WO1999049073A1

WO1999049073A1 - Procede de production de cytidine 5'-diphosphate choline

Info

Publication number: WO1999049073A1
Application number: PCT/JP1999/001312
Authority: WO
Inventors: Toshitada Noguchi; Kiyoshi Okuyama; Tomoki Hamamoto; Kenji Takenouchi
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 1999-09-30

Description

明細書シチジン 5¹—ジリン酸コリンの製造方法技術分野

本発明は、頭部外傷、脳手術に伴う意識障害、脳卒中などの改善治療に用いられるシチジン 5¹—ジリン酸コリン（CDP—コリン）の製造方法に関するものである。背景技術

酵母などの微生物を用いて CDP—コリンを製造する方法は古くからよく知られていることである。しかしながら、上記従来の方法は、目的産物である CDP—コリンの生産性が低かったり、基質として高価なシチジン 5¹—モノリン酸（CMP) ゃシチジン 5'—二リン酸（CDP) を用いるなど、実用的に満足しうる方法とはなりえなかった。

また、最近、ォロット酸とコリンから CDP—コリンを製造する方法も報告されているが（特開平 76974号公報）、この方法は、ォロット酸からゥリジン 5，一トリリン酸（5¹— UTP) を製造するための微生物を培養する工程と、 5，一 UTPからの CDP—コリンの合成に関与する 3種類の酵素を生産する組換え大腸菌を培養する工程とが必要であり、微生物培養の手間と培養設備の観点から必ずしも満足しうる方法ではない。発明の開示

本発明者らは、簡便な操作法で CDP—コリンを収率よく製造する方法を確立すベく研究を重ねた結果、

( 1 ) 酵母菌体がヌクレオシド 5¹—モノリン酸を効率的にヌクレオシド 5'—トリリン酸に転換する活性を有すること、 ( 2 ) この反応系にコリンホスフエ一トシチジルトランスフェラ一ゼ

(CCT) 、コリンキナーゼ（CKI) 及びシチジン 5，一トリリン酸シンテターゼ (PyrG) を共存させるだけでゥリジン 5¹—モノリン酸（5¹— UMP) とコリンから

CDP—コリンを製造できること、

( 3 ) 特に、反応条件を約 20~30°Cの範囲内に制御することにより、 CDP—コリンの合成収率を著しく増加させ、一方ゥリジン 5¹—モノリン酸一グルコース

(UDP—ダルコ一ス）など目的外の産物の生産は低く押さえることができること、

( 4 ) グルコース等のエネルギー源を分割して添加することにより CDP—コリンの生産性が一層向上すること

を見いだし、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、酵母菌体、 5¹— UMP及びコリンを、 CCT、 CKI及び PyrG の共存下に反応させることを特徴とする CDP—コリンの製造法に関するものである。

また、本発明は、酵母菌体、 5¹— UMP及びホスホリルコリンを、 CCT及び PyrG の共存下に反応させることを特徴とする CDP—コリンの製造法に関するものである。図面の簡単な説明

図 1は、反応温度が CDP—コリンの生産性と反応液の組成に与える影響を示したものである。発明を実施するための最良の形態

本発明で使用できる酵母菌体としては、 5¹— UMPを 5¹— UTPに変換できる酵母であれば特に制限されないが、例えばサッカロミセス（Saccharomyces) 属、チゴサッカロミセス (Zygosaccharomyces) 属、カンディダ (Candida) 属、トノレロプシス（Torulopsis) 属、ノ、ンセヌラ（Hansenula) 属、デバリオミセス (Debaiyomyces) 属などの属に属するものが挙げられる。なかでも市販のパン酵母を用いるのが簡便であり、また酵母乾燥菌体、酵母生菌体いずれの形態の菌体も利用可能である。

酵母菌体の使用濃度としては、乾燥重量で約 10重量％以下、更に約 2 ~ 5重量 %、特に約 2 ~ 3重量％の範囲が好ましい。

基質として使用する 5¹— UMP、コリン及びホスホリルコリンは、いずれも市販されており、これら市販品を利用することができる。各基質の使用濃度は、約 1 ~200mM、特に約 10~100mMの範囲が好ましい。

反応系に共存させる CCT、 CKI及び PyrGは、動物由来、植物由来、微生物由来など、特定の由来のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性、反応効率などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好ましい。また、各種酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる組換 DNA}支術を用いた酵素生産が最も好適である。

例えば、微生物由来の CCT及び CKIとしては、酵母由来の酵素を例示できる。酵母 CCT遺伝子は既にクローン化され、その全塩基配列が決定されている（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 1987) 。 CKI遺伝子も酵母染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている（J. Biol. Chem.， 264， 2053-2059， 1989) 。また、 PyrGとしては、大腸菌、枯草菌由来の酵素が例示できる。大腸菌 PyrG遺伝子も既にクローン化されており、その全塩基配列の決定されている（J. Biol. Chem.， 261, 5568-5574, 1982) 。従って、いずれの遺伝子も PCR法によりクローン化することが可能であり、また各種遺伝子の発現系の構築、酵素の発現なども公知の方法、例えば「Molecular Cloning, A Laooratory Manual, Second Edition,

Sambrookら編、 Cold Spring Harbor Laboratory (1989)」に従って行うことができる。

反応液に添加する酵素調製物としては、微生物の菌体、該菌体の処理物、該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイョン培地、 LB培地（ 1 %トリプトン， 0.5%ィ一ストエキストラクト， 1 %食塩）、 2 XYT培地（1.6%トリプトン， 1 %イーストエキストラクト， 0.5%食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約 30~50°Cで約 10~50時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。

微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダ一、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。

酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィ一処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。

CDP—コリンの合成反応は、例えば水溶液、好ましくは緩衝液中、酵母菌体、 5'— UMP、コリンまたはホスホリルコリンを添加し、さらに CCT、 CKI (ホスホリルコリンを用いたときは不要）及び PyrGの各酵素調製物を約 0.01ュニット /ml 以上、好ましくは約 0.04~1.0ュニット /ml程度共存させ、約 5 ~30°C、好ましくは約 20~30で、さらに好ましくは約 23~28°Cで約 1 ~60時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。

なお、上記酵素反応は、酵母菌体、基質及び酵素調製物以外にも無機リン酸、窒素源及びエネルギー源を反応系に添加して行うのが好ましい。使用する無機リン酸としては、リン酸カリゥ厶などのリン酸塩をそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのがより好ましい。無機リン酸の使用濃度は、約 10~500mM、特に約 20〜300mMの範囲が好ましく、リン酸緩衝液の pH は、約 6.0~8.0の範囲が好ましい。また、エネルギー源としては、グルコース、フラクト一スなどの糖類；酢酸、クェン酸などの有機酸を使用することができ、窒素源としては、グルタミン等のアミノ酸あるいは硫安を使用することができ、それぞれ、約 10〜500mM、特に約 20~400mMの範囲で使用するのが好ましい。特にエネルギー源は、一回の添加量力'; 500mMを超えないように分割して小量ずつ反応液に添加するのが CDP—コリンの生産性からは効果的である。

このようにして得られた CDP—コリンは、通常の単離精製手段（イオン交換ク口マトグラフィ一、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。実施例

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は何等限定されるものではない。

なお、実施例における DNAの調製、制限酵素による切断、 T4DNAリガ一ゼによる DNA¾結、及び大腸菌の形質転換法は、すべて「Molecular cloning」

(Maniatisら l， Cold spring Harbor Laooratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) に従って行い、反応液中の CDP—コリンの定量は、 HPLC法により行つた。また制限酵素、 AmpliTaq DNAポリメラ一ゼ及び T4DNAリガ—ゼは、宝酒造（株）より入手した。

( 1 ) CCT遺伝子のクロ一ニング

酵母 Saccharomyces cerevisiae DB746 (ATCC 44773) の染色体 DNAを公知の方法「Metnods in Yeast Genetics LaDoratory ManualJ 〔Cold spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, New York (1983)〕に従って調製した。この DNA をテンペレートとして、以下に示す 2種類のプライマ一 DNAを常法に従って合成し、 PCR法により酵母 CCT遺伝子を増幅した。プライマ一（A) ： 5' -TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3'

プライマ一（B) ： 5' - TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT - 3'

PCRによる CCT遺伝子の増幅は、反応液 10(^ 1 [50mM塩化力リウム， 10mM トリス塩酸 (pH8.3) ， 1.5mM塩化マグネシウム， 0.001%ゼラチン，テンペレート DNA 0.5 g，プライマー DNA(A)及び (B)各々 0.2 _Λ M , AmpliTaq DNAポリメラ一ゼ 2.5ュニット〕中、 Perkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（94°C , 1分）、アニーリング（55°C， 1.5分）、ポリメライゼ一シヨン（72°C， 1.5分）のステップを 25回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後、反応液をフヱノール/クロ口ホルム（1 : 1 ) 混合液で処理し、水溶性画分に 2倍容のエタノールを添加し DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを文献 (Molecular cloning, 前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 1.8kb相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 Ncol及び Xbalで切断し、同じく制限酵素 Ncol及び Xbalで消化したプラスミド pTrc99A

(Pharmacia Biotech.社より入手）と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用 t、て大腸菌 JM109菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc—CCTを単離した。 pTrc— CCTは、 pTrc99Aの trcプロモ一タ—下流の Ncol— Xbal切断部位に酵母 CCT遺伝子を含有する Ncol— Xbal DNA断片が挿入されたものである。

( 2 ) CKI遺伝子のクローニング

酵母 Saccharomyces cerevisiae DB746 (ATCC 44773) の染色体 DNAをテンペレートとして、以下に示す 2種類のプライマ一 DNAを常法に従って合成し、 PCR 法により酵母 CCT遺伝子を増幅した。

プライマー（C) ： 5 ' -ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCA-3 '

プライマー（D) ： 5'— ATCTGCAGGMTTCGTATACGTA ACA - 3'

PCRによる CCT遺伝子の増幅は、反応液 100 1 〔50mM塩化カリウム， 10mM トリス塩酸（pH8.3) , 1.5mM塩化マグネシゥム， 0.001%ゼラチン，テンペレ一ト DNA 0.5 g，プライマー DNA(C)及び (D)各々 0.2 M， AmpliTaq DNAポリメラーゼ 2.5ュニット〕中、 Perkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（94°C， 1分）、アニーリング（55°C， 1.5分）、ポリメライゼ一シヨン（72°C， 1.5分）のステップを 25回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後、反応液をフエノールノクロ口ホルム（ 1 : 1 ) 混合液で処理し、水溶性画分に 2倍溶のエタノールを添加し DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを文献（Molecular cloning, 前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 2.0kb相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 Xbal及び Pstlで切断し、同じく制限酵素 Xbal及び Pstlで消化したプラスミド pTrc99A

(Pharmacia Biotech.社より入手）と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 JM109菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc— CKIを単離した。 pTrc— CKIは、 pTrc99Aの trcプロモータ一下流の Xbal— Pstl切断部位に酵母 CKI遺伝子を含有する Xbal— Pstl DNA断片が挿入されたものである。

( 3 ) CCT及び CKIの調製

プラスミド pTrc— CCTを制限酵素 Ncol及 O^Xbalで消化し、 CCT遺伝子を含む Ncol— Xbal断片を分離精製した。該断片と Ncol及び alで切断したプラスミド pTrc— CKI DNAと T4DNAリガーゼを用いて連結し、連結反応液を用いた大腸菌 JM109を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc— CCKを単離した。 pTrc— CCKは、 pTrc99Aの trcプロモータ一下流に酵母 CCT及び CKI遺伝子が連結されて挿入されたものである。

プラスミド pTrc— CCKを保持する大腸菌 JM109菌を、 100 g/mlのアンピシリンを含有する 2 XYT培地 300mlに植菌し、 37°Cで振とう培養した。 4 X10⁸菌 /ml に達した時点で、培養液に終濃度 0.5mMになるようにィソプロピル-/? -D-チォガラクトビラノシド（IPTG) を添加し、さらに 37°Cで 5時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（9，000X g , 10分）により菌体を回収し、 30mlの緩衝液

(50mM トリス塩酸 (pH7.5) , 0.5mM EDTA) に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破碎し、さらに遠心分離（20，000X g， 10分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液における CCT活性は 18ュニット /ml、 CKT活性は 1.6ュニット /mlであった。

なお、各酵素の単位（ュニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。

(CCT活性の測定と単位の算出法）

10mM CTP、 lOmMホスホコリン及び 10mM塩化マグネシゥ厶を含有する 200mM トリス一塩酸緩衝液 (pH7.8) に酵素標品を添加し、 37°Cで反応させる。反応終了後 100°C、 1分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィ―

(HPLC) で反応液中の CDP—コリン量を分析する。 37°Cで 1分間に 1 moleの CDP—コリンを生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

(CKI活性の測定と単位の算出法）

lOmM CTP、 lOmM塩化コリン、 lOmM ATP、 lOmM塩化マグネシゥム及び 1ュニット /ml CCTを含有する 200mM トリス塩酸緩衝液 (pH7.8) に酵素標品を添加し、 37°Cで反応を行い、 100°C、 1分間の熱処理により反応を停止させる。反応液中の CDP—コリン量を HPLC法により定量する。 37°Cで 1分間に 1 moleの CDP—コリンの生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

( 4 ) 大腸菌 PyrG遺伝子のクローニング

大腸菌 JM109の染色体 DNAをテンペレ一トとして、以下に示す 2種類のプライマ— DNAを常法に従って合成し、 PCR法により大腸菌 PyrG遺伝子を増幅した。

プライマー（E) ： 5' -TCGTCTTTTCAACCTAACTTCTCA-3 '

プライマー（F) ： 5' -CCGATGATTTTTACGArnTGGAC-3 '

PCRによる PyrG遺伝子の増幅は、反応液 100 1 〔50mM塩化カリウム， lOmM トリス塩酸 (pH8.3) 、 1.5mM塩化マグネシウム、 0.001%ゼラチン、テンペレ一ト DNA 0.5 _g、プライマ一 DNA(E)及び (F)各々 0.2 M、 AmpUTaq DNAポリメラ一ゼ 2.5ュニット〕中、 Perkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（94°C， 1分）、アニーリング（37°C， 2分）、ポリメライゼーシヨン（72°C， 3分）のステップを 25回繰り返すことにより行った。遺伝子増幅後、反応液をフヱノール/クロ口ホルム（ 1 : 1 ) 混合液で処理し、水溶性画分に 2倍容のェタノ一ルを添加し DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを文献（Molecular cloning , 前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 1.8kb相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 Smalで消化したプラスミド pUC18 (宝酒造（株）より入手）と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 JM105菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pUC— pyrGを単離した。 pUC— PyrGは、 pUC18 の lacプロモ―タ—下流の Smal切断部位に大腸菌 pyrG遺伝子が挿入されたものである。

( 5 ) PyrGの調製

プラスミド pUC— PyrGを保持する大腸菌 JM105菌を、 100 g/mlのアンピシリンを含有する 2 ΧΥΤί音地 300mlに植菌し、 37°Cで振とう培養した。 4 X10⁸菌 /ml に達した時点で、培養液に終濃度 0.5mMになるように IPTGを添加し、さらに 37°C で 20時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（9，000X _g， 10分）により菌体を回収し、 30mlの緩衝液〔50mM トリス塩酸 (pH7.5) ， 0.5mM EDTA] に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（20，000X g， 10分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液における PyrG活性は 4.0ュニット /mlであった。

なお、 PyrG活性の測定と単位の算出は次の方法で行った。すなわち、 5 mM UTP、 5 mMホスホコリン、 5 mM ATP、 10mM塩化マグネシゥ厶、 50mM硫安及び 1ュニット /ml CCTを含有する 200mM トリス塩酸緩衝液 (pH7.8) に酵素標品を添加し、 37°Cで反応を行い、 100°Cで 1分間の熱処理により反応を停止させる。反応液中の CDP—コリン量を HPLC法により定量する。 37°Cで 1分間に 1 μ moleの CDP—コリンの生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

( 6 ) CDP—コリンの合成 I

lOOmM リン酸カリウム（pH8.0) 、 30mM UMP、 25mM塩化マグネシウム、 25mMホスホリルコリン、 25mMグルタミン、 0.2Mグルコース、 2 % (w/v) 乾燥酵母（オリエンタル酵母社）、 0.5ュニット /ml CCT、及び 0.15ュニット /ml PyrGを含有する合成反応液 5 mlを試験管中で通気撹拌し、 17〜32°Cで 20時間保温した。反応開始 20時間後に HPLC法にて反応液の組成を調べたところ、図 1に示すように 23~28°Cにおいて CDP—コリンの合成収率を著しく増加させ、 UDP— グルコースなど目的外の産物の生産は低く押さえることができることが確認された。

( 7 ) CDP—コリンの合成 II

200mMリン酸カリウム（pH8.0) 、 40mM UMP、 40mM塩化マグネシウム、 40mM塩化コリン、 40mMグルタミン、 0.4M グルコース、 2 % (w/v) 乾燥酵母（オリエンタル酵母社）、 0.04ュニッ卜/ ml CKI、 0.45ュニット /ml CCT、及び 0.04ュニット /ml PyrGを含有する合成反応液 5 mlを試験管中で通気撹拌し、 28°C で 40時間保温した。反応開始 16時間後に終濃度 0.2Mとなるようにグルコースを添加した。反応 40時間後に 22mMの CDP—コリンが合成された。

なお、グルコースを 2分割せずに、最初から 0.6M添加して反応させた場合には 20mM以上の CDP—コリンを生産させることはできなかった。

( 8 ) CDP—コリンの合成 III

lOOmM リン酸カリウム（pH8.0) 、 35mM UMP、 25mM塩化マグネシゥ厶、 25mMホスホリルコリン、 40mMグルタミン、 0.2Mグルコース、 2 % (w/v) 乾燥酵母（オリエンタル酵母社）、 0.6ュニット /ml CCT、及び 0.16ュニット /ml PyrGを含有する合成反応液 5 mlを試験管中で通気撹拌し、 28°Cで 24時間保温した。反応開始 6時間後に終濃度 0.15Mとなるようにグルコースを添加した。反応 24時間後に 23mMの CDP—コリンが合成された。産業上の利用可能性

本発明は、酵母菌体、 5"— UMP、及びコリンまたはホスホリルコリンの反応系に CCT、 CKI (ホスホリルコリンを用いたときは不要）及び PyrGを共存させるという簡便な操作法で効率よく CDP—コリンを製造することができ、極めて実用的な方法である。特に、反応温度を約 20〜30°Cの範囲内に制御することにより、 CDP—コリンの合成収率を著しく増加させ、一方 UDP—グルコースなど目的外の産物の生産は低く押さえることができる。さらに、エネルギー源を分割して添加することにより、 CDP—コリンの生産性をより一層向上させることが可能である。

Claims

求の範囲 . 酵母菌体、ゥリジン 5'—モノリン酸（5¹— UMP) 及びコリンを、コリンホスフエ一トシチジルトランスフェラ一ゼ（CCT) 、コリンキナーゼ（CKI) 及びシチジン 5¹—トリリン酸シンテタ一ゼ（PyrG) の共存下に反応させることを特徴とするシチジン 5'—ジリン酸コリン（CDP—コリン）の製造法。

. 酵母菌体、ゥリジン 5'—モノリン酸（5¹— UMP) 及びホスホリルコリンを、コリンホスフェートシチジルトラ口ンスフェラ一ゼ（CCT) 及びシチジン 5¹—トリリン酸シンテターゼ（PyrG) の共存下に反応させることを特徴とするシチジン 5¹—ジリン酸コリン（CDP—コリン）の製造法。

. 約 20~30°Cの温度条件で反応を行うものである請求項 1または 2記載の方法。

. 約 23~28°Cの温度条件で反応を行うものである請求項 1または 2記載の方法。

. エネルギー源を分割して添加するものである請求項 1または 2記載の方法。