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WO1999056865A1 - Vorrichtung und verfahren zur herstellung einer anordnung von kettenmolekülen auf einem trägermaterial - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur herstellung einer anordnung von kettenmolekülen auf einem trägermaterial Download PDF

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WO1999056865A1
WO1999056865A1 PCT/EP1999/002958 EP9902958W WO9956865A1 WO 1999056865 A1 WO1999056865 A1 WO 1999056865A1 EP 9902958 W EP9902958 W EP 9902958W WO 9956865 A1 WO9956865 A1 WO 9956865A1
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Stephan Burkhardt
Jonathan Hall
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Novartis Ag
Novartis-Erfindungen Verwaltungsgesellschaft Mbh
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a carrier material with chain molecules synthesized in synthesis fields with a predetermined sequence of chain building blocks, in particular oligonucleotides complementary to at least parts of sections of genetic information carriers, in which at least one reaction cell is relative in one synthesis cycle in a sequence of synthesis cycles in one cycle direction positioned to the carrier material with partially overlapping synthesis areas and chain building blocks of a basic type series intended for chain extension are passed through the reaction cell, so that chain molecules with sequences of the same sequences of chain building blocks are synthesized in several synthesis cycles in synthesis fields repeatedly covered by synthesis areas of a reaction cell.
  • the invention further relates to a device, in particular for producing a carrier material with chain molecules synthesized in synthesis fields with a predetermined sequence of chain building blocks, in particular oligonucleotides complementary to at least parts of sections of genetic information carriers, with a carrier material holder to which the carrier material can be applied, with a storage unit, with at least one reaction cell connected to the supply unit, through which chain components provided for chain extension when the or each reaction cell is placed on the support material in a sealing manner can be passed through in contact with the support material in a synthesis area, with a positioning unit with which the or each reaction cell can be passed through in a synthesis process in a sequence of synthesis cycles, each by a displacement path relative to the carrier material with synthesis areas partially overlapping in synthesis fields is possible, and with a control unit for controlling the supply unit and the positioning unit, so that chain molecules with the same sequences of chain components can be synthesized in several synthesis cycles in synthesis fields repeatedly covered by synthesis areas of a reaction cell.
  • a control unit for
  • the invention further relates to the use of a device for producing a carrier material with chain molecules synthesized in synthesis fields with a predetermined sequence of chain building blocks, in particular at least in part of - 2 -
  • Sections of genetic information carriers of complementary oligonucleotides in particular for carrying out a method according to one of claims 1 to 4, with a carrier material holder to which the carrier material is applied, with a supply unit, with at least one reaction cell connected to the supply unit, by means of which the or each reaction cell on the support material for chain extension intended chain blocks are passed through in contact with the support material in a synthesis area, with a positioning unit with which the or each reaction cell in a synthesis run in a sequence of synthesis cycles each by a displacement path relative to the support material with partially in Positioned synthesis field overlapping synthesis areas, and with a control unit for controlling the storage unit and the positioning unit, so that in several synthesis cycles in the synthesis area repeatedly In a reaction cell covered by synthesis cells, chain molecules with the same sequences of chain building blocks are synthesized.
  • Such a method and such a device are known from the article "Arrays of complementary oligonucleotides for analyzing the hybridization behavior of nucleic acids" by E.M. Southern, S.C. Case-Green, J.K. Eider et al., Pages 1368 to 1373, Nucleic Acid Research, 1994, vol. 22, no. 8, known.
  • a reaction cell with a diamond-shaped or circular synthesis area is offset in one synthesis step in a sequence of synthesis cycles in one passage direction relative to a carrier material with partially overlapping synthesis areas, with a reaction solution with one provided for chain extension in each synthesis cycle Chain building block is passed through the reaction cell in contact with the carrier material.
  • Chain molecules with a predetermined sequence of chain building blocks in particular oligonucleotides complementary to sections of genetic information carriers, can be synthesized by passing a reaction solution with a predetermined chain building block in the synthesis area over the carrier material in each case during the synthesis cycles, so that a reaction cell is repeated from synthesis areas covered synthetic fields, chain molecules with sections of the same sequence of chain building blocks are synthesized.
  • the chain molecules are preferably designed as oligonucleotides.
  • the oligonucleotides serve to analyze the hybridization behavior of nucleic acids.
  • the target nucleic acid when inhibiting the expression of a protein encoded by a target nucleic acid by interaction (hybridization) of relatively short oligonucleotides complementary to the base sequence of the target nucleic acid with the target nucleic acid or a target nucleic acid - protein complex, the target nucleic acid in particular a single-stranded target nucleic acid with a secondary and tertiary structure, in particular a "messenger RNA" (mRNA) (so-called “antisense technology”), there is the problem of inhibiting translation due to the complicated secondary and tertiary structure of the mRNA to identify available binding sites for a specific mRNA for an oligonucleotide, the localization of which is difficult to predict.
  • mRNA messenger RNA
  • a carrier material on which the above-mentioned arrangement of oligonucleotides is located can be used in particular in an assay with which it is determined whether or how strongly a target nucleic acid, such as such an mRNA molecule, is able to hybridize one or more of the oligonucleotides on the support material.
  • the hybridization conditions are chosen as far as possible so that the secondary or tertiary structure of the target nucleic acid is largely preserved and matches the corresponding in vivo structure of the RNA.
  • the strength of the hybridization can serve as a measure of the accessibility of a specific region of the target nucleic acid by the oligonucleotides.
  • a single oligonucleotide, identified in this way and capable of hybridizing with the target nucleic acid can then be produced by known methods and used in antisense technology for medical-therapeutic or diagnostic purposes.
  • oligonucleotides that can be hybridized to an mRNA on a solid support as so-called “antisense” to identify binding sites that can be used for inhibition
  • the oligonucleotides each consisting entirely of a single defined type of chain building block, for example of the deoxyribonucleotide -Type, of the deoxyribophosphorothioate nucleotide type or of the 2'-O-methyl-ribonucleotide type (ie in each case from chain building blocks of a single basic type series).
  • oligonucleotides on the support which are composed entirely of chain molecules of a single specific basic type series.
  • Such oligonucleotides often do not have the multiple properties desired in antisense technology, such as, for example, high binding affinity for the target nucleic acid and or high resistance to endogenous nucleases combined with the ability to effectively inhibit expression of the target protein at the level of the target nucleic acid.
  • oligonucleotides are those which combine several properties, for example a high binding affinity for the target nucleic acid / or resistance to degradation by endonucleases combined with the property that the target nucleic acid is cleaved efficiently by the endogenous one To cause RNAse H. It has been possible to combine a large number of such properties in one and the same molecule in oligonucleotides, in that such an oligonucleotide is constructed in sections from chain building blocks of a specific basic type series, each section being responsible for a specific property or function of the oligonucleotide. Such oligonucleotides are often referred to as "chimeric" oligonucleotides.
  • Chimeric oligonucleotides consist of chain building blocks of at least two different basic type series, which are synthesized in at least two successive or adjacent sections, often also in three or more such sections (see, for example, ST Crooke et al., J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics 277 (1996) , Pp. 923-937).
  • the invention has for its object to provide a method and a device of the type mentioned, in which on the carrier material an efficient synthesis of an arrangement of chain molecules with the same sequence of sections of chain building blocks of different basic type series, in particular oligonucleotides with a chimeric structure, but otherwise largely the same characteristic characteristics such as base recognition characteristics can be carried out on oligonucleotides.
  • the invention is based in particular on the object of providing a method and a device of the type mentioned at the beginning for chain molecules which are at least partially complementary to oligonucleotides of genetic information carriers, the oligonucleotides having a chimeric structure, as a result of which, for example, a high binding affinity and or a high resistance against such oligonucleotides - 5 -
  • chain components of at least two different basic type series are stored in the supply unit, that the or each reaction cell can be positioned with the control unit in at least two synthesis cycles in the same direction in such a way that synthesis cycles of a synthesis cycle the associated synthesis area is overlaid in sections with a synthesis field hitherto uncovered in this synthesis run, in which chain molecules with a maximum chain length synthesized in the or each previous synthesis run are present, and that, controlled by the control unit, chain building blocks of different basic type series can be passed through the or each reaction cell in two successive synthesis runs .
  • a device can comprise a corresponding supply unit, which in each case contains chain components of a single basic type series, and in which the supply unit is designed to be interchangeable, so that after each synthesis cycle the supply unit is replaced by a another supply unit with chain components of another basic type series can be exchanged.
  • chain components of at least two different basic type series are stored in the supply unit, that with the control unit the or each reaction cell can be positioned in at least two synthesis cycles in the same direction in such a way that one during synthesis cycles
  • the associated synthesis area is partially sectioned with a synthesis field hitherto uncovered in this synthesis process, in which chain molecules with a maximum chain length synthesized in the or each previous synthesis process are present, and that, controlled by the control unit, chain building blocks of different basic type series are passed through the or each reaction cell in two successive synthesis processes become.
  • the present invention thus furthermore relates to the use of a device for producing a carrier material comprising an arrangement of chain molecules synthesized in synthesis fields with a predetermined sequence of chain building blocks, in particular of oligonucleotides complementary to at least parts of sections (20) of genetic information carriers, adjacent synthesis fields Chain molecules with sections of the same sequence of chain building blocks of different basic type series include.
  • Such an arrangement thus comprises chain molecules that comprise at least two sections, each with different basic type series of chain building blocks.
  • Another object of the invention is a carrier material, comprising an arrangement of chain molecules synthesized in synthesis fields with a predetermined sequence of chain building blocks, in particular of oligonucleotides complementary to at least parts of sections (20) of genetic information carriers, adjacent synthesis fields being chain molecules with the same sequence of chain building blocks of different basic type series include.
  • Such an arrangement thus comprises chain molecules that comprise at least two sections, each with different basic type series of chain building blocks.
  • the present invention is directed to a carrier material which can be produced by a method according to the present invention. - 7 -
  • chain molecules with blocks of chain building blocks of different basic type series, but otherwise the same characteristics as base recognition characteristics can be synthesized, whereby, for example, different sequences of basic type series and / or differently designed synthesis areas of reaction cells used in the various synthesis runs can achieve high varieties in the synthesized chain molecules with high efficiency.
  • the synthesis areas of each reaction cell are expediently rectangular in shape, each having the same transverse sides, the length of each long side of a reaction cell corresponding to an integral multiple of a displacement path in the longitudinal direction.
  • the reaction cells are shifted from one synthesis cycle to the next by the displacement distance corresponding to the size of a synthesis field in the longitudinal direction.
  • the reaction cells are to be positioned in a first synthesis cycle of each synthesis run in such a way that the synthesis areas of the reaction cells are flush with one another in the passage direction.
  • the chain molecules are preferably oligonucleotides.
  • Such oligonucleotides are capable of pairing with a complementary nucleic acid strand, in particular an mRNA, and consist of individual chain building blocks, namely nucleosides or nucleoside analogues, which as a rule carry a nucleic acid base or a base analog, which mediate the properties of the oligonucleotides for base pairing .
  • a chain building block also includes an intemucleosidic bridge bond to the next building block, for example of the phosphodiester, phosphorothioate or amide type, as described, for example, in A. de Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 28 (1995), pp. 366-374.
  • a basic type series of the chain molecules is in each case chain building blocks of the same basic structure, members of a first basic type series being members of a second basic type series in particular by the properties to be achieved, for example those by the part of the chain molecule under consideration - 8th -
  • oligonucleotides such properties of the chain molecules are, for example, the affinity for a target nucleic acid, the nuclease resistance, the sensitivity to RNAse H or the toxic properties.
  • An advantageous oligonucleotide which is used as a drug in the context of antisense technology, combines several advantageous properties.
  • the basic types of building blocks are natural nucleosides, such as 2'-deoxyribonucleosides or ribonucleosides; or by 2'-0-alkyl-modified ribonucleosides, the 2'-O-alkyl group, which is preferably 2'-OC 1 -C 5 alkyl, in particular 2'-O-methyl or 2'-O-ethyl, unsubstituted or, in the case of 2'-O-ethyl at the ⁇ -position, can be substituted with -OH, -F or alkoxy, preferably with dC 5 -alkoxy, in particular methoxy, where 2'-O- (2-methoxyethyl ) -modified ribonucle
  • building blocks of a basic type series are synthesized in one section in an oligonucleotide, an oligonucleotide consisting of at least 2, for example 2 or 3 sections.
  • Chimeric oligonucleotides which consist of two sections are preferred as chain molecules, one section consisting of 2'-O- (2-methoxyethyl) ribonucleosides which are linked to one another via phosphodiester bridges or phosphorothioate bridges, and the other section 2'-deoxyribonucleosides, which are linked together via phosphorothioate bridges.
  • Chain molecules are chimeric oligonucleotides which consist of three sections, the first section consisting of 2'-O- (2-methoxyethyl) ribonucleosides, viewed from 5'- in 3'-direction, via phosphodiester bridges or phosphorothioate bridges are linked together, the adjoining second section consists of 2'-deoxyribonucleosides which are linked together via phosphorothioate bridges, and the adjoining third section in turn consists of 2'-O- (2-methoxyethyl) ribonucleosides , which are linked together via phosphodiester bridges or phosphorothioate bridges.
  • two individual sections are preferably linked to one another via a phosphorothioate bridge if the nucleoside at the 3 'end of a section is one 2'-deoxyribonucleoside; or alternatively, two individual sections are linked to one another via a phosphodiester bridge or via a phosphorothioate bridge if the nucleoside at the 3 'end of a section is a 2'-O- (2-methoxyethyl) ribonucleoside.
  • Suitable, preferred chimeric oligonucleotides have a total length of about 15 to about 25, for example 20, nucleoside building blocks, the section consisting of 2'-deoxyribonucleoside building blocks comprising at least about 5 such building blocks.
  • FIG. 1 shows a schematic representation in one exemplary embodiment of a carrier material strip with a reaction cell which has been placed on and has a synthesis area covering four synthesis fields, after a first synthesis - 10 -
  • FIG. 2 shows the arrangement according to FIG. 1 after the last synthesis cycle of the first synthesis run has been carried out
  • FIG. 3 shows the arrangement according to FIG. 2 after carrying out a first synthesis cycle of a further second synthesis run with chaining of a chain building block of a different basic type series used in relation to or in the first synthesis run,
  • FIG. 5 in a schematic representation in a further embodiment
  • FIG. 6 shows the arrangement according to FIG. 5 with a reaction cell placed on top of it, which has a synthesis area covering five synthesis fields, after a second synthesis cycle of a further second synthesis run, FIG.
  • FIG. 7 shows the arrangement according to FIG. 6 after the last synthesis cycle of the second synthesis run has been carried out
  • FIG. 8 shows the arrangement of FIG. 7 with a covering two synthesis fields
  • Reaction cell having synthesis area after carrying out the last synthesis cycle of a further third synthesis pass Reaction cell having synthesis area after carrying out the last synthesis cycle of a further third synthesis pass.
  • FIG. 9 shows a device for producing a carrier material with chain molecules synthesized in synthesis fields according to the invention in a schematic perspective view. - 11 -
  • Fig. 10 shows the lifting unit of the device schematically in a perspective enlarged view.
  • FIG. 11 shows the lifting unit according to FIG. 10 in a top view.
  • Fig. 12 shows a cross section through the support beam of the lifting unit with a
  • reaction cell 13 is a plan view of a reaction cell
  • FIG. 1 shows, in a schematic representation in an exemplary embodiment of a method and a device according to the invention, a support material strip 17 which can be occupied with a total of 16 synthesis fields 1 to 16 and which is made of polypropylene (PP), for example chemically treated for the synthesis of oligonucleotides, as the support material.
  • the carrier material strip 17 is placed on a carrier material holder, not shown in FIG. 1, for example in the form of a metal plate provided with an elastic layer.
  • a displaceable reaction cell 18, shown in its outline is placed on the carrier material strip 17 and is connected to a storage unit, not shown in FIG. 1.
  • reaction cells 18 are provided which, for example for carrying out a parallel synthesis, are arranged next to one another on a reaction cell carrier and can be moved together.
  • reaction fluids for example reaction solutions, which are provided for a synthesis of chain molecules with chain extension with a predetermined, specific sequence of chain components, are stored or are successively stored, which are controlled by the control unit or can be fed to each reaction cell 18.
  • the reaction cell 18 can be placed on the carrier material strips 17 with a seal.
  • the reaction cell 18 has a recess with a rectangle-shaped border which is open on one side and delimits a synthesis region 19, the dimensions of which in the illustrated exemplary embodiment correspond to the size of four adjacent synthesis fields 1 to 16. 1 is the means of a - 12 -
  • oligonucleotides complementary to at least part of a section 20 of a genetic information carrier are synthesized with the above-described device in a method.
  • the individual bases of section 20 carrying the genetic information are symbolically identified in FIG. 1 with B1 to B17 and each stand for one of the bases A, C, G and U or T according to the Watson-Crick model.
  • oligonucleotides 21 each assigned to a synthesis field 1 to 16 as chain molecules. Each oligonucleotide 21 is attached to a residual group R of the substrate strip 17 prepared for binding.
  • the reaction cell 18 is arranged in the position of a first synthesis cycle of a first synthesis run in which a reaction fluid intended for chain extension with a natural nucleotide N1 complementary to the base B1 of the section 20 has been passed through the reaction cell 18 is.
  • the reaction fluid has washed over the synthesis area 19, so that the nucleotide N1 has been added to the residual groups R of the first four synthesis fields 1 to 4 on the left in the illustration in FIG. 1.
  • FIG. 2 shows the arrangement according to FIG. 1 with the reaction cell 18 in one of the four synthesis fields 13 to 16 located on the left in the selected illustration and in the passage direction. - 13 -
  • each four natural nucleotides N1 to N13-containing oligonucleotides 21 have been synthesized, each oligonucleotide 21 synthesized in one of the synthesis fields 4 to 13, as represented by the same sequence of atomic numbers, being complementary to a coherent part of section 20 of bases B1 to B13 of the genetic information carrier.
  • FIG. 3 shows the arrangement according to FIG. 2 with the reaction cell 18 having the synthesis area 19 covering the four synthesis fields 1 to 16 in the positioning of a first synthesis cycle of a further second synthesis run.
  • the reaction cell 18 is brought into the same position as in the first synthesis cycle of the first synthesis run, covering the first four synthesis fields 1 to 4 on the left in the illustration in FIG. 3.
  • a reaction fluid with a now modified nucleotide n5 as a chain building block of a different basic type series compared to the one used in the first synthesis run is then flushed out, the base of the modified nucleotide n5 being complementary to the base B5 of section 20 of the genetic information carrier.
  • an oligonucleotide 21 composed of five chain building blocks in the sequence N1-N2-N3-N4-n5 is synthesized in the fourth synthesis field 4 counted from the left, which oligonucleotide 21 forms the first five bases B1 to B5 of section 20 of the genetic information carrier is complementary and has natural nucleotides N1 to N4 of the basic type series used in the first synthesis run and the modified nucleotide n5 of the further basic type series used in the second synthesis run.
  • edge-side synthesis fields 1 to 3 oligonucleotides 21 that are not or not completely complementary to the beginning of section 20 of the genetic information carrier have been synthesized.
  • reaction fluids with modified nucleotides n6 to n17 are then passed through after shifting the reaction cell 18 by a displacement path corresponding to the size of an adjacent synthesis field 5 to 16, whereby the sequence follows - 14 -
  • the sequence of the modified nucleotides n6 to n17 complementary to the bases B6 to B17 is predetermined.
  • FIG. 4 shows in the arrangement according to FIG. 3 the reaction cell 18 in the position in the last synthesis cycle of the second synthesis run after flushing with a reaction fluid containing the modified nucleotide n17 complementary to the last base B17 of section 20 of the genetic information carrier. From Fig. 4 it can be seen that now except for the three edge-side synthesis fields 1, 2, 3, 14, 15, 16 in the middle synthesis fields 4 to 13 sequence homologues, each with a part of section 20 of the genetic information carrier complementary oligonucleotides 21 with a Length of eight nucleotides have been synthesized.
  • Each oligonucleotide 21 has four natural nucleotides N1 to N13 in blocks and then four modified nucleotides n5 to n17, each following the natural nucleotides N4 to N13 added last in the first synthesis run in one of the sequences of bases B1 to B17 of section 20 of the Genetic information carrier corresponding order.
  • the carrier material strip is now, in particular with regard to the oligonucleotides 21 synthesized in the middle synthesis fields 4 to 13, as chain molecules with eight chain building blocks arranged in two blocks or sections with different basic type series, for use in an assay for examining parts of section 20 of the genetic information carrier with regard to accessible Binding sites for so-called "antisense 'oligonucleotides are available, as mentioned above.
  • FIGS. 1 to 4 shows schematically similar to FIGS. 1 to 4 in a further exemplary embodiment of a method and a device according to the invention the carrier material strip 17 according to the aforementioned exemplary embodiment.
  • oligonucleotides 21 which are complementary to connected parts of section 20 of the genetic information carrier and have a chain length which is greater than the exemplary embodiment explained with reference to FIGS. 1 to 4 using natural and modified nucleotides in three differently long blocks of pairs of different basic type series are intended be synthesized.
  • a reaction cell 22 with a synthesis area 23 covering three synthesis fields 1 to 16 is arranged in the arrangement with a tenth synthesis cycle - 15 -
  • the reaction cell 22 was arranged in such a way that the synthesis area 23 covered the third to fifth synthesis fields 3, 4, 5 counted from the left in the illustration in FIG. 5. Then, in the subsequent synthesis cycles of the first synthesis run, the reaction cell 22 was placed in each case on the next neighboring synthesis field 5 to 14 and flushed with a reaction fluid containing a complementary natural nucleotide N2 to N10 corresponding to the sequence of bases B2 to B10, so that up to the in 5, the tenth synthesis cycle shown have built up the complementary oligonucleotides 21 shown.
  • FIG. 6 shows the arrangement according to FIG. 5 after a second synthesis cycle of a further second synthesis run.
  • a reaction cell 24 is used, with the synthesis area 25 of which five synthesis fields 1 to 16 can be covered.
  • the reaction cell 24 is arranged such that the only synthesis field 5 to 12 with a chain of three natural nucleotides N1 to N12 is the fifth synthesis field 5 counted from the left in the illustration in FIG. 6 together with the left side outer four synthesis fields 1 to 4 has been covered for the first time by the synthesis area 25.
  • the first two synthesis fields 1, 2 located on the left outside in the illustration in FIG. 6 were first flushed with a reaction fluid.
  • a reaction fluid which contains the modified nucleotide n4 which is complementary to the fourth base B4 of section 20, while in the second synthesis cycle of the second synthesis run shown in FIG. 6 that to the fifth base B5 of section 20 of the genetic information carrier complementary, modified nucleotide n5 was contained in the reaction fluid.
  • reaction cell 24 is in each case displaced by a displacement path corresponding to the size of a synthesis field 1 to 16, and reaction fluids with complementary modified nucleotides n6 to n15 in the corresponding sequence of the bases B6 to B15 of section 20 of the genetic information carrier are passed through . - 16 -
  • FIG. 7 shows in the illustration in FIG. 6 the positioning of the reaction cell 24 used in the second synthesis run after the last synthesis cycle of the second synthesis run has been carried out. From Fig. 7 it can be seen that apart from the four synthesis fields 1 to 4, 13 to 16 located on the right and left edges in the middle synthesis fields 5 to 12 oligonucleotides with eight chain components N1 to N10, n4 to n15 have been synthesized, the in the first synthesis step, three nucleotides N1 to N10 synthesized block by block of a natural basic type series and the five nucleotides n4 to n15 linked in the second synthesis cycle are assigned in blocks to a modified basic type series.
  • FIG. 8 shows the arrangement according to FIG. 7 after carrying out the last synthesis cycle of a further third synthesis run, in which, as chain building blocks, a basic type series different from the previous synthesis run in turn complements the natural nucleotides N9 to N17 to the bases B9 to B17 to those in the first two Synthesis runs synthesized oligonucleotides 21 have been linked.
  • a reaction cell 26 is used, with the synthesis region 27 of which two adjacent synthesis fields 1 to 16 can be covered.
  • a reaction fluid with a natural nucleotide N9 complementary to the ninth base B9 of section 20 of the genetic information carrier was passed through the reaction cell 26.
  • reaction fluids containing complementary natural nucleotides N10 to N17 predetermined by the sequence of the bases B10 to B17 were flushed through the reaction cell 26 to cover for the first time the next neighboring synthesis field 6 to 16. - 17 -
  • 5 to 12 sequence homologous oligonucleotides 21 with a length of ten chain building blocks, which are each complementary to part of section 20 of the genetic information carrier and consist of a block of three, are now synthesized in the middle synthesis fields 5 to 12 after completion of the third synthesis run natural nucleotides N1 to N10, a block of five modified nucleotides n4 to n15 and a further block of two natural nucleotides N9 to N17 are constructed.
  • Each block of natural nucleotides N1 to N10 or N9 to N17 and of modified nucleotides n4 to n15 has a length which corresponds to the number of synthesis fields covered by the synthesis areas 23, 25, 27 of the reaction cells 22, 24, 26 used in the corresponding synthesis runs Corresponds to 1 to 16.
  • longer-chain chain molecules can be synthesized by using reaction cells having larger synthesis areas and by carrying out a plurality of synthesis cycles having a greater number of synthesis cycles than in the exemplary embodiments explained in detail above.
  • reaction cells with differently sized synthesis areas, diverse variations in the block-wise sequence of basic type series can be achieved, it being expedient that the rectangular sides of the synthesis areas have the transverse sides of the reaction cells of the same size and the size of the long sides a full-page multiple of that due to a displacement path in the passage direction correspond to the specified dimension of the synthesis fields and the reaction cells are displaced in the longitudinal direction by the corresponding dimension of the synthesis fields.
  • a cut polypropylene film (PP: Mobil 40MB400, 400 mm x 300 mm) is placed in a cylindrical glass drum (diameter: 170 mm, length: 400 mm) in a solution (180 ml) of 0.9 g chromium (VI) oxide (Fluka), dissolved in a 1: 1 mixture of acetic anhydride: acetic acid (Fluka), immersed.
  • the reaction drum is quickly rotated for 1 hour using a mechanical rolling device.
  • the film is then removed, immersed in a bath of 1 M aqueous acetic acid for 30 minutes and then rinsed with methanol (Fluka) for 30 minutes.
  • the film is dried in a high vacuum, being located between 2 glass plates for protection.
  • the film is then immersed in a corresponding glass container in a 1 M solution of BH 3 (Aldrich Chemical Co.) in tetrahydrofuran (180 ml), which is diluted to 0.2M with additional tetrahydrofuran.
  • the glass vessel is rotated quickly for 1 hour.
  • the film is removed, immersed in 1 M aqueous acetic acid, rinsed in methanol and dried under vacuum.
  • the film treated in this way is used without further treatment as a carrier material in a process according to the invention.
  • FIG. 9 shows an automated device (so-called "array maker") which is used for the synthesis of a carrier material according to the invention with chain molecules synthesized in synthesis fields.
  • the device comprises an automatic cell positioning device or cell positioning unit 36 and a DNA synthesizer (ABI 394/4) 31.
  • the DNA synthesizer 31 is connected to the automatic cell positioning device 36 by means of hose connections for the reagents (not particularly reaction solutions) which are not shown in the drawing , Purge liquids and purge gases).
  • the inlet tubing connections that are normally used to deliver the reagents from the DNA synthesizer to the 4 reaction columns, which comprise a solid support and are standard for the synthesis of oligonucleotides, are instead with the inlet openings of 4 reaction cells 32, 33, 34, 35 connected.
  • the outlet tube connections that normally connect the DNA synthesizer to the respective outlet openings of the 4 reaction columns mentioned are instead to the outlet openings of the 4 reaction cells - 19 -
  • the cell positioning machine 36 is connected via a trigger line (not shown in the drawing) to an electronic control unit 37, with the aid of which a trigger signal ("advance fraction collector signal") for the respective next cell position of the cell positioning machine 36 from the DNA synthesizer 31 the cell positioning machine 36 is transmitted.
  • the automatic cell positioning device 36 and the DNA synthesizer 31 stand on a stable base 38 below an extractor hood 39 with a rear wall 40.
  • the automatic cell positioning device 36 has its own protective hood 41, which is only shown in parts in the drawing, and which has a vertical sliding door is provided, which are moved by means of a handle 42 and via pulling ropes (not shown in the drawing), which are connected to a counterweight (not shown in the drawing) and are deflected via rollers 43, into an indicated upper position and a likewise indicated lower position can.
  • the rollers 43 are connected via brackets and struts to the profile frame 45, which consists of several profile tubes 44 and is supported on the base 38.
  • the automatic cell positioning device (36) is moved by an electrically operated unit 46, which, controlled by the control unit 37, moves a pressure plate 47 vertically in stages between an illustrated upper position and an indicated lower position.
  • the PP film 49 is fastened on the pressure plate 47 with the aid of 5 vertical metal holding bars 48 by means of screws located at the upper and lower ends of the holding bars.
  • a thin piece of rubber 90 (see FIG. 11) is located between the PP film 49 and the pressure plate 47.
  • the pressure plate 47 is moved vertically to preprogrammed positions.
  • the reaction cells 32, 33, 34 and 35 are horizontally next to each other on a support beam
  • the lifting unit 51 is shown separately and enlarged in FIG. 10. 11 shows the lifting unit
  • the lifting unit 51 in plan view together with the reaction cells 32, 33, 34 and 35 and with the pressure plate 47.
  • the lifting unit 51 has a left-hand guide 52 and a right-hand guide 53, each of which is designed as a hollow cylinder.
  • a left push rod 54 and a right push rod 55 each extend through the guides 52 and 53.
  • Both push rods 54, 55 are prestressed with the aid of pressure springs (not shown in the drawing) arranged in the guides 52, 53 such that the reaction cells 32, 33, 34, 35 are pressed onto the pressure plate 47.
  • eccentric disks not shown in the drawing, are provided, which cooperate with the end faces 56 and 57 of the pressure rods 54, 55, around the - 20 -
  • the eccentric discs are adjusted with the aid of an electric drive, which is also connected to the control electronics 37.
  • the push rods 53, 54 are detachably connected to the support beam 50 by means of knurled nuts 58. In this way, the reaction cells 32, 33, 34, 35 can be removed together with the support bar 50. After dismantling the support bar 50, it is possible to detach each individual reaction cell 32, 33, 34, 35 from the support bar 50 and, if necessary, to replace it with another reaction cell 32, 33, 34, 35.
  • the connection of the reaction cell 32 is shown in FIG. 12, for example.
  • the reaction cell 32 is fastened to a pin 59 which extends through a bore 60 in the support beam 50.
  • the pin 59 On the side of the support beam 50 pointing away from the reaction cell 32, the pin 59 is provided with a thread onto which a knurled nut 61 is screwed.
  • the pin 59 with the screwed-on knurled nut 61 is prestressed with the aid of a compression spring 62, so that the knurled nut 61 is pressed against the back of the support beam 50.
  • the compression spring 62 is designed to be significantly weaker than the compression springs provided in the guides 52, 53, so that when the reaction cells 32, 33, 34, 35 are placed on the plastic film 49 and the pressure plate 47, the compression spring 52 is compressed and the pressure force of the reaction cell 32, 33, 34, 35.
  • the optimal pressure force can be set quickly and easily by changing the pressure spring 62.
  • a pressure spring 62 with 42N is used for the PP film 40MB400 used as carrier material in this example.
  • the compression spring 62 ensures a uniform pressure of the reaction cells 32, 33, 34, 35 against the plastic film 49 (see FIG. 11), which either directly on the pressure plate 47 or with the interposition of an intermediate carrier film 90 (see FIG.
  • the intermediate carrier film 90 which is preferably up to 1 mm thick (see FIG. 11), consists, for example, of a polymer film made of Neoprene 60 ° Shore A or natural rubber (for example Paragummi 40 ° Shore A), both from Richterich + Zeller AG, Basel, Switzerland are distributed.
  • reaction cells 32, 33, 34, 35 which are open on one side, is explained in more detail below with reference to FIGS. 12 and 13. - 21 -
  • the reaction cells 32, 33, 34, 35 consist of a block with a rectangular cross section made of a deformable material or a plastic.
  • PTFE is used.
  • the rear side 63 facing the support beam 50 and the outer sides 64, 65, 66, 67 and 68 are each flat.
  • a peripheral edge strip 70 is provided, which encloses a flat space 71 (corresponding to 19, 23, 25, 27 in FIGS. 1 to 8).
  • the height of this flat space 71 and the height of the edge strip 70 are one millimeter.
  • the four edge strip sections circumscribing a rectangle are each 40 mm x 10 mm in size. In the area of the corners 72, 73, 74 and 75, the edge strip sections run in an arc shape, the inner radius being approximately 0.5 millimeters.
  • bores 76 and 77 running at right angles to the upper side, which in the exemplary embodiment shown likewise have a radius of 0.5 millimeters.
  • the bore 76 opens into an outlet channel 78.
  • the lower bore 77 opens into an inlet channel 79.
  • Each inlet channel 79 and each outlet channel 78 of the reaction cells 32, 33, 34, 35 is connected to the synthesizer 1 via a hose connection, not shown in the drawing.
  • the support bar 50 is moved horizontally in order to press the reaction cells 32-35 against the PP film.
  • the control unit 37 sends a signal to the cell positioner 36.
  • the support bar 50 is then moved horizontally to remove the reaction cells 32-35 from the surface of the PP film .
  • the pressure plate 47 is then moved vertically into a new position.
  • the carrier bar 50 is again moved horizontally, and the reaction cells 32-35 are pressed again onto the surface of the PP film.
  • the preparation of an arrangement of chimeric oligonucleotides on the solid support material comprises the following steps: - 22 -
  • a PP film 49 preactivated as in Example 1 is fastened in the cell positioning device 36 using a rubber piece 90 in order to guarantee a good seal.
  • the vertical support bars 48 are attached in place to ensure that the film 49 holds well.
  • the selected reaction cells (between 1 and 4) 32, 33, 34, 35, with corresponding compression springs 62 are attached to the support bar 50, which is installed on the cell positioning machine.
  • the selected reaction cells 32, 33, 34, 35 are connected to the inlets and outlets of the DNA synthesizer via hose connections.
  • the coordinates of the starting position and the length of the displacement path are programmed into the control unit 37, the pressure plate 47 is moved into the starting position, and the reaction cells 32, 33, 34, 35 are brought into contact with the PP film 49.
  • the DNA synthesizer is programmed to synthesize the desired oligonucleotide sequences in the desired order and the synthesis begins.
  • the lifting unit 51 lifts the reaction cells away from the surface of the PP film, the pressure plate moves vertically upwards by the selected displacement length, and moves the lifting unit 51 forwards the support beam 50, whereby the contact between the reaction cells and the film is established.
  • a reaction cycle is then carried out by means of the DNA synthesizer in order to synthesize a first building block of an oligonucleotide on the surface of the film or in order to carry out a chain extension reaction of an oligonucleotide.
  • Step 7 is repeated as many times as necessary for a synthesis run.
  • the PP film 49 is pretreated as described herein.
  • a sheet of natural rubber (Paragummi 40 ° Shore, Richterich & Zeller, Basel, Switzerland, 0.5 mm thick, 400 x 300 mm) 90 is used as described.
  • 4 rectangular reaction cells 32, 33, 34, 35 made of Teflon are used, each reaction cell being held by two compression springs 62 (42N).
  • Each reaction cell is connected to the inlet and outlet tubing connections of an ABI 394/4 DNA synthesizer (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA, USA).
  • ABI 394/4 DNA synthesizer Perkin Elmer Corp., Foster City, CA, USA.
  • the starting position of the beam is set to 5 mm below the top edge of the PP film. 5 mm are programmed as the length of the displacement path of the reaction cells after each synthesis cycle. Due to the length of the reaction cells of 40 mm, an arrangement of oligonucleotides is generated in one synthesis run, which have a maximum length of 8 building blocks.
  • chimeric oligonucleotides total length of a chimeric oligonucleotide: 16 nucleotide building blocks, of which (i) building blocks 1 to 8: deoxyribonucleosides, which are linked to one another via phosphorothioate bridges, and (ii) building blocks 9 to 16 : 2'-0- (2-methoxyethyl) ribonucleosides which are linked to one another via phosphodiester bridges).
  • building blocks 1 to 8 deoxyribonucleosides, which are linked to one another via phosphorothioate bridges
  • building blocks 9 to 16 2'-0- (2-methoxyethyl) ribonucleosides which are linked to one another via phosphodiester bridges.
  • the supply unit comprises, among other things, 8 bottles with nucleoside building blocks, 4 bottles each containing one of the four deoxyribonucleotides (corresponds to chain building blocks of a first basic type series), and the 4 remaining bottles each to one of the four 2'-0- (2-methoxyethyl) -ribonucleosides (corresponding to Chain components of a second basic type series) included.
  • the corresponding bottles with the building blocks of the first basic type series are activated in the synthesis of the 1st to 8th building blocks of the oligonucleotides
  • the corresponding bottles with the building blocks of the second basic type series are activated for the synthesis of the 9th to 16th building blocks.
  • the synthesis of the DNA phosphorothioate portion of the oligonucleotides is accomplished by programming the DNA synthesizer to use one of the four possible reaction cells, for example cell 32, to provide the desired arrangement of oligonucleotides - 24 -
  • reaction cells for example 33, 34 and 35, are freely available in order to simultaneously synthesize adjacent arrays of oligonucleotides on the same PP film which correspond to other target sequences.
  • Commercially available phosphoramidites are used as nucleotide building blocks (Cruachem, A: 208120-21; G: 208190-2; C: 208130-21; T: 208100-21).
  • the synthesis machine dilutes 2 g of the phosphoramidites with 50 ml of acetonitrile (MWG-Biotech). In the synthesis, tetrazole (Cruachem.
  • this sequence is complementary to the sequence of the target nucleic acid. This sequence is programmed into the synthesizer, the synthesis taking place from 3 'to 5'.
  • the synthesis protocol reproduced below for coupling a nucleotide building block to the film or to a nucleotide chain is a protocol of the DNA synthesizer ABI 394/4, which is based on the specific circumstances of the production of an arrangement of oligonucleotides has been adapted on a PP film.
  • the protocol is reproduced in English, since the machine must be programmed in English: -25-
  • Bottle 18 contains acteonitrile, bottle 14 the detritylation solution, bottle 10 the phenylacetyl disulfide reagent and bottle B the respective phosphoramidite solution.
  • the described protocol is repeated correspondingly often until the desired arrangement of the first part of chimeric oligonucleotides has been completed, the first part, based on a single oligonucleotide, each comprising a maximum of the first 8 building blocks, and the arrangement as a whole includes the sequence given above.
  • the reaction cell is reset to the original starting position.
  • the DNA synthesizer is programmed so that 2'-0- (2-methoxyethyl) ribonucleoside phosphoramidite building blocks (2g) are used for the 9th to 16th building blocks, which according to P. Martin, Helv. Chim. Acta 78 (1995), pp. 486-504 and dissolved in 50 ml of acetonitrile.
  • the tetrazole (Cruachem. No. 17112044) used in the further course of the synthesis is used as obtained from the manufacturer.
  • Trichloroacetic acid in 1, 1, 1 trichloroethane (2.5% w / v) is used for demetilation.
  • a mixture of iodine / lutidine water / acetonitrile (0.65 g (Fluka) / 50 ml (Fluka) / 2.5 ml / 450 ml) is used for the oxidation.
  • the synthesis protocol is modified according to the use of the modified phosphoramidite building blocks.
  • the first base (3 'end) in each sequence is coupled to the PP film at the starting position of the reaction cell.
  • the starting position corresponds to the starting position at the beginning of the first synthesis run (5mm below the top edge of the PP film).
  • Subsequent bases are added while the reaction cell is moved vertically along the carrier film (displacement length 5 mm).
  • the synthesis sequence is based on the following base sequence:
  • This sequence is programmed into the synthesizer; the synthesis again takes place in the 3'-5 'direction.
  • the first base "g" at the 3 'end of SEQ ID No 2 corresponds to the 9th base "G” counted from the 3' end of SEQ ID NO 1, since the maximum length of the oligonucleotides synthesized in the 1st synthesis step is 8 chain building blocks .
  • Bottle 18 contains acteonitrile
  • bottle 14 contains the detritylation solution
  • bottle 15 contains the oxidation reagent (l 2 / lutidine / H 2 0)
  • bottle B contains the respective phosphoramidite solution.
  • the PP film is removed from the device and rinsed in isopropanol.
  • the film is then washed in 32% ammonia at room temperature in a reaction drum (see Example 1).
  • the chamber is rotated rapidly for 16 hours to ensure good reagent mixing.
  • the film is removed from the chamber, rinsed with water and methanol and briefly dried under vacuum.
  • the film with the desired arrangement of chimeric oligonucleotides can now be used in a standard hybridization assay, as mentioned above.

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Abstract

Bei einem Verfahren, einer Vorrichtung und einer Verwendung einer Vorrichtung zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldern synthetisierten Kettenmolekülen, insbesondere von zu Abschnitten von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, ist vorgesehen, nach einem Synthesedurchgang zum Synthetisieren von Kettenmolekülen (21) in einer Abfolge von Synthesefeldern (1 bis 16) wenigstens einen weiteren Synthesedurchgang durchzuführen, bei dem auf die bei dem oder jedem vorangehend durchgeführten Synthesedurchgang synthetisierten Kettenmoleküle (21) mit Kettenbausteinen (N1 bis N12; N9 bis N17) einer Grundtypreihe weitere Kettenbausteine (n4 bis n15) einer anderen Grundtypreihe verkettet werden, wobei die Zufuhr von Kettenbausteinen (N1 bis N17; n4 bis n15) zu den Synthesefeldern (1 bis 16) in den Synthesedurchgängen der vorgesehenen Abfolge der Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis n15) in den zu synthetisierenden Kettenmolekülen (21) entspricht und die Gruppen von Synthesefeldern (1 bis 16) zugeordneten Synthesebereiche (27) bei jedem Synthesezyklus in jeweils gleicher Durchgangsrichtung um ein Synthesefeld (1 bis 16) versetzt werden. Dadurch sind beispielsweise wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementäre Kettenmoleküle (21) mit Gruppen von Kettenbausteinen (N1 bis N17, n4 bis n15) zu verschiedenen Grundtypreihen effizient synthetisierbar.

Description

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Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von Kettenmolekülen auf einem Trägermaterial
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten von Erbinformationsträgem komplementären Oligonukleotiden, bei dem in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung wenigstens eine Reaktionszelle relativ zu dem Trägermaterial mit teilweise überlappenden Synthesebereichen positioniert und für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine einer Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung insbesondere zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten von Erbinformationsträgem komplementären Oligonukleotiden, mit einem Trägermaterialhalter, auf den das Trägermaterial aufbringbar ist, mit einer Vorratseinheit, mit wenigstens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial in einem Synthesebereich durchleitbar sind, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reaktionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial mit teilweise in Synthesefeldem überlappenden Synthesebereichen positionierbar ist, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vorratseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisierbar sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung einer Vorrichtung zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von - 2 -
Abschnitten von Erbinformationsträgem komplementären Oligonukleotiden, insbesondere zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einem Trägermaterialhalter, auf den das Trägermaterial aufgebracht wird, mit einer Vorratseinheit, mit wenigstens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial für eine Kettenverlängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial in einem Synthesebereich durchgeleitet werden, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reaktionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial mit teilweise in Synthesefeldem überlappenden Synthesebereichen positioniert wird, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vorratseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.
Ein derartiges Verfahren und eine derartige Vorrichtung sind aus dem Artikel "Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridisation behaviour of nucleic acids" von E.M. Southern, S.C. Case-Green, J.K. Eider et al., Seiten 1368 bis 1373, Nucleic Acid Research, 1994, Vol. 22, No. 8, bekannt. Bei dem vorbekannten Verfahren und der vorbekannten Vorrichtung ist eine Reaktionszelle mit einem rautenförmigen oder kreisförmigen Synthesebereich in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung relativ zu einem Trägermaterial mit teilweise überlappenden Synthesebereichen versetzt, wobei bei jedem Synthesezyklus eine Reaktionslösung mit einem für eine Kettenverlängerung vorgesehenen Kettenbaustein unter Kontakt mit dem Trägermaterial durch die Reaktionszelle durchgeleitet wird. Kettenmoleküle mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von zu Abschnitten von Erbinformationsträgem komplementäre Oligo- nukleotide, sind synthetisierbar, indem bei den Synthesezyklen jeweils eine Reaktionslösung mit einem vorbestimmten Kettenbaustein in dem Synthesebereich über das Trägermaterial geleitet wird, so daß in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisiert werden.
Die Kettenmoleküle sind vorzugsweise als Oligonukleotide ausgebildet. In der vorliegenden Anordnung auf dem Trägermaterial (als sog. "scanning array") dienen die Oligonukleotide der Analyse des Hybridisierungsverhaltens von Nukleinsäuren. Mit dem vorbekannten Verfahren - 3 -
und der vorbekannten Vorrichtung sind eine Vielzahl von sequenzhomologen komplementären Oligonukleotiden mit verschiedenen Kettenlängen synthetisierbar.
Bei der Inhibierung der Expression eines von einer Ziel-Nukleinsäure kodierten Proteins durch Interaktion (Hybridisierung) von relativ kurzen, zur Basensequenz der Ziel-Nukleinsäure komplementären Oligonukleotiden mit der Ziel-Nukleinsäure oder einem Ziel-Nukleinsäure - Protein-Komplex, wobei die Ziel-Nukleinsäure insbesondere eine einzelsträngige Ziel- Nukleinsäure mit sekundärer und tertiärer Struktur, insbesondere eine "messenger RNA" (mRNA) darstellt (sog. "Antisense-Technologie"), besteht aufgrund der komplizierten Sekundär- und Tertiärstruktur der mRNA das Problem, für eine Inhibierung der Translation einer spezifischen mRNA verfügbare Bindungsplätze für ein Oligonukleotid zu identifizieren, über deren Lokalisierung nur schwer Voraussagen getroffen werden können. Ein Trägermaterial, auf dem sich die genannte Anordnung von Oligonukleotiden befindet, kann insbesondere in einem Assay eingesetzt werden, mit dem bestimmt wird, ob bzw. wie stark eine Ziel-Nukleinsäure, wie beispielsweise ein solches mRNA-Molekül, in der Lage ist, mit einem oder mehreren der auf dem Trägermaterial befindlichen Oligonukleotide zu hybridisieren. In einem solchen Assay werden die Hybridisierungsbedingungen möglichst so gewählt, dass dabei die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur der Ziel-Nukleinsäure weitgehend erhalten bleibt und mit der entsprechenden in- vivo-Struktur der RNA übereinstimmt. Dabei kann die Stärke der Hybridisierung als Mass für die Zugänglichkeit einer bestimmten Region der Ziel-Nukleinsäure durch die Oligonukleotide dienen. Ein einzelnes, solchermassen identifiziertes, zur Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäure befähigtes Oligonukleotid kann dann nach bekannten Verfahren hergestellt und in der Antisense-Technologie zu medizinisch-therapeutischen oder diagnostischen Zwecken eingesetzt werden.
Aus der WO 95/21265 ist bekannt, zur Identifizierung von zur Inhibierung verwendbaren Bindungsplätzen als sogenannte "Antisense"moleküle an eine mRNA hybridisierbare Oligonukleotide auf einem festen Träger zu synthetisieren, wobei die Oligonukleotide jeweils vollständig aus einer einzigen definierten Art von Kettenbausteinen, beispeilsweise vom Desoxyribonukleotid-Typ, vom Desoxyribophosphorothioatnukleotid-Typ oder vom 2'-O-Methyl- Ribonukleotid-Typ (d.h. jeweils aus Kettenbausteinen einer einzigen Grundtypreihe), aufgebaut sind. - 4 -
Die bekannten Verfahren haben den Nachteil, dass sich mit ihrer Hilfe nur Oligonukleotide auf dem Träger synthetisieren und identifizieren lassen, die vollständig aus Kettenmolekülen einer einzigen bestimmten Grundtypreihe aufgebaut sind. Solche Oligonukleotide besitzen häufig nicht die in der Antisense-Technologie erwünschten multiplen Eigenschaften, wie beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität zur Ziel-Nukleinsäure und oder eine hohe Resistenz gegenüber endogenen Nukleasen verbunden mit dem Vermögen, die Expression des Zielproteins auf der Ebene der Zielnukleinsäure wirksam zu inhibieren.
Es ist weiterhin bekannt, dass pharmazeutisch besonders effiziente Oligonukleotide solche sind, die mehrere Eigenschaften in sich vereinen, beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität zur Ziel- Nukleinsäure / oder Resistenz gegen Abbau durch Endonukleasen verbunden mit der Eigenschaft, eine effiziente Spaltung der Ziel-Nukleinsäure durch die endogene RNAse H zu bewirken. Es ist gelungen, bei Oligonukleotiden eine Vielzahl von solchen Eigenschaften in ein und demselben Molekül vereinen, indem ein solches Oligonukleotid abschnittsweise aus Kettenbausteinen einer bestimmten Grundtypreihe aufgebaut ist, wobei jeder Abschnitt für eine bestimmte Eigenschaft oder Funktion des Oligonukelotides verantwortlich ist. Solche Oligonukleotide werden oft als "chimäre" Oligonukleotide bezeichnet. Chimäre Oligonukleotide bestehen aus Kettenbausteinen wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen, die in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden oder benachbarten Abschnitten, häufig auch in drei oder mehr solchen Abschnitten, synthetisiert sind (siehe beispielsweise S.T. Crooke et al., J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics 277 (1996), S. 923 -937).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, bei denen auf dem Trägermaterial eine effiziente Synthese einer Anordnung von Kettenmolekülen mit abschnittsweiser gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen, insbesondere Oligonukleotiden mit chimärer Struktur, jedoch ansonsten weitgehend gleichen charakteristischen Kenneigenschaften wie Basenerkennungscharakteristika bei Oligonukleotiden durchgeführt werden kann.
Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, bei als zu Abschnitten von Erbinformationsträgem wenigstens teilweise komplementären Oligonukleotiden ausgebildeten Kettenmolekülen ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, wobei die Oligonukelotide eine chimäre Struktur aufweisen, wodurch beispielsweise eine hohe Bindungsaffinität und oder eine hohe Widerstandsfähigkeit gegen auf solche Oligonukleotide - 5 -
einwirkenden natürlichen Abbauenzyme, verbunden mit der Fähigkeit zur effizienten Inhibition der Translation, oder allgemeiner der Expression, einer Ziel-Nukleinsäure erzielt wird.
Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß nach einer Abfolge von Synthesezyklen in einem Synthesedurchgang wenigstens ein weiterer Synthesedurchgang mit Kettenbausteinen einer gegenüber dem vorangegangenen Synthesedurchgang unterschiedlichen Grundtypreihe durchgeführt wird, daß bei dem oder jedem weiteren Synthesedurchgang bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges eine in diesem Synthesedurchgang verwendete Reaktionszelle in der gleichen Durchgangsrichtung wie bei dem vorangegangenen Synthesedurchgang so positioniert wird, daß der zugehörige Synthesebereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überiagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß an dieser Kettenposition vorgesehene Kettenbausteine des zu synthetisierenden Kettenmoleküles der in diesem Synthesedurchgang verwendeten Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden.
Diese Aufgaben werden bei einer Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet sind, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen Durchgangsrichtungen so positionierbar ist, daß bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges der zugehörige Synthesebereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überlagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuereinheit gesteuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle durchleitbar sind.
Alternativ zu einer solchen Vorrichtung, deren Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet, kann eine erfindungsgemässe Vorrichtung eine entsprechende Vorratseinheit umfassen, die jeweils Kettenbausteine einer einzigen Grundtypreihe enthält, und bei der die Vorratseinheit austauschbar ausgebildet ist, so dass nach jedem Synthesedurchgang die Vorratseinheit durch eine weitere Vorratseinheit mit Kettenbausteinen einer anderen Grundtypreihe ausgetauscht werden kann. - 6 -
Diese Aufgaben werden bei einer Verwendung einer Vorrichtung der beschriebenen Art dadurch gelöst, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet werden, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen Durchgangsrichtungen so positionierbar werden, daß bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges der zugehörige Synthesebereich abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld überiagert, in dem Kettenmoleküle mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuereinheit gesteuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle durchgeleitet werden.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer beschriebenen Vorrichtung zur Herstellung eines Trägermaterials umfassend eine Anordnung von in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmolekule mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen. Eine solche Anordnung umfasst somit Kettenmoleküle, die wenigstens zwei Abschnitte mit jeweils unterschiedlichen Grundtypreihen von Kettenbausteinen umfassen.
Ein weiterer erfindungsgemässer Gegenstand ist ein Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationstragem komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen. Eine solche Anordnung umfasst somit Kettenmoleküle, die wenigstens zwei Abschnitte mit jeweils unterschiedlichen Grundtypreihen von Kettenbausteinen umfassen.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Trägermaterial, das nach einem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbar ist. - 7 -
Durch das Durchführen von wenigstens zwei überlagerten Synthesedurchgängen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verwendung einer Vorrichtung lassen sich Kettenmoleküle mit Blöcken von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen, jedoch ansonsten gleicher Kenneigenschaften wie Basenerkennungscharakteristika synthetisieren, wobei sich beispielsweise durch unterschiedliche Abfolgen von Grundtypreihen und / oder verschieden groß ausgestaltete Synthesebereiche von in den verschiedenen Synthesedurchgängen verwendeten Reaktionszellen hohe Varietäten in den synthetisierten Kettenmolekülen mit hoher Effizienz erzielen lassen.
Zweckmäßigerweise sind die Synthesebereiche jeder Reaktionszelle rechteckförmig mit jeweils gleich großen Querseiten ausgebildet, wobei die Länge jeder Längsseite einer Reaktionszelle einem ganzzahligen Vielfachen eines Verschiebewegs in Längsrichtung entspricht. Die Reaktionszellen werden dabei von einem Synthesezyklus zum nächsten um den die Größe eines Synthesefeldes in Längsrichtung entsprechenden Verschiebeweg versetzt. Bei unterschiedlich langen Synthesebereichen sind die Reaktionszellen bei einem jeweils ersten Synthesezyklus jedes Synthesedurchganges so zu positionieren, daß die Synthesebereiche der Reaktionszellen in Durchgangsrichtung vorderseitig bündig miteinander überlagern.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Kettenmolekülen, wie bereits erwähnt, vorzugsweise um Oligonukleotide. Solche Oligonukleotide sind zur Paarung mit einem komplementären Nukleinsäurestrang, insbesondere einer mRNA, befähigt und bestehen aus einzelnen Kettenbausteinen, nämlich Nukleosiden oder Nukleosid-Analoga, die im Regelfall eine Nukleinsäure-Base oder ein -Basenanalog, die die Eigenschaften der Oligonukleotide zur Basenpaarung vermitteln, tragen. Ein Kettenbaustein umfasst auch eine intemukleosidische Brückenbindung zum nächsten Baustein, bespielsweise vom Phosphodiester-, Phosphorothioat- oder Amid-Typ, wie beispielsweise beschrieben in A. de Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 28 (1995), S. 366 - 374.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei einer Grundtypreihe der Kettenmoleküle jeweils um Kettenbausteine derselben Grundstruktur, wobei sich Mitglieder einer ersten Grundtypreihe von Mitgliedern einer zweiten Grundtypreihe insbesondere durch die zu erzielenden Eigenschaften, beispielsweise die durch den betrachteten Teil des Kettenmoleküls - 8 -
hervorgerufenen oder vermittelten physiologischen oder pharmakologischen Eigenschaften, unterscheiden. Im Falle von Oligonukleotiden sind solche Eigenschaften der Kettenmoleküle beispielsweise die Affinität zu einer Ziel-Nukleinsäure, die Nukleaseresistenz, die Sensitivität gegenüber RNAse H oder die toxischen Eigenschaften. Ein vorteilhaftes Oligonukleotid, das als Medikament im Rahmen der Antisense-Technologie eingesetzt wird, vereinigt mehrere vorteilhafte Eigenschaften in sich.
Innerhalb eines Kettenmoleküls sind solche unterschiedlichen Eigenschaften häufig mit dem Vorhandensein von Bausteinen bestimmter Grundstrukturen oder Grundtypen verknüpft. Beispiele von verschiedenen Grundtypreihen von Kettenbausteinen von Oligonukleotiden sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise handelt es sich bei den Grundtypen von Bausteinen um natürliche Nukleoside, wie beispielsweise 2'-Desoxyribonukleoside oder Ribonukleoside; oder um 2'-0-Alkyl-modifizierte Ribonukleoside, wobei die 2'-O-Alkylgruppe, die vorzugsweise 2'-O-C1-C5-Alkyl darstellt, insbesondere 2'-O-Methyl oder 2'-O-Ethyl, unsubstituiert oder, im Falle von 2'-O-Ethyl an der ß-Position mit -OH, -F oder Alkoxy, vorzugsweise mit d-C5-Alkoxy, insbesondere Methoxy, substituiert sein kann, wobei 2'-O-(2-Methoxyethyl)-modifizierte Ribonukleoside ganz besonders bevorzugt sind; um Bausteine von Nukleotiden oder Nukleotid- Analoga, die zu Oligonukleotiden mit einer intemukleosidischen Brückenbindung vom Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Typ, oder zu Oligonukleotiden einem modifizierten Rückgrat (intemukleosidische Brückenbindung) führen, wie PNA-Bausteine, Amid-Bausteine oder 3-Methylenphosphonat-Bausteine; oder um basenmodifizierte Nukleosidbausteine, wie beispielsweise 5-Propinyl-Nukleosid-Bausteine, wobei die einzelnen Grundtypen in Abhängigkeit von der Basensequenz der Zielnukleinsäure entsprechende Nukleinsäure-Basen oder - Basenanaloga aufweisen (siehe auch A. De Mesmaeker et al., wie oben erwähnt; E. Uhlmann et al., Chem. Rev. 90 (1990), S. 543-584). Auch Kombinationen von chemischen Modifikationen zu Bausteinen führen, die zu unterschiedlichen Grundtypreihen zählen. Beispielsweise werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleotide mit einer Phosphodiestergruppe als Bausteine einer Grundtypreihe, und 2'-O-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleotide mit einer Phosphorothioatgruppe als Bausteine einer anderen Grundtypreihe betrachtet. Erf indungsgemäss sind in einem Oligonukleotid Bausteine jeweils einer Grundtypreihe in einem Abschnitt synthetisiert, wobei ein Oligonukleotid aus wenigstens 2, beispielsweise 2 oder 3 Abschnitten besteht. - 9 -
Bevorzugt sind als Kettenmoleküle chimäre Oligonukleotide, die aus zwei Abschnitten bestehen, wobei der eine Abschnitt aus 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind, und der andere Abschnitt aus 2'-Desoxyribonukleosiden besteht, die über Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind.
Weiter bevorzugt sind als Kettenmoleküle chimäre Oligonukleotide, die aus drei Abschnitten bestehen, wobei, von 5'- in 3'-Richtung betrachtet, der erste Abschnitt aus 2'-O-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind, der daran anschliessende zweite Abschnitt aus 2'-Desoxyribonukleosiden besteht, die über Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind, und der daran anschliessende dritte Abschnitt wiederum aus 2'-O-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleosiden besteht, die über Phosphodiester-Brücken oder Phosphorothioat-Brücken miteinander verknüpft sind.
Bei solchen Chimären Oligonukleotiden, die Abschnitte mit 2'-0-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleosiden enthalten, sind zwei einzelne Abschnitte bevorzugt über eine Phosphorothioat- Brücke miteinander verknüpft, wenn es sich bei dem Nukleosid am 3'-Ende eines Abschnittes um ein 2'-Desoxyribonukleosid handelt; oder zwei einzelne Abschnitte sind alternativ über eine Phosphodiester-Brücke oder über eine Phosphorothioat-Brücke miteinander verknüpft, wenn es sich bei dem Nukleosid am 3'-Ende eines Abschnittes um ein 2'-O-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleosid handelt.
Geeignete, bevorzugte chimäre Oligonukleotide haben eine Gesamtlänge von etwa 15 bis etwa 25, beispielsweise 20, Nukleosidbausteinen, wobei der aus 2'-Desoxyribonukleosidbausteinen bestehende Abschnitt wenigstens etwa 5 solcher Bausteine umfasst.
Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezug auf die Figuren der Zeichnung. Es zeigen:
Fig. 1 in einer schematischen Darstellung in einem Ausführungsbeispiel einen Trägermaterialstreifen mit einer aufgesetzten, einen vier Synthesefelder überdeckenden Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach einem ersten Syn- - 10 -
thesezyklus eines ersten Synthesedurchganges mit grafischer Darstellung der synthetisierten Kettenbausteine einer Grundtypreihe,
Fig. 2 die Anordnung gemäß Fig. 1 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges,
Fig. 3 die Anordnung gemäß Fig. 2 nach Durchführen eines ersten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges mit Verkettung eines Kettenbausteines einer gegenüber oder bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten verschiedenen Grundtypreihe,
Fig. 4 die Anordnung gemäß Fig. 3 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges,
Fig. 5 in einer schematischen Darstellung in einem weiteren Ausführungsbeispiel einen
Trägermaterialstreifen mit einer einen drei Synthesefelder bedeckenden Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach Durchführen eines zehnten Synthesezyklus eines ersten Synthesedurchganges mit Darstellung der bis dahin verketteten Kettenbausteine einer Grundtypreihe,
Fig. 6 die Anordnung gemäß Fig. 5 mit einer aufgesetzten, einen fünf Synthesefelder überdeckenden Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach einem zweiten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges,
Fig. 7 die Anordnung gemäß Fig. 6 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges und
Fig. 8 die Anordnung gemäß Fig. 7 mit einer einen zwei Synthesefelder überdeckenden
Synthesebereich aufweisenden Reaktionszelle nach Durchführen des letzten Synthesezyklus eines weiteren dritten Synthesedurchganges.
Fig. 9 eine Vorrichtung zur Herstellung eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen gemäss der Erfindung in einer schematischen perspektivischen Ansicht. - 11 -
Fig. 10 die Hubeinheit der Vorrichtung schematisch in einer perspektivischen vergrösseren Ansicht.
Fig. 11 die Hubeinheit gemäss Fig. 10 in einer Draufsicht.
Fig. 12 einen Querschnitt durch den Trägerbalken der Hubeinheit mit einer am
Trägerbalken befestigten Reaktionszelle in einer Seitenansicht, teilweise aufgeschnitten:
Fig. 13 eine Draufsicht auf eine Reaktionszelle
Fig. 1 zeigt in einer schematischen Darstellung in einem Ausführungsbeispiel zu einem Verfahren und einer Vorrichtung gemäß der Erfindung einen mit insgesamt 16 Synthesefeldem 1 bis 16 belegbaren Trägermaterialstreifen 17 aus beispielsweise chemisch zur Synthese von Oligonukleotiden behandelten Polypropylen (PP) als Trägermaterial. Der Trägermaterialstreifen 17 ist auf einem in Fig. 1 nicht dargestellten, beispielsweise als mit einer elastischen Schicht versehene Metallplatte ausgestalteten Trägermaterialhalter aufgelegt. Auf den Trägermaterialstreifen 17 ist in der Darstellung gemäß Fig. 1 eine in ihren Umrissen dargestellte verschiebbare Reaktionszelle 18 aufgesetzt, die an eine in Fig. 1 nicht dargestellte Vorratseinheit angeschlossen ist. In Weiterbildungen sind mehrere Reaktionszellen 18 vorgesehen, die beispielsweise zum Durchführen einer Parallelsynthese nebeneinander angeordnet an einem Reaktionszellenträger angebracht und gemeinsam verschiebbar sind. In der an eine in Fig. 1 ebenfalls nicht dargestellten Steuereinheit angeschlossenen Vorratseinheit sind für eine Synthese von Kettenmolekülen unter Kettenverlängerung mit einer vorbestimmten, spezifischen Abfolge von Kettenbausteinen vorgesehene Reaktionsfluide, beispielsweise Reaktionslösungen, bevorratet oder beziehungsweise werden aufeinanderfolgend bevorratet, die von der Steuereinheit gesteuert der oder jeder Reaktionszelle 18 zuführbar sind.
Die Reaktionszelle 18 ist unter Abdichtung auf den Trägermaterialstreifen 17 auflegbar. Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 weist die Reaktionszelle 18 eine Vertiefung mit einer zu einer Seite offenen, rechteckförmigen, einen Synthesebereich 19 begrenzenden Umrandung auf, deren Abmessungen in dem dargestellten Ausführungsbeispiel der Größe von vier benachbarten Synthesefeldem 1 bis 16 entspricht. In der Darstellung gemäß Fig. 1 ist die mittels einer - 12 -
in Fig. 1 nicht dargestellten Positioniereinheit von der Steuereinheit gesteuert in Richtung der Synthesefelder 1 bis 16 unter Abheben verschiebbare Reaktionszelle 18 die von links gezählten ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 überdeckend positioniert dargestellt.
Im nachfolgenden wird erläutert, wie mit der vorangehend erläuterten Vorrichtung in einem Verfahren eine Anzahl von wenigstens zu einem Teil eines Abschnittes 20 eines Erbinformationsträgers komplementären Oligonukleotiden synthetisiert werden. Die einzelnen, die Erbinformation tragenden Basen des Abschnittes 20 sind in Fig. 1 symbolisch mit B1 bis B17 gekennzeichnet und stehen jeweils für eine der Basen A, C, G und U beziehungsweise T nach dem Watson-Crick-Modell.
Weiterhin ist in der Darstellung gemäß Fig. 1 der Aufbau von jeweils einem Synthesefeld 1 bis 16 zugeordneten Oligonukleotiden 21 als Kettenmoleküle dargestellt. Jedes Oligonukleotid 21 wird an eine zur Bindung vorpräparierte Restgruppe R des Trägermaterialstreifens 17 angefügt.
In der Darstellung gemäß Fig. 1 ist die Reaktionszelle 18 in der Position eines ersten Synthesezyklus eines ersten Synthesedurchganges angeordnet, bei dem ein für eine Kettenveriängerung vorgesehenes Reaktionsfluid mit einem natürlichen, zu der Base B1 des Abschnittes 20 komplementären Nukleotid N1 durch die Reaktionszelie 18 geleitet worden ist. Das Reaktionsfluid hat den Synthesebereich 19 überspült, so daß an die Restgruppen R der in der Darstellung gemäß Fig. 1 links gelegenen ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 das Nukleotid N1 angefügt worden ist.
In sich an den ersten Synthesezyklus gemäß Fig. 1 anschließenden weiteren Synthesezyklen des ersten Synthesedurchganges werden nunmehr unter schrittweisem Versetzen der Reaktionszelle 18 mittels der Positioniereinheit in einer Durchgangsrichtung jeweils um einen der Größe eines nächstbenachbarten Synthesefeldes 5 bis 16 entsprechenden Verschiebeweg die von dem Synthesebereich 19 überdeckten Synthesefelder 2 bis 16 in der Darstellung gemäß Fig. 1 von links nach rechts mit natürliche, zu den Basen B1 bis B13 des Abschnittes 20 komplementäre Nukleotide N2 bis N13 einer Grundtypreihe enthaltenden Reaktionsfluiden überspült.
Fig. 2 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 1 mit der Reaktionszelle 18 in einer die in der gewählten Darstellung links gelegenen, in Durchgangsrichtung letzten vier Synthesefelder 13 bis 16 über- - 13 -
deckenden Anordnung nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges mit einem das zu der Base B13 komplementäre natürliche Nukleotid N13 aufweisenden Reaktionsfluid. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß bis auf die in der Darstellung gemäß Fig. 2 von links gezählten ersten drei Synthesefelder 1 bis 3 und die letzten drei Synthesefelder 14 bis 16 in den mittigen Synthesefeldem 4 bis 13 sequenzhomologe, jeweils vier natürliche Nukleotide N1 bis N13 aufweisende Oligonukleotide 21 synthetisiert worden sind, wobei jedes in einem der Synthesefelder 4 bis 13 synthetisierte Oligonukleotid 21 , wie durch die jeweils gleiche Abfolge von Ordnungszahlen repräsentiert, zu einem zusammenhängenden Teil des Abschnittes 20 der Basen B1 bis B13 des Erbinformationsträgers komplementär ist.
Fig. 3 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 2 mit der den vier Synthesefelder 1 bis 16 überdeckenden Synthesebereich 19 aufweisenden Reaktionszelle 18 in der Positionierung eines ersten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 18 in die gleiche Positionierung wie bei dem ersten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges unter Überdeckung der in der Darstellung gemäß Fig. 3 links gelegenen ersten vier Synthesefelder 1 bis 4 gebracht. Dann wird ein Reaktionsfluid mit einem nunmehr modifizierten Nukleotid n5 als Kettenbaustein einer gegenüber der bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten verschiedenen Grundtypreihe durchgespült, wobei die Base des modifizierten Nukleotides n5 zu der Base B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär ist. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird somit in dem von links gezählten vierten Synthesefeld 4 ein aus fünf Kettenbausteinen in der Abfolge N1-N2-N3-N4-n5 zusammengesetztes Oligonukleotid 21 synthetisiert, das zu den ersten fünf Basen B1 bis B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär ist und natürliche Nukleotide N1 bis N4 der bei dem ersten Synthesedurchgang verwendeten Grundtypreihe und das modifizierte Nukleotid n5 der bei dem zweiten Synthesedurchgang verwendeten weiteren Grundtypreihe aufweist. In den randseitigen Synthesefeldem 1 bis 3 sind gegenüber dem Anfang des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers nicht oder nicht vollständig komplementäre Oligonukleotide 21 synthetisiert worden.
In den auf den ersten Synthesezyklus folgenden weiteren Synthesezyklen des zweiten Synthesedurchganges werden nunmehr nach Versetzen der Reaktionszelle 18 jeweils um einen der Größe eines benachbarten Synthesefeldes 5 bis 16 entsprechenden Verschiebeweges Reaktionsfluide mit modifizierten Nukleotiden n6 bis n17 durchgeleitet, wobei durch die Abfolge - 14 -
der Basen B6 bis B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers die Abfolge der zu den Basen B6 bis B17 komplementären modifizierten Nukleotide n6 bis n17 vorgegeben ist.
Fig. 4 zeigt in der Anordnung gemäß Fig. 3 die Reaktionszelle 18 in der Position bei dem letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges nach Durchspülen mit einem das zu der letzten Base B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre modifizierte Nukleotid n17 enthaltenden Reaktionsfluid. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß nunmehr bis auf die jeweils drei randseitigen Synthesefelder 1 , 2, 3, 14, 15, 16 in den mittleren Synthesefeldem 4 bis 13 sequenzhomologe, jeweils zu einem Teil des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre Oligonukleotide 21 mit einer Länge von acht Nukleotiden synthetisiert worden sind. Jedes Oligonukleotid 21 weist blockweise vier natürliche Nukleotide N1 bis N13 sowie sich daran anschließend vier modifizierte Nukleotide n5 bis n17 jeweils im Anschluß an die bei dem ersten Synthesedurchgang zuletzt angefügten natürlichen Nukleotide N4 bis N13 in einer der Abfolge der Basen B1 bis B17 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers entsprechenden Reihenfolge auf.
Der Trägermaterialstreifen steht nun, insbesondere hinsichtlich der in den mittleren Synthesefeldem 4 bis 13 synthetisierten Oligonukleotide 21 als Kettenmoleküle mit acht, in zwei Blöcken oder Abschnitten mit unterschiedlichen Grundtypreihen angeordneten Kettenbausteinen, zur Verwendung in einem Assay zur Untersuchung von Teilen des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers hinsichtlich zugänglicher Bindungsplätze für sogenannte "Antisense'Oiigonukleotide zur Verfügung, wie oben erwähnt.
Fig. 5 zeigt schematisch ähnlich Fig. 1 bis Fig. 4 in einem weiteren Ausführungsbeispiel zu einem Verfahrens und einer Vorrichtung gemäß der Erfindung den Trägermaterialstreifen 17 gemäß dem vorgenannten Ausführungsbeispiel. Bei dem nachfolgend erläuterten Ausführungsbeispiel sollen wiederum zu zusammenhängenden Teilen des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre Oligonukleotide 21 mit einer gegenüber dem anhand Fig. 1 bis Fig. 4 erläuterten Ausführungsbeispiel größeren Kettenlänge unter Verwendung von natürlichen und modifizierten Nukleotiden in drei unterschiedlich langen Blöcken von paarweise verschiedenen Grundtypreihen synthetisiert werden.
Hierzu wird gemäß Fig. 5 eine Reaktionszelle 22 mit einem drei Synthesefelder 1 bis 16 überdeckenden Synthesebereich 23 in der Anordnung bei einem zehnten Synthesezykius eines - 15 -
ersten Synthesedurchganges gezeigt. Bei dem ersten Synthesezyklus des ersten Synthesedurchganges wurde die Reaktionszelle 22 so angeordnet, daß von dem Synthesebereich 23 das in der Darstellung gemäß Fig. 5 von links gezählte dritte bis fünfte Synthesefeld 3, 4, 5 überdeckt worden ist. Dann wurden in den nachfolgenden Synthesezyklen des ersten Synthesedurchganges die Reaktionszelle 22 jeweils auf das nächstbenachbarte Synthesefeld 5 bis 14 versetzt und mit einem ein der Abfolge von Basen B2 bis B10 entsprechenden komplementären natürlichen Nukleotid N2 bis N10 enthaltenden Reaktionsfluid durchspült, so daß sich bis zu dem in Fig. 5 dargestellten zehnten Synthesezyklus die dargestellten komplementären Oligonukleotide 21 aufgebaut haben.
Fig. 6 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 5 nach einem zweiten Synthesezyklus eines weiteren zweiten Synthesedurchganges. Bei dem zweiten Synthesedurchgang wird eine Reaktionszelle 24 verwendet, mit deren Synthesebereich 25 fünf Synthesefelder 1 bis 16 überdeckbar sind. Bei einem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 24 so angeordnet, daß als einziges der Synthesefelder 5 bis 12 mit einer Kette von drei natürlichen Nukleotiden N1 bis N12 das in der Darstellung gemäß Fig. 6 von links gezählte fünfte Synthesefeld 5 zusammen mit den linksseitig äußeren vier Synthesefeldem 1 bis 4 erstmalig von dem Synthesebereich 25 überdeckt worden ist. Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wurden die in der Darstellung gemäß Fig. 6 ersten beiden links außen gelegenen Synthesefelder 1 , 2 erstmalig mit einem Reaktionsfluid überspült.
Bei dem ersten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges wurde ein Reaktionsfluid verwendet, die das zu der vierten Base B4 des Abschnittes 20 komplementäre modifizierte Nukleotid n4 enthält, während bei dem in Fig. 6 dargestellten zweiten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges das zu der fünften Base B5 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementäre, modifizierte Nukleotid n5 in dem Reaktionsfluid enthalten war.
In den weiteren Synthesezyklen des zweiten Synthesedurchganges wird die Reaktionszelle 24 jeweils um einen der Größe eines Synthesefeldes 1 bis 16 entsprechenden Verschiebeweg versetzt, und Reaktionsfluide mit komplementären modifizierten Nukleotiden n6 bis n15 in der entsprechenden Abfolge der Basen B6 bis B15 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers werden durchgeleitet. - 16 -
Fig. 7 zeigt in der Darstellung Fig. 6 die Positionierung der in dem zweiten Synthesedurchgang verwendeten Reaktionszelle 24 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus des zweiten Synthesedurchganges. Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß bis auf die vier am rechten und linken Rand gelegenen Synthesefelder 1 bis 4, 13 bis 16 in den mittleren Synthesefeldem 5 bis 12 Oligonukleotide mit acht Kettenbausteinen N1 bis N10, n4 bis n15 synthetisiert worden sind, wobei die bei dem ersten Synthesedurchgang synthetisierten drei Nukleotide N1 bis N10 biockweise einer natürlichen Grundtypreihe und die bei dem zweiten Synthesedurchgang verketteten fünf Nukleotide n4 bis n15 blockweise einer modifizierten Grundtypreihe zugeordnet sind.
Fig. 8 zeigt die Anordnung gemäß Fig. 7 nach Durchführen des letzten Synthesezyklus eines weiteren dritten Synthesedurchganges, bei dem als Kettenbausteine einer von dem vorangegangenen Synthesedurchgang verschiedenen Grundtypreihe wiederum zu den Basen B9 bis B17 komplementäre natürliche Nukleotide N9 bis N17 an die in den ersten beiden Synthesedurchgängen synthetisierten Oligonukleotide 21 verkettet worden sind. Bei dem dritten Synthesedurchgang wird eine Reaktionszelle 26 verwendet, mit deren Synthesebereich 27 zwei benachbarte Synthesefelder 1 bis 16 überdeckbar sind.
Bei einem ersten Synthesezyklus des dritten Synthesedurchganges wurde die Reaktionszelle 26 so positioniert, daß das in der Darstellung gemäß Fig. 8 von links gezählte fünfte Synthesefeld 5 als einziges Synthesefeld mit einer bei den vorangegangenen beiden Synthesedurchgängen synthetisierten vollen Anzahl von acht Kettenbausteinen erstmalig überdeckt worden ist. Bei diesem ersten Synthesezyklus wurde ein Reaktionsfluid mit einem zu der neunten Base B9 des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementären natürlichen Nukleotid N9 durch die Reaktionszelle 26 durchgeleitet.
Bei den weiteren Synthesezyklen des dritten Synthesedurchganges wurden nach Versetzen der Reaktionszelle 26 zum erstmaligen Überdecken des jeweils nächstbenachbarten Synthesefeldes 6 bis 16 durch die Abfolge der Basen B10 bis B17 vorgegebene komplementäre natürliche Nukleotide N10 bis N17 enthaltende Reaktionsfluide durch die Reaktionszelle 26 durchgespült. - 17 -
Wie aus Fig. 8 ersichtlich, sind nunmehr nach Abschluß des dritten Synthesedurchganges in den mittleren Synthesefeldem 5 bis 12 sequenzhomologe Oligonukleotide 21 mit einer Länge von zehn Kettenbausteinen synthetisiert, die jeweils zu einem Teil des Abschnittes 20 des Erbinformationsträgers komplementär sind und aus einem Block von drei natürlichen Nukleotiden N1 bis N10, einem Block von fünf modifizierten Nukleotiden n4 bis n15 und einem weiteren Block von zwei natürlichen Nukleotiden N9 bis N17 aufgebaut sind. Jeder Block von natürlichen Nukleotiden N1 bis N10 beziehungsweise N9 bis N17 und von modifizierten Nukleotiden n4 bis n15 weist eine Länge auf, die der Anzahl von von den Synthesebereichen 23, 25, 27 der in den entsprechenden Synthesedurchgängen verwendeten Reaktionszellen 22, 24, 26 überdeckten Synthesefeldem 1 bis 16 entspricht.
Es versteht sich, daß in weiteren, nicht dargestellten Ausführungen längerkettige Kettenmoleküle durch Verwendung von größere Synthesebereiche aufweisenden Reaktionszellen unter Ausführung von eine größere Anzahl von Synthesezyklen aufweisenden mehreren Synthesedurchgängen als bei den voranstehend ausführlich erläuterten Ausführungsbeispielen synthetisierbar sind. Durch Vorsehen von Reaktionszellen mit unterschiedlich großen Synthesebereichen sind dabei vielfältige Variationen in der blockweisen Abfolge von Grundtypreihen erzielbar, wobei es zweckmäßig ist, daß bei rechteckig ausgebildeten Synthesebereichen die Querseiten der Reaktionszellen gleich groß und die Größe der Längsseiten einem ganzseitigen Vielfachen der durch einen Verschiebeweg in Durchgangsrichtung festgelegten Abmessung der Synthesefelder entsprechen und die Reaktionszellen in Längsrichtung um die entsprechende Abmessung der Synthesefelder versetzt werden.
Es versteht sich, daß auch mehr als zwei verschiedene Grundtypreihen in den verschiedenen Synthesedurchgängen vorgesehen werden können, so daß mit einer entsprechenden Anzahl von Synthesedurchgängen vielfältigste Variationen in der Abfolge von Grundtypreihen erreichbar sind. - 18 -
Beispiele:
1. Herstellung eines aktivierten Polypropylen-Träαermaterials
Eine zurechtgeschnittene Polypropylen-Folie (PP: Mobil 40MB400, 400 mm x 300 mm) wird in einer zylinderförmigen Glastrommel (Durchmesser: 170 mm, Länge: 400 mm) in eine Lösung (180 ml) von 0,9 g Chrom(VI)oxid (Fluka), gelöst in einer 1 :1 Mischung von Essigsäureanhydrid : Essigsäure (Fluka), getaucht. Die Reaktionstrommel wird mit Hilfe einer mechanischen Rollvorrichtung 1 Std. schnell rotiert. Danach wird die Folie entnommen, für 30 Min. in ein Bad aus 1 M wässriger Essigsäure getaucht und anschliessend 30 Min. mit Methanol (Fluka) gespült. Die Folie wird im Hochvakuum getrocknet, wobei sie sich zum Schutz zwischen 2 Glasplatten befindet. Sodann wird die Folie in einem entsprechenden Glassbehälter in eine 1 M Lösung von BH3 (Aldrich Chemical Co.) in Tetrahydrofuran (180ml), die mit zusätzlichem Tetrahydrofuran auf 0.2M verdünnt wird, getaucht. Das Glassgefäss wird 1 Std. schnell rotiert. Die Folie wird entfernt, in 1 M wässrige Essigsäure getaucht, in Methanol gespült und unter Vakuum getrocknet. Die so behandelte Folie wird ohne weitere Behandlung als Trägermaterial in einem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt.
2. Automatisierte Vorrichtung zur erfindungsoemässen Herstellung eines Trägermaterials mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen
In Fig. 9 ist eine automatisierte Vorrichtung (sog. "Array-Maker") dargestellt, die zur Synthese eines erfindungsgemässen Trägermaterials mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen verwendet wird. Die Vorrichtung umfasst einen Zellen-Positionierautomaten oder Zellen-Positioniereinheit 36 und einen DNA-Synthetisierer (ABI 394/4) 31. Der DNA- Synthetisierer 31 ist mit dem Zellen-Positionierautomaten 36 über in der Zeichnung nicht dargestellte Schlauchverbindungen für die Reagenzien (insbesondere Reaktionslösungen, Spülflüssigkeiten und Spülgase) verbunden. Die Einlass-Schlauchverbindungen, die normalerweise verwendet werden, um die Reagenzien vom DNA-Synthetisierer den 4 Reaktionssäulen zuzuführen, die einen festen Träger umfassen und standardmässig zur Synthese von Oligonukleotiden vorgesehen sind, sind stattdessen mit den Einlassöffnungen von 4 Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 verbunden. Die Auslass-Schlauchverbindungen, die normalerweise den DNA-Synthetisierer mit den jeweiligen Auslassöffnungen der genannten 4 Reaktionssäulen verbinden, sind stattdessen mit den Auslassöffnungen der 4 Reaktionszellen - 19 -
32, 33, 34, 35 verbunden. Der Zellen-Positionierautomat 36 ist über eine nicht in der Zeichnung dargestellte Triggerleitung mit einer elektronischen Steuereinheit 37 verbunden, mit deren Hilfe ein Triggersignal ("advance fraction collector Signal") für die jeweils nächste Zellenposition des Zellen-Positionierautomaten 36 vom DNA-Synthetisierer 31 auf den Zellen-Positionierautomaten 36 übertragen wird. Der Zellen-Positionierautomat 36 und der DNA-Synthetisierer 31 stehen auf einem stabilen Untergrund 38 unterhalb einer Abzugshaube 39 mit einer Rückwand 40. Der Zellen-Positionierautomate 36 besitzt eine eigene Schutzhaube 41 , die in der Zeichnung nur stückweise dargestellt ist, und die mit einer vertikalen Schiebetür versehen ist, die mit Hilfe eines Griffes 42 und über in der Zeichnung nicht dargestellte Zugseile, die mit einem in der Zeichnung nicht dargestellten Gegengewicht verbunden sind und über Rollen 43 umgelenkt werden, in eine angedeutete obere und eine ebenfalls angedeutete untere Lage bewegt werden kann. Die Rollen 43 sind über Bügel und Streben mit dem aus mehreren Profilrohren 44 bestehenden und auf dem Untergund 38 abgestützen Profilgestell 45 verbunden. Der Zellen-Positionierautomat (36) wird über eine elektrisch betriebene Einheit 46, die, gesteuert über die Steuereinheit 37, eine Andruckplatte 47 vertikal stufenweise zwischen einer dargestellten oberen Position und einer angedeuteten unteren Position bewegt.
Die PP-Folie 49 ist auf der Andruckplatte 47 mit Hilfe von 5 vertikalen Metall-Haltestegen 48 mittels von am oberen und am unteren Ende der Haltestege befindlichen Schrauben befestigt. Ein dünnes Stück Gummi 90 (siehe Fig. 11 ) befindet sich zwischen der PP-Folie 49 und der Andruckplatte 47. Die Andruckplatte 47 wird vertikal zu vorprogrammierten Positionen bewegt. Die Reaktionszellen, 32, 33, 34 und 35 sind horizontal nebeneinander auf einem Trägerbalken
50 einer Hubeinheit 51 montiert.
Die Hubeinheit 51 ist in Fig. 10 gesondert und vergössert dargestellt. Fig. 11 zeigt die Hubeinheit
51 in Draufsicht zusammen mit den Reaktionszellen 32, 33, 34 und 35 sowie mit der Andruckplatte 47. Die Hubeinheit 51 verfügt über eine linke Führung 52 sowie eine rechte Führung 53, die jeweils als Hohlzylinder ausgebildet sind. Durch die Führungen 52 und 53 erstreckt sich jeweils eine linke Druckstange 54 und eine rechte Druckstange 55. Beide Druckstangen 54, 55 sind mit Hilfe von in der Zeichnung nicht dargestellten, in den Führungen 52, 53 angeordneten Druckfedern so vorgespannt, dass die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 auf die Andruckplatte 47 aufgedrückt werden. Zum Abheben der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 weg von der Andruckplatte 47 sind in der Zeichnung nicht dargestellte Exzenterscheiben vorgesehen, die mit den Stirnflächen 56 und 57 der Druckstangen 54, 55 zusammenwirken, um den - 20 -
Trägerbalken 50 und damit die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 von der Andruckplatte 47 wegzubewegen. Die Exzenterscheiben werden mit Hilfe eines elektrischen Antriebs verstellt, der ebenfalls mit der Steuerelektronik 37 verbunden ist.
Die Druckstangen 53, 54 sind mit Hilfe von Rändelmuttern 58 lösbar mit dem Trägerbalken 50 verbunden. Auf diese Weise können die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 zusammen mit dem Trägerbalken 50 abmontiert werden. Nach der Demontage des Trägerbalkens 50 ist es möglich, jede einzelne Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 vom Trägerbalken 50 zu lösen und gegebenen falls durch eine andere Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 zu ersetzen.
Die Verbindung der Reaktionszelle 32 ist in Fig. 12 beispielsweise dargestellt. Die Reaktionszelle 32 ist an einem Zapfen 59 befestigt, der sich durch eine Bohrung 60 im Trägerbalken 50 erstreckt. Auf der von der Reaktionszelle 32 wegweisenden Seite des Trägerbalkens 50 ist der Zapfen 59 mit einem Gewinde versehen, auf das eine Rändelmutter 61 aufgeschraubt ist. Der Zapfen 59 mit der aufgeschraubten Rändelmutter 61 ist mit Hilfe einer Druckfeder 62 vorgespannt, so dass die Rändelmutter 61 gegen die Rückseite des Trägerbalkens 50 angedrückt ist. Die Druckfeder 62 ist wesentlich schwächer ausgelegt als die in den Führungen 52, 53 vorgesehenen Druckfedem, so dass bei einem Aufsetzen der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 auf die Kunststoffolie 49 und die Andruckplatte 47 die Druckfeder 52 komprimiert wird und die Andruckkraft der Reaktionszelle 32, 33, 34, 35 festlegt. Die optimale Andruckkraft kann dabei durch Auswechseln der Druckfeder 62 schnell und einfach eingestellt werden. Für die in diesem Beispiel als Trägermaterial verwendete PP-Folie 40MB400 wird eine Druckeder 62 mit 42N verwendet. Ausserdem sorgt die Druckfeder 62 für einen gleichmässigen Andruck der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 gegen die Kunststoffolie 49 (siehe Fig. 11), welche entweder unmittelbar auf der Andruckplatte 47 oder unter Zwischenlegen einer Zwischenträgerfolie 90 (siehe Fig. 11 ) aus einem elastischen Material mit Hilfe der Haltestege 48 an der Andruckplatte 47 befestigt ist. Die vorzugsweise bis 1 mm starke Zwischenträgerfolie 90 (siehe Fig. 11 ) besteht zum Beispiel aus einer Polymerfolie aus Neoprene 60° Shore A oder Naturgummi (zum Beispiel Paragummi 40° Shore A), die beide von der Firma Richterich + Zeller AG, Basel, Schweiz vertrieben werden.
Der Aufbau der einseitig offenen Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 wird nachfolgend unter Bezug auf die Fig. 12 und 13 näher erläutert. - 21 -
Wie man den Fig. 12 und 13 entnehmen kann, bestehen die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 aus einem im Querschnitt rechteckigen Klotz aus einem verformbaren Material oder einem Kunststoff. In diesem Fall wird PTFE verwendet. Die zum Trägerbalken 50 weisende Rückseite 63 sowie die Aussenseiten 64, 65, 66, 67 und 68 sind jeweils eben. Auf der vom Trägerbalken 50 wegweisenden Oberseite 69 ist eine umlaufende Randleiste 70 vorgesehen, die einen flachen Raum 71 (entsprechend 19, 23, 25, 27 in Fig. 1 bis 8) einschliesst. Die Höhe dieses flachen Raumes 71 und die Höhe der Randleiste 70 betragen einen Millimeter. Die vier ein Rechteck umschreibenden Randleistenabschnitte sind jeweils 40 mm x 10 mm gross. Im Bereich der Ecken 72, 73, 74 und 75 laufen die Randleistenabschnitte bogenförmig, wobei der innere Radius etwa 0,5 Millimeter beträgt.
Zwischen den Ecken 72 und 75 bzw. 73 und 74 befinden sich rechtwinklig zur Oberseite verlaufende Bohrungen 76 und 77, die bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel ebenfalls einen Radius von 0,5 Millimeter aufweisen. Die Bohrung 76 mündet in einen Auslasskanal 78. Die untere Bohrung 77 mündet in einen Einlasskanal 79. Jeder Einlasskanal 79 und jeder Auslasskanal 78 der Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 ist über eine in der Zeichnung nicht dargestellte Schlauchverbindung mit dem Synthetisierer 1 verbunden.
3. Betrieb der Synthesevorrichtung
Im Betrieb der Vorrichtung wird der Trägerbalken 50 horizontal bewegt, um die Reaktionszellen 32 - 35 an die PP-Folie anzudrücken. Wenn ein elektrisches Signal vom Synthetisierer (advance fraction collector) empfangen wird, sendet die Steuereinheit 37 ein Signal an den Zellen- Positionierautomaten 36. Der Trägerbalken 50 wird daraufhin horizontal bewegt, um die Reaktionszellen 32 -35 von der Oberfläche der PP-Folie zu entfernen. Die Andruckplatte 47 wird daraufhin vertikal in eine neue Position bewegt. Schliesslich wird der Trägerbalken 50 wiederum horizontal bewegt, und die Reaktionszellen 32 - 35 werden erneut an die Oberfläche der PP- Folie angedrückt.
Die Herstellung einer Anordnung von Chimären Oligonukleotiden auf dem festen Trägermaterial umfasst folgende Schritte: - 22 -
1. Eine wie in Beispiel 1 voraktivierte PP-Folie 49 wird im Zell-Positionierautmaten 36 unter Verwendung eines Gummistückes 90, um eine gute Abdichtung zu garantieren, befestigt.
2. Die vertikalen Haltestege 48 werden an vorgesehener Stelle befestigt, um sicherzustellen, dass die Folie 49 gut hält.
3. Die ausgewählten Reaktionzellen (zwischen 1 und 4) 32, 33, 34, 35, mit entsprechenden Druckfedem 62 werden am Trägerbalken 50, der am Zellen-Positionierautomaten installiert wird, befestigt.
4. Die ausgewählten Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 werden über Schlauchverbindungen mit den Einlassen und Auslässen des DNA-Synthetisierers verbunden.
5. Die Koordinaten der Startposition und die Länge des Verschiebungsweges werden in die Steuereinheit 37 einprogrammiert, die Andruckplatte 47 wird in die Startposition bewegt, und die Reaktionszellen 32, 33, 34, 35 werden mit der PP-Folie 49 in Kontakt gebracht.
6. Der DNA-Synthetisierer wird so programmiert, dass die gewünschten Oligonukleotidsequenzen in der gewünschten Anordnung synthetisiert werden, und die Synthese beginnt.
7. Sobald gemäss dem Syntheseprotokoll (siehe unten) das sog. "advance fraction collector" Signal erzeugt wird, hebt die Hubeinheit 51 die Reaktionszellen von der Oberfläche der PP-Folie weg, bewegt sich die Andruckplatte vertikal um die gewählte Verschiebungslänge aufwärts, und bewegt die Hubeinheit 51 den Trägerbalken 50 vorwärts, wodurch der Kontakt zwischen den Reaktionszellen und der Folie hergestellt wird. Sodann wird mittels des DNA-Synthetisierers ein Reaktionszyklus durchgeführt, um einen ersten Baustein eines Oligonukleotides an der Oberfläche der Folie zu synthetisieren oder um eine Kettenverlängerungsreaktion eines Oligonukelotides durchzuführen.
8. Schrittt 7 wird so oft wiederholt, wie für einen Synthesedurchgang notwendig ist.
4. Herstellung einer Anordung von Oligonukleotiden auf einem Träger (sog, "scanning arrav"), die chimäre Oligonukleotide mit einer Länge von 16 Nukleotidbausteinen umfasst
Die PP-Folie 49 wird, wie hierin beschrieben, vorbehandelt. Ein Bogen Naturgummi (Paragummi 40° Shore, Richterich & Zeller, Basel, Schweiz, 0,5 mm dick, 400 x 300 mm) 90 wird wie beschrieben verwendet. Wie oben beschrieben, werden 4 rechteckige Reaktionszellen 32, 33, 34, 35, aus Teflon verwendet, wobei jede Reaktionszelle von zwei Druckfedem 62 (42N) gehalten wird. Jede Reaktionszelle wird mit den Einlass- und Auslass-Schlauchverbindungen eines ABI 394/4 DNA-Synthetisierers (Perkin Eimer Corp., Foster City, CA, USA) verbunden. Die - 23 -
Startposition des Trägerbalkens wird auf 5 mm unterhalb der Oberkante der PP-Folie eingestellt. Als Länge des Verschiebungsweges der Reaktionszellen nach jedem Syntheseszyklus werden 5 mm programmiert. Aufgrund der Länge der Reaktionszellen von 40 mm wird somit in einem Synthesedurchgang eine Anordnung von Oligonukleotiden erzeugt, die eine Maximallänge von 8 Bausteinen aufweisen.
Durch die im folgenden beschriebenen Reaktionsabläufe entsteht auf dem Trägermaterial eine Anordnung von Chimären Oligonukleotiden (Gesamtlänge eines Chimären Oligonukleotides: 16 Nukleotidbausteine, davon (i) Bausteine 1 bis 8: Desoxyribonukleoside, die über Phosphorothioatbrücken miteinander verknüpft sind, und (ii) Bausteine 9 bis 16: 2'-0-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleoside, die über Phosphodiesterbrücken miteinander verknüpft sind). In Analogie zu dem oben in allgemeiner Form beschriebenen Vorgehen (Fig. 1 bis 3; chimäres Oligonukleotid mit einer Gesamtlänge von 8 Bausteinen, davon die ersten 4 als N1 bis N4 und die letzten 4 als n5 bis n8 bezeichnet), entsprechen die Nukleotide des in einem ersten Synthesedurchgang hergestellten, Bausteine 1 bis 8 umfassenden Teils der gewünschten Oligonukleotide den Nukleotiden N1 bis N8, während die Nukleotide des im zweiten Synthesedurchgang hergestellten, Bausteine 9 bis 16 umfassenden Teils der gewünschten Oligonukleotide analog als n10 bis n16 zu bezeichnen wären.
Die Vorratseinheit umfasst unter anderem 8 Flaschen mit Nukleosidbausteinen, wobei 4 Flaschen jeweils eines der vier Desoxyribonucleotide (entspricht Kettenbausteinen einer ersten Grundtypreihe) enthalten, und die 4 übrigen Flaschen jeweils eines der vier 2'-0-(2- Methoxyethyl)-Ribonukleoside (entspricht Kettenbausteinen einer zweiten Grundtypreihe) enthalten. Im folgenden werden bei der Synthese der jeweils 1. bis 8. Bausteine der Oligonukleotide die entsprechenden Flaschen mit den Bausteinen der ersten Grundtypreihe angesteuert, und zur Synthese der jeweils 9. bis 16. Bausteine werden die entsprechenden Flaschen mit den Bausteinen der zweiten Grundtypreihe angesteuert.
(i) Synthese der jeweils 1. bis 8. Bausteine einer Anordnung von Oligonukleotiden auf der PP- Folie (DNA-Bausteine verknüpft über Phosphorothioat-Brücken)
Die Synthese des DNA-Phosphorothioat-Teiis der Oligonukleotide wird durchgeführt, indem der DNA-Synthetisierer so programmiert wird, dass eine der vier möglichen Reaktionszellen verwendet wird, beispielsweise Zelle 32, um die gewünschte Anordnung von Oligonukleotide zu - 24 -
erzeugen. Die drei übrigen Reaktionszellen, beispielsweise 33, 34 und 35 stehen zur freien Verfügung, um simultan auf derselben PP-Folie benachbarte Anordnungen von Oligonukleotiden zu synthetisieren, die anderen Zielsequenzen entsprechen. Als Nukleotidbausteine werden kommerziell erhältliche Phosphoramidite verwendet (Cruachem, A: 208120-21 ; G: 208190-2; C: 208130-21 ; T: 208100-21). 2 g der Phosphoramidite werden von der Synthesemaschine mit 50 ml Acetonitril (MWG-Biotech) verdünnt. Bei der Synthese wird Tetrazol (Cruachem. 17112044) wie vom Hersteller bezogen verwendet; Trichloressigsäure in 1 ,1 ,1-Trichlorethan (2,5% Gew./Vol.) wird zur Detritylierung verwendet; Phenylacetyldisulfid (hergestellt gemäss S. 329 des Artikels von H.C.P.F. Roden et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 110 (1991), S. 325-331) wird als 0,5 M Lösung in einem Gemisch von Acetonitril / 3-Picolin (4:1) zur Oxidation verwendet. Die erste Base (vom 3'-Ende her) wird an der Startposition an die PP- Folie gekoppelt, und nachfolgende Basen werden zugefügt, indem sich die Reaktionszelle gemäss der entsprechend programmierten Steuereinheit vertikal abwärts bewegt.
Es wird eine Anordnung von Oligonukleotiden erzeugt, der die folgende Sequenz zugrundeliegt:
5'-GGC CTG AAG GTG CTG GAC AGT GTC TGA AAG TAG GGC ACT AGC CAA GTT GCA GCA GAA GGC-3' (SEQ ID NR 1).
In der dargestellten Form ist diese Sequenz komplementär zur Sequenz der Zielnukleinsäure. Diese Sequenz wird in den Synthetisierer einprogrammiert, wobei die Synthese von 3'- in 5'- Richtung erfolgt.
Bei dem im folgenden wiedergegebenen Syntheseprotokoll zur Kopplung eines Nukleotidbausteines an die Folie bzw. an eine Nukleotidkette (d.h. eines Synthesezyklus), handelt es sich um ein Protokoll der DNA-Synthetisiermaschine ABI 394/4, das an die spezifischen Gegebenheiten der Herstellung einer Anordnung von Oligonukleotiden auf einer PP-Folie angepasst worden ist. Das Protokoll wird in englischer Sprache wiedergegeben, da die Maschine in Englisch zu programmieren ist: -25-
Schritt Funktion Dauer
1. begin
2. 18 to waste 3s
3. 18 to column 8s
4. reverse f lush 6s
5. block f lush 3s
6. phos prep 4s
7. column 1 on
8. block vent. 2s
9. B+tet to column 4s
10. column 1 off
1 1. column 2 on
12. 18 to waste 4s
13. block flush 3s
14. block vent 2s
15. B+tet to column 4s
16. column 2 off
17. column 3 on
18. 18 to waste 4s
19. block flush 3s
20. block vent 2s
21. B+tet to column 4s
22. column 3 off
23. column 4 on
24. 18 to waste 4s
25. block flush 3s
26. block vent 2s
27. B+tet to column 4s
28. column 4 off
29. wait 20 s
30. 18 to waste 3s
31. block flush 3s
Figure imgf000027_0001
32. 18 to column 8s - 26 -
33. reverse flush 4 s
34. 10 to column 6 s
35. wait 15 s
36. 10 to column 1 s
37. wait 10 s
38. start detrityi
39. 18 to waste 3 s
40. 18 to column 6 s
41. reverse flush 6 s
42. 18 to column 6 s
43. reverse flush 6 s
44. 14 to waste 3 s
45. 14 to column 9 s
46. wait 15 s
47. 18 to column 4 s
48. reverse flush 4 s
49. 18 to column 4 s
50. reverse flush 15 s
51. advance fraction collector
52. wait 2 s
Figure imgf000028_0001
53. end
Dabei enthält in der Vorratseinheit Flasche 18 Acteonitril, Flasche 14 die Detritylierungslösung, Flasche 10 das Phenylacetyldisulfid-Reagenz und die Flasche B die jeweilige Phosphoramidit- Lösung.
Zur Kopplung der weiteren Bausteine wird das beschriebene Protokoll entsprechend oft wiederholt, bis die gewünschte Anordnung des ersten Teils von Chimären Oligonukleotiden fertiggestellt ist, wobei der erste Teil, bezogen auf ein einzelnes Oligonukleotid, maximal jeweils die ersten 8 Bausteine umfasst, und wobei die Anordnung insgesamt die oben angegebene Sequenz umfasst.
(ii) Synthese der jeweils 9. bis 16. Bausteine einer Anordnung von Oligonukleotiden auf der PP- Folie (2'-0-(2-Methoxyethyl)-Ribonukleoside verknüpft über Phosphodiester-Brücken) - 27 -
Die Reaktionszelle wird in die ursprüngliche Ausgangsposition zurückgesetzt. Der DNA- Synthetisierer wird so programmiert, dass für den 9. bis 16. Baustein 2'-0-(2-Methoxyethyl)- Ribonukleosid-Phosphoramidit-Bausteine (2g) verwendet werden, die gemäss P. Martin, Helv. Chim. Acta 78 (1995), S. 486 - 504 hergestellt und in 50 ml Acetonitril gelöst werden. Das im weiteren Syntheseverlauf verwendete Tetrazole (Cruachem. No. 17112044) wird wie vom Hersteller bezogen verwendet. Zur Detrytilierung wird Trichloressigsäure in 1 ,1 ,1 Trichlorethan (2,5% w/v) verwendet. Zur Oxidation wird ein Gemisch von Jod/Lutidin Wasser/Acetonitril verwendet (0.65g (Fluka)/50ml (Fluka)/2,5ml/450ml) verwendet. Das Syntheseprotokoll wird entsprechend der Verwendung der modifizierten Phosphoramidit-Bausteine abgeändert. Die erste Base (3'-Ende) in jeder Sequenz wird an der Ausgangsposition der Reaktionszelle an die PP-Folie gekoppelt. Dabei entspricht die Ausgangsposition der Startposition zu Beginn des ersten Synthesedurchganges ( 5mm unterhalb der Oberkante der PP-Folie). Nachfolgende Basen werden zugefügt, während die Reaktionszelle vertikal auf der Trägerfolie entlang bewegt wird (Verschiebungslänge 5 mm). Der Syntheseabfolge liegt folgende Basenquenz zugrunde:
5'-ccc acc gag gcc tga agg tgc tgg aca gtg tct gaa agt agg gca cta gcc aag ttg cag-3' (SEQ ID NR 2).
Diese Sequenz wird in den Synthetisierer einprogrammiert; die Synthese erfolgt wiederum in 3'-5'-Richtung. Dabei entspricht die erste Base "g" am 3'-Ende der SEQ ID No 2 der 9. Base "G" gezählt vom 3'-Ende der SEQ ID NO 1 , da die Maximallänge der im 1. Synthesedurchgang synthetisierten Oligonukleotide 8 Kettenbausteine beträgt.
Syntheseprotokoll der Synthesemaschine ABI 394/4 (modifiziert hinsichtlich der Herstellung der Oligonukleotid-Anordnung ("array"); das "advance fraction collector" - Signal wird verwendet zur Verschiebung der Reaktionszelle). Das Protokoll wird in englischer Sprache wiedergegeben, da die Maschine in Englisch zu programmieren ist:
Schritt Funktion Dauer
1. begin
2. 18 to waste 3 s
3. 18 to column 8 s -28-
4. reverse flush 6s
5. block flush 3s
6. phos prep 4s
7. column 1 on
8. block vent. 2s
9. B+tet to column 4s
10. column 1 off
11. column 2 on
12. 18 to waste 4s
13. block flush 3s
14. block vent 2s
15. B+tet to column 4s
16. column 2 off
17. column 3 on
18. 18 to waste 4s
19. block flush 3s
20. block vent 2s
21. B+tet to column 4s
22. column 3 off
23. column 4 on
24. 18 to waste 4s
25. block flush 3s
26. block vent 2s
27. B+tet to column 4s
28. column 4 off
29. wait 50 s
30. 18 to waste 3s
31. block flush 3s
32. 18 to column 8s
33. reverse flush 4s
34. 15 to column 8s
35. wait 20 s
Figure imgf000030_0001
36. 15 to column 2s - 29 -
37. wait 10 s
38. start detrityl
39. 18 to waste 3 s
40. 18 to column 6 s
41. reverse flush 6 s
42. 18 to column 6 s
43. reverse flush 6 s
44. 14 to waste 3 s
45. 14 to column 9 s
46. wait 15 s
47. 18 to column 4 s
48. reverse flush 4 s
49. 18 to column 4 s
50. reverse flush 15 s
51. advance fraction collector
52. wait 2 s
Figure imgf000031_0001
53. end
Dabei enthält in der Vorratseinheit Flasche 18 Acteonitril, Flasche 14 die Detritylierungslösung, Flasche 15 das Oxidationsreagenz (l2 / Lutidin / H20) und Flasche B die jeweilige Phosphoramidit-Lösung.
Auf diese Weise erhält man schliesslich die gewünschte Anordnung ("scanning array") von Chimären Oligonukleotiden auf dem Träger.
5. Entschützung der Oligonukleotide
Die PP-Folie wird wird aus der Vorrichtung genommen und in iso-Propanol gespült. Danach wird die Folie in 32% Ammoniak bei Raumtemperatur in einer Reaktionstrommel (siehe Beispiel 1) gewaschen. Man lässt die Kammer 16 Std. schnell rotieren, um ein gutes Vermischen der Reagenzien zu garantieren. Die Folie wird aus der Kammer genommen, mit Wasser und Methanol gespült und kurz unter Vakuum getrocknet. Die Folie mit der gewünschten Anordnung von Chimären Oligonukleotiden kann nun in einem Standard- Hybridisierungsassay, wie oben erwähnt, eingesetzt werden.

Claims

- 30 -PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten
Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, bei dem in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen in einer Durchgangsrichtung wenigstens eine Reaktionszelle relativ zu dem Trägermaterial (17) mit teilweise überlappenden Synthesebereichen positioniert und für eine Kettenveriängerung vorgesehene Kettenbausteine einer Grundtypreihe durch die Reaktionszelle geleitet werden, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen synthetisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Abfolge von Synthesezyklen in einem Synthesedurchgang wenigstens ein weiterer Synthesedurchgang mit Kettenbausteinen einer gegenüber dem vorangegangenen Synthesedurchgang unterschiedlichen Grundtypreihe durchgeführt wird, daß bei dem oder jedem weiteren Synthesedurchgang bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges eine in diesem Synthesedurchgang verwendete Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) in der gleichen Durchgangsrichtung wie bei dem vorangegangenen Synthesedurchgang so positioniert wird, daß der zugehörige Synthesebereich (19, 23, 25, 27) abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld (1 bis 16) überlagert, in dem Kettenmoleküle (21) mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß an dieser Kettenposition vorgesehene Kettenbausteine des zu synthetisierenden Kettenmoleküles der in diesem Synthesedurchgang verwendeten Grundtypreihe durch die Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) geleitet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß bei einem ersten Synthesezyklus des oder jedes weiteren Synthesedurchganges die oder jede bei diesem Synthesedurchgang verwendete Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) so positioniert wird, daß ein einziges Synthesefeld (1 bis 16) mit Kettenmolekülen (21) einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge von deren Synthesebereich (19, 23, 25, 27) überlagert wird, und daß bei jedem weiteren Synthesezyklus ein weiteres benachbartes Synthesefeld (3 bis 16) mit einer in dem oder jedem vor- - 31 -
angegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge erstmalig von dem Synthesebereich (19, 23, 25, 27) überlagert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei jedem
Synthesedurchgang die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) bei jedem Synthesezyklus um den gleichen Verschiebeweg versetzt wird, so daß die Synthesefelder (1 bis 16) gleich groß sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei wenigstens zwei
Synthesedurchgängen die Synthesebereiche (23, 25, 27) der jeweils verwendeten Reaktionszelien (22, 24, 26) verschieden groß sind, wobei jeder Synthesebereich (23, 25, 27) in einer Richtung einem Vielfachen der Abmessungen der Synthesefelder (1 bis 16) in dieser Richtung entspricht.
5. Vorrichtung insbesondere zum Herstellen eines Trägermateriales mit in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationstragem komplementären Oligonukleotiden, insbesondere zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einem Trägermaterialhalter, auf den das Trägermaterial (17) aufbringbar ist, mit einer Vorratseinheit, mit wenigstens einer an die Vorratseinheit angeschlossenen Reaktionszelle, durch die bei abdichtendem Auflegen der oder jeder Reaktionszelle auf das Trägermaterial (17) für eine Kettenveriängerung vorgesehene Kettenbausteine unter Kontakt mit dem Trägermaterial (17) in einem Synthesebereich durchleitbar sind, mit einer Positioniereinheit, mit der die oder jede Reaktionszelle in einem Synthesedurchgang in einer Abfolge von Synthesezyklen jeweils um einen Verschiebeweg relativ zu dem Trägermaterial (17) mit teilweise in Synthesefeldem überlappenden Synthesebereichen positionierbar ist, und mit einer Steuereinheit zum Steuern der Vorratseinheit und der Positioniereinheit, so daß bei mehreren Synthesezyklen in wiederholt von Synthesebereichen einer Reaktionszelle überdeckten Synthesefeldem Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleichen Abfolgen von Kettenbausteinen synthetisierbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorratseinheit Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis n15) wenigstens zweier verschiedener Grundtypreihen bevorratet sind, daß mit der Steuereinheit die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) bei wenigstens zwei Synthesedurchgängen in jeweils gleichen - 32 -
Durchgangsrichtungen so positionierbar ist, daß bei Synthesezyklen eines Synthesedurchganges der zugehörige Synthesebereich (19, 23, 25, 27) abschnittsweise mit einem in diesem Synthesedurchgang bislang unbedeckten Synthesefeld (1 bis 16) überlagert, in dem Kettenmoleküle (21) mit einer in dem oder jedem vorangegangenen Synthesedurchgang synthetisierten maximalen Kettenlänge vorliegen, und daß von der Steuereinheit gesteuert bei zwei aufeinanderfolgenden Synthesedurchgängen Kettenbausteine (N1 bis N17, n4 bis 15) verschiedener Grundtypreihen durch die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) durchleitbar sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede Reaktionszelle (18,
22, 24, 26) einen rechteckigen Synthesebereich (19, 23, 25, 27) aufweist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Längsabmessungen jedes
Synthesebereiches (19, 23, 25, 27) einer Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einem ganzzahligen Vielfachen der durch jeweils gleiche Verschiebewege in allen Synthesedurchgängen festgelegten Größe der Synthesefelder (1 bis 16) in Längsrichtung der Synthesebereiche (19, 23, 25, 27) entspricht.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in verschiedenen Synthesedurchgängen verwendete Reaktionszellen (22, 24, 26) verschieden große Synthesebereiche (23, 25, 27) aufweisen.
9. Verwendung einer in Anspruch 5 definierten Vorrichtung zur Herstellung eines
Trägermaterials umfassend eine Anordnung von in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgem komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen.
10. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die oder jede Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einen rechteckigen Synthesebereich (19, 23, 25, 27) aufweist. - 33 -
11. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die
Längsabmessungen jedes Synthesebereiches (19, 23, 25, 27) einer Reaktionszelle (18, 22, 24, 26) einem ganzzahligen Vielfachen der durch jeweils gleiche Verschiebewege in allen Synthesedurchgängen festgelegten Größe der Synthesefelder (1 bis 16) in Längsrichtung der Synthesebereiche (19, 23, 25, 27) entspricht.
12. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß in verschiedenen Synthesedurchgängen verwendete Reaktionszellen (22, 24, 26) verschieden große Synthesebereiche (23, 25, 27) aufweisen.
13. Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldem synthetisierten Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationstragem komplementären Oligonukleotiden, wobei benachbarte Synthesefelder Kettenmoleküle mit abschnittsweise gleicher Abfolge von Kettenbausteinen unterschiedlicher Grundtypreihen umfassen.
14. Trägermaterial, aufweisend eine Anordnung von in Synthesefeldem synthetisierten
Kettenmolekülen mit einer vorbestimmten Abfolge von Kettenbausteinen, insbesondere von wenigstens zu Teilen von Abschnitten (20) von Erbinformationsträgern komplementären Oligonukleotiden, herstellbar nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.
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