ⁇ / reaction was used.
  • Example 4 Using a denaturing gel for sequence analysis, analysis was performed using the ABI 377 DNA Sequencer and an analysis program. The results are shown in FIG. In FIG. 33, the upper part shows the result using the terminator used in Example 2, and the lower part shows the result using the die terminator 1 having a longer linker. The combination of a long term dye terminator and a mutant T7 RNA polymerase results in higher incorporation efficiency than the conditions of Example 2 using a shorter term dye terminator. I understand. These results indicate that the analysis of a base sequence using an in vitro transcription reaction is possible at a practical level.
  • Example 4 Example 4
  • Sequence reaction in which a vector having a T7 promoter was used as a type I transcription reaction in vitro was performed in the same manner as in Examples 1 to 3, Melton, DA (1984, Nucleic Acids Res., 12: 7035- 7056). Specifically, a plasmid vector P BluescriptKS (+) (Stratagene) having a T7 promoter was reacted with a restriction enzyme PvuII, and a linear form was used as a type II.
  • the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia's Biotech). It was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
  • hTSH- ⁇ cDNA subcloned into the EcoRI site of pBluescriptKS (+) (Stratagene) was used. However, it is not limited to hTSH-i3 cDNA, and any gene can be used. good. It is important to explain the present example that if a T7 promoter that recognizes T7 RNA polymerase can be supplied to the PCR product whose base sequence is to be determined, the sequence can be performed as in this example. is there.
  • One method of supplying a T7 promoter in a PCR product that allows for sequencing is to use the T7 promoter sequence at the 5'-end of either primer and start transcription necessary for transcription during PCR. By adding dots, this goal can be achieved with any DNA.
  • Another method is the method described in the present example below, but using a plasmid preliminarily retaining the T7 promoter and using a primer that sandwiches at least the T7 promoter, the T7 promoter is used. It is possible to obtain a PCR product with a certain degree. Useful for performing the latter PCR
  • 129 As vectors the pBluescript series, pBC Phagemid vector-1 (Stratagene) and pGEM vector series (Promega) are commercially available.
  • lOOfg a plasmid containing this hTSH-
  • the dried reaction product is transferred to ABI PRISM 377 of Parkin Elma Japan, Inc.
  • Inorganic pyrophosphatase (PPase) without RNase contamination was purified as follows, but is not limited to the following method.
  • a crudely purified yeast-derived product (Sigma 1-1643, EC. 3.6.1.1.1) manufactured by Sigma was used as a buffer solution (20 mM Tris-HC1). , 1 mM EDTA, pH 7.9) Suspended in 1 ml, dialyzed against the same buffer for 2 hours, desalted, and dialysed from the SP Sepharose column chromatogram (Pharmacia Biotech) Made).
  • Example 6 Effect of Addition of Dye Terminator with Linker and Inorganic Pyrophosphatase on Sequence Reaction Using Mutant T7 RNA Polymerase Effect of PPase Purified in Reference Example 6 in Sequence Transcription Reaction in vitro It was investigated. First, the reaction was carried out with the added amount of purified PPase varied to determine the added amount. The sequence reaction is described in Melton, DA (1984, Nucleic Acids Res., 12:
  • the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia's Biotech). It was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
  • the sequence reaction was performed as follows.
  • the type III of the PCR reaction used human thyroid-stimulating hormone (hTSH- ⁇ ) cDNA pBluescriptKS (, +), which was subcloned at the EcoRI site of Stratagene, but hTSH- ] 3 It is not limited to cDNA, but may be any gene.
  • the hTSH-] 3 This plasmid with c DNA, using 100f g, to exist in the form sandwiching the cloning site 220 primer one (5, -TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A- 3,) and 1211 primers one (5'_ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T-3 ') PCR reaction with 20 ⁇ l reaction volume [(94 ° C for 2 minutes) Once,
  • RNA polymerase F644Y25 Twenty-five units of type T7 RNA polymerase F644Y25 were added thereto, and the reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour in a total reaction volume of ⁇ . When adding PPase, the equivalent of 0.000042 unit was added. Next, in order to remove unreacted dye and luminescent remaining in the reaction product, the transcript was purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech). The purified product was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
  • the dried reaction product is dissolved in formamide / EDTA / BluedeX tran loading buffer 6 ⁇ 1 according to ABI PRISM 377 DNA Sequencing System Instruction Manual Ver. Using ⁇ 377 DNA Sequencer and an analysis program (Sequencing Analysis Ver. 3.), use 2 ⁇ l of the gel on a modified gel for sequence analysis containing 6 ⁇ urea / 4% Long Ranger TM acrylamide solution (FMC). 0).
  • FMC Long Ranger TM acrylamide solution
  • Fig. 39 shows the results without the addition of inorganic pyrophosphatase.
  • the type II transcription reaction is performed by reacting plasmid pBluescript (KS +) (Stratagene) with a restriction enzyme, PvuI I, and using a linearized product. ATP, CTP, GTP, and UTP are each used.
  • the mutant T7 RNA polymerase F644Y / L665P / F667Y means that it is an enzyme that is more likely to incorporate 3′-dATP by a factor of 558 than the wild-type enzyme.
  • the F644Y / L665P / F667Y mutant is the most mutant mutant enzyme that incorporates 3'-dNTP among the mutant enzymes that were created.
  • sequence transcription reaction was performed using the method described in Melton, DA [Nucleic Acids Res., 12: 7035-7036 (1984)].
  • ⁇ (about 10 ng) was used for the sequence reaction.
  • the reaction was performed as a 3′-dNTP derivative, using the same dye terminator as used in Example 2; uMR6G-3′dATP [5-carboxyrhodamine 6G-labeled 3′-deoxyadenosine-5-trifos).
  • Mutant T7 RNA polymerase under the conditions of 500 ⁇ , 250 ATP, 200 ⁇ CTP, 500 ⁇ GTP, 2 mM spermidine- (HCI) 3, 5 mM DTT, 40 mM Tris / HCl pH8.0 (BRL, Gibco) 25 units of F644Y / L665P / F667Y were added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour with a total reaction volume of 10 ⁇ 1.
  • the transcript is purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech). It was evaporated to dryness using a centrifugal evaporator.
  • the dried reaction product was dissolved in formamide / EDTA / Blue dextran loading buffer ⁇ 1 according to ABI PRISM 377 DNA sequencing System Instruction Manual Ver.
  • a denaturing gel for sequence analysis containing 6 ⁇ urea / 4% Long Granger TM acrylamide solution (FMC), ⁇ 377 DNA sequencer and horn? Analysis was performed using an analysis program (Sequencing Analysis Ver.3.0) to obtain an elect-mouth ferogram.
  • Figure 41 shows the results. Thus, good sequence analysis is possible.
  • -T7 RNA polymerase (manufactured by Gibco BRL): 37 samples of 25 units. After heating at C for 30 minutes, the unincorporated promoter was removed by a gel filtration method using a Sephadex G25 column (manufactured by Pharmacia), and the precipitate was collected by centrifugation. Next, the precipitate was washed with 4 ⁇ formamide dye.
  • FIG. 7 Electrophoresis was performed using a fluorescence automatic sequencer (manufactured by ⁇ ⁇ ).
  • Figure 42A shows the result of matrix conversion of the gel image of the sequencer obtained using TMR-3 'd UT ⁇ (n4) as the terminator (termination pattern), and the TMR as the terminator.
  • -Allyl The matrix image of the sequencer gel image obtained using 3 'dUTP (n 4)

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Description

明細書
DN Aの塩基配列決定方法 技術分野
本発明は、 DNA の塩基配列決定方法に関する。 特に本発明は、 変異 型 RNA ポリ メ ラーゼを用いる DNAの塩基配列決定方法に関する。 さ らに本発明は、 蛍光標識されたターミネータ一と して新規な 3'デォキ シリボヌクレオチド誘導体を用いる DNAの塩基配列決定方法に関する。 さ らに本発明は、 核酸転写生成反応に無機ピロフォスファターゼを併用する DNA の塩基配列決定方法に関する。 背景技術
ポリ メ ラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 法は優れた方法であり、 年々その利 用範囲力 広カ Sつてレヽる [Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。 PCR 法では、 1分子の DNA 断片を増幅すること も可能で ある。 PCR 法で増幅した生成物をクローニングすることなく シークェ ンスする方法 （ダイ レク ト · シークェンス法） も有用な方法である [Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330,384-386]。 この方法は ライブラ リ一作製やそのライブラ リーのスク リ一ニングが不要であり 多くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法である。
しかるに、 上記ダイ レク ト · シークェンス法には 2つの大きな問題 点がある。 一つは、 取り込めなかったプライマー及び 2 ' デォキシリボヌク レ オシ ド 5，ト リ フォスフェー ト （ 2 ' d N T P s ) が反応系中に残存し、 これらがシークェンス反応を妨げることである。 従って、 従来法では、 これら残存するプライマ一と 2 ' d N T P s は、 シークェンスの前に P C R生成物から除去する必要があった。 P C R生成物の精製方法に は種々の方法があり、 例えば、 電気泳動による精製法、 エタノール沈 殿法、 ゲル濾過法、 H P L C精製法がある [例えば、 Dorit R. L et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, John Wiley and Sons, New York, 15.2.1 - 15.2. 11 参照」 。 し力 し、 何れの方法 でも煩雑である。
2つ目の問題は、 PCR 生成物の迅速な再生 （renaturation) である- P C R生成物が 2本鎖 D N Aに再生してしま う と、 1本鎖のテンプレ ― ト （錄型） ではなく なり、 ブライマーと 1 本鎖テンブレー 卜 との間 のァ二一リ ングを妨げる。 再生を最小限にするための方法と して、 例 えば変性後の急冷、 1 つのプライマーのピオチレ一ショ ン
(biotilation) と ス ト レプ トァ ビジン被覆物への P C R生成物の吸着、 ェク ソヌ ク レア一ゼの使用、 ァシンメ ト リ ッ ク P C R等が報告されて レヽる 例えば、 Barbara Bachmann ら、 1990， Nucleic Acid Res. , 18, 1309 に開示されている。 しかし、 これらの方法の殆どは、 長い時間を必要 と し、 非常に面倒である。 そこでそれらを解決するための新しい方法と して、 本発明者は、 PCR 反応系中に残存する未反応のブライマー及び 2 ' デォキシリボヌク レ オシド 5'ト リ フォスフェー ト （ 2 ' d T P s ) を除去することなく 、 かつ P C R反応生成物が迅速に再生する問題を回避するため、 変性自 体を全く行わないで良い、 全く新しい DNA の塩基配列決定方法を提 案した 〔W096八 4434〕 。 この方法は、 T7 RNAポリ メ ラーゼ等の RNA ボ リ メラーゼと R N A転写反応のタ一ミネーター （例えば、 3 ' デォキ シ リ ボヌ ク レオシ ド 5 ' ト リ フォスフェー ト、 3 ' d N T P s ) を用 いるダイ レク ト転写シークェンス法である。 この方法によれば、 ポリ メ ラ一ゼ連鎖反応によ り増幅した D N A生成物の塩基配列を、 プライ マ一及び 2 ' デォキシリ ボヌク レオシ ド 5， ト リ フォスフエ一 ト （ 2 ' d N T P s ) を除去する必要なしにそのままシークェンスに使用でき る。 さらに、 変性自体を全く行わないため、 P C R生成物が迅速に再 生する問題も回避でき、 極めて優れた方法である。
と ころが、上記方法について本発明者がさ らに研究を行ったと ころ、 よ り正確な塩基配列データを得るためには、 さらに解決すべき課題が あることを見出した。
上記塩基配列決定法において、 T7 RNAポリ メ ラ一ゼ等の RNAポリ メ ラ一ゼは、 ATP 、 GTP 、 CTP 及び UTP 又はそれらの誘導体からなる リ ボヌク レオシ ド 5，ト リ フォスフエ一 ト類並びに 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP、 3' dUTP或いはそれらの誘導体からなる少なく とも 1種の 3' デォキシリボヌク レオチ ドの混合物中で反応させる。 この反応におい て、 铸型の配列に相応した塩基を有する リボヌク レオチ ド及びデォキ シリボヌク レオチ ドが、 リボヌク レオチ ド配列中に逐次取り込まれる ことで、 ポリ リ ボヌク レオチ ドが合成される。
と ころが、 リボヌク レオチ ドに比べて、 対応する 3' -デォキシリ ボ ヌク レオチ ドやその誘導体は、 上記配列に取り込まれにくいこと、 さ らに、 リ ボヌク レオチ ドの中及び 3 ' -デォキシリボヌク レオチドの中 でもそれぞれ塩基の種類によ り 、 配列への取り込まれ方に差があるこ とが判明した。 このよ うにリボヌク レオチ ドと 3 ' -デォキシリボヌク レオチドとの間、 並びに異なる塩基を有する リ ボヌク レオチド間及び 異なる塩基を有するデォキシリ ボヌク レオチ ド間でのバイアスが存在 するため、 転写生成物は得られるものの、 得られる転写生成物は短鎖 であったり、 標識されたリ ボヌク レオチ ドからのシグナルにバラツキ があったり して、正確なシークェンスデータを得ることは難しかった。 そこで、 本発明の目的は、 この取り込み能力に対してヌク レオチ ド の種類によるバイアスが少ない力 、 或いは全く ない RNA ポリ メラー ゼを用いて、 長鎖の転写生成物の生成が可能であり 、 標識されたデォ キシリボヌク レオチ ドからのシグナルにバラツキが少ない、 よ り正確 なシークェンスデータを得ることが可能な D N Aの塩基配列決定方法を提 供することにある。
尚、 本明細書中において、 アミノ酸残基は、 慣例により使用されている一文字 表記法を用いる。 本文中に出てくるアミノ酸のみ、 理解のために記述すると、 フ ェニルァラニン（F)、 チロシン（Y)、 プロリン（Ρ；)、 ロイシン（し）、 ヒスチジン（Η)で ある。 また、 ポリメラーゼ蛋白質の Ν末端からの番号を記し、 例えば F667 という ように表す。 これは、 このポリメラーゼの 667番目のアミノ酸残基が F であるこ とを示し、 F 667Yの記述は、 667番目のアミノ酸残基 Fを Υに置換させたことを 意味する。 ところで、 DNA ポリ メラーゼについても、 ヌク レオチドの種類によ り取り込みに差異があることが知られており 、 さ らにこのような取り 込みの差異を解消した変異型の DNA ポリ メ ラーゼが知られている 〔特 開平 8 - 205874号、 Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 92 : 6339-6345, 1995)〕 。 そこには、 T7 DNAポリメラーゼを用いたシークェンス反応における均一性は、 このポリメラーゼ中の 526番目のアミノ酸が生み出しているということが記載さ れている。 さらに、 この酵素とその他の DNAポリメラ一ゼのアミノ酸配列の相同 性に基づいて、 他の DNAボリメラ一ゼの相同部位のァミノ酸を変えることにより、 取り込みのバイアスが低下すると記載されている。 即ち、 T7 DNAポリメラ一ゼの Y (チロシン） 526力；、 2' - dNTPと 2' 3 ' -ddNTPの取り込み効率のバイアスが少なレヽ 原因である。 更に、 大腸菌 DNAポリメラ一ゼ Iの F (フエ二ルァラニン） 762、 及び Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ （Taq DNA ボリメラ一ゼと一般には呼ばれて いる） の F (フエ二ルァラニン） 667力；、 T7 DNAポリメラ一ゼの Y526の相同なアミ ノ酸残基であり、 このアミノ酸残基を各々、 F762Y (チロシン）および F667Y (チロシ ン）に変化させることで取り込みバイアスが低下すると記載している。
さらに、 このような DNAポリメラ一ゼに関するデータに基づいて、 T7 R N Aポ リメラーゼについても、 DNAポリメラ一ゼで議論されている領域と相同な領域、 即 ち残基 631-640に対する修飾は dNTPに対するその特異性を変化させるであろうこ とを示唆している、 と記載している。
しかるに、 RNA ポリ メ ラーゼについては、 これまでシークェンス法 に使用されることはなく 、 リボヌク レオチ ドの取り込みに差異がある こと自体問題にならなかった。 さらに、 このよ うな状況下、 当然のこ とながら、 取り込みの差異を解消した変異型の RNA ポリ メ ラ一ゼは 知られていなかった。 事実、 上記特開平 8- 205874号公報には、 T7 R N Aポリメラーゼを修飾した実例は記載されていない。
さらに、 T7 R N Aポリメラーゼのこの領域は、 Protein Engineering, 3 : 461-467, 1990に示されているモチーフ B 中の、 DNAポリメラーゼの α型、 I型及び DNA依 存性 RNAポリメラ一ゼ （T7RNAポリメラ一ゼはこの中に分類される） に特に保存さ れたアミノ酸 Κと Y Gに挟まれた 9〜 1 0アミノ酸残基からなる領域に相当する と考えられる。 先に DNAポリメラーゼで議論された大腸菌 DNAポリメラ一ゼのァ ミノ酸残基 7 6 2あるいは T a q DNAポリメラーゼのアミノ酸残基 6 6 7の F (フ ェニルァラニン） は、 I型に分類されている DNAポリメラ一ゼの多くに観察され る。 しかるに、 驚いたことに、 DNAポリメラーゼと極めて相同性が高いにも係わら ず、 T7RNAポリメラ一ゼでは、 上記領域に相当する残基 631-640には F (フエ-ル ァラニン）は存在せず、 上記公報の示唆をそのまま実行することはできないことが 判明した。
加えて、本発明者は、大腸菌 DNAポリメラーゼ Iの F762の位置は、 フィンガー · サブドメインのへリックス 0に存在し、 T7 RNA ポリメラ一ゼにおいて、 この領域 に相当する領域におけるァミノ酸の修飾を検討した。 ところが Sousa et al.の文 献 (Nature, 364: 593-599， L993)で示された立体構造上からの、 大腸菌 DNAボリメ ラーゼ Iのヘリックス 0に相当する T7 RNAポリメラ一ゼ中のヘリックス Zにも F (フ ェニルァラニン）がなかつた。
このような状況下、 本発明者は、 この取り込み能力に対して リ ボヌク レ ォチ ド及び 3' -デォキシヌク レオチ ドの種類によるバイアスが少ない 力 、 或いは全く なレ、 RNA ポリ メ ラーゼを提供することを目的と して、 新たな R N Aポリ メ ラ一ゼを独自に探索した。 その結果、 野性型 R N Aポリメラ一ゼのァミノ酸の一部を修飾することで、 3'デォキシリボヌクレオチ ドまたはその誘導体を取り込む能力を増加させた R N Aポリメラーゼを見いだし て本発明の D N Aの塩基配列決定方法を完成した。
尚、 後述の説明から明らかになるが、 本発明で用いる変異型 R N Aポリメラ一 ゼ、 とくにそのアミノ酸修飾位置は、 上記特開平 8-205874 号には全く示唆も教示 もされていない部位であり、 今回、 全く新らたに見いだされたものである。
さらに本発明者の検討の結果は、 リ ボヌク レオチ ドの取り込みに関する バイアスは、 変異型 RNA ポリ メ ラ一ゼを用いるこ とである程度解消 されるが、 核酸伸長反応におけるターミネータ一と して蛍光標識した 3' デォキシリボヌクレオチドを使用した場合、 取り込みに関するバイアスが依 然と してある程度残ることが判明した。
そこで、 本発明の更なる目的は、 よ り実用的な観点から、 蛍光標識した 3'デォキシリボヌクレオチドを使用した場合でも取り込みに関するバイアス を解消して、 よ り正確に塩基配列を読み取れる方法を提供することに あ o。 発明の要約
本発明は、 R N Aポリメラーゼ及び前記 R N Aポリメラーゼのためのプロモー タ一配列を含む D N A断片の存在下、 A T P、 G T P、 〇丁 及び11丁？又はそ れらの誘導体からなるリボヌクレオシド 5，トリフォスフェート類並びに 3，dATP、 3，dGTP、 3'dCTP、 3'dUTP及びそれらの誘導体からなる 1種又は 2種以上の 3'デォキ シリボヌクレオシド 5'トリフォスフェート（以下 3'dNTP誘導体という）を反応させ て核酸転写生成物を得、 得られる核酸転写生成物を分離し、 得られる分離分画か ら核酸の配列を読み取る D N Aの塩基配列決定方法であって、 前記 R N Aポリメ ラーゼが、 対応する野性型 R N Aポリメラーゼの能力と比較して、 前記 3'dNTP 誘 導体を取り込む能力を増加させるように、 少なくとも 1つのアミノ酸が修飾され た野性型 R N Aポリメラーゼからなる変異型 R N Aポリメラーゼであることを特 徴とする D N Aの塩基配列決定方法に関する。
さらに本発明は、 上記 D N Aの塩基配列決定方法であって、 3'dNTP 誘導体 が下記一般式 [ I ]で示される 3'デォキシリボヌクレオチド誘導体である方法に関 する。
Q— V— ( C H 2 ) n - N H - R 〔门
〔式中、 Qは 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基を表し、 nは 1以上、 好まし くは 4以上の整数を表し、 Vは一 C≡C一又は一 C H = C H—を表し、 Rは蛍光 性を有する基を表す。 〕
さ らに本発明は、 上記 D N Aの塩基配列决定方法であって、 核酸転写生成 反応を無機ピ口フォスファターゼの存在下で行う方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 T7ファージゲノム上の T7 RNAボリメラ一ゼ遺伝子とコ一ドされている T7 RNA ポリメラ一ゼのアミノ酸配列 （前半） である。 上段は、 塩基配列、 下段はその 配列に対応するアミノ酸配列を示した。 右端の数字は、 塩基配列の場合、 DNA配列 データベース GeneBankに登録されている T7 ファ一ジゲノム（Locus T7CG, 39, 937 塩基対）の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ポリメラ一ゼき最初の M (メチ ォニン）を 1として、 全長 883アミノ酸残基からなっていることを示す。
図 2は、 T7ファージゲノム上の T7 RNAポリメラ一ゼ遺伝子とコ一ドされている T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列 （後半） である。 上段は、 塩基配列、 下段はその 配列に対応するアミノ酸配列を示した。 右端の数字は、 塩基配列の場合、 DNA 配列 データベース GeneBankに登録されている T7 ファージゲノム（Locus T7CG, 39, 937 塩基対）の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ポリメラ一ゼき最初の M (メチ ォニン）を 1 として、 全長 883アミノ酸残基からなっていることを示す c
図 3は、 現在報告されているファージ由来 RNAポリメラーゼのアミノ酸配列の比較 (前半） である。 最上段の T7 RNA ポリメラ一ゼを基準として、 ·は T7 RNA ポリメ ラ一ゼと同一のアミノ酸、 一は欠損、 最下段の *はすべてのポリメラ一ゼに共通し ているァミノ酸であることを示す。
図 4は、 現在報告されているファ一ジ由来 RNAボリメラーゼのァミノ酸配列の比較 (後半） である。 最上段の T7 RNA ボリメラ一ゼを基準として、 ·は T7 RNA ポリメ ラ一ゼと同一のアミノ酸、 一は欠損、 最下段の *はすべてのボリメラ一ゼに共通し ているアミノ酸であることを示す。
図 5は、 T7 RNAポリメラーゼの変異部位導入部位の詳細図である。 白ぬき文字は、 変異導入されたアミノ酸であることを示している。
図 6は、 T7 RNA ポリメラーゼと T3 RNA ポリメラ一ゼのアミノ酸配列の比較 （前 半） である。 最上段の T7 RNAポリメラ一ゼを基準として、 ·は同一のアミノ酸、 -は欠損、 最下段の *は 2つのポリメラ一ゼに共通しているアミノ酸であることを示 す。
図 Ίは、 Τ7 RNA ポリメラーゼと T3 RNA ボリメラ一ゼのァミノ酸配列の比較 （後 半） である。 最上段の T7 RNAポリメラーゼを基準として、 'は同一のアミノ酸、 —は欠損、 最下段の *は 2つのポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを 示す。
図 8は、 T7 RNA ポリメラーゼの残基 641-667 の前後の配列と、 それに対応する領 域の T 3 RNA ポリメラ一ゼ、 K11RNA ポリメラ一ゼ、 及び SP6RNA ポリメラーゼァ ミノ酸配列を示す。 T7RNA ポリメラーゼについては、 残基を全て示したが、 対応す る T3, Kl l, SP6については T7と同じ残基については · （ドット）で示した。
図 9は、 野生型 T7 RNAポリメラ一ゼを発現するプラスミ ド、 pT7Rの構築図である。 図 1 0は、 変異型 T7RNA ボリメラ一ゼ F644Yを発現するプラスミ ド、 pT7RF644Yの 構築図である。
図 1 1は、 T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子中に制限酵素 Xhol 部位を持つ、 pT7R の改 良型プラスミ ド、 pT7R- Xhoの構築図である。
図 1 2は、 変異型 T7RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y を発現するプラスミ ド、 PT7RL665P/F667Yの構築図である。
図 1 3は、 変異型 T7RNAボリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yを発現するプラスミ ド、 pT7R F644Y/L665P/F667Yの構築図である。
図 1 4は、 合成例 6で得られた、 カルボキシローダミン X標識 3' - デォキシシチ ジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが— C≡C—であって、 n = 3の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 1 5は、 合成例 1 0で得られた、 カルボキシローダミン X標識 3' - デォキシシ チジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔I〕 に於いて Vが一 C≡C—であって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 1 6は、 合成例 1 4で得られた、 カルボキシローダミン X標識 3' -デォキシシ チジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔I〕 に於いて Vが一 C≡C一であって、 n = 6の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 1 7は、 合成例 2 3で得られた、 カルボキシローダミン 6 G標識 7-デァザ- 3' - デォキシアデノシン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C 一であって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スペク トルを測定した結果を示す。 図 1 8は、 合成例 2 6で得られた、 力ルボキシロ一ダミン 6 G標識 7-デァザ- 3' - デォキシアデノシン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C三 C —であって、 n = 6の化合物） の紫外可視吸収スペク トルを測定した結果を示す。 図 1 9は、 合成例 3 0で得られた、 カルボキシテトラメチルローダミン標識 3' -デ ォキシゥリジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C一で あって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スペク トルを測定した結果を示す。
図 2 0は、 合成例 3 9で得られた、 カルボキシローダミン 1 1 0標識 7-デァザ- 3' - デォキシグアノシン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C —であって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。 図 2 1は、 合成例 5 3で得られたカルボキシローダミン 1 1 0標識 3，-デォキシシ チジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔I〕 に於いて、 V が一 C三 C一であつ て、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 2 2は、 合成例 5 4得られた、 カルボキシローダミン 6 G標識 3，-デォキシシチ ジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C—であって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 2 3は、 合成例 5 5で得られた、 カルボキシローダミン X標識 7-デァザ _3， -デ ォキシアデノシン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて、 V が一C三 C一であって、 n = 4の化合物）の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。 図 2 4は、 合成例 5 6で得られた、 カルボキシローダミン X標識 7-デァザ -3' -デ ォキシグアノシン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔I〕 に於いて、 V が一 C≡ C _であって、 n = 4の化合物）の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。 図 2 5は、 合成例 6 1で得られた、 カルボキシテトラメチルローダミン標識 3' -デ ォキシゥリジン- 5' -トリホスフエ一ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vが- CH=CH -であつ て、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 2 6は、 合成例 6 4で得られた、 カルボキシローダミン X標識 3'-デォキシシチ ジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vカ CH=CH -であって、 n = 4 の化合物） の紫外可視吸収スぺク トルを測定した結果を示す。
図 2 7は、 合成例 6 7で得られた、 カルボキシローダミン 6 G標識 3，-デォキシ -7 - デァザアデノシン- 5' -トリホスフヱ一ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vが- CH=CH -であ つて、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スべク トルを測定した結果を示す。
図 2 8は、 合成例 7 0で得られた、 カルボキシ口一ダミン 1 1 0標識 3'-デォキシ - 7 -デァザアデノシン - 5' -トリホスフエ一卜 （一般式 〔 I〕 に於いて V力; - CH=CH-で あって、 n = 4の化合物） の紫外可視吸収スペク トルを測定した結果を示す。
図 2 9は、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼによるダイ 'ターミネ一ターの取り込み率 の改善を示す。 ダイ 'ターミネータ一として、 Rox-3' dCTPを用いた。 野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ボリメラーゼ F644Y (F644Y)、 変異型 T7 RNA ボ リメラーゼ L665P/F667Y (F667Y) C
図 3 0は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Yによるダイ 'タ一ミネーターの取り 込み率の改善を示す。 ダイ .ターミネータ一として、 Rox-3' dCTP を用い、 エレク トログラムとして表示した。 野生型 T7 RNA ポリメラーゼ (WT)、 変異型 T7 RNA ポ リメラ一ゼ F644Y (F644Y)。
図 3 1は、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ L665P/F667Yによるダイ ·タ一ミネ一ター の取り込み率の改善を示す。 ダイ 'ターミネータ一として、 Rox- 3' dCTP を用い、 エレク トログラムとして表示した。 野生型 T7 RNAポリメラーゼ（WT)、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y (F667Y)。
図 3 2は、シークェンス反応例 野生型 T7 RNAポリメラ一ゼ（WT)、変異型 T7 RNAボ リメラーゼ F644Y (F644Y)、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y (F667Y)を用 いて反応した結果を示す。 何れも同じ領域のシークェンスパターンであるが、 野生 型 T7 RNA ポリメラーゼ（WT) (最上段）では、 ベ一スコールが正しく機能せず、 塩基 の間隔が狭まり（塩基の表示が重なってしまい）、 正しくシークェンスできていない 事が分かる。
図 3 3は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Yを用い、 リンカ一長の異なる ダイ ·ターミネータ一を用いて、 T7 RNA ポリメラ一ゼを用いたシークェンス結果 の比較である。
図 3 4 (1)及び（2)は、 T7 プロモータ一を持つベクタ一を铸型として用いた時のシ ークエンス結果を示す。
図 3 5は、 PCR産物を铸型に用いた時のシークェンス結果を示す。
図 3 6 (1)及び (2)は、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼを用いたシ一ケンシンス反応に 対する無機ピロホスファタ一ゼの添加効果を示すシ一クェンス結果 (無添加及び 0. 4 2 5単位添加） を示す。
図 3 7 (1)及び（2)は、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼを用いたシ一ケンシンス反応に 対する無機ピロホスファタ一ゼの添加効果を示すシークェンス結果 （0. 0425 単位添加及び 0. 004 25単位添加） を示す。
図 3 8は、 PCR産物を铸型として用いたシークェンス反応に対する無機ピロホスフ ァタ一ゼの添加効果を示すシークェンス結果を示す。
図 3 9は、 hTSH-|3cDNA について無機ピロホスファタ一ゼ無添加で行ったシ一ケン ス結果を示す。 読みとつた塩基配列を既に報告されている hTSH-jScDNA と比較し た。
図 40は、 hTSH - ]3cDNA について無機ピロホスファタ一ゼを添加して行ったのシ一 ケンス結果を示す。 読みとつた塩基配列を既に報告されている hTSH-]3cDNA と比 較した。
図 4 1 (1)〜（4)は、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Yによるダイ · ターミネータ一の取り込み率の改善結果をエレク トログラムとして表示した。 図 4 2は、 参考例 8においてタ一ミネ一タ一として TMR_3'dUTP(n4)を用いて得ら れたターミネ一シヨン 'パターン （A) 及びターミネータ一として TMR - Ally卜 3'dUTP(n4)を用いて得られたターミネーシヨン .パターン （B) を示す。
発明を実施するための態様
本発明の D N Aの塩基配列決定方法は、 R N Aポリメラ一ゼ及び前記 R N A ポリメラーゼのためのプロモータ一配列を含む DNA断片の存在下、 リボヌタレ ォチド （NTP) と 3'デォキシリボヌクレオチド （3，dNTP)誘導体、 特に蛍光物質 と 3，デォキシリボヌクレオチドとの間にリンカ一を挿入した 3'dNTP誘導体、 を反 応させ、 得られた核酸転写生成物の分離分画のパターンから核酸の配列を読み取 る事からなるものであり、 RNAポリメラーゼとして変異型の RNAポリメラー ゼを用いることに特徴がある。
変異型 RN Aポリメラ一ゼ
本発明に用いる変異型の R N Aポリメラーゼは、 対応する野性型 R N Aポリメ ラ一ゼの能力と比較して、 3，dNTP誘導体を取り込む能力を増加させるように、 野 性型 RNAポリメラ一ゼの少なくとも 1つのアミノ酸が修飾されたものである c 本発明において、 「野性型 RNAポリメラーゼ」 とは、 天然に存在する全て の RNAポリメラ一ゼを意味する。 さらに、 「野性型 RNAポリメラーゼ」 は、 野性型 RNAポリメラーゼであって、 対応する野性型 RN Aポリメラ一ゼの能力 と比較して、 3'デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を 増加させることを目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、 揷入または欠落を、 さ らに有するものであることもできる。 即ち、 野性型 RNAポリメラ一ゼを人為的 に上記以外の目的で修飾した RN Aポリメラーゼも、 上記 「野性型 RN Aポリメ ラーゼ」 に含まれる。 但し、 そのようなアミノ酸の置換、 挿入または欠落は、 R N Aポリメラ一ゼとしての活性を維持する範囲で、 行われたものであることが適 当である。
「野性型 RN Aポリメラーゼ」 としては、 例えば、 T 7ファ一ジ、 T3ファー ジ、 S P 6ファ一ジ、 K 1 1ファージに由来する RNAポリメラ一ゼを挙げるこ とができる。 但し、 これらの RNAポリメラ一ゼに限定されるものではない。 また、 本発明において 「野性型 RNAポリメラ一ゼ」 は、 天然に存在する耐熱 性の RNAポリメラ一ゼ、 及び天然に存在する RN Aポリメラーゼを耐熱性を有 するように人為的に修飾した （即ち、 ァミノ酸の置換、 挿入または欠落を行った） ものも包含する。 但し、 耐熱性を付与するための修飾は、 RNAポリメラ一ゼと しての活性を維持する範囲で、 行われたものであることが適当である。 「野性型 RNAポリメラーゼ」 として耐熱性の RN Aポリメラ一ゼを用いた本発明の変異 型 RN Aポリメラ一ゼも耐熱性となる。 その結果、 例えば、 PCR法に併用して、 PCR 産物を铸型としてその場で、 即ち、 PCR と並行して、 シークェンス用の RNAフラ グメントを合成することも可能である。
T7 R A ポリメラーゼは、 極めて特異性の高いブロモータ一特異的 RNA ポリメラ ーゼとして知られている。 T7 RNA ポリメラーゼの塩基配列と生産法に関しては Da丽 loo et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.USA. , 81:2035-2039 (1984)に記載されて いる。 さらに大量生産に関しては、 Zawadzki et al. , Nucl. Acids Res. , 19: 1948(1991)に既に記載されている。 このファージ由来の RNA ポリメラ一ゼは、 大腸菌や高等な生物の RNA ポリメラ一ゼと異なり、 単一のポリペプチドのみで転 写反応を行うことが出来る（Chamberlin et al. , Nature, 228:227-231, 1970)。 そ のため、 転写メカニズムを解析する格好の材料となり、 沢山の突然変異体が分離 され、 報告されている。 さらに Sousa et al. , Nature, 364:593-599, 1993 に結晶 解析結果が記載されている。
さらに、 その他極めて特異性の高いプロモータ一特異的 RNA ポリメラ一ゼとし て大腸菌に感染する T3 ファージ、 サルモネラ菌に感染する S P 6ファージ及び Klebsiella pneumoniae に感染する K11 ファージ由来の RNA ポリメラーゼの 3つ がよく知られている。 尚、 上記 4種の R N Aポリメラーゼは、 後述するように、 アミノ酸の一次構造、 プロモ一ターの配列等、 極めて類似している。
本発明で用いる変異型の R N Aポリメラ一ゼは、 対応する野性型 R N Aポリメ ラ一ゼの能力と比較して、 3，デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取 り込む能力を増加させたものである。 前述のように、 野性型 R N Aポリメラーゼ では、 リボヌクレオチドに比べて 3'デォキシリボヌクレオチドの取り込みが悪く、 塩基配列決定法に用いる妨げとなっていた。 それに対して、 上記変異型の R N A ポリメラ一ゼは、 3'デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する取り 込み能力を、 好ましくは野性型の少なくとも 2倍増加させるように修飾されてい る。 3'デォキシリボヌクレオチドの取り込みは、 3'デォキシリボヌクレオチドに蛍 光標識を付した 3'デォキシリボヌクレオチド誘導体を用いた場合に特に低下する 傾向があるが、 上記変異型の R N Aポリメラーゼは、 このような 3，デォキシリボ ヌクレオチド誘導体の取り込みも改善できる。
尚、 ここで、 リボヌクレオチドとは、 ΛΤΡ、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘導 体からなるリボヌクレオシド 5 ' トリフォスフェート類を意味し、 3'デォキシリボ ヌクレオチドは、 3' dATP、 3' dGTP、 3' dCTP及び 3' dUTPを意味し、 その誘導体は、 これら 3'デォキシリボヌクレオチドに例えば、 蛍光標識を付した化合物を意味す る。
本発明の R N Aボリメラ一ゼは、 対応する野性型 R N Aポリメラーゼの少なく とも 1つのアミノ酸が修飾されたものである。 この点について以下に詳細に説明 する。
本発明者は、 前述のような T7 RNA ポリメラ一ゼに関する種々の報告を踏まえた 上で、 T7 RNA ポリメラ一ゼにおけるリボヌクレオチド等の種類により取り込み効 率にバイアスが少ない或いは全くない RNA ポリメラーゼ変異体を構築することを 検討した。 特に、 野性型 RNA ポリメラーゼ上のどのアミノ酸を変異させるのか、 さらに、 変異として置換を行う場合、 どのようなアミノ酸に置換させればよいか について実際に、 種々の変異体を作成して検討し、 野性型 R N Aポリメラ一ゼの 少なくとも 1つのァミノ酸を修飾することで 3 'デォキシリボヌクレオチドまたは それらの誘導体を取り込む能力を改善することができることを見出して、 上記変 異型の変異型 R N Aポリメラーゼを完成した。
本発明者は、 まず、 T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子を揷入した発現プラスミ ド PT7R を構築し、 次に、 この発現プラスミ ド pT7R をベースにして T7 RNA ポリメラ一ゼ の変異体を構築した。 即ち、 T7 RNA ポリメラーゼの F (フエ二ルァラニン） 残基 を Y (チロシン） 残基に変化させた変異型 T7 R N Aポリメラ一ゼである F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y を構築し、 これらの変異体について取り込み 能力の比較を行った。 さらに、 文献（（Sousa. , EMBO J. , 14 : 4609- 4621 (1995) )に は、 Τ7 DNAポリメラ一ゼの Y526に相当する位置である T7 RNAポリメラ一ゼの Y639F 変異体の性質を記述している。 特に、 特開平 8-205874 号に記載された dNTP に対 するその特異性を変化させるであろうことを示唆した残基 631-640 に含まれる Y639F変異体も構築した。
本明細書において、 野性型 T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列は、 遺伝子配列 データべ—スである GeneBankより、 accession No. V01148 J02518 X0041 1の T7 ファ一ジ DNA配列（39, 937塩基対）の塩基番号 3171-5822にコードされている配列 (図 1及び 2参照） を基礎としている。 図 1及び 2に示す配列の上段は、 塩基配 列、 下段はその配列に対応するアミノ酸配列である。 右端の数字は、 塩基配列の 場合、 GeneBankに登録されている T7 ファージゲノム（Locus T7CG, 39, 937塩基対） の番号を示し、 アミノ酸の番号は、 T7 RNA ポリメラ一ゼき最初の M (メチォニン） を 1 として、 全長 883アミノ酸残基からなっていることを示す。
尚、 このアミノ配列は、 上記 Moffatt et al.， J. Mol. Biol. , 173 (2) : 265-269, 1984 に報告されているアミノ酸配列と同一である。
従って、 本明細書における野性型 Τ7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のァミノ酸配列及 び各ァミノ酸に付された番号は、 この図 1及び 2に示される配列及び番号であるつ さらに、 前述のように、 上記野性型 Τ7 RNA ボリメラ一ゼは、 本発明で目的とする 修飾以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落を、 さらに有するものであることも できる。 従って、 3'デォキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む 能力を増加させる目的で変異を導入すべき野性型 R N Αボリメラーゼが、野性型 T7 RNAボリメラ一ゼに別の変異を導入したものである場合、 特に、 そのような変異が、 アミノ酸の挿入または欠落である場合、 そのような挿入または欠落に応じて、 上 記ァミノ酸番号は変動し、 アミノ酸番号が図 1及び 2に示す番号とは異なったと しても、 T7 RNA ポリメラ一ゼ活性を維持している限り、 そのようなに挿入または 欠落を有する T7 RNA ポリメラ一ゼも、 3'デォキシリボヌクレオチドまたはそれら の誘導体を取り込む能力を増加させる目的で変異を導入する野生型 T7 RNA ポリメ ラーゼの範疇に含まれる。
T7 RNAポリメラ一ゼ以外の RNAポリメラーゼについてのァミノ酸配列の番号は、 図 3及び 4に示す配列表に基づき決定される。 さらに、 本発明で目的とする修飾 以外のアミノ酸の置換、 挿入または欠落を、 さらに有するものであることもでき る。 従って、 これらのアミノ酸配列及びその番号に付いても、 T7 RNA ポリメラ一 ゼの場合と同様であり、 アミノ酸の挿入または欠落による変異がある場合、 その ような挿入または欠落に応じて、 上記アミノ酸番号は変動するが、 そのような一 部に変異を有する野性型の R N Aポリメラーゼも本発明において 3 'デォキシリボ ヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させる目的で変異を導 入する野生型 T7 RNAポリメラ一ゼの範疇に含まれる。
T7 RNA ボリメラーゼ遺伝子は、 T7 ファージ DNA を精製後、 T7 RNA ポリメラ一 ゼ 遺伝子の N末端アミノ酸領域上流に特異的なプライマー（T7Rpol- N： 5' -ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3' )、 及び C末 端ァミノ酸領域下流に特異的なプライマ一（ T7Rpol-C： 5' -ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GGC G -3' )を合成し、 PCR を用いて増幅、 発現べクタ — PT7R を構築することができる （参考例 1参照)。 この発現べクタ一を用い、 大 腸菌 DH5 aに形質転換し、 イソプロピル- β - D -チォガラク トピラノシド （IPTG) を 添加すると、 Τ7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を大量に発現する。
この Τ7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のァミノ酸配列を、 図 1及び 2に示すァミノ 酸配列と比較したところ、 両者完全に一致した。 尚、 図 1及び 2に示すアミノ酸 配列と Grachev et al. , Bioorg. Kim. , 10 : 824-843, 1984 に報告されているアミ ノ酸配列とは、 図 1及び 2に示すアミノ酸配列における 623 番目の Υ及び 665 番 目の L力；、 Grachev et al .の報告におけるアミノ酸配列では、 それぞれ H (623番 目） 及び P (665番目） である点で相違していた。 上述のように、 本発明の変異型 R N Aポリメラ一ゼのべ一スとなる野性型 R N Aポリメラーゼは、 図 1及び 2に 示す配列に対して、 本発明で目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、 挿入または 欠落を、 さらに有するものであることもでき、 上記 Grachev et al.の報告してい る 623番目及び 665番目の残基がそれぞれ H及び Pであるアミノ酸配列も、 本発 明の変異型 R N Aポリメラ一ゼのベースとなる野性型 R N Aポリメラーゼに含ま れる。
発現ベクター pT7R を持つ大腸菌から精製した T7 RNA ポリメラーゼは、 イン - ビトロで T7プロモーターを含んだ DNA存在下で充分な RNA合成活性を有していた。 この発現プラスミ ド pT7R をベースにして変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼとして、 前 述の Y639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y を構築し、 これらの変 異体にっレ、て取り込み能力の比較を行った。
尚、 F644Y変異を持つ、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼについては、 F644に対する 変異以外に、 F644の近傍の L665 を前述の Grachev et al.の報告に従って P とす る変異も導入した。 即ち、 F644Y/し 665P として変異を導入し、 L665P の影響を調べ た。 また、 F667Y変異を持つ、 変異型 T7 RNA ボリメラ一ゼも、 F667に対する変異 以外に、 F667 の近傍の L665 を前述の Grachev et al.の報告に従って P とする変 異も導入した。 即ち、 し 665P/F667Yとして変異を導入した。
さらに、 F644Y/L665P/F667Y変異を導入した変異型 T7 RNA ボリメラーゼも構築し た。 これらの変異体の取り込み能力の比較も行った。
変異を導入した T7 RNA ポリメラーゼを精製し、 プロモータ一配列特異的な RNA 合成と ATP、 GTP、 CTP及び UTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド 5 ' トリフォスフエ一ト類並びに 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いはそ れらの誘導体の取り込み能力を野生型 T7 RNA ポリメラーゼと比較した。 結果は後 述の表 1に示す。 その結果、 表 1 に示すよ うに、 F644Y、 F644Y/し 665P、 L665P/F667Y 及び F644Y/L665P/F667Yは、 RNA合成活性を充分維持し、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込みの大幅な改善が見られた。 また、 F644Y/L665P変異体の取り込み能力は、 F644Y 変異体と同等であった。 この結果か ら、 665 のロイシンのプロリンへの置換は、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込みに影響がないことが分かる。 なお、 表 1に は、 L665P/F667Y変異体の結果のみを示すが、 F667Y 変異体も、 L665P/F667Y 変異 体の取り込み能力と同等であった。 さらに、 F644Y/L665P/F667Y変異体の取り込み 能力が最も高かった。 また、 表 1には示していないが、 F644Y/F667Y変異体の取り 込み能力は F644Y/L665P/F667Y変異体のそれとほぼ同等であった。
F782Y変異体は、 RNA合成活性を保持しており、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込み能力も若干改善された。 F733Y 変異体 は、 RNA合成活性が若干低下したものの、 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いはそれらの誘導体の取り込みの若干の改善が見られた。 F646Y 変異体は、 RNA 合成活性を保持していたものの 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP 或いは それらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなかった。 F882Y は、 RNA合成活性 が著しく低下していたので、 表 1には結果を示さなかった。
さらに、 T7 DNA ボリメラ一ゼの Y526に相当する位置である T7 RNA ポリメラ一 ゼの Y639F変異体は、 RNA合成活性を保持していたものの 3 ' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' dCTP、 3 ' dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなかった。 以上の結果に基づいて、 上記変異型の R N Aポリメラ一ゼは、 特に、 ポリメラ —ゼの 「ヌクレオチド結合部位」 中に存在する少なくとも 1つのァミノ酸が修飾 された R N Aポリメラーゼであり、 このような修飾により、 対応するリボヌクレ ォチドに対して 3，デォキシリボヌクレオチドまたは他のリボヌクレオチド類似体 を取り込む能力を増加させることができる。
また、 上記 「ヌクレオチド結合部位」 に存在するアミノ酸は、 例えば、 野性型 R N Aポリメラーゼのヘリックス Y とへリックス Z との間のル一プ中のアミノ酸 及び Z又はへリックス Z とへリックス A Aとの間のループ中のアミノ酸であるこ とができる。
Sousa et al.の文献（Nature, 364 : 593-599, 1993)に示されている立体構造から、 铸型 DNAを包み込むボリメラーゼ分子中のクラフトの内側に面する、 ヘリックス Y
(T7 RNA ボリメラーゼのアミノ酸残基 625から 634に相当） とヘリックス Z (同 アミノ酸残基 649から 658に相当）に挟まれたループ（同アミノ酸残基 635から 647 に相当）及びヘリックス Zとヘリックス AA (同アミノ酸残基 685から 699に相当） に挟まれたループ （同アミノ酸残基 659 から 684 に相当） は、 極めてヌクレオチ ドに近いところに位置するリボヌクレオチド結合部位の一部であると考えられる。 本発明では、 実際に、 このループに相当する領域の 644、 646、 667 に存在する F 残基を Y残基に置換した （図 5参照） 。
また、 733、 782及び 882の F残基は、 ループに相当する領域以外の領域に存在 し、 ポリメラ一ゼ分子中のクラフトの内側に面すると考えられる。 これらの F残 基にっレ、ても実際に Y残基に置換した。
さらに本発明は、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼのアミノ酸残基 641- 667 に対応する領域から選択される領域中のァミノ酸において修飾されている R N Aポリメラ一ゼに関する。 T 7ファージ由来の R N Aポリメラーゼのァミノ酸残 基 641- 667に対応する領域は、 前述の 「ヌクレオチド結合部位」 に相当する。 前記 4種の R N Aポリメラ一ゼは、 アミノ酸の一次構造、 プロモーターの配列 等、 極めて類似している。 図 3及び 4に、 上記 4つのファージ由来の RNA ボリメ ラーゼのアミノ酸配列を比較して示す。 この比較より、 T7、 T3、 K11由来の RNAポ リメラ一ゼは、 極めて類似していることが分かる。 特に、 図 6及び 7に示すよう に、 T7と T3ファ一ジ由来の RNAポリメラ一ゼのァミノ酸配列は、 極めて類似性が 高レ、。 T7と T3ファージは、 共に大腸菌に感染するファージであり、 その性質も極 めて類似していることと符合する。 更にこの 2つの RNA ポリメラ一ゼの認識する プロモーター配列も類似しているが、 その認識特異性は極めで高いことが知られ ている。 このように T7 RNA ポリメラ一ゼにおいて得られた結果を、 アミノ酸配列 の類似する他の RNAボリメラーゼに適応することは比較的容易にできる。
このような高い相同性から、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼ以外の R N Aポリメラ一ゼにおける、 T 7ファージ由来の R N Aポリメラーゼのァミノ酸 残基 641-667 に対応する領域は、 T 3ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼについ ては、 アミノ酸残基 64 2 - 66 8であり、 K 1 1ファージ由来の R N Aポリメラーゼ については、 アミノ酸残基 664-690であり、 SP6ファージ由来の R N Aポリメラー ゼについては、 アミノ酸残基 633-670である、 と言える。 前述のように、 T7、 Τ3、 K1 1 由来の RNA ポリメラ一ゼは、 極めて類似しており、 T7 RNA ポリメラーゼにつ いての結果を、 アミノ酸配列の類似する他の由来 RNA ポリメラーゼに適応するこ とができる（図 8参照)。
上記 R N Aポリメラーゼとしては、 例えば、 T 7ファージ由来の R N Aポリメ ラ一ゼであって、 アミノ酸残基 6 4 4または 6 6 7においてチロシンを有する R N Aポリメラーゼを挙げることができる。 また、 T 3ファ一ジ由来の R N Aポリ メラ一ゼであって、 アミノ酸残基 6 4 5または 6 6 8においてチロシンを有する R N Aポリメラーゼを例示することもできる。 さらに、 K 1 1ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼであってアミノ酸残基 664〜669の間または 690においてチロシ ンを有する R N Aポリメラ一ゼを例示することもできる。 さらにまた、 さらに、 S P 6ファージ由来の R N Aポリメラ一ゼであってアミノ酸残基 633〜638 の間ま たは 670においてチロシンを有する R N Aポリメラ一ゼを例示することもできる。 このようなアミノ酸の修飾は、 アミノ酸の変異のみならず、 挿入または欠落で あることができる。 また、 アミノ酸の変異は、 例えば、 天然に存在するアミノ酸 の少なくとも 1つをチロシンに置換することである。 さらに、 置換されるべき天 然に存在するアミノ酸は、 例えば、 フエ二ルァラニンであることができる。 但し、 フエ二ルァラニンに限定されることはなく、対応するリポヌクレオチドに対して 3' デォキシリボヌクレオチドまたは他のリポヌクレオチド類似体を取り込む能力を 増加させることができるァミノ酸の置換であればよい c
本発明の変異型 R N Aボリメラーゼにおいて、 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y、 L665P/F667Y及び F644Y/L665P/F667Yは、 RNA合成活性を充分保持し、 さらに 3 ' dNTPs の取り込み能力が大幅に改善し、 野生型で観察された強いバイアスが著しく 低下していた。 このような優れた特性を有する、 変異型 T7 R Aポリメラーゼ F644Y、 L 665P/F667Y 又は F644Y/L665P/F667Y を用いることにより、 DNA ポリメラーゼを 用いる塩基配列決定法を超える実用レベルで、 転写生成物による塩基配列決定法 が可能になる。
変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y、し 665P/F667Yを生産する大腸菌 pT7RF644Y (DH5 α )及び pT7RL665P/F667Y(DH5 a )は、 生命研国際寄託番号がそれぞれ 5998 号 (FERM-BP - 5998)及び 5999号 (FERM- BP - 5999)として 1997年 7月 2 日に、 さらに、 変異型 T7 RNA ポ リ メ ラーゼ F644Y/L665P/F667Y を生産する大腸菌 pT7RF644Y/L665P/F667Y(DH5 a )は、 生命研国際寄託番号が 6364号 (FERM- BP- 6364) として 1998年 5月 20日に工業技術院生命工学工業技術研究所（〒305- 0046日本国 茨城県つくば市東 1-1-3)に寄託済みである。
上記変異型 R N Aポリメラーゼは、 R NAポリメラーゼをコードする核酸分子 を用意し、 ヌクレオチド塩基配列内の 1 つまたはそれ以上の部位における 1 つま たはそれ以上の塩基を変異させるように該核酸分子に突然変異を起こさせ、 次い で変異させた核酸分子により発現される修飾された RN Aポリメラーゼを回収す ることで製造することができる。 R N Aポリメラーゼをコ一ドする核酸分子の用 意、 核酸分子への突然変異の導入、 修飾された R N Aポリメラーゼの回収はいず れも、 公知の手法を用いて行うことが出来る。
変異型 T7 RNA ポリメラーゼは、 例えば、 以下の方法により構築することができ る。 T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を揷入してある発現ベクターを铸型にして T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子の C末端側に相当する制限酵素 Hpa I， Nco I部位にはさまれ る領域を PCR法を利用して変異を導入した発現プラスミ ドを構築する。 次いで、 この発現プラスミ ドを用レ、、 大腸菌 DH5ひに形質転換し、 イソプロピル - i3 - D-チォ ガラクトピラノシド （IPTG) を添加すると、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を 大量に発現させることができる。
DNAの塩基配列決定方法
RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む D NA断片を錄型として、
26
差替え用紙 （規則 26) RNAポリメラーゼを用いて核酸転写生成物を酵素的に合成する方法、 核酸転写
26/ 1 差替え用紙 （規則 26) 生成物の分離方法、 さらには分離された分画から核酸の配列を読み取る方法は、 原理的には何れも公知の方法である。 従って、 これらの点に関して、 いずれの公 知の方法及び条件、 装置等を適宜利用することができる。
また铸型となる DNA断片にも、 RNAポリメラ一ゼのためのプロモーター配 列を含むこと以外、 制限はない。 例えば、 プロモータ一配列を含む DN A断片が ポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅した DN A生成物であることができる。 さらに、 増幅した DN A生成物から、 ポリメラーゼ連鎖反応に用いたプライマー及び/又は 2'デォキシリボヌクレオシド 5' トリフォスフエ一ト及び/又はその誘導体を除去す ることなしに、 本発明の方法における核酸転写生成反応を行うことができる。 上 記 DNA増幅のためのポリメラ一ゼ連鎖反応は、 PCR法として広く用いられて いる方法をそのまま用いることができる。 また、 プロモータ一配列を含む DN A 断片は、 プロモータ一配列と増幅対象の D N A断片とをライゲ一シヨンした後、 適当な宿主を用いてクローニングされた DNA断片であることもできる。 即ち、 本発明において、 増幅の対象である DN A配列、 プライマ一、 増幅のための条件 等には特に制限はない。
例えば、 プロモーター配列を含む DNA断片の増幅のためのポリメラ一ゼ連鎖 反応の反応系として、 1 0〜50 n gのゲノミック DNA又は 1 p gのクローン された DNA、 Ι Ο μΜの各プライマ一、 200 μ Μの各 2 ' デォキシリボヌク レオシド 5' トリフォスフェート （dATP、 dGTP、 d CTP、 dTTP) を含む 20 μ 1容量中で DNAポリメラーゼとして、 例えば T a qポリメラ一ゼ 等を用いて行うことができる。
但し、 ポリメラ一ゼ連鎖反応のためのプライマーのいずれか一方又は増幅され
27 た挿入（insert) DN Aが、 後述する RNAポリメラーゼのためのプロモータ一配 列を含む必要がある。 ダイレク ト転写シーケンス法では、 PCR法において、 2 種類のプライマーのいずれか一方にファ一ジプロモータ一配列を持っているプラ イマ一を用いるか、 又は増幅された挿入 DN A内にファ一ジプロモーター配列を 持たせることで、 得られる PC R生成物はそのプロモータ一により働く RNAポ リメラーゼを用いる in vitro転写に付すことができる。
RNAポリメラーゼのためのプロモータ一配列は、 用いる RNAポリメラ一ゼ の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明の方法ではプロモータ一配列を含む DNA 断片から RN A転写物等の核酸 転写物を合成する。 DNA断片は、 RNAポリメラ一ゼのためのプロモータ一配列を 含むので、 このプロモータ一配列が前述の変異型 RN Aポリメラ一ゼを起動させ て R N A転写物等の核酸転写物を合成する。
RN A転写物等の核酸転写物の合成は、 前記変異型 RN Aポリメラ一ゼの存在 下、 ATP、 GTP、 CT P及び UT P又はこれらの誘導体からなるリボヌクレ オシド 5' トリフォスフェート （NTP) 類、 並びに 1種又は 2種以上の 3 ' d NT P誘導体を反応させる。 尚、 3 ' d NT P誘導体は、 本明細書においては、 3 ' dATP、 3 ' d GTP、 3 ' d CTP、 3 ' d UT P及びこれらの誘導体 の総称として用いる。 リボヌクレオシド 5' トリフォスフェート （NTP) 類と しては、 その一部が AT P等の誘導体である場合も含めて、 塩基が異なる少なく とも 4種類の化合物が転写物の合成に必要である。 但し、 同じ塩基を含む 2種以 上の化合物を用いることはできる。
転写生成物である RNA又は核酸の 3 ' 末端には、 3 ' d NTP誘導体が取り
28 込まれることにより、 3' ヒ ドロキシ基が欠落し、 RNA又は核酸の合成が阻害 される。 その結果、 3 ' 末端が 3 ' d NT P誘導体である種々の長さの RNA又 は核酸断片が得られる。 塩基の異なる 4種類の 3 ' d NT P誘導体について、 そ れぞれ、 このようなリボヌクレオシド .アナログ体を得る。 このリボヌクレオシ ド ·アナログ体を 4通り用意することで、 RN A又は核酸配列の決定に用いるこ とができる [Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716- 5723 〕。
尚、 3 ' d NT P誘導体は、 1つの核酸転写反応に 1種類又は 2種以上を用い ることができる。 1種のみの 3' d NT P誘導体を用いて 1つの核酸転写反応を 行う場合、 核酸転写反応を 4回行うことで、 3' 末端の 3' d NT P誘導体の塩 基の異なる 4通りの転写生成物を得る。 1回の核酸転写反応で、 3 ' 末端の 3 ' d NT P誘導体は同一で、 分子量の異なる種々の RNA又は核酸断片の混合物で ある転写生成物が得られる。 得られた 4通りの転写生成物について、 独立に、 後 述する分離及び配列の読み取りに供することができる。 また、 4通りの転写生成 物の 2種以上を混合し、 この混合物を分離及び配列の読み取りに供することもで さる。
1回の核酸転写反応に 2種以上の 3 ' d NT P誘導体を同時に用いると、 1つ の反応生成物中に、 3 ' 末端の 3 ' d NT P誘導体の塩基の異なる 2通り以上の 転写生成物が含まれることになる。 これを後述する分離及び配列の読み取りに供 することができる。 核酸転写反応に 2種以上の 3 ' d NT P誘導体を同時に用い ると、 核酸転写反応操作の回数を减らすことができるので好ましい。
さらに、 RN A等の核酸転写が、 塩基の異なる 4種類のリボヌクレオシド 5'
29 トリフォスフエ一ト類の存在下で、 RNAポリメラ一ゼにより行われ、 かつ 3 ' dNTP誘導体によりタ一ミネートされる。 その結果、 各塩基について、 RNA 又は核酸ラダ一 （ladder) がシーケンスのために生成される。 本発明では、 特に、 核酸転写を塩基の異なる 4種類のリボヌクレオシド 5 ' トリフォスフエ一ト類の 存在下で行い、 これを分離して、 4種類の塩基の配列を一度に （同時に） 読み取 りることが好ましい。
本発明の方法では、 RN A又は核酸転写生成物を分離する。 この分離は、 転写 生成物に含まれる分子量の異なる複数の生成物分子を、 分子量に応じて分離する ことができる方法で適宜行うことができる。 このような分離方法としては、 例え ば電気泳動法を挙げることができる。 その他に HPLC等も用いることができる。 電気泳動法の条件等には特に制限はなく、 常法により行うことができる。 転写 生成物を電気泳動法に付することにより得られるバンド （RN A又は核酸ラダー） から R N A又は核酸の配列を読み取ることができる。
R N A又は核酸ラダ一の読み取りは、 転写物反応に用いるターミネータ一であ るリボヌクレオシド 5' トリフォスフエ一ト （NTP) 類を標識することにより 行うことができる。 また、 RN A又は核酸ラダーの読み取りは、 転写物反応に用 いる 3' d NT P誘導体を標識することにより行うこともできる。 標識としては、 例えば、 放射性若しくは安定同位元素又は蛍光標識等を挙げることができる。 ま た、 上記のような標識を用いることなく、 電気泳動法等により分離した各転写反 応生成物の質量を質量分析計で測定することにより、 転写生成物の配列を読み取 ることもできる。
具体的には、 例えば、 標識された 3 ' dNTP誘導体、 より具体的には、 標識
30 された 3 ' dATP、 3 ' d GTP、 3， d CTP及び 3， dUTPを用い、 転 写生成物を電気泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又は 蛍光を検出することで、 転写生成物の配列を読み取ることができる。 このように 3 ' d NT P誘導体を標識することで、 いずれのバンド間の放射性強度又は蛍光 強度にばらつきがなく、 測定が容易になる。 さらに放射性若しくは安定同位元素 又は蛍光を発生するラダ一の検出は、 例えば、 DN Aシーケンシンクに用いてい る装置を適宜用いて行うことができる。
また、 放射性若しくは安定同位元素又は蛍光標識された AT P、 GTP、 CT P及び U TPを用い、 電気泳動に付して得られるバンドの放射性若しくは安定同 位元素又は蛍光を検出することでも転写生成物の配列を読み取ることができる。 さらに、 異なる蛍光で標識されてた 3' dATP、 3 ' d GTP、 3 ' d CT P及び 3 ' dUTPを用い、 末端が 3' dATP、 3 ' dGTP、 3 ' d CTP 又は 3 ' dUTPであり、 異なる標識がなされた種々の転写生成物断片の混合物 を電気泳動に付して得られるバンドの 4種類の蛍光を検出することで RN A又は 核酸の配列を読み取ることもできる。
この方法では、 4種類の 3' d NT Pをそれぞれ異なる蛍光で標識する。 この ようにすることで、 3 ' 末端の異なる 4種類の転写生成物の混合物を電気泳動に 付することで、 3' 末端の 4種類の異なる 3 ' d NT Pに応じた蛍光を発するバ ンドが得られ、 この蛍光の違いを識別しながら、 1度に 4種類の RNA又は核酸 の配列を読み取ることができる。
蛍光標識した 3' dNTPとしては、 以下に示す 3'デォキシリボヌクレオチド誘 導体を用いることが好ましい。
31 3'デォキシリボヌクレオチド誘導体 （ターミネ一ター）
本発明の塩基配列決定方法で使用する 3'dNTP誘導体としては、 下記一般式 [I ] で示される 3，デォキシリボヌクレオチド誘導体を用いることが好ましい。 一般式 [I]で示される 3'デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 RNAポリメラーゼによ るポリメラーゼ連鎖反応において配列に取り込まれ易いからである。
Q-V- (CH2) n— NH - R 〔 I〕
式中、 Qは 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基を表し、 nは 4以上の整数を表 し、 Vは一 C三 C—又は一 CH=CH—を表し、 Rは蛍光性を有する基を表す。 好ましくは、 一般式 [ I]における nは 4〜10の整数を表す。 さらに、 一般式 [ I] における Rは下記一般式 〔VII〕 で示されることが好ましい。
〔VII〕
Figure imgf000035_0001
本発明の一般式 〔I〕 で示される 3' —デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 (a) 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基： Q、
(b)リンカ一：一般式 〔VI〕
—V— (CH2) n-NH- 〔VI〕
〔式中、 V及び nは前記に同じ。 〕
及び (c )蛍光性を有する基
の 3つの構成部分に分けることができる c
32 Qで示される 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基としては、 下記一般式 〔Π〕 及び 〔III 〕 で示される 7—デァザプリンヌクレオチド残基、 下記一般式 〔IV〕 及び 〔V〕 で示されるピリミジンヌクレオチド残基が挙げられる。
〔 II〕
Figure imgf000036_0001
〔III〕
〔IV〕
Figure imgf000036_0002
33 〔 V〕
Figure imgf000037_0001
尚、 上記一般式 〔II〕 〜 〔V〕 に於いて、 R3は一 P 03H2 ： - P206H3 ： - P 309H4 又はその塩を表し、 当該塩の具体例としては、 例えばナトリウム塩、 カリ ゥム塩、 リチウム塩等のアルカリ金属塩、 例えばバリウム塩等のアルカリ土類金 属塩、 アンモニゥム塩、 例えば、 トリェチルアンモニゥム塩、 ピリジン塩等の有 機ァミン塩等が好ましく挙げられる。
上記一般式 〔VI〕 で示されるリンカ一は、 Qで示される 3 ' —デォキシリボヌ クレオチド残基と蛍光性を有する基とを結合するためのリンカ一である。
即ち、 該リンカ一の二重結合又は三重結合を形成する炭素原子の一末端が、 前 述した如き 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基 Qのうち、 ピリミジンヌクレオ チド残基についてはその 5位に、 また、 7—デァザプリンヌクレオチド残基につ いてはその 7位に夫々結合し、 更に、 該リンカ一のアミノ基は、 蛍光色素基上の カルボキシル基と結合することにより、 3 ' —デォキシリボヌクレオチド残基と、 蛍光色素基とを有する化合物を形成する。
一般式 〔VI〕 で表されるリンカ一に於いて、 nが 4以上のメチレン鎖としては、 例えば nが 4〜 のメチレン鎖が挙げられ、 具体的には、 テトラメチレン基、 ぺ ンタメチレン基、 へキサメチレン基、 ヘプタメチレン基、 ォクタメチレン基、 ノ ナメチレン基、 デカメチレン基等が挙げられる。 R N Aポリメラ一ゼによる取り
34 込み率の改善という観点から、 nは 4以上の整数である力 好ましくは nは 4〜10 の整数であり、 より好ましくは、 nは 4〜 8の整数を表し、 さらに好ましくは n は 4または 6である。
Rで表される蛍光性を有する基は、 蛍光性を有する基が直接一 N H—基に結合 していても、 間に何らかのリンカ一を介して一 N H—基に結合していてもよい。 蛍光性を有する基としては、 特に限定はなく、 蛍光強度や蛍光の波長、 R N Aボ リメラーゼによる取り込みの容易さ等を考慮して適宜選択できる。 但し、 蛍光性 を有する基は、 アルゴンレーザーのような適切な供給源からのエネルギー吸収に よる刺激に引き続いて、 検知可能な発光放射を生じる蛍光色素基であることが好 ましい。
蛍光性を有する基 Rとしては、 例えば、 下記一般式 〔VI I 〕 で示される基を挙 げることができる。 一般式 〔VI I 〕 で示される蛍光性を有する基は、 特に、 アル ゴンレ一ザ一のような適切な供給源からのエネルギー吸収による刺激に引き続い て、 検知可能な発光放射を生じる蛍光色素基である。
一 c=o
〔V I I〕
Figure imgf000038_0001
〔式中、 Wはカルボキシル基を表し、 Xは一O—、 一 S—、 - N R ' - (但し、 R ' は、 水素原子、 低級アルキル基、 ァラルキル基又はァリール基を表す） 又は — C H2 —を表し、 環 A及び環 Bは何れか一方が
35
Figure imgf000039_0001
であり、 他方が
Figure imgf000039_0002
であり （但し、 Ζは、 Ο又は =N+ R,!^を表し、
Yは、 OH又は一 NR, R2 を表し、 （但し、 及び R2 は、 夫々独立して水 素原子又は低級アルキル基を表すか、 または、 R, 及び R2が共にトリメチレン基 を表す （但し、 該 2つのトリメチレン基の各他端は、 該 2つのトリメチレン基を 有する窒素原子が結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の両 隣の炭素原子の何れか一方とそれぞれ結合している） ） ） 、
環 C
C
、x に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味し、 上記環 A、 B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更に置換基を有していて
36 もよい。 〕
一般式 〔VII 〕 に於いて、 Xとして表される一 N R ' —に於ける R ' で示され る低級アルキル基としては、 直鎖状、 分枝状或いは環状の何れにても良く、 例え ば炭素数 1 6のアルキル基が挙げられ、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n— プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 イソブチル基、 sec-ブチル基、 ぺ ンチル基、 イソペンチル基、 tert—ペンチル基、 1ーメチルペンチル基、 n—へ キシノレ基、 イソへキシル基、 シクロプロピノレ基、 シクロペンチノレ基、 シクロへキ シル基等が挙げられる。 R ' で示されるァラルキル基としては、 例えば炭素数 7 20 のァラルキル基が挙げられ、 具体的にはべンジル基、 フユネチル基、 フエ二 ルプロピル基、 メチルベンジル基、 メチルフエネチル基、 ェチルベンジル基、 ナ フチルメチル基、 ナフチルェチル基等が挙げられ、 また、 ァリール基としては、 例えばフエニル基、 トリル基、 キシリル基、 ナフチル基等が挙げられる。
一般式 〔VI I〕 に於いて、 Zとして表される = N+ R i R2又は Yとして表される一 N F^ I^に於ける 及び R2 で示される低級アルキル基としては、 直鎖状、 分枝 状或いは環状の何れにても良く、 例えば炭素数 1 6のアルキル基が挙げられ、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル 基、 イソブチル基、 sec-ブチル基、 ペンチル基、 イソペンチル基、 tert—ペンチ ル基、 1—メチルペンチル基、 n キシル基、 イソへキシル基、 シクロプロピ ル基、 シクロペンチル基、 シクロへキシル基等が挙げられる。
上記一般式 〔VII〕 に於いて、 Wで示されるカルボキシル基が下記一般式 〔VIII〕 に示す如き位置に結合している場合、
37
Figure imgf000041_0001
本発明の 3 ' —デォキシリボヌクレオチド誘導体に於ける蛍光色素基の部分は、 下記式の何れの状態をも取り得る。
Figure imgf000041_0002
また、 該カルボキシル基は、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩、 リチウム塩等 のアルカリ金属塩、 例えばバリウム塩等のアルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩、 例えばトリエ ニゥム塩、 ピリジン塩等の有機アミン塩等の塩を形成し ていてもょレ'
上記一般式 〔VII 〕 に於いて、 環 A又は環 Bに於ける置換基 2が= ^ 1^ 1¾2で あり、 Yが一 N Ri R2である場合で、 及び R2 が共にトリメチレン基を表し、 該 2つのトリメチレン基の各他端が、 該 2つのトリメチレン基を有する窒素原子が 結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の両隣の炭素原子の何
38 れか一方とそれぞれ結合している場合としては、 例えば下記式で示すものが挙げ られる。
Figure imgf000042_0001
上記一般式 〔VI I〕 に於いて、 環 C
Figure imgf000042_0002
に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味する ものであるが、 これを具体的に示すと、 例えば以下の如くになる。
即ち、 環 Aが
Figure imgf000042_0003
である場合は、 環 cに於ける結合手の位置は以下に示す如きであり
39
Figure imgf000043_0001
また、 環 Bが
Figure imgf000043_0002
である場合は、 環 cに於ける結合手の位置は以下に示す如きである:
Figure imgf000043_0003
更に、 Xがー NH—である場合、 環 A (又は環 B) と環 Cとは、 下記に示す何 れの状態をも取り得る。
Figure imgf000043_0004
40 上記一般式 〔VII 〕 に於ける環 A、 B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更に置換基を有していてもよいが、 このような置換基としては、 アルキル基、 ァ ルコキシ基、 ハロゲン原子等が挙げられる。
アルキル基としては、 直鎖状、 分枝状或いは環状の何れにても良く、 また、 二 重結合を有していても良く、 例えば炭素数 1〜20 のアルキル基が挙げられ、 好ま しくは、 炭素数 1〜6の低級アルキル基が挙げられる。 具体的にはメチル基、 ェ チル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 イソブチル基、 sec- ブチル基、 ベンチル基、 イソペンチル基、 tert—ベンチル基、 1 一メチルベンチ ル基、 n—へキシル基、 イソへキシル基、 シクロプロピル基、 シクロペンチル基、 シクロへキシル基等が好ましく挙げられる。 アルコキシ基としては、 低級アルコ キシ基、 例えば炭素数 1〜6のアルコキシ基が好ましく、 具体的にはメ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、 ペンチル ォキシ基、 イソペンチルォキシ基、 tert—ペンチルォキシ基、 1一メチルベンチ ルォキシ基、 n—へキシルォキシ基、 イソへキシルォキシ基等が挙げられる。 ま た、 ハロゲン原子としては、 フッ素、 塩素、 臭素、 沃素等が挙げられる。
上記一般式 〔VII〕 で示される蛍光色素基としては、 より具体的には、 例えば 5
(または 6 ) カルボキシテトラメチルローダミン （以下、 TM Rと略記する。 ) 、 5 (または 6 ) カルボキシローダミン X (以下、 X Rと略記する。 ） 、 5 (また は 6 ) カルボキシローダミン 6 G (以下、 R 6 Gと略記する。 ） 、 5 (または 6 ) カルボキシローダミン 1 1 0 (以下、 R 1 1 0と略記する。 ） 、 5 (または 6 ) カルボキシフルォレツセイン、 5 (または 6 ) カルボキシ一 2 ' ， 7 ' —ジクロ 口フルォレツセイン、 5 (または 6 ) カルボキシー 2 ' ， 4 ' ， 5 ' , 7 ' —テ
41 トラクロ口フルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ 4， 7—ジクロロー 2' ， 7 ' ージメ トキシフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ一 4， 7, 4' , 5 ' —テトラクロ口一 2' ， 7 ' ージメ トキシフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ一 4' ， 5， ージクロロー 2' ， 7 ' ージメ トキシフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ一 4， A7—ジクロ口一 1 ' ， 2， ， 7， ， 8' —ジ ベンゾフルォレツセイン、 5 (または 6) カルボキシ一 4， 7—ジクロロ一 1 ' ， 2 ' , 7 ' , 8 ' ージベンゾフルォレッセイン等の蛍光色素から誘導されたもの が好ましく挙げられる。
一般式 〔 I〕 で示される 3 ' —デォキシリボヌクレオチド誘導体は、 例えば以 下の如き合成スキームに従えば容易に合成することができる。
尚、 下記合成スキーム中、 R4 は上記した如き蛍光色素基を表わす。 また、 下 記合成スキームに於レ、て使用される略称の正式名は下記の通りである。
C AN：硝酸二アンモニゥムセリウム （IV) 、
A c OH：酢酸、
NPETFA : 5—トリフルォロアセタミ ド一 1一ペンチン
NHETF A： 6— トリフルォロアセタミ ド一 1—へキシン
NOTF A： 8—トリフルォロアセタミ ドー 1ーォクチン
E 13N： トリェチルァミン、
(P h3P) 4P d ：テトラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) 、 DMF ： N, N—ジメチルホルムアミ ド、
NHT f a : トリフルォロアセタミ ド、
(E t O) 3PO： リン酸トリエチル、
42 T r i s (TBA) PP : トリス （トリ一 n—ブチルアンモニゥム） ピロホスフ エート、
TEAB ：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液、
T B DM SC I : tert—ブチルジメチルシリルク口リ ド、
THF ：テトラヒ ドロフラン、
TCD I ： 1， 1 ' —チォカルボニルジイミダゾール、
n - B u3S n H：水素化—トリ— n—ブチルすず、
A I B N： 2, 2 ' —ァゾビス （イソブチロニトリル） 、
p y r . ： ピリジン、
n-B u4NF ：テトラブチルアンモニゥムフルオラィ ド、
A c20：無水酢酸、
Me OH： メタノ一ル、
N I S ： N—ョ一ドコハク酸イミ ド、
S T C： 4—チォクレゾ一ル、
HMP A：へキサメチルホスホルァミ ド、
MC P B A： m—クロ口過安息香酸、
R4-OS u ：蛍光色素基のコハク酸ィミジルエステル体。
( 1 ) 蛍光標識 3， —デォキシゥリジン 5 ' —トリホスフエ一ト （一般式 〔 I〕 に於いて、 Vがー C三 C一であって、 n = 4の化合物） の合成。
43
Figure imgf000047_0001
(2) 蛍光標識 3' —デォキシシチジン 5' —トリホスフ. ト （一般式〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C一であって、 n = 4の化合物） の合成。
44
Figure imgf000048_0001
(3) 蛍光標識 3' —デォキシシチジン 5' —トリホスフエ一ト （一般式〔I〕 に於いて Vが— C≡C—であって、 n = 6の化合物） の合成。
45
Figure imgf000049_0001
(4) 蛍光標識 7—デァザ一 3 ' —デォキシアデノシン 5' — トリホスフ: ト （一般式 〔I〕 に於いて Vが— C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成。
46
Figure imgf000050_0001
Π 12 13
i
飞
AcjO AcO-i o CAN, Iz
pyr. CHjCN
Figure imgf000050_0002
DMS OAe
14 15 16
Figure imgf000050_0003
(5) 蛍光標識 7—デァザ一 3 ' —デォキシアデノシン 5 ' — トリホスフ: ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vが— C三 C—であって、 n = 6の化合物） の合成。
47
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
ェ
(6) 虽光標識 7 -デァザ一 3' -デォキシグァハンン 5 ' — トリホスフ ト （ 般式 U〕 に於いて Vが- Cョ C-であって、 n-4の化合物） の合成
48
Figure imgf000052_0001
32
(7) 蛍光標識 3，-デォキシゥリジン 5， 一 トリホスフエ一ト （一般式 〔I〕 於いて Vが— CH=CH—であって、 n = 4の化合物） の合成。
49
Figure imgf000053_0001
(8) 蛍光標識 3，-デォキシゥリジン 5' —トリホスフェート （一般式 〔I〕 に於いて Vが _CH=CH—であって、 n = 4の化合物） の合成。
50
Figure imgf000054_0001
(9) 蛍光標識 7—デァザ一 3，-デォキシシチジン 5' —トリホスフエ一ト （- 般式 〔I〕 に於いて Vがー CH = CH—であって、 n = 4の化合物） の合成。
51
Figure imgf000055_0001
( 10) 蛍光標識 7—デァザ一 3，-デォキシアデノシン 5' —トリホスフエ一
52 ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vが— CH = CH—であって、 n = 4の化合物） の合 成。
Figure imgf000056_0001
(1 1) 蛍光標識 7—デァザ一 3'-デォキシグアノシン 5' —トリ ト （一般式 〔I〕 に於いて Vが— CH = CH_であって、 n = 4の化合物） の合 成。
53
Figure imgf000057_0001
上記一般式 [ I ]で示される 3 ' —デォキシリボヌク レオチド誘導体は、 本発明 の変異型 R N Aポリメラ一ゼを用レ、る連鎖停止法による D N A塩基配列決定法に 於ける RNA伸長反応停止剤として非常に有効であり、 これらを用いることによ り DN A塩基配列をより確実に決定することができる。 例えば、 塩基配列を決定すべき鍩型 DN Aを各 RN Aポリメラーゼのプロモ一
54 ターの下流に繋ぎ、 アデニン （A) 、 グァニン （G) 、 シトシン （C) 、 ゥラシ ル （U) の 4種類のリボヌクレオチドと該リボヌクレオチドに対応する一般式 [ I ] で示される異なる蛍光色素で修飾された 4種の 3 ' —デォキシリボヌクレオチド 誘導体の存在下で各塩基の部位で RN Aポリメラ一ゼの伸長停止反応を行い、 そ れらの産物を混合して 1つのレーンで電気泳動した後、 レーザーの励起による蛍 光波長を分光することにより D N A塩基配列を逐次決定することができる。 尚、 蛍光色素と 4種類の 3' —デォキシリボヌクレオチドとの組み合わせは、 特に、 1つのレーンで 4種類の配列を並行して決定する場合、 蛍光色素の発光強 度及び RN Aポリメラ一ゼによる 3 ' —デォキシリボヌクレオチドの塩基の種類 の違いによる取り込み率の高低を勘案して、 適宜決定する。 即ち、 各転写生成物 からの蛍光シグナルの強度が均一になるような組み合わせにすることが、 読み取 りを安定して行い、 高レ、精度で D N A塩基配列決定を行う上で好ましい。 本発明の実施例で用いた 4種類の蛍光色素 5-カルボキシ- X- ローダミンコハ ク酸イミ ドエステル （XR) 、 5-カルボキシローダミン 6 Gコハク酸イミ ドエス テル （R6G) 、 5-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミ ドエステル
(TMR) 、 5-力ノレボキシ口一ダミン 110-ビス-トリフノレオ口アセテート コノヽ ク酸ィミ ドエステル （R 1 10) を 488 n m及び 514 n mのアルゴンレーザ —で励起した場合の蛍光強度は、 R1 10、 R6 G〉TMR〉XRである。 また、 検出感度は、 R 1 10、 R 6 Gは約 40amolであり、 TMRは約 400amolであり、 X Rは約 800amolである。 また、 3 ' —デォキシリボヌクレオチドの取り込み率は、 RNAポリメラーゼ の種類によっても異なるので、 組合せる際には、 この点も考慮すべきである。 T
7 RNAポリメラーゼによる 3 ' d NT Pの取り込み率を放射性 [ひ-32 P] 3 ' dN
TPを用いて測定した。 その結果、 3 ' d GTP>3 ' d ATP, 3 ' d UTP>
55 3 ' d CTPであった。
上記蛍光色素の発光強度及び T 7 RNAポリメラ一ゼによる取り込み率を考慮 して、 本発明の実施例では、 以下の組合せ及び量の蛍光ターミネータ一を使用し ている。
R 6 G-3 ' d ATP ΙμΜ
R 1 10-3 ' d GT P 1
X R-3 ' d CTP 50 μΜ
TMR-3 ' d UT P 12.5μΜ
さらに、 R6G— 3 ' dATP、 R 1 1 0-3 ' d CT P、 X R-3 ' dGTP、 TM R-3 ' dUTPの組合せを用いると以下の量で、 均一なピークの出力が得られる。 R 6 G-3 ' d ATP 1 /
R 1 10-3' dCTP 10 μ
X R-3 ' dGTP 5/iM
TMR-3 ' d UT P 12.5μΜ
T 7 R RNAボリメラーゼ及びその変異体を用いる場合の、 蛍光色素と 4種類の 3 ' 一デォキシリボヌクレオチドとの好ましい組合せの例を以下に示す。 但し、 これらは単なる例示に過ぎず、 蛍光色素が変われば、 好ましい組合せも変化する。 蛍光色素と塩基との組合せの例
R 6 G-3 ' dCTP、 R 1 10-3 ' d AT P、 X R~3 ' dUTP、 TMR-3 ' dGT P
R 6 G-3 ' dATP、 R1 10- 3' d CT P、 X R-3 ' dUTP、 TMR-3 ' dGTP
R 6 G-3 ' dCTP、 R 1 1 0-3 ' dUTP、 XR-3 ' dATP、 TMR-3 ' dGTP
56 R 6 G- 3 ' d UT P、 R 1 1 0 - 3 ' d CT P、 X R- 3 ' d AT P、 TM R- 3 ' d GT P 無機ピロフォスファターゼ存在下での核酸転写生成反応 本発明の方法において、 核酸転写生成反応は、 無機ピロフォスファタ一ゼ存在 下で行うこと力 各標識されたリ ボヌク レオチ ドに対応して得られるピ —ク高さ （シグナルの強弱） の差を小さく してシークェンスの読み取 りの精度を向上させて、 よ り正確なシークェンスデータを得ることを 可能にするという観点から好ましい。
ピロホスホロリシスは、 DNA合成によって生じるピロリン酸塩が増加することに よって起こり、 結果として合成された DNA生成物が分解する方向に反応を促進す る働きをする。 その結果、 ピロホスホロリシスは、 DNA ポリメラーゼを用いたジデ ォキシシーケンス法においてシーケンスを阻害することになる。 それに対して、 無機ピロフォスファタ一ゼを DNA ポリメラ一ゼを用いたジデォキシシーケンス法 において使用すると、 ピロホスホロリシスを阻害して、 安定したシークェンスデ —タが得られることが知られている [特開平 4— 5 0 6 0 0 2号]。 しかるに、 ピロホスホロリシスが、 R N Aポリメラ一ゼを用いたシーケンス法に おいて、 どのような作用をするかは知られていなかった。 そこで、 本発明者の検 討の結果、 上記本発明の方法において、 核酸転写生成反応を無機ピロフォスファ タ一ゼ存在下で行うことで、 より安定したシークェンスデータが得られるが判明 した。
無機ピロフォスファターゼ（EC. 3. 6. 1. 1)は、 市販品として入手可能であり、 例 えば、 シクマ社から INORGANIC PYROPHOSPHATASE として、 またべ一リンガー社か らピロフォスファタ一ゼとして市販されている。 また、 無機ピロフォスファタ一 ゼの使用量は、 無機ピロフォスファタ一ゼ及び R N Aポリメラーゼの活性の程度
57 にもよるが、 例えば、 R N Aポリメラーゼ 1単位に対して 10— 6〜 10— 2単位の範囲と することが適当である。
上記のように読み取られた R N A又は核酸配列から、 転写の铸型として用いら れた D N A配列を決定することができる。 各塩基について、 それぞれラダ一を形 成した場合には、 4種類のラダ一から得られた R N A又は核酸配列情報を総合し て、 転写の铸型として用いられた D N A配列を決定することができる。 また、 2 種以上の塩基について同時にラダーを形成した場合 （同一のラダー内に 2種以上 の塩基のバンドが共存する場合） には、 各ラダーから得られた R N A又は核酸配 列情報を総合して、 転写の铸型として用いられた D N A配列を決定することがで きる。 特に、 4種の塩基について同時にラダーを形成した場合 （同一のラダー内 に 4種の塩基のバンドが共存する場合） には、 1つのラダ一から得られた R N A 又は核酸配列情報から、 転写の铸型として用いられた D N A配列を決定すること ができる。
また、 本発明のシークェンス方法は、 各種キットとして利用することもできる。 本発明によれば、 リボヌク レオチ ドに比べて、 対応する 3 ' -デォキ シリボヌク レオチ ドやその誘導体がポリ リボヌク レオチ ド配列に取り 込まれにくかったり 、 リボヌク レオチ ドの中及び 3 ' -デォキシリ ボヌ ク レオチ ドの中でもそれぞれ塩基の種類によ り、 配列への取り込まれ 方に差がある といった、 リボヌク レオチ ド等の取り込み能力に対する バイアスを解消して、 よ り安定したシークェンスデータをえることが できる DNAの塩基配列決定方法を提供することができる。
本発明の塩基配列決定方法は、 R N Aポリ メ ラ一ゼの高いブロセッ シビリティ一を考えると、 D N Aポリメラ一ゼを用いる塩基配列決定法以上
58 の塩基配列決定を可能にする。 特に、 本発明の方法によれば、 PCR生成物を精製することなく、 そのまま P CR生成物の DN Aの塩基配列を決定することもできる。 これは、 反応混合物に 残存する 2' dNTPが、 シ一クェンシングのための 3 ' d NT Pの存在下では RNA転写反応において試薬として消費されることがないという、 RNAポリメ ラ一ゼの特徴によるものである。 さらに、 本発明の方法では、 RNAの転写反応を利用するため、 通常の DNA シーケンス法のように 1本鎖テンプレ一ト DNAを使用する必要も、 プライマ一 も必要がなく、 さらにシークェンシンダプライマ一のハイブリダイズのための変 性工程も必要としない。 そのため、 P CR生成物の再生の影響も受けず、 容易に DN Aの塩基配列を決定することができる。 また、 本発明の DNA の塩基配列決定方法において、 RNAポリメラ一ゼ として耐熱性を有する変異型の RN Aポリメラ一ゼを用いる場合、 PCR法を行う段 階に併用することができ、 その結果、 より迅速に DNA の塩基配列の決定を 行う ことが可能になる。
実施例 以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 参考例 1
野生型 T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のクローニングと発現プラスミ ドの構築 大腸菌を宿主とする T7 ファージは、 以下のように精製した。 大腸菌 C600を LB 培地 (Bacto tryptone 10g， Bacto yeast extract 5g， NaCl 5gを 1 リッターの水 に溶かし、 pH 7.5 に調整したのち、 オートクレーブにて滅菌した培地） 200ml に 植菌し、 菌体濃度が 0D (600nm) =1.0 に達した時点で、 多重感染度約 2 で感染さ
59 せ、 その後 0Dを経時的に測定し、 0Dが急激に落ちた時点で遠心操作にて、 菌体残 査をのぞき、 NaCl及びポリエチレングリコ一ル 6000をそれぞれ最終濃度、 0. 5M、 及び 10%になるように加え、 よく撹拌後、 一晩、 4eCにて静置し、 沈殿を形成させ た。 この沈殿を遠心操作で集め、 SM緩衝液 （10 mM Tris-HCl , pH 7. 5， 10 mM MgS04,
50 mM NaCl , 0. 01% gelatin) にて懸濁した。 この T7 ファ一ジの濃縮液を、 次に 遠心管に丁寧に重層した密度の異なる CsCl 溶液上 （下層から、 CsCl 濃度が、
1. 267g/ml, 0. 817g/ml, 0· 705g/mlである溶液) に重層し、 22, OOOrpmで 2時間、 遠心することにより、 ファ一ジ層を形成させ、 このファ一ジの白いバンドを丁寧 に分取し、 TE緩衝液 （10mM Tris-HCl, pH 7. 5， ImM EDTA)で透析し、 CsCl 成分を 除去した。 更にこのファージ溶液を、 フエノール処理により、 ファ一ジ蛋白質を 変性させ、 T7 ファ一ジのゲノム DNAを精製した。
T7 RNAポリメラ一ゼ遺伝子はこのゲノム DNA、 39, 937塩基対の内、 31 から 5822 番目にコードされている [T7 ゲノム遺伝子の全塩基配列については、 Dunn らによ つて既に報告されている（1983, J. Mol. Biol. , 166 (4) : 477- 535)。 但し、 若千の 訂正がある（GeneBank、 access ion No. V01148 J02518 X00411 の T7 ファージ DNA 配列参照）]。 このゲノム DNA を鎊型として PCR を利用して増幅し、 以下のように 発現べクタ一にクロ一ニングした （図 9参照）。 すなわち、 5 ' 末端に制限酵素 Nco
I 切断部位をそれぞれ含み、 T7 RNA ボリメラーゼ 遺伝子の N末端ァミノ酸領域 上流に特異的なプライマ一（T7Rpol - N 5' -ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA
ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3' )、 及び C末端アミノ酸領域下流に特異的なプラ ィマー（ T7Rpo卜 C 5' -ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG -3' ) を用いて、 この酵素遺伝子を PCR法により増幅した。 この DNAフラグメントを Nco
I で消化し、 1%ァガロース電気泳動を行い、 目的の DNA フラグメントをァガロー スから切り出し、 Gene Pure Kit (二ツボンジーン） を用いて精製した。 これを Nco
60 I で消化し脱リン酸化した発現ベクター pTrc99a (フアルマシア 'バイオテク） と 連結することで T7 RNA ポリメラーゼ を高発現する pT7R を構築した。 野生型 T7 RNA ポリメラーゼを発現するプラスミ ド pT7R は、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 抗 生物質アンピシリン耐性を示す大腸菌を、 培養し、 培養液中に IPTG を添加し、 発 現べクタ— pT7Rに含まれる Trc プロモータ一を稼働させた。 IPTG添加 2時間後、 大腸菌を回収し、 全蛋白質を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により解析し たところ、 T7 RNAポリメラーゼの分子量である 99kDa付近に、 IPTGを添加した時 のみ蛋白質のバンドが検出された。 この蛋白質を更に、 Zawadzki, Vら、 1991， Nucl. Acids Res. , 19 : 1948 に既に記載されている方法を一部改良した方法 （詳しい方 法は参考例 3で例示されている変異型 Τ7 RNA ポリメラーゼの精製法とほとんど同 じ方法で行うことが出来る） で精製したところ、 Τ7 プロモータ一特異的に作用す る RNAポリメラーゼの活性を有していた。
参考例 2
変異型 Τ7 RNAポリメラ一ゼを生産するための発現プラスミ ドの構築
( 1)変異型 Τ7 RNAボリメラ一ゼ F644Yを生産するための発現プラスミ ドの構築 (図 1 0参照）
野生型 Τ7 RNAポリメラーゼ 遺伝子の挿入してある pT7R を铸型にして、 T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子の C末端側に相当する制限酵素 Hpa I , Nco I 部位 に 挟まれる領域を PCR 法を利用して変異を導入した。 更に詳しく例示すると、 変異 を導入したい塩基を境界として、 左右に分け、 変異の導入してある プライマ一
F646Y (+) (5， -GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC - 3' )、 F646Y (-) (5'一 GTC
CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3' ) とそれぞれの制限酵素切断部位を 5'末端に 持つ プライマ一 T7RNAP- Hpal- N (5' -CGC GCG GTT AAC TTG CTT CCT AG- 3' ) 、 pTrc99a-PstI-C (5' - GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG- 3' )を用いて PCR により
61 それぞれの DNA フラグメントを増幅した。 これらの DNA フラグメントには相補 する部分があり、 これらを変性、 ァニール、 伸長反応を繰り返すことで目的の変 異の導入された DNA フラグメントを作製した。 この DNA フラグメントをァガロ —スゲル電気泳動により、 目的の大きさの DNA フラグメントのみを切り出すこと で精製し、 これを鐯型としてプライマー T7RNAP-HpaI - N と pTrc99a_PstI-Cを用い て再増幅し、 制限酵素 Hpa I ， Pst I で切断した。 この DNA は 1 %ァガ口一ス電 気泳動を行い、 分離した後、 目的の DNA フラグメントを切り出し、 精製した。 こ の DNA フラグメントを pT7R の Hpa I , Pst I DNA フラグメントと置き換える ことで変異を導入し， 大腸菌 DH5ひに形質転換し、 変異の導入されたプラスミ ド を選択し、 最終的には塩基配列を確認することで目的の位置に変異が導入されて いるかどうかを確認した。 そして、 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Yを生産する ための発現プラスミ ド pT7RF644Yを得た。 このプラスミ ドからの変異型 T7 RNAポ リメラーゼ F644Yの生産は、 野生型 T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、 本プラス ミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTGを添加することにより、 発現誘導可能であった。
(2)変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ L665P/F677Y を生産するための発現プラスミ ド の構築 （図 1 1及び 1 2参照）
変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ L665P/F667Yの構築は、 先の F644Yの構築同様、 PCR 法をべ一スにして以下のように行った。
先ず、 野生型 T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を持つ発現べクタ一 pT7R中の T7 RNAポ リメラ一ゼ遺伝子領域内に、 変異導入操作を容易にするため制限酵素 Xhol (CTC
GAG)を導入した。 更に具体的に述べるとプライマー ApaFl (5' -CAT CTG GTC GCA TTG
GGT CAC- 3' )とプライマ一 Xho-R (5， -CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA- 3' )の組み合 わせで、 また、 Xho - F (5' -CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG- 3' )とプライマ
― Afl I I-R (δ' -CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3' )の組み合わせで、 各々踌型とし
62 て発現べクタ一 pT7Rを用いて、 PCRを行った。 増幅した前者の DNAフラグメント は制限酵素 Apal と Xhol で、 後者の増幅した DNA フラグメントは制限酵素 Aflll と Xholでそれぞれ反応し、 さらに発現べクター pT7Rを予め Apal と Aflllで処理 して、 全てを T4 DNA ライゲ一スを用いて結合させた。 この反応物を大腸菌 DH5 a に形質転換し、 抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを 複数得た。 このコロニーをいくつか選択し、 培養、 プラスミ ド DNAの抽出を行い、
T7 RNA ポリメラ一ゼ遺伝子領域内に制限酵素 Xhol 部位が生まれたプラスミ ド pT7R-Xhoを得た （図 1 1参照)。 この Xhol部位は、 制限酵素 Xholで処理すること によって、 切断されること及び DNA の塩基配列决定を行い、 その存在を確認可能 である。 このプラスミ ド pT7R - Xhoを铸型として、 プライマ一 Xho- R とプライマー
667R (5' -GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3' )の組み合わせとプライマ一 667F (δ' -
GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3' )とブライマ一 AflllR の組み合わせで各々 PCR を行った。 この PCR産物を直接铸型として、 DNAの塩基配列を決定し、 プライマ一
667Rおよび 667Fの配列を確認し後、 それぞれを 2%ァガロース電気泳動 （ァガ口
—スは二ツボンジ一ン製のァガロース Xを使用） を行い、 目的の大きさの DNA フ ラグメントを切り出し、 Gene Pure Kitを用いて、 この DNAフラグメントを精製し た。 この精製した 2つの DNA を混合し、 铸型としてプライマー XhoF及び Afl llR を用いて PCRを行レ、、 増幅した DNAフラグメントを制限酵素マッビング、 DNA塩基 配列の解析により目的のフラグメントであることを確認、後、制限酵素 Xholと ΑΠΠ を用いて酵素反応を行い、 これを予め制限酵素 Xholおよび ΑΠ ΙΙで処理したプラ スミ ド pT7R- Xho に T4 DNA ライゲースを用いて結合させた。 この反応物を大腸菌
DH5 αに形質転換し、 抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニ
—を複数得た。 このコロニーをいくつか選択し、 培養、 プラスミ ド DNA の抽出を 行い、 目的の変異が導入されているかを DNA塩基配列の決定を行レ、、 確認し、 最
63 終的に目的の変異型 T7 RNAポリメラーゼ L665P/F667Yを生産するための発現プラ スミ ド pT7RL665P/F667Y を構築した （図 1 2参照）。 このプラスミ ドからの変異型 T7 RNAポリメラーゼし 665P/F667Yの生産は、 野生型 T7 RNAポリメラーゼの生産と 同様、 本プラスミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTG を添加することにより、 発現誘 導可能であった。
参考例 3
変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ の精製 大腸菌に導入した変異型 T7 RNA ボリメラーゼ蛋白質を精製した。 尚、 本蛋白質の野生型については既に Chamberl in, M et al. Nature,
228: 227-231 (1970) , Davanloo et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA.， 81 : 2035—
2039 (1984)に記載されている。 さらに大量生産に関しては、 Zawadzki, V et al. ,
Nucl. Acids Res.， 19 : 1948 (1991)に報告されている。 変異型 T7 RNA ポリメラーゼは基本的に全て同じ方法で精製できる。 変異部位の 違いにより、 その発現量、 カラムクロマトグラフィの挙動が若干異なることもあ る。 以下、 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Yの精製法を例示する。 F644Y の発現 ベクター pT7RF644Yを大腸菌 DH5 aに導入、 抗生物質アンピシリンを含んだ LB培 地にて、 先ず、 試験管培養にて 0D (600nm) =0. 4〜0. 6 になったとき、 イソプロピ ル - -チォガラク トピラノシドを終濃度 0. 4mM になるように加え、 更に 8 時間培 養する。 このとき遠心分離により、 大腸菌菌体を集め、 典型的には 2 リツターの 培養液より 10g の湿重量の大腸菌が得られる。 この大腸菌菌体を直ぐに使用しな い時は、 -20°C以下の冷凍庫で保存が可能である。 この段階以降、 酵素の精製の全ての工程は、 特記しない限り、 室温以下の温度、 好ましくは 0〜5°Cにて実施する。 この大腸菌は、 このとき菌体重量の 10倍の洗浄 緩衝液 （20mM Tris-HCl, pH 8. 1， 130 mM NaCl, 2mM EDTANa2 at 25°C)で洗い、
64 再び遠心分離（5， 000xg、 4°Cにて 10分間） し、 10倍量のソニケ一シヨン緩衝液 [50 mM Tris-HCl, pH 8. 1， 100 mM NaCl, 0. 1 mM EDTANa2, δ mMジチォスレイ トール（DTT)、
0. 1 mMベンザミジン， 30 i g/ml フエ二ルメチルスルホニルフルオリ ド（PMSF)、 10
M g/mU バシトラシン] に懸濁し、 ソニフアイャ一 450 (ブランソン社） を用い、
80W、 分間超音波処理を行い菌体を破砕、 粘度を低下させる。 続いて、 12，000xg、
4°Cにて 10分間遠心分離し、細胞残查を除いた。得られた上清を撹拌しながら、 10% 硫酸ストレプトマイシンをゆつくりと滴下し、 終濃度 2. 0%とした後、 更に 30 分 間撹拌を続けた。 12, 000xg。 4°Cにて 10 分間遠心分離し、 沈殿を除去し、 粉末硫 安をゆつく り添加しながら撹拌し、 沈殿を形成させる。 この場合、 最初に 30%飽 和硫安で沈殿を集め （30%硫安沈殿）、 上清は更に 60%飽和硫安になるように硫安 を撹拌しながら添加し、 再び沈殿を形成させ （30-60%硫安沈殿）、 更に上清を 90% 飽和硫安になるように粉末硫安を加え、 4°Cにて 1時間撹拌し、 遠心し回収した。 この 3つの硫安画分の一部を SDS-アクリルアミ ドゲル電気泳動を行い、 蛋白質を 分析したところ、 目的の変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼのほとんどは、 30-60%硫安 画分に存在し、 以後この画分を用いて精製を進めた。 30- 60%硫安画分は少量の力 ラム緩衝液 （20 mM KP04, ρΗ7. 7, 100 mM NaCl, lmM DTT, 30 μ g/ml PMSF)に懸濁 し、 同じ緩衝液 500ml にて、 16 時間透析し、 脱塩した。 この透析液を、 カラム体 積 5ml のへパリン -セファロ一ス （フアルマシア 'バイオテク） に付加する。 次い で、 このカラムを同緩衝液で、 280nm の紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗 浄し、 カラム体積の約 40倍の体積の同一緩衝液中の 0. 1M〜0. 64M NaCl の直線 濃度勾配で溶出する。 溶出液は、 適当量を試験管に分画して集め、 直ぐに SDS-ァ クリルアミ ドゲル電気泳動を行い、 蛋白質を分析し、 目的の変異型 T7 RNA ポリメ ラーゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。 典型的な例で は 0. 4M の NaCl付近に見いだされるはずである。 この蛋白質を含む分画を集め、
65 約 1 リツターのカラム緩衝液 （20 mM KP04, pH7. 7, 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 μ g/ml PMSF)に対して 16 時間透析し、 脱塩操作を行った。 この透析脱塩した分画を、 同 緩衝液で予め平衡化した 5ml のカラム体積の Q-セファロ一ス（Q_sepharose, ファ ルマシア ·バイオテク）に付加し、 同緩衝液で、 280nm の紫外線吸収物質が検出さ れなくなるまで洗浄し、カラム体積の約 40倍の体積の同一緩衝液中の 0. 1M〜0. 64 M NaCl の直線濃度勾配で溶出する。 溶出液は、 適当量を試験管に分画して集め、 直ぐに SDS-ァクリルアミ ドゲル電気泳動行い、 蛋白質を分析し、 目的の変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。 典 型的な例では 0. 24M の NaCl 付近に見いだされるはずである。 この蛋白質を含む 分画を集め、 500mlの保存用緩衝液 （50% glycerol, 20 mM KP04> ρΗ7. 7， 100 mM NaCl, ImM DTT, 30 μ g/ml PMSF) に対して 16時間透析し、 使用まで - 20°Cにて保存する。 この状態で、 イン ' ビトロの RNA合成活性、 或いは混入しているリボヌクレア一 ゼ活性について試験する。 ここでこの方法を例示すると、 イン · ビトロ RNA 合成 活性については、 T7 プロモータ一を含むプラスミ ドを铸型として用い、 野生型 T7 RNAポリメラ一ゼの市販品 （BRL ·ギブコ社） を標準品として酵素希釈法を用いて、 RNA合成反応を行い、 合成した RNAをァガロース電気泳動する事により、 おおよそ の力価を推定した。 このとき、 合成された RNA の分解の程度も観察されるため、 同時に混入リボヌクレア一ゼに関しての、 簡単な検定も可能である。 典型的な例 として、以上のような工程を踏まえた精製法で、 1 リッターの培養液から 2, 500, 000 単位の変異型 T7 RNA ボリメラーゼ F644Y蛋白質が精製され、 この標品にはほとん ど RNaseの混入は認められない。 参考例 4 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yを生産するための発現プラスミ ド の構築 （図 1 3参照）
66 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yの構築は、 先に構築した変異型 T7 RNA ポリメラーゼ L665P/F667Y を生産する発現プラスミ ド構築方法 （参考例 2 参照） と同様に、 PCRをべ一スにして以下のように行った。
変異型 T7 RNAポリメラーゼし 665P/F667Yを生産する発現プラスミ ドを铸型とし て 、 プ ラ イ マ 一 Xho- F と プ ラ イ マ 一 T7-D0UBLE- R (21mer: 5，- CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3' )の組み合わせとプライマー T7 - DOUBLE- F (29mer： δ' - TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC- 3' )とプライマ一 ΑΠ ΙΙ - R の組み合わせで各々 PCRを行った。 この PCR産物を直接铸型として、 DNAの塩基配列を決定し、 プライ マ一 T7-D0UBLE-Rおよび T7-D0UBLE- F の配列を確認後、 それぞれを 2%ァガ口一ス 電気泳動を行い、 目的の大きさの DNA フラグメントを精製した。 この精製した 2 つの DNAを混合し、 铸型としてプライマ一 Xho- Fおよび ΑΠ Π- R用いて PCRを行 レ、、 増幅した DNAフラグメントを制限酵素マッビング、 DNA塩基配列の解析により 目的のフラグメントであることを確認後、 制限酵素 Xholおよび ΑΠ Ι Ι を用いて酵 素反応を行い、 これを予め制限酵素 Xhol および Afl l l で処理したプラスミ ド PT7RL665P/F667Y に T4 DNA ライゲ一スを用いて結合させた。 この反応物を大腸菌 DH5 aに形質転換し、 抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニ —を複数得た。 このコロニーをいくつか選択し、 培養、 プラスミ ド DNA の抽出を 行い、 目的の変異が導入されているかを DNA塩基配列の決定を行い、 確認し、 最 終的に目的の変異型 T7 R Aポリメラ一ゼ F644Y/し 665P/F667Yを生産するための発 現プラスミ ド pT7RF644Y /し 665P/F667Y を構築した （図 1 3参照）。 このプラスミ ド からの変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Y の生産は、 野生型 T7 RNA ポリメラーゼの生産と同様、 本プラスミ ドを含む大腸菌を培養し、 IPTG を添加す ることにより発現誘導可能であつた。
参考例 5
67 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yの精製
変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Yは、 参考例 3に記載の方法と同 じ方法で精製可能であった。典型的な例として、 1 リッターの培養液から 1,000,000 単位の変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Y蛋白質が精製された。 得ら れた RNA ポリメラ一ゼは、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にて、 ほぼ単一 バンドであり、 この標品から RNaseは検出されなかった。
合成例 1
3'ーデォキシ- 5—ョ一ドシチジン （前述の合成スキーム中の化合物 6に相当。 以下、 化合物 6と略記する。 尚、 以下の化合物についても同様に合成スキーム中 の化合物を夫々示す。 ) の合成
3'-デォキシシチジン （化合物 5 ： 3.0g, 13.2mraol ) を 1,4-ジォキサン （300tnl ) とエタノール （30ml) の混合溶液に懸濁させ、 10°Cまで冷却させた後、 トリフル ォロ酢酸銀 （7.0g，31.7mmol ) 及びヨウ素 （8.04g, 31.7画 ol) を添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了後、 沈澱物をセライ トを通して濾別し、 1,4-ジォキサ ンで洗浄し、 ろ液と洗液を合わせて濃縮して、 3'—デォキシ -5—ョ一ドシチジン
(化合物 6 ) を 3.84g得た （収率 82.4% ) 。
1H -匪 R (270MHz, DMS0-d6) 6 ppm: 1.64-1.70 (m, 1H， 3' - Ha) , 1.88-1.99 (m, 1H, 3' -Hb) , 3.60-3.89 (m, 2H, 5'— Ha，b), 4.20-4.21 (m， 1H, 4'一 H)， 4.37-4.39 (m, 1H, 2' -H) , 5.59 (s， 1H， — H)， 7.58 (brs, 1H, NH 2 a), 8.41 (brs, 1H， NH 2 b)， 8.79 (brs, H, 6-H) 合成例 2
5-トリフルォロアセタミ ド- 1一ペンチンの合成
水素化ナトリゥム （60%油性； 5.99g, 0.15mol) の DMF (340ml ) 溶液にトリ フルォロアセタミ ド （19.2g,0.17mol) を氷冷下、 10 回にわけて添加した。 次いで
68 ヨウ化ナトリ ウム （20.4g,0.136mol) を加え、 その後 5-クロ口- 1一ベンチン
(13.97g, 0.136mol ) のジメチルホルムアミ ド （DMF) (50ml) 溶液を加て、 室温で 4.5 時間、 次いで 60°Cで 21 時間撹拌反応させた。 反応液を冷却後、 リン 酸二水素カリゥム （59.2g) 水溶液 （500ml) を加え、 この溶液をエーテル （500ml) で抽出した。 エーテル層を水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮 し、 得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー （溶出液；へキサン-酢 酸ェチル混合溶媒） で精製して、 5-トリフルォロアセタミ ド -1-ペンチン 17.6gを 得た （収率 67% ) 。
1H -剛 R (270MHz, CDC13 ) δ ppm: 1.83 (m, 2H, —(¾(¾(¾-)， 2.04 (t, 1H, J=2.7Hz, H-CC-) , 2.31 (dt, 2H, J=2.7, 6.6Hz, - CCC - ), 3.52 (q, 2H， J=6.7Hz, CH2N)， 6.88 (brs, 1H， NHTfa) 合成例 3
3'- デオ^^ - 5·： (5"- トリフルォロアセタミ ド—！ "—ペンチニル） シチジンの合 逮
3'-デォキシ- 5- ョ一ドシチジン （化合物 6 ： 777mg, 2.20mmol) の DMF (11ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 2で得た 5-トリフルォロアセタミ ド -1- ベンチン
(1.18g,6.60mmol) 、 よう化銅 （ I) (83.8mg， 0.44隱 ol) 、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0) (254mg，0.22圆 ol) 及びトリェチルァミン
(0.613ml, 4.4mmol ) を加え室温で 30 分間反応させた。 反応液を塩化メチレン - メタノ一ル混液 （20ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (バイオラド社製； HC03_ 型； 2.02g ) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリ 力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロロホルム- メタノール混合溶液） で精製し、 メタノール - エーテル混合液より結晶化して、 新規物質 3'-デォキシ-
5- (5"- トリフルォロアセタミ ド- 1' ペンチニル） シチジン 409mg を得た （収率
69 46.0% ) 。 融点 191-193。C
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.63-1.78 (m， 3H， 3' -Ha and CH2 CH2CH2N) , 1.86-1.96 (m, 1H, 3'— Hb)， 2.39-2.44 (m, 2H, C^C^Cl^N) , 3.27— 3.31 (m, 2H, CH2N) , 3.51-3.82 (m, 2H， δ' -Ha, b) , 4.12-4.31 (m, 2H, 2' -H and 4' -H) , 5.15 (t, 1H, J = 5.1Hz, 5'— OH), 5.51 (d, 1H, J = 4.1Hz, 2'— OH)， 5.62 (s, 1H， l'-H), 6.69 (brs, 1H, 4-NHa) , 7.64 (brs， 1H， 4-NHb) , 8.30 (s, 1H, 6— H)， 9.50 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 4
トリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートの合成 ピロリン酸テトラナトリウム十水和物 （2.23g ) を水 （50ml) に溶解し、 ィォ ン交換樹脂ダウエックス 50WX8 (ダウエックス社製； H+型、 45ml) のカラムに通 した。 カラムは更に水で溶出し、 溶出液の pH がほぼ中性になるまで集めた。 トリ - n- プチルァミン （3.55ml) を溶出液に加え良く撹拌した。 混合液を減圧濃縮 し残渣はエタノール、 ピリジン、 DMFで更に共沸濃縮乾固した。 得られた残渣 を乾燥 DMFに溶解し 10ml にメスアップして 0.5M濃度のトリス （トリ- n_ブチ ルアンモニゥム） ピロホスフェートを得た。 合成例 5
5- (5"- ァミノ- ペンチニル) -3'-デォキシシチジン- 5 トリホスフエ- ト の合成
3'-デォキシ -5- (5"-ト リ フルォロアセタ ミ ド- 1"-ペンチニル） シチジン
(I21mg, 0.3mmol) をリン酸トリェチル （1.21ml) に溶解し、 _20°Cまで冷却した 後ォキシ塩化リン （25 μΐ ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩 化リン （22//1) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 一 20°Cに冷却
70 した合成例 4で得たトリス（トリ -n-ブチルァンモ-ゥム）ピロホスフエ一トを 0.5M 含む DMF溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了後、 トリェチ ルァミン- 水混液 （5ml) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を DE A E- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ一 （東ソ一社製： 1.7 X 30cm； 溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (ρΗ7· δ)0Μ→0.3Μ 直線濃度勾配 ( 全量 1 ) で精製して、 新規物質 5- (5"-ァミノ- 1 "-ペンチニル） -3'-デォキ シシチジン- 5'-トリホスフェート 105mgを得た （収率 36.6% ) 。
合成例 6
XR—標識 3'—デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て Vがー C三 C一であって、 n = 3の化合物） の合成
5- (5"—ァミノ- 1"-ペンチニル） -3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート (8 μιποΐ) を溶解した DMF (300 μ 1) -水 （300μ1) 混合液に、 トリェチルァ ミン （10/il) と 5-カルボキシ- X- ローダミンコハク酸イミ ドエステル （モレキ ユラ一プローブ社製） （26.9 mol) を加え室温で一夜撹拌した。反応液に水（30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー (1.7 X 15cm;溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M→0.7M 直線濃度勾配 （全量 2 ） で精製して、 下記式で示される XR- 標識 3'- デォキ シシチジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C三 C一であつ て、 n = 3の化合物。 以下、 XR— 3' d CTP (n 3) と略記する。 〕 6.28 μ mol を得た （収率 78.5% ) 。
71 NH2
0 0 0
II II II
o-p— o- -p— o- — P—
1 1 1
0一 0一 0—
また、 得られた XR- 3 ' d CTP (n 3) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 4に示す。
合成例 7
6-トリフルォロアセタミ ド -1-へキシンの合成 1 ) 5 -へキシュル- p- トゾレエ ンスルフォネー卜の合成
氷冷した塩化 P-トルエンスルフォ-ル （20. llg, 105.5mmol) のピリジン （30ml) 溶液に 5-へキシン- 1- オール （東京化成 （株） 製； 10ml，91.7mmol) を滴下し、 そ の後室温で 20 時間撹拌した。 反応液に水 （15ml) を加え攪拌した後水 （500ml) に投入した。 この溶液をェ一テル （300ml) で抽出し、 エーテル層を冷 1N-塩酸、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液および水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後减 圧下に濃縮して、 5 -へキシニル -P-トルエンスルフォネ一ト 7.33g を得た
(収率 32%) 。 2) 6-ョ一ド- 1—へキシンの合成
5 -へキシュル- p-トルエンスルフォネート （7.33g，33.3瞧 ol) 、 よう化ナトリウ ム （4.99g,33.3mmol) およびアセトン （37ml) の混合液を 1時間還流反応させた。 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した。 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロ マトグラフィ一 （溶出液；へキサン） で精製し、 6-ョ一ド- 1-へキシン 3.31g を
72 得た （収率 54. 8% ) 。
3 ) 6-トリフルォロアセタミ ド- 1-へキシンの合成 水素化ナトリウム （60%油性； 2. 55g, 63. 6mol) の DM F (50ml) 溶液にトリフ ルォロアセタミ ド （8. 99g, 79. 6隱 ol) を氷冷下、 約 10 部分にわけて添加した。 次 いで 6-ョ一ド -1-へキシン （3. 31g, 15· 9隱 ol) の DM F (15ml) 溶液を加えた。 反 応液を室温で 4時間撹拌した。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水 （100ml) および エーテル （100ml) を加え抽出した。 エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥後減圧 下に濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液；へ キサン-醉酸ェチル混合溶媒） で精製して、 6-トリフルォロアセタミ ド-卜へキシ ン 2. 0gを得た （収率 65. 4% ) 。 融点 41. 0-42. 5 °C
1H-NMR (270MHz, CDC1 3 ) δ ppm: 1. 53-1. 80 (m, 4H, -CH2 (CH2) 2 -）， 1. 98 (t, 1H, J=2. 7Hz, H-CC-) , 2. 26 (dt, 2H, J=2. 5, 6. 7Hz, CC— CH2_)， 3. 41 (q, 2H， J=6. 8Hz, CHj-N ) , 6. 48 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 8
3'—デォキシ- 5— （6"—トリフ /レオロアセタミ ド- ' -へキシニル） シチジン （化 合物 7 ) の合成
3'—デォキシ- 5—ョードシチジン （化合物 6 ： 800mg, 2. 27mmol) の DMF (11. 4ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド -1- へキシン
( 1. 31g, 6. 80mmol) 、 よう化銅 （ I ) (86· 3mg， 0. 453瞧 ol ) 、 テ トラキス （トリ フエニルホスフィン） パラジウム （0 ) (262mg， 0. 227匪 ol ) 及びトリェチルァ ミン （0. 632ml， 4. 53画 ol) を加え室温で 30 分間反応させた。 反応液を塩化メチレ ン- メタノール混液 （20ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03—型； 2. 02g ) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラム
73 クロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合溶液） で精製し、 メ タノール- エーテル混合液より結晶化して、 新規物質 3'- デォキシ- 5- 6"- トリ フルォロアセタミ ド— i "—へキシュル） シチジン （化合物 7) 399mg を得た （収率 42.1% ) 。
融点 195-197 °C
1H-NMR (270MHz, DMS0 - d6) δ ppm: 1.52—1.69 (m, δΗ, 3' -Ha and C^C^C^C^N) , 1.86— 1.96 (m， 1H, 3' -Hb), 2.39-2.50 (m， 2H, C CH2— ), 3.18-3.28 (m, 2H, CH2N) , 3.50-3.83 (m, 2H, 5' -Ha, b) , 4.11-4.33 (m， 2H, 2'— H and 4'— H)， 5, 14 (t， 1H， J = 4.9Hz, 5'— 0H)， 5.50 (d， 1H, J = 4.0Hz, 2'— OH)， 5.62 (s， 1H, — H) , 6.65 (brs, 1H, 4-NHa) , 7.59 (brs, 1H， 4一 NHb), 8.29 (s， 1H, 6— H) , 9.41 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 9
5- (6 "—ァミノ- Γ'-へキシュル） -3' -デォキシシチジン- 5' -トリホスフエ一ト (化合物 8) の合成
3'—デォキシ- 5— (6"— トリフルォロアセタミ ド- へキシニル） シチジン （化 合物 7 ： 125.5mg, 0.3mmol ) をリン酸トリェチル （1.26ml) に溶解し、 一 20。Cま で冷却した後ォキシ塩化リン （25.11 μ 1) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過 後、 ォキシ塩化リン （22.32 μ 1) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液 を、 一 20。Cに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートを
0.5M含む D F 溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了後、 ト リエチルァミン- 水混液 （4ml) を添加、 一夜静置後、 25。/。アンモニア水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を
DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.7 X30cm ;溶出 液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直線濃度勾配（ 全 量 1し） ) で精製して、 新規物質 5- (6"-ァミノ- 1"-へキシニル） -3'-デォキシシ
74 チジン- 5'-トリホスフェート （化合物 8) 200mg を得た （収率 69.0%) 。 合成例 10
XR—標識 3'—デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て Vがー C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成
5- (6"- ァミノ- 1"-へキシニル） -3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート (化合物 8 ： 10//mol) を溶解した DMF (300 μ 1) —水 （300 μ 1) 混合液に、 トリェチルァミン （ΙΟμΙ) 、 5-カルボキシー X—ローダミンコハク酸イミ ドエス テル （モレキュラープローブ社製） （15μπι01) を加え室温で一夜撹拌した。 反応 液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロ マトグラフィ一 （1.7 X 15cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (pH7.5)0.1M→0.7 直線濃度勾配 （全量 2し） ) で精製して、 下記式で示されるリ ンカ一部のメチレン鎖の nの数が 4個である XR—標識 3'—デォキシシチジン - 5' -トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C三 C一であって、 n = 4の 化合物。 以下、 XR- 3 ' d CTP (n 4) と略記する。 〕 8.02μπιο1 を得た （収 率 80.2% ) .
Figure imgf000078_0001
また、 得られた XR- 3 ' d CTP (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nm〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 5に示す。
75 合成例 1 1
8 -トリフルォロアセタミ ド -1- ォクチンの合成
1 ) 7-ォクチン- 1—オールの合成
リチウムァセチリ ドエチレンジァミン錯体 （アルドリ ツチ社製 ； 11. 3g, 122. 5mmol) とジメチルスルホキシド （50ml) の懸濁液を 5 〜10°Cに冷却し、 1-ブ ロモ- 6- テトラヒ ドロピラニルォキシへキサン （シグマ社製； 25g， 94. 3画 ol ) を 2時間かけて滴下した。 その後室温で 2時間撹拌した。 反応液に水 （10ml ) を加 え 10 分間撹拌した後水 （150ml) に投入しエーテル （300ml) で抽出した。 ェ一テ ル層を水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後减圧下に濃縮し、 油状物として 8 - (テトラヒ ドロビラュルォキシ） -卜ォクチン 18. lgを得た （収率 91. 2% ) 。 8- (テ トラヒ ドロビラニルォキシ） - 1-ォクチン （18g， 85. 6mmol) とクロ口ホルム （40ml) とメタノール （140ml ) の混合液にダウエックス 50WX8 (H+型、 18g ) を添加し 環流下に 1時間加熱した。 樹脂を濾別後、 濾液を濃縮して得られた残渣をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液；へキサン- 酢酸ェチル混合液） で精製 し、 7-ォクチン - 1- オール 9. 6gを得た （収率 88. 6% ) 。
2 ) 7 -ォクチニル -P- トルエンスルフォネートの合成
氷冷した塩化 p-トルエンスルフォニル （17, 4g， 9 L 3mmol ) のピリジン （30ml ) 溶液に 7-ォクチン - 1- オール （9. 6g， 76. lmmol) を滴下し、 その後 5 〜 10。Cで 20 時間撹拌した。 反応液に水 （ ml ) を加え攪拌後反応液を水 （500ml ) に投入し エーテル （500ml) で抽出した。 エーテル層を冷 1N-塩酸、 飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液および水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮して、 7-ォ クチ二ル- p -トルエンスルフォネート 18. 3g を得た （収率 85. 7% ) 。
3 ) 8 -ョード -1—ォクチンの合成
7-ォクチ二ル- P—トルエンスルフォネート （18. 3g， 65. 2匪 ol ) 、 よう化ナトリ
76 ゥム （9. 77g， 65. 2mmol) およびアセトン （91ml) の混合液を 4時間環流反応した。 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一 （溶出液；へキサン） で精製し、 8-ョード -1- ォクチン 14. 5g を 得た （収率 94. 2% ) 。
4 ) 8-トリフルォロアセタミ ド- 1- ォクチンの合成 水素化ナトリウム （60。/。油性； 9. 82g, 245隱 ol) の DM F (200ml ) 溶液にトリ フルォロアセタミ ド （34. 7g, 307mmol) を氷冷下、 10 回にわけて添加した。 次いで 8-ョ一ド- 1- ォクチン （14. 5g，61. 4瞧 ol) の DM F (60ml) 溶液を加え、 室温で 2時間撹拌させた。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水溶液 （400ml) およびエーテ ル （400ml) を加え抽出した。 エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃 縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出液；へキサン 一酢酸ヱチル混合溶媒） で精製し、 へキサンより結晶化して 8_トリフルォロアセ タミ ド -1- ォクチン 10. 8g を得た （収率 79· 3% ) 。 融点 29. 5-30. 0 °C
1H-NMR (270MHz, CDC13 ) δ ppm: 1. 36-1. 63 (m, 8H, — CH2 (CH2) 4 -）， 1. 94 (t, 1H, J=2. 7Hz, H-CC-) , 2. 20 (dt, 2H， J=2. 5, 6. 7Hz, CC- CH2 -）， 3. 37 (q, 2H，J=6. 8Hz, C¾-N )， 6. 28 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 1 2
3'—デォキシ -5— （8 "— トリフルォロアセタミ ド- 1' ォクチニル） シチジン （化 合物 9 ) の合成
3'—デォキシ -5—ョ一ドシチジン （化合物 6 ： 450mg, 1. 27mmol) の DMF (6. 4ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 1 1で得た 8-トリフルォロアセタミ ド- 1- ォクチン
(846mg, 3. 82mmol) 、 よう化銅 （ I ) (48· 5mg, 0. 25mmol) 、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0 ) (147mg，0. 127mmol) 及びトリェチルァミン
77 (0.355ml, 2.55mraol) を加え室温で 30 分間反応させた。 反応液を塩化メチレン一 メタノール混液 （12ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03—型； 1.17g) を加え
30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ一 （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合溶液） で精製し、 メタノ 一ルーエーテル混合液より結晶化して、 新規物質 3'ーデォキシー 5_ (8"- トリフ ルォロアセタミ ド- Γ'-ォクチ二ル）シチジン（ィヒ合物 9) 219mgを得た（収率 38.5% )。 融点 165-167 °C
1H-MR (270MHz, DMSO- d6) 6 ppm:l.27-1.54 (m, 8H， _(CH2)4 -）, 1.63-1.69 (m, 1H， 3' -Ha), 1.86-1.97 (m, 1H, 3'— Hb)， 2.37 (t, 2H, J=7.0Hz, CCCH2), 3.14-3.2 Km, 2H， CHjN), 3.49-3.56 (m, 1H, 5' - Ha), 3.75-3.81 (m, 1H， 5' -Hb), 4.08-4.31 (m, 2H, 2'— H and 4'— H)， 5.13 (t, 1H， J = 5.0Hz, 5'—OH) , 5.49 (d, 1H， J = 4.1Hz, 2' -OH), 5.62 (d, 1H, J=l.4Hz, l'_H)， 6.62 (brs, 1H, 4— NHa)， 7.58 (brs, 1H, 4-NHb) , 8.28 (s, 1H， 6 - H) , 9.41 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 1 3
5- (8"—ァミノ- 1"-ォクチ二ル） -3'-デォキシシチジン - 5 '-トリホスフエ- ト (化合物 1 0 ) の合成
3'-デォキシ -5- (8"- トリフルォロアセタミ ド- Γ' -ォクチ-ル） シチジン （化 合物 9 ： 134mg, 0.3mmol) をリン酸トリェチル （1.34ml) に溶解し、 一 20°Cまで冷 却した後ォキシ塩化リン （25.11 μΐ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30分経過後、 ォキシ塩化リン （22.32 //1) を追加し、 さらに 3.5時間撹拌した。 この反応液を、
_20。Cに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモユウム） ピロホスフエ一トを 0.5M 含む DMF溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了後、 トリエ チルァミン-水混液 （5ml) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 （20ml) を加 え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を DE
78 AE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ一 （1.7 X30cm ;溶出液： 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5) 0M →0.3M 直線濃度勾配（ 全量 ID) で精製して、 新規物質 5- (8"-アミノ- Γ'-ォクチュル） -3' -デォキシシチジ ン- 5' -トリホスフェート （化合物 1 0) 262mg を得た （収率 50.0% ) 。
合成例 1 4
X R—標識 3' —デォキシシチジン- 5' -トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て Vがー C≡ C一であって、 n = 6の化合物） の合成
5- (8"—ァミノ- ' -ォクチニル） -3' -デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート (化合物 1 0 : 8 /x mol) を溶解した DMF (300 μ 1) -水 （300 μ 1) 混合液に トリェチルァミン （10 1) と 5-カルボキシ- X -ローダミンコハク酸イミ ドエステ ル （モレキュラープローブ社製） （12μ πιο1) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液 に水 （30ml) を加え希釈した後、 D E A E- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィ一 （1.7 X 15cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (pH7.5)0. 1M →0.7M 直線濃度勾配 （全量 2L) ) で精製して、 下記式で示される X R - 標識- 3' -デォキシシチジン- 5' -トリホスフヱ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて V がー C三 C—であって、 n = 6の化合物。 以下、 X R- 3 ' d CT P ( n 6 ) と 略記する。 〕 5.34/zmol を得た （収率 66.7% ) 。
79
Figure imgf000083_0001
また、 得られた XR— 3 ' d CTP (n 6) を、 DU 640紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定 した結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 6に示す。
合成例 1 5
6-クロロ -9— {2',5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） -3' -0- [ (ィ ミダゾ一ル- 1" —ィル） チォカルボニル] - |3- D- リボフラノシル} -7—デァ ザプリン （化合物 1 3) の合成
6_クロロ- 9— (j3 -D- リボフラノシル） -7—デァザプリ ン （化合物 1 1 ： 3.58g， 12.5隨 ol) を THF (160ml ) に溶解後、 ピリジン （5. lml， 62.7mmol) 、 硝酸銀 （4.68g, 27.6画 ol) 及び tert—ブチルジメチルシリ ルク ロ ライ ド
(4.16g, 27.6mmol) を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 沈澱物をセ ライ トを通して濾別し、 濾液を濃縮、 クロ口ホルムに溶解後、 0.2N塩酸及び飽 和食塩水にて洗浄した。 クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、 クロ口ホルムを留去し、 新規物質 6 -クロロ- 9一 [2,5-ビス （0_tert—ブチルジ メチルシリル） 一 3 -D-リボフラノシル] -7—デァザプリン （化合物 1 2) 6.42g を定量的に得た。 このものを更に精製することなく DMF (120ml ) に溶解後、 1， -チォカルボニルジイミダゾール （13.36g, 75. Ommol ) を添加し、 室温でー晚 撹拌した。 反応終了後、 酢酸ェチル及び水を加えたのち、 有機層を飽和食塩水
80 にて洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 減圧濃縮し、 得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル -n- へ キサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 6-クロ口- 9- {2',5'-ビス （0- tert-ブ チルジメチルシリル） -3'- 0- [ (イミダゾール- 1- ィル） チォカルボニル] - β -D- リボフラノシル } -7-デァザプリン （化合物 1 3) 4.03gを得た（収率 51.5% )。
合成例 1 6
6-クロロ- 9_ [2' , 5' -ビス (0-tert- ブチルジメチルシリル） -3' -デォキシ 一 β -D-リボフラノシル] -7—デァザプリン （化合物 1 4 ) の合成
6-クロ口- 9- {2',5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） - 3' - 0- [ (ィ ミダゾール- 1- ィル） チォカルボニル] - |3_D- リボフラノシル} -7- デァザ プリン （化合物 1 3 ： 4.0g,6.41mmol ) をトルエン （200ml ) に溶解後、 2, 2' -ァ ゾビス （イソブチロニトリル） （0.21g， 1.3mmol ) 及び水素化— トリ一 n—ブ チルすず （3.45ml， 13mmol ) を添加し、 窒素気流下、 80°Cで 30 分間撹拌した。 反応終了後、 トルエンを留去し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液； 酢酸ェチル -n-へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 6—クロロー 9— [2'，5'- ビス （0 - tert - ブチルジメチルシリル） -3' -デォキシ- β - D- リボフラノシル] - 7-デァザプリン （化合物 1 4) 2.60g を得た （収率 81.5% ) 。
合成例 1 7
6 -クロ口 -9- (3'- デォキシ-) 3 - D- リボフラノシル） -7- デァザプリン （化 合物 1 5) の合成
6 -クロ口 -9- [2' , 5' -ビス （0- tert-ブチルジメチルシリル） -3' -デォキシ- β
-D-リボフラノシル] -7-デァザプリン（化合物 1 4 :2· 6g， 5.2mmol)を THF (30ml) に溶解し、 1M テトラプチルアンモニゥム フルオライ ド （12.5ml, 12.5画 ol) を 添加し、 室温で一晩撹拌した。 反応終了後、 反応液を减圧濃縮し、 シリカゲル
81 カラムクロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合溶媒） で精 製して、 新規物質 6-クロ口 -9- (3'-デォキシ- J3-D- リボフラノシル） -7 -デ ァザプリン （化合物 1 5) 1.47g を定量的に得た。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.93, 2.23 (m, 2H， 3' -Ha, b) , 3.55， 3.71 (2dd, 2H, J = 4.1, 11.9; 3.2， 11.6 Hz, 5'_Ha,b), 4.36 (m, 1H, 2' _H)， 4.45 (m, 1H, 4'-H), 5.02 (brs, 1H， 5' -OH)， 5.66 (brs, 1H， 2' -OH) , 6.19 (d, 1H, J = 2.4Hz, 1 '一 H)， 6.70 (d， 1H, J = 3.8Hz, 7— H) , 8.02 (d, 1H, J = 4.1Hz, 8— H)， 8.66 (s, 1H, 2 - H)
合成例 1 8
6-クロ口- 9- (3'- デォキシ -2',5'- ジ- 0- ァセチル- ]3 - D- リボフラノシ ル） +デァザプリン （化合物 1 6) の合成
6-クロ口- 9- (3'- デォキシ- リボフラノシル） -7-デァザプリン （化 合物 1 5 ： 1.47g, δ.45mmol) をピリジン （15ml) に溶解後、 無水酢酸 （5ml) を 添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 0°Cに冷却しメタノール （5ml) を 加え減圧濃縮し、 クロ口ホルムに溶解後 0.5N塩酸及び飽和食塩水にて洗浄した。 クロロホルム層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、 ク口口ホルムを留去して 新規物質 6-クロ口- 9- (3'- デォキシ -2', 5'- ジ -0- ァセチル- ]3- D- リボフ ラノシル） - 7- デァザプリン （化合物 1 6) 2.00 を定量的に得た。
合成例 1 9
6 -クロ口- 7- ョ一ド- 9- (3'- デォキシ- 2', 5'- ジ- 0- ァセチル- -D - リ ボフラノシル） -7- デァザプリン （化合物 1 7) の合成
6_クロロ- 9- (3'- デォキシ- 2'，5'- ジ- 0- ァセチル- /3-D- リボフラノシ ル） -7-デァザプリン （化合物 1 6 ： 1.44g, 4.07mraol) をァセトニトリル (67ml) に溶解後、 硝酸二アンモニゥムセリウム （IV) (0.62g,2.44mmol) 及びヨウ素
82 (1. 12g, 2. 03mmol) を添加し、 80°Cで 30 分間撹拌した。 反応終了後、 ァセトニ トリルを減圧濃縮し酢酸ェチルに溶解後、 5 %亜硫酸水素ナトリゥム溶液、 飽 和炭酸水素ナトリゥム溶液及び飽和食塩水で洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫 酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去し、 塩化メチレン- エーテルで結 晶化させ、 新規物質 6-クロ口- 7- ョード -9- (3' - デォキシ- 2'，5' - ジ- 0- ァ セチル - ]3 - D-リポフラノシル） -7- デァザプリン （化合物 1 7 ) 1. 46g を得た
(収率 75. 0%) 。 融点： 149-150 °C
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) 6 ppm: 2. 14, 2. 17 (2s, 6H, 2Ac) , 2. 23-2. 49 (m, 2H, 3'一 Ha, b)， 4. 25- 4. 48 (m， 2H, 5' -Ha, b)， 4. 58—4. 68 (m, 1H, 4'— H) , 5. 52—5. 54 (m, 1H， 2'— H)， 6. 33 (d, 1H, J = 1. 4Hz, — H)， 7. 64 (s， 1H， 8— H) , 8. 63 (s, 1H, 2 - H) 合成例 2 0
7 -ョ一ド- 3' -デォキシ- 7- デァザアデノシン （化合物 1 8 ) の合成
6-クロ口 7- ョ一ド- 9- (3' - デォキシ- 2'，5' - ジ- 0- ァセチル- β - D- リ ボフラノシル） -7- デァザプリ ン （化合物 1 7 ： 1. 63g, 3. 40mmol ) とアンモニ ァ-メタノール （70ml) を 110 °Cで 20 時間反応させた。 反応終了後、 反応液を 減圧濃縮し、 メタノールで結晶化させ、 新規物質 7 -ョード -3' -デォキシ- 7- デ ァザアデノシン （化合物 1 8 ) l. OOg を得た （収率 78. 8% ) 。 融点： 223-225 °C (分解） 合成例 2 1
7-デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- '-へキシニル） -3' -デォキシァ デノシン （化合物 1 9 ) の合成
7 -ョード -3' -デォキシ- 7-デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 220mg, 0. 585mmol)
83 の DMF (3ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1 - へキシン （339mg, 1.75瞧 ol) 、 よう化銅 （ I ) (22.3mg, 0.117圍 ol) 、 テトラ キス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (67.5mg，0.058隱 ol) 及び トリェチルァミン （0.163ml, 1.17瞧 ol) を加え室温で 30 分間反応させた。 反応 液を塩化メチレン-メタノ一ル混液 （6ml) で希釈しィオン交換樹脂 AG1X8 (HC03— 型； 0.55g ) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシ リ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロロホルム- メタノ一ル混合溶 液） で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-へ キシニル） - 3' -デォキシアデノシン （化合物 1 9) 210mgを得た （収率 81.6% ) 。 1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.55-1.63 (m, 4H, — (CH2)2-) ， 1.83—1.92 (m， 1H， 3'— Ha)， 2.13-2.24 (m, 1H, 3， - Hb)， 2.47-2.52 (m, 2H, CC CH2— )， 3.16-3.24 (m, 2H， CH2N) ， 3.46-3.54 (m, 1H， 5'— Ha), 3.62-3.68 (m, 1H， 5'— Hb)， 4.23-4.38 (m, 2H， 2'— H and 4'— H)， 5.03 (t, 1H， J = 5.5Hz, 5' -OH) , 5.56 (d， 1H, J = 4.3Hz, 2' - 0H)， 6.01 (d, 1H, J = 2.2Hz, Γ— H) , 6.60 (brs, 2H， 6 - NH2) , 7.65 (s， 1H, 8— H)， 8.11 (s, 1H, 2 - H), 9.44 (brs, 1H， NHTfa) 合成例 2 2
7 -デァザ- 7- (6"- ァミノ- -へキシェル） -3 '-デォキシアデノシン - 5'-トリ ホスフニ一ト （化合物 20) の合成
7-デァザ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド -1' へキシュル） - 3' -デォキシ アデノシン （化合物 1 9 ： 181mg, 0.41画 ol) をリン酸トリェチル （1.81ml) に 溶解し、 一20°Cまで冷却した後ォキシ塩化リン （34.32 μ 1)を添加し一 20°Cで 撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩化リン （30.5 μ ΐ)を追加し、 さらに 4時間撹 拌した。
この反応液を、 一 20。Cに冷却したトリス （トリ- n - プチルアンモ-ゥム） ピロ
84 ホスフ:！一トを 0.5M含む DMF溶液 （4.9ral ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終了後、 トリェチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%ァ ンモニァ水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃 縮乾固して得た残渣を D E A E- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフ ィー （1.2 X 30cm;溶出液：炭酸水素トリェチルアンモェゥム緩衝液（pH7.5) 0M— 0.3M直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7- (6"- アミ ノ- 1" -へキシュル） -3'-デォキシアデノシン- 5' -トリホスフェート （化合物 2 0) 283mgを得た （収率 69.6% ) 。
合成例 23
R6G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成
7 -デァザ - 7- (6' ァミノ- 1" -へキシニル） -3'-デォキシアデノシン- 5'-ト リホスフエ一ト （化合物 20 ： 8 imol ) を溶解した DMF (0.6ml ) -水 （0.3tnl) の混合液に、 トリェチルァミン （ΙΟμΙ ) と 5_カルボキシローダミン 6 Gコハ ク酸イミ ドエステル （モレキュラープロ一ブ社製） （16μπιο1 ) の DMF (1.3ml) 溶液を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE- トヨパ一ルイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X30cm;溶出液： 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M →0.6M 直線濃度勾配（ 全 量 2L) ) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデ ノシン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C≡C一であって、 n = 4の化合物。 以下、 R6G- 3 ' d AT P (n 4) と略記する。 〕 5· 33 μ mol を得た （収率 66.7% ) 。
85
Figure imgf000089_0001
〔式中、 E tはェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す。 〕
また、 得られた R 6 G— 3 ' d AT P (n 4 ) を、 DU 6 4 0紫外可視分光 解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測 定した結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 7に示す = 合成例 24
7 -デァザ - 7— (8"—トリフルォロアセタミ ド- 1" -ォクチニル） -3'-デォキシ アデノシン （化合物 2 1 ) の合成
7 -ョード -3' -デォキシ -7-デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 220mg,0.585mmol) の DMF (3ml ) 溶液に窒素気流下、 合成例 1 1で得た 8-トリフルォロアセタミ ド- 1—ォクチン （388mg, 1.75mmol) 、 よう化銅 （ I ) (22.3mg， 0.117mmol ) 、 テトラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (67.5mg，0.058mmol) 及びトリェチルァミン （0.163ml, 1.17mmol) を加え室温で 30 分間反応させた。 反応液を塩化メチレン- メタノール混液 （6ml ) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03—型； 0.55g ) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残 渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノ一ル 混合溶液） で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7— (8"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-ォクチュル） -3' -デォキシアデノシン （化合物 2 1 ) 216mg を得た （収率 78.7% ) 。
86 IH-NMR (270MHz, DMSO— d6) 6 ppm: 1.29-1.58 (m, 8H，—（CH2)4— ), 1.83—1.91 (m, IH, 3'— Ha), 2.14-2.24 (m, IH, 3'— Hb)， 2.44-2.5 Km, 2H, CC CH2)， 3.15—3.22 (m， 2H, CH2N) , 3.46-3.54 (m, IH, 5' -Ha)， 3.62—3.70 (m, 1H， 5' - Hb) , 4.26-4.36 (m, 2H, 2' -H and 4' -H) , 5.04 (t, IH, J = 5.4Hz, 5'— OH)， 5.56 (d， IH, J = 4.6Hz, 2'— 0H)， 6.01 (d, IH, J = 2.4Hz, _H)， 6.60 (brs, 2H, 6—NH 2) , 7.65 (s, 1H， 8 - H)， 8.11 (s, IH, 2— H)， 9.38 (brs, 1H， NHTfa) 合成例 25
7 -デァザ- 7- (8' アミノ- ォクチニル） -3'-デォキシアデノシン - 5，-ト リホスフェート （化合物 22) の合成
7 -デァザ- 7- (8"- トリフルォロアセタミ ド- -ォクチニル） -3'-デォキシ アデノシン （化合物 2 1 ： 189mg, 0.403mmol ) をリン酸トリェチル （1.89ml) に溶解し、 一 20°Cまで冷却した後ォキシ塩化リン （33·7μ 1)を添加し一 20°Cで 撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩化リン （30.0/il)を追加し、 さらに 4時間撹 拌した。
この反応液を、 一 20°Cに冷却した 0.5M- トリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフェートの DMF 溶液 （4.8ml ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反 応終了後、 トリェチルァミン- 水混液 （15ml) を添加、 一夜静置後、 25%アン モニァ水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮 乾固して得た残渣を DE AE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ 一 (l.2X30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（ρΗ7· 5)0M→ 0.6M直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7- (8"- アミ ノ- 1"-ォクチ二ル） -3'-デォキシアデノシン - 5'-トリホスフェート （化合物 2 2) 143mg を得た （収率 35% ) 。
合成例 26
87 R6G標識 7-デァザ- 3' -デォキシアデノシン- 5'-トリホスフエ一ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C≡C一であって、 n = 6の化合物） の合成
7-デァザ- 7- (8"- ァミノ- -ォクチニル） -3'-デォキシアデノシン - 5'-ト リホスフエ一ト （化合物 22 ： 8 μπιοΐ ) を溶解した DMF (0.6ml ) -水 （0.3tnl) の混合液に、 トリェチルァミン （10 zl ) と 5-カルボキシ口一ダミン 6 Gコハ ク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （16μπιο1 ) の DMF (1.3ml) 溶液を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X30cm;溶出液： 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M →0.6M 直線濃度勾配（ 全 量 2L) ) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデ ノシン- 5'-トリホスフエ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが一C三 C—であって、 n = 6の化合物。 以下、 R6G- 3' d AT P (n 6) と略記する。 〕 4.3 μ mol を得た （収率 53.8% ) 。
Figure imgf000091_0001
〔式中、 E tはェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す。 〕 また、 得られた R6G- 3 ' d AT P (n 6) を、 DU 640紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定し た結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 8に示す。 合成例 27
_ 3'- デォキシ- 5- ョ一ドウリジン （化合物 2) の合成
88 3'-デォキシゥリジン （化合物 1 ： 2.08g,9. llmmol) を酢酸 （75ml) に溶解後、 硝酸二ア ンモニ ゥムセ リ ウム （ IV) ( 2.50g, 4.56画 ol ) 及びヨ ウ素 (1.39g, 2.73mmol) を添加し、 80°Cで 30 分間撹拌した。 反応終了後、 酢酸を減 圧濃縮し次いでエタノール- トルエン混液 （l:2v/v;30ml ) で 3回、 水- エタノ —ル混液 （l:2v/V;30ml ) で 3回共沸濃縮し油状物を得た。 得られた残渣をシリ 力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン- メタノール混合溶媒） で精製して、 3'- デォキシ -5- ョ一ドウリジン （化合物 2) 1.78g を得た （収率 55.08%) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) 6 ppm:l.89-1.92 (m, 1H， 3' -Ha) , 2.17-2.26 (m, 1H， 3' -Hb) , 3.51-3.56 (m, IH, 5' -Ha), 3.74-3.79 (m, IH, 5， _Hb)， 4.22-4.30 (m, 2H， 2' -H and 4' -H) , 5.59 (s， 1H， l'-H), 8.31 (s, IH, 6— H) , 11.72 (s, IH, NH) 合成例 28
3' -デォキシ- 5- トリフルォロアセタミ ド- -へキシニル） ゥリジン （化 合物 3) の合成
3' -デォキシ- 5-ョ一ドウリジン （化合物 2 ： 805mg， 2.27mmol) の DMF (12ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1- へキシン (1.31g, 6.80tnmol) 、 よう化銅 （ I ) (86.3mg, 0.453mmol) 、 テトラキス （ト リ フエニルホスフィン） パラジウム （0) (262mg, 0.227匪 ol ) 及びトリェチルァ ミン （0·63ιη1,4.53mmol ) を加え室温で 4時間反応させた。 反応液を減圧濃縮し て得た残渣を塩化メチレン- メタノール混液 （20ml) に溶解しイオン交換樹脂 AG1X8 (バイオラド社製， HC03—型； 2g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液 を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチ レン- メタノール混合溶液） で精製して、 新規物質 3'- デォキシ- 5- (6"- ト リフルォロアセタミ ド- i へキシニル） ゥリジン （化合物 3) 419mg を得た （収
89 率 45.5% ) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm:l.49-1.64 (m, 4H， -（CH2)2 -）， 1.92-1.97 (m， 1H， 3' - Ha), 2.17-2.28 (m, 1H, 3'- Hb), 2.39 (t, 2H, J=6.9Hz, — CCCH2)， 3.21 (q, 2H, J=6.3Hz, CH2N) , 3.49-3.54 (m， 1H, 5' -Ha) , 3.72-3.75 (m, 1H, 5'— Hb)， 4.24-4.35 (m, 2H, 2' -H and 4' H) , 5.20 (t, 1H, J=4.9Hz, 5' -OH), 5.52 (d, 1H, J=3.8Hz, 2' -OH), 5.75 (s, 1H， J = 2.2Hz, l'-H), 8.23 (s, 1H, 6-H), 9.42 (brs, 1H， NHTf a) , 11.57 (s, 1H, 3- NH) 合成例 2 9
5 - (6_"- ァミノ- 1"-へキシュル） -3' -デォキシゥリジン- 5' -トリホスフェート (化合物 4) の合成
3'-デォキシ- 5- (6"- トリフルォロアセタミ ド- 1' へキシニル） ゥリジン （化 合物 3 ： 122.5mg,0.3mmol ) をリン酸トリェチル （1.23ml) に溶解し、 一 20°Cま で冷却した後ォキシ塩化リン （25μ 1 ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過 後、 ォキシ塩化リ ン （22/ l ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 — 20。Cに冷却したトリス（トリ- n-ブチルアンモニゥム）ピロホスフエ一トを 0.5M 含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 4時間撹拌した。 反応終了後、 トリ ェチルァミン- 水混液 （5ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア水 （20ml) を加え 4時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固して得た残渣を DEAE- トヨパ一ルイオン交換カラムクロマトグラフィー（東ソ一社製； 1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素ト リエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 新規物質 5- (6"- ァミノ- '-へキシニル） - 3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート （化合物 4 ) 172mg を得た （収率 60.0% ) 。 合成例 30
90 TMR-標識 3' -デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て Vが— C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成
5- (6"- アミノ- 1' へキシュル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート (化合物 4 ： 8 / mol ) を溶解した DMF (300 μ 1 ) - 水 （300 μ 1 ) 混合液 にトリエチルァミン （ΙΟμΙ ) と 5_カルボキシテトラメチルローダミンコハク 酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （13/imol ) を加え室温で一夜 撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン 交換カラムクロマトグラフィー （1.7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアン モニゥム緩衝液（pH7.5)0.05M→0.7M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 下 記式で示される TMR- 標識 3'- デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト 〔一 般式〔 I〕 に於いて Vが— C三 C—であって、 n = 4の化合物。以下、 TMR- 3 ' d UT P (n 4) と略記する。 〕 5.9 / mol を得た （収率 73.8% ) 。
0-
Figure imgf000094_0001
〔式中、 Meはメチル基を示す。 〕 また、 得られた TMR- 3 ' dUTP (n 4) を、 DU 640紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定し た結果 （測定波長： 700nm 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 1 9に示す。 合成例 3 1
6-メ トキシ- 2-メチルチオ - 9- {2'，5'-ビス （0 - tert-ブ：
91 - 3，-0- C (イミダゾ一ル- 1- ィル） チォカルボニル] - - D- リボフラノシル} -7- デァザプリン （化合物 2 5) の合成
6 -メ トキシ -2-メチルチオ- 9- ()3-D- リボフラノシル） -7 -デァザプリン （化 合物 2 3 ： 12.86g, 39.28mmol ) を THF ( 580ml ) に溶解後、 ピ リ ジン
(16.8ml,208mmol) 、 硝酸銀 （15.55g, 91.5隱 ol ) 及び tert- ブチルジメチル シリルクロライ ド （13.80g,91.5mmol ) を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終 了後、 沈澱物をセライ トを通して濾別し、 濾液を濃縮、 クロ口ホルムに溶解後、 0.2N塩酸及び飽和食塩水にて洗浄した。 クロ口ホルム層を無水硫酸マグネシゥ ムにて乾燥後、 クロ口ホルムを留去し、粗 6-メ トキシ- 2-メチルチオ - 9- [2' ,5' - ビス （0 - tert- ブチルジメチルシリル） - リボフラノシル] - 7- デァザプ リン （化合物 24) 24. Ogを得た。 得られた化合物 24 (24. Og ) を DMF (400ml ) に溶解後、 1， -チォカルボニルジイミダゾ一ル （35. Og, 196.5mmol ) を添加し、 室温でー晚撹拌した。 反応終了後、 酢酸ェチル及び水を加えたのち、 有機層を飽 和食塩水にて洗浄した。 酢酸ェチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 减圧濃 縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；酢酸ェチル ― クロ口ホルム混合溶媒） で精製して、 新規物質 6-メ トキシ- 2- メチルチオ- 9 - '， 5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） - 3'- 0- [ (イミダゾール -1- ィ ル） チォカルボニル] - /3- D- リボフラノシル} -7-デァザプリン （化合物 2 5) 20.45gを得た （収率 78.2% ) 。
合成例 3 2
6 -メ トキシ- 2 - メチルチオ- 9- [2',5'-ビス （0 - tert-ブチルジメチルシリル）
- 3'-デォキシ- jg- D- リボフラノシル] -7- デァザプリン （化合物 26) の合成
6-メ トキシ- 2-メチルチオ - 9- {2'，5'-ビス （0 - tert-ブチルジメチルシリル）
- 3'- 0- [ (イミダゾ一ル -1- ィル） チォカルボニル] - /3- D- リボフラノシル}
92 -7-デァザプリン （化合物 2 5 ： 20.45g, 30.7mmol ) をトルエン （1L) に溶解後、 2,2' - ァゾビス （イソプチロニトリル） （1.01g，6.1瞧 ol ) 及び水素化- n-トリ ブチル すず （16.5ml，61.4mmol ) を添加し、 窒素気流下、 80°Cで 30 分間撹拌 した。 反応終了後、 トルエンを留去し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶 出液；酢酸ェチル -n-へキサン混合溶媒）で精製して、新規物質 6 -メ トキシ- 2 -メ チルチオ- 9- [2',5'-ビス （0- tert- ブチルジメチ /レシリル） -3'-デォキシ- β - D - リボフラノシル] -7-デァザプリン（化合物 26 ) 14.57 を得た（収率 87.9% )。 合成例 3 3
7-ョ一ド- 6- メ トキシ -2- メチルチオ- 9- [2'，5'-ビス （0- tert- ブチルジメ チルシリル） -3'-デォキシ- j¾- D- リボフラノシル] -7- デァザプリン （化合物 2 7) の合成
6-メ トキシ- 2- メチルチオ- 9- [2'， 5' -ビス （0 - tert-ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ- ]3 - D- リボフラノシル] -7- デァザプリン （化合物 2 6 ： 15.57 g, 28.84闘 ol ) を DMF に溶解し、 N-ョ一 ドこはく酸イ ミ ド （7.79g, 34.61mmol) を加え、 窒素気流下遮光し、 室温で 5時間撹拌した。 反応終了後、 反応液を 0 SCに冷却し酢酸ェチルおよび水を加えたのち有機層を 5 %チォ硫酸ナ トリウム溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液、 飽和食塩水で洗浄した。 酢酸ェチ ル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 酢酸ェチルを留去し、 シリカゲルカラム クロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム - n- へキサン混合溶媒） で精製して、 新規物質 7-ョード -6- メ トキシ -2- メチルチオ- 9- [2',5'-ビス （0-tert- ブ チルジメチルシリル） -3'-デォキシ- β-D - リボフラノシル] -7- デァザプリン
(化合物 2 7) 19.06gを得た （収率 99· 3% ) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) 6 ppm: -0.10, -0.06， 0.12, 0.13 (4s, 12H, 4MeSi),
0.80， 0.93 (2s, 18H, 2t - Bu), 1.90-2.10 (m, 1H, 3'— Ha)， 2.18—2.28 (m, 1H,
93 3'- Hb), 2.54 (s, 3H， SMe) , 3.72 (dd， 1H, J = 2.7, 11.6Hz, 5'— Ha), 3.94 (dd, 1H, J = 2.2, 11.6Hz, 5'— Hb) , 4.03 (s, 3H, OMe) , 4.32-4.48 (m, 2H, 2' -H, 4'— H)， 6.07 (d, 1H， J = 3.0Hz, l'-H), 7.59 (s, 1H, 8 - H) 合成例 3 4
7 -ョ一ド- 2- メチルチオ- 9- [2' ,5'-ビス （0_tert - ブチルジメチルシリル） -3' -デォキシ- β -D- リボフラノシル， -7-デァザプリン- 6-オン （化合物 2 8 ) の合成
4 -チォクレゾ- ル （3.36g， 27. Ommol) をメタノールに溶解後、 ナトリウムメ ト キシド （1.61g, 29.7画 ol) を添加し、 5分間撹拌後メタノールを留去した。 これ に、 トルエン （150ml ) に溶解した 7-ョ一ド -6- メ トキシ- 2- メチルチオ - 9 -
[2',5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ- 3 - D- リボフラ ノシル] -7- デァザプリン （化合物 2 7 ： 4.00g,6mmol ) 及びへキサメチルホス ホルアミ ド （10ml， 57. lmitiol ) を添加し、 窒素気流下、 4.5 時間還流した。 反応 終了後、 酢酸ェチルと水を加え、 有機層を飽和食塩水で洗浄した。 有機層を無水 硫酸マグネシゥムで乾燥後减圧濃縮し、 得られた残渣をシリカゲル力ラムクロマ トグラフィ （溶出液：塩化メチレン- メタノール混合溶媒） で精製して、 新規物 質 7-ョ一ド -2- メチルチオ- 9- [2'，5'-ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） -3' -デォキシ- β -D- リボフラノシル] -7 -デァザプリン -6-オン （化合物 2 8 ) 2.35g を得た （収率 59.9% ) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0 - d6) δ ppm: 0.06, 0.08, 0.20, 0.24 (4s, 12H, 4 eSi),0.92, 1.03 (2s, 18H, 2t-Bu) , 2.07—2.13 (m, 1H， 3' - Ha)， 2.34-2.38 (m, 1H, 3' -Hb), 2.63 (s， 3H, SMe), 3.81-4.05 (m， 2H, 5' -Ha, b) , 4.46—4.57 (m, 2H, 2' -H, 4' -H) , 6.12 (d, 1H, J = 3.0Hz, Γ - H) ' 7.47 (s, 1H， 8 - H) , 12.44 (s， 1H, 1-H)
94 合成例 3 5
7 -ョ一ド一2'， 5' -ビス （0- tert- _ -3'-デォキシ-7-_デ
(化合物 29 ) の合成
7 -ョード -2 - メチルチオ- 9- [2' ,5'-ビス （0- tert- - 3' -デォキシ- β-D -リボフラノシル] -7-デァザプリン -6-オン （化合物 2 8 ： 2.30g, 3.53mmol) を塩化メチレン （90ml) に溶解し、 0°Cに冷却後、 m-クロ口過 安息香酸 （0.96g, 3.88mmol) を添加し 0 °Cで 15 分間撹拌、 さらに室温で 1時間 撹拌した。 反応終了後、 反応液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び飽和食塩水で 洗浄し、 無水硫酸マグネシゥムで乾燥後塩化メチレンを留去した。 得られた残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム- メタノール混合 溶媒） で精製しスルホキシド体 2.02g (収率 83.9% ) を得た。 これを 1,4 -ジォ キサン （20ml) に溶角？し、 一 78°Cに冷却後、液体アンモニア （60ml) を加え、 110 °C で 6時間加熱した。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 得られた残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン- メタノール混合溶媒） で精 製して、 新規物質 7-ョ一ド- 2'，5'- ビス （Ο-tert-プチルジメチルシリル） - 3' - デォキシ- 7 - デァザグアノシン （化合物 2 9) 1.60g を得た （収率 73.1% ) 。 合成例 3 6
3' - デォキシ -7- ョ一ド- 7- デァザグアノシン （化合物 3 0) の合成
7-ョ一ド- 2'，5' - ビス （0- tert- ブチルジメチルシリル） -3'-デォキシ- 7- デ ァザグアノシン （化合物 2 9 ： 1.6g，2.58隱 ol ) を THF (50ml) に溶解し、 1M- テトラプチルアンモニゥムフルオライ ド （6.2ml,6.17mra0l) を添加し、 室温で一 晚撹拌した。 反応終了後、 反応液を減圧濃縮し、 シリカゲルカラムクロマトダラ フィ （溶出液； クロロホルム- メタノール混合溶媒） で精製後、 メタノ一ルで結 晶化させ、 新規物質 3'- デォキシ- 7- ョード- 7- デァザグアノシン （化合物 3
95 0) 0.80g を得た （収率 79.1% ) 。 融点： 176-178 °C (分解）
IH-NMR (270MHz, DMSO- d6) δ ppm: 1.81-1.89 (m， IH, 3' -Ha), 2.10-2.20 (m, IH, 3'- Hb), 3.43-3.64 (m， 2H, 5' - Ha, b)， 4.18-4.29 (m, 2H， 2' - H， 4'- H)，4.91 (t, IH, J = 5.5Hz， 5' -OH)， 5.46 (d, 1H， J = 4.3Hz, 2' -OH)， 5.80 (d, IH, J = 2.4Hz, l'-H), 6.30 (brs, 2H， 2— NH2) , 7.10 (s， IH, 8— H) , 10.45 (brs, IH, 1-H) 合成例 3 7
3'- デォキシ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド- Γ へキシェル） - 7- デァザ グアノシン （化合物 3 1) の合成
3'- デォキシ- 7- ョ一ド- 7- デァザグアノシン （化合物 30 ： 765mg,2. Ommol) の DMF (10ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1 -へキシン （1.16g,6.0mmol ) 、 よう化銅 （ I ) (76.4mg， 0.40瞧 ol) 、 テト ラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (226mg, 0.20mmol) 及び ト リェチルァミン （0.56ml,4. Orrnnol) を加え室温で 1時間反応させた。 反応液を 塩化メチレン- メタノール混液 （20ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03" 型； 2.0g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリ 力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロロホルム- メタノール混合溶液） で精製して、 新規物質 3'- デォキシ -7- (6"- ト リ フルォロアセタミ ド - ' -へ キシュル） -7-デァザグアノシン （化合物 3 1) 616mgを得た （収率 69.5% ) 。 mp 185-187
IH-NMR (270MHz, DMS0 - d6) δ ppm: 1· 47— 1.68 (m， 4H, — (CH2)2— )， 1· 80— 1.88 (m,
1H， 3' -Ha) , 2.09-2.19 (m, IH, 3' - Hb) , 2.38 (t, 2H, J=6.9Hz, CCCH2) , 3.25 (q,
2H， J=6.8Hz， CH2N) , 3.42—3· 62 (m， 2H, 5' -Ha, b) , 4.17-4.30 (m, 2H, 2' _H, 4' -H) ,
4.90 (t, IH, 5.5Hz， 5' -OH) , 5.45 (d， IH, J = 4.3Hz， 2' - OH) ' 5.80 (d, IH,
96 J = 2.7Hz, 1' -H), 6.28 (brs， 2H, 2— N ) , 7.11 (s, 1H，8—H)， 9.42 (brs, 1H, NHTfa) , 10.39 (s, 1H, 1— H) 合成例 38
7-デァザ- 7- (6" - ァミノ- へキシェル） -3'-デォキシグアノシン- 5'-トリ ホスフェート （化合物 32) の合成
3'- デォキシ- 7- (6"- トリフルォロアセタミ ド - 1'しへキシェル） -7- デァザ グアノシン （化合物 3 1 ： 133mg, 0.3mmol ) をリン酸トリェチル （1.33ml) に溶 解し、 —20°Cまで冷却した後ォキシ塩化リン （25μ 1)を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩化リン （22μ1)を追加し、 さらに一晩撹拌した。 この反 応液を、 一 20°Cに冷却したトリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ —トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液（4ml) を添加、 反応液をエーテルにて洗浄後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.7 X30cm;溶出 液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M→0.6M直線濃度勾配（全 量 2L) ) で精製した。 これに 25%アンモニア水 （20ml) を加え 1時間静置し、 減圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィ一 （1.7 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモユウム緩衝液 (pH7.5)0M ~→0.3M直線濃度勾配（全量 1L) ) で精製して、 新規物質 7-デァザ- 7-
(6"-ァミノ- '-へキシニル） -3'-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフェート （化 合物 32 ) 108mg を得た （収率 36.4% ) 。 合成例 3 9
R 1 1 0標識 7-デァザ- 3'-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフェート （一般 式 〔 I〕 に於いて Vがー C三 C一であって、 n = 4の化合物） の合成
7 -デァザ - 7- (6"- ァミノ- Γ-へキシニル） -3' -デォキシグァノシン- 5' -トリ
97 ホスフェート （化合物 32 ： 8 μ mol ) と 5-カルボキシ口一ダミン 110-ビス - トリフルォロアセテート コハク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社 製） （ / mol ) を DMF (500 μ ΐ ) - 水 （250 μ 1 ) に溶角？し、 トリェチル ァミン（0.16ml)及びピリジン（0.29ml)を加え、一夜撹拌した。反応液に水（30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー (1.7 X30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5 ) 0.1M →0.8M 直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 下記式で示される R l 1 0標識 7 -デァザ- 3'-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C≡C一であって、 n = 4の化合物。 以下、 R l 1 0- 3 ' d GT P (n 4) と略記する。 〕 3.38/imol を得た （収率 42.3% ) 0
Figure imgf000101_0001
また、 得られた R 1 1 0- 3 ' d GT Ρ (n 4) を、 DU640紫外可視分 光 解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定 した結果 （測定波長： 700mii 〜200nm 、 対照：蒸留水） を図 20に示す。 合成例 40
N- プロパルギルトリフルォロアセタミ ドの合成
0°Cに冷却したトリフルォロ酢酸メチル （東京化成製； 69.2g,0.54mol ) にプ 口パルギルアミン （アルト"リッチ社製； 25g，0.45mol ) を滴下した。 0°Cで 2時間反 応後、 減圧蒸留 （23固 Hg; 沸点 77°C) により精製して、 N- プロパルギルトリ
98 フルォロアセタミ ド 43.8g (86.0% ) を得た。 合成例 4 1
3 デォキシ- 5- (3' トリフルォロアセタミ ド- 1' プロピニル） ゥリジンの 合成
3' -デォキシ- 5-ョ一ドウリジン （化合物 2 ： L 56g, 4.4國 ol ) の DMF (22ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 40で得た N- プロパルギルトリフルォロアセタミ ド
(1.54ml, 13.2mmol ) 、 よう化銅 （ I ) (168mg， 0.88匪 ol) 、 テトラキス （トリ フエニルホスフィン） パラジウム （0) (508mg，0.44瞧 ol) 及びトリェチルアミ ン （1.23ml，8.8mmol) を加え室温で 4時間反応させた。 反応液を減圧濃縮して得 た残渣を塩化メチレン- メタノール混液 （40ml) に溶解しイオン交換樹脂 AG1X8
(バイオラ ド社製， HC( 型； ½) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃 縮し得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン - メタノール混合溶液） で精製して、 3'- デォキシ -5- (3" -トリフルォロアセ タミ ド- 1"-プロピニル） ゥリジン 918mg を得た （55.3% ) 。
1H-陋 R (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.89-1.92 (m, 1H, 3' - Ha)， 2.17-2.26 (m， 1H, 3'-Hb)， 3.53, 3.76 (2dd, 2H, J = 3.1, 11.9; 2.7, 12.1Hz, δ' -Ha, b) , 4.22-4.30 (m, 4H， 2'— H， 4'-H, — CH2— ) , 5.20 (brs, 1H, 5， - OH)， 5.52 (d, 1H, J = 4.0Hz, 2' -OH) , 5.75 (d, 1H， J = 1.9Hz， Γ - H) , 8.34 (s， 1H， 6 - H), 10.06 (t, 1H, J=5.4Hz, NHTfa) , 11.67 (s， 1H, NH) 合成例 42
5- (3" - アミノ- プロピニル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート の合成
3' - デォキシ- 5- (3"- ト リフルォロアセタミ ド- '-プロビュル） ゥリジン
(42呵,0. llmmol ) をリン酸トリヱチル （1.13ml) に溶解し、 -20 CCまで冷却し
99 た後ォキシ塩化リン （25 /zl ) を添加し- 20 °Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキ シ塩化リン （22μ1 ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 - 20 °C に冷却した合成例 4で得たトリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ ートを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜諍置後、 25% アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィー （東ソ 一社製； 1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素卜リエチルアンモ -ゥム緩衝液 (pH7.5)0M →0.3M直線濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 5- (3"- アミノ- -プロピニル） -3' -デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート 115mg を得た （収率 41.3% ) 。 合成例 43
TMR- 標識 3'- デォキシゥリジン- 5 トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に 於いて Vが一 C三 C—であって、 n= lの化合物） の合成
5- (3"- ァミノ- 1 プロピニル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート (10. δμπιοΐ ) の 1M- 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 （pH9.05;1.2ml) に 5 -カルボキシテ トラメチノレローダミンコハク酸ィ ミ ドエステル （モレキユラ —プローブ社製） （ mg) の DMF 溶液 （0.9ml ) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩 衝液（pH7.5)0.05M→0.7M 直線濃度勾配（ 全量 2L) ) で精製して、 TMR- 標識 3' -デォキシゥリジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於ける n= lの化 合物。
以下、 TMR- 3 ' d UT P (n 1 ) と略記する。〕 7.38 molを得た（収率 70.2% )。 合成例 44
100 3' デォキシ- 5- (3"- トリフルォロアセタミ ド- '-プロピニル） シチジンの 合成
3' -デォキシ -5-ョードシチジン （化合物 6 1.0g 2.83 ol ) の DMF (14ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 2で得た N- プロパルギルトリフルォロアセタミ ド
(0.99ml, 8.50mmol ) 、 よう化銅 （ I ) (108mg 0.566mmol ) 、 テトラキス （ト リフエニルホスフィン） パラジウム （0) (327mg 0.283 ol ) 及びトリェチル ァミン （0· 8ml 5.66mmol) を加え室温で 30 分反応させた。 反応液を塩化メチレ ン- メタノール混液 （25ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03—型； 2.6g) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン -メタノール混合溶液） で精製して、 3'-デォキシ -5- (3"- トリフルォロアセタミ ド -1"-プロピニル） シチジン 879mg を得た （収率 82.5% )
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.64-1.71 (m 1H, 3' - Ha) 1.86-1.96 (m, 1H, 3' - Hb) 3.52-3.57 (m 1H δ' -Ha) , 3.79-3.83 (m, 1H, 5' - Hb) , 4.14-4.28 (m 4H 2 H 4' -H, — CH2 -）， 5.18 (t, 1H J = 5.0Hz, 5' -OH), 5.53 (d 1H, J = 3.8Hz 2' -OH), 5.63 (s, 1H, l'-H), 6.76 (brs, 1H NH2a) 7.74 (brs, 1H NH2b) , 8.38 (s, 1H, 6 - H), 9.93 (brs, 1H NHTfa) 合成例 45
5- (3"- ァミノ- '-プロピニル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ- ト の合成
3'- デォキシ- 5- (3"- トリフルォロアセタミ ド- '-プロピニル） シチジン
(I13mg, 0.3mmol ) をリン酸トリェチル （1.13ml) に溶角 し、 -20 °Cまで冷却し た後ォキシ塩化リン （25μ1 ) を添加し- 20 °Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキ シ塩化リン （22μ1 ) を追加し、 さらに 5時間撹拌した。 この反応液を、 - 20 °C
101 に冷却した合成例 4で得たトリス （トリ- n- プチルァンモニゥム） ピロホスフエ —トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 2時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜静置後、 25%アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DE AE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー（1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M→0.3M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 5- (3"- ァミノ- 1"-プロピニル） -3'-デォ キシシチジン- 5'-トリホスフェート 115mg を得た （収率 41.3% ) 。
合成例 46
XR-標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフエ-ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C≡C—であって、 n= lの化合物） の合成
5 - (3"- ァミノ- 1"-プロピニル） -3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート (8 μιποΐ ) を溶解した 1M- 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 （ρΗ9.05; 0.4ml ) に、 5-カルボキシ- X- ローダミンコハク酸イミ ドエステル （モレキュ ラーブローブ社製） （ mg) の DMF溶液 （0.9ml ) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパ一ルイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素ト リェチルアンモニゥム緩 衝液（pH7.5)0.1M→0·7Μ直線濃度勾配 （全量 2L) ) で精製して、 X R-標識 3' - デォキシシチジン 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C≡C— であって、 n= lの化合物。 以下、 XR- 3 ' d CTP (n 1 ) と略記する。 〕 2.93μηιο1 を得た （収率 36.6% ) 。
合成例 47
7-デァザ- 7- (3"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-プロピニル） -3'-デォキシァ
102 7-ョード -3' -デォキシ- 7- デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 0.5g, 1.33mmol) の DMF (6.7ml ) 溶液に窒素気流下、 合成例 40で得た N- プロパルギルトリ フルォロアセタミ ド （0.47ml， 3· 99隨。1 ) 、 よう化銅 （ I ) (51mg, 0.266mmol) 、 テトラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (154mg, 0.133刚 ol ) 及びトリェチルァミン （0.37ml, 2.66mmol ) を加え室温で 30 分反応させた。 反 応液を塩化メチレン- メタノール混液 （12ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC03—型； 1.22g ) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた 残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン- メタノ一ル 混合溶液） で精製して、 7-デァザ- 7- (3"-トリフルォロアセタミ ド- 1"-プロピニ ル） - 3'-デォキシアデノシン 436ing を得た （収率 82.3% ) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) 6 ppm: 1.83-1.91 (m, 1H， 3' - Ha)， 2.14-2.24 (m, 1H， 3' - Hb), 3.48-3.56 (m, 1H, 5' -Ha) , 3.66—3.73 (m, 1H, 5'-Hb), 4.30-4.35 (m, 4H， 2，- H, 4' -H, — CH2— )， 5.08 (t, 1H， J = 5.5Hz, 5' - OH) , 5.59 (d, 1H, J = 3.8Hz, 2' - OH), 6.02 (d, 1H， J = 2.2Hz, - H) , 6.80 (brs, 2H， NH2)， 7.79 (s, 1H, 8— H)， 8.12 (s， 1H, 2-H), 10.08 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 48
7 -デァザ- 7- (3' ァミノ- Γ'-プロピニル） -3' -デォキシアデノシン- 5' -トリホ スフ^ 卜の合成
7-デァザ- 7- (3"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-プロビュル） -3'-デォキシアデ ノシン （120mg,0.3画 ol ) をリン酸トリェチル （1.2ml ) に溶解し、 -20 =Cまで 冷却した後ォキシ塩化リン （25// 1)を添加し- 20 °Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩化リン （22/il)を追加し、 さらに 4時間撹拌した。 この反応液を、 - 20 °C に冷却した合成例 4で得たトリス （トリ- n- ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ
—トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 3 時間撹拌した。 反応終
103 了後、 トリェチルァミン- 水混液 （4ml ) を添加、 一夜静置後、 25% アンモニア 水 （20ml) を加え 4 時間静置した。 反応液をエーテルにて洗浄後、 濃縮乾固し て得た残渣を DE AE- トヨバールイオン交換カラムクロマトグラフィー（1.2 X 30cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M →0.3M 直線 濃度勾配（ 全量 1L) ) で精製して、 7 -デァザ -7- (3"- ァミノ- '-プロピニル） -3'-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフェート 114mg を得た （収率 39.9% ) 。 合成例 49
R6G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフエ一ト （一般式 〔 I〕 に於いて Vが— C≡ C一であって、 n= lの化合物） の合成
7-デァザ - 7— （3" - ァミノ- 1' プロピエル） -3' -デォキシアデノシン- 5' -トリ ホスフヱ一ト （8 μ mol ) を溶解した 1M- 炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩 衝液 （pH9.05;0.4ml) に、 5-カルボキシ口一ダミン 6G コハク酸イミ ドエステル (モレキュラープローブ社製） （14.5mg) の DMF 溶液 （0.8ml ) を加え室温で 一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイ オン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素トリェチル アンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M→0.6M直線濃度勾配（全量 2 ) で精製して、 R6G標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5'-トリホスフ-—ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが一 C三 C—であって、 n= lの化合物。 以下、 R6G— 3' d AT P (n 1 ) と略記する。 〕 2.54// mol を得た （収率 31.7% ) 。 合成例 50
3'ーデォキシ- 7-(3"- トリフルォロアセタミ ド- '-プロピニル） -7- デァザグ 、成
3'—デォキシ- 7- ョード -7- デァザグアノシン （化合物 30 ： 0.65g, 1.7mmol) の DMF (8.5ml ) 溶液に窒素気流下、 合成例 40で得た N- プロパルギルトリ
104 フルォロアセタミ ド （0.58ml, 5.0瞧。1) 、 よう化銅 （ I ) (63mg, 0.33mmol ) 、 テトラキス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (192mg,0.17mmol) 及 びトリエチルァミン （0.46ml，3.31mmol ) を加え室温で 1 時間反応させた。 反 応液を塩化メチレン- メタノール混液 （16ml) で希釈しイオン交換樹脂 AG1X8 (HC( 型； 1.6g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣 をシリカゲル力ラムクロマトグラフィ （溶出液； クロ口ホルム-メタノール混合 溶液） で精製して、 3'- デォキシ- 7- (3"- トリフルォロアセタミ ド- 1"-プロピ ニル） - 7- デァザグアノシン 485mg を得た （収率 70.5% ) 。
1H-NMR (270MHz, DMSO— d6) δ ppm: 1.81— 1.91 (m， 1H， 3' -Ha) , 2.10-2.21 (m, 1H, 3' - Hb)， 3.42-3.68 (m, 2H， 5'— Ha，b)， 4.22-4.30 (m, 4H， 2'— H， 4, - H, — CH2— )， 4.94 (t, 1H, J = δ.5Hz, 5'— 0H)， 5.49 (d， 1H， J = 4.3Hz, 2' - OH) , 5.81 (d, 1H， J = 2.4Hz, 1 '- H)， 6.32 (brs, 2H, 2-NH2) , 7.27 (s, 1H, 8— H)， 10.05 (brs, 1H, NHTfa) , 10.50 (brs, 1H， 1— H) 合成例 5 1
7-デァザ - 7- ァミノ- -プ口ピニル） -3' -デォキシグアノシン- 5' -トリ ホスフエ一 トの合成
3' - デォキシ -7- (3"- トリフルォロアセタミ ド- '-プロピニル） -7- デァザ グアノシン （125mg，0.3mmol ) をリン酸トリェチル （1.25ml) に溶解し、 -20 °C まで冷却した後ォキシ塩化リ ン （25 μ 1)を添加し- 20 °Cで撹拌した。 30 分経過 後、ォキシ塩化リン（22μ 1)を追加し、 さらに一晩撹拌した。 この反応液を、- 20°C に冷却した合成例 4で得たトリス （トリ- n- ブチルアンモ-ゥム） ピロホスフエ
—トを 0.5M含む DMF 溶液 （3.6ml ) に添加し、 室温で 3 時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン- 水混液（4ml) を添加、 反応液をエーテルにて洗浄後、
DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.2 X30cm ;溶出
105 液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0M→0.6M 直線濃度勾配（全 量 2L) ) で精製した。 これに 25% アンモニア水 （15ml) を加え 1 時間静置し、 減圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E- トヨバールイオン交換カラムクロマ トグラフィ一 （1.2 X30cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 (pH7. δ)0Μ→0.3Μ直線濃度勾配（全量 1L) ) で精製して、 7-デァザ- 7- (3"-ァ ミノ- 1' プロビュル） -3'-デォキシグアノシン - 5'-トリホスフェート 75mg を得 た （収率 25.9% ) 0 合成例 52
R 1 1 0標識 7-デァザ- 3' -デォキシグァノシン- 5' -トリホスフエ一ト （一般 式 〔 I〕 に於いて Vが— C≡C—であって、 n = lの化合物） の合成 7 -デァザ - 7— (3" - アミノ- 1' プロビニル） -3'-デォキシグアノシン- 5'-トリホ スフェート （10.5/_imol ) と 5-カルボキシローダミン U0-ビス- トリフルォ ロアセテ一ト コハク酸イ ミ ドエステル （モレキュラープロ一ブ社製） （31.5mg) を DMF (0.49ml) - 水 （0.23ml) に溶解し、 トリヱチルァミン （0.16ml) 及び ピリジン （0.29ml) を加え、 一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した 後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマ トグラフィー （1.2 X30cm； 溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液 （PH7.5 ) 0.1M→0.8M 直線濃 度勾配（ 全量 1し） ) で精製して、 R l 1 0標識 7 -デァザ- 3' -デォキシグアノシ ン -5' -トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vがー C三 C—であって、 n = 1の化合物。 以下、 R 1 10-3 ' d GT P (n 1 ) と略記する。 〕 3.67μιηο1を 得た （収率 34.9% ) 。 合成例 53
R 1 1 0標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於 いて、 V が一 C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成。
106 5- (6"-ァミノ- 1"-へキシェル） -3，-デォキシシチジン- 5' -トリホスフエ一ト (化合物 8 : 8μπιο1) を溶解した DMF (400 μ 1) -水 （200μ1) 混合液にトリ ェチルァミン （20 μΐ) と 5-カルボキシ口一ダミン 110 -ビス-トリフルォロア セテート コハク酸イ ミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （21μπιο1) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE- トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ一 （1.7X15cm；溶出液：炭酸水 素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M→0.8M 直線濃度勾配 （全量 1し）） で精製して、 下記式で示される R l 1 0標識 - 3'-デォキシシチジン - 5'-トリホス フェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V が— Cョ C—であって、 n = 4の化合物- 以下、 R 1 1 0- 3 ' d CTP (n 4 ) と略記する。 〕 5.83//mol を得た （収率 72.9%)
Figure imgf000110_0001
また、 得られた R 1 1 0- 3 ' d CTP (n 4) を、 DU640紫外可視分 光解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測 定した結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 21に示す。 合成例 54
R 6 G標識 3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於い て、 V が— C≡C—であって、 n = 4の化合物） の合成。
5 - （6' ァミノ- 1"-へキシニル） -3，_デォキシシチジン- 5' -トリホスフェート
107 (化合物 8 : 8//mol) を溶解した DMF (2.9ml) -水 （0.9ml) 混合液にトリェ チルァミン （20μ1) 、 6-カルボキシローダミン 6Gコハク酸イミ ドエステル （モ レキュラープローブ社製） （16/ mol) とを加え室温で一夜撹拌した。 反応液に 水 （30ml) を加え希釈した後、 DEAE-トヨパ一ルイオン交換カラムクロマト グラフィー （1.7X 15cm；溶出液： 炭酸水素トリヱチルアンモニゥム緩衝液 (pH7.5)0.1M— 0.7M 直線濃度勾配 （全量 1L)) で精製して、 下記式で示される R 6 G標識- 3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 において n =4の化合物。 以下、 R 6G- 3 ' d CTP (n 4) と略記する。 〕 5.83 mol を得た （収率 43.1%) 。
Figure imgf000111_0001
〔式中、 E tはェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す。 〕 また、 得られた R6G- 3 ' d CTP (n 4) を、 DU 640紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定し た結果 （測定波長： 700nm〜200nm、 対称：蒸留水） を図 22に示す。 合成例 55
X R標識 7-デァザ- 3'-デォキシアデノシン- 5' -トリホスフェート（一般式〔 I〕 に於いて、 V が一 C≡C一であって、 n = 4の化合物） の合成。
7-デァザ - 7- (6' ァミノ -1" -へキシニル） - 3， -デォキシアデノシン- 5'-トリホ
108 スフエ一ト （化合物 20： 8μπιο1) を溶解した DMF (400 μ 1) -水 （400// 1) の 混合液に、 トリェチルァミン （20 と 6-カルボキシ- X-ローダミンコハク酸 イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （22 mol) を加え室温で一夜撹 拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE-トヨパ一ルイオン交 換カラムクロマトグラフィ一 （1.7X15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモ ニゥム緩衝液（pH7.5)0.1M—0.6M直線濃度勾配 (全量 1L)) で精製して、 下記式で 示される XR標識 7-デァザ- 3，-デォキシアデノシン- 5 '-トリホスフエ一ト 〔一般 式〔 I〕 に於いて、 V がー C≡C一であって、 n = 4の化合物。 以下、 XR- 3 ' d AT P (n 4) と略記する。 〕 4.39/imolを得た （収率 54.8%) c
Figure imgf000112_0001
また、 得られた XR- 3 ' d AT P (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700nti！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 23に示す。 合成例 56
XR標識 7-デァザ- 3'-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフェート（一般式〔 I〕 に於いて、 V がー C三 C一であって、 η = 4の化合物） の合成。
109 7 -デァザ - 7- (6"-アミノ- '-へキシュル） _3， -デォキシグアノシン - 5' -トリホ スフェート （化合物 3 2 ： 8μπιο1) と 5-カルボキシ -X-ローダミンコハク酸ィ ミ ドエステル（モレキュラープローブ社製） （19μπιο1) を DMF (400 / 1) -水 （200 μ 1) に溶解し、 トリェチルァミン （20 μΐ) を加え、 一夜撹拌した。 反応液に水 (30ml) を加え希釈した後、 DEAE-トヨパ一ルイオン交換カラムクロマトグ ラフィ一 （1.7 X 15cm;溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5) 0.1M—0.8M直線濃度勾配（全量 1L)) で精製して、 下記式で示される XR-標識- 7 - デァザ- 3，-デォキシグアノシン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて、 V が一 C三 C一であって、 n = 4の化合物。 以下、 XR- 3 ' d GT P (n 4) と略記する。 〕 2.68/zmolを得た （収率 33.5%) 。
Figure imgf000113_0001
また、 得られた XR- 3 ' d GTP (n 4) を、 D U 640紫外可視分光解析 システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定した 結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 24に示す。 合成例 57
6-トリフルォロァセタミ ド- 1 -へキセンの合成。
1) 5-へキセニル- p-トルエンスルフォネートの合成。
110 氷冷した塩化 p-トルエンスルフォニル （54. 78g， 287mmol)のピリジン （100ml) 溶液に 5 -へキセン- 1 -オール 〔東京化成 （株） 製； 20ml, 239tnmol〕 を滴下し、 その後 5°Cで 16時間撹拌した。 反応液を氷水 （500ml) に投入した後、 エーテル (500ml) で抽出し、 エーテル層を冷 1N -塩酸、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 および飽和食塩水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮して、 5 -へ キセニル- p-トルエンスルフォネート 44. 37gを得た （収率 72. 9%) 。
2 ) 6 -ョ一ド- 1-へキセンの合成。
5 -へキセニル— p-トルエンスルフォネート （44. 3g, 174mmol)、 よう化ナトリウ ム （31. 3g， 209mmol)およびァセトン （250ml) の混合液を 3時間環流反応させた。 冷却後、 沈殿物を濾別し濾液を濃縮した。 得られた残渣をェ一テル （500ml) に 溶解後、 飽和亜硫酸水素ナトリゥム水溶液、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液およ び飽和食塩水で洗浄し、 硫酸マグネシウムで乾燥後減圧下に濃縮して、 6 -ョー ド -1-へキセン 31· 27gを得た （収率 85. 5%) 。
3 ) 6-トリフルォロアセタミ ド- 1 -へキセンの合成。 水素化ナトリウム （60%油性； 14. 89g, 372mmol)の D M F (370ml) 溶液にトリ フルォロアセタミ ド （50. 39g, 446咖 ol)を氷冷下、 約 10部分にわけて添加した。 次いで 6 -ョ一ド- 1-へキセン （31. 27g, 149mmol)の DM F (130ml) 溶液を加え、 室温で 3 時間撹拌した。 反応液に飽和塩化アンモニゥム水 （300ml) およびェ一 テル （300ml) を加え抽出した。 エーテル層を飽和食塩水 （300ml) で二回洗浄後、 硫酸マグネシウムで乾燥して減圧下に濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィ一 （溶出液；へキサン -酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 6 - トリフルォロアセタミ ド - 1 -へキセン 24. 36gを得た （収率 83· 8%) 。'
1H-NMR (270MHz, CDC13) δ pptn: 1. 39-1. 69 (m, 4H, -CH„ (CHJ CH, -) , 2. 04—
2. 14 (m, 2H, H2C=C— )， 3. 37 (dd, 2H, J=7. 0, 13. 8Hz, CH2N) , 4. 96-5. 06 (m, 2H,
111
Figure imgf000115_0001
, 6. 45 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 5 8
3，-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド- '-へキセニル） ゥリジン （化 合物 3 3 ) の合成。 塩化パラジウム （1. 77g, lOmmol)と塩化リチウム （0. 85g, 20mmol)のメタノール (100ml) 溶液をー晚撹拌し、 リチウムテトラクロ口パラデートの 0. 1M溶液を調 製した。 3'-デォキシゥリ ジン （化合物 1 ： 1· 14g，5mtiiol)と酢酸水銀 （I I )
(1. 60g, 5mmol)を水 （50ml) に溶解し、 60°Cで 5時間撹拌した。 反応液を減圧下 に濃縮後、 残渣を無水メタノール （55ml ) に懸濁させ、 先に調製したリチウムテ トラクロ口パラデートの 0. 1M溶液 （55ml) と合成例 5 7で得た 6-トリフルォロ ァセタミ ド- 1-へキセン （3. 42g， 17. 5mmol)を加え 16 時間還流反応させた。 反応 液を硫化水素ガスで飽和させた後、 沈澱をセライ トを通して濾別し、 濾液を濃縮 した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液； ジクロロメ タン-メタノール混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosi l I I 5C18 RS Prep 20. 0 X 250ram, 溶出液； ァセトニトリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 3'-デォ キシ -5- (6 -トリフルォロアセタミ ド -Γ'-へキセニル） ゥリジン （化合物 3 3 ) 454mgを得た （収率 21. 6%) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1. 25—1. 55 (m, 4H, — (CH2) 2— ) , 1. 68—1. 80 (m,
IH, 3'— Ha) , 1. 95-2. 18 (m, 3H， 3' -Hb and =CHCH^) , 3. 05-3. 25 (m, 2H, CH2N) , 3. 50—3. 60 (m， 1H， 5' -Ha) , 3. 70-3. 85 (m, 1H， 5' -Hb) , 4. 15-4. 36 (m, 2H， 2' - H and 4' -H) , δ. 22 (t, 1H, J = 5. 1Hz, 5' -OH) , 5. 54 (d, 1H, J = 4. 3Hz， 2' -OH) , 5. 66 (d, 1H, J = 1. 6Hz, 1 '一 H)， 6. 03 (d， 1H, J = 15. 7Hz, -CH=CHCH2-) , 6. 38 (dt, 1H， J = 7. 0， 16. 2Hz， -CH=CHCH2 -) , 8, 18 (s， 1H, 6 - H)， 9. 39 (brs, 1H， NHTfa) ,
I I. 32 (s, 1H, 3-NH)
112 合成例 59
3，-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド -1 へキセニル） ゥリジン （化 合物 33) の合成。
3，-デォキシ- 5-ョ一ドウリジン （化合物 2 ： 300mg, 0.85瞧 ol)の DMF (4.25ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 5 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1-へキセン
(496mg, 2.54mmol)、 よう化銅 （ I ) (32.3mg, 0.17隱 ol)、 テトラキス （トリフ ェニルホスフィン） パラジウム （0) (97.9mg,0.085mmol)及びトリェチルァミン
(0.24ml， 1.69隱 ol)を加え 60°Cで 18 時間反応させた。 反応液を塩化メチレン - メタノ一ル混液（9.3ml)で希釈し、ィオン交換樹脂 AG1 X8 (バイオラド社製， HC03— 型； 0.68g) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン -メタノール混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosil II
5C18 RS Prep 20.0 X 250mm, 溶出液；ァセトニトリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 3，-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド- 1"-へキセニル） ゥリジ ン （化合物 33 ) 127mgを得た （収率 35.5%) 。
1H-NMR (270MHz, DMS0-d6) δ ppm: 1.25— 1.55 (m, 4H, _(CH2)2— )， 1.68—1.80 (m, 1H， 3' - Ha)， 1.95-2.18 (m， 3H, 3'— Hb and =CHQ^)， 3.05-3.25 (m, 2H, CH2N) , 3.50-3.60 (m, 1H， 5'— Ha)， 3.70 - 3.85 (m, 1H， 5'— Hb)， 4.15-4.36 (m, 2H, 2' - H and 4' -H) , 5.22 (t, 1H， J = 5.1Hz, 5'— OH)， δ.54 (d, 1H， J = 4.3Hz, 2' -OH) , 5.66 (d, 1H, J = 1.6Hz, l'-H), 6.03 (d, 1H, J = 15.7Hz, -CH=CHCH2-), 6.38 (dt,
IH, J = 7.0， 16.2Hz, -CH=CHCH2-), 8.18 (s， 1H, 6— H)， 9.39 (brs, 1H， NHTfa)，
II.32 (s, 1H, 3-NH) 合成例 60 δ- (6' アミノ- 1 へキセニル） -3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト
113 (化合物 34 ) の合成。
3，-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド- 1" -へキセニル） ゥリジン （化 合物 33 ： 126.4mg,0.3mmol)をりん酸トリェチル （1.26ml) に溶解し、 一 20。Cま で冷却した後ォキシ塩化リン （41.9 1) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過 後、 ォキシ塩化リン （55.9 /1) を追加し、 さらに 23時間撹拌した。 この反応液 を、 一 20°Cに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフェート を 0.5M含む DMF溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終了後、 トリェチルァミン-水混液 （15ml) を添加し、 一夜静置した。 反応液をエーテル にて洗浄後、 DEAE-トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.7X 40cm；溶出液：炭酸水素トリェチルァンモニゥム緩衝液 （ρΗ7. δ) 0Μ→0.3Μ 直線 濃度勾配 （全量 1L) ) で精製した。 これに 17%アンモニア水 （60ml) を加え 5°C で 17時間静置し、 減圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E-トヨパールイオン 交換カラムクロマトグラフィ一 （1.7X40cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアン モニゥム緩衝液 （pH7.5) 0M— 0.3M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して新規物 質 5- (6"-ァミノ- '-へキセニル） _3，-デォキシゥリジン- 5 トリホスフェート
(化合物 34 ) 65.3mgを得た （収率 22.4%) 。 合成例 6 1
TMR標識 3，-デォキゥリジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて
Vが- CH=CH-であって、 n = 4の化合物） の合成。
5- (6"-ァミノ- 1' へキセュル） -3'-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト
(化合物 34 ： 14.8/imol) を溶解した DMF (300 μ 1) -水 (300μ1) 混合液に、 トリェチルァミン （10 μΐ) 及び 6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸 イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製） （15.9/zmol) を加え室温で一夜 撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE-トヨパールイオン
114 交換カラムクロマトグラフィー （1.7X15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアン モニゥム緩衝液 （pH7.5) 0.05M→0.65M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して、 下記式で示されるリンカ一部が二重結合であって、 そのメチレン鎖の nの数が 4 個である TMR標識 3，-デォキシゥリジン- 5'-トリホスフエ一ト 〔一般式 〔I〕 に於いて Vカ CH=CH-であって、 n = 4の化合物。 以下、 TMR- Allyl- 3 ' d U TP (n 4) と略記する。 〕 7·62μηιο1を得た （収率 51.4%) 。
Figure imgf000118_0001
〔式中、 Meはメチル基を示す。 〕
また、 得られた TMR-Allyl- 3 ' dUTP (n 4) を、 DU 640紫外可視 分光解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを 測定した結果 （測定波長： 700nm〜200nni、 対称：蒸留水） を図 25に示す。 合成例 62
3' -デォキシ -5- (6' トリフルォロアセタミ ド- '-へキセニル） シチジン （化 合物 35) の合成。
3， -デォキシ -5-ョ一ドシチジン （化合物 6 ： 600tng， 1.70mmol)の DMF (8.5ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 5 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1-へキセン
(995mg, 5. lmmol), よう化銅 （ I ) (64.7mg， 0.34mmol)、 テトラキス （トリフエ ニルホスフィン） パラジウム （0) (196tng，0.17mmol)及びト リェチルァミ ン
115 (0.47inl,3.40mmol)を加え 60。Cで 18 時間反応させた。 反応液を塩化メチレン - メタノ一ル混液（20ml)で希釈し、イオン交換樹脂 AG1X8 (バイオラド社製， HC03_ 型； 1.36g) を加え 30分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮し得られた残渣をシリ 力ゲルカラムクロマ トグラフィ （溶出液；塩化メチレン-メタノール混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0 X 250mm, 溶出液； ァセ ト 二トリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 3'-デォキシ- 5- (6"-トリフルォ ロアセタミ ド- '-へキセニル） シチジン（化合物 3 5) 187mgを得た（収率 26.2%)。
1H-NMR (400MHz, DMSO— d6) δ ppm: 1.37-1.52 (m, 4H, — (CH2) 2— ), 1.64-1.68 (m， 1H， 3'— Ha), 1.90-1.97 (m, 1H， 3' - Hb) , 2.07-2.12 (m, 2H, =C¾) , 3.18(dd， 2H， J = 6.8, 12.8Hz, CH2N) , 3.53-3.56 (m, 1H, 5' - Ha) , 3.80-3.82 (m, 1H, 5'— Hb)， 4.10-4.30 (m， 2H, 2' - H and 4' - H)， 5.15(t, 1H, J = 5.0Hz, 5'— OH), 5.48 (d, 1H, J = 4.0Hz, 2' -OH) , 5.65(s, 1H, Γ -H) , 5.87(dt, 1H, J = 6.8， 15.6Hz, -CH=CHCH 2 -）， 6.18 (d, 1H, J = 15.6Hz, -CH=CHCH2-), 6.91, 7.10 (2 br s, 2H, 4— NH2)， 8.26 (s, 1H, 6 - H), 9.38 (brs, 1H, NHTfa)
合成例 6 3
5- (6"-ァミノ- 1"-へキセニル） -3'-デォキシシチジン- 5' -トリホスフェー ト (化合物 3 6) の合成。
3，-デォキシ- 5- (6"-トリフルォロアセタミ ド -1' へキセニル） シチジン （化 合物 3 5 ： 126. ltng，0.3mmol)をリン酸トリェチル （1.26ml) に溶角 し、 一 20°Cま で冷却した後、 ォキシ塩化リン （25. Ιμ ΐ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経 過後、 ォキシ塩化リン （22.3 z l) を追加し、 さらに 4 時間撹拌した。 この反応 液を、 一 20。Cに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフエ一 トを 0.5M含む DMF溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終了後、 トリェチルァミン-水混液 （5ml) を添加し、 一夜静置した。 反応液をェ一テルに
116 て洗浄後、 DEAE-トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー （1.7X 40cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩衝液 （pH7.5) 0M→0.3M 直線 濃度勾配 （全量 1L) ) で精製した。 これに 17%アンモニア水 （60ml) を加え 5°C で 15時間静置し、 減圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E-トヨパールイオン 交換カラムクロマトグラフィー （1.7X40cm；溶出液：炭酸水素トリ 1チルアン モニゥム緩衝液 （pH7.5) 0M→0.3M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して新規物 質 5- (6"-ァミノ- 1' へキセニル） -3，-デォキシシチジン -5'_トリホスフェート (化合物 36) 175mgを得た （収率 60.2%) 。
合成例 64
XR標識 3，-デォキシチジン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて V カ CH=CH-であって、 n==4の化合物） の合成。
5- (6"-ァミノ- 1' へキセニル） -3，-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート (化合物 36 ： ΙΟμιοΐ) を溶解した DMF (300/ 1) -水 （300μ1) 混合液に、 トリェチルァミン （10 /1) 、 6-カルボキシ -X -ローダミンコハク酸イミ ドエス テル （モレキュラープローブ社製） （25μπιο1) を加え室温で一夜撹拌した。 反 応液に水 （30ml) を加えて希釈した後、 DEAE-トヨバールイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.7X15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩 衝液 （pH7.5) 0.05Μ→0· 65M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して、 下記式で示 されるリンカ一部が二重結合であって、 そのメチレン鎖の ηの数が 4個である X R標識 3'-デォキシシチジン- 5'-トリホスフェート 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが -CH=CH-であって、 n = 4の化合物。 以下、 XR-Allyl- 3 ' d CTP (n 4) と 略記する。 〕 6.55μπιο1を得た （収率 65.5%) 。
117
Figure imgf000121_0001
また、 得られた X R - Allyl- d C T P ( n 4 ) を、 D U 6 4 0紫外可視分光解 析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを測定し た結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 2 6に示す。 合成例 6 5
7 - （6"-トリフルォロアセタミ ド- '-へキセニル） -3，-デォキシ- 7-デァザアデ ノシン （化合物 3 7 ) の合成。
7-ョ一ド- 3，-デォキシ- 7 -デァザアデノシン （化合物 1 8 ： 600g, 1. 60画 ol)の
DMF (8. 0ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 5 7で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 卜へキセン （912mg, 4. 80瞧 ol)、 よう化銅 （ I ) (62mg, 0. 32mmol)、 テトラキス
(トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (184mg, 0. 16瞧 ol)及びトリェチル ァミン （0. 44ml， 3. 2mmol)を加え 60°Cで 18 時間反応させた。 反応液を塩化メチ レン -メタノール混液 （16ml) で希釈し、 イオン交換樹脂 AG1X8 (バイオラド社 製， HC03— 型； 1. 50g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮して得られ た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン -メタノ一 ル混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosil I I 5C18 RS Prep 20. 0 X 250mm, 溶 出液；ァセトニトリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 7- (6"-トリフルォ ロアセタミ ド- 1"-へキセニル） -3，-デォキシ -7-デァザアデノシン （化合物 3 7 )
118 175mgを得た （収率 24.8%)
1H-NMR (400MHz, DMSO— d6) δ ppm: 1.23-1.54 (m, 4H, — (CH2)2 - 1.87-1.90 (m, 1H 3'— Ha), 2.19-2.20 (m, 3H 3' -Hb and =CHCH ), 3.20 (dd, 2H, J = 6.6, 13.0Hz, CH2N 3.46-3.62 (m 2H, 5' -Ha and δ'-Hb), 4.25-4.38 (m, 2H, 2'— H and 4'-H), 5.01 (t, 1H J = 5.6Hz, 5'— OH), 5.50 (d, 1H, J = 4.8Hz, 2' -OH) ,
5.95 (dt, 1H J = 7.2, 15.2Hz, -CH=CHCH2-), 6.01 (d, 1H, J = 2.4Hz, — H) ,
6.62 (br s 2H, 6 - NH2), 6.74 (d, 1H J = 15.2Hz, ~CH=CHCH2-), 7.48 (s 1H 8_H 8.03 (s, 1H 2— H), 9.40 (brs, 1H, NHTfa) 合成例 66
7- (6" -ァミノ -1"-へキセ -ル） - 3， -デォキシ- 7-デァザアデノシン- 5'-トリホ スフェー ト （化合物 3 8) の合成。
7- (6 "-トリフルォロアセタミ ド- 1"-へキセニル） -3'-デォキシ -7-デァザアデ ノシン （化合物 3 7 133mg,0.3 ol)をリン酸トリェチル （1.26ml) に溶解し、 — 20°Cまで冷却した後、 ォキシ塩化リン （25. Ιμ ΐ) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30分経過後、 ォキシ塩化リン （22.3μ 1) を追加し、 さらに 6時間撹拌した。 こ の反応液を、 一 20Cに冷却したトリス （トリ- n-ブチルアンモニゥム） ピロホス フエ一トを 0.5M含む DMF溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応 終了後、 トリェチルァミン-水混液 （5ml) を添加し、 一夜静置した。 反応液をェ —テルにて洗浄後、 DE AE -トョパールイオン交換カラムクロマ トグラフィー
(1.7X40cm;溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液（pH7.5) 0M→0.3M 直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製した。 これに 17%アンモニア水 （60ml) を加え
5°Cで 15 時間静置し、 減圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DEAE-トヨパールイ オン交換カラムク口マトグラフィ一 （1.7X40cm；溶出液：炭酸水素トリエチル アンモニゥム緩衝液 （pH7.5) 0M→0.3M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して新
119 規物質 7- (6" -ァミノ- 1"-へキセニル） -3，-デォキシ- 7-デァザアデノシン- 5'- トリホスフエ一ト （化合物 38) 126mgを得た （収率 42.2%) 。
合成例 67
R 6G標識 3，-デォキシ- 7-デァザアデノシン- 5'-トリホスフェート （一般式 〔 I〕 に於いて Vが- CH=CH-であって、 n = 4の化合物） の合成。
7 - （6"-ァミノ- '-へキセニル） -3, -デォキシ- 7-デァザアデノシン - 5'-トリホ スフユート （化合物 38 ： 8μπιο1) を溶解した DMF (2ml) -水 （1ml) 混合液 に、 トリェチルァミン （10 μΐ) 、 5-カルボキシローダミン 6G コハク酸イミ ド エステル （モレキュラープロ一ブ社製） （16μπιο1) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE A E-トヨパールイオン交換カラム クロマトグラフィー （1.7X15cm；溶出液：炭酸水素トリエチルアンモニゥム緩 衝液 （pH7.5) 0.05M— 0.65M直線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製して、 下記式で示 されるリンカ一部が二重結合であって、 そのメチレン鎖の nの数が 4個である R 6G標識 3，-デォキシ -7-デァザアデノシン- 5' -トリホスフエ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vカ CH=CH-であって、 n = 4の化合物。 以下、 R6G- Allyl- 3' d A TP (n 4) と略記する。 〕 3.90μπιο1を得た （収率 48.7%) 。
120
Figure imgf000124_0001
〔式中、 E tはェチル基を、 また、 Meはメチル基を夫々示す。 〕
また、 得られた R 6 G- Allyl- 3 ' d AT P (n 4) を、 DU 640紫外可視 分光解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トルを 測定した結果 （測定波長： 700ηπ！〜 200nm、 対称：蒸留水） を図 27に示す。 合成例 68
7 - (6"-トリフルォロアセタミ ド- へキセニル） -3，-デォキシ- 7-デァザグァ ノシン （化合物 3 9) の合成。
7 -ョ一ド- 3'-デォキシ- 7-デァザグアノシン （化合物 30 ： 1.31g, 3.33画 ol)の
DMF (16.67ml) 溶液に窒素気流下、 合成例 57で得た 6-トリフルォロアセタミ ド- 1-へキセン （1.90g, 9.99画 ol)、 よう化銅 （ I ) ( 130mg, 0.66瞧 ol)、 テ トラ キス （トリフエニルホスフィン） パラジウム （0) (385mg，0.33mmol)及びトリェ チルァミン （0.93ml, 6.66mmol)を加え 60°Cで 18時間反応させた。 反応液を塩化 メチレン-メタノール混液 （40ml) で希釈し、 イオン交換樹脂 AG1X8 (バイオラ ド社製， HC03- 型； 2.96g) を加え 30 分間撹拌した。 濾別後、 濾液を濃縮して得 られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ （溶出液；塩化メチレン-メタ
121 ノール混合溶液） 及び、 HPLC (カラム； Wakosil II 5C18 RS Prep 20.0 X 250mm, 溶 出液；ァセトニトリル-水混合溶液） にて精製し、 新規物質 3'-デォキシ -7- (6"- トリフルォロアセタミ ド -1"-へキセニル） -7-デァザグアノシン （化合物 3 9) 439mgを得た （収率 28.7%) 。
1H-隱 R (400MHz, DMSO- d6) δ ppm: 1.35-1.53 (m, 4H, _(CH2)2_)， 1.85-1.89 (m， 1H, 3' -Ha) , 2.09-2.15 (m, 3H, 3' -Hb and =CHCH2), 3.19 (dd, 2H, J = 6.8， 12.8Hz， CH2N)， 3.43-3.56 (m, 2H, 5' -Ha and 5' -Hb) , 4.10-4.30 (m, 2H, 2' - H and 4，一 H) , 4.84 (t, 1H, J = 5.6Hz, 5' - OH) , 5.42 (d, 1H, J = 4.4Hz, 2' -OH) , 5.81(d, 1H, J = 2.8Hz, l'-H), 6.21 (br s， 2H, 2— NH2)， 6.37 (d, 1H， J 二 15.6Hz, -CH=CHCH 2-)， 6.57 (dt, 1H, J = 7.1, 15.6Hz, -CH=CHCH2-), 6.93 (s， 1H, 8 - H)， 9.39 (brs, 1H, NHTf a) , 10.29 (s, 1H, 1-H) 合成例 69
7- (6"-ァミノ- 1"-へキセニル） -3， -デォキシ- 7 -デァザグアノシン- 5'-トリホ スフエート （化合物 4 0) の合成。
7- (6"-トリフルォロアセタミ ド- -へキセニル） -3，-デォキシ- 7-デァザグァ ノシン （化合物 3 9 ： 138mg， 0.3mmol)をリン酸トリェチル （1.26ml) に溶解し、
— 20°Cまで冷却した後ォキシ塩化リン （25.1 / 1) を添加し一 20°Cで撹拌した。 30 分経過後、 ォキシ塩化リン （22.3μ 1) を追加し、 さらに 8 時間撹拌した。 この 反応液を、 一20。Cに冷却したト リス （ト リ -n-ブチルアンモニゥム） ピロホスフ ェ一トを 0.5M含む DMF溶液 （3.6ml) に添加し、 室温で 3時間撹拌した。 反応終 了後、 トリェチルァミン-水混液 （5ml) を添加し、 一夜静置した。 反応液をェ一 テルにて洗浄後、 D E A E-トヨパールイオン交換力ラムクロマトグラフィー（1.7
X 0cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアンモニゥム緩衝液 （ρΗ7.5) 0M→0.3M 直 線濃度勾配 （全量 1L) ) で精製した。 これに 17%アンモニア水 （60ml) を加え 5°C
122 で 16時間静置し、 减圧濃縮後、 得られた残渣を再度 DE A E-トヨパールイオン 交換カラムクロマトグラフィー （1.7 X 40cm；溶出液：炭酸水素トリェチルアン モニゥム緩衝液 （pH7.5) 0M→0.3M直線濃度勾配 （全量 1し） ) で精製して新規物 質 7- (6" -ァミノ- '-へキセニル） - 3' -デォキシ- 7-デァザグアノシン- 5'-トリ ホスフェート （化合物 40) 122mgを得た （収率40.4%) 。
合成例 70
R 1 1 0標識 3，-デォキシ -7-デァザグアノシン- 5'-トリホスフェート （一般 式 〔 I〕 に於いて Vが- CH=CH-であって、 n = 4の化合物） の合成。
7 - （6' ァミノ- 1"-へキセニル） -3，-デォキシ- 7-デァザグアノシン- 5' -トリ ホスフ-—ト （化合物 40 ： ΙΟμπιοΙ) を溶解した DMF (500 μ 1) -水 （375μ1) 混合液に、 トリェチルァミン （25μ1) 、 5-カルボキシローダミン 110-ビス-ト リフルォロアセテート コハク酸イミ ドエステル （モレキュラープローブ社製）
(2δμιηο1) を加え室温で一夜撹拌した。 反応液に水 （30ml) を加え希釈した後、 DE AE-トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィ一（1.7X 15cm;溶出液： 炭酸水素トリェチルァンモ -ゥム緩衝液（pH7.5) 0.05M→0.65M直線濃度勾配（全 量 1L) ) で精製して、 下記式で示されるリンカ一部が二重結合であって、 その メチレン鎖の nの数が 4個である R 1 1 0標識 3'-デォキシ- 7-デァザグアノシ ン- 5' -トリホスフエ一ト 〔一般式 〔 I〕 に於いて Vが- CH=CH-であって、 n = 4 の化合物。 以下、 R 1 1 0- Allyl- 3 ' d AT P (n 4) と略記する。 〕 5.1 mol を得た （収率 51.0%) 。
123
Figure imgf000127_0001
また、 得られた R 1 1 0-Allyl-3 ' d AT P (n 4) を、 DU 640紫外可 視分光解析システム 〔ベックマン （株） 製〕 を用いて、 紫外可視吸収スぺク トル を測定した結果 （測定波長： 700nm〜200nm、 対称：蒸留水） を図 28に示す。
実施例 1
精製された変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y及びし 665P/F667Yを用いて 3' dNTP の取り込み効率を野生型 T7 RNA ポリメラーゼと以下のように比較した。 イン ' ビトロでの転写反応は、 例えば、 Melton, D. A, [Nucleic Acids Res. , 12:
7035-7056(1984)]に示された方法を一部改良して行った。 具体的には、 T7 プロ モータ一を有するプラスミ ドベクタ— pBluescriptKS(+) (ストラタジーン社） を、制限酵素 PvuIIあるいは Sealで反応し、線状にしたものを銬型として用い、
3' dNTPの誘導体として、合成例 46で合成したダイ .タ一ミネ一ター X R-3' dCTP
(n = 1 ) を 150//M, さらに 500 M GTP， UTP及び 250 /i M ATP, CTP、 8mM MgCl2、
2mM spermidine- (HC1) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社） の 条件下に、 野生型 T7 RNA ポリメラーゼ（BRL, ギブコ社あるいは二ツボンジーン
124 製）、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Yあるいは L665P/F667Y 2 5単位を加え て、 合計反応体積 10 i l として、 37°Cで 1間反応を行った。 次に反応産物中に残 存している未反応のダイ ·ターミネータ一を除去するため、 セフアデックス G-50 カラム （フアルマシア .バイオテク） を用いたゲル濾過法により転写産物を精製 し、 精製産物は遠心式エバポレータ一を用いて蒸発乾固した。 この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1. 0に従い、ホルムアミ ド /EDTA/Blue dextran loading buffer 6 μ 1に溶角？し、 そのうち 2 μ 1を、 6Μ尿素/ 4%ロングレ ンジャー ΤΜァク リルアミ ド溶液 （FMC) を含むシークェンス解析用変性ゲルを用 レヽ、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer 及び解析プログラム （株式会社パーキンエルマ一ジ ャパン） により解析した。 その結果を図 2 9にゲル 'イメージとして示す。 変異 型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Y及びし 665P/F667Yを用いたいずれの場合も、 野生 型 T7 RNA ポリメラ一ゼ （WT ) に較べて、 約 3倍のシ一クエンスラダーが得ら れることが分かる。 さらに、 約 700塩基の転写産物も確認された。 図 3 0に、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ F644Yを用いて得られたシークェンス ラダーのピーク強度を野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼを用いて得られたピーク強度 と対比して示す。 さらに図 3 1に変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ L665P/F667Yを用 いて得られたシークェンスラダ一のピーク強度を野生型 T7 RNA ポリメラーゼを 用いて得られたピーク強度と対比して示す。 これらの対比から、 変異型酵素のピ ークの高さは、 野生型と較べてバラツキが少なく、 さらに強いシグナルをもつピ
—クが得られることが分かる。 これは、 F644Yあるいは L665P/F667Yの変異によ つて、 この場合、 3' dCTP誘導体の取り込み率が改善されたことを示し、 さらに、 この変異型 T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応が、 既に存在する DNAポリメラ ーゼによる塩基配列決定法のデータ生産力に匹敵するラダー伸長反応特性を持つ
125 ていることを示している。 実施例 2
変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼを用いたダイ · ターミネータ一法によるシークェ ンス反応例
ダイ ·ターミネータ一法によるシークェンス反応を、 精製された変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y及び L665P/F667Yと野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼについて以 下のように比較した。 イン ' ビトロでの転写反応は、 実施例 1 で例示した、 Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res.， 12: 7035-7056)によって示された方法を用いた。 さらに具 体的に述べると、 T7プロモータ一を有するプラスミ ドべクタ一 pBluescriptKS (+) を、制限酵素 PvuIIあるいは Sealで反応し、線状にしたものを銬型として用い、 3' dNTP の誘導体として、 上記合成例 4 9、 5 2、 4 6 及び 4 3でそれぞれ合 成したダイ 'ターミネータ一、250 / M R6G— 3' c!ATP(n=l), 25 μ M R110- 3' dGTP (n=l), 150 //M XR-3' dCTP (n=l) , 50 μ M TMR-3' dUTP (n=l) , さらに 500 μ M GTP, UTP 及び 250 ATP, CTP、 8mMMgCl2、 2mM spermidine- (HC1) 3, 5mMDTT、 40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社） の条件下に、 野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼ（BRL, ギブ コ社あるいは二ツボンジーン製） あるいは変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10 /i l として、 37°Cで 1時間反応を行った。 次に 反応産物中に残存している未反応のダイ ·ターミネータ一を除去するため、 セフ アデックス G- 50 カラム （フアルマシア ·バイオテク） を用いたゲル濾過法によ り転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固した。 この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377
DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1.0に従い、ホルムアミ K/EDTA/Blue d e X t r a n loading buffer 6μ 1 に溶角？し、 そのうち 2 ζ 1 を、 6Μ尿素/ 4%
126 ロングレンジャー TMアクリルアミ ド溶液 （FMC) を含むシークェンス解析用変性 ゲルを用い、 ABI 377 DNA Sequencer 及び解析プログラムにより解析した。 その 結果、図 3 2に示したが、変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Yあるいは L665P/F667Y は野生型 T7 RNA ポリメラ一ゼに較べて、 ピーク強度が高く、 更にバラツキが少 なく、 シークェンスを読み取れることが分かる。 ここで野生型 T7 RNA ポリメラ —ゼを用いた場合、 ほとんどシークェンスは不可能であつた。
実施例 3
イン ' ビトロでの転写反応は、 実施例 1及び 2と同様に Melton , D. A. (1984, Nucleic Acids Res. , 12: 7035 - 7056)によって示された方法を用いた。
具体的には、 T7 プロモータ一を有するプラスミ ドベクター pBluescriptKS(+) (ストラタジーン社） を、 制限酵素 PvuIIで反応し、 線状にしたものを錄型とし て反応当たり 0.25μ ^、 用いた。
ダイ .ターミネータ一 （4x linker rdye terminator)として、 4μΜ R6G-3' dATP
(n=4), 4 iM R110-3'dGTP(n=4), 80 μ M XR— 3' dCTP (n=4) , 20 / M TMR-3' dUTP (n=4) , さらに 500 M GTP, UTP及び 250 μ M ATP, CTP、 8mM MgCl2、 2mM spermidine— (HC1) 3、
5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社）の条件下に、 変異型 T7 RNAポ リメラ一ゼ F644Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10 / 1 として、 同じく 37°C で一時間反応を行った。 次に反応産物中に残存している未反応のダイ ·タ一ミネ 一ターを除去するため、セフアデックス G-50カラム（フアルマシア 'バイオテク） を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレータ一 を用いて蒸発乾固した。 この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャ パンの ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver.1.0に従い、 ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e x t r a n loading buffer 6 1 に溶解し、 その うち 2/i lを、 6M尿素/ 4%ロングレンジャー™アクリルアミ ド溶液 （FMC社） を含
127 むシークェンス解析用変性ゲルを用い、 ABI 377 DNA Sequencer 及び解析プログ ラムにより解析した。 その結果を図 3 3に示した。 図 3 3において、 上段は、 実施例 2で用いたター ミネーターを用いた結果であり、 下段がリンカ一長の長いダイ ·ターミネータ一 を用いた本実施例の結果である。 リンカ一長の長いダイ · ターミネータ一と変異 型 T7 RNA ポリメラーゼの組み合わせは、 リンカ一長の短いダイ ·ターミネータ —を用いた実施例 2の条件に比べて、 取り込み効率の均一性がより高くなること が分かる。 これらの結果は、 イン · ビトロの転写反応を利用した塩基配列の解析 実用的なレベルで可能であることを示している。 実施例 4
T7プロモータ一を持つべクタ一を铸型として用いた時のシークェンス反応 イン · ビトロでの転写反応は、 実施例 1〜 3と同様に Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. , 12: 7035 - 7056)に示された方法を用いた。 具体的には、 T7 プロモータ一を有するプラスミ ドベクター PBluescriptKS(+) (ス トラタジーン社） を、 制限酵素 PvuIIで反応し、 線状にしたものを錄型とし て用いた。 反応は、 4μ Μ R6G-3' clATP (n=4) , 4μΜ R110-3' dGTP(n=4), 80 μ Μ XR- 3' dCTP(n=4)， 20 μ Μ TMR-3' dUTP(n=4), さらに SOO M GTP, UTP及び 250 μ Μ ΑΤΡ， CTP、 8mM MgCl2、 2mM spermidine- (HC1) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社）の条件下に、変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y (あるいは L665P/F667Y) 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10 1 として、 同じく 37°Cで一時間反応を行 つた。 次に反応産物中に残存している未反応のダイ ' ターミネータ一を除去する ため、 セフアデックス G-50 カラム（フアルマシア 'バイオテク）を用いたゲル濾 過法により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾 固した。
128 この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1. 0に従い、 ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e x t r a n loading buffer 6 μ 1 に溶解し、 そのうち 2 μ 1 を、 6Μ尿素/ 4%口 ングレンジャー ΤΜアク リルアミ ド溶液 （FMC社） を含むシークェンス解析用変性 ゲノレを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer及び解析プログラム (Sequencing Analysis Ver. 3. 0) により解析した。 その結果は図 3 4に示した。 この結果より、 まだ判 別の多少困難な箇所が僅かに見られるものの、 実用的なレベルで充分使用に耐え るシークェンスエレク トログラムが得られた。
実施例 5
PCR産物を铸型に用いた時のシークェンス反応例 本実施例では、 PCR 反応の铸型として human thyroid-stimulating hormone
( hTSH- β ) cDNAを pBluescriptKS (+) (ストラタジーン社） の EcoRI 部位にサブ クロ一ニングしたものをを用いたが、 hTSH- i3 cDNA に限定するものではなく、 遺 伝子であれば何でも良い。 また、 本実施例を説明する上で重要なことは、 塩基配 列を決定したい PCR産物中に T7 RNAポリメラーゼの認識する T7プロモータ一を 供給できれば本実施例のごとく、 シークェンスが可能となることである。 シーク エンスを可能とするような PCR産物中に T7プロモータ一を供給する一つの方法 は、 PCRを行う際、 いずれかのプライマーの 5' -末端に T7プロモーターの配列及 び転写に必要な転写開始点を付加させることにより、 いかなる DNAにおいても、 この目的を達成することが出来る。 また、 別な方法は、 以下、 本実施例で示した 方法であるが、 予め T7 プロモーターを保持しているプラスミ ドを用い、 この T7 プロモータ—を少なくとも挟むようなプライマーを用いることで、 T7 プロモ一 ターを持った PCR産物を得ることが可能になる。 後者の PCRを行う上で、 有用な
129 ベクタ一として、 pBluescriptシリーズ、 pBC Phagemidベクタ一 （以上、 ストラ タジーン社） や pGEMベクターシリ一ズ （プロメガ社） が市販されている。 この hTSH - |3 cDNAを持つプラスミ ド、 lOOfgを用い、 クロ一ニング部位を挟む形で存 在するし 220プライマ一 （5' - TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A- 3' )及び 1211プラ イマ一 （5， -ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T- 3' )で反応液量 20 μ 1で PCR反応 [ (94°C 2分） 1回、 （9 4°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1· 5分） 30回、 72°C 5分] を行った。 この PCR反応で出来た PCR産物の 1211プライマ一の下流に T7プロモータ一が存 在する。
この PC R産物の内の 1 μ 1 (約 10ng) をシークェンス反応に用いた。 反応は、 4 μ Μ R6G-3' dATP (n=4) , 4 μ M R110-3' dGTP (n=4) , 80 // M XR-3' dCTP (n=4) , 20 μ M TMR-3' dUTP (n=4) ,さらに 500 // M GTP, UTP及び 250 /z M ΛΤΡ， CTP、 8mMMgCl2、 2mM spermidine- (HC1) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8. 0 (BRL, ギブコ社）の条件下 に、 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10 μ 1 として、 同じく 37°Cで一時間反応を行った。 次に反応産物中に残存している未 反応のダイ 'ターミネ一ターを除去するため、 セフアデックス G- 50カラム（ファ ルマシア ·バイオテク製）を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、 精製産 物は遠心式エバポレータ一を用いて蒸発乾固した。
この乾燥させた反応物を株式会社パ一キンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377
DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1. 0に従い、ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e X t r a n loading buffer 6 μ 1 に溶解し、 そのうち 2 μ 1 を、 6Μ尿素/ 4% ロングレンジャー ΤΜアクリルアミ ド溶液 （FMC社） を含むシークェンス解析用変 性ゲルを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer及び解析プログラム （Sequencing Analysis
Ver. 3 . 0) により解析した。 その結果は図 3 5に示した。 この結果より、 まだ判 別の多少困難な箇所が見られるものの、 実用的なレベルで充分使用に耐えるシ一
130 クエンスエレク トログラムが得られた。 参考例 6
RNase活性の混入のない無機ピロホスファターゼの精製
RNase の混入のない、 無機ピロホスファターゼ （PPase) は以下のように精製 したが、 以下の方法に限定されるものではない。 無機ピロホスファタ一ゼの出発材料としては、 シグマ社製の酵母由来の粗精製 品 （シグマ 1-1643, EC. 3. 6. 1. 1)、 4mg (680単位） を緩衝液 （20mM Tris- HC1, 1 mM EDTA, pH 7. 9) 1mlに懸濁し、 同緩衝液に対して 2時間透析し、 脱塩操作を行い、 この透析液をカラム体積 1ml の SP Sepharose カラムクロマトグラム （フアルマ シァ ·バイォテック製） を行った。 具体的には約 2 0倍の体積の同カラム緩衝液 で 280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで充分洗浄し、 カラム体積の約 20倍の体積の同緩衝液を用いて 0〜0. 1Mの NaCl直線濃度勾配で溶出する。 溶出 液は、 適当量に分画して集め、 直ぐに SDS- 12. 5%ポリアクリルアミ ド電気泳動 を行い、 分子量約 32kDaの蛋白質を含む画分を検査した。 典型的な例では、 PPase 画分は、 未吸着部分に見いだされるはずである。 この蛋白質を含む分画を集め、 カラム体積 lmlの Q- Sepharose (フアルマシア .バイオテック製） に吸着させ、 カラム体積の約 20倍の体積の同緩衝液中を用いて 0〜1. 0Mの NaCl直線濃度勾配 で溶出する。 溶出液は、 適当量に分画して集め、 直ぐに SDS - 12. 5%ポリアクリ ルアミ ド電気泳動を行い、 分子量約 32kDaの蛋白質を含む画分を検査した。 典型 的な例では、 0. 35Mの NaCl付近に見いだされるはずである。 分子量 32kDaの蛋 白質を含む分画を集め、 500mlの保存緩衝液（20mM Tris- HC1， ImM EDTA, 50% glycer ol, PH7. 9) に対して 16 時間透析し、 使用まで- 20°Cにて保存する。 典型的な例 では、 回収率 62. 5%で PPase蛋白質 425単位、 0. 425単位/ μ 1 の標品を得るこ とが出来る。
131 この状態で RNase混入度合いを、 大腸菌の rRNA (16Sと 23S) 8 // gを基質として 検査した。 具体的には、 大腸菌 rRNAを 8mM MgCl2、 2mM spermidine- (HC1) 3, 5m DTT、 40mM Tris/HCl pH 8. 0 の緩衝液中で、 PPase、 0. 17U相当を加え、 37°C、 4 時間反応させた。 この RNAをホルムアミ ドが存在する変性条件下の 1. 0%ァガロ ース電気泳動を行い、 共に添加した色素であるキシレンシァノールがァガロース ゲルの約 1/3に達したときに泳動を止め、 紫外線 （波長 254nm) を照射して、 写 真撮影を行い、 RNAの分解度合いを検査した。このとき、粗精製品と精製後の PPase を比較したところ、粗精製品では RNAの分解が観察されたが、精製品については、 有為な RNA分解活性が検出されなかつた。 実施例 6 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼを用いたシ一ケンシンス反応に対するリンカー付き ダイターミネータ一及び無機ピロホスファタ一ゼの添加効果 参考例 6で精製された PPase のイン ' ビトロにおけるシークェンス転写反応時 の効果を検討した。 先ず、 添加量を調べる為に精製された PPaseの添加量を変え て反応した。 シークェンス反応は、 Melton, D. A. (1984, Nucleic Acids Res. , 12 :
7035 - 7056)によって示された方法を用いた。 さらに具体的に述べると、 T7 プロ モータ一を有するプラスミ ドベクタ一 pBluescriptKS (+) (ストラタジーン社） を、 制限酵素 PvuI I で反応し、 線状にしたものを铸型として用いた。 反応は、 4 μ M R6G-3' dATP (n=4) , 4 μ Μ R110-3' dGTP (n=4) , 80 / Μ XR-3' dCTP (n=4) , 20 μ Μ
TMR-3' dUTP (η=4) , さらに 500 μ Μ GTP, UTP及び 250 μ Μ ΑΤΡ， CTP、 8mM MgCl2、
2mM spermidine- (HC1) 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8. 0 (BRL, ギブコ社）の条 件下に、 変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 10 μ 1 として、 同じく 37°Cで一時間反応を行った。 この反応時に、 PPaseの効果を 調べるために酵素を無添加、 0. 425単位、 0. 0425単位、 0. 00425単位相当を添加
132 した。 次に反応産物中に残存している未反応のダイ ·ターミネータ一を除去する ため、 セフアデックス G- 50 カラム（フアルマシア 'バイオテク製）を用いたゲル 濾過法により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレータ一を用いて蒸発 乾固した。
この乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1.0に従い、ホルムアミ K/EDTA/Blue d e X t r a n loading buffer 6μ 1に溶解し、 そのうち 2 μ 1を、 6Μ尿素/ 4% ロングレンジャー "1アクリルアミ ド溶液 （FMC社） を含むシークェンス解析用変 性ゲルを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer及び解析プログラム （Sequencing Analysis Ver.3.0) により解析した。 その結果は図 3 6及び 3 7に示した。 この結果より、 PPase を添加したものは何れも各ピークの分離が改善し、 さらにピーク高の均一 性が高くなつた。 また、 0.00425単位の PPaseの添加でもその効果は変わらず、 以後、 PPaseの添加量は 0.00425単位とした。
次に PCR産物を踌型として用いたシークェンス反応に対する効果を検査した。 シークェンス反応は以下のように行った。 以下の例では、 PCR反応の铸型として human thyroid-stimulating hormone (hTSH- β ) cDNA pBluescriptKS (,+) 、ス トラタジーン社）の EcoRI部位にサブクローエングしたものをを用いたが、 hTS H - ]3 cDNAに限定するものではなく、 遺伝子であれば何でも良い。 この hTSH- ]3 c DNA を持つこのプラスミ ド、 100fgを用い、クローニング部位を挟む形で存在するし 220 プライマ一（5， -TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A- 3，）及び 1211プライマ一（5' _ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG T- 3' )で反応液量 20 μ 1で PCR反応 [ (94°C 2分） 1回、
(9 4°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1.5分） 30回、 72°C 5分] を行った。 その内の
Ιβ ϊ (約 10ng) をシ一クエンス反応に用いた。 反応は、 4/ZM R6G- 3' dATP(n=4), 4 μΜ R 110-3' dGTP (η=4) , 80 μ Μ XR-3' dCTP (η=4) , 20 μ Μ TMR-3' dUTP(n=4), さら
133 に SOO M GTP, UTP及び 250 μ M ATP, CTP、 8mM MgCl2、 2mM spermidine— (HC1) 3、 5mMD TT、 40mM Tri s/HCl pH 8. 0 (BRL, ギブコ社）の条件下に、 変異型 T7 RNAポ リメラ一ゼ F644Y 2 5単位を加えて、 合計反応体積 ΙΟ μ Ι として、 同じく 37°C で一時間反応を行った。 PPase を加える場合は、 0. 00425 単位相当を添加した。 次に反応産物中に残存している未反応のダイ ·タ一ミネ一ターを除去するため、 セフアデックス G-50 カラム（フアルマシア 'バイオテク製）を用いたゲル濾過法 により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固し た。
この乾燥させた反応物を株式会社パ一キンエルマ一ジャパンの AB I PRISM 377 DNA Sequenc ing System取り扱い説明書 Ver. 1. 0に従い、ホルムアミ ド /EDTA/Blue d e X t r a n loading buffer 6 μ 1 に溶角 し、 そのうち 2 μ 1 を、 6Μ尿素/ 4% ロングレンジャー™アクリルアミ ド溶液 （FMC社） を含むシークェンス解析用変 性ゲルを用い、 ΑΒΙ 377 DNA Sequencer及び解析プログラム (Sequencing Anal ysis Ver. 3. 0) により解析した。 その結果の一部は図 3 8に示した。 この結果、 PPase を添加するとピークの分離が改善し、 更に各ピークの高さが均一となり、 先のプ ラクミ ドをシークェンスの铸型として用いた場合と同じ結果が得られた。 このこ とは、 PPase の併用によりシークェンスの読みとり精度が高くなることを示唆す る。
実施例 7
無機ピロホスファターゼを添加した具体的なシークェンス反応
無機ピロホスファタ一ゼを添加したシークェンス反応例を実施例 6の PCR産物を 銹型として用いる場合と同じ条件で行い、 得られたシークェンスの精度を比較し た。
図 3 9は、 無機ピロホスファターゼを添加していないもので、 図 4 0は無機ピ
134 口ホスファターゼを添加して反応したものである。 この結果、 読みとつた塩基配 列を既に報告されている hTSH - ]3 cDNAと比較した結果、 読みとつた 510塩基対に 関して、 無機ピロホスファタ一ゼを添加しなかった反応では、 90°/o、 無機ピロホ スファターゼを添加した場合は、 98%の精度であることが分かった。 尚、 実施例 6で示した図 3 8は、 この実験の結果の一部に付いて、 無機ピロホスファタ一ゼ の添加効果を比較する為に加ェしたものである。 以上のことから、 変異型 T7 RNA ポリメラーゼ、 ダイ . ターミネータ一及び無機 ピロホスファターゼを用レ、ることにより、 現在の主流である DNAポリメラ一ゼを 用いた塩基配列決定法とほぼ同等、 あるいはそれ以上の精度で塩基配列が決定出 来ることが分かる。 参考例 7
3' dNTP誘導体の取り込み率の改善 参考例 5で精製した変異型 T7 RNAポリメラーゼのリボヌクレオチド（NTP)と 3' デォキシヌクレオチド（3' dNTP)の取り込み率を以下のように測定した。
転写反応の铸型は、 プラスミ ド pBluescript (KS+) (ストラタジーン社） を制限 酵素、 PvuI Iで反応し、 線状としたものを用い、 ATP， CTP, GTP, UTPをそれぞれ
250uM、 2mM spermidine- (HC1) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH 8. 0、 0. lul の
[alpha-32P] UTP (3000 Ci/隨 ole)の条件下、 変異型 T7 RNA ポリ メ ラ一ゼ
F644Y/L665P/F667Yを 25単位、 反応に用いた。 そして、 2種類の反応液 （3' dATP の無添加又は添加 （終濃度 ΙΟΟ μ Μ) ) を用意して、 37°C、 60分反応させた。 そし て、 この反応物全量を DE81 paper (ワッ トマン社） にスポットし、 リン酸緩衝 液で 3 回洗浄、 乾燥させ、 DE81 paper をシンチレ一シヨンバイアルに入れて、 シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン） を用いて、 それぞれの放射活性を測 定した。 これにより得られた放射活性より、 3' - dATP の添加、 無添加時の値と比
135 較することによってどれだけ [alpha_32P] UTP の取り込みが阻害されるかを算出 した。 算出値を、 野性型 T7 RNA ポリメラーゼの阻害度 1 . 0 0 0と比較して得 られる相対活性を表 1に示す。
上記 F644Y/L665P/F667Y変異体に代えて、 野性型 T7 RNAポリメラ一ゼ、 参考 例 3で得た変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y若しくは L665P/F667Y、 又は実施 例 2及び 3と同様の方法で構築精製した変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P、 F782Y、 F733Y、 F646Y若しくは Y639Fを反応に用いて、 阻害結果を得た。 相対活 性を表 1に示す。
表 1の結果は、 数値が大きレ、ほど、 その変異型酵素が、 3' -dATPを取り込みや すくなつている変異であることを示している。 例えば、 この場合、 変異型 T7 RNA ポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Yは、 野性型酵素より、 5· 58倍、 3' -dATPを取り 込みやすい酵素であることを意味する。 F644Y/L665P/F667Y 変異体は、 今回、 作 製した変異型酵素の中で、 もっとも 3' -dNTPを取り込むバイアスの少ない変異型 酵素であることを示している。
136 表 1
Figure imgf000140_0001
実施例 8
変異型 T7 RNAポリメラーゼ F644Y/L665P/F667Yを用いたシークェンス反応例 シークェンス反応の铸型として用いた鎢型は以下のように PCRにより作製した。 PCRの錄型として human thyroid-stimulating hormone (hTSH- β ) cDNAを T7 プロモーターを有する BS750由来のプラスミ ドにサブクローニングしたものを用 いた。 この hTSH- ]3をもつプラスミ ド、 lOOfg を用い、 クローニング部位を挟む 形で存在する L220プライマー（5'- TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC A- 3')及び 1211 プライマー（5' -ACG TTG TAA AAC GACGGC CAG T-3' )で反応液量 20 μ 1で PCR [ (94°C 2分） 1回、 （94°C 1分、 55°C ί分、 72°C 1.5分） 30回、 72°C 5分] を行った。 この PCRで出来た PCR産物の 1211プライマ一の下流に T7プロモータ一が存在す る。
シークェンス転写反応は、 Melton, D. A [Nucleic Acids Res. , 12:7035- 7036(1984) ]に示されている方法を用いて行つた。
上記 PCR産物の内 Ιμ ΐ (約 lOng)をシークェンス反応に用いた。反応は、 3'dNTP の誘導体として、 実施例 2で用いたと同様のダイ · ターミネータ一 4;uMR6G - 3'dATP[5-カルポキシローダミン 6G標識 3' -デォキシアデノシン- 5-トリフォス
137 フェート（n=4)]、 4μΜ R110- 3' dGTP [5-カルボキシローダミン 110標識 3' -デォ キシグアノシン - 5_トリフォスフェート（n=4)]、 80 μΜ XR- 3' dCTP[5-カルボキシ - X一口—ダミン標識 3'—デォキシシチジン—5—トリフォスフエ—ト（n=4)]、 20 μ Μ
TMR-3' dUTP [5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3' -デォキシゥリジン - 5- トリフォスフヱ一ト（n=4)]を用いた。 さらに 500μΜυΤΡ、 250 ATP, 200 μ Μ CTP, 500 μΜ GTP、 2mM スペルミジン-（HCI) 3、 5mM DTT、 40mM Tris/HCl pH8.0 (BRL、 ギブコ社）の条件下、 変異型 T7 RNAポリメラ一ゼ F644Y/L665P/F667Y 25単位を 加えて、 合計反応体積 10μ 1 として、 37°Cで一時間反応を行った。
次に反応産物中に残存している未反応のダイ · ターミネータ一を除去するため、 セフアデックス G-50カラム（フアルマシア ·バイオテク製） を用いたゲル濾過法 により転写産物を精製し、 精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固し た。
この乾燥させた反応物を株式会社パ一ケンエルマ一ジャパンの ABI PRISM 377 DNA sequencing System取り扱い説明書 Ver. 1.0に従い、ホルムアミ ド /EDTA/Blue dextran loading buffer μ 1 に溶解し、 そのうちの 2μ 1 を、 6Μ尿素/ 4% ロン グレンジャ一™ァクリルァミ ド溶液（FMC社）を含むシ一クエンス解析用変性ゲル を用レヽ、 ΑΒΙ 377 DNA sequencer 及び角？析プログラム（Sequencing Analysis Ver.3.0)により解析し、 エレク ト口フエログラムを得た。 図 4 1にその結果を示 す。 このように良好なシークェンス解析が可能である。
参考例 8 リンカ一部のメチレン鎖が異なる 3，-デォキシタ一ミネ一ターの検討
〔錄型 DNA〕
下記試料を用いて P C R法を行い（96°C 1分， 55°C30秒， 72°C 1分： 1回、 96°C
30秒， 55°C30秒， 72°C 1分： 24回） 、 得られた P C R産物 （ヒ ト甲状腺刺激ホ
138 ルモン （TSH) /3サブユニット DNA増幅断片） を铸型 DN Aとした。 尚、夫々の試料を所定量サンプルチューブに添加した後、 EXT a q緩衝液（宝 酒造 （株） ） により全体量を ΙΟμΙ としたものを PC R用試料とした。 〈試料〉
• ヒ ト TSH]3サブュニット DNA (accession No. S70586) を導入した Bluescriptll (ス トラタジーン社製） ： 1 pg • フォヮ一ド ·プラ一マー
(5， -ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' ) ： 0.1M
• リバース ·プラ一マ一
(5' -TAACAATTTCACAGGAAACA-3' ) ： 0.1M
• 2' d GTP ： 200μ M
• 2 ' d ΤΤ Ρ ： 200μ M
• 2 ' d AT P ： 200μ M
• 2 ' d C T P : 200 μ M • EXT a qポリメラ一ゼ （宝酒造 （株） 製） ： 0.5units
〔ターミネ一ター〕 • TMR3， dUTP (n 4) (合成例 30の化合物） - TMR-Allyl-3 ' dUTP (n 4) (合成例 6 1の化合物）
〔操作方法〕
踌型 DNA 10ngを、各ターミネータ一， グアノシン- 5' -トリホスフエ一ト （ r
GTP) , ゥリジン- 5'-トリホスフェート （r UTP) ， アデノシン- 5' -トリホ スフェート （r ATP) ， シチジン- 5'-トリホスフエ一ト （r CTP) ， MgCl2, スペルミジン- （HC 1 ) 3， ジチオスレィ トール （DTT) ， トリス/ HC 1
(pH7.5) ， 酵母無機ピロホスファターゼ （P P a s e) 及び T 7 RNAポリメ
139 ラーゼを下記条件となるようにサンプルチ. —ブに添加した後、 蒸留水により全 体量を 10//1 とし、 これを試料とした。
〈条件〉
.ターミ 一ター ： 10μ M
• r GT P ： 500 // Μ
• r UT P ： 500μ Μ
• r AT P ： 250/i Μ
• r CT P ： 250μ M
• MgCl2 ： 8 mM
• スぺゾレミジン- （HC 1 ) 3 ： 2 mM
• DTT ： 5 mM
• トリ 7_ HC 1 (ρΗ7· δ) ： 40mM •酵母 Ρ Ρ a s e ： lOunits
- T 7 RNAポリメラ一ゼ （ギブコ B R L社製） ： 25units 試料を 37。Cで 30分間加温した後、 セフアデックス G 25カラム （フアルマシ ァ社製）を用いたゲル濾過法により取り込まれなかったタ一ミネ一ターを除去し、 遠心分離により沈澱を採取した。 次いで、 該沈殿物を 4 μ ΐ ホルムアミ ドダイ
(lOmM EDTA含有、 95%ホルムアミ ド） に溶解した後、 90°Cで 2分間加温し た。 これを冷却した後、 4 %シークェンスゲルに 2 μ 1 アプライし、 ΑΒ I 3 7
7蛍光自動シークェンサ一 （ΑΒ Ι社製） による泳動を行った。 ターミネータ一 として TMR- 3 ' d UT Ρ (n 4) を用いて得られたシークェンサ一のゲルイ メージをマトリ ックス変換した結果 （タ一ミネーシヨン 'パターン） を図 42 A に、 また、 ターミネータ一として TMR-Allyl— 3 ' dUTP (n 4) を用いて 得られたシークェンサ一のゲルイメージを同様にマトリックス変換した結果 （タ
140 —ミネ一シヨン 'パターン） を図 42 Bに夫々示す。
〔結果〕
図 42 A及び Bから明らかな如く、 TMR-3 ' d U T P ( n 4 )と TM R- Allyl- 3 ' dUTP (n 4) とのタ一ミネ一シヨン 'パターンに違いは認められず、 T NR-Allyl-3 ' dUTP (n 4) は、 TMR-3 ' dUTP (n 4) と同様に効 率よく取り込まれることが判る。
尚、 ターミネ一ターの使用量を 10/iMから 0.5μΜとした以外上記と同様に行 つた場合も、 上記と同様の結果であった。
141

Claims

請求の範囲
(1) RNAポリメラーゼ及び前記 RN Aポリメラ一ゼのためのプロモータ —配列を含む DN A断片の存在下、 ATP、 GTP、 。丁？及びじ丁 又はそ れらの誘導体からなるリボヌクレオシド 5，トリフォスフエ一ト類並びに 3'dATP、 3'dGTP、 3'dCTP、 3'dUTP及びそれらの誘導体からなる 1種又は 2種以上の 3，デォ キシリボヌクレオシド 5，トリフォスフエ一ト（以下 3，dNTP誘導体という）を反応 させて核酸転写生成物を得、 得られる核酸転写生成物を分離し、 得られる分離 分画から核酸の配列を読み取る D N Aの塩基配列決定方法であって、
前記 RN Aポリメラーゼが、 対応する野性型 RN Aポリメラ一ゼの能力と比較 して、 前記； TdNTP誘導体を取り込む能力を増加させるように、 少なくとも 1つ のァミノ酸が修飾された野性型 R N Aポリメラーゼからなる変異型 R N Aポリ メラ一ゼであることを特徴とする D N Aの塩基配列決定方法。
(2) 変異型 RNAポリメラ一ゼが、 野性型 RNAボリメラーゼのヌクレオ チド結合部位中に存在する少なくとも 1つのアミノ酸が修飾されている RN A ポリメラ一ゼである請求項 1記載の方法。
(3) アミノ酸の修飾が、 アミノ酸の置換、 挿入または欠落である請求項 2 に記載の方法。
(4) 変異型 RN Aポリメラーゼが、 野性型 RN Aポリメラ一ゼのヌクレオ チド結合部位中に存在する少なくとも 1つのアミノ酸がチロシンに置換されて いる R N Aポリメラ一ゼである請求項 1〜 3のレ、ずれか 1項に記載の方法。
(5) 置換されるアミノ酸がフエ二ルァラニンである請求項 4に記載の方法。
(6) ヌクレオチド結合部位に存在するアミノ酸が、 ヘリックス Y とへリック ス Z との間のル一プ中のアミノ酸及びノ又はへリックス Z とへリックス AAと の間のループ中のァミノ酸である請求項 2〜 5のレ、ずれか 1項に記載の方法。
(7) 変異型 RNAポリメラーゼが、 3' dNTP誘導体に対する取り込み能力を、 野性型の少なくとも 2倍増加させるように修飾されている RNAポリメラーゼ である請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の方法。
(8) 変異型 RNAボリメラーゼが、 T 7ファージ、 T 3ファージ、 S P 6フ ァージ、 Kl 1ファージに由来する請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
142
(9) 変異型 RNAポリメラーゼが、 T 7ファ一ジ由来の RNAポリメラー ゼのァミノ酸残基 641 - 667 に対応する領域から選択される領域中の少なくとも 1つのアミノ酸が修飾されている野性型 RN Aポリメラーゼである請求項 1 記 載の方法。
(10) 変異型 RN Aポリメラ一ゼが、 T 7ファ一ジ由来の RN Aポリメラ一 ゼであって、 ァミノ酸残基 644または 667においてチロシンを有する RN Aポリメラーゼである請求項 1記載の方法。
(1 1) 変異型 RN Aポリメラーゼが、 野性型 T 7 RN Aポリメラーゼの 6 44番目のァミノ酸残基フエ二ルァラニンがチロシンに置換された RNAポリ メラーゼである請求項 1記載の方法。
(1 2) 変異型 RN Aポリメラ一ゼが、 野性型 T 7 RN Aポリメラーゼの 6 67番目のアミノ酸残基フエ二ルァラニンがチロシンに置換された RN Aポリ メラ一ゼである請求項 1記載の方法。
(1 3) 変異型 RN Aポリメラ一ゼが、 野性型 T 7 RN Aポリメラ一ゼの 6 65番目のアミノ酸残基ロイシンがプロリンにさらに置換されている RN Aポ リメラーゼである請求項 1 1又は 1 2に記載の方法。
(14) 変異型 RN Aポリメラーゼが、 野性型 T 7 RN Aポリメラ一ゼの 6 44番目のアミノ酸残基フエ二ルァラニンがチロシンに置換され、 かつ 667 番目のァミノ酸残基フエ二ルァラニンがチロシンに置換されている RN Aボリ メラーゼである請求項 1記載の方法。
(1 5) 変異型 RN Aポリメラ一ゼが、 野性型 T 7 RN Aポリメラ一ゼの 6 65番目のアミノ酸残基ロイシンがプロリンにさらに置換されている RNAポ リメラ一ゼある請求項 14記載の方法。
(1 6) 変異型 RNAポリメラ一ゼが、 T 3ファージ由来の RNAポリメラ —ゼであって、 ァミノ酸残基 645または 668においてチロシンを有する R NAポリメラーゼである請求項 1記載の方法。
(1 7) 変異型 RNAポリメラーゼが、 K 1 1ファ一ジ由来の RNAポリメ ラーゼであって、 アミノ酸残基 663〜668の間または 690においてチロシンを有 する RNAポリメラーゼである請求項 1記載の方法。
143
(1 8) 変異型 RNAポリメラーゼが、 S P 6ファージ由来の RNAポリメ ラ一ゼであって、 アミノ酸残基 633〜638の間または 670においてチロシンを有 する RN Aポリメラ一ゼである請求項 1記載の方法。
(1 9) 3'dNTP誘導体が下記一般式 [ I ]で示される 3，デォキシリボヌクレオチ ド誘導体である請求項 1〜 18のいずれか 1項に記載の方法。
Q- V- (CH2) n-NH-R 〔I〕
〔式中、 Qは 3' —デォキシリボヌクレオチド残基を表し、 nは 1以上の整数 を表し、 Vは一 C三 C一又は一 CH=CH—を表し、 Rは蛍光性を有する基を 表す。 〕
(20) 一般式 [ I ]における nが 4〜 10の整数を表す請求項 1 9記載の方 法。
(21) —般式 [ I ]における Rが下記一般式 〔VII〕 で示される請求項 1 9ま たは 20記載の方法。
Figure imgf000147_0001
〔式中、 Wはカルボキシル基を表し、
Xは一 O—、 一 S―、 -NR' - (但し、 R' は、 水素原子、 低級アルキル基、 ァラルキル基又はァリール基を表す） 又は一 CH2—を表し、
環 A及び環 Bは何れか一方が
Figure imgf000147_0002
144 であり、 他方が
Figure imgf000148_0001
であり （但し、 Ζは、 Ο又は =N+R,R2を表し、
Yは、 OH又は一 NR,R2を表し、 （但し、 及び R2は、 夫々独立して水素 原子又は低級アルキル基を表すか、 ま X Cたは、 R,及び R2が共にトリメチレン基を 表す （但し、 該 2つのトリメチレン基の各他端は、 該 2つのトリメチレン基を 有する窒素原子が結合している環上の、 該窒素原子と結合している炭素原子の 両隣の炭素原子の何れか一方とそれぞれ結合している） ） ） 、
環 C
に於ける波線 は、 環 A及び環 Bの構造に対応した位置の結合手を意味し、 上記環 A、 B及び C並びに Wを有するベンゼン環は、 更に置換基を有してい てもよい。 〕
(22) プロモータ一配列を含む DNA断片がポリメラーゼ連鎖反応により増 幅した DNA生成物である請求項 1〜21のいずれか 1項に記載の方法。
(23) 増幅した DNA生成物から、 ポリメラ一ゼ連鎖反応に用いたプライマ 一及び/又は 2'デォキシリボヌクレオシド 5'トリフォスフエ一ト及び/又はその 誘導体を除去することなしに、 核酸転写生成反応を行う請求項 22記載の方法。
(24) 核酸転写生成反応を無機ピロフォスファタ一ゼの存在下で行う請求項 1〜 23のいずれか 1項に記載の方法。
1 5
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101093A1 (fr) * 2001-06-11 2002-12-19 Nippon Genetech Co., Ltd. Procede pour determiner une sequence nucleotidique d'adn

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3172710B2 (ja) * 1997-07-07 2001-06-04 理化学研究所 Ｒｎａポリメラーゼ
JP3489991B2 (ja) * 1997-07-07 2004-01-26 理化学研究所 ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体
JP2002360256A (ja) * 2001-06-04 2002-12-17 Inst Of Physical & Chemical Res Ｒｎａプローブ作成方法、標的核酸の検出方法及びｒｎａプローブ作成用キット
US20040067492A1 (en) * 2002-10-04 2004-04-08 Allan Peng Reverse transcription on microarrays
US20060084799A1 (en) * 2003-09-24 2006-04-20 Williams Lewis T Human cDNA clones comprising polynucleotides encoding polypeptides and methods of their use
US20050075543A1 (en) * 2003-10-03 2005-04-07 Calabrese Charles A. Method of anonymous medical testing and providing the patient with the test results
US20070274988A1 (en) * 2003-10-10 2007-11-29 Five Prime Therapeautics, Inc. Kiaa0779, Splice Variants Thereof, and Methods of Their Use
US7378260B2 (en) * 2005-04-01 2008-05-27 Applera Corporation Products and methods for reducing dye artifacts
JP4621921B2 (ja) * 2005-07-27 2011-02-02 国立大学法人群馬大学 新規核酸誘導体及びそれを用いたポリヌクレオチドの製造方法
US20080206850A1 (en) * 2007-02-28 2008-08-28 Dellinger Douglas J Methods and compositions for DNA synthesis
LT2231689T (lt) * 2008-01-18 2016-10-25 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Nauji citostatiniai 7-deazapurino nukleozidai
US20090203086A1 (en) * 2008-02-06 2009-08-13 454 Life Sciences Corporation System and method for improved signal detection in nucleic acid sequencing
US9045740B2 (en) * 2012-02-24 2015-06-02 University Of Massachusetts Modified T7-related RNA polymerases and methods of use thereof
EP4355757A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Nucleoside-5 -oligophosphates having a cationically-modified nucleobase

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996014434A1 (fr) * 1994-11-07 1996-05-17 The Institute Of Physical And Chemical Research Procede de sequençage de l'adn
JPH08205874A (ja) * 1994-10-17 1996-08-13 Univ Harvard 修飾されたヌクレオチド結合部位を有するｄｎａシークエンシング用のｄｎａポリメラーゼ

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6061594A (ja) 1983-09-05 1985-04-09 ジヨエル　ブレスラ 固定化ｒνａ
FI87360C (fi) 1990-01-18 1992-12-28 Neste Oy Foerfarande foer framstaellning av eten-propen-kopolymerer i partikelform
US6027877A (en) 1993-11-04 2000-02-22 Gene Check, Inc. Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification
JPH07327698A (ja) 1994-04-13 1995-12-19 S R L:Kk Ｄｎａの変異の検出方法
GB9408344D0 (en) 1994-04-27 1994-06-15 St James S University Hospital Nucleic acid assays
EP0655506B1 (en) 1994-10-17 1996-09-18 President And Fellows Of Harvard College DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
SE9602062D0 (sv) 1996-05-29 1996-05-29 Pharmacia Biotech Ab Method for detection of mutations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08205874A (ja) * 1994-10-17 1996-08-13 Univ Harvard 修飾されたヌクレオチド結合部位を有するｄｎａシークエンシング用のｄｎａポリメラーゼ
WO1996014434A1 (fr) * 1994-11-07 1996-05-17 The Institute Of Physical And Chemical Research Procede de sequençage de l'adn

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101093A1 (fr) * 2001-06-11 2002-12-19 Nippon Genetech Co., Ltd. Procede pour determiner une sequence nucleotidique d'adn
EP1413628A1 (en) * 2001-06-11 2004-04-28 Nippon Genetech Co. Ltd. Method of determining dna base sequence
EP1413628A4 (en) * 2001-06-11 2005-01-19 Nippon Genetech Co Ltd METHOD FOR DETERMINING A NUCLEOTIDE DNA SEQUENCE

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