WO1999000382A1

WO1999000382A1 - Inhibiteurs de l'activite du hsf

Info

Publication number: WO1999000382A1
Application number: PCT/JP1998/002829
Authority: WO
Inventors: Shin-Ichi Yokota; Kozo Yamamoto; Souichi Morikawa; Yoshihide Fuse; Mikio Kitahara
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 1999-01-07
Also published as: EP0995745B1; AU7933298A; US20030149077A1; US6281229B1; US6613780B2; US20020058679A1; US6903116B2; DE69831950D1; CA2295055A1; EP0995745A4; DE69831950T2; EP0995745A1

Description

明細書熱ショック因子活性阻害剤技術分野

本発明は、熱ショック因子（HSF) の活.性阻害剤、熱ショックエレメント (HSE) 配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤、およびそれに基づく癌の治療または予防、及びストレス性疾患の治療または予防薬に関する。背景技術

細胞は、その蛋白質を作り出すため、遺伝子である DNAから mRNAを転写し、さらに蛋白質に翻訳している。転写を抑制すればその DN Aがコードする蛋白質は発現し得ないことは明白である。転写には転写因子と呼ばれる多くの因子が関わる。転写因子は、基本転写因子群と転写調節因子群とに分類される。基本転写因子群は大部分の遺伝子の転写に関与するのに対し、転写調節因子群は特定の時期あるいは特定の条件下にのみ特異的に転写に関わる。 HS Fはこ.のような転写調節因子の一つであり、進化上酵母からヒトまで広く存在する。 HSFは、熱等の環境或いは物理的ストレスまたはアミノ酸アナログ、エタノール、過酸化物等の化学物質によるストレス条件下、一般の転写または蛋白合成が抑制されるにも関わらず、特異的に対象遺伝子群を発現誘導することを特徴とする。 HSF は、その活性化の際、細胞質内でモノマーからホモ卜ライマ一となって核に移行し、 DNA上の HSE配列と呼ばれる結合配列（約 8 bp以上の塩基配列）を認識、結合して mRNAを誘導転写させることが知られている（Mol. Cell. Biol.

(13), 2486, 1993)。 H S Fには H S F 1から 4までの 4種類が報告されており、このうち熱等の外界からのストレス関連では HSF 1が働いているといわれている（Mol. Cell. Biol. (17), 469, 1997)。 HSE配列を有し、 HSFの制御を受ける遺伝子から転写、翻訳される蛋白質は総称として熱ショック蛋白質（HS P) あるいはストレス蛋白質またはシャペロン蛋白質と呼ばれる。 HSPの例としては、例えば、 HSP 70、 HSP 90、 HSP 100等があり、これらの発現には実際に HSFが機能していることが報告されている。従来 HSF阻害物質としては、ケルセチンをはじめとするフラボノイド類が知られている（Cell Sir uct. Func. (15), 393, 1990).

ストレスには細胞レベルでのストレスはもちろん個体レベルでのストレスがあり、細胞レベルの調節制御と個体レベルでの治療との関連は、検討すべき課題である。本発明は、ストレスによって、即ち HS Fによって誘導が起こる蛋白質の発現制御を行うことによる疾患の治療を提供するものである。 HSPは、普段は細胞内で H S F活性化以外の転写機構で合成されているものが多く、その機能として細胞機能を営む上で必須と考えられているものもある（Nature, (355)， 33, 1992):Nature, (381), 571, 1996)。一般的に、蛋白質に結合して機能を発揮する阻害剤は、標的蛋白質の種類によっては、治療対象以外の細胞或いは組織にも効果を及ぼす結果となり、重大な副作用に槃がるおそれがある。 HSFはストレス誘導転写因子なので、その阻害物質は転写阻害或いは活性化途中のシグナル伝達阻害を起こすと考えられる。 HS Fは本来細胞が特異的環境にある場合のみ活性化し発現誘導に導く。ここでいう HSF阻害とは、平常時に細胞が必要とする必須 HSPの発現にはできるだけ影響を及ぼさず、ストレスによる誘導（異常な誘導も含む）のみを抑制することを目指すものである。これまではストレス時 (熱等）の誘導のみを抑える特異的な薬剤で効果 ·特異性等において満足できるものはなかった。

HSFの活性化過程、すなわち熱等のストレス刺激が細胞に負荷されることによる HSFの修飾およびシグナリレ伝達についてまだ十分に解明されておらず、特異的阻害剤が見出された場合、その機序から新しいタイプの薬剤としての可能性が期待される。例えば、癌温熱療法においては、温熱治療のあと一定期間細胞が温熱に対して耐性を獲得することが知られており、それを温熱耐性の獲得という。温熱耐性の消失には 4〜 5日かかるため一般的に週 1 ~ 2回の温熱療法が行われている。温熱耐性を獲得しないようにできれば、さらに治療回数を増大させることが可能となり癌治療の効果の向上が期待される。また癌の温熱療法は単独より放射線療法或いは化学療法等と併用することでその効果が大きくなることは広く臨床的に認められている。温熱耐性の機序としては、熱で細胞内に誘導産生される H S Pの働きにより細胞内で変性された、または変性しつつある蛋白等を回復させ、結果的に細胞致死効果を減弱させると考えられているが詳細は不明である。また，癌細胞では H S Pがアポトーシスを防いでいるといわれており、 H S Pの発現誘導を抑制することで癌細胞に正常なアポトーシスをおこさせ、癌細胞の不死性または無限増殖を制御できる可能性もある。

さらに現代では精神的ストレスに起因するストレス性疾患も多くなりその例として鬱病及び不安が挙げられる。これに対する多くの従来の薬剤については効果 '副作用の点で満足されるものはない。また、従来の薬剤は、効果を発現するまでの時間が長く、レセプ夕一理論からだけではその作用機作を説明できない。そういった中で、現在抗鬱薬として、選択的にセロトニンの再取り込み.を阻害する薬剤が、副作用の軽減等から注目されている。一方、抗不安薬として、セロトニン（5— H T) 受容体ァゴニストが注目されており、このような薬剤の一部 (例えば、クェン酸タンバスピロン）は、抗鬱作用及び抗不安作用の両方を発揮する。このことは、ストレス性疾患としての鬱および不安が、少なくとも一部が共通の機構により制御されていることを示唆する。鬱病 ·不安をはじめとしたストレス性疾患の本質を解明し新作用機作を利用した薬剤が期待されている。細胞レベルでのストレスと個体レベルでのストレスを新しい観点で結びつけることもその一つである。本発明者らは、熱ショック因子の活性化を細胞レベルで阻害する薬剤が、結果的に變病 ·不安をはじめとした個体レベルでのストレス性疾患に効果を有するはずであると考えた。すなわち，ストレスとそれに対する応答は細胞および個体の階層をこえた共通の基本的構造がある（矢原一郎、ストレス蛋白質（永田和宏編）、 257-262、 1 994) 。その証左としては、ストレスを受けると次のストレスに耐性となるストレス応答の合目的性が認められること、異なるス卜レスに対して同じストレス抵抗性となること、ストレスは普通一過性であること等が挙げられる。本発明は、これらのストレスが持つ特性を考え、個々の細胞における過剰もしくは未制御反応を制御し通常状態に戻すことで疾患の治療を行おうとするものである。熱ショック因子活性化のシグナル伝達阻害は、細胞のストレス反応を阻害すると共に細胞をストレスがかかっていない状態にすると考えてよい。よって、 H S F活性化の抑制または H S P発現の抑制による細胞レベルでのストレス反応の抑制が、個体レベルでのストレス反応を抑制し得、従って H S F活性または H S P発現の阻害が、鬱病 ·不安をはじめとしたストレス性疾患の治療または予防を導き得る。

現在、ケルセチンをはじめとするフラボノイドに H S P産生抑制作用があり、これは mR N Aの発現を抑制していることより H S Fの活性化を阻害していると考えられているが、その作用機構は完全にはわかっていない。ケルセチンは、治療薬として十分な H S F活性の阻害効果を有さない。その上、ケルセンは、変異原性をはじめ抗ウィルス作用、チロシンキナーゼ阻害作用、ズ σ インキナ一ゼ C阻害作用、乳酸輸送阻害作用等他の種々生理活性作用を有し、副作用が危惧される。従って、より強い効果と少ない副作用の点からさらに特異的な薬剤が望まれていた。発明の開示

本発明者らは、前記の実状に鑑み鋭意研究を重ねた結果、転写調節因子である H S Fの活性阻害作用に基づき癌温熱療法等の細胞温熱耐性獲得阻害に有効な薬剤を見い出した。本発明者らはまた、 H S Fの活性阻害剤が抗鬱作用等を示したことから、細胞レベルだけでなく個体レベルでのストレスに起因する疾患に対しても有効であることを見い出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明の第 1は、一般式（I) ：

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（CH₂) ₂—で、 R¹は炭素数 1〜3 のアルキル基、ホルミル基, ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物に関するものである。一般式（I) において、ォレファン性二重結合は E—および Z—のいずれの配置もとり得る。

好適な実施態様において、 Xがー CH₂—で、 R¹がホルミル基である化合物に関する。

別の好適な実施態様においては、 Xは— （CH₂) ₂—で、 R¹が水素原子である化合物に関する。

さらに別の好適な実施態様においては、 Xは一（CH₂〉 ₂—で'、 R¹がホルミル基である化合物に関する。

本発明の第 2は、一般式（I) ：

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂ 一で、 R¹は炭素数 1〜 3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショック因子活性阻害剤に関するものである。

好適な実施態様においては、熱ショック因子は HSF 1である。

好適な実施態様においては、有効成分は、一般式（I) において， Xがー CH ₂—で、 R¹がホルミル基である。

別の好適な実施態様においては、有効成分は、一般式（I) において、 Xがー (CH₂) ₂—で、 R¹が水素原子である。

また別の好適な実施態様においては、有効成分は、一般式（I) において、 X が— CH₂—で、 R¹が水素原子である。

また別の好適な実施態様においては、有効成分は、一般式（I) において、 X が— CH₂—で、 R¹がァセチル基である。

本発明の第 3は、一般式（I) ：

(式中、 Xがー CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂ —で、 R¹は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショックェレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤に関するものである。

好適な実施態様において、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質は、 HSP40、 HSP47 HS P 70, HSP90、 HSP 100、 I L一 1、ひ一フエトプロテイン、 I FN— ひ、ビトロゲニン、 P—糖蛋白のからなる群から選択される。

本発明の第 4は、一般式（I) ：

(式中、 Xがー CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基，ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂ —で、 R¹は炭素数 1~3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショック因子の活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用が有効な疾患の治療または予防薬に関するものである。

好適な実施態様において、熱ショック因子の活性阻害作用、または熱.ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用が有効な疾患は癌である。

より好適な実施態様としては、一般式（I) において、 Xが _CH₂—で、 R

¹がホルミル基である。

別の好適な実施態様において、熱ショック因子の活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコ一ドされる物質の発現抑制作用が有効な疾患はストレス性疾患である。

より好適な実施態様において、ストレス性疾患は鬱である。

なお好適な実施態様としては、一般式（I) において、 Xが— （CH₂) ₂— で、 R¹が水素原子であるか、または、 Xが— CH₂—で、 R¹が水素原子である。本発明の第 5は、熱ショック因子活性阻害作用、またはその遺伝子中に熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコ —ドされる物質の発現抑制作用を示す、ストレス性疾患の治療または予防薬に関するものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の新規化合物は、一般式（ I ) ：

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基，ホルミル基、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂_で、 R¹は炭素数 1〜3 のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物に関する。

一般式（I) において、ォレファン性二重結合は E—および Z— いずれの配置もとり得る。

好適な実施態様としては、 Xがー CH₂_で、 R¹がホルミル基である化合物として構造式（I) ：

が挙げられる。

また別の好適な実施態様としては、 Xは- (CH₂) ₂—で、 R¹が水素原子である化合物として構造式（I I) ：

が挙げられる。

本発明の一般式（I)

(式中、 Xがー CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（tH₂) ₂ —で、 R¹は炭素数 1~3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基 '水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物の製造方法は、下記に示すピぺロナール

と、一般式 (II)

(式中、 Xが _CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（CH₂) ₂ 一で， R¹は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物とを、塩基性触媒（例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物、ナトリウムメチラート、ナトリウムェチラート等のアルカリ金属アルコラ一ト、リチウムジイソプロピルアミド等のアルカリ金属アミド、酢酸ナトリウム等の有機酸塩、炭酸ナトリウム、炭酸力リゥム等のアル力リ金属炭酸塩、水酸化ナトリゥム等のアル力リ金属水酸化物、ピぺリジン等の有機酸塩基など）の存在下で反応させることにより得ることができる。

また、一般式（III) ：

(式中、 Xがー CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（CH₂) ₂ 一で、 R'は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物と、ョードメタン等のハロゲノアルカン、ギ酸等の有機酸、塩化ァセチル等の有機酸ハロゲン化物、若しくは塩素等のハロゲンとを、脱水縮合反応、脱ハロゲン化水素縮合反応等の縮合反応を行うことにより得ることができる。

本発明によれば、一般式（I)

(式中、 Xがー CH₂ -で、 R'は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（CH₂) ₂ —で、 R¹は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショック因子の活性阻害剤、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤、あるいは、熱ショック因子の活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用が有効な疾患の治療または予防薬が提供される。この有効成分は、転写制御因子 HSFの活性を阻害することで、 HS Fが認識する DNA配列（すなわち、 HSE) を転写調節に働く遺伝子領域に有する構造遺伝子の転写誘導を阻害し得る。 sすなわち、細胞にとつて不可欠な分子種の基本的転写発現は阻害せず、熱等の定常ではないストレスによって発現誘導してくる蛋白質を特異的に抑制するものである。従って、この有効成分は、 HS Eを転写調節に働く遺伝子領域に有する構造遺伝子にコードされ、熱等のストレスにより発現誘導される蛋白質を有効に阻害抑制することができる。

例えば、 H S P 27、 H S P 47などの低分子 H SP、 HSP60ファミリー、 HSP70ファミリー、 HSP 90ファミリ一、 H S P 100ファミリ一をはじめとする典型的なストレス蛋白質およびある種の糖代謝関連酵素、 I L— 1、 a ーフエトプロテイン、 I N F—ひ、ビトロゲニン、 P—糖蛋白等は、そのプロモ一夕一遺伝子配列中に H S Fが認識する配列である H S Eを保持する。よって、それら遺伝子からの遺伝子発現誘導を抑制することでそれぞれ関連する疾患を予防 -治療することができると考えられる。したがって、熱ショック因子の活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用を示す化合物は、例えば癌の治療及び予防、鬱病 ·不安等ストレスが原因と考えられる疾患の治療及び予防に効果を示す。癌の治療には、癌温熱療法単独または放射線、化学療法剤との併用によるもの、多剤耐性獲得阻害による癌細胞が獲得した耐性を克服し化学療法剤の作用を回復させる耐性克服によるものが含まれる。

本発明の熱ショック因子の活性阻害剤、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤は、細胞温熱耐性抑制作用に基づいて、癌温熱療法における治療効果を向上させる。癌温熱療法における本発明の化合物のヒトへの投与量は、当該分野において公知の方法によって決定され得る。例えば、ヒト投与量は、実施例 8に記載されるような試験において決定されるマウスにおける適切な投与量と等価な値として決定され得る。マウスにおける投与量は、代表的には、 0 . 0 1〜2 0 0 O ing/kgの範囲であり、好ましくは、 0 . 1〜1 0 0 O mg/kgであり、より好ましくは、 1〜5 0 O mg/kgである。

本発明の熱ショック因子の活性阻害剤、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤はまた抗鬱作用を示す。本発明の化合物の抗鬱薬としてのヒトへの投与量は、当該分野において周知の方法によって決定され得る。例えば、ヒト投与量は、実施例 7に記載されるような試験において決定されるラットにおける適切な投与量と等価な値として決定され得る。ラットにおける投与量は、代表的には、 0 . 1〜5 0 0 O mg/kgの範囲であり、好ましくは、 1〜2 0 0 O mg/kgであり、より好ましくは、 1 0〜50 Omg/kgである。適切な投与量を導き得る他の鬱病モデルとしては、実施例 7に記載した強制水泳テストの他に、ストレス（Chronic Stress) モデル、ムリサイドモデル、レセルビン拮抗モデル、電極による自己刺激（Self -stimulation) モデル (Psychopharmacology, 83: 1, 1984) 、尾懸垂モデル (J pn. I. Psychopharmacol., 12: 207, 1992) などが挙げられる。

他のストレス性疾患に対する、本発明の熱ショック因子の活性阻害剤、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤の効果は、当該分野において周知の薬理学的試験または行動薬理学的試験により確認し得る。例えば、抗不安作用については、コンフリクトモデル（Jpn. J. Psychopharmacol. , 15: 115, 1995) 、高架式十字迷路法（Jpn. J. Psychopharmacol., 15: 125, 1995) 、心理的ストレス負荷法（Jpn. J. Psychopharmacol. , 15: 375, 1995) などが挙げられる。他のストレス性疾患についての試験法は、例えば、動物モデル利用集成（伊藤隆太他編、 R&Dプランニング， 1985年）に詳細に記載されている。本発明の化合物のヒトへの投与量は、当該分野において周知の方法によって決定され得る。例えば、上記のような動物試験において決定される効果的な投薬量を、当該分野で周知の方法によりヒトへの投薬量に外挿し得る。

実際の投薬量は、特定の患者の必要に応じて臨床医により調整さる。

本発明の熱ショック因子の活性阻害剤、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤、若しくはこれらの薬剤からなる癌及びストレス性疾患の治療または予防薬の投与方法としては、経口、経腸、または非経口的投与方法のいずれをも選ぶことができる。具体的な製剤形態としては、例えば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の経口剤、または坐剤、軟膏剤、注射剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬等の非経口剤をあげることができる。

本発明の熱ショック因子の活性阻害剤、熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤、若しくはこれらの薬剤からなる癌の治療または予防薬及びス卜レス性疾患の治療または予防薬の製剤の担体としては、経口、経腸、その他非経口的に投与するために適した有機または無機の固体または液体の任意成分を含有することができる。任意成分としては、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、しょ糖、澱粉、コーンスターチ、デキストリン、マンニット、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性および動物性脂肪、ならびに油、ガム、ポリアルキレングリコール、アラビアゴム、ぺクチン、などの賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、増量剤，着色剤、安定剤、等張剤，可溶化剤、分散剤、溶解補助剤、乳化剤. 着色剤、保湿剤、酸化防止剤等をあげることができる。本発明の化合物は製剤中に 0.001〜 100 %含ませることができる。また、これと両立しうる他の阻害剤、その他の医薬を含むことができる。この場合本発明の化合物は必ずしもその製剤中の主成分でなくてもよい。以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

本発明における化合物は次のような方法により合成することができる'。

(実施例 1 ) 化合物 101、及び 102の合成

N—ァセチル一 2—ピロリドン（70.0 g、 0.55mo 1 ) とピぺロナ一ル

(82.0 g、 0.55mo 1 ) のテトラヒドロフラン（500ml ) 溶液を、水素化ナトリウム（60%鉱物油懸濁物、 63.0g、 1.57mo l) のテトラヒドロフラン（1000ml) 懸濁液に、アルゴン雰囲気下、氷冷しながら滴下した後、反応液を室温にて一晚攪拌した。反応液を希硫酸で中和、クロ口ホルムで抽出、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、濾過、減圧にて溶媒留去した。得られた反応物を 2—プロパノールで再結晶して、化合物 101 (79.0 g、収率 65%) を得た。

化合物 101

NMR (400MHz, CDC 1₃) 3.03 (2H、 m) 、 3.48 (2H, m) 、 6.03 (2H、 s) 、 6.29 (1H、 s) 、 6.86 (1H、 d) 、 7. 24 ( 1H、 s) 、 7.49 ( 1 H、 d)

上記化合物 101 (82.0 g、 380 mm o 1 ) の蟻酸（500m l) 溶液を、ディーンスターク共沸装置を用いて、 20時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、残滓をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液はクロ口ホルム：酢酸ェチル =1 ： 1) にて分離し、クロ口ホルムにて再結晶し、化合¹物 102 (10.5 g、収率 1 1 %) を得た。

NMR (400MHz、 CDC 1₃) 3. 10 (2H、 m) 、 3.84 (2H、 m) 、 6.05 (2H、 s) 、 6.89 (1H、 d) 、 7.01 (1H、 s) 、 7 07 (1H、 d) 、 7.55 (1H、 s) 、 9.25 (1H、 s)

(実施例 2 ) 化合物 103、及び 104の合成

N—ァセチルー 2—ピペリドン（77.5g、 0.55mo 1 ) とピぺロナール (82.0g、 0.55mo 1 ) を原料とし、上記化合物 101と同様の操作で、化合物 103を得た。

化合物 103 上記化合物 103 (97.5 g, 380 mm o l) を原料とし、化合物 102 と同様の操作で、化合物 104を得た。

化合物 104 (実施例 3) レポーター蛋白による発現抑制実験

HS P 47の HSE配列を含むプロモ一夕一領域の遺伝子下流に /3—ガラクトシダ—ゼ遺伝子を連結させたプラスミドを作製し、チャイニーズハムスター卵巣

(CHO) 細胞にトランスフエクシヨンして安定形質転換体 Aを得た。一方、 H SE配列を含まず他の転写因子制御領域を多く持つ SV40初期プロモーターの下流に /3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子を連結させたプラスミドを作製し、チヤィニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞にトランスフエクシヨンして安定形質転換体 Bを得た。これらの安定形質転換体を前記化合物 101、 102、 103及び化合物 C ( 1—ァセチル— 3 _ベンゾ（ 1 , 3) ジォキソール— 5 Γルメチレン一ピロリジン— 2—オン；この化合物は、本発明に関する一般式（I) において、 Xがー CH₂—で、 R¹がァセチル基である。）で C0₂インキュベータ一中 3 7 、 60分の前処理をした後、 42 、 90分の熱ショックを与え、さらに 3 7 、 2時間リカバリーさせ細胞内に発現した β—ガラクトシダーゼの活性を基質として 4—メチルゥンベリフェリル一 3— D—ガラクトシドを用い 30分室温インキュベートの後、蛍光（Ex. 365 nm, Em. 450 nm〉測定した。被験化合物または比較薬物である既知のケルセチン処理での /3—ガラクトシダーゼ発現量を、溶媒対照ジメチルスルホキシド（DMSO) 処理での; 3— ラクトシダ一ゼ発現量で除し、発現率（％) として算出し、表 1に示す。 *

表 1

陽性コン卜ロールとして HS F阻害物質、かつ HS P阻害物質とじ'て証明されているケルセチンを用いた。本発明の化合物で処理することにより明らかにレポ一夕一蛋白質である 3 _ガラクトシダーゼの発現を転写レベルで抑制し，既知のケルセチン以上の効果を示した。

(実施例 4) ノザンハイブリダィゼーシヨン法による HS P 70 (誘導タイプ） mRNAの転写抑制

COLO 320DM細胞（ATCC C C L— 220) を 10 % F C S DM

EM培地（ギブコ BRL社製）を用い前記化合物 101, 102, 103で C〇 ₂インキュベータ一中 371：、 60分前処理した後、 42で、 90分の熱ショックを与えた。その後ただちに処理細胞を回収し、酸グァニジンチオシァネ一トフエノ一ルクロロホルム（AGPC) 法にて細胞から全 RNAを抽出した。全 RN Aを電気泳動、次にナイロンフィルターにトランスファ一しノザンハイブリダィゼ一シヨン法にて HS Pの mRNA量を比較した。プローブは [ a— ³²P] d C TPで標識した HSP 70 (誘導タイプ）の cDNAを、また内部コントロールとして) 3—ァクチンの cDNAを用いた。前記化合物 101、 102、 103で処理することにより HSP 70の mRNA転写が特異的かつ顕著に抑制され転写レベルでの阻害効果を示した。各化合物で処理し熱ショックを与えた細胞での H SP 70 (誘導タイプ）の転写量を、溶媒対照とした DM S〇処理細胞での誘導転写量を 1.0として比較したものを表 2に示す。表 2 化合物 HSP70 (誘導ヲイブ)

の転写量

D S0 (0.25%) 1.0 ケルセチン (100/zM) 0.4

化合物 101 (100/ ) 0.03

化合物 102 (100z ) 0.04

化合物 103 (100 0.1

この時、各処理間で 3—ァクチンの量に大きな変化はなかった。なお熱ショックを与えない細胞では HSP 70 (誘導タイプ） mRNA転写はほとんど見られなかった。 (実施例 5 ) 2次元電気泳動法による H S Pの発現誘導抑制

COLO 320 DM細胞を前記化合物 101、 102、 103で37 、 60 分前処理し、引き続き 42で、 90分の熱ショックを与え、さらに 37 、 2時間リ力バリーさせた後メチォ二ン不含培地に交換し S— 35メチォニンを加え 3 7 ， 1時間処理で新規合成蛋白質を標識する。

その細胞ライゼートを取得し、 1次元目として等電点電気泳動、 2次元目として SDS— PAGE法で展開後、ゲルのフルォログラフィーを行い、合成された HS Pの量を熱誘導時と非誘導時で比べた。ほかの蛋白が正常に合成されていることは、内部コントロールとして )3—ァクチンの合成量を比較することにより確認した。熱ショック処理による HSP熱誘導を、 HSP合成が強く誘導された D MSO溶媒対照群と比較したものを表 3に示す。表 3 熱ショ 'リク処理による HSP熱誘導

化合物 HSP40 HSP47 HSP70 HSP90 HSP100 —ァクチン

D S0 (0.25%) HI tH 変化なしケルセチン (100#M) i i * 変化なし化合物 101 (100^M) iH "* 変化なし化合物 102 (100/ίΜ) H* "* 変化なし化合物 103 (W ) Hi *H 変化なし t :抑制なし（強く誘導)、 t:弱く抑制、抑制、強く抑制

]3ァクチン合成量は熱ショック、非熱ショック、及び各サンプル処理で大きな変化はなかった。本発明の化合物で処理することにより明らかにすべての HS Ρ が発現誘導条件下で特異的に蛋白質合成抑制され、またそれは既知のケルセチンを大きく上回る効果を示した。 (実施例 6 ) 細胞温熱耐性抑制作用

COLO 320DM細胞を用い前記化合物で 37 、 60分の前処理、引き続き 42 、 90分の熱ショックをプレヒートとして与え、さらに 37 、 60分の処理の後、前記化合物不含の培地に交換し、さらに 60分 37でで培菱する。こののち 45 で 60分処理し、コロニー形成アツセィ法にて約 10日培養後細胞の生存数をコロニー数として計測した。ただし化合物 101、化合物 102、及び化合物 103の場合、 DM SO溶媒処理と比べコロニーが明らかに極小にもかかわらず計数に入れたので、通常おこなわれている直径 0.5 mm程度以下のコロニーを無視した場合はさらに上回る温熱耐性阻害効果を示すため、生存率 (Surviving fraction) は 2〜 3桁低くなる（0.001〜 0.01 %) 。また 4 5 処理を行わなかった場合のコロニー形成数はどの薬剤ともほぼ同程度であつた。これらの結果を表 4に示す。表 4

本発明の化合物を投与することにより明らかに細胞温熱耐性獲得阻害効果が確認され、既知のケルセチンを越える値を示した。生存率（Surviving fraction) は下記の式により算出した。

生存率（％) = 45 、 60分処理の細胞生存率 Z45T:未処理の細胞生存率 X 100

細胞生存率 =生存細胞数 Z播種細胞数 (実施例 7 ) ラットを用いた強制水泳試験における抗鬱効果

実験はポアソール等の方法（Eur. J. P arm. (47), 379, 1978) を一部修飾した方法にて行った。すなわち約 1 5 cmの深さまで水（水温、 25 ）を入れた内径 18cm、高さ 40 cmのガラス円筒にウィスター系雄性ラット（5週齢、体重 1 30〜1 50 g) を投下し、 1 5分後に取り出して乾燥してからホームゲージに戻した。 24時間後に再び同じ円筒内の水中に投下し、 5分間の間の無動時間 (ラッ卜が動かずにじっとしている時間）をストップウォッチにより累積的に計測した（5分間テスト）。被験化合物は生理食塩水に懸濁して 5分間テストの前に 10 OmgZkgを 1回経口投与して抗鬱効果を調べた。また比較薬物として既知のイミプラミン 1 0 OragZkgを、対照群として生理食塩水を 5mlZkg同様にして経口投与した。また短縮した無動時間を下記の式により抑制率として算出した。抑制率（％) = (生理食塩水での無動時間 -被験化合物での無動時間） Z生理食塩水での無動時間 X 100

これらの結果を表 5に示す。表 5

本発明の化合物を投与することにより明らかに無動時間が短縮され、既知の抗鬱薬であるィミブラミンを越える効果を示した。 (実施例 8 ) 担癌マウスを用いた癌温熱耐性獲得阻害効果

C 3H/Heマウス（雄、各群約 10匹）の右足にマウス瘙細胞（SCC VI I) を移植し腫瘍径が約 lcmになったところで実験を開始した。腫瘍に対する加温は全身麻酔下のマウス腫瘍部を 44 の恒温槽につけて行った。癌細胞の温熱耐性獲得阻害効果の判定は腫瘍の成長遅延アツセィにて調べた。被験化合物はォリーブ油に懸濁して最初の加温 6時間前に 20 OingZkgを 1回腹腔内投与した。 1回目の加温は 10分間（Hl)、 2回目の加温は 30分間（H2)行い、 1回目と 2回目の加温の間に室温 8時間の回復期をおいた。表 6

本発明の化合物の投与することにより、明らかに癌細胞温熱耐性獲得阻害効果が確認された。産業上の利用可能性

本発明により、熱ショック因子（HSF :特にHSF 1) の活性阻害剤、又は HSFによって調節される蛋白質の産生誘導阻害剤が提供される。さらに、癌温熱療法の治療及び予防、鬱病 ·不安等ストレス性疾患の治療および予防に有用な新規べンゾー 1, 3—ジォキソール化合物、ならびに、又有効成分としてべンゾ一 1 , 3—ジォキソ一ル化合物を含有する癌温熱療法治療予防剤およびストレス性疾患治療予防剤が提供される,

Claims

請求の範囲

1. 一般式（ I )

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂—で、 R¹は炭素数 1〜3 のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物。

2. Xが— CH₇—、 R¹がホルミル基である請求項 1記載の化合物。

3. Xがー（CH₂) ₂—、 R¹が水素原子である請求項 1記載の化合物。

4. Xがー（CH₂) 。一、 R¹がホルミル基である請求項 1記載化'合物。

5. 一般式（ I ) ：

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂〉 ₂ 一で、 R¹は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショック因子の活性阻害剤。

6. 熱ショック因子が H S F 1である、請求項 5記載の活性阻害剤。

7. Xがー CH₂—で、 R¹がホルミル基である、請求項 5記載の活性阻害剤。

8. Xがー（CH₂) ₂ -で、 R¹が水素原子である、請求項 5記載の活性阻害剤。

9. Xがー CH₂ -で、 R¹が水素原子である、請求項 5記載の活性阻害剤。

10. Xが— CH₂—で、 R¹がァセチル基である、請求項 5記載の活性阻害剤。

11. 一般式（ I ) ：

(式中、 Xが— CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xが— （CH₂) ₂ 一で、 R¹は炭素数 1〜3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、熱ショックェレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制剤。

12. 前記熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質が、 HSP40、 HSP47、 HSP 70、 H SP90、 HSP 100、 I L一 1、ひ一フエトプロテイン、 I FN— α、ビトロゲニン、 Ρ—糖蛋白のからなる群から選択される、請求項 1 1記載の発現抑制剤。

3. 一般式（I) ：

(式中、 Xがー CH₂—で、 R¹は炭素数 1若しくは 2のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、水素原子、またはハロゲン原子、あるいは Xがー（CH₂) ₂ —で、 R¹は炭素数 1 ~3のアルキル基、ホルミル基、ァセチル基、 7 '素原子、またはハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする、 -熱ショック因子の活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用が有効な疾患の治療または予防薬。

14. 前記疾患が癌である、請求項 13記載の治療または予防薬。 15. Xが— CH₂—で、 R¹がホルミル基である、請求項 14記載の治療または予防薬。

16. 前記疾患がストレス性疾患である、請求項 13記載の治療または予防薬。

17. 前記ストレス性疾患が鬱である、請求項 16に記載の治療または予防薬。

18. Xがー（CH₂) ₂—で、 R¹が水素原子であるか、または、 Xが— CH₂ 一で、 R¹が水素原子である、請求項 17記載の治療または予防薬。

19. 熱ショック因子活性阻害作用、または熱ショックエレメント配列を転写調節に働く遺伝子領域に有する、構造遺伝子によりコードされる物質の発現抑制作用を示す、ストレス性疾患の治療または予防薬。