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WO1999053304A1 - Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre - Google Patents

Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre Download PDF

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WO1999053304A1
WO1999053304A1 PCT/FR1999/000830 FR9900830W WO9953304A1 WO 1999053304 A1 WO1999053304 A1 WO 1999053304A1 FR 9900830 W FR9900830 W FR 9900830W WO 9953304 A1 WO9953304 A1 WO 9953304A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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buffer solution
biological sample
compartment
nucleic material
nucleic
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000830
Other languages
English (en)
Inventor
Lyse Santoro
Patrick Broyer
Marc Rodrigue
Bruno Colin
Sophie Barral-Cadiere
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
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Priority to AU31518/99A priority patent/AU745247B2/en
Priority to CA002328298A priority patent/CA2328298A1/fr
Priority to EP99913375A priority patent/EP1070246A1/fr
Publication of WO1999053304A1 publication Critical patent/WO1999053304A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a process for electro-separation of a nucleic fraction from a cell lysate, as well as to any device, in particular for single use, for the implementation of said process for electro-separation.
  • nucleic material or a nucleic fraction
  • separation is meant generically any process making it possible to enrich or concentrate a medium, to isolate or to determine (qualitatively and / or quantitatively) in a complex medium, at least one nucleic material, ie deoxyribonucleic acid (DNA) and / or ribonucleic acid (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • a first reservoir for a first buffer solution comprising two opposite compartments, each closed by a permeable membrane, one of large section, and the other of small section, and each having a cut-off threshold making it possible to retain the nucleic material or protein of interest,
  • This device is used to concentrate a nucleic or protein fraction, already relatively pure but diluted, by placing this fraction on the membrane of large section, and by collecting on the membrane of small section the same fraction, but concentrated. Concentration is obtained due to the transport of biomolecules by electric field lines, which are concentrated at the level of the membrane of small section.
  • the biological sample 44 comprising a nucleic material, for example a drop of blood placed on a porous support, is eluted by the electrolytic flow, so that in each well the nucleic material is dissolved or distributed, for a subsequent sampling, for example with a pipette .
  • document US-C-5 41 5 758 describes a method of treatment under the action of an electric field in a liquid medium, of a biological sample comprising both a nucleic material and a non-nucleic material, for example protein, free and mobile in said liquid medium under the action of the electric field, process according to which: a) a buffer solution is available, b) a permeable membrane is available, in contact on one side with the buffer solution, and having a predetermined cutoff threshold for stopping the nucleic material, on the side of said buffer solution, during its migration under the action of the electric field, c) establishing said electric field, so that its lines of force pass through the buffer solution, and pass through the permeable membrane.
  • the biological sample is placed in the buffer solution, upstream of the membrane, according to the direction of circulation of the nucleic material under the action of the electric field,
  • a method does not make it possible to separate the nucleic material from the biological sample, to the point of eliminating practically any non-nucleic material, for example protein.
  • a first stage consists in bringing the lysed biological sample into contact with an adsorbent, so as to separately fix the nucleic material
  • a second step consists in salting out this nucleic material, starting from the adsorbent.
  • a buffer solution 10 is placed in a container 10, subjected to an electric field between two electrodes 20a and 20b.
  • This container communicates with the rest of the container 10, by means of an orifice 1 2, through which is arranged a membrane 30 allowing to stop the moving nucleic material under the electric field.
  • a well 60 for collecting the nucleic material.
  • it is in the part 17 of the container 1 5, that is arranged the adsorbent element from which it is desired to release the nucleic material.
  • the present invention proposes to provide a solution to this unsolved problem.
  • the electric field is applied directly to the biological sample in the buffer solution, for a limited and defined period, on the one hand by the time sufficient for the arrival on the membrane stopping the nucleic material, and the presence of nucleic material on the side of the buffer solution, and on the other hand by the fact that at the end of said duration the non-nucleic material has not migrated and / or remains in the process of migration towards said membrane,
  • the nucleic material is taken at the end of said duration.
  • electro-separation in the present invention, it is meant that molecules present together in a medium, and being able to present identical electrical charges, are distinguished from each other in said medium because of their respectively different kinetics in the same field. electric.
  • the method according to the invention provides the essential advantage of quickly and easily obtaining a nucleic fraction free of other constituents, in particular proteins, directly amplifiable, from a cell lysate. We know the difficulties associated with amplification techniques, especially for respiratory type samples, in that the fraction to be amplified must be free of inhibitors. By implementing the method according to the invention, the protein inhibitors of the amplification techniques are practically eliminated.
  • the fraction enriched in nucleic material, comprising DNA and / or RNA which is obtained by the implementation of the method according to the invention, is directly amplifiable by commonly used techniques used, such as in particular the PCR technique for DNA and the NASBA or TMA technique for RNA.
  • the biological sample is placed on another membrane, on the side of the latter in contact with the buffer solution.
  • the time of application of the electric field is at most 30 minutes, and preferably between 5 and 30 minutes.
  • the duration of migration of the nucleic fraction is from 10 to 20 minutes, more preferably from 15 minutes.
  • the value of the majority of the buffer solution is at least equal to 0.1 mol / l, and preferably between 0.1 and 5 mol / l.
  • the majority of the buffer solution being between 0.1 and 5 mol / l, it is effectively possible either to put only one buffer solution in the two compartments, or to put two different buffer solutions in the two compartments.
  • the proportion of the buffer solution can be the same in the two compartments and will be between 0.1 and 1 mol / l, more preferably 0.1 mol / l.
  • the proportion of the buffer solution can be different in the two compartments and will preferably be 0.1 mol / l in the first compartment and 1 mol / l in the second compartment, respectively.
  • the electric field has a value between 100 and 250 V, and preferably equal to 1 50 V.
  • the distance separating the biological sample from the permeable membrane, following the lines of force of the electric field is at least equal to 30 mm, and preferably to 75 mm.
  • the cell lysate from which the process according to the invention is carried out can be a cell lysate coming from a simple or complex culture, that is to say comprising different cells, or can also be a biological sample, such as in particular blood , urine, and respiratory-like sputum.
  • the cell lysate from which the nucleic fraction is obtained, then subjected to the method according to the invention can be obtained by various lysis techniques, in particular lysis by mechanical shock, by electric shock and others.
  • the biological sample results directly from the lysis of a cell sample, in particular by mechanical or electrical means. This embodiment is carried out in the same device, as described below.
  • the cell lysate is obtained from a sample of a bodily fluid, for example blood or respiratory sputum.
  • the membrane recovering the fraction enriched in nucleic material has a predetermined cutoff threshold, preferably less than 100 kDa.
  • the porosity of the membrane at the cathode will preferably be greater than 10 kDa.
  • a proteinase is added to the biological sample.
  • the fraction enriched in nucleic material is directly subjected to a subsequent amplification step.
  • Cell lysis will preferably also be carried out by electrical lysis in the presence of proteinase K and a detergent.
  • a second object according to the invention is a single-use device for implementing a method according to the invention, comprising a support or base, in which the various means are assembled and integrated, as well as arranged between them , in particular electrodes, required for electro-separation, as well as means for interfacing said support with the outside, on the one hand for the transfer of the various fluids or liquids to and / or out of the support, including the biological sample, the buffer solution, and the fraction enriched in nucleic material, and on the other hand for the supply and control of the electrical means required at least for electro-separation, including that of the electric field.
  • the device comprises means for receiving the biological sample; a reservoir for the buffer solution, comprising a compartment closed by the permeable membrane, communicating at an end opposite to said compartment with the means for receiving the biological sample, said reservoir being intended to receive a first buffer solution; and a second reservoir for a second buffer solution, identical or different from the first buffer solution, separated from the first reservoir only by said membrane; two electrodes for generating the electric field, one in contact with the first buffer solution, upstream of the membrane in the direction of circulation of the nucleic material, and the other in contact with the second buffer solution; and a means of extracting the fraction enriched in nucleic material from the compartment closed by the membrane.
  • the reservoir comprises another compartment, for the reception of at least a fraction obtained from the biological sample, disposed upstream of said compartment according to the direction of circulation of the nucleic material. , communicating with the means for receiving the biological sample.
  • the two tanks communicate respectively with ventilation vents, and with at least one filling channel.
  • an intermediate well is arranged and communicates between the means for receiving the biological sample and the first reservoir.
  • the intermediate well is provided with means making it possible to lyse a cell sample.
  • the intermediate well is provided with electrodes ensuring lysis of said cell sample.
  • the device comprises, communicating with each other, a compartment for receiving the lysate, an intermediate lysis well, and a compartment for receiving the fraction enriched in nucleic material.
  • the volume of the lysate receiving compartment is greater 8 the volume of the compartment for receiving the fraction enriched in nucleic material.
  • the proportion between the volumes of the compartments for receiving the lysate and for receiving the nucleic fraction is between 1 ⁇ and 1/50, in particular between 1/5 and 1/20 .
  • a third object according to the invention is the use of the device described above for electro-separating a fraction of nucleic acids from a cell lysate.
  • a fourth object according to the invention is the use of the electro-separated fraction by the implementation of the method according to the invention for detecting and / or identifying nucleic acids directly after amplification.
  • FIG. 1 shows schematically an electroelution apparatus for nucleic acids and proteins from a gel, and electrophoretic concentration of macromolecules (Isco, Iowa, USA), which is used in a different process, namely electro-separation according to the invention.
  • Compartments A and B in which two negative and positive electrodes are immersed respectively, are filled with 1 x TBE buffer; compartment C, comprising a part C1 and a part C2, and compartment Cf are filled with 0.1 ⁇ TBE buffer.
  • a dialysis membrane is placed at the interface of compartments Cf and B (porosity 100 kDa), and compartments C1 and A (porosity 10 kDa).
  • Figure 2 indicates the percentage of nucleic acids of S. epidermidis recovered in compartment Cf, after migration from a cell lysate obtained by mechanical shock, determined by analysis with a Vidas device (BioMerieux, France), according to example 2.
  • the migration time minutes
  • the percentage of nucleic acids recovered in the compartment Cf expressed in relative units of fluorescence.
  • Figure 3 shows the kinetics of protein recovery from a cell lysate.
  • the percentage of proteins of the bacterial lysate is recovered in compartment Cf, after migration from a cell lysate obtained by mechanical shock, determined by Bradford assay, according to example 2.
  • On the abscissa is shown the migration time (minutes) , and on the ordinate is represented the percentage of acids nucleic acids recovered in compartment Cf, expressed in optical density (OD) at 595 nm.
  • Figure 4 shows the kinetics of nucleic acid recovery from cell lysate.
  • the percentage of nucleic acids of Staphycoccus epidermidis, recovered in compartment Cf after migration from a cell lysate obtained by electric shock, is determined by analysis with a Vidas device, according to example 2.
  • On the abscissa is represented the time of migration (minutes), and on the ordinate is represented the percentage of nucleic acids recovered in the compartment Cf, expressed in relative units of fluorescence.
  • Figure 5 shows the amplification of purified nucleic acids from a cell lysate.
  • the amount of amplicons produced by PCR from 10 ⁇ l of DNA molecules is recovered in the compartment Cf, from a cell lysate obtained by mechanical shock, after different migration times, according to Example 2.
  • On the abscissa is represented the migration time (minutes), and on the ordinate is represented the percentage of nucleic acids recovered in the compartment Cf, expressed in relative units of fluorescence.
  • Figure 6 shows the amount of amplicons produced by PCR amplification, after lysis of different initial concentrations of bacteria by mechanical shock, and migration of their nucleic material for 1 5 minutes under an electric field, according to Example 2.
  • abscissa is represented the number of initial bacteria for 200 ⁇ ⁇ of lysate, and on the ordinate is represented the signal obtained after PCR, expressed in relative units of fluorescence.
  • FIG. 7 illustrates the amount of amplicons produced by TMA amplification, after lysis of different initial concentrations of bacteria by mechanical shock, and migration of their nucleic material for 15 minutes under an electric field, according to example 2.
  • the abscissa is shown the number of initial bacteria per 200 ⁇ ⁇ of lysate, and on the ordinate is represented the signal obtained after TMA, expressed in OD x 1000.
  • FIG. 8 indicates the percentage of blood proteins recovered in compartment Cf as a function of the migration time of a clinical blood sample lysed by mechanical shock, according to example 3. On the abscissa is shown the migration time (minutes), and on the ordinate 10 shows the percentage of proteins recovered in the compartment Cf, expressed as OD at 595 nm.
  • FIG. 9 indicates the percentage of proteins of a sputum recovered in compartment Cf as a function of the migration time of a clinical sample of the respiratory type lysed by mechanical shock, according to example 2. On the abscissa is represented the migration time (minutes), and on the ordinate is represented the percentage of proteins recovered in the compartment Cf, expressed in OD at 595 nm.
  • Figure 10 shows the elimination of PCR inhibitors initially present in the respiratory type clinical sample. It indicates the quantity of DNA amplicons produced by PCR from different initial quantities of DNA of S. epidermidis, according to Example 5. On the abscissa is shown the number of copies of initial DNA for 10 ⁇ ⁇ of sample , and on the ordinate is shown the signal obtained after PCR, expressed in relative fluorescence units.
  • Figure 11 indicates the amount of amplicons produced from different initial amounts of lysed bacteria and deposited in compartment C1. Each point represented on the graph represents an average value obtained from 13 different sputum and bronchial aspirations, according to Example 5. On the abscissa is shown the number of copies of initial DNA for 200 ⁇ of sample, and on the ordinate is represented the signal obtained after PCR, expressed in relative units of fluorescence.
  • Figure 12 indicates the amount of amplicons produced from different initial amounts of bacteria lysed by mechanical shock, and deposited in compartment C1, according to Example 5. The study was carried out in parallel on 4 different sputum. On the abscissa is represented the number of copies of initial DNA for 200 ⁇ ⁇ of sample, and on the ordinate is represented the signal obtained after TMA, expressed in OD x 1000.
  • Figure 1 3 shows a disposable device according to the invention, seen in perspective.
  • FIG. 14 represents a bottom view of the device represented in FIG. 13.
  • FIG. 1 5 represents a top view of the device represented in FIG. 13. 1 1
  • FIG. 1 6 represents a sectional view, along the section line represented in FIG. 1 5, of the device according to FIG. 13.
  • Example 1 General procedure for implementing the method according to the invention. The procedure is based on the use of a nucleic acid electroelution apparatus according to FIG. 1. A volume of biological sample is carefully placed at the bottom of compartment C1. The two electrodes of the circuit are connected to an electric generator. A constant voltage of 150 V is applied across the generator. The intensity of the circuit varies from 15 to 20 mA and the temperature of the buffer in compartment C varies from 23 to 30 ° C. The biological molecules initially deposited at the bottom of compartment C1 migrate in the electric field thus created, at a speed defined according to their charge and their size.
  • the voltage at the terminals of the generator is stopped and the molecules which have migrated to the cathode and of apparent molecular weight less than or equal to 10 kDa are collected in the compartment Cf, in a final volume of 200 ⁇ l.
  • the sample thus recovered is kept in ice before analysis.
  • the biological sample deposited in compartment C1 can be a nucleic and / or protein material, purified or not, a cell lysate, coming from a biological sample such as blood, urine and a sputum of respiratory type.
  • the cell lysates studied were obtained from S. epidermidis, Gram + walled bacteria (A054). These bacteria are grown in BCC liquid medium (Brain Heart Broth, bioMerieux 4101 9). Before lysis, they are suspended, either in a clinical sample (liquefied and decontaminated sputum, blood, plasma, serum, etc.), or in lysis buffer (30 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI pH 7.2).
  • 300 ⁇ ⁇ of this cell suspension were lysed by essentially following two protocols: - Lysis protocol by mechanical shock: 90 ⁇ ⁇ of glass beads with a diameter between 90 and 1 50 ⁇ m, 3 iron beads with a diameter of 2 mm and 5 glass beads with a diameter of 3 mm are placed in a Falcon tube in the presence of 300 ⁇ l of the cell suspension, as described in the patent (FR-A-2 768 743). 6 mg / ml final proteinase K (PK) (EC 3.4.21 .14 Boehringer-Mannheim, ref. 1092766) can be added to the cell suspension. The closed tube is vortexed for two minutes, at 1 2 maximum power of the device (Reax 2000, Heidolph). The bacterial suspension thus treated and recovered is immediately deposited in compartment C1 of the device described in Figure 1. If the PK is present in the cell solution, an additional incubation for 15 minutes at 37 ° C is carried out.
  • PK final proteinase K
  • the percentage of nucleic acids collected from the cathode side, after migration into the compartment Cf, is determined by measuring the OD (optical density) of the sample recovered at 260 nm. The percentage collected is equal to the ratio of the OD value at 260 nm after migration, over the OD value at 260 nm before migration. Likewise, the amount of protein collected at the cathode after migration is determined by Bradford assay and OD reading at 595 nm. The percentage of proteins collected is equal to the ratio of the protein quantity recovered to the initial quantity.
  • the quantity of nucleic acids recovered from the cathode side after migration is checked on 0.8% agarose gel; 10 ⁇ l of the sample are deposited per well, the electrophoretic migration is carried out under constant voltage (1 50 V) and the gel is stained with ethidium bromide (BET) before observation under ultraviolet radiation.
  • BET ethidium bromide
  • the proteins recovered at the cathode after migration can be observed on polyacrylamide gel in the presence of SDS (SDS-PAGE 10%); 5 to 10 ⁇ l of the sample are deposited per well, the electrophoretic migration is carried out at constant intensity (25 mA), and the gel is stained with Coomassie blue.
  • the quantity of nucleic acids recovered from the cathode side is determined by specific detection according to a hybridization technique 1 3 said sandwich, using the Vidas device marketed by bioMérieux (France).
  • Oligonucleotide probes for capture and specific detection of nucleic acids of S. epidermidis were chosen.
  • the capture and detection oligonucleotides have respectively the sequence: 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3 '(SEQ ID No: 1) and 5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID No: 2).
  • the detection probe is labeled by coupling with alkaline phosphatase (AKP).
  • the specific hybridization of these probes with the nucleic acids released in the lysate is a function of the quantity of nucleic acids present, but also of their accessibility for the probes used.
  • Two specific amplification protocols for DNA and RNA molecules of S. epidermidis were carried out from the samples collected after migration: a PCR protocol for the amplification of DNA and a NASBA protocol for the amplification of 6S rRNA 1 and a TMA protocol for the amplification of 1 6S rRNA.
  • Primer 2 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3 '(SEQ ID No: 4) The following temperature cycles were used: 1 time 3 minutes at 94 ° C 2 minutes at 65 ° C 35 times 1 minute at 72 ° C
  • Primer 1 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA -3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Primer 2 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTT TGTCACCGGCAGTCAACTTAGA -3 '(SEQ ID NO: 6) 14
  • PCR 10 ⁇ l or 50 ⁇ l of collected sample are used for each PCR and TMA test, respectively.
  • the amplicons produced by PCR are observed on 0.8% agarose gel and quantified on Vidas according to the protocol described above.
  • the amplicons produced by TMA are detected and quantities on microplate by hybridization with a capture probe and a detection probe, specific for S. epidermidis, according to the method described by P. Cros et al. , Lancet 1992, 240: 870.
  • the detection probe is coupled to "Horse Radish Peroxidase" (HRP).
  • HRP "Horse Radish Peroxidase”
  • Example 2 Kinetics of recovery of nucleic acids from cell lysate.
  • a suspension of Staphylococcus epidermidis (1-5.10 ⁇ b./300 ⁇ l) is lysed by mechanical shock or by electric shock, as described in the general protocol above. 200 ⁇ l of each lysate are deposited at the bottom of compartment C1. The electric field is applied for different times between the two electrodes. The amounts of nucleic acids or proteins present in the sample collected in compartment Cf are determined by analysis with a Vidas apparatus or Bradford assay, respectively. The quality of the molecules recovered was assessed on agarose or acrylamide gel, in the presence of SDS.
  • the nucleic acids of the lysate migrated into the compartment Cf gradually over time, as shown in FIG. 2. After 60 minutes, all of the nucleic material of the lysate is recovered, regardless of the presence or not of proteinase K during the lysis step. This result is in favor of good release and accessibility of nucleic acids in the lysate.
  • the DNA molecules recovered have the same migration profile on 0.8% agarose gel as before migration into the lysate. In the presence of proteinase K during the lysis step, as shown in FIG. 3, only a negligible percentage of proteins is recovered after 60 minutes, while in the absence of protease, approximately 50% of proteins are recovered. 1 5
  • the nucleic acids of the lysate gradually migrate to the cathode. After 60 minutes, a large percentage of nucleic acids is recovered. The recovery of the nucleic material initially present in this lysate is similar to that of the nucleic material initially present in a lysate obtained by mechanical shock (cf. above).
  • no nucleic acid can be detected in the compartment Cf, even after 60 minutes of migration (Vidas analysis and 0.8% agarose gel). On agarose gel, the DNA and RNA molecules of the lysate recovered can be observed separately after migration, whereas they are not initially in the lysate.
  • Amplification of the purified nucleic acids from cell lysate The S. epidermidis bacteria diluted in 300 ⁇ l of lysis buffer are lysed by mechanical shock in the absence of PK, as described in the general protocol of Example 1. 200 ⁇ l of the lysate are deposited at the bottom of compartment C1. An electric field is applied between the two electrodes for different times.
  • the nucleic material which has migrated into compartment Cf is amplified by PCR (10 ⁇ l per test) or TMA (50 ⁇ l per test). The amount of amplicons produced is analyzed by specific hybridization on Vidas or microplate, respectively.
  • the DNA of a number greater than or equal to 1.10 ⁇ initial bacteria (/ 200 ⁇ l) can be amplified and detected, after mechanical lysis of the cells and migration of the constituents of the lysate under an electric field; or 10 ⁇ DNA molecules or bacteria per PCR test, given that the migrated material is recovered in 200 ⁇ l and that 10 ⁇ l of this material is used for each PCR test.
  • 10 ⁇ DNA molecules correspond to the sensitivity limit of the PCR protocol, in general. This result demonstrates a high sensitivity for the recovery of bacterial DNA molecules after cell lysis by mechanical shock and purification of the intracellular DNA molecules by electric field in solution.
  • the RNA of at least 40 initial bacteria can be detected after lysis of the bacteria, migration of the cellular constituents under an electric field and specific amplification of the rR1 6S of S. epidermidis; or 10 initial bacteria per TMA test, taking into account that the migrated nucleic material is recovered in 200 ⁇ l final, and that 50 ⁇ l are added by TMA test.
  • This result demonstrates a high sensitivity for the recovery of bacterial 16S rRNA molecules, after lysis by mechanical shock and purification of the lysate nucleic acids by electric field.
  • Example 3 Kinetics of recovery of nucleic acids from a blood sample.
  • the blood sample is used without pre-treatment. 200 ⁇ l of this clinical sample is deposited at the bottom of compartment C1. A voltage of 150 V is applied between the two electrodes for different times, then the material recovered from the cathode side in the compartment Cf is analyzed by assaying proteins according to the Bradford method, and on polyacrylamide gel in the presence of SDS (SDS-PAGE 10%).
  • the pH of the TBE buffer used for migration was fixed at pH 7.0, the isoelectric point of the hemoglobin being equal to 7.0.
  • 50 or 100 kDa membranes were placed at the interface of the 1 7 compartments Cf and B.
  • a negligible percentage of proteins is recovered with the 100 kDa membrane, and 10% of the proteins are recovered with the 50 kDa membrane.
  • pH 7.0 only 10% of negatively charged blood proteins at pH 7.0 have an apparent molecular weight greater than 50 kDa and less than 100 kDa.
  • a negligible percentage of proteins are recovered after 1 5 minutes of migration, using either a 50 or 100 kDa membrane.
  • Example 4 Kinetics of recovery of nucleic acids from a respiratory type sample.
  • the respiratory sample Before use, the respiratory sample is fluidized, decontaminated according to the standard protocol with N-acetyl-L-cysteine and sodium hydroxide (NALC / NaOH); then it is inactivated for 20 minutes at 95 ° C.
  • NALC / NaOH N-acetyl-L-cysteine and sodium hydroxide
  • the TBE buffer used for migration has a pH equal to 8.3 or 7.0, and membranes of different pore sizes were placed at the interface of compartments Cf and B: 10, 50 or 100 kDa.
  • pH 8.3 10% of the proteins are recovered after 30 minutes, and 70-80% after 60 minutes with membranes of 50 or 10 kDa, which suggests that 70-80% of the proteins sputum are negatively charged at these pHs and have an apparent molecular weight greater than 50 kDa.
  • pH 7.0 approximately 0% of the proteins are recovered after 30 or 60 minutes of migration, whatever the size of the pores of the membrane used (within the sensitivity limit of the detection techniques used).
  • Example 5 Lifting of inhibition of amplification protocols by the respiratory type samples after migration.
  • Respiratory-type samples are inhibitors of PCR and TMA reactions. 200 ⁇ l of these samples were deposited at the bottom of compartment C1 of the system described in Figure 1. A voltage of 1 50 V 1 8 constant was applied between the two electrodes for 1 5 minutes. A 10 kDa separation membrane between Cf and B was chosen. After migration, the sample recovered in compartment Cf (200 ⁇ l) was supplemented with different quantities of purified nucleic acids from S. epidermidis. 10 ⁇ l or 50 ⁇ l of this solution were used for each PCR or TMA test, respectively. As shown in Figure 10, up to 102-103 initial copies of DNA can be amplified in 10 ⁇ l of migrated sample. This result demonstrates that the migrated sputum has lost its PCR inhibitory character. Similar results were obtained with the TMA amplification.
  • S. epidermidis were seeded in 300 ⁇ l of fluidized sputum, decontaminated and inactivated as described in Example 4 above. These cells in suspension were lysed by mechanical shock in the absence of PK, and the lysate migrated for 15 minutes at 150 V with a 10 kDa membrane between compartments Cf and B, according to the diagram presented in Figure 1.
  • the quantity of bacterial nucleic acids recovered in the compartment Cf after migration was quantified by Vidas analysis specific to the bacterial species studied. The experiment was carried out from different sputum. On average, 80% of S. epidermidis nucleic acids are recovered.
  • the S. epidermidis bacteria were seeded in 300 ⁇ l of fluidized sputum, decontaminated, inactivated, then lysed by mechanical shock in the absence of PK as described in Example 1.
  • 200 ⁇ l of the lysate migrated for 1 5 minutes at 150V with a 10 kDa membrane between compartments Cf and B.
  • the nucleic material present in the sample was amplified by PCR (10 ⁇ l per test), and the amplicons produced were quantified by Vidas analysis.
  • up to 10 4 -1 ⁇ 3 initial lysed bacteria can be detected after migration and amplification of DNA molecules (i.e. 100-10 DNA molecules / 10 ⁇ l of PCR test).
  • the S. epidermidis bacteria were seeded in 300 ⁇ l of fluidized sputum, decontaminated, inactivated and then lysed by mechanical shock in the absence of PK.
  • 200 ⁇ l of the lysate migrated for 1 5 minutes under 1 50V with a 10 kDa membrane between the compartments Cf and A.
  • the rRNA molecules present in the recovered sample were amplified by TMA (50 ⁇ l per test), and the amplicons produced were quantified by specific sandwich hybridization on a microplate.
  • TMA 50 ⁇ l per test
  • the amplicons produced were quantified by specific sandwich hybridization on a microplate.
  • at least 10 ⁇ -10 5 initial lysed bacteria can be detected after migration and amplification of RNA molecules (i.e. at least 5.10 4 -5.10 3 initial bacteria / 50 ⁇ l TMA test). This result demonstrates the elimination of the TMA inhibitors initially present in the sputum.
  • Example 6 Electro-separation after lysis by electric shock. 1-5.10 9 S. epidermidis were seeded in 300 ⁇ l of fluidized sputum, decontaminated and inactivated as described in example 4. These cells in suspension were lysed by electric shock in the presence of 10 "2 mg / ml final of PK and 2% final LLS (Lithium Lauryl Sulfate, Sigma) 200 ⁇ l of lysate migrated for 1 5 minutes at 150 V with a 10 kDa membrane between compartments Cf and B, according to the diagram presented in FIG. 1. The nucleic material recovered after migration (200 ⁇ l) was amplified by specific PCR for S.
  • LLS Lithium Lauryl Sulfate
  • epidermidis (10 ⁇ l / test), and the amplicons produced were quantified by Vidas analysis. Up to 10 -10 initial bacteria lysed (/ ml ) can be detected after migration and amplification of the DNA molecules (i.e. 100-10 DNA molecules / 10 ⁇ l PCR test, which represents the sensitivity limit of the PCR technique used).
  • Such a device comprises a support 1, or base, generally having a parallelepiped shape, comprising in particular a 20 upper face 1 b, a lower face 1 c and a lateral flank 1 a, shown in FIGS. 1 3 and 14.
  • this support 1 the various means, including electrodes required for electro-separation, are assembled and integrated, as well as arranged between them, as well as interfacing means corresponding to the side 1a of the support 1 with the outside, on the one hand for the transfer of the various fluids or liquids to and / or out of the support 1, including the treated biological sample, the aqueous liquid medium (buffers) and the fraction enriched in nucleic material, and on the other hand for supplying and controlling the electrical means required at least for electro-separation, including that of the electric field.
  • the various fluids or liquids including the treated biological sample, the aqueous liquid medium (buffers) and the fraction enriched in nucleic material
  • the two faces 1 a and 1 b of the device, or card are coated with a transparent, waterproof film, adhering to the support, and closing the various conduits and cavities shown on the surface at Figures 1 3 and 14.
  • This device also includes:
  • a first reservoir 3 for a first aqueous liquid medium (TBE buffers diluted to 10 times), itself comprising a compartment 31 closed by a permeable membrane 4, for example having a capacity of the order of 100 ⁇ l, as well as another compartment 32, having a capacity of 1 ml, for the reception of at least one fraction obtained from a biological sample; this other compartment is arranged upstream of compartment 31 according to the direction of circulation of the nucleic material, under the effect of the electric field, and communicates itself with the means 2 for receiving the biological sample
  • a second reservoir 5 for a second aqueous liquid medium for example TBE buffer, once concentrated
  • a second aqueous liquid medium for example TBE buffer, once concentrated
  • the two tanks 3 and 5 communicate respectively with ventilation vents 33 and 53, and with at least one filling channel 34 communicating as far as it is concerned with the second tank 5.
  • An intermediate well 7 is arranged and communicates between the means 2 for receiving the biological sample and the first reservoir 3. This well is not compulsory, since the lysate can be deposited directly in compartment 32.
  • This well 7 is provided means for lysing a cell sample to obtain a fraction then subjected to electro-separation; these means are electrodes 81 and 82, making it possible to expose the sample to one or more electrical pulses, in accordance with the method described elsewhere in French patent application FR-A-2,763 in the name of the Applicant.
  • These electrodes 81 and 82 communicate respectively with electrical contact pads 83 and 84 provided on the side 1a. There are therefore two electrical circuits, one associated with electrodes 81 and 82, and the other associated with electrodes 61 and 62.
  • buffer 5 of buffer.
  • the latter can be constituted by a TBE buffer (Tris-Borate-EDTA) whose concentration varies from one reservoir to another.
  • the first reservoir 3, upper, is filled by the receiving means 2, with buffer diluted ten times, and the second reservoir 5, lower, by the channel 34 with buffer once concentrated.
  • the ventilation vents 33 and 53 are drilled at the level of the waterproof films covering the faces 1a and 1b, in order to allow the air to escape when the tanks are filled. 1) Lyse
  • the sample is introduced into the receiving means 2 by means of a pipette, manually or by an automated device.
  • the volume of the sample is between 0 and 1 ml. It then arrives in the intermediate lysis well 7.
  • the lysis is carried out by means of an electric discharge of 500 V for approximately 1 second, between the electrodes 81 and 82.
  • sample volume is greater than 50 ⁇ l, several lysis steps are carried out one after the other, the 22 lysed fractions being transferred progressively to the receiving compartment 32.
  • the first electrical circuit of the electrodes 81 and 82 is open, the second of the electrodes 61 and 62 is closed.
  • the constituents of the negatively charged lysate will then migrate to the anode 62.
  • the nucleic acids being strongly negative will migrate faster. It is therefore possible to recover them selectively above the membrane 4, at the level of the reception compartment 31 by the sampling channel 9.
  • the current imposed for this migration is between 0 and 30 mA, at a voltage of 150 V.
  • the optimal duration of migration is approximately 1 5 minutes.
  • the upper reservoir 3 is emptied until there is no longer any fluid connection between the compartment 32 and the receiving compartment 31.
  • the 100 ⁇ l of buffer contained in compartment 31 is then withdrawn with a pipette, via channel 9. Sampling can be done manually or through the automated system.
  • a device as described above may include only three electrodes. Indeed, the two cathodes 61 and 81, respectively assigned to the electro-separation circuit and to the lysis circuit, become the cathode common to the two circuits. In this case, the biological sample is lysed in compartment 32. Such a device can be used on the wafer. It will then be easy to integrate it into a PLC thanks to this space saving.

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Abstract

Procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique: a) on dispose d'une solution tampon; b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique; c) on établit ledit champ électrique; d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique; caractérisé en ce que: on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane; on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare de l'échantillon biologique au moins le matériel nucléique, et dispositif pour le mettre en oeuvre.

Description

1
PROCEDE D'ELECTRO-SEPARATION D'UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET
DISPOSITIF DE MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé d'électro-séparation d'une fraction nucléique à partir d'un lysat cellulaire, ainsi que tout dispositif, notamment à usage unique, pour la mise en oeuvre dudit procédé d'électro-séparation.
Différents procédés, mais aussi dispositifs, ont été à ce jour proposés ou décrits, aux fins de séparer un matériel nucléique ou une fraction nucléique, à partir d'un lysat cellulaire. Par " séparation ", on entend de manière générique tout processus permettant d'enrichir ou concentrer un milieu, isoler ou déterminer (de manière qualitative et/ou quantitative) dans un milieu complexe, au moins un matériel nucléique, c'est à dire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou de l'acide ribonucléique (ARN). Conformément au document de la Société ISCO, dénommé
ISCO Applications (Bulletin 54, " Electroelution of Nucleic Acids and Proteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 1989), mais aussi conformément au document US-C-4 164 464, il est décrit un dispositif d'électro-élution, et non d'électro-séparation, comprenant:
- un premier réservoir pour une première solution tampon, comportant deux compartiment opposés, fermés chacun par une membrane perméable, l'une de section importante, et l'autre de section faible, et présentant chacune un seuil de coupure permettant de retenir le matériel nucléique ou protéique d'intérêt,
- un second réservoir pour une deuxième solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir par lesdites membranes,
- deux électrodes en contact électrique avec la seconde solution tampon, générant un champ électrique traversant les deux membranes perméables, de celle de section importante à celle de section faible, et donc traversant la première solution tampon.
Ce dispositif sert à concentrer une fraction nucléique ou protéique, déjà relativement pure mais diluée, en disposant cette fraction sur la membrane de section importante, et en recueillant sur la membrane de section faible la même fraction, mais concentrée. La concentration est obtenue du fait du transport des biomolécules par les lignes de champ électrique, qui se concentrent au niveau de la membrane de faible section.
Il ne s'agit donc ni d'un procédé, ni d'un dispositif de séparation, au sens de la définition précédente, c'est à dire au sens où à partir d'un milieu complexe on sépare ou isole un matériel biologique d'intérêt.
Conformément à la figure 5 du document US-C- 5 41 5 758, il est décrit un procédé d'électro-élution en parallèle, au sein d'une multiplicité de puits 42 d'une plaque de titration 41 . La plaque 41 est immergée dans un tampon 52, sans débordement de ce dernier à l'intérieur de chaque puits 42, et chaque puits comporte une membrane 53 fermant une ouverture 54 ménagée dans son fond, en sorte que une communication osmotique puisse s'établir entre le tampon 52 et un tampon 55 disposé dans chaque puits 42. Dans chaque puits 42 s'établit un champ électrique, grâce à une cathode 24, distribuée entre les différents puits 42, et l'anode unique 14. L'échantillon biologique 44, comportant un matériel nucléique, par exemple une goutte de sang disposée sur un support poreux, est élue par le flux électrolytique, en sorte que dans chaque puits le matériel nucléique se trouve dissous ou distribué, pour un prélèvement ultérieur, par exemple avec une pipette.
De manière générale, le document US-C-5 41 5 758 décrit un procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, libres et mobiles dans ledit milieu liquide sous l'action du champ électrique, procédé selon lequel : a) on dispose d'une solution tampon, b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable. d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique, En pratique, un tel procédé ne permet pas de séparer le matériel nucléique de l'échantillon biologique, jusqu'au point d'éliminer pratiquement tout matériel non nucléique, par exemple protéique.
D'autre part, aux fins de séparer un matériel nucléique, on connaît la demande de brevet publiée sous le numéro WO 97/41 21 9, qui divulgue un procédé pour capturer des acides nucléiques à partir d'un mélange constitué par exemple de cellules lysées. Le procédé nécessite de déposer une électrode dans le mélange, d'appliquer à l'électrode un voltage permettant d'attirer les acides nucléiques, puis d'enlever l'électrode recouverte par les acides nucléiques. L'électrode recouverte des acides nucléiques est alors plongée dans une solution permettant, par inversion du courant, de libérer les acides nucléiques qui sont ensuite directement amplifiables. Le voltage appliqué pour pouvoir effectuer une amplification est de préférence de 0,5 à 3 volts pendant environ 30 secondes. Ce procédé, bien qu'utile pour séparer des plasmides contenus dans des cellules E.coli lysées par chauffage, n'est pas adapté pour séparer l'ADN et/ou l'ARN d'un lysat plus complexe de cellules, notamment provenant d'un échantillon biologique.
Conformément à la figure 1 du document WO 97/34908, il est décrit un procédé de séparation d'un matériel nucléique à partir d'un échantillon biologique, en deux étapes : une première étape consiste à mettre en contact l'échantillon biologique lysé avec un adsorbant, de manière à fixer séparément le matériel nucléique, - une deuxième étape consiste à relarguer ce matériel nucléique, à partir de l'adsorbant.
Pour le relargage, on dispose dans un récipient 10 d'une solution tampon, soumise à un champ électrique entre deux électrodes 20a et 20b. Un récipient séparé 1 5, mais immergé dans la solution tampon, est disposé dans le récipient 10. Ce récipient communique avec le reste du récipient 10, par l'intermédiaire d'un orifice 1 2, au travers duquel est disposée une membrane 30 permettant d'arrêter le matériel nucléique en mouvement sous le champ électrique. Auprès de cet orifice est situé un puits 60 de prélèvement du matériel nucléique. Et c'est dans la partie 17 du récipient 1 5, qu'est disposé l'élément adsorbant duquel on veut relarguer le matériel nucléique. Au terme de cet inventaire, aucun procédé n'apparaît permettre de séparer de manière simple et efficace, un matériel nucléique d'un matériel non nucléique, notamment protéique, à partir d'un lysat cellulaire complexe. La présente invention se propose d'apporter une solution à ce problème non résolu.
Conformément à la présente invention, on a découvert qu'on pouvait électro-séparer au moins le matériel nucléique d'un échantillon biologique, de manière efficace, en traitant l'échantillon biologique directement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, et en choisissant les conditions opératoires suivantes :
- on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane arrêtant le matériel nucléique, et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane,
- on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée. Par "électro-séparation " dans la présente invention, on entend que des molécules présentes ensemble dans un milieu, et pouvant présenter des charges électriques identiques, sont distinguées les unes des autres dans ledit milieu en raison de leurs cinétiques respectivement différentes dans un même champ électrique. Le procédé selon l'invention apporte l'avantage essentiel d'obtenir rapidement et facilement une fraction nucléique exempte d'autres constituants, notamment protéines, directement amplifiable, à partir d'un lysat cellulaire. On connait les difficultés liées aux techniques d'amplification, notamment pour les échantillons de type respiratoire, en ce que la fraction à amplifier doit être exempte d'inhibiteurs. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les inhibiteurs protéiques des techniques d'amplification sont pratiquement éliminés.
La fraction enrichie en matériel nucléique, comprenant l'ADN et/ou l'ARN, que l'on obtient par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est directement amplifiable par les techniques couramment utilisées, telles que notamment la technique PCR pour les ADN et la technique NASBA ou TMA pour les ARN.
Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, l'échantillon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière en contact avec la solution tampon.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, la durée de migration de la fraction nucléique est de 10 à 20 minutes, de préférence encore de 1 5 minutes.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la valeur de la moiarité de la solution tampon est au moins égale à 0, 1 mol/l, et préférentiellement comprise entre 0, 1 et 5 mol/l. La moiarité de la solution tampon étant comprise entre 0, 1 et 5 mol/l, on peut effectivement, soit ne mettre qu'une même solution tampon dans les deux compartiments, soit mettre deux solutions tampon différentes dans les deux compartiments.
La moiarité de la solution tampon peut être la même dans les deux compartiments et sera comprise entre 0, 1 et 1 mol/l, de préférence encore de 0, 1 mol/l.
La moiarité de la solution tampon peut être différente dans les deux compartiments et sera respectivement de préférence de 0, 1 mol/l dans le premier compartiment et de 1 mol/l dans le second compartiment. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 1 50 V.
Dans un autre mode de réalisation très préféré selon l'invention, la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, en suivant les lignes de force du champ électrique, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm.
Le lysat cellulaire à partir duquel on effectue le procédé selon l'invention peut être un lysat cellulaire provenant d'une culture simple ou complexe, c'est à dire comprenant différentes cellules, ou peut être également un échantillon biologique, tel que notamment du sang, de l'urine et un crachat de type respiratoire. Le lysat cellulaire à partir duquel on obtient la fraction nucléique, soumis ensuite au procédé selon l'invention, peut être obtenu par différentes techniques de lyse, notamment la lyse par choc mécanique, par choc électrique et autres. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon biologique résulte directement de la lyse d'un échantillon cellulaire, notamment par voie mécanique ou électrique. Ce mode de réalisation est effectué dans le même dispositif, comme cela est décrit ci-après. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le lysat cellulaire est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, on préfère que le pH de la solution tampon soit de 7. La membrane récupérant la fraction enrichie en matériel nucléique présente un seuil de coupure prédéterminée, de préférence inférieure à 100 kDa.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, la porosité de la membrane à la cathode sera de préférence supérieure à 10 kDa. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification. La lyse cellulaire sera de préférence encore effectuée par lyse électrique en présence de protéinase K et d'un détergent.
Un second objet selon l'invention est un dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, comprenant un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage dudit support avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont celle du champ électrique. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend un moyen de réception de l'échantillon biologique; un réservoir pour la solution tampon, comportant un compartiment fermé par la membrane perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment avec le moyen de réception de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes de génération du champ électrique, l'une au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé par la membrane.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le réservoir comprend un autre compartiment, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, les deux réservoirs communiquent respectivement avec des évents d'aération, et avec au moins un canal de remplissage.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, un puits intermédiaire est disposé et communique entre le moyen de réception de l'échantillon biologique et le premier réservoir. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu d'électrodes assurant une lyse dudit échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse, et un compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le volume du compartiment de réception du lysat est supérieur 8 au volume du compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre 1Λ et 1 /50, notamment entre 1 /5 et 1 /20.
Un troisième objet selon l'invention est l'utilisation du dispositif décrit ci-dessus pour électro-séparer une fraction d'acides nucléiques à partir d'un lysat cellulaire. Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour détecter et/ou identifier des acides nucléiques directement après amplification.
La Figure 1 représente shématiquement un appareil d'éléctroélution d'acides nucléiques et de protéines à partir d'un gel, et de concentration électrophorétique de macromolécules (Isco, Nebraska, USA), que l'on utilise dans un procédé différent, à savoir d'électro-séparation selon l'invention. Les compartiments A et B, dans lequel sont plongés deux électrodes négative et positive respectivement, sont remplis de tampon TBE 1 x; le compartiment C, comprenant une partie C1 et une partie C2, et le compartiment Cf sont remplis de tampon TBE 0.1 x. Une membrane de dialyse est placée à l'interface des compartiments Cf et B (porosité 100 kDa), et des compartiments C1 et A (porosité 10 kDa).
La Figure 2 indique le pourcentage d'acides nucléiques de S. epidermidis récupérés dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par analyse avec un appareil Vidas (BioMerieux, France), selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 3 présente la cinétique de récupération des protéines d'un lysat cellulaire. Le pourcentage des protéines du lysat bactérien est récupéré dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par dosage Bradford, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en densité optique (DO) à 595 nm.
La Figure 4 présente la cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire. Le pourcentage d'acides nucléiques de Staphycoccus epidermidis, récupéré dans le compartiment Cf après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs électriques, est déterminé par analyse avec un appareil Vidas, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 5 présente l'amplification des acides nucléiques purifiés à partir d'un lysat cellulaire. La quantité d'amplicons produits par PCR à partir de 10 μ\ de molécules d'ADN est récupérée dans le compartiment Cf, à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, après différents temps de migration, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 6 présente la quantité d'amplicons produits par amplification PCR, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 1 5 minutes sous un champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 μ\ de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 7 illustre la quantité d'amplicons produits par amplification TMA, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 μ\ de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La Figure 8 indique le pourcentage de protéines du sang récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un échantillon clinique sanguin lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 3. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée 10 est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 9 indique le pourcentage de protéines d'un crachat récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un échantillon clinique de type respiratoire lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 10 montre l'élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présent dans l'échantillon clinique de type respiratoire. Elle indique la quantité d'amplicons ADN produits par PCR à partir de différentes quantités initiales d'ADN de S. epidermidis, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 10 μ\ d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 1 1 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées et déposées dans le compartiment C1 . Chaque point représenté sur le graphe représente une valeur moyenne obtenue à partir de 13 crachats et aspirations bronchiques différents, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 μ\ d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 1 2 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées par chocs mécaniques, et déposées dans le compartiment C1 , selon l'exemple 5. L'étude a été réalisée en parallèle sur 4 crachats différents. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 μ\ d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La figure 1 3 représente un dispositif à usage unique selon l'invention, vu en perspective.
La figure 14 représente une vue de dessous du dispositif représenté à la figure 13. La figure 1 5 représente représente une vue de dessus du dispositif représenté à la figure 13. 1 1
La figure 1 6 représente représente une vue en coupe, selon le trait de coupe représenté à la figure 1 5, du dispositif selon la figure 13.
Exemple 1 : Mode opératoire général pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention. Le mode opératoire est basé sur l'utilisation d'un appareil d'éléctroélution d'acides nucléiques selon la figure 1 . Un volume d'échantillon biologique est déposé soigneusement au fond du compartiment C1 . Les deux électrodes du circuit sont reliées à un générateur électrique. Une tension constante de 1 50 V est appliquée aux bornes du générateur. L'intensité du circuit varie de 1 5 à 20 mA et la température du tampon dans le compartiment C varie de 23 à 30°C. Les molécules biologiques initialement déposées au fond du compartiment C1 migrent dans le champ électrique ainsi créé, à vitesse définie en fonction de leur charge et de leur taille. Après différents temps de migration, la tension aux bornes du générateur est arrêtée et les molécules ayant migré vers la cathode et de poids moléculaire apparent inférieur ou égal à 10 kDa sont recueillies dans le compartiment Cf, dans un volume final de 200 μl. L'échantillon ainsi récupéré est conservé dans la glace avant analyse.
L'échantillon biologique déposé dans le compartiment C1 peut être un matériel nucléique et/ou protéique purifié ou non, un lysat cellulaire, provenant d'un échantillon biologique tel que le sang, l'urine et un crachat de type respiratoire. Les lysats cellulaires étudiés ont été obtenus à partir de S. epidermidis, bactérie à paroi Gram + (A054) . Ces bactéries sont cultivées en milieu liquide BCC (Bouillon Coeur Cervelle, bioMerieux 4101 9). Avant lyse, elles sont mises en suspension, soit dans un prélèvement clinique (crachat liquéfié et décontaminé, sang, plasma, sérum, ....), soit en tampon de lyse (30 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI pH 7.2). 300 μ\ de cette suspension cellulaire ont été lysés en suivant essentiellement deux protocoles : - Protocole de lyse par chocs mécaniques : 90 μ\ de billes de verre de diamètre compris entre 90 et 1 50 μm, 3 billes de fer de diamètre 2 mm et 5 billes de verre de diamètre 3 mm sont placés dans un tube Falcon en présence de 300μl de la suspension cellulaire, comme décrit dans le brevet (FR-A-2 768 743) . 6 mg /ml final de protéinase K (PK) (E.C. 3.4.21 .14 Boehringer-Mannheim, réf. 1092766) peut être ajoutée à la suspension cellulaire. Le tube fermé est vortexé pendant deux minutes, à 1 2 puissance maximale de l'appareil (Reax 2000, Heidolph). La suspension bactérienne ainsi traitée et récupérée est déposée immédiatement dans le compartiment C1 du dispositif décrit dans la Figure 1. Si la PK est présente dans la solution cellulaire, une incubation supplémentaire de 1 5 minutes à 37°C est réalisée.
- Protocole de lyse par choc électrique : 300 μl de la suspension cellulaire sont déposés dans une cuve d'électroporation caractérisée par une distance entre les deux électrodes de 2 mm, en présence de 0.01 à 6 mg /ml final de PK. La cuve est placée dans un circuit électrique dont les paramètres sont choisis comme suit : tension 500 V, résistance 1 86 Ohms, capacité de 500 ou 1 500 μFD. Après lancement d'une impulsion électrique, la décharge électrique se réalise en quelques millisecondes entre les deux électrodes. Le lysat ainsi récupéré est déposé immédiatement dans le compartiment A du dispositif décrit dans la Figure 1 (FR-A-2 763 957).
Le pourcentage d'acides nucléiques recueilli du côté de la cathode, après migration dans le compartiment Cf, est déterminé par mesure de DO (densité optique) de l'échantillon récupéré à 260 nm. Le pourcentage recueilli est égal au rapport de la valeur de DO à 260 nm après migration, sur la valeur de DO à 260 nm avant migration. De même, la quantité de protéines recueillies à la cathode après migration est déterminée par dosage Bradford et lecture de DO à 595 nm. Le pourcentage de protéines recueillies est égal au rapport de la quantité protéique récupérée sur la quantité initiale. La quantité des acides nucléiques récupérés du côté de la cathode après migration est vérifiée sur gel d'agarose 0.8% ; 10 μl de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous voltage constant ( 1 50 V) et le gel est coloré au bromure d'ethidium (BET) avant observation sous rayonnement ultra-violet. En parallèle, les protéines récupérées à la cathode après migration peuvent être observées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE 10%); 5 à 10 μl de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous intensité constante (25 mA), et le gel est coloré au bleu de Coomassie. La quantité d'acides nucléiques récupérés du côté de la cathode est déterminée par détection spécifique selon une technique d'hybridation 1 3 dite sandwich, en utilisant l'appareil Vidas commercialisé par bioMérieux (France). Des sondes oligonucléotidiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis (EP-A-0 632 269) ont été choisies. Les oligonucléotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence : 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID N ° : 1 ) et 5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID N ° :2) . La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatase alcaline (AKP). L'hybridation spécifique de ces sondes avec les acides nucléiques libérés dans le lysat est fonction de la quantité d'acides nucléiques présents, mais aussi de leur accessibilité pour les sondes utilisées.
Deux protocoles d'amplification spécifique des molécules d'ADN et d'ARN de S. epidermidis ont été réalisés à partir des échantillons recueillis après migration : un protocole PCR pour l'amplification de l'ADN et un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr1 6S et un protocole TMA pour l'amplification de l'ARNr 1 6S.
-Protocole PCR : la technique de PCR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR Stratégies, Ed : Innis, Gelford et Sninsky Académie press 1 995, pp 1 7-31 . Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes : Amorce 1 : 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' (SEQ ID N° :3)
Amorce 2 : 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' (SEQ ID N° :4) Les cycles de température suivants ont été utilisés : 1 fois 3 minutes à 94°C 2 minutes à 65°C 35 fois 1 minute à 72°C
1 minute à 94°C
2 minutes à 65 °C 1 fois 5 minutes à 72°C
-Protocole TMA : la technique de TMA suivie est celle décrite par US-A-5 554 51 6. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes :
Amorce 1 : 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA -3' (SEQ ID N ° :5)
Amorce 2 : 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTT TGTCACCGGCAGTCAACTTAGA -3' (SEQ ID N ° :6) 14
10 μl ou 50 μl d'échantillon recueilli sont utilisés pour chaque essai PCR et TMA, respectivement. Les amplicons produits par PCR sont observés sur gel d'agarose 0.8% et quantifiés sur Vidas selon le protocole décrit ci-dessus. Les amplicons produits par TMA sont détectés et quantités sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection, spécifiques de S. epidermidis, selon la méthode décrite par P. Cros et al. , Lancet 1992, 240 :870. La sonde de détection est couplée à la " Horse Radish Peroxidase " (HRP) . Les deux sondes présentent les séquences suivantes : Sonde de capture : 5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' (SEQ ID
N° :7)
Sonde de détection : δ'-GACATCCTCTGACCCCTCTA -3' (SEQ
ID N ° :8)
Exemple 2 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire.
Une suspension de Staphylococcus epidermidis (1 -5.10^ b./300μl) est lysée par choc mécanique ou par choc électrique, comme décrit dans le protocole général ci-dessus. 200 μl de chaque lysat sont déposés au fond du compartiment C1 . Le champ électrique est appliqué pendant différents temps entre les deux électrodes. Les quantités d'acides nucléiques ou de protéines présentes dans l'échantillon recueilli dans le compartiment Cf sont déterminées par analyse avec un appareil Vidas ou dosage Bradford, respectivement. La qualité des molécules récupérées a été appréciée sur gel d'agarose ou d'acrylamide, en présence de SDS. - Lysat cellulaire obtenu par choc mécanique :
Les acides nucléiques du lysat ont migré dans le compartiment Cf progressivement au cours du temps, comme montré à la figure 2. Après 60 minutes, la totalité du matériel nucléique du lysat est récupéré, quelque soit la présence ou non de protéinase K pendant l'étape de lyse. Ce résultat est en faveur d'une bonne libération et accessibilité des acides nucléiques dans le lysat. Les molécules d'ADN récupérées ont le même profil de migration sur gel d'agarose 0.8% qu'avant migration dans le lysat. En présence de protéinase K pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 3, seul un pourcentage négligeable de protéines est récupéré après 60 minutes, tandis qu'en l'absence de protéase, environ 50% de protéines sont récupérées. 1 5
- Lysat cellulaire obtenu par choc électrique.
En présence de PK pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 4, les acides nucléiques du lysat migrent progressivement jusqu'à la cathode. Après 60 minutes, un pourcentage important d'acides nucléiques est récupéré. La récupération du matériel nucléique présent initialement dans ce lysat est similaire à celle du matériel nucléique présent initialement dans un lysat obtenu par choc mécanique (cf. ci-dessus) . Par contre, en absence de PK pendant l'étape de lyse, aucun acide nucléique ne peut être détecté dans le compartiment Cf, même après 60 minutes de migration (analyse Vidas et gel d'agarose 0.8%) . Sur gel d'agarose, les molécules d'ADN et d'ARN du lysat récupérées sont observables séparément après migration, alors qu'elles ne le sont pas initialement dans le lysat.
- Amplification des acides nucléiques purifiés à partir de lysat cellulaire Les bactéries S. epidermidis diluées dans 300 μl de tampon de lyse sont lysées par choc mécanique en l'absence de PK, comme décrit dans le protocole général de l'exemple 1 . 200μl du lysat sont déposés au fond du compartiment C1 . Un champ électrique est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps. Le matériel nucléique qui a migré dans le compartiment Cf est amplifié par PCR (10 μl par essai) ou TMA (50 μl par essai). La quantité d'amplicons produite est analysée par hybridation spécifique sur Vidas ou microplaque, respectivement.
- Amplification PCR des molécules d'ADN récupérées après migration : Pour 10^ bactéries initiales lysées, déposées dans le compartiment C1 , différentes quantités d'amplicons sont produites, en fonction du temps de migration. Pour 1 5 minutes de migration, comme représenté à la figure 5, les molécules d'ADN récupérées permettent une production optimale d'amplicons par PCR. Avant 1 5 minutes, une quantité inférieure de molécules d'ADN sont récupérées. Pour 20 minutes et après, une quantité supérieure de molécules d'ADN sont récupérées, mais de qualité moins adaptée à une amplification PCR optimale. Plus la migration dure, plus la structure de l'acide nucléique peut être altérée. Afin d'obtenir une amplification PCR optimale, un compromis entre quantité et qualité des molécules d'ADN récupérées à la cathode doit être respecté. Ce résultat a 1 6 été confirmé en utilisant des suspensions initiales de S. epidermidis plus concentrées (105-106 bactéries initiales /200μl).
Comme représenté à le figure 6, l'ADN d'un nombre supérieur ou égal à 1 .10^ bactéries initiales (/200μl) peut être amplifié et détecté, après lyse mécanique des cellules et migration des constituants du lysat sous champ électrique; soit 10^ molécules d'ADN ou bactéries par essai PCR, étant donné que le matériel migré est récupéré dans 200 μl et que 10 μl de ce matériel est utilisé pour chaque essai PCR. 10^ molécules d'ADN correspondent à la limite de sensibilité du protocole PCR, de façon générale. Ce résultat démontre une grande sensibilité de récupération des molécules d'ADN bactérien après lyse cellulaire par choc mécanique et purification des molécules d'ADN intracellulaire par champ électrique en solution.
- Amplification TMA des molécules d'ARN récupérées après migration :
Comme représenté à la figure 7, l'ARN de au moins 40 bactéries initiales (/200μl) peut être détecté après lyse des bactéries, migration des constituants cellulaires sous champ électrique et amplification spécifique des ARNr1 6S de S. epidermidis ; soit 10 bactéries initiales par essai TMA, compte tenu que le matériel nucléique migré est récupéré dans 200 μl final, et que 50 μl sont ajoutés par essai TMA. Ce résultat témoigne d'une grande sensibilité de récupération des molécules d'ARNr 1 6S bactérien, après lyse par choc mécanique et purification des acides nucléiques du lysat par champ électrique. Exemple 3 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir d'un échantillon sanguin.
L'échantillon sanguin est utilisé sans pré-traitement préalable. 200 μl de cet échantillon clinique est déposé au fond du compartiment C1 . Un voltage de 1 50 V est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps, puis le matériel récupéré du côté de la cathode dans le compartiment Cf est analysé par dosage de protéines selon la méthode de Bradford, et sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE 10%) .
Dans cet exemple, le pH du tampon TBE utilisé pour la migration a été fixé à pH 7.0, le point isoélectrique de l'hémoglobine étant égal à 7.0. Des membranes de 50 ou 100 kDa ont été placées à l'interface des 1 7 compartiments Cf et B. Comme cela est représenté à la figure 8, après 60 minutes de migration, un pourcentage négligeable de protéines est récupéré avec la membrane de 100 kDa, et 10% des protéines sont récupérées avec la membrane de 50 kDa. A pH 7.0, seulement 10% des protéines sanguines chargées négativement à pH 7.0 ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa et inférieur à 100 kDa. Un pourcentage négligeable de protéines sont récupérées après 1 5 minutes de migration, en utilisant indifféremment une membrane de 50 ou 100 kDa. Ces conclusions ont été vérifiées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-PAGE 10%. La porosité de la membrane sera préférentielement supérieure à 10 kDa, afin de ne pas obtenir un pourcentage trop élevé de protéines.
Exemple 4 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de type respiratoire.
Avant utilisation, l'échantillon respiratoire est fluidifié, décontaminé selon le protocole standard au N-acetyl-L-cysteine et à la soude (NALC/NaOH); puis il est inactivé 20 minutes à 95 °C.
Dans cet exemple, le tampon TBE utilisé pour la migration a un pH égal à 8.3 ou 7.0, et des membranes de différentes tailles de pores ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B: 10, 50 ou 100 kDa. Comme cela est représenté à la figure 9, à pH 8.3, 10% des protéines sont récupérées après 30 minutes, et 70-80% après 60 minutes avec des membranes de 50 ou 10 kDa, ce qui suggère que 70-80% des protéines du crachat sont chargées négativement à ces pH et ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa. A pH 7.0, environ 0% des protéines sont récupérées après 30 ou 60 minutes de migration, quelque soit la taille des pores de la membrane utilisée (dans la limite de sensibilité des techniques de détection utilisées). A ce pH, les 55-60% des protéines préalablement récupérées à pH 8.0 ne sont plus chargées négativement. Avec les membranes de 10 ou 50 kDa, un pourcentage négligeable des protéines du crachat est récupéré après 1 5 minutes de migration. On a vérifié ce point sur gel de polycrylamide en présence de SDS-PAGE 10%.
Exemple 5 : Levée d'inhibition de protocoles d'amplification par les échantillons de type respiratoire après migration.
Les échantillons de type respiratoire sont inhibiteurs des réactions PCR et TMA. 200 μl de ces échantillons ont été déposés au fond du compartiment C1 du système décrit Figure 1 . Un voltage de 1 50 V 1 8 constant a été appliqué entre les deux électrodes pendant 1 5 minutes. Une membrane de séparation entre Cf et B de 10 kDa a été choisie. Après migration, l'échantillon récupéré dans le compartiment Cf (200 μl) a été supplémenté avec différentes quantités d'acides nucléiques purifiés de S. epidermidis. 10 μl ou 50 μl de cette solution ont été utilisés pour chaque essai PCR ou TMA, respectivement. Comme représenté à la figure 10, jusqu'à 102-103 copies initiales d'ADN peuvent être amplifiées dans 10 μl d'échantillon migré. Ce résultat démontre que le crachat migré a perdu son caractère inhibiteur de la PCR. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'amplification TMA.
1 -5.10^ S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 μl de crachat fluidifié, décontaminés et inactivés comme décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc mécanique en absence de PK, et le lysat a migré pendant 1 5 minutes sous 1 50 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le schéma présenté à la Figure 1 . La quantité d'acides nucléiques bactériens récupérés dans le compartiment Cf après migration a été quantifiée par analyse Vidas spécifique de l'espèce bactérienne étudiée. L'expérience a été réalisée à partir de différents crachats. En moyenne, 80% d'acides nucléiques S. epidermidis sont récupérés. Ce résultat indique que les molécules de la matrice du crachat ne gênent pas la migration des molécules d'ADN et d'ARN du lysat bactérien dans le champ électrique, dans ces conditions. Au contraire, il semble que l'environnement soit propice à une meilleure récupération et/ou migration de ces molécules. Amplification PCR:
Les bactéries S. epidermidis ont été ensemencées dans 300 μl de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé, puis lysées par choc mécanique en absence de PK comme décrit dans l'exemple 1 . 200 μl du lysat a migré pendant 1 5 minutes sous 1 50V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B. Le matériel nucléique présent dans l'échantillon a été amplifié par PCR (10 μl par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Comme représenté à la figure 1 1 , jusqu'à 104-1 θ3 bactéries initiales lysées (/200μl de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 molécules d'ADN /10μl d'essai PCR). Ce résultat, d'une part confirme un très bon rendement de récupération des molécules d'ADN bactérien du 1 9 lysat dans le crachat, et d'autre part démontre une très bonne élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présents dans les crachats. Amplification TMA:
De même que pour l'étude de l'amplification PCR décrite ci- avant, les bactéries S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 μl de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé puis lysées par choc mécanique en absence de PK. 200 μl du lysat a migré pendant 1 5 minutes sous 1 50V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et A. Les molécules d'ARNr présentes dans l'échantillon récupéré ont été amplifiées par TMA (50 μl par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par hybridation spécifique sandwich sur microplaque. Comme représenté à la figure 1 2, au moins 10^-105 bactéries initiales lysées (/200μl de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ARN (soit au moins 5.104-5.103 bactéries initiales /50 μl d'essai TMA). Ce résultat démontre l'élimination des inhibiteurs de la TMA initialement présents dans les crachats.
Exemple 6: Electro-séparation après lyse par chocs électriques. 1 -5.109 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 μl de crachat fluidifié, décontaminé et inactivé comme décrit dans l'exemple 4. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc électrique en présence de 10"2 mg/ml final de PK et 2% final de LLS (Lithium Lauryl Sulfate, Sigma). 200 μl de lysat a migré pendant 1 5 minutes sous 1 50 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le shéma présenté à la figure 1 . Le matériel nucléique récupéré après migration (200 μl) a été amplifié par PCR spécifique de S. epidermidis ( 10 μl/essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Jusqu'à 10 -10 bactéries initiales lysées (/ml) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 molécules d'ADN/10 μl d'essai PCR, ce qui représente la limite de sensibilité de la technique PCR utilisée).
Conformément aux figures 1 3 à 1 6, on décrit ci-après un dispositif à usage unique, c'est-à-dire consommable, ou jetable après emploi, permettant de mettre en oeuvre le procédé d'électro-séparation décrit et exemplifié précédemment. Un tel dispositif comprend un support 1 , ou base, ayant généralement une forme parallèlépipédique, comprenant notamment une 20 face supérieure 1 b, une face inférieure 1 c et un flanc latéral 1 a, montrés sur les Figures 1 3 et 14.
De manière générale dans ce support 1 , sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes requis pour l'électro-séparation, ainsi que des moyens d'interfaçage correspondant au flanc 1 a du support 1 avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support 1 , dont l'échantillon biologique traité, le milieu liquide aqueux (tampons) et la fraction enrichie en matière nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électro-séparation, dont celle du champ électrique.
De manière non représentée, à titre d'exemple, les deux faces 1 a et 1 b du dispositif, ou carte, sont revêtues d'un film transparent, étanche, adhérant au support, et fermant les différents conduits et cavités représentés en surface aux figures 1 3 et 14.
Ce dispositif comprend encore :
- un moyen de réception 2 de l'échantillon biologique traité
- un premier réservoir 3 pour un premier milieu liquide aqueux (tampons TBE dilué à 10 fois), comportant lui-même un compartiment 31 fermé par une membrane 4 perméable, ayant par exemple une capacité de l'ordre de 100 μl, ainsi qu'un autre compartiment 32, ayant une capacité de 1 ml, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir d'un échantillon biologique ; cet autre compartiment est disposé en amont du compartiment 31 selon le sens de circulation du matériel nucléique, sous l'effet du champ électrique, et communique lui-même avec le moyen de réception 2 de l'échantillon biologique
- un second réservoir 5 pour un second milieu liquide aqueux (par exemple tampon TBE, une fois concentré), identique ou différent du premier liquide aqueux, séparé du premier réservoir 3, uniquement par la membrane 4
- deux électrodes 61 et 62 pour générer un champ électrique, communiquant avec deux plots 63 et 64 de contact électrique sur le flanc 1 a ; l'une des électrodes, à savoir 61 , ou cathode, est au contact du premier milieu liquide aqueux dans le premier réservoir 3, et l'autre électrode 62, ou anode, est au contact du second milieu aqueux dans le second réservoir 5 21
- un moyen d'extraction 9 de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment 31 fermé par la membrane 4
Les deux réservoirs 3 et 5 communiquent respectivement avec des évents d'aération 33 et 53, et avec au moins un canal de remplissage 34 communiquant en ce qui le concerne avec le second réservoir 5.
Un puits intermédiaire 7 est disposé et communique entre le moyen de réception 2 de l'échantillon biologique et le premier réservoir 3. Ce puits n'est pas obligatoire, puisque le lysat peut être déposé directement dans le compartiment 32. Ce puits 7 est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire pour obtenir une fraction soumise ensuite à électro-séparation ; ces moyens sont des électrodes 81 et 82, permettant d'exposer l'échantillon à une ou plusieurs impulsions électriques, conformément au procédé décrit par ailleurs dans la demande de brevet français FR-A-2 763 au nom de la Demanderesse. Ces électrodes 81 et 82 communiquent respectivement avec des plots de contact électrique 83 et 84 prévus sur le flanc 1 a. Il existe donc deux circuits électriques, l'un associé aux électrodes 81 et 82, et l'autre associé aux électrodes 61 et 62.
I - Préparation du dispositif Avant de démarrer toute réaction, on remplit les réservoirs 3 et
5 de tampon. Ce dernier peut être constitué par un tampon TBE (Tris- Borate-EDTA) dont la concentration varie d'un réservoir à l'autre. On remplit le premier réservoir 3, supérieur, par le moyen de réception 2, avec du tampon dilué dix fois, et le second réservoir 5, inférieur, par le canal 34 avec du tampon une fois concentré. On perce les évents d'aération 33 et 53 au niveau des films étanches recouvrant les faces 1 a et 1 b, afin de permettre à l'air de s'échapper lors du remplissage des réservoirs. 1 ) Lyse
L'échantillon est introduit dans le moyen de réception 2 à l'aide d'une pipette, manuellement ou par un automate. Le volume de l'échantillon est compris entre 0 et 1 ml. Il arrive alors dans le puits intermédiaire 7 de lyse. La lyse est réalisée grâce à une décharge électrique de 500 V pendant environ 1 seconde, entre les électrodes 81 et 82.
Dans le cas où le volume d'échantillon est supérieur à 50 μl, plusieurs étapes de lyse sont réalisées les unes après les autres, les 22 fractions lysées étant transférées au fur et à mesure dans le compartiment 32 de réception.
2) Electro-séparation
Une fois l'échantillon lysé et transféré en totalité dans le compartiment 32 de départ de l'électro-séparation, le premier circuit électrique des électrodes 81 et 82 est ouvert, le deuxième des électrodes 61 et 62 est fermé. Les constituants du lysat chargés négativement vont alors migrer jusqu'à l'anode 62. Les acides nucléiques étant fortement négatifs migreront plus vite. On pourra donc les récupérer sélectivement au-dessus de la membrane 4, au niveau du compartiment de réception 31 par le canal de prélèvement 9.
Le courant imposé pour cette migration est compris entre 0 et 30 mA, sous une tension de 1 50 V. La durée optimale de migration est d'environ 1 5 minutes. Afin de récupérer les acides nucléiques, on vide le réservoir 3 supérieur jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liaison fluidique entre le compartiment 32 et le compartiment de réception 31 . On prélève alors avec une pipette, par le canal 9, les 100 μl de tampon contenus dans le compartiment 31 . Le prélèvement peut se faire manuellement ou par l'intermédiaire de l'automate.
On peut prévoir de récupérer aussi les protéines purifiées. Pour cela, il faut effectuer deux passes successives d'électro-purification, la première permettant de récupérer la fraction enrichie en acides nucléiques et la deuxième la fraction enrichie en protéines. Dans ce cas précis, les acides nucléiques doivent être récupérés entre les deux passes, et sans vider le réservoir 3 supérieur du tampon qui contient les protéines qui n'ont pas fini de migrer.
Un dispositif tel que précédemment décrit peut ne comprendre que trois électrodes. En effet, les deux cathodes 61 et 81 , respectivement affectées au circuit d'électro-séparation et au circuit de lyse, deviennent la cathode commune aux deux circuits. Dans ce cas, la lyse de l'échantillon biologique s'effectue dans le compartiment 32. Un tel dispositif peut être utilisé sur la tranche. Il sera alors facile de l'intégrer dans un automate grâce à ce gain de place.

Claims

23
REVENDICATIONS
1/ Procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, libres et mobiles dans ledit milieu liquide sous l'action du champ électrique, procédé selon lequel : a) on dispose d'une solution tampon, b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique, caractérisé en ce que : - on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare de l'échantillon biologique au moins le matériel nucléique.
2/ Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'échantillon biologique comprend un lysat cellulaire. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière en contact avec la solution tampon.
4/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes. 24
5/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la valeur de la moiarité de la solution tampon est au moins égale à 0, 1 mol/l, et préférentiellement comprise entre 0, 1 et 5 mol/l.
6/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 1 50 V.
Il Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire.
9/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique. 10/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification.
1 1/ Dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage ( 1 a, 1 b, 1 c) dudit support avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont celle du champ électrique.
12/ Dispositif selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il comprend un moyen de réception (2) de l'échantillon biologique ; un réservoir (3) pour la solution tampon, comportant un compartiment (31 ) fermé par la membrane (4) perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment (31 ) avec le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir (5) pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du 25 premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes (61 , 62) de génération du champ électrique, l'une (61 ) au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre (62) au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction (9) de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé (31 ) par la membrane.
13/ Dispositif selon la revendication 1 2, caractérisé en ce que le réservoir (3) comprend un autre compartiment (32), pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment (31 ) selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique.
14/ Dispositif selon la revendication 1 2, caractérisé en ce que les deux réservoirs (3,5) communiquent respectivement avec des évents d'aération (33,53), et avec au moins un canal de remplissage (34) .
15/ Dispositif selon la revendication 1 2, caractérisé en ce que un puits intermédiaire (7) est disposé et communique entre le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique et le premier réservoir (3).
16/ Dispositif selon la revendication 1 5, caractérisé en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire.
17/ Dispositif selon la revendication 1 6, caractérisé en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu d'électrodes (81 ,82) assurant une lyse dudit échantillon cellulaire. 18/ Dispositif selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment (32) de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse (7), et un compartiment de réception (31 ) de la fraction enrichie en matériel nucléique.
19/ Dispositif selon la revendication 1 8, caractérisé en ce que le volume du compartiment de réception (32) du lysat est supérieur au volume du compartiment de réception (31 ) de la fraction enrichie en matériel nucléique.
20/ Dispositif selon la revendication 1 9, caractérisé en ce que la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre V et 1 /50, notamment entre 1 /5 et 1 /20. 26
21 / Utilisation du dispositif selon les revendications 1 1 à 20, pour électro-séparer une fraction ou la totalité des acides nucléiques à partir d'un lysat cellulaire.
22/ Utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon les revendication 1 à 10 pour détecter et/ou identifier des acides nucléiques directement après amplification.
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