WO1999049892A2 - Utilisation de conjugues p40 actifs par voie nasale - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to obtaining immunizing preparations which are effective when administered via the nasal route. It therefore relates to the use of carrier proteins capable of improving the immune response to a hapten, when the hapten-carrier protein conjugate is administered by the nasal route.
- the Applicant has now found that a membrane protein originating from another bacterium makes it possible, when administered jointly with an antigen by the nasal route, to induce an immune response of satisfactory intensity and quality to get a vaccine.
- the present invention relates to the use of at least one fragment of an OmpA membrane protein of enterobacteriac for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by the nasal route, to improve immunity. of a mammal with respect to an antigen or a hapten.
- the expression OmpA is intended to denote the proteins of the external membrane of type A (OmpA for "Outer membrane protein A").
- the subject of the invention is also the use of at least one fragment of a Klebsiella membrane protein for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by the nasal route, to improve the immunity of a mammal vis -to an antigen or a hapten.
- the membrane protein is an OmpA protein from Klebsiella pneumoniae.
- said fragment of the OmpA membrane protein of enterobacterium or of the Klebsiella membrane protein according to the invention is obtained by recombinant route.
- rP40 the major membrane protein of Klebsiella pneumoniae, OmpA called P40, coupled to subunit peptide antigens is very immunogenic by the systemic route.
- a particularly suitable protein comprises the sequence SEQ ID No. 1.
- the Applicant has demonstrated that an anti-P40 antibody response is found in all adults, the Klebsiella pneumoniae enterobacterium being a very widespread pathogen. This sensitization is favorable to an increase in the antibody response directed against an antigen or a hapten which is administered coupled to the carrier protein.
- Said antigen or hapten according to the invention can be chosen from the group comprising proteins, peptides, polysaccharides, oligosaccharides and nucleic acids.
- it is of bacterial or viral origin.
- the present invention is thus suitable for the preparation of vaccine directed against any microorganism responsible for pathologies of the airways such as for example the microorganisms chosen from RSV, para influenzae virus (P1V), influenza virus, l hantavirus, streptococci, pneumococci and meningococci.
- microorganisms chosen from RSV, para influenzae virus (P1V), influenza virus, l hantavirus, streptococci, pneumococci and meningococci.
- the antigen or hapten according to the invention will comprise at least one fragment of said microorganism, such as a protein fragment, which a person skilled in the art will be able to determine for its capacity to confer the desired immunity by techniques. standards such as those described in the examples below.
- the present invention is suitable for the preparation of a vaccine directed against RSV (or respiratory syncytial virus), in particular human or bovine.
- the antigen or the hapten according to the invention comprises at least one protein fragment of the RSV virus, and in particular at least one fragment of the G protein of the RSV.
- said protein fragments of the VRS virus are chosen from fragments having as amino acid sequences the sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No.
- Sequences suitable for the preparation of a vaccine according to the invention are the sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 74.
- the protein fragment originating from OmpA membrane protein from enterobacteria or from Klebsiella membrane protein is covalently coupled with the antigen or hapten, such as a protein fragment of RSV.
- the invention also comprises the use of at least one fragment of an entero-bacteria OmpA membrane protein or of a membrane protein of Klebsiella according to the invention, characterized in that said fragment is covalently coupled with said antigen or hapten.
- the covalent coupling of the antigen or the hapten according to the invention can be carried out at the N- or C-terminal end of the fragment of the membrane protein according to the invention.
- the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined as a function of the end of the fragment of the membrane protein chosen to effect the coupling and of the nature of the antigen or the hapten to be coupled.
- the conjugates resulting from a coupling of peptides to at least one fragment of an OmpA membrane protein of enterobacteria or of a Klebsiella membrane protein can be prepared by genetic recombination.
- the hybrid protein (conjugate) can indeed be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for the membrane protein fragment, of a sequence coding for the antigen or hapten peptide (s). .
- These techniques for preparing hybrid protein by genetic recombination are well known to those skilled in the art (cf. for example SC MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60, 3, 512-538) and will not be developed herein. description.
- the invention also comprises the use, according to the invention, characterized in that the hybrid protein, obtained after coupling between the fragment of a membrane protein and the protein type antigen or hapten, is prepared by genetic recombination.
- the hybrid protein obtained after coupling between the fragment of a membrane protein and the protein type antigen or hapten, is prepared by genetic recombination.
- Klebsiella pneumoniae administration of a hapten coupled to at least one fragment of a membrane protein, such as the rP40 protein, by the nasal route in the absence of an adjuvant induced an anti-hapten antibody response.
- the invention relates to the use, according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition contains a fragment of a membrane protein coupled with an antigen or a hapten according to the invention, or a transformed host cell capable of expressing a recombinant hybrid protein containing a fragment of membrane protein coupled with the antigen or hapten according to the invention, in particular in the absence of an adjuvant.
- the transformed host cells capable of expressing said hybrid protein gram-negative bacteria such as Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli type K 12 commonly used in fermentation or E. coli transformed by an expression vector plasmid containing a promoter are preferred. strong such as the operon of the tryptophan promoter (trp).
- staphylococci such as non-pathogenic staphylococci, S. carnosus and S. xylosus, since these bacteria do not produce LPS (lipopolysaccharides) on the membrane surface.
- staphylococci can be transfected with expression vectors containing promoters such as the trp, or the secretion signal of Lipase or the secretion signal of protein A or even the promoter signal of the OmpA of Klebsiella pneumoniae.
- the invention relates to a process for the preparation of a protein or one of its fragments by recombinant means, characterized in that the protein or its fragment is, after extraction, renated in the presence of a solution containing a detergent chosen from Zwittergent 3-14, Zwittergent 3-12 and octylglucopyrannoside, and in that said recombinant protein is not interferon ⁇ .
- said protein is an enterobacterium membrane protein, in particular of the OmpA type.
- said protein is an OmpA of Klebsiella pneumoniae.
- the Zwittergent 3-14 will preferably be at a concentration of between 0.05% and 2%, more preferably close to 0.1%.
- Figure 1A Coomassie blue revelation - lane 1: lot 1, 2 ⁇ g - lane 2: lot 1, 10 ⁇ g
- FIG. 1B immunoblot and revelation using an anti-P40 rabbit polyclonal serum
- Figure 2 Distribution of patients according to the OD (Optical Density) corresponding to anti-P40 antibodies, measured by ELISA.
- Figure 3 Anti-Gl 'antibody response.
- Figure 4 Anti-rP40 antibody response.
- Figure 5 IgA type anti-Gl 'antibody response.
- Figure 6 Isotyping of anti-Gl 'immunoglobulins obtained in secondary response.
- Figure 8 Response anti-Gl 'serum antibodies of total IgG type.
- Figure 9 Isotyping of anti-Gl 'serum immunoglobulins after three immunizations.
- Figure 10 Isotyping of anti-Gl 'immunoglobulins from bronchoalveolar lavage after three immunizations.
- the gene coding for rP40 was obtained by amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction) from the chromosomal DNA of the strain Klebsiella pneumoniae IP 1145 (described in patent WO 96/14415). After identification by DNA sequencing, the fragment corresponding to rP40 is cloned in various expression vectors, in particular that under the control of the promoter of the trp operon, upstream of 9 amino acids of the leader peptide (MKAIFVLNA).
- the peptide sequence of rP40 is represented in the list of sequences by the sequence SEQ ID No. 1.
- the protein rP40 is produced in the form of inclusion bodies with a high yield (> 10%, g protein / g dry biomass). Fermentation of rl'40 fusion proteins:
- the medium contains (g / 1): glycerol, 5; ammonium sulfate, 2.6; potassium dihydro-genophosphate, 3; dipotassium hydrogen phosphate, 2; sodium citrate 0.5; yeast extract, 1; Ampicillin, 0, 1; Tetracycline 0.008; Thiamine, 0.07; magnesium sulfate, 1 and 1 ml / 1 of trace element solution and 0.65 ml / 1 of vitamin solution.
- the parameters controlled during fermentation are: pH, agitation, temperature, oxygenation rate, feeding of combined sources (glycerol or glucose).
- the pH is regulated at 7.0.
- the temperature is set at 37 ° C.
- the cells After centrifugation of the culture broth (4000 rpm, 10 min, 4 ° C), the cells are resuspended in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5. Treatment with lysozyme (0.5 g 1, 1 hour / room temperature / gentle agitation) allows the release of the inclusion bodies.
- Denaturation of the protein is obtained by incubation of the inclusion bodies at 37 ° C. for 2 hours in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 7 M urea. (denaturing agent) and 10 mM dithiothreitol (reduction of disulfurc bridges). Centrifugation (15 min at 10,000 g) eliminates the insoluble part of the inclusion bodies.
- the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong anion exchanger type (Biorad Macro Prep High Q gel) balanced in the buffer described above at a linear flow rate of 15 cm / h. Proteins are detected at 280 nm. The rP40 protein is eluted, with a linear flow rate of 60 cm / h, for a concentration of 0.6
- the fractions containing the rP40 protein are combined and concentrated by ultrafiltration using an Amicon shaking cell system used with a Diaflo membrane of the YM10 type (cutoff threshold 10 Da) for volumes of the order of 100 ml. , or using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates having a cutoff threshold of 10 kDa for higher volumes.
- the fraction thus concentrated is dialyzed overnight at 4 ° C. against a 20 mM citrate buffer, pH 3.0, at 0.1% of Zwittergent 3-14.
- the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong cation exchanger type (Biorad Macro Prep High S gel) balanced in the citrate buffer.
- a denaturation-regeneration cycle makes it possible to obtain 300 mg of protein (estimation by assay according to the Lowry method).
- 75 mg of rP40 are purified after the two chromatographic steps.
- the protein rl O is concentrated after purification in order to reach a final concentration of between 5 and 10 mg / ml.
- the electrophoretic profiles show a degree of purity of the order of 95% (FIG. 1A).
- the protein is specifically recognized by a natural anti-P40 onoclonal antibody obtained in mice (FIG. 1B). The state of the protein is followed by SDS-PAGE.
- the P40 protein extracted from the membrane of Klebsiella pneumoniae has a characteristic electrophoretic (migration) behavior.
- the native form ⁇ -sheet structure
- the denatured form ⁇ -helical structure
- a denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride
- Figure IB the rP40 protein is not correctly renature at the end of renaturation, whether this is carried out in the absence or in the presence of 0.1% (w / v) Zwittergent 3-14.
- Gl 'peptide is a synthetic peptide of 15 amino acids, the sequence of which is as follows (SEQ ID N ° 74):
- this peptide (part 1-14) corresponds to part 174-187 of protein G of the respiratory syncytial virus and presents, compared to the native peptide, two major modifications which are :
- the peptide is coupled to the protein using the reagent BHA or bromo-N-hydroxysuccinimide acetate (Svenson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1347, Bematowicz and Matsueda, 1986, Anal. Biochem. 155, 95).
- This heterobifunctional reagent allows activation of the Lys (Lysine) residues of the protein by bromoacetylation, then coupling of the peptide by the free thiol group carried by the Cys residue.
- the rP40 protein is activated by BHA.
- the rP40 is dialyzed against a 0.1 M phosphate buffer pH 7 containing 0.1% Zwittergent 3-14 for 24 hours at + 4 ° C. After dialysis, the concentration is adjusted to 5 mg / ml using the same buffer before adding BHA at the rate of 1.2 mg (50 ⁇ l) / mg of rP40.
- the peptide (10 mg / ml in 0.1 M phosphate buffer pH 7 containing 0.1% Zwittergent 3-14) is added to the activated protein at a rate of 0.4 mg / mg of protein. After saturation under a stream of nitrogen, the tube is again placed in the dark for 2 hours with stirring and at room temperature.
- the unbound peptide can be removed using a dialysis or molecular sieve chromatography step.
- conjugate obtained is characterized by protein assay (BCA method or
- the coupling rate of the peptide on the protein is estimated by assaying the carboxymethylysteine residue: the assay of the acids amines released by hydrolysis (HC1 6N) is produced by HPLC after derivatization using PITC (Pico-Tag method, Waters).
- the coupling rate determined by this method is approximately 10 G l 'peptides / mole of rP40.
- mice BALB / c mice were or were not sensitized twice with a strain of Klebsiella pneumoniae 1145 in order to reproduce the seropositivity found in humans.
- the mice are then immunized via the nasal route in the absence of an adjuvant 7 days after sensitization. This immunization is carried out with a low level of antigen, the mice receiving 10 ⁇ g of Gl 'equivalent coupled to rP40.
- the mice receive a booster 10 and 20 days after the first immunization.
- a puncture is performed at the retro-orbital sinus of the mice 9 days after the first immunization and 10 days after each booster (secondary and tertiary responses).
- the serum anti-Gl '(FIG. 3) and anti-carrier (FIG. 4) antibodies are assayed by ELISA method. 5.1 Determination of anti-Gl 'serum IgG
- mice presensitized with Klebsiella pneumoniae and immunized with rP40-Gl' is increased after a second immunization.
- a second immunization in the presence of the rP40-Gl 'conjugates induces an anti-Gl' antibody response.
- the anti-P40 antibody response shows that the mice were sensitized to Klebsiella pneumoniae identically regardless of the batch considered. Immunization in the presence of rP40-Gl 'conjugates slightly increases the anti-rP40 antibody response.
- IgA is not detected after a single immunization. After two immunizations, anti-Gl 'IgA are detected essentially in mice presensitized with Klebsiella pneumoniae and immunized with rP40-Gl'. This response is increased by the third immunization. In the absence of sensitization, anti-Gl 'IgA are detected in mice after two immunizations with rP40-Gl' conjugates. This IgA level is increased by the third immunization.
- Thl and Th2 Two types of responses can be observed, Thl and Th2. These responses differ in the profile of cytokines produced and in their functions in the immune response. IgG1 are characteristic of a Th2 response and IgG2a of a Th1 response.
- Thl and Th2 response profile is found only in mice immunized with the rP40-Gl 'conjugates whether or not they are presensitized with Klebsiella pneumoniae (FIG. 6).
- Example 6 Anti-Gl 'antibody response after distant sensitizations and immunizations. Compared to the previous protocol, the first immunization is separated from the last sensitization by a period of 3 weeks instead of a week. The anti-Gl 'antibodies are assayed in the se ⁇ ns and in a tertiary response in the bronchoalveolar washings by ELISA method.
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie ou de protéine de membrane de Klebsiella pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.
Description
UTILISATION DE CONJUGUES P40 ACTIFS PAR VOIE NASALE
La présente invention concerne l'obtention de préparations immunisantes qui soient efficaces lors d'une administration par voie nasale. Elle se rapporte donc à l'utilisation de protéines porteuses susceptibles d'améliorer la réponse immunitaire à un haptène, lorsque le conjugué haptène-protéine porteuse est administré par voie nasale.
L'utilisation de vaccin par voie orale ou par voie nasale aurait une grande influence sur l'éradication de germes pathogènes. En effet, toute modification d'un vaccin lui permettant d'être utilisé avec une plus grande flexibilité (thermostabilité, distribution sans seringue, ...) aurait pour conséquence une vaccination plus efficace et plus étendue. D'autre part, l'immunisation par les voies muqueuses permet d'induire une immunité locale constituant la première barrière à l'invasion par un microorganisme.
Actuellement, les vaccins oraux sur le marché ne concernent que des vecteurs vivants atténués ou recombinés :
- vaccin oral tétravalent contre la polio,
- vaccin oral contre la fièvre typhoïde.
Des approches de vaccination par voie nasale ou orale sont déjà décrites dans la littérature. Des essais ont ainsi été effectués sur des administrations mucosales de la PspA qui correspond à la protéine de surface A de Pneumocoque (Briles D.E., brevet EP 0 682 950), sur les filaments d'hémaglutinine (Capron A., brevet FR 2 718 750 ; Kimura A, brevet EP 0 471 177 ; Shahin R.D., brevet US 7532327), sur un fragment de la toxine tétanique (Dougan G., brevet WO 93/21950), sur la choléra toxin B (CTB). Une protéine de la membrane externe de Neisseria eningilidis est utilisée mélangée à l'haptène en tant qu'adjuvant pour une immunisation par voie nasale (Van de Ver L.L., Infection and immunity, 1996, 64 : 5263-5268).
De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé qu'une protéine de membrane provenant d'une autre bactérie permet, lorsqu'elle est administrée conjointement avec un antigène par la voie nasale, d'induire une réponse immunitaire d'intensité et de qualité satisfaisante pour l'obtention d'un vaccin.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactéric pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptènc. Dans la présente description, on entend désigner par OmpA les protéines de la membrane externe de type A (OmpA pour "Outer membrane protein A").
L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane de Klebsiella pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.
De préférence, la protéine de membrane est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Avantageusement, ledit fragment de la protéine de membrane OmpA d'entérobactérie ou de la protéine de membrane Klebsiella selon l'invention est obtenu par voie recombinante.
De manière très avantageuse, ladite protéine de membrane ou son fragment obtenu par voie recombinante est, après extraction, renaturée en présence de détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglycopyrannoside, de préférence en présence de Zwittergent 3-14 à une concentration comprise entre 0,05 % et 2 % (p/v), de manière très préférée à une concentration voisine de 0, 1 %.
La demande WO 96/14415 a montré que la protéine membranaire majeure de Klebsiella pneumoniae, OmpA baptisée P40, couplée à des antigènes sous unitaires peptidiques est très immunogénique par voie systémique. La protéine P40 recombinante, exprimée chez E. Coli sous forme de corps d'inclusion, est baptisée rP40. Dans le cadre de la présente invention, une protéine particulièrement adaptée comporte la séquence SEQ ID N° 1.
La Demanderesse a démontré qu'une réponse anticorps anti-P40 est retrouvée chez tous les adultes, l'entérobactérie Klebsiella pneumoniae étant un pathogène très répandu. Cette sensibilisation est favorable à une augmentation de la réponse anticorps dirigée contre un antigène ou un haptène qui est administré couplé à la protéine porteuse
P40. L'administration s'effectue par voie nasale en absence d'adjuvant.
Ledit antigène ou haptène scion l'invention peut être choisi dans le groupe comprenant les protéines, les peptides, les polysaccharides, les oligosaccharides et les acides nucléiques. Avantageusement, il est d'origine bactérienne ou virale.
La présente invention est ainsi appropriée pour la préparation de vaccin dirigé contre tout micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes tel que par exemple les micro-organismes choisis parmi le VRS, le para influenzae virus (P1V), l'influenza virus, l'hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques et les méningocoques.
L'antigène ou l'haptène selon l'invention comprendra au moins un fragment dudit micro-organisme, tel qu'un fragment proteique, que l'homme de l'art saura déterminer pour sa capacité à conférer l'immunité recherchée par des techniques standards telles que celles décrites dans les exemples ci-après.
En particulier, la présente invention est appropriée pour la préparation de vaccin dirigé contre le VRS (ou virus respiratoire syncytial), notamment humain ou bovin. Dans ce cas, l'antigène ou l'haptène selon l'invention comprend au moins un fragment proteique du virus VRS, et notamment au moins un fragment de la protéine G du VRS.
Les séquences de tels fragments ont été notamment décrites dans la demande WO 95/27787.
De préférence, lesdits fragments protéiques du virus VRS sont choisis parmi les fragments ayant pour séquences d'acides aminés les séquences SEQ ID N° 2 à SEQ ID
N° 74.
Des séquences convenant à la préparation d'un vaccin selon l'invention sont les séquences SEQ ID N° 2 à SEQ ID N° 74.
Les conjugués chimiques issus d'un couplage de peptides à au moins un fragment d'une protéine membranaire de Klebsiella, telle que la rP40, donnent de bons résultats, et une évaluation de la réponse immunitaire montre des réponses anticorps contre ces peptides très fortes après pré-sensibilisation à Klebsiella pneumoniae.
Avantageusement, le fragment proteique provenant de protéine de membrane OmpA d'entérobactéries ou de protéine de membrane de Klebsiella est couplé de façon covalente avec l'antigène ou l'haptène, tel qu'un fragment proteique du VRS.
L'invention comprend également l'utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entéro-bactéries ou d'une protéine de membrane de
Klebsiella selon l'invention, caractérisée en ce que ledit fragment est couplé de façon covalente avec ledit antigène ou haptène.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le fragment de protéine de membrane et l'antigène ou l'haptène.
Le couplage covalent de l'antigène ou l'haptène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C-terminale du fragment de la protéine de membrane selon l'invention. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité du fragment de la protéine de membrane choisie pour effectuer le couplage et de la nature de l'antigène ou l'haptène à coupler. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art.
Les conjugués issus d'un couplage de peptides à au moins un fragment d'une protéine membranaire OmpA d'entérobactéries ou d'une protéine membranaire de Klebsiella, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine hybride (conjugué) peut en effet être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le fragment de protéine de membrane, d'une séquence codant pour le ou les peptides antigènes ou haptènes. Ces techniques de préparation de protéine hybride par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme de l'art (cf. par exemple S.C. MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60, 3, 512-538) et ne seront pas développées dans la présente description.
Ainsi, l'invention comprend également l'utilisation, selon l'invention, caractérisée en ce que la protéine hybride, obtenue après couplage entre le fragment d'une protéine de membrane et l'antigène ou l'haptène, de type proteique, est préparée par recombinaison génétique. La Demanderesse a également montré qu'en absence de sensibilisation à
Klebsiella pneumoniae, l'administration d'un haptène couplé à au moins un fragment d'une protéine membranaire, telle que la protéine rP40, par voie nasale en absence d'adjuvant induisait une réponse anticorps anti-haptène.
L'invention concerne l'utilisation, selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un fragment d'une protéine de membrane couplé avec un antigène ou un haptène selon l'invention, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer une protéine recombinante hybride contenant un fragment de
protéine de membrane couplé avec l'antigène ou l'haptène selon l'invention, notamment en absence d'adjuvant. Parmi les cellules hôtes transformées capables d'exprimer ladite protéine hybride, on préfère les bactéries à gram négatifs telles que Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli type K 12 couramment utilisée dans la fermentation ou E. coli transformée par un plasmide vecteur d'expression renfermant un promoteur fort tel que l'opéron du promoteur tryptophane (trp). Sont également préférées, les bactéries à gram positifs telles que les staphylocoques non pathogènes, S. carnosus et S. xylosus, dans la mesure où ces bactéries ne produisent pas de LPS (lipopolysaccharides) à la surface membranaire. Ces staphylocoques peuvent être transfectés par des vecteurs d'expression renfermant des promoteurs tels que le trp, ou le signal de sécrétion de Lipase ou encore le signal de sécrétion de la protéine A ou encore le signal du promoteur de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Enfin, l'invention concerne un procédé de préparation d'une protéine ou un de ses fragments par voie recombinante, caractérisé en ce que la protéine ou son fragment est, après extraction, renaturee en présence d'une solution contenant un détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside, et en ce que ladite protéine recombinante n'est pas l'interféron β.
De préférence, ladite protéine est une protéine de membrane d'entérobactérie, notamment de type OmpA. De manière très préférée, ladite protéine est une OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Dans le procédé selon l'invention, le Zwittergent 3-14 sera de préférence à une concentration comprise entre 0,05 % et 2 % de manière plus préférée voisine de 0, 1 %.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes :
Figures 1A et 1B : Analyse par électrophorèse SDS-PAGE de la protéine rP40 après purification.
Figure 1A : révélation au bleu de Coomassie - piste 1 : lot 1, 2 μg - piste 2 : lot 1, 10 μg
- piste 3 : lot 2, 2 μg - piste 4 : lot 2, 10 μg
- piste 5 : lot 3, 2 μg
- piste 6 : lot 3, 10 μg
Figure 1 B : immunoblot et révélation à l'aide d'un sérum polyclonal de lapin anti-P40
- std : standard de masse moléculaire - piste 1 : rP40 dénaturée, 100 ng
- piste 2 : rP40 native, 100 ng.
Figure 2 : Répartition des patients selon la D.O. (Densité Optique) correspondant aux anticorps anti-P40, mesurés par ELISA.
Figure 3 : Réponse anticorps anti-Gl '. Figure 4 : Réponse anticorps anti-rP40.
Figure 5 : Réponse anticorps anti-Gl ' de type IgA.
Figure 6 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl ' obtenues en réponse secondaire.
Figure 7 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl ' obtenues en réponse tertiaire.
Figure 8 : Réponse anticorps sériques anti-Gl ' de type IgG totales. Figure 9 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl ' sériques après trois immunisations.
Figure 10 : Isotypage des immunoglobulines anti-Gl ' des lavages broncho-alvéolaires après trois immunisations.
Exemple 1 : clonage de rP40
Clonage du gène rP40 :
Le gène codant pour rP40 a été obtenu par amplification par PCR (Réaction en Chaîne à la Polymérase) à partir de l'ADN chromosomal de la souche Klebsiella pneumoniae IP 1145 (décrit dans le brevet WO 96/14415). Après identification par séquençage ADN, le fragment correspondant à rP40 est cioné dans divers vecteurs d'expression, en particulier celui sous le contrôle du promoteur de l'opéron trp, en amont de 9 acides aminés du peptide leader (MKAIFVLNA). La séquence peptidique de rP40 est représentée dans la liste des séquences par la séquence SEQ ID N° 1. Dans différentes souches E.coli K12, la protéine rP40 est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g protéines / g de biomasse sèche).
Fermentation de protéines de fusion rl'40 :
Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline ( 100 μg/ml, Sigma) et de la Tétracyclinc (8 μg/ml, Sigma), on inocule avec E. coli K 12 transformé avec le plasmide pvaLI O. On incube pendant 16 heures à T° = 37°C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermenteur (CHEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres de milieu de culture. Le milieu contient (g/1) : glycérol, 5 ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydro-génophosphate de potassium, 3 ; hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ; Ampicilline, 0, 1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 de solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé à 7,0. La température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse obtenue est d'environ 200 g, exprimée en biomasse humide.
Exemple 2 : extraction et purification de rP40
Matériel et méthodes
Extraction de la rP40
Après centrifugation du bouillon de culture (4000 rpm, 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5. Un traitement par le lysozyme (0,5 g 1, 1 heure / température ambiante / agitation douce) permet la libération des corps d'inclusion.
Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 5 mM MgCl2, puis centrifugé ( 15 min à 10 000 g).
La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37°C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 7 M urée
(agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfurc). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.
Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant du NaCl (8,76 g/1) et du Zwittergent 3- 14 (0, 1 %, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air (renaturation de la protéine par dilution et réoxydation des ponts disulfure). Purification de la protéine rP40 Etape de chromatographie d'échange d'anions. Après une nouvelle centrifugation, l'échantillon est dialyse contre un tampon
Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0, 1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci- dessus à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,6
M en NaCl dans le tampon Tris/HCl 25 mM pH 8,5 ; 0, 1 % Zwittergent 3-14.
Etape de chromatographie d'écha ge de cations.
Les fractions contenant la protéine rP40 sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 Da) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4°C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0, 1 % de Zwittergent 3-14.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate
20 mM pH 3,0, à 0, 1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse
61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les fractions contenant la rP40 sont rassemblées et concentrées comme décrit précédemment.
Résultats
A partir d'une culture de 1 litre, un cycle de dénaturation-rcnaturation permet d'obtenir 300 mg de protéine (estimation par dosage selon -la méthode de Lowry). 75 mg de rP40 sont purifiés après les deux étapes chromatographiques. Comme précédemment, la protéine rl O est concentrée après purification afin d'atteindre une concentration finale comprise entre 5 et 10 mg/ml. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95 % (figure 1A). Après immunoblot la protéine est spécifiquement reconnue par un anticorps onoclonal anti- P40 naturelle obtenu chez la souris (figure IB). L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme, dénaturée ou native, la protéine P40 extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets β) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices α) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, ou par chauffage à 100°C en présence de SDS (figure IB). La protéine rP40 n'est pas correctement renaturee en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0, 1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Par contre une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0, 1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux-mêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent).
Exemple 3 : couplage du peptide Gl' sur rP40
Matériel et méthodes Le peptide Gl ' est un peptide synthétique de 15 acides aminés, dont la séquence est la suivante (SEQ ID N° 74) :
N-1SIDSNNPTOWAISKC15-C
Sans le résidu Cys (Cystéine) ajouté en position C-terminale, ce peptide (partie 1-14) correspond à la partie 174-187 de la protéine G du virus respiratoire syncytial et présente, par rapport au peptide natif, deux modifications majeures qui sont :
- le remplacement en position 13 du résidu Cys par un résidu Ser (Serine),
- le remplacement en positions 3 et 9 des résidus Cys, formant un pont disulfurc, par respectivement des résidus Asp (acide aspartiquc) et Orn (Ornithinc) formant un pont de type lactamc.
Ces modifications sont introduites dans le but d'éliminer les résidus Cys du peptide natif afin de pouvoir réaliser un couplage univoque de ce dernier sur la protéine grâce au résidu Cys introduit en position C-tcrminale, tout en maintenant la structure du peptide à l'aide de l'introduction d'un pont lactame.
Le couplage du peptide sur la protéine est réalisé à l'aide du réactif BHA ou bromo-N-hydroxysuccinimide acétate (Svenson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1347, Bematowicz and Matsueda, 1986, Anal. Biochem. 155, 95). Ce réactif hétérobifonctionnel permet une activation des résidus Lys (Lysine) de la protéine par bromoacétylation, puis un couplage du peptide par le groupement thiol libre porté par le résidu Cys.
Dans un premier temps, la protéine rP40 est activée par le BHA. La rP40 est dialysée contre un tampon phosphate 0, 1 M pH 7 contenant 0, 1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à + 4°C. Après dialyse, la concentration est ajustée à 5 mg/ml à l'aide du même tampon avant addition du BHA à raison de 1,2 mg (50 μl) / mg de rP40.
L'ensemble est placé à l'obscurité pendant une heure sous agitation et à température ambiante. La rP40 activée est ensuite dessalée par chromatographie de gel-filtration
(élution par le tampon précédemment cité). Les fractions contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées.
Pour le couplage, le peptide (10 mg/ml en tampon phosphate 0, 1 M pH 7 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14) est additionné à la protéine activée à raison de 0,4 mg / mg de protéine. Après saturation sous courant d'azote, le tube est placé à nouveau à l'obscurité pendant 2 heures sous agitation et à température ambiante.
Le peptide non fixé peut être éliminé à l'aide d'une étape de dialyse ou de chromatographie de tamisage moléculaire.
Résultats Le conjugué obtenu est caractérisé par dosage de protéine (méthode BCA ou
LOWRY) et par électrophorèse SDS-PAGE. Le taux de couplage du peptide sur la protéine est estimé par dosage du résidu carboxyméthyleystéine : le dosage des acides
aminés libérés par hydrolyse (HC1 6N) est réalisé par HPLC après dérivatisation à l'aide du PITC (méthode Pico-Tag, Waters).
Le taux de couplage déterminé par cette méthode est d'environ 10 peptides G l '/mole de rP40. Exemple 4 : Immunité naturelle chez l'adulte
Des sérums humains issus d'une étude clinique sont analysés par dosage EL1SA pour déterminer la présence d'anticorps anti-P40.
Les résultats sont représentés sur la figure 2.
Parmi 1 13 sérums testés après dilution au 1/400, 1 10 sérums donnent un signal colorimétrique révélant les IgG anti-P40. Il existe chez tous les patients des anticorps anti-P40 circulant avec des taux plus ou moins élevés selon le patient considéré. Exemple 5 : Réponse anticorps anti-Gl' après des sensibilisations et des immunisations rapprochées
Des souris BALB/c ont été ou non sensibilisées 2 fois avec une souche de Klebsiella pneumoniae 1145 afin de reproduire la séropositivité retrouvée chez l'homme. Les souris sont par la suite immunisées par voie nasale en l'absence d'adjuvant 7 jours après la sensibilisation. Cette immunisation est effectuée avec un faible taux d'antigène, les souris recevant 10 μg d'équivalent Gl' couplé à rP40. Les souris reçoivent un rappel 10 et 20 jours après la première immunisation. Une ponction est pratiquée au sinus rétro-orbital des souris 9 jours après la première immunisation et 10 jours après chaque rappel (réponses secondaire et tertiaire). Les anticorps anti-Gl' (figure 3) et antiporteur (figure 4) sériques sont dosés par méthode ELISA. 5.1 Dosage des IgG sériques anti-Gl'
Les résultats sont représentés sur la figure 3. En réponse primaire, les souris présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-Gl' sont les seules à produire des anticorps anti-Gl '.
Le taux d'anticorps anti-G l' retrouvé chez les souris présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-Gl' est augmenté après une seconde immunisation. En absence de présensibilisation, une seconde immunisation en présence des conjugués rP40-Gl' induit une réponse anticorps anti-Gl'.
Après trois immunisations, la réponse anticorps anti-Gl ' est augmentée chez les souris présensibilisées ou non.
5.2 Dosage des IgG sériques anti-rP40
Les résultats sont représentés sur la figure 4.
La réponse anticorps anti-P40 montre que les souris ont été sensibilisées à Klebsiella pneumoniae de façon identique quel que soit le lot considéré. L'immunisation en présence de conjugués rP40-Gl' augmente faiblement la réponse anticorps anti-rP40.
5.3 Dosage des IgA sériques anti-Gl '
Dans un second temps nous avons dosé la réponse anticorps anti-Gl' de type IgA sérique : immunoglobuline caractéristique d'immunisations effectuées par les voies muqueuses (nasales ou orales).
Les résultats sont représentés sur la figure 5.
Après une seule immunisation les IgA ne sont pas détectées. Après deux immunisations, des IgA anti-Gl ' sont détectées essentiellement chez des souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées avec rP40-Gl'. Cette réponse est augmentée par la troisième immunisation. En absence de sensibilisation des IgA anti-Gl' sont détectées chez des souris après deux immunisations avec des conjugués rP40-Gl'. Ce taux d'IgA est augmenté par la troisième immunisation.
5.4 Isotypage des immunoglobulines sériques anti-Gl'
Deux types de réponses peuvent être observées, Thl et Th2. Ces réponses diffèrent par le profil de cytokines produites et par leurs fonctions dans la réponse immunitaire. Les IgGl sont caractéristiques d'une réponse de type Th2 et les IgG2a d'une réponse Thl .
Un profil mixte de réponse Thl et Th2 est retrouvé uniquement chez les souris immunisées avec les conjugués rP40-Gl' qu'elles soient ou non présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae (figure 6).
Après trois immunisations (figure 7), le profil reste mixte chez les souris immunisées avec les conjugués rP40-Gl'.
Exemple 6 : Réponse anticorps anti-Gl' après des sensibilisations et des immunisations éloignées. Par rapport au protocole précédent, la première immunisation est séparée de la dernière sensibilisation par une période de 3 semaines au lieu d'une semaine. Les
anticorps anti-Gl' sont dosés dans les séαπns et en réponse tertiaire dans les lavages broncho-alvéolaires par méthode ELISA.
6. 1 Dosage des IgG sériques anti-G l '
Comme on le voit sur la figure 8, 7 jours après la première immunisation des anticorps sériques anti-G l ' de type IgG totales sont détectés chez les souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées en présence des conjugués rP40-Gl'. Cette réponse anticorps est augmentée par les deux autres immunisations.
6.2 Isotypage des immunoglobulines sériques
Les résultats sont représentés sur la figure 9. Dans ce cas nous observons également une réponse mixte, nous obtenons en effet le même titre en IgGl qu'en IgG2a (Figure 9). De plus, un taux élevé d'IgA est retrouvé chez les souris présensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées trois semaines après en présence des conjugués rP40-Gl'.
6.3 Isotypage des immunoglobulines des lavages broncho-alvéolaires Dans les lavages broncho-alvéolaires, on retrouve les 4 types d'immunoglobulines uniquement chez les souris sensibilisées à Klebsiella pneumoniae et immunisées 3 fois en présence des conjugués rP40-Gl' (figure 10).
Claims
1 . Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.
2. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane de Klebsiella pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène.
3. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon la revendication 2, caractérisée en ce que la protéine de membrane est une OmpA de Klebsiella pneumoniae.
4. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine de membrane ou son fragment est obtenue par voie recombinante.
5. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite protéine de membrane recombinante ou son fragment est renaturee en présence de détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3- 12 et l'octylglucopyrannoside.
6. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'au moins un fragment présente la séquence SEQ ID N° 1.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène sont choisis dans le groupe comprenant les protéines, les peptides, les polysaccharides, les oligosaccharides et les acides nucléiques.
8. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène provient d'un virus ou d'une bactérie.
9. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène comprend au
moins un fragment proteique de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes est choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, l'hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques et les méningocoques.
1 1. Utilisation d'au moins un fragment d'une protéine de membrane selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène comprend au moins un fragment proteique du virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin.
12. Utilisation selon la revendication 1 1, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du VRS.
13. Utilisation selon l'une des revendications 1 1 et 12, caractérisée en ce que l'antigène ou l'haptène comprend au moins l'une des séquences SEQ ID N° 2 à SEQ ID
N° 74.
14. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ledit fragment d'une protéine de membrane est couplé de façon covalente avec ledit antigène ou haptène.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans le fragment de protéine membranaire et/ou de l'antigène ou de l'haptène pour faciliter le couplage.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'élément de liaison introduit est un acide aminé.
17. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que la protéine hybride, obtenue après couplage entre le fragment d'une protéine de membrane et l'antigène ou l'haptène, lorsque ledit antigène ou haptène est de type proteique, est préparée par recombinaison génétique.
18. Utilisation selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un fragment d'une protéine de membrane couplé avec un antigène ou un haptène.
19. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient une cellule hôte transformée capable d'exprimer une protéine
hybride contenant ledit fragment de protéine de membrane couplé avec ledit antigène ou haptène.
20. Utilisation selon l'une des revendications 18 et 19, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant.
21. Procédé de préparation d'une protéine ou un de ses fragments par voie recombinante, caractérisé en ce que ladite protéine ou un de ses fragments est, après extraction, renaturee en présence d'une solution comprenant un détergent choisi parmi le Zwittergent 3-14, le Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside, et en ce que ladite protéine recombinante n'est pas l'interféron β.
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