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WO1999061661A1 - Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre - Google Patents

Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre Download PDF

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WO1999061661A1
WO1999061661A1 PCT/FR1999/001247 FR9901247W WO9961661A1 WO 1999061661 A1 WO1999061661 A1 WO 1999061661A1 FR 9901247 W FR9901247 W FR 9901247W WO 9961661 A1 WO9961661 A1 WO 9961661A1
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WO
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primer
amplification
blocking
nucleotide
hla
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/001247
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English (en)
Inventor
Bruno Mougin
Ali Laayoun
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP99922230A priority patent/EP1082461A1/fr
Priority to AU39355/99A priority patent/AU3935599A/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a new method for amplifying at least one particular nucleotide sequence of a synthetic or natural nucleic acid contained in a reaction mixture. It also relates to primers allowing such amplification.
  • the state of the art describes methods for amplifying nucleotide sequences using primers specific for these sequences to be amplified.
  • a gene or a family of genes can be amplified within a preparation of nucleic acids.
  • Many techniques use oligonucleotides complementary to the target sequence serving as primers for elongation by a polymerase.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR Liigase Chain Reaction
  • RCR Repair Chain Reaction
  • the risks of obtaining truncated amplification products and of the difficulties in obtaining primers specific for the nucleotide sequence to be amplified are overcome, since it is possible to specifically amplify the nucleotide sequence of interest. under standard hybridization conditions.
  • primers Two complementary types of primers are used, on the one hand, a type of primers which hybridizes indifferently on all related nucleotide sequences and, on the other hand, a type of primers or each primer s 'hybrid on only one of these related sequences.
  • the first, which are non-specific, will serve as primers for elongation
  • the second, specific for nucleotide sequences related to the sequence of interest will serve as primers for blocking the elongation of some of these sequences. related nucleotides.
  • the present invention relates to a method for amplifying at least one particular nucleotide sequence of a synthetic or natural nucleic acid contained in a reaction mixture, the reaction mixture consisting of at least one nucleic acid comprising at least at least two related nucleotide sequences and / or at least two nucleic acids each comprising at least one related nucleotide sequence; the method using at least one type of amplification primers capable of hybridizing with the nucleic acid to allow the amplification of the related nucleotide sequences, characterized in that it consists in adding, to the reaction mixture, at least a sequence, acting as a blocking primer, which is capable of:
  • nucleotide sequence which is not the particular nucleotide sequence (s) to be amplified
  • the blocking primer or primers are capable of hybridizing to the nucleotide sequence (s), which are not the particular nucleotide sequence (s) to be amplified.
  • each blocking primer is an oligonucleotide based on deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides and / or modified nucleotides, such as PNAs or thiophosphate nucleotides.
  • each blocking primer has at least one element which prevents amplification.
  • the element which prevents amplification, is located at the 3 'end of the blocking primer and does not allow its elongation.
  • another element which prevents amplification, is located at the 5 'end of the blocking primer and acts as a protective element.
  • Each element, which prevents amplification consists of:
  • nucleotide, the modified nucleotide or the oligonucleotide does not hybridize to the nucleic acid, - or by a molecule, different from a nucleotide or a modified nucleotide.
  • the element consists of at least five, in particular at least ten and preferably at least fifteen nucleotides, modified nucleotides or a mixture of nucleotide (s) and modified nucleotide (s).
  • the element is constituted by a modified nucleotide or nucleotide or by an oligonucleotide comprising or not comprising at least one modified nucleotide; the nucleotide, the modified nucleotide or the oligonucleotide does not hybridize to the nucleic acid, the element is long enough to allow the formation of a loop and of hybridization between the nucleotides and / or the modified nucleotides, that make up this loop
  • the element in the case where the element is constituted by a modified nucleotide or nucleotide or by an oligonucleotide comprising or not comprising at least one modified nucleotide; the nucleotide, the modified nucleotide or the oligonucleotide does not hybridize to the nucleic acid, the element consists of a "tail" of polynucleotides and / or modified polynucleotides, which all have the same bases.
  • the element is substituted for the hydrogen atom of the hydroxyl group or the hydroxyl group, placed in position 3 'of ribose, itself located at the 3' end of the nucleic acid.
  • the element is:
  • FIG. 1 represents a schematic view in principle of an amplification of a strand of nucleic acid and of its complementary strand by means of two primers, in this case which is the simplest, there is one primer per strand .
  • FIG. 2 represents a schematic view in principle of an amplification according to FIG. 1 but using the technique exposed by the present invention.
  • FIG. 3 represents the different substitutions which can be made on the nucleotides of the blocking primer where: - RI is an element which is found at the 3 ′ end of the blocking primer and which prevents any elongation during the amplification,
  • - R2 is an element which can be found on at least one of the 2 ′ positions of the ribose of a nucleotide of the blocking primer and which enhances the stability of the blocking primer duplex
  • - nucleic acid, and - R3 is an element which is at the 5 'end of the blocking primer and which acts as a protective element.
  • FIG. 4 represents the positioning of the RI element at the 3 ′ end of the blocking primer when said primer is hybridized to the nucleic acid.
  • FIG. 5 represents the positioning of the element R3 at the 5 ′ end of the blocking primer when said primer is hybridized to the nucleic acid.
  • FIG. 6 represents the blocking primer duplex - nucleic acid where X represents a nucleotide of the blocking primer comprising the element R2 which enhances the stability of the duplex, in position on the ribose of this nucleotide.
  • FIG. 7 shows different structures which, by adding the blocking primer in position 3 ′, prevent any elongation during amplification.
  • FIG. 8 represents different structures which, by adding in the 5 ′ position of the blocking primer, in addition to the modifications in the 3 ′ position, as shown in FIG. 3, act as a protective element by preventing degradation or ejection of the blocking primer during amplification.
  • FIG. 9 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample from a lymphoblastoid line HLA-DRB 1 * 1301 and HLA-DRB3 * 01, observed for the region coding for amino acids 56 to 65 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes without the use of a blocking primer.
  • FIG. 9 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample from a lymphoblastoid line HLA-DRB 1 * 1301 and HLA-DRB3 * 01, observed for the region coding for amino acids 56 to 65 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes without the use of a blocking primer.
  • FIG. 10 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample from an HLA- lymphoblastoid line DRB1 * 1301 and HLA-DRB3 * 01, observed for the region coding for amino acids 56 to 65 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes with the use of a 5 '-phosphate / 3'-C 6 oligonucleotide -NH 2 inhibiting the amplification of the HLA-DRB3 gene.
  • FIG. 11 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample from a lymphoblastoid line HLA-DRB 1 * 0901 and HLA-DRB4 * 01, observed for the region coding for amino acids 29 to 47 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes without the use of a blocking primer.
  • FIG. 11 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample from a lymphoblastoid line HLA-DRB 1 * 0901 and HLA-DRB4 * 01, observed for the region coding for amino acids 29 to 47 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes without the use of a blocking primer.
  • FIG. 12 represents the electropherogram corresponding to the result of the sequence reaction of a DNA sample of a lymphoblastoid line HLA-DRB1 * 0901 and HLA-DRB4 * 01, observed for the region coding for amino acids 29 to 47 (according to the official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes with the use of an oligonucleotide 5'-acridine / 3'-H inhibiting the amplification of the HLA-DRB4 gene.
  • FIG. 13 represents a schematic view of the principle of a selective amplification of a gene in a family of related genes located on the same chromosome.
  • the present invention therefore relates, among other things, to the use of oligonucleotide primers modified at their ends, for the selective amplification of genes.
  • the invention also relates to a method using modified oligonucleotide primers for the selective amplification of certain genes present in a set of related genes.
  • genes of interest are facilitated by the use of gene amplification techniques, which make it possible to prepare, from a biological sample, quantities of specific material that can easily be analyzed with conventional techniques of molecular biology.
  • gene amplification techniques which make it possible to prepare, from a biological sample, quantities of specific material that can easily be analyzed with conventional techniques of molecular biology.
  • oligonucleotide primers, bounding a gene region leads to the obtaining of a mixture of nucleotide molecules considerably enriched in the molecule of interest, which then becomes easily detectable by electrophoretic analysis techniques or molecular hybridization techniques.
  • the effectiveness of this approach lies in the use of oligonucleotide primers specific for the gene regions to be analyzed. These primers must therefore be oligonucleotide sequences capable of selectively hybridizing with the nucleic sequences of interest, present in the sample.
  • the present invention therefore consists in combining the use of specific oligonucleotide primers for the amplification of a limited set of structurally close genes, and modified oligonucleotide primers capable of specifically blocking unwanted genes.
  • each type of these modified primers has only one type of unwanted gene.
  • This strategy simplifies the analysis of mixed genes, by determining their nucleotide sequence (by gel sequencing for example or by sequencing by multiple hybridization - DNA Chip -) or by the analysis of mutations.
  • the invention claims the use of mixtures of nucleotide primers allowing the effective amplification of corresponding nucleic regions, and of blocking nucleotide primers, overlapping or located downstream (relative to the nucleotide primer allowing amplification), consisting oligonucleotides which cannot serve as initiator sequences for elongation and therefore for amplification of the downstream sequences.
  • the non-blocking primer and the blocking primer hybridize on the same strand for a given primer polarity (primers 5 'upstream, or primers 3' downstream of the region to analyze).
  • the non-blocking primer if it succeeds in hybridizing on the strand to be amplified, cannot generate amplicons beyond the region corresponding to the site of hybridization of the blocking primer, rendering ineffective the amplification corresponding to the non-blocking primer.
  • This principle illustrated in Figures 1, 2 and 13, relates to the operation of blocking primers and non-blocking primers. According to FIG. 1, an amplification is carried out with non-blocking primers PI and
  • the primers PI and P2 are extended and multiple amplicons A are obtained.
  • FIGS. 1 and 2 are used exactly since it is a selective amplification of the G gene by blocking the related genes Gl and G3 by specific blocking primers and non-specific amplification primers.
  • the invention claims the use of blocking primers comprising modified nucleotides. This principle is illustrated in FIGS. 3 to 6. According to FIG. 3, the nucleotide can be modified at the 2 'or 3' positions of the ribose, at the 3 'end of the oligonucleotide and at the 5' position ribose at the 5 'end of said oligonucleotide.
  • the RI group substitutes, in the 3 ′ position of the ribose, hydroxyl and makes it possible to prevent the elongation of the 3 ′ end of the primer by the polymerase, when the nucleic acid - blocking primer duplex is formed.
  • the R3 group substitutes, in the 5 ′ position of the ribose, the phosphate and makes it possible to protect the blocking primer from degradation of the 5 ′ end and / or displacement of the blocking primer, during the elongation of the amplification primer.
  • the nucleic acid-blocking primer duplex can be reinforced by substitution of hydroxyl or hydrogen in position 2 ′ of ribose, this substitution can be made on several nucleotides of the blocking primer.
  • the group R2 can be, for example, a 2 ′ O-methyl radical, which stabilizes the DNA-RNA duplexes, by creating a hydrophobic interaction.
  • the claimed strategy finds multiple applications whenever a mixture of related sequences is to be analyzed: human or animal genetics, analyzes of infectious agents (viruses, bacteria, parasites, ...)
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA genes Within this set of MHC genes more commonly called “HLA genes”, some are now well known, both their nucleic sequence and the functions of the corresponding proteins. These are essentially the so-called class I HLA genes (HLA-A, HLA-B, HLA-Cw) and the so-called class II HLA genes (HLA-DR,
  • HLA-DQ and HLA-DP HLA-DQ and HLA-DP. These genes participate in the regulation of the immune response at the level of monitoring the integrity of the self, with different consequences in the medical field.
  • a first application concerns the field of organ or bone marrow transplants, and numerous studies have demonstrated the importance of an optimal apartment between the organ donor (s) and the recipient, for the HLA genes therefore involved in histocompatibility.
  • a second application relates to the study of the susceptibility of each individual to develop certain pathologies induced by infectious agents (viruses, bacteria, parasites) or by other mechanisms which are still poorly understood (case of autoimmune diseases for example).
  • infectious agents viruses, bacteria, parasites
  • the HLA genes then participate in the development of the very great diversity of the immune response, observed at the level of each individual, for a given ethnic group.
  • the determination of HLA gene alleles allow precise characterization or identification of any individual, constituting a third area of application of HLA typing.
  • HLA-A typing is based on the selective analysis of the two alleles of the HLA-A gene observed in an individual, avoiding the analysis of the structurally close genes HLA-B and HLA-Cw. It is therefore essential to be able to specifically amplify the related regions observed for the HLA-A gene, by using nucleotide primers capable of hybridizing only with the regions targeted on this gene.
  • HLA-DR typing Another example concerns HLA-DR typing, where the analysis of polymorphism only concerns the HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 and HLA-DRB5 genes which correspond to the genes coding for the polypeptide chains constituting the functional proteins. expressed on the cell surface, avoiding the co-amplification and analysis of the pseudogens HLA-DRB2, HLA-DRB6, HLA-DRB7, HLA-DRB8 and HLA-DRB9.
  • HLA-DR typing illustrates the great complexity of the mixture of nucleic acid sequences to identify encountered for a given sample, and the presence of two alleles for each of the genes further increases the difficulty, sometimes making the interpretation of the results very delicate ( typing ambiguities).
  • HLA-DR typing it may turn out that the simplification of the analysis can be very beneficial, by restricting it only to the analysis of the HLA-DRB 1 gene (with its two alleles for each individual), if the molecular analysis techniques used call for the determination of signal intensity (fluorescence intensity for molecules of increasing size for sequencing) or the interpretation of reactivity profiles for oligoprobe hybridization , for example.
  • This objective can be achieved by selecting specific amplification nucleotide primers HLA-DRB 1, but this approach is not always possible because of the nucleic sequences observed for the different alleles of the HLA- gene. DRB1 and sequences of the other HLA-DRB genes which share a great homology.
  • An alternative consists of the present invention, and is based on the use of a mixture of primers specific for the HLA-DRB genes but not specific for the HLA-DRB 1 gene, and blocking primers specific for the HLA-DRB3 genes, HLA -DRB4 and HLA-DRB 5. This therefore results in a selective amplification of the HLA-DRB 1 genes, allowing easier determination of the two HLA-DRB 1 alleles observed for a given individual.
  • the nucleotide primers are synthesized according to traditional methods such as those using solid phase synthesis for example, and unless otherwise indicated, contain a -OH residue in 3 ′ on the sugar (3 -OH) allowing their elongation during step d 'amplification. They are essentially oligonucleotides of length between 10 and 30 seas, depending on the applications, this depending on the nucleic sequences considered.
  • the blocking nucleotide primers are prepared according to the methods mentioned above and contain a functional group, which inhibits elongation, located at the 3 ′ end of the oligoncucleotide.
  • the object of this blocking function is to prevent the addition, by DNA polymerase, of the following base according to the information read on the complementary sequence.
  • this functional group blocking at 3 ′ may be a phosphate-alkylamine (C 6 -NH 2 ), phosphate or dabcyl group, see on this subject FIG. 7. These groups protect the hydroxyl function (3'- OH) and thus block its reactivity during polynucleotide polymerization catalyzed by DNA polymerase.
  • the blocking of the enzymatic polymerization can also be obtained by dehydroxylation from the 3 'position.
  • primers containing 3'-H, 2'-OH ends can be obtained using appropriate reagents and the oligonucleotide assembly technique on solid support.
  • the acridine nucleus is a powerful intercalator, thus giving the primer - target sequence duplex very great stability and preventing displacement of the primer.
  • Dimethoxytrityl (DMT) used as a protecting group for the 5'-hydroxyl end, the thiophosphate group used in the antisense strategy, and an additional sequence capable of forming a secondary "stem-loop" structure protect the primer from possible degradation by exonuclease activity.
  • the principle of using mixtures of non-blocking primers and blocking primers can be used for the 3 'end (downstream), or for the 3' end and for the 5 'end (upstream of the region to be analyzed), according to the characteristics of the nucleic sequences or according to the complexity of the genes of the region to be analyzed.
  • This amplification approach using blocking primers can also be applied for simple amplification strategies corresponding to a mixture of primers capable of hybridizing to the same nucleic sequence to be analyzed, or in multiplex corresponding to several mixtures of primers capable of hybridizing during the same amplification reaction on different nucleic sequences to be analyzed (different loci, different genes or different gene regions).
  • HLA-DRB genes can code for an HLA-DR ⁇ polypeptide chain: HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 and HLA-DRB5.
  • the organization of this set of functional genes transmitted in a hereditary manner varies according to the individuals, who therefore have different conserved haplotypes. If the presence of a HLA-DRB 1 gene is still observed, the presence of one or two other genes (HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5) is optional, depending on the HLA-DRB 1 allele carried by the same chromosome.
  • HLA-DRB 1 alleles due to the presence of the two haplotypes (one inherited from the mother, the other from the father), the complexity of the mixture of HLA-DRB sequences to be analyzed is very variable. The analysis of the main information associated with the HLA-DRB 1 alleles can therefore be difficult to interpret depending on the presence or not of other HLA-DRB genes, such as HLA-DRB3 for example.
  • HLA-DRB 1 alleles (184 registered in the 1997 nomenclature, Nomenclature for factors of the HLA system, 1996, Tissue Antigens, 49, 3-II, March 1997) without amplifying the HLA-DRB3 alleles possibly present (1 or 2 possible alleles among the 11 alleles registered in the 1997 nomenclature).
  • oligonucleotide 5858 SEQ ID 3
  • SEQ ID 4 an oligonucleotide comprising a modified 3 'end comprising an -H and a modified 5' end comprising an acridine
  • the DNAs were extracted according to conventional cell lysis and proteinase K digestion techniques, then purified by ethanolic precipitation after phenolic extraction.
  • the DNA solutions (concentration adjusted to 100 ng / ⁇ l of H 2 O) are stored at 2-8 ° C.
  • the amplification products obtained were checked by analyzing an aliquot part (5 ⁇ l) by electrophoresis in agarose gel then staining with ethidium bromide. After this control, the amplicons prepared were analyzed with the bioMérieux HLA-DR oligodetection typing kit (ref. 74,500). This test makes it possible to determine the HLA-DR typing by reverse hybridization technique in microplates, by detection and analysis of the HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 and HLA-DRB5 alleles (PCT / FR92 / 00702). DRB3 blocking with oligo 5'-phosphate / 3'-C 6 -NH 2 :
  • DNA OMW line (ECCAC 9058), DRB1 * 1301, DRB3 * 01
  • HLA-DRB primer oligonucleotide 5867, SEQ ID NO 1
  • Probes 13 and 3 + 6 are specific for the DRB1 gene, and probe 52a is specific for the DRB3 gene.
  • the addition of oligonucleotide 5858 during amplification inhibits the amplification of the DRB3 gene, without affecting the amplification of the DRB1 gene. This inhibition is dose dependent, and total inhibition is observed for a concentration of DRB3 blocking oligonucleotide of 0.6 ⁇ M and more.
  • the amplification products obtained with or without blocking of the DRB3 gene were sequenced using the ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready kit. Reaction (perkin-Elmer ref. 4303152). The electroporegrams for the reverse reaction are reported below, for the test without blocking and for the test with blocking with 0.9 ⁇ M of oligonucleotide 5858.
  • the assembly of the electrophoregrams concerning the region coding for amino acids 56 to 65 (official HLA nomenclature) of the HLA-DRB genes illustrates the inhibition of the amplification of the HLA-DRB3 gene (FIGS. 9 and 10).
  • DRB3 specific blocking primer oligonucleotide 5858, 3'-
  • DNA OMW line (ECCAC 9058), DRB1 * 1301, DRB3 * 01
  • HLA-DRB primer oligonucleotide 5867, SEQ ID NO 1: 0.1 ⁇ M final 3' generic HLA-DRB primer (oligonucleotide P2, SEQ ID NO 2): 0.1 ⁇ M final 5 'blocking HLA-DRB3 primer (oligonucleotide 5967 , SEQ ID NO 4): 0, 0.3, 0.6,
  • Table 3 hybridization signals of the blocking primer 5967 to different target sequences as a function of its concentration
  • oligonucleotide 5967 inhibits the amplification of the DRB3 gene, without affecting the amplification of the DRB1 gene. This inhibition is dose dependent, and total inhibition is observed for a concentration of DRB3 blocking oligonucleotide of 0.3 ⁇ M and more.
  • Example 1 DNA line T7526 (ECCAC 9076), DRB1 * 0901, DRB4 * 01 Generic HLA-DRB primer 5 '(oligonucleotide 5867, SEQ ID NO 1) 0 1 ⁇ M final HLA primer - generic 3 'DRB (P2 oligonucleotide, SEQ ID NO 2) 0 1 ⁇ M final 5' blocking HLA-DRB4 primer (oligonucleotide 5965, SEQ ID NO 5) 0, 0 3, 0 6, 0 9, 1 2 ⁇ M final
  • Table 4 hybridization signals of the blocking primer 5965 to different target sequences according to its concentration The calculation of the ratio of the value read for 0.6 ⁇ M / the value read without blocking makes it possible to assess the inhibition of the amplification of the DRB4 gene.
  • Probe 9 is specific for the DRB1 gene, and probe 53 is specific for the DRB4 gene.
  • the addition of oligonucleotide 5965 during amplification inhibits the amplification of the DRB4 gene, without affecting the amplification of the DRB 1 gene. This inhibition is dose dependent, and total inhibition is observed for a concentration of oligonucleotide
  • the amplification products obtained with or without blocking of the DRB4 gene were sequenced using the ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready kit.
  • the assembly of the electrophoregrams concerning the region coding for amino acids 29 to 47 (HLA official nomenclature) of the HLA-DRB genes illustrates the inhibition of the amplification of the HLA-DRB4 gene (FIGS. 1 1 and 12).
  • DRB4 specific blocking primer oligonucleotide 5965, 3'- C ⁇ -NH 2
  • DRB4 specific blocking primer oligonucleotide 5965, 3'- C ⁇ -NH 2
  • the present invention can be applied to high-resolution HLA-DRB 1 typing, the specific blocking of the specific amplification of the HLA-DRB3, - DRB4, -DRB5 genes and the HLA-DRB2, -DRB6, -DRB7, -DRB8 pseudogenes. and -DRB9 by the use of blocking primers reducing the analysis to a mixture of one (in the case of a homozygous sample) or of two nucleotide sequences (in the case of a heterozygous sample).
  • HLA-DRB3 blocking primers oligonucleotides 5816 (SEQ ID NO 6), 5868 (SEQ ID NO 7), 5885 (SEQ ID NO 8) as examples
  • specific HLA-DRB4 primers oligonucleotides
  • Complete blocking of the HLA-DRB3, -DRB4 and -DRB5 genes can be achieved using a mixture of blocking primers.
  • i inosine
  • Table 5 nucleotide sequence of the oligonucleotides used as primers for amplification
  • Inosine an unnatural base, is used to weaken the nucleic acid hybrid - blocking primer.
  • Inosine is linked to its nucleotide complementary by two hydrogen bonds and therefore when substituted for a pyrimidine, the bond between the two strands, at its level, is weaker. Since a gene can vary from other genes related by a single base, it is advantageous to substitute on the blocking primer, complementary to the gene, the bases around this crucial position with inosines. The duplex nucleic acid - blocking primer thus becoming weakened, there can be hybridization only if the primer is perfectly complementary to the target gene sequence. This reinforces the specificity of the blocking primer.
  • the present invention therefore relates to a method for the selective amplification of genes present in a mixture of related genes, by using blocking oligonucleotide primers corresponding to oligonucleotides comprising a modified 3 ′ end which does not allow their elongation during the enzymatic amplification steps target genes.
  • the invention also relates to the use of blocking primers in the sense described in claim 1, comprising a modified 5 ′ end which does not allow their displacement or their degradation, during the steps of enzymatic amplification of the target genes by a specific primer d 'a region located more in 5' on the same gene.
  • the modification at the end 5 is optional. Thus, two different possibilities exist.
  • the group -OH at 3 ′ is replaced by a group naturally not found in nature, such as a group -H, - phosphate, -dabcyl, or a carbon chain terminated by a group -NH 2 , as examples.
  • the 5 'phosphate group is replaced by a group naturally not found in nature, such as a group -DMT, acridine, -thiophosphate, or a "stem-loop" structure, as 'examples.
  • the blocking primers can also comprise modifications of the oligonucleotide in non-terminal position and are used in order to promote their hybridization on their target sequences.
  • the blocking primers as described above, are capable of hybridizing on the coding strand or on the complementary strand (use of 5 ′ blocking primers or 3 ′ blocking primers).
  • blocking primers is particularly advantageous for the methods of amplification of the target sequences, such as for example PCR, TMA or any other technique.
  • the invention relates to the use of one or more blocking primers for the inhibition of the amplification of the HLA-DRB3, -DRB4 and -DRB5 genes, chosen from those which are defined by the sequences SEQ ID Nos: 3 to 19, and their complementary.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique particulière d'un acide nucléique de synthèse ou naturel contenu dans un mélange réactionnel, le mélange réactionnel étant constitué d'au moins un acide nucléique comportant au moins deux séquences nucléotidiques apparentées et/ou d'au moins deux acides nucléiques comportant chacun au moins une séquence nucléotidique apparentée; le procédé utilisant des amorces d'amplification capables de s'hybrider avec l'acide nucléique pour permettre l'amplification des séquences nucléotidiques apparentées. L'invention concerne également des amorces permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé. Ce procédé consiste à ajouter, dans le mélange réactionnel, au moins une séquence, faisant office d'amorce de blocage, qui est capable: de s'hybrider à au moins une séquence nucléotidique, qui n'est pas la ou les séquences nucléotidiques particulières à amplifier, et d'empêcher à son niveau l'élongation de l'amorce d'amplification. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine des techniques d'amplification de gènes apparentés.

Description

Procédé d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique particulière et amorces de mise en œuvre
La présente invention concerne un nouveau procédé d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique particulière d'un acide nucléique de synthèse ou naturel contenu dans un mélange réactionnel. Elle concerne également des amorces permettant une telle amplification.
L 'état de la technique décrit des méthodes permettant d'amplifier des séquences nucléotidiques utilisant des amorces spécifiques de ces séquences à amplifier. Ainsi on peut amplifier un gène ou une famille de gènes au sein d'une préparation d'acides nucléiques. De nombreuses techniques utilisent des oligonucléotides complémentaires de la séquence cible servant d'amorces pour l 'élongation par une polymérase.
Pour l 'amplification des ADN, il existe la PCR (Polymérase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,I95, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EPA-0.201.184, ou la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069.
Pour l 'amplification des ARN, plusieurs techniques ont aussi été décrites dans différents documents. Ces techniques sont les suivantes :
- 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A- 90/06995,
- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818,
- SPSR (Single Primer Séquence Replication) avec le brevet US-A-5, 194,370, et
- 1MA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491. Cependant, ces techniques imposent un choix rigoureux des amorces d'amplification. En effet, des amorces peu spécifiques de la séquence d'intérêt vont permettre l'amplification de nombreuses séquences apparentées sur lesquelles elles se seront fixées. L'amplicon correspondant à la séquence d'intérêt se retrouvera donc dilué dans un mélange d'amplicons, ce qui ne facilitera pas l'utilisation de ce produit d'amplification. Dans ces conditions, s'impose alors le choix rigoureux d'une région de la séquence nucléotidique qui soit suffisamment spécifique pour permettre de produire une amorce complémentaire tout aussi spécifique. Toutefois, d'autres problèmes peuvent apparaître lors du choix de la séquence à utiliser pour l'hybridation de l'amorce. En effet, il arrive que la région réellement spécifique soit unique et se trouve à l'intérieur de la séquence d'intérêt. Le choix d'hybrider une amorce au niveau d'une telle région implique de n'obtenir qu'une fraction plus ou moins importante de ladite séquence d'intérêt. On a donc une perte d'information. De plus, l'obtention d'une amorce spécifique de la séquence nucléotidique d'intérêt apporte un surcroît important de difficulté et de travail.
Avec la présente invention, on s'affranchit des risques d'obtention de produits d'amplification tronqués et des difficultés à obtenir des amorces spécifiques de la séquence nucléotidique à amplifier, puisqu'il est possible d'amplifier spécifiquement la séquence nucléotidique d'intérêt dans des conditions d'hybridation classiques.
Pour ce faire, on utilise deux types d'amorces complémentaires, d'une part, un type d'amorces qui s'hybride indifféremment sur toutes les séquences nucléotidiques apparentées et, d'autre part, un type d'amorces ou chaque amorce s'hybride sur une seule de ces séquences apparentées. Les premières, qui sont non-spécifiques, vont servir d'amorces pour l'élongation, les secondes, spécifiques de séquences nucléotidiques apparentées à la séquence d'intérêt, vont servir d'amorces de blocage de l'élongation de certaines de ces séquences nucléotidiques apparentées.
Dans le cas où on utilise un mélange d'amorces non spécifiques et spécifiques, selon le choix du type de séquences spécifiques utilisées, on peut empêcher l'élongation de certaines séquences non spécifiques. Il est alors possible de sélectionner les amplicons que l'on obtient.
Ainsi, on peut bloquer l'amplification de certaines séquences apparentées que l'on ne souhaite pas amplifier, par l'intermédiaire d'un ajout de séquences complémentaires, spécifiques de ces séquences apparentées, séquences complémentaires spécifiques qui font office d'amorces de blocage. Ainsi on isole la ou les séquences d'intérêt qui va ou vont être amplifiées sélectivement. On obtient donc un seul amplicon pour chaque séquence d'intérêt pour laquelle aucune amorce de blocage n'a été ajoutée. A cet effet, la présente invention concerne un procédé d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique particulière d'un acide nucléique de synthèse ou naturel contenu dans un mélange réactionnel, le mélange réactionnel étant constitué d'au moins un acide nucléique comportant au moins deux séquences nucléotidiques apparentées et/ou d'au moins deux acides nucléiques comportant chacun au moins une séquence nucléotidique apparentée ; le procédé utilisant au moins un type d'amorces d'amplification capables de s'hybrider avec l'acide nucléique pour permettre l'amplification des séquences nucléotidiques apparentées, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter, dans le mélange réactionnel, au moins une séquence, faisant office d'amorce de blocage, qui est capable :
- de s'hybrider à au moins une séquence nucléotidique, qui n'est pas la ou les séquences nucléotidiques particulières à amplifier, et
- d'empêcher à son niveau l'élongation de l'amorce d'amplification.
Préférentiellement, la ou les amorces de blocage sont capables de s'hybrider à la ou à toutes les séquences nucléotidiques, qui ne sont pas la ou les séquences nucléotidiques particulières à amplifier.
Premièrement, dans le cas d'une amorce de blocage utilisée dans un procédé d'amplification, tel que décrit ci-dessus, chaque amorce de blocage est un oligonucléotide à base de désoxyribonucléotides et/ou de ribonucléotides et/ou de nucléotides modifiés, tels que des PNA ou des nucléotides thiophosphates.
Deuxièmement, dans le cas d'une amorce de blocage utilisée dans un procédé d'amplification, tel que décrit ci-dessus, chaque amorce de blocage comporte au moins un élément qui empêche l'amplification.
Ainsi, l'élément, qui empêche l'amplification, est situé à l'extrémité 3' de l'amorce de blocage et ne permet pas son élongation.
De plus, un autre élément, qui empêche l'amplification, est situé à l'extrémité 5' de l'amorce de blocage et fait office d'élément protecteur.
Chaque élément, qui empêche l'amplification, est constitué :
- soit par un nucleotide ou nucleotide modifié ou par un oligonucléotide comportant ou non au moins un nucleotide modifié ; le nucleotide, le nucleotide modifié ou l' oligonucléotide ne s'hybride pas sur l'acide nucléique, - soit par une molécule, différente d'un nucleotide ou d'un nucleotide modifié.
Dans ce cas, l'élément est constitué par au moins cinq, notamment au moins dix et préférentiellement au moins quinze nucléotides, nucléotides modifiés ou un mélange de nucléotide(s) et de nucléotide(s) modifié(s). Selon un premier mode de réalisation et dans le cas où l'élément est constitué par un nucleotide ou nucleotide modifié ou par un oligonucléotide comportant ou non au moins un nucleotide modifié ; le nucleotide, le nucleotide modifié ou l' oligonucléotide ne s'hybride pas sur l'acide nucléique, l'élément est suffisamment long pour permettre la formation d'une boucle et d'une hybridation entre les nucléotides et/ou les nucléotides modifiés, qui constituent cette boucle
Selon un second mode de réalisation et dans le cas où l'élément est constitué par un nucleotide ou nucleotide modifié ou par un oligonucléotide comportant ou non au moins un nucleotide modifié ; le nucleotide, le nucleotide modifié ou l' oligonucléotide ne s'hybride pas sur l'acide nucléique, l'élément est constitué d'une " queue " de polynucléotides et/ou de polynucléotides modifiés, qui comporte tous les mêmes bases.
Dans le cas d'une amorce de blocage utilisée dans un procédé d'amplification comportant un élément qui ne permet pas l'élongation, l'élément est substitué à l'atome d'hydrogène du groupement hydroxyle ou au groupement hydroxyle, placé en position 3' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 3' de l'acide nucléique. Dans le cas d'une amorce de blocage utilisée dans un procédé d'amplification comportant, en plus, un élément protecteur, l'élément est :
- substitué au phosphate placé en position 5' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 5' de l'acide nucléique, ou
- greffé sur le phosphate, placé en position 5' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 5' de l'acide nucléique.
Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif.
La figure 1 représente une vue schématique de principe d'une amplification d'un brin d'acide nucléique et de son brin complémentaire par l'intermédiaire de deux amorces, dans ce cas qui est le plus simple, il y a une amorce par brin. La figure 2 représente une vue schématique de principe d'une amplification selon la figure 1 mais utilisant la technique exposée par la présente invention.
La figure 3 représente les différentes substitutions qui peuvent être réalisées sur les nucléotides de l'amorce de blocage où : - RI est un élément qui se trouve à l'extrémité 3' de l'amorce bloquante et qui empêche toute élongation lors de l'amplification,
- R2 est un élément qui peut se trouver sur au moins une des positions 2' du ribose d'un nucleotide de l'amorce bloquante et qui renforce la stabilité du duplex amorce bloquante
- acide nucléique, et - R3 est un élément qui se trouve à l'extrémité 5' de l'amorce bloquante et qui fait office d'élément protecteur.
La figure 4 représente le positionnement de l'élément RI à l'extrémité 3' de l'amorce de blocage lorsque ladite amorce est hybridée à l'acide nucléique.
La figure 5 représente le positionnement de l'élément R3 à l'extrémité 5' de l'amorce de blocage lorsque ladite amorce est hybridée à l'acide nucléique.
La figure 6 représente le duplex amorce de blocage - acide nucléique où X représente un nucleotide de l'amorce de blocage comportant l'élément R2 qui renforce la stabilité du duplex, en position sur le ribose de ce nucleotide.
La figure 7 représente différentes structures qui, par ajout en position 3' de l'amorce bloquante, empêche toute élongation lors de l'amplification.
La figure 8 représente différentes structures qui, par ajout en position 5' de l'amorce bloquante, en complément des modifications en position 3', telles que représentées à la figure 3, font office d'élément protecteur en empêchant la dégradation ou l'éjection de l'amorce de blocage lors de l'amplification. La figure 9 représente l'électrophorégramme correspondant au résultat de la réaction de séquence d'un échantillon d'ADN d'une lignée lymphoblastoïde HLA- DRB 1*1301 et HLA-DRB3*01, observé pour la région codant pour les acides aminés 56 à 65 (selon la nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB sans utilisation d'amorce bloquante. La figure 10 représente l'électrophorégramme correspondant au résultat de la réaction de séquence d'un échantillon d'ADN d'une lignée lymphoblastoïde HLA- DRB1* 1301 et HLA-DRB3*01, observé pour la région codant pour les acides aminés 56 à 65 (selon la nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB avec utilisation d'un oligonucléotide 5 '-phosphate / 3'-C6-NH2 inhibant l'amplification du gène HLA- DRB3. La figure 11 représente l'électrophorégramme correspondant au résultat de la réaction de séquence d'un échantillon d'ADN d'une lignée lymphoblastoïde HLA- DRB 1*0901 et HLA-DRB4*01, observé pour la région codant pour les acides aminés 29 à 47 (selon la nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB sans utilisation d'amorce bloquante. La figure 12 représente l'électrophorégramme correspondant au résultat de la réaction de séquence d'un échantillon d'ADN d'une lignée lymphoblastoïde HLA- DRB1*0901 et HLA-DRB4*01, observé pour la région codant pour les acides aminés 29 à 47 (selon la nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB avec utilisation d'un oligonucléotide 5'-acridine / 3'-H inhibant l'amplification du gène HLA-DRB4. La figure 13 représente une vue schématique de principe d'une amplification sélective d'un gène dans une famille de gènes apparentés localisé sur un même chromosome.
La présente invention concerne donc, entre autre, l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques modifiées en leurs extrémités, pour l'amplification sélective de gènes.
L'invention concerne également une méthode utilisant des amorces oligonucléotidiques modifiées, pour l'amplification sélective de certains gènes présents dans un ensemble de gènes apparentés.
L'analyse de gènes d'intérêt est facilitée par l'utilisation de techniques d'amplification génique, qui permettent de préparer à partir d'un échantillon biologique, des quantités de matériel spécifique aisément analysable avec les techniques classiques de biologie moléculaire. Ainsi, l'emploi d'amorces oligonucléotidiques, bornant une région génique, conduit à l'obtention d'un mélange de molécules nucléotidiques considérablement enrichi en la molécule d'intérêt, qui devient alors facilement détectable par des techniques d'analyse électrophorétique ou des techniques d'hybridation moléculaire. L'efficacité de cette approche réside dans l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques spécifiques des régions géniques à analyser. Ces amorces doivent donc être des séquences oligonucléotidiques capables de s'hybrider sélectivement avec les séquences nucléiques d'intérêt, présentes dans l'échantillon.
L'analyse de gènes membres de familles de gènes structurellement proches, peut cependant être parfois délicate. La recherche de régions nucléotidiques uniques pour un gène donné permet d'atteindre la spécificité recherchée, mais cette approche peut parfois s'avérer être difficile voire impossible.
La présente invention consiste donc à combiner l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'un ensemble limité de gènes structurellement proches, et d'amorces oligonucléotidiques modifiées capables de bloquer spécifiquement les gènes indésirables. En fait, à chaque type de ces amorces modifiés correspond un seul type de gène indésirable.
Cette stratégie permet de simplifier l'analyse de gènes en mélange, par détermination de leur séquence nucléotidique (par séquençage en gel par exemple ou par séquençage par hybridation multiple - DNA Chip -) ou par l'analyse de mutations.
L'invention revendique l'utilisation de mélanges d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification effective de régions nucléiques correspondantes, et d'amorces nucléotidiques bloquantes, chevauchantes ou situées en aval (par rapport à l'amorce nucléotidique permettant l'amplification), constituées d'oligonucléotides ne pouvant servir de séquences initiatrices pour l'élongation et donc pour l'amplification des séquences en aval.
Ainsi, pour un gène ou un allèle indésirable, l'amorce non bloquante et l'amorce bloquante s'hybrident sur le même brin pour une polarité d'amorce donnée (amorces 5' en amont, ou amorces 3' en aval de la région à analyser). L'amorce non bloquante, si elle parvient à s'hybrider sur le brin à amplifier, ne peut générer des amplicons au-delà de la région correspondant au site d'hybridation de l'amorce bloquante, rendant inefficace l'amplification correspondant à l'amorce non bloquante. Ce principe, illustré sur les figures 1, 2 et 13, concerne le fonctionnement des amorces bloquantes et des amorces non bloquantes. Selon la figure 1, on réalise une amplification avec amorces non bloquantes PI et
P2. De manière tout à fait classique, l'extension des amorces PI et P2 s'opère et de multiples amplicons A sont obtenus.
Selon la figure 2, on reprend exactement la figure 1, puisqu'il s'agit d'une amplification avec amorces non bloquantes PI et P2. Néanmoins sur le brin complémentaire et en aval de la progression de l'élongation de l'amorce PI, on ajoute une séquence, faisant office d'amorce de blocage Plb, qui est capable de s'hybrider sur le brin complémentaire, et d'empêcher l'amplification à son niveau. Dans ce cas de figure, il n'y aura aucun amplicon produit.
Selon la figure 13, on reprend exactement les figures 1 et 2 puisqu'il s'agit d'une amplification sélective du gène G par blocage des gènes apparentés Gl et G3 par des amorces bloquantes spécifiques et des amorces d'amplification non spécifiques.
L'invention revendique l'utilisation d'amorces de blocage comprenant des nucléotides modifiés. Ce principe est illustré sur les figures 3 à 6. Selon la figure 3, le nucleotide peut être modifié sur les positions 2' ou 3' du ribose, au niveau de l'extrémité 3' de l' oligonucléotide et sur la position 5'du ribose au niveau de l'extrémité 5' dudit oligonucléotide.
Selon la figure 4, le groupement RI substitue, en position 3' du ribose, l'hydroxyle et permet d'empêcher l'élongation de l'extrémité 3' de l'amorce par la polymérase, lorsque le duplex acide nucléique - amorce bloquante est formé.
Selon la figure 5, le groupement R3 substitue, en position 5' du ribose, le phosphate et permet de protéger l'amorce bloquante d'une dégradation de l'extrémité 5' et/ou d'un déplacement de l'amorce bloquante, lors de l'élongation de l'amorce d'amplification. Selon la figure 6, le duplex acide nucléique - amorce bloquante peut être renforcé par substitution de l'hydroxyle ou de l'hydrogène en position 2' du ribose, cette substitution pouvant se faire sur plusieurs nucléotides de l'amorce bloquante. Le groupement R2 peut être, par exemple, un radical 2' O-méthyle, qui stabilise les duplex ADN - ARN, en créant une interaction de type hydrophobe.
La stratégie revendiquée trouve de multiples applications chaque fois qu'un mélange de séquences apparentées est à analyser : génétique humaine ou animale, analyses d'agents infectieux (virus, bactéries, parasites,...)
A titre d'exemple, des applications dans le domaine du typage HLA (pour Human Leukocyte Antigens) sont décrites ci-après. Ainsi, le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) comprend un ensemble de gènes situés sur le chromosome 6 chez l'homme, impliqués dans la régulation de la réponse immunitaire (Bodmer et al. Nomenclature for factors of the HLA System, 1996, Tissue Antigens, 1997, 49, 297-321). Un très grand polymorphisme est observé pour ces gènes, et un jeu bien particulier de versions (ou allèles) de chacun de ces gènes est observé pour chaque individu. Il est important de noter que tout individu possède deux allèles de chaque gène, hérités l'un de la mère, l'autre du père.
Au sein de cet ensemble de gènes du CMH plus couramment nommés "gènes HLA", certains sont désormais bien connus, tant leur séquence nucléique que les fonctions des protéines correspondantes. Il s'agit essentiellement des gènes HLA dits de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-Cw) et des gènes HLA dits de classe II (HLA-DR,
HLA-DQ et HLA-DP). Ces gènes participent à la régulation de la réponse immunitaire au niveau de la surveillance de l'intégrité du soi, avec différentes conséquences dans le domaine médical. Une première application concerne le domaine des greffes d'organes ou de moelle osseuse, et de nombreux travaux ont démontré l'importance d'un appartement optimal entre le donneur d'organe(s) et le receveur, pour les gènes HLA impliqués donc dans l'histocompatibilité. Une seconde application concerne l'étude de la susceptibilité de chaque individu à développer certaines pathologies induites par des agents infectieux (virus, bactéries, parasites) ou par d'autres mécanismes encore mal connus (cas des maladies auto-immunes par exemple). Les gènes HLA participent alors au développement de la très grande diversité de la réponse immunitaire, observée au niveau de chaque individu, pour un groupe ethnique donné. Enfin, la détermination des allèles des gènes HLA permet une caractérisation ou identification précise de tout individu, constituant un troisième domaine d'application du typage HLA.
Une des difficultés principales du typage HLA réside dans l'homologie structurelle observée pour ces gènes, ceux-ci ayant évolué à partir d'ancêtres communs. II en résulte que les gènes d'intérêt sont à analyser au sein d'un ensemble de gènes fonctionnels proches, ou de gènes non fonctionnels (pseudogènes). Il est donc essentiel de maîtriser le mieux possible le ciblage de l'analyse des séquences nucléiques, en optimisant les techniques d'amplification des régions à séquencer.
Par exemple, le typage HLA-A repose sur l'analyse sélective des deux allèles du gène HLA-A observés chez un individu, en évitant l'analyse des gènes structurellement proches HLA-B et HLA-Cw. Il est donc essentiel de pouvoir amplifier spécifiquement les régions apparentées observées pour le gène HLA-A, en utilisant des amorces nucléotidiques capables de s'hybrider uniquement avec les régions ciblées sur ce gène.
Un autre exemple concerne le typage HLA-DR, où l'analyse du polymorphisme ne concerne que les gènes HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA-DRB5 qui correspondent aux gènes codant pour les chaînes polypeptidiques constituant les protéines fonctionnelles exprimées à la surface des cellules, en évitant la co-amplification et l'analyse des pseudogènes HLA-DRB2, HLA-DRB6, HLA-DRB7, HLA-DRB8 et HLA-DRB9. L'exemple du typage HLA-DR illustre la grande complexité du mélange de séquences nucléiques à identifier rencontrées pour un échantillon donné, et la présence de deux allèles pour chacun des gènes accroît encore la difficulté, rendant parfois l'interprétation des résultats bien délicate (ambiguïtés de typage).
En prenant pour exemple le typage HLA-DR, il peut s'avérer que la simplification de l'analyse puisse être très bénéfique, en restreignant celle-ci uniquement à l'analyse du gène HLA-DRB 1 (avec ses deux allèles pour chaque individu), si les techniques d'analyse moléculaire employées font appel à la détermination d'intensité de signaux (intensité de fluorescence pour des molécules de tailles croissantes pour le séquençage) ou à l'interprétation de profils de réactivité d'hybridation d'oligosondes, par exemple. Cet objectif peut être atteint en sélectionnant des amorces nucléotidiques d'amplification spécifiques HLA-DRB 1, mais cette approche n'est pas toujours possible du fait des séquences nucléiques observées pour les différents allèles du gène HLA- DRBl et des séquences des autres gènes HLA-DRB qui partagent une grande homologie. Une alternative consiste en la présente invention, et repose sur l'utilisation d'un mélange d'amorces spécifiques des gènes HLA-DRB mais non spécifiques du gène HLA-DRB 1, et d'amorces bloquantes spécifiques des gènes HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA-DRB 5. Il en résulte donc une amplification sélective des gènes HLA-DRB 1, permettant la détermination plus facile des deux allèles HLA-DRB 1 observés pour un individu donné.
Les amorces nucléotidiques sont synthétisées selon les méthodes traditionnelles comme celles utilisant la synthèse en phase solide par exemple, et sauf indications contraires, comportent un résidu -OH en 3' sur le sucre (3 -OH) permettant leur élongation lors de l'étape d'amplification. Il s'agit essentiellement d'oligonucléotides de longueur comprise entre 10 et 30 mers, selon les applications, ceci dépendant des séquences nucléiques considérées.
Les amorces nucléotidiques bloquantes sont préparées selon les méthodes citées ci-dessus et contiennent un groupement fonctionnel, qui inhibe l'élongation, situé à l'extrémité 3' de l'oligoncucléotide. L'objet de cette fonction bloquante est d'empêcher l'addition par la DNA polymérase, de la base suivante selon l'information lue sur la séquence complémentaire. A titre d'exemple, ce groupement fonctionnel bloquant en 3' peut être un groupement phosphate-alkylamine (C6-NH2), phosphate ou dabcyl, voir à ce sujet la figure 7. Ces groupements protègent la fonction hydroxyle (3'-OH) et bloquent ainsi sa réactivité lors de la polymérisation polynucléotidique catalysée par la DNA polymérase. Le blocage de la polymérisation enzymatique peut être aussi obtenu par déshydroxylation de la position 3'. En effet, des amorces contenant des extrémités 3'-H, 2'-OH peuvent être obtenues en utilisant des réactifs appropriés et la technique d'assemblage oligonucléotidique sur support solide.
Si l'utilisation d'une amorce bloquante non chevauchante avec l'amorce non bloquante doit être envisagée, il peut être avantageux de protéger également extrémité 5' de l'amorce bloquante, afin que celle-ci ne soit ni dégradée par l'activité exonucléase de la polymérase, ni déplacée lors de l'élongation de l'amorce non bloquante située plus en amont (plus en 5') de la région à amplifier. Pour cela, différentes modifications peuvent permettre de maintenir l'intégrité de l'amorce bloquante hybridée sur la séquence nucléique à inactiver. Plusieurs possibilités peuvent être citées à titre d'exemples : le noyau acridine, le diméthoxytrityle (DMT), le groupement thiophosphate, une séquence additionnelle "tige-boucle". De telles modifications sont bien représentées à la figure 8.
Le noyau acridine est un intercalant puissant, il confère ainsi au duplex amorce - séquence cible une très grande stabilité et évite le déplacement de l'amorce. Le diméthoxytrityle (DMT) utilisé comme groupement protecteur de l'extrémité 5'- hydroxyle, le groupement thiophosphate utilisé dans la stratégie antisens, et une séquence additionnelle capable de former une structure secondaire "tige-boucle" protègent l'amorce d'une éventuelle dégradation par une activité exonucléasique.
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Tableau 1 : modifications des extrémités 3' (et) 5' des amorces bloquantes
Le principe d'utilisation de mélanges d'amorces non bloquantes et d'amorces bloquantes, peut être utilisé pour l'extrémité 3' (en aval), ou pour l'extrémité 3' et pour l'extrémité 5' (en amont de la région à analyser), selon les caractéristiques des séquences nucléiques ou selon la complexité des gènes de la région à analyser. Cette approche d'amplification utilisant des amorces bloquantes peut aussi être appliquée pour des stratégies d'amplification simple correspondant à un mélange d'amorces capables de s'hybrider sur une même séquence nucléique à analyser, ou en multiplex correspondant à plusieurs mélanges d'amorces capables de s'hybrider lors d'une même réaction d'amplification sur différentes séquences nucléiques à analyser (différents loci, différents gènes ou différentes régions de gène).
Exemple de synthèse d'amorces oligonucléotidiques bloquées en 3' et en 5' Les amorces oligonucléotidiques bloquées ont été synthétisées sur un appareil
Expidite (Perseptive Biosystems) selon la méthode au phosphoramidite par voie automatique conformément au protocole proposé par le constructeur. Les réactifs phosphoramidites nécessaires à l'introduction des modifications en 3' et en 5' ont été obtenus de chez Glenn Research. La purification des oligonucléotides est réalisée par HPLC en phase inverse
(colonne semi-préparative Beckman ODS 10 mm x 25 cm; C18; 5 μm de porosité; éluant: gradient de 30 min de 10 à 30% d'acétonitrile en mélange avec une solution aqueuse d'acétate de triéthylammonium 0,1 M à pH 7). Les fractions contenant F oligonucléotide sont collectées et séchées. Les différents oligonucléotides sont ensuite repris dans de l'eau pure et quantifiés par mesure de l'absoprption UV.
Pour illustrer le principe de la présente invention, deux exemples d'application dans le domaine HLA sont décrits ci-après.
Exemple 1 : blocage spécifique de l'amplification du gène HLA-DRB3
Plusieurs gènes HLA-DRB peuvent coder pour une chaîne polypeptidique HLA- DRβ : HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA-DRB5. L'organisation de cet ensemble de gènes fonctionnels transmis de façon héréditaire, varie selon les individus, qui présentent donc différents haplotypes conservés. Si la présence d'un gène HLA- DRB 1 est toujours observée, la présence de un ou deux autres gènes (HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5) est facultative, selon l'allèle HLA-DRB 1 porté par le même chromosome. Par ailleurs, du fait de la présence des deux haplotypes (un hérité de la mère, l'autre du père), la complexité du mélange des séquences HLA-DRB à analyser est très variable. L'analyse de l'information principale associée aux allèles HLA-DRB 1, peut donc être délicate à interpréter selon la présence ou non des autres gènes HLA-DRB, comme par exemple le HLA-DRB3. Il peut donc être avantageux de pouvoir amplifier tous les allèles possibles HLA-DRB 1 (184 inscrits à la nomenclature de 1997, Nomenclature for factors of the HLA system, 1996, Tissue Antigens, 49, 3-II, March 1997) sans amplifier les allèles HLA-DRB3 éventuellement présents (1 ou 2 allèles possibles parmi les 11 allèles inscrits à la nomenclature de 1997).
Afin d'illustrer l'inhibition spécifique de l'amplification du gène DRB3, deux exemples sont décrits ci-après, le premier en utilisant un oligonucléotide comportant une extrémité 3' modifiée par incorporation d'un bras aminé (oligonucléotide 5858, SEQ ID 3) et le second en utilisant un oligonucléotide comportant une extrémité 3' modifiée comportant un -H et une extrémité 5' modifiée comportant une acridine (oligonucléotide 5967, SEQ ID 4).
Les ADN ont été extraits selon les techniques classiques de lyse cellulaire, de digestion par la protéinase K, puis purifiés par précipitation éthanolique après extraction phénolique. Les solutions d'ADN (concentration ajustée à 100 ng/μl en H2O) sont conservées à 2-8°C.
Les conditions générales d'amplification utilisées ont été les suivantes :
- Tampon X10 10 μl - amorce 5' générique (5867, SEQ ID NO 1 ) (lOμM) (0,lμM final) 1 μl
- amorce 5' bloquante (lOμM) (0 à l,2μM final) : 0 à 12 μl
- amorce 3' générique (P2, SEQ ID NO 2) (lOμM) (0, 1 μM final) 1 μl
- dNTP (20mM) (0,2mM final) 1 μl - Taq polymérase (5UI/μl) (l,5U) 0,3 μl - ADN (100ng/μl) (100ng) 1 μl
- H2O (QSP) 100 μl Les caractéristiques du programme d'amplification utilisé avec un appareil Perkin Elmer GeneAmp 9600, ont été les suivantes : 2 min à 95°C (l cycle) 30 sec à 95°C + 30 sec à 55°C + 30 sec à 72°C (32 cycles)
7 min à 72°C (l cycle)
Les produits d'amplification obtenus ont été contrôlés en analysant une partie aliquote (5μl) par électrophorèse en gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium. Après ce contrôle, les amplicons préparés ont été analysés avec le coffret bioMérieux de typage HLA-DR oligodetection (réf. 74 500). Ce test permet de déterminer le typage HLA-DR par technique d'hybridation reverse en microplaques, par détection et analyse des allèles HLA-DRB 1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA-DRB5 (PCT/FR92/00702). Blocage DRB3 avec oligo 5'-phosphate / 3'-C6-NH2 :
ADN : lignée OMW (ECCAC 9058), DRB1*1301, DRB3*01
Amorce HLA-DRB générique 5' (oligonucléotide 5867, SEQ ID NO 1) : 0.1 μM final Amorce HLA-DRB générique 3' (oligonucléotide P2, SEQ ID NO 2) : 0.1 μM final Amorce HLA-DRB3 bloquante 5' (oligonucléotide 5858, SEQ ID NO 3) : 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 μM final
Hybridation en microplaque :
Les valeurs des signaux d'hybridation (densité optique lue à 492 nm xlOOO) observées pour chacune des sondes spécifiques, sont reportées dans le tableau 2 ci- dessous.
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
Tableau 2 ; signaux d'hybridation de l'amorce bloquante 5858 à différentes séquences cibles en fonction de sa concentration
Le calcul du ratio de la valeur lue pour 0.6 μM par rapport à la valeur lue sans blocage, permet d'apprécier l'inhibition de l'amplification du gène DRB3.
Les sondes 13 et 3+6 sont spécifiques du gène DRBl, et la sonde 52a est spécifique du gène DRB3. L'addition d'oligonucléotide 5858 lors de l'amplification, inhibe l'amplification du gène DRB3, sans affecter l'amplification du gène DRBl. Cette inhibition est dose dépendante, et l'inhibition totale est observée pour une concentration d'oligonucléotide DRB3 bloquant de 0.6 μM et plus.
Séquençage :
Les produits d'amplification obtenus avec ou sans blocage du gène DRB3, ont été séquences en utilisant le kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (perkin-Elmer réf. 4303152). Les électrophorégrammes de la réaction Reverse sont reportés ci-après, pour l'essai sans blocage et pour l'essai avec blocage par 0.9 μM d'oligonucléotide 5858.
Le montage des électrophorégrammes concernant la région codant pour les acides aminés 56 à 65 (Nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB, illustre l'inhibition de l'amplification du gène HLA-DRB3 (Figures 9 et 10).
Séquence attendue pour 5 ' > 3 '
56 60 65
DRB1*1301 CCT GAT GCC GAG TAC TGG AAC AGC CAG AAG GAC
DRB3*01 CCT GTC GCC GAG TCC TGG AAC AGC CAG AAG GAC
DRB1*1301+DRB3*01 (forward) CCT G Y GCC GAG TMC TGG AAC AGC CAG AAG GAC
DRBl* 1301+DRB3*01 (reverse) GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CTG
Séquence lue pour essai sans blocage GGA CWR CGG CTC AKG ACC TTG TCG GTC TTC CTG essai avec blocage (0.9 μM) GGA CTA CGG CTC ATG ACC TTG TCG GTC TTC CTG
Ainsi, l'addition d'amorce bloquante spécifique DRB3 (oligonucléotide 5858, 3'-
Cβ-NH2) inhibe l'amplification du gène DRB3 comme le montre la disparition des bases apparentées en position 57 et 60, démontrant l'absence de la séquence correspondant à l'allèle DRB3*01.
Blocage DRB3 avec oligonucléotide 5'-acridine / 3'-H
ADN : lignée OMW (ECCAC 9058), DRB1*1301, DRB3*01
Amorce HLA-DRB générique 5' (oligonucléotide 5867, SEQ ID NO 1) : 0.1 μM final Amorce HLA-DRB générique 3' (oligonucléotide P2, SEQ ID NO 2) : 0.1 μM final Amorce HLA-DRB3 bloquante 5' (oligonucléotide 5967, SEQ ID NO 4) : 0, 0.3, 0.6,
0.9, 1.2 μM final Hybridation en microplaque :
Les valeurs des signaux d'hybridation (densité optique lue à 492 nm xlOOO) observées pour chacune des sondes spécifiques, sont reportées dans le tableau 3 ci- dessous.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Tableau 3 : signaux d'hybridation de l'amorce bloquante 5967 à différentes séquences cibles en fonction de sa concentration
Le calcul du ratio de la valeur lue pour 0.6 μM / la valeur lue sans blocage, permet d'apprécier l'inhibition de l'amplification du gène DRB3.
Là encore, l'addition d'oligonucléotide 5967 lors de l'amplification, inhibe l'amplification du gène DRB3, sans affecter l'amplification du gène DRBl. Cette inhibition est dose dépendante, et l'inhibition totale est observée pour une concentration d'oligonucléotide DRB3 bloquant de 0.3 μM et plus.
Exemple 2 : blocage spécifique de l'amplification du gène HLA-DRB4
La situation est comparable à celle décrite dans l'exemple 1. Afin de simplifier l'interprétation du typage HLA-DRB 1, il peut être avantageux de limiter l'amplification HLA-DRB avec les amorces HLA-DRB génériques, au gène DRBl, sans co- amplification du gène DRB4 La présente invention décrit l'utilisation d'amorces spécifiques DRB4 bloquantes
Les protocoles expérimentaux sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 1 ADN lignée T7526 (ECCAC 9076), DRBl* 0901, DRB4*01 Amorce HLA-DRB générique 5' (oligonucléotide 5867, SEQ ID NO 1) 0 1 μM final Amorce HLA-DRB générique 3' (oligonucléotide P2, SEQ ID NO 2) 0 1 μM final Amorce HLA-DRB4 bloquante 5' (oligonucléotide 5965, SEQ ID NO 5) 0, 0 3, 0 6, 0 9, 1 2 μM final
Hybridation en microplaque
Les valeurs des signaux d'hybridation (densité optique lue à 492 nm xlOOO) observées pour chacune des sondes spécifiques, sont reportées dans le tableau 4 ci- dessous
Figure imgf000021_0001
Tableau 4 signaux d'hybridation de l'amorce bloquante 5965 à différentes séquences cibles en fonction de sa concentration Le calcul du ratio de la valeur lue pour 0.6 μM / la valeur lue sans blocage, permet d'apprécier l'inhibition de l'amplification du gène DRB4.
La sonde 9 est spécifique du gène DRBl, et la sonde 53 est spécifique du gène DRB4. L'addition d'oligonucléotide 5965 lors de l'amplification, inhibe l'amplification du gène DRB4, sans affecter l'amplification du gène DRB l. Cette inhibition est dose dépendante, et l'inhibition totale est observée pour une concentration d'oligonucléotide
DRB4 bloquant de 0.6 μM et plus.
Séquençage :
Les produits d'amplification obtenus avec ou sans blocage du gène DRB4, ont été séquences en utilisant le kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction (perkin-Elmer réf. 4303152). Les électrophorégrammes de la réaction Reverse sont reportés ci-après, pour l'essai sans blocage et pour l'essai avec blocage par 0.9 μM d'oligonucléotide 5965.
Le montage des électrophorégrammes concernant la région codant pour les acides aminés 29 à 47 (Nomenclature officielle HLA) des gènes HLA-DRB, illustre l'inhibition de l'amplification du gène HLA-DRB4 (Figures 1 1 et 12).
Séquence attendue pour 5' > 3'
30 35 40 45
DRB1*0901 AGA GGC ATC TAT AAC CAA GAG GAG AAC GTG CGC TTC GAC AGC GAC GTG GGG GAG TA DRB4*01 AGA TAC ATC TAT AAC CAA GAG GAG TAC GCG CGC TAC AAC AGT GAC CTG GGG GAG TA
DRB1*0901+DRB *01 (forward) AGA KRC ATC TAT AAC CAA GAG GAG WAC GYG CGC TWC RAC AGY GAC STG GGG GAG TA DRB1*0901+DRB4*01 (reverse) TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC WTG CRC GCG AWG YTG TCR CTG SAC CCC CTC AT
Séquence lue pour essai sans blocage TCT MYG TAG ATA TTG GTT CTC CTC WTG CRC GCG AWG YTG TCR CTG SAC CCC CTC AT essai avec blocage (0.9 μM) TCT CCG TAG ATA TTG GTT CTC CTC TTG CAC GCG AAG CTG TCG CTG CAC CCC CTC AT
Ainsi, l'addition d'amorce bloquante spécifique DRB4 (oligonucléotide 5965, 3'- Cβ-NH2) inhibe l'amplification du gène DRB4 comme le montre la disparition des bases apparentées en positions 30, 37, 38, 40, 41, 42 et 44, démontrant l'absence de la séquence correspondant à l'allèle DRB4*01.
La présente invention peut être appliquée au typage HLA-DRB 1 de haute résolution, le blocage spécifique de l'amplification spécifique des gènes HLA-DRB3, - DRB4, -DRB5 et des pseudogènes HLA-DRB2, -DRB6, -DRB7, -DRB8 et -DRB9 par l'utilisation d'amorces bloquantes réduisant l'analyse à un mélange de une (cas d'un échantillon homozygote) ou de deux séquences nucléotidiques (cas d'un échantillon hétérozygote). Une telle stratégie utilise des amorces bloquantes HLA-DRB3 spécifiques (oligonucléotides 5816 (SEQ ID NO 6), 5868 (SEQ ID NO 7), 5885 (SEQ ID NO 8) à titre d'exemples), des amorces HLA-DRB4 spécifiques (oligonucléotides
5883 (SEQ ID NO 9), 5916 (SEQ ID NO 10), 5917 (SEQ ID NO 11) à titre d'exemples) et des amorces HLA-DRB5 spécifiques (oligonucléotides 5021 (SEQ ID NO 12), 5870 (SEQ ID NO 13), 5871 (SEQ ID NO 14), 5881 (SEQ ID NO 15), 5902 (SEQ ID NO 16), 5903 (SEQ ID NO 17), 5913 (SEQ ID NO 18), 5914 (SEQ ID NO 19) à titre d'exemples), modifiés en leurs extrémités 3' et 5' comme décrit plus haut.
Un blocage complet des gènes HLA-DRB3, -DRB4 et -DRB5 peut être réalisé en utilisant un mélange d'amorces bloquantes.
Dans le tableau 5 qui suit, i représente l'inosine.
Figure imgf000024_0001
Tableau 5 : séquence nucléotidique des oligonucléotides utilisés comme amorces pour l'amplification
L'inosine, base non naturelle, est utilisée afin de fragiliser l'hybride acide nucléique - amorce de blocage. En effet, l'inosine est relié à son nucleotide complémentaire par deux liaisons hydrogènes et donc lorsqu'on la substitue à une pyrimidine, la liaison entre les deux brins, à son niveau, est plus faible. Un gène pouvant varier d'autres gènes apparentés par une seule base, il est intéressant de substituer sur l'amorce de blocage, complémentaire du gène, les bases autour de cette position cruciale par des inosines. Le duplex acide nucléique - amorce de blocage devenant ainsi fragilisé, il ne peut y avoir hybridation que si l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence génique cible. On renforce ainsi la spécificité de l'amorce de blocage.
La présente invention concerne donc un procédé d'amplification sélective de gènes présents dans un mélange de gènes apparentés, par utilisation d'amorces oligonucléotidiques bloquantes correspondant à des oligonucléotides comportant une extrémité 3 ' modifiée ne permettant pas leur élongation lors des étapes d'amplification enzymatique des gènes cibles.
L'invention concerne également l'utilisation d'amorces bloquantes au sens décrit dans la revendication 1, comportant une extrémité 5' modifiée ne permettant pas leur déplacement ou leur dégradation, lors des étapes d'amplification enzymatique des gènes cibles par une amorce spécifique d'une région située plus en 5' sur le même gène.
Dans le cas d'une utilisation d'amorces bloquantes au sens décrit ci-dessus la modification à l'extrémité 5'est facultative. Ainsi, deux possibilités différentes existent.
Selon un premier mode d'utilisation, le groupement -OH en 3' est remplacé par un groupement naturellement non trouvé dans la nature, comme un groupement -H, - phosphate, -dabcyl, ou une chaîne carbonée terminée par un groupement -NH2, à titre d'exemples.
Selon un second mode d'utilisation, le groupement -phosphate en 5' est remplacé par un groupement naturellement non trouvé dans la nature, comme un groupement -DMT, acridine, -thiophosphate, ou une structure " tige-boucle ", à titre d'exemples.
Les amorces bloquantes, telles que décrites ci-dessus, peuvent aussi comporter des modifications de l'oligonucléotide en position non terminale et sont utilisées afin de favoriser leur hybridation sur leurs séquences cibles. Les amorces bloquantes, telles que décrites ci-dessus, sont capables de s'hybrider sur le brin codant ou sur le brin complémentaire (utilisation d'amorces bloquantes 5' ou d'amorces bloquantes 3').
Il est également possible d'utiliser une amorce bloquante ou un mélange d'amorces bloquantes.
L'utilisation d'amorces bloquantes est particulièrement intéressante pour les méthodes d'amplification des séquences cibles, comme par exemple la PCR, la TMA ou tout autre technique.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'une ou de plusieurs amorces bloquantes pour l'inhibition de l'amplification des gènes HLA-DRB3, -DRB4 et -DRB5, choisies parmi celles qui sont définies par les séquences SEQ ID Nos :3 à 19, et leurs complémentaires.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'amplification d'au moins une séquence nucléotidique particulière d'un acide nucléique de synthèse ou naturel contenu dans un mélange réactionnel, le mélange réactionnel étant constitué d'au moins un acide nucléique comportant au moins deux séquences nucléotidiques apparentées et/ou d'au moins deux acides nucléiques comportant chacun au moins une séquence nucléotidique apparentée ; le procédé utilisant au moins un type d'amorces d'amplification capables de s'hybrider avec l'acide nucléique pour permettre l'amplification des séquences nucléotidiques apparentées, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter, dans le mélange réactionnel, au moins une séquence, faisant office d'amorce de blocage, qui est capable :
- de s'hybrider à au moins une séquence nucléotidique, qui n'est pas la ou les séquences nucléotidiques particulières à amplifier, et
- d'empêcher à son niveau l'élongation de l'amorce d'amplification.
2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les amorces de blocage sont capables de s'hybrider à la ou à toutes les séquences nucléotidiques, qui ne sont pas la ou les séquences nucléotidiques particulières à amplifier.
3. Amorce de blocage utilisée dans un procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que chaque amorce de blocage est un oligonucléotide à base de désoxyribonucléotides et/ou de ribonucléotides et ou de nucléotides modifiés, tels que des PNA ou des nucléotides thiophosphates.
4. Amorce, selon la revendication 3, caractérisée par le fait que chaque amorce de blocage comporte au moins un élément qui empêche l'amplification.
5. Amorce, selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l'élément, qui empêche l'amplification, est situé à l'extrémité 3' de l'amorce de blocage et ne permet pas son élongation.
6. Amorce, selon la revendication 5, caractérisée par le fait que l'élément, qui empêche l'amplification, est situé à l'extrémité 5' de l'amorce de blocage et fait office d'élément protecteur.
7. Amorce, selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée par le fait que chaque élément, qui empêche l'amplification, est constitué par un nucleotide ou nucleotide modifié ou par un oligonucléotide comportant ou non au moins un nucleotide modifié ; le nucleotide, le nucleotide modifié ou l'oligonucléotide ne s'hybride pas sur l'acide nucléique.
8. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée par le fait que chaque élément, qui empêche l'amplification, est constitué par une molécule, différente d'un nucleotide ou d'un nucleotide modifié.
9. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée par le fait que l'élément est constitué par au moins cinq, notamment au moins dix et préférentiellement au moins quinze nucléotides, nucléotides modifiés ou un mélange de nucléotide(s) et de nucléotide(s) modifié(s).
10. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 ou 9, caractérisée par le fait que l'élément est suffisamment long pour permettre la formation d'une boucle et d'une hybridation entre les nucléotides et/ou les nucléotides modifiés, qui constituent cette boucle.
11. Amorce, selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 ou 9, caractérisée par le fait que l'élément est constitué d'une "queue " de polynucléotides et/ou de polynucléotides modifiés, qui comporte tous les mêmes bases.
12. Amorce dans laquelle l'élément ne permet pas l'élongation, selon l'une quelconque des revendications 4, 5 ou 7 à 11, caractérisée par le fait que l'élément substitué à l'atome d'hydrogène du groupement hydroxyle ou du groupement hydroxyle, placé en position 3' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 3' de l'acide nucléique.
13. Amorce dans laquelle l'élément est protecteur, selon l'une quelconque des revendications 4, 6 à 12, caractérisée par le fait que l'élément est :
- substitué au phosphate, placé en position 5' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 5' de l'acide nucléique, ou
- greffé sur le phosphate, placé en position 5' du ribose, lui-même situé à l'extrémité 5' de l'acide nucléique.
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