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WO1999047701A1 - Verfahren zum nachweis einer nukleotidsequenz - Google Patents

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WO1999047701A1
WO1999047701A1 PCT/DE1999/000726 DE9900726W WO9947701A1 WO 1999047701 A1 WO1999047701 A1 WO 1999047701A1 DE 9900726 W DE9900726 W DE 9900726W WO 9947701 A1 WO9947701 A1 WO 9947701A1
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primer
strand
nucleotide sequence
solid phase
bound
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PCT/DE1999/000726
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French (fr)
Inventor
Wolf Bertling
Original Assignee
november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2000536884A priority patent/JP2002506655A/ja
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Priority to CA002324249A priority patent/CA2324249A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the invention relates to a method according to the preamble of claim 1. It also relates to a kit for performing the method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR is suitable for the production of large quantities of a sought-after DNA sequence.
  • two synthetic oligonucleotide primers are added to a solution containing the sample, which are complementary to sections on a strand and a counter strand that flank the sought DNA sequence.
  • the DNA sequence searched for can be added after the amplification by adding detection reagents, e.g. by means of a color reaction or electrophoresis.
  • WO 94/02636 describes a method in which a first primer bound to a solid phase is brought into contact with and hybridized with a sample containing a nucleotide sequence. Subsequently, the sample vessel is opened and a second primer is added to the sample, the nucleotide sequence hybridizing. The second primer is marked. It accumulates on the solid phase. The marking can be observed there. Furthermore, it is known from WO 94/02636 to carry out a polymerase chain reaction using three primers in solution, the solution being brought into contact with the primers in succession.
  • WO 96/26291 describes a method for differentiating several alternative DNA sequences.
  • a first and a second primer are bound to a solid phase.
  • a third primer is in solution. This method is only suitable for distinguishing the predecessor from alternative DNA sequences, but not for the detection of a specific nucleotide sequence.
  • PCR only two primers are included in the reaction, one of which is bound to a solid phase. This is not very flexible and hard to access. The method is less suitable for PCR than if there are free primers.
  • a method for the detection of specific DNA is known from WO 90/11369, in which the sample is first subjected to a first amplification by means of PCR. The sample is then transferred to a further reaction vessel, where it is brought into contact with a second primer bound to a solid phase. A second amplification by means of PCR takes place.
  • This method also disadvantageously entails the risk of contamination when the sample is transferred from the first to the second reaction vessel.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a fast method for the detection of a nucleotide sequence with a reduced risk of contamination is to be specified.
  • a method for the detection of a nucleotide sequence by means of polymerase chain reaction the nucleotide sequence being part of a solution consisting of a strand (S) and a counter strand (G) formed double-stranded nucleic acid molecule, with the following steps:
  • a) adding a first primer to the solution, the first primer being complementary to a first section of the strand located 5'-terminally of a central section, and a second primer, the second primer being complementary to a 5'-terminal second section the opposite strand is
  • the nucleotide sequence sought is thereby enriched on the solid phase.
  • the necessary reaction time is shortened and the sensitivity is improved.
  • the third primer is advantageously a DNA molecule or a PNA-DNA chimera.
  • the solid phase is a, preferably electrically conductive, plastic, the plastic being able to contain a polycarbonate, trimethylthiophene, triaminobenzene and / or a polycarbene and / or carbon fibers.
  • the solid phase is expediently a microtiter plate, in the cavity of which the third primer can be bound covalently or by means of biotin.
  • the nucleotide sequence when the nucleotide sequence is present, an interaction between a first and a second fluorophoric molecule that enables a radiation-free or direct energy transfer is generated or eliminated.
  • the first fluorophore molecule can be bound to the solid phase.
  • the first fluorophoric molecule may also be bound to the solid phase via the third primer.
  • a particularly simple variant consists in that the third primer has a hairpin loop, and the first fluorophoric molecule is bound to a first loop section and the second fluorophoric molecule opposite to a second loop section at a distance that enables the interaction.
  • the interaction can be eliminated by hybridization with a complementary strand complementary to the third primer or by a synthesis taking place at the third primer.
  • the second fluorophore molecule can be bound to the second primer.
  • the solid phase is expediently a microtiter plate.
  • the kit may comprise, as further components, the buffers required to carry out the polymerase chain reaction, the deoxy nucleotide triphosphates required to amplify the nucleotide sequence and the polymerase required to carry out the polymerase chain reaction, preferably a Taq polymerase.
  • the first and second primers and the further components can be in the lyophilized state.
  • a reaction can be started by adding the solution containing the nucleotide sequence.
  • the first and the second and / or the further components can be coated with wax. This enables the reaction to be started by heating the solution containing the nucleotide sequence and the coated components.
  • Fig. 4 shows a second way of detecting the nucleotide sequence.
  • a first primer P1 hybridizes with a 5 '-terminal section AtS of strand S and a second primer P2 with a 5' -terminal section AtG of opposite strand G.
  • a central section AzS of strand S hybridizes with a third primer P3.
  • the third primer P3 is bound to a solid phase M with its 5 'terminal end.
  • the third primer P3 is a DNA or PNA-DNA chimera.
  • the solid phase M consists of an electrically conductive polycarbonate.
  • the solid phase M can also be used as a resistance heating element due to its electrical conductivity.
  • a short product P F is bound to the solid phase M via the third primer P3.
  • the third primer P3 is part of a synthesis counter strand SGI.
  • a synthetic strand SSI containing the nucleotide sequence N and the second primer P2 is paired with the synthetic counter strand SGI.
  • a long product P_- in solution contains the first primer P1 in the synthesis counter-strand SG2 and the second primer P2 in the synthesis strand SS2 and the nucleotide sequence N.
  • a first fluorophore molecule F1 is bound to the third primer P3 and a second fluorophore molecule F2 to the second primer.
  • the first fluorophoric molecule F1 is a donor group and the second fluorophoric molecule F2 is a corresponding acceptor group.
  • the distance between the donor and the acceptor group is approximately 30 to 60 A. In this state, the so-called Förster effect leads to the formation of interactions between the donor and the acceptor group.
  • Suitable donor / acceptor compounds are shown in the table below:
  • IAEDANS 5- ((((2-iodoacyl) fluorescein amino) ethyl) amino) naphthalene-1-sulonic acid)
  • ⁇ DANS 5- ((2-aminomethyl) DABCYL (4-dimethylaminoazoamino) naphthalene-1-sulfonic acid benzene-4 ' sulfoyl chloride)
  • the first fluorophoric molecule F1 is directly bound to the solid phase M in the vicinity of the third primer P3.
  • a 96-well microtiter plate made of polycarbonate or polypropylene is advantageously used, which can contain a conductive polymer component such as polycarbene, trimethylthiopene and / or triamino-benzene and / or carbon fibers.
  • the third primer P3 is bound to the cavities.
  • the microtiter plate forms 1 1
  • a resistance heating element as part of a circuit, a resistance heating element.
  • the samples and the other components necessary for carrying out a PCR are pipetted into the cavities. These contain in particular the first P1 and the second primer P2 with an attached second fluorophore molecule F2.
  • a target DNA contained in the sample is denatured by increasing the temperature to 95 °, i.e. separated into the strand S and the corresponding counter strand G.
  • the temperature is then reduced to 40 to 60 °.
  • the strand S binds with its central section AzS to the third primer P3 and with its further 5 '-terminal section AtS to the first primer P1.
  • the second primer P2 binds to the 5' -terminal section of the opposite strand G.
  • This is then carried out Using a Taq DNA polymerase, a synthesis of the missing sequence sections at 72 ° C.
  • the temperature is increased to 95 ° C., so that the synthesis strands containing the fluorophore molecules F1, F2 are present as single strands, namely as synthesis strand SSI and as synthesis counter strand SGI.
  • the temperature is reduced to 50 to 60 °.
  • synthesis strand SSI and the synthesis counter strand SGI bound to the solid phase M pair so that the first F1 and the second fluorophoric molecule F2 are in a section from 30 to 60 .-. available.
  • Fig. 3 shows this schematically. 12
  • the next PCR cycle is then initiated by increasing the temperature. This leads to a further increase in the synthesis strand SSI and the synthesis counter strand SGI.
  • As a template for the PCR product P ? serves both the nucleotide sequence N contained in the sample and the resulting PCR product P F.
  • the change in the fluorescence intensity over the number of PCR cycles is a measure of the initial concentration of the nucleotide sequence. The more nucleotide sequence contained in a sample, the faster the fluorescence intensity increases.
  • the first fluorophoric molecule F1 is bound directly to the solid phase M.
  • the third primer P3 is bound to the solid phase M in the vicinity of the first fluorophoric molecule F1.
  • the third primer P3 can also have a hairpin loop, the first fluorophore molecule F1 being bound to a first loop section and the second fluorophore molecule F2 being bonded to an opposite second loop section at a distance which enables the interaction.
  • the first F1 and the second fluorophoric molecule F2 are preferably selected such that the interaction which forms when the hairpin loop is closed causes the fluorescence to be quenched.
  • the hairpin loop is opened by hybridization with a counter strand G complementary to the third primer P3 or by a synthesis taking place at the third primer P3. The interaction between the first F1 and the second fluorophoric molecule F2 is released. When the fluorophoric molecules are excited, fluorescence occurs.
  • the nucleotide sequence N can also be detected by using labeled primers.
  • the second primer P2 can be biotinylated and can be detected with a color reaction using an enzyme coupled to strepatvidin or avidin.
  • the second primer P2 can be labeled with an antibody, which is in a by means of a further enzyme-labeled antibody 14
  • Color reaction is detectable. It is also conceivable to label the second primer P2 with digoxigenin and then to detect it in a color reaction using enzyme-labeled anti-digoxigenin antibodies.
  • nucleotide sequence N it is also possible to detect the nucleotide sequence N using labeled nucleotides.
  • part of the nucleotides can be biotinylated and detected by means of an enzyme coupled to streptavidin or avidin on the solid phase with a color reaction.
  • Some of the nucleotides can be labeled with digoxigenin and detected in a color reaction using enzyme-labeled anti-digoxigenin antibodies.
  • Some of the nucleotides can also be fluorescence-labeled and their incorporation can be verified using a fluorometer.
  • the formation of the PCR products P, on the solid phase M causes an increase in the layer thickness. This can be measured via plasmon resonance, laser-optical methods or the change in electrical properties.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz mittels Polymerase-Ketten-Reaktion, wobei die Nukleotidsequenz (N) Bestandteil eines in Lösung befindlichen, aus einem Strang (S) und einem Gegenstrang (G) gebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ist, mit folgenden Schritten: a) Versetzen der Lösung mit einem ersten Primer (P1), wobei der erste Primer (P1) komplementär zu einem ersten, 5'-terminal eines zentralen Abschnitts (AzS) befindlichen Abschnitt (AtS) des Strangs (S) ist und einem zweiten Primer (P2), wobei der zweite Primer (P2) komplementär zu einem 5'-terminalen zweiten Abschnitt (AtG) des Gegenstrangs (G) ist, b) Inkontaktbringen der Lösung mit einem dritten Primer (P3), dessen 5'-terminales Ende an eine feste Phase (M) gebunden ist, wobei der dritte Primer (P3) komplementär zum zentralen Abschnitt (AzS) des die Nukleotidsequenz (N) enthaltenden Strangs (S) ist, c) Verschließen eines die Lösung enthaltenden Reaktionsgefäßes und d) wiederkehrendes Aufheizen und Abkühlen der Lösung mit folgenden Schritten: d1) Aufheizen auf 92 °C - 100 °C, d2) Abkühlen auf 40 °C - 60 °C, d3) Aufheizen auf 72 °C - 75 °C, und e) Detektion des Nukleinsäuremoleküls während oder nach dem Schritt lt. d) bei geschlossenem Reaktionsgefäß.

Description

Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft außerdem einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.
Ein solches Verfahren ist unter der Bezeichnung "Polymerase- Ketten-Reaktion" (PCR) bekannt. Die PCR eignet sich zur Herstellung großer Mengen einer gesuchten DNA-Sequenz. Zur Durchführung des Verfahrens werden einer die Probe enthaltenden Lösung zwei synthetische Oligonukleotidprimer zugesetzt, die zu Abschnitten auf einem Strang und einem Gegenstrang komplementär sind, welche die gesuchte DNA-Sequenz flankieren. Die gesuchte DNA-Sequenz kann nach der Ampflifizierung durch Zugabe von Nachweisreagenzien, z.B. mittels einer Farbreaktion oder Elektrophorese, nachgewiesen werden.
Das bekannte PCR-Verfahren erfordert, bedingt durch notwendige Diffussionen in der Lösung, eine lange Reaktionszeit. Au- ßerdem ist der Nachweis der gebildeten PCR-Produkte, z.B. mittels Farbreaktion oder Elektrophorese, zeitaufwendig. Zum Nachweis ist es außerdem erforderlich, den die vervielfältigten Produkte enthaltenden Reaktionsansatz öffnen. Das stellt ein Kontaminationsrisiko dar. Schließlich ist die Sensiti- tivtät des bekannten Verfahrens für bestimmte Fragestellungen nicht ausreichend. Die WO 94/02636 beschreibt ein Verfahren, bei dem ein an eine feste Phase gebundender erster Primer mit einer eine Nukleotidsequenz enthaltenden Probe in Kontakt gebracht und hybridisiert wird. Im Anschluß daran wird das Probengefäß geöffnet und die Probe mit einem zweiten Primer versetzt, wobei die Nukleotidsequenz hybridisiert. Der zweite Primer ist markiert. Er reichert sich an der festen Phase an. Die Markierung kann dort beobachtet werden. Ferner ist es aus WO 94/02636 bekannt, eine Polymerase-Ketten-Reaktion unter Ver- wendung von drei in Lösung befindlichen Primern durchzuführen, wobei die Lösung nacheinander mit den Primern in Kontakt gebracht wird.
Der Nachteil der aus der WO 94/02636 bekannten Verfahren be- steht darin, dass zum Inkontaktbringen der Probe mit dem zweiten und ggf. dem dritten Primer das Reaktionsgefäß geöffnet werden muß. Dabei kann es zu Kontaminationen kommen.
Die WO 96/26291 beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung mehrerer alternativer DNA-Sequenzen. Dabei ist ein erster und ein zweiter Primer an eine feste Phase gebunden. Ein dritter Primer befindet sich in Lösung. Dieses Verfahren ist lediglich für die Unterscheidung des Vorlieger.s von alternativen DNA-Sequenzen, nicht aber zum Nachweis einer bestimmten Nu- kleotidsequenz geeignet. Bei der PCR werden nur zwei Primer in die Reaktion mit einbezogen, von denen einer an einer festen Phase gebunden ist. Dieser ist wenig beweglich und schwer zugänglich. Das Verfahren ist für die PCR weniger geeignet als bei Vorliegen freier Primer.
Aus Chemical Abstracts 126: 70853z (1997) zu: Chapture PCR amplification with single-sided specifity across mutation break-points; Lagerstroem-Fermer, Maria et al; Lab. Protoc . Mutat. Detect. 1996, 183 - 188 ist ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von DNA-Sequenzen bekannt. Dabei werden die nachzuweisenden DNA-Sequenzen zunächst amplifiziert und dann an eine feste Phase gebunden. In darauffolgenden Schritten wird die nachzuweisende DNA-Sequenz durch weitere PCR nachgewiesen. Bei diesem Verfahren wird die nachzuweisende DNA- Sequenz durch Bindung an die feste Phase immobilisiert.
Aus Chemical Abstracts 120: 155091a (1994): Incorporation on nonbase residues into synthetic oligonucleotids and their use in the PCR; Gade et al.; Genet . Anal.: Tech. Appl. 1993, 10(2), 61-5 ist die Verwendung von synthetischen Resten in Primern, die nicht repliziert werden können, bekannt. Bei der PCR wird hier durch die Polymerase doppelsträngige DNA produziert, bis sie auf einen solchen synthetischen Rest trifft. Ab dieser Position bleibt der DNA-Strang einzelsträngig. Die einzelsträngige DNA-Sequenz kann ohne vorhergehende Denatu- rierung mit einer komplementären an eine feste Phase gebunde- nen weiteren DNA hybridisieren.
Aus Cardullo R.A. et al: Detection of nucleic acid hybridisa- t-Jon by nonradiative fluorescence resonance energy transfer; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 8790-8794 ist es bekannt, dass ein Fluoreszenz-Energie-Transfer zwischen an Oli- gonukleotiden gebundenen fluorogenen Gruppen möglich ist, wenn diese durch eine Hybridisierung in definierten Abständen fixiert werden.
Aus der WO 90/11369 ist ein Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA bekannt, bei dem die Probe zunächst mittels PCR einer ersten Amplifikation unterzogen wird. Danach wird die Probe in ein weiteres Reaktionsgefäß überführt und dort mit einem zweiten an eine feste Phase gebundenen Primer in Kontakt gebracht. Es findet eine zweite Amplifikation mittels PCR statt. Auch bei diesem Verfahren besteht nachteiligerweise die Gefahr einer Kontamination bei der Überführung der Probe von dem ersten in das zweite Reaktionsgefäß.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein schnelles Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz mit verminder- tem Kontaminationsrisiko angegeben werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 - 18.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz mittels Polymerase-Ketten-Keaktion vorgesehen, wobei die Nuklotidsequenz Bestandteil eines in Lösung befindlichen, aus einem Strang (S) und einem Gegenstrang (G) gebildeten doppelstrangigen Nukleinsäuremoleküls ist, mit folgenden Schritten:
a) Versetzen der Lösung mit einem ersten Primer, wobei der erste Primer komplementär zu einem ersten, 5'- terminal eines zentralen Abschnitts befindlichen Abschnitt des Strangs ist, und einem zweiten Primer, wobei der zweite Primer komplementär zu einem 5 ' -terminalen zweiten Abschnitt des Gegenstrangs ist,
b) Inkontaktbringen der Lösung mit einem dritten Primer, dessen 5 ' -terminales Ende an eine feste Phase gebunden ist, wobei der dritte Primer komplementär zum zentralen Abschnitt des die Nukleotidsequenz enthaltenden Strangs ist,
c) Verschließen eines die Lösung enthaltenden Reaktionsgefäßes ,
d) wiederkehrendes Aufheizen und Abkühlen der Lösung mit folgenden Schritten:
dl) Aufheizen auf 92°C - 100°C d2) Abkühlen auf 40 °C - 60 °C d3) Aufheizen auf 72°C - 75°C
und
e) Detektion des Nukleinsäuremoleküls während oder nach dem Schritt lit. d) bei geschlossenem Reaktionsgefäß.
Dadurch wird die gesuchte Nukleotidsequenz an der festen Phase angereichert. Die notwendige Reaktionszeit wird verkürzt und die Sensitivität verbessert. Der dritte Primer ist vorteilhafterweise ein DNA-Molekül oder eine PNA-DNA-Chimäre.
Die feste Phase ist ein, vorzugsweise elektrisch leitfähiger, Kunststoff, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trime- thylthiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben und/oder Kohlefasern enthalten kann. Zweckmäßigerweise ist die feste Phase eine Mikrotiterplatte, in deren Kavität der dritte Pri- mer kovalent oder mittels Biotin gebunden sein kann.
Nach einem besonders vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal wird bei Vorliegen der Nukleotidsequenz eine einen strahlungslosen oder direkten Energieübergang ermöglichende Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem zweiten fluorophoren Molekül erzeugt oder beseitigt. Dabei kann das erste fluorophore Molekül an die feste Phase gebunden sein. Es kann aber auch sein, dass das erste fluorophore Molekül über den dritten Primer an die feste Phase gebunden ist.
Eine besonders einfache Variante besteht darin, dass der dritte Primer eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluorophore Molekül an einen ersten Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül gegenüberliegend an einen zweiten Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind. Die Wechselwirkung kann durch Hybridisierung mit einem zum dritten Primer komplementären Gegenstrang oder durch eine am dritten Primer erfolgende Synthese beseitigt werden. Dabei kann das zweite fluoro- phore Molekül an den zweiten Primer gebunden sein. - Mit den vorgenannten Merkmalen ist eine einfache und automatisierbare Detektion des Nukleinsäurmoleküls schon während der PCR möglich. Nach der Erfindung ist außerdem ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, umfassend als erste Komponente einen ersten Primer und als zweite Komponente ei- nen zweiten Primer sowie einen dritten Primer, dessen 5'- terminales Ende an eine feste Phase gebunden ist.
Die feste Phase ist zweckmäßigerweise eine Mikrotiterplatte. Der Kit kann als weitere Komponenten die zur Durchführung der Polymerase-Ketten-Reaktion erfoderlichen Puffer, die zur Vervielfältigung der Nukleotidsequenz erforderlichen Desoxy- Nukleotid-Triphosphate und die zur Durchführung der Polymerase-Ketten-Reaktion erfoderliche Polymerase, vorzugsweise eine Taq-Polymerase, umfassen.
Der erste und der zweite Primer sowie die weiteren Komponenten können in lyophylisiertem Zustand vorliegen. So kann eine Reaktion durch Zugabe der die Nukleotidsequenz enthaltenden Lösung gestartet werden. Alternativ können die erste und die zweite und/oder die weiteren Komponenten mit Wachs umhüllt sein. Das ermöglicht einen Start der Reaktion durch Erhitzen der die Nukleotidsequenz und die umhüllten Komponenten enthaltenden Lösung.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung werden nachfolgend anhand der in der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 die Paarung eines Strangs und eines Gegenstrangs mit den Primern, 8
Fig. 2 die nach Durchführung der PCR gebildeten Produkte,
Fig. 3 eine erste Möglichkeit des Nachweises der Nukleotidsequenz und
Fig. 4 eine zweite Möglichkeit des Nachweises der Nukleotidsequenz.
In Fig. 1 ist ein die gesuchte Nukleotdisequenz N enthalten- der Strang S und dessen komplementärer Gegenstrang G gezeigt. Ein erster Primer Pl hybridisiert mit einem 5 '-terminalen Abschnitt AtS des Strangs S und ein zweiter Primer P2 mit einem 5 '-terminalen Abschnitt AtG des Gegenstrangs G. Ein zentraler Abschnitt AzS des Strangs S hybridisiert mit einem dritten Primer P3. Der dritte Primer P3 ist mit seinem 5 '-terminalen Ende an eine feste Phase M gebunden. Beim dritten Primer P3 handelt es sich um eine DNA- oder PNA-DNA-Chimäre. Die feste Phase M besteht hier aus einem elektrisch leitfähigen Poly- carbonat. Die feste Phase M kann aufgrund ihrer elektrischen Leitfähigkeit auch als Widerstandsheizelement benutzt werden.
Fig. 2 zeigt die nach Durchführung des unten beschriebenen PCR-Verfahrens gebildeten Produkte. Ein kurzes Produkt PF ist an die feste Phase M über den dritten Primer P3 gebunden. Der dritte Primer P3 ist Bestandteil eines Svnthesegegenstrangs SGI. Mit dem Synthesegegenstrang SGI ist ein die Nukleotidsequenz N und den zweiten Primer P2 enthaltender Synthesestrang SSI gepaart. Ein in der Lösung befindliches langes Produkt P_- enthält im Synthesegegenstrang SG2 den ersten Primer Pl und im Synthesestrang SS2 den zweiten Primer P2 sowie die Nukleo- tidesequenz N.
Fig. 3 zeigt eine erste Möglichkeit des Nachweises der Nukleotidsequenz N. Am dritten Primer P3 ist ein erstes fluoro- phores Molekül Fl und am zweiten Primer ein zweites fluoro- phores Molekül F2 gebunden. Das erste fluorophore Molekül Fl ist eine Donor- und das zweite fluorophore Molekül F2 eine korrespondierende Akzeptorgruppe. Bei einer Paarung des Strangs SSI mit dem Gegenstrang SGI beträgt der Abstand zwischen der Donor- und der Akzeptorgruppe etwa 30 bis 60 A. In diesem Zustand kommt es nach dem sogenannten Förster-Effekt zur Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen der Donor- und der Akzeptorgruppe. In der nachfolgenden Tabelle sind geeignete Donor-/Akzeptorverbindungen wiedergegeben:
Donor Akzeptor
Fluorescein Tetramethylrhodamin
IAEDANS (= 5-( ( ( (2-iodoacyl) Fluorescein amino )ethyl ) amino)naphthalene- 1-sulonsäure)
ΞDANS ( = 5-( (2-aminomethyl) DABCYL ( 4-dimethylaminoazo- amino )naphthalen-l-sulfonsäure benzen-4 '-sulfoylchlorid)
BODIPY FL BODIPY FL
Fluorescein Fluorescein
Figure imgf000011_0001
10
Geeignete Quencher/Fluorophorpaare sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:
Quencher Fluorophor
DABCYL Coumarin
DABCYL EDANS
DABCYL Fluorescein
DABCYL Lucifer-Yellow
DABCYL Bodipy
DABCYL Eosin
DABCYL Tetramethylrhodamin
DABCYL Texas-Red
DABCYL Erythrosin
Figure imgf000012_0001
Fig. 4 zeigt eine weitere Möglichkeit des Nachweises der Nukleotidsequenz. Hierbei ist im Gegensatz zu der in Fig. 3 gezeigten Möglichkeit das erste fluorophore Molekül Fl, in der Nähe des dritten Primers P3 unmittelbar an die feste Phase M gebunden.
Zur Durchführung des Verfahrens wird vorteilhafterweise eine aus Polycarbonat oder Polypropylen hergestellte 96-Kavitäten Mikrotiterplatte verwendet, die einen leitfähigen Polymeranteil wie z.B. Polycarben, Trimethylthiopen und/oder Triamino- benzol und/oder Kohlefasern enthalten kann. Der dritte Primer P3 ist an den Kavitäten gebunden. Die Mikrotiterplatte bildet 1 1
als Bestandteil eines Stromkreises ein Widerstandsheizelement.
In die Kavitäten werden die Proben sowie die weiteren zur Durchführung einer PCR notwendigen Komponenten pipettiert. Diese enthalten insbesondere den ersten Pl und den zweiten Primer P2 mit einem daran gebundenen zweiten fluorophoren Molekül F2. Eine in der Probe enthaltene Ziel-DNA wird durch Temperaturerhöhung auf 95° denaturiert, d.h. in den Strang S und den korrespondierenden Gegenstrang G getrennt.
Sodann wird die Temperatur auf 40 bis 60° zurückgenommen. Der Strang S bindet mit seinem zentralen Abschnitt AzS an den dritten Primer P3 und mit seinem weiteren 5 '-terminalen Ab- schnitt AtS an den ersten Primer Pl. Der zweite Primer P2 bindet an den 5 ' -terminalen Abschnitt des Gegenstrangs G. Anschließend erfolgt mittels einer Taq-DNA-Polymerase eine Synthese der jeweils fehlenden Sequenzabschnitte bei 72 °C. Dann wird die Temperatur auf 95 °C erhöht, so daß die die fluoro- phoren Moleküle Fl, F2 enthaltenden Synthesestränge als Einzelstränge, nämlich als Synthesestrang SSI und als Synthesegegenstrang SGI vorliegen. Die Temperatur wird auf 50 bis 60° zurückgenommen. Der Synthesestrang SSI und der an die feste Phase M gebundene Synthesegegenstrang SGI paaren, so daß das erste Fl und das zweite fluorophore Molekül F2 in einem Abschnitt von 30 bis 60 .-. vorliegen. Fig. 3 zeigt das schematisch. 12
Bei Anregung des als Donor wirkenden ersten fluorophoren Moleküls Fl kommt es zu einem strahlungslosen Energieübergang auf das als Akzeptor wirkende zweite fluorophore Molekül F2. Dadurch wird am zweiten fluorophoren Molekül F2 eine ver- stärkte Fluoreszenz beobachtet. Die Fluoreszenz kann mittels eines Fluorometers detektiert werden. Die detektierten Werte werden zur Auswertung an ein Datenverarbeitungssystem weitergeleitet.
Sodann wird durch Temperaturerhöhung der nächste PCR-Zyklus eingeleitet. Dabei kommt es zu einer weiteren Vermehrung des Synthesestrangs SSI und des Synthesegegenstrangs SGI. Als Template für das PCR-Produkt P? dient sowohl die in der Probe enthaltene Nukleotidsequenz N als auch das entstandene PCR- Produkt PF.
Die Änderung der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der PCR-Zyklen ist ein Maß für die Ausgangskonzentration der Nukleotidsequenz. Je mehr Nukleotidsequenz in einer Probe ent- halten ist, desto schneller nimmt die Fluoreszenzintensität zu.
3ei der in Fig. 4 gezeigten weiteren Nachweismöglichkeit ist das erste fluorophore Molekül Fl unmittelbar an die feste Phase M gebunden. Der dritte Primer P3 ist in der Nähe des ersten fluorophoren Moleküls Fl an die feste Phase M gebunden. Nach der Paarung des Synthesestrangs SSI mit dem Synthesegegenstrang SGI kommt es bei einer Anregung zum strahlungs- 13
losen oder direkten Energieübergang vom ersten fluorophoren Molekül Fl (Donor) zum zweiten fluorophoren Molekül F2 (Akzeptor) und dort zu einer Fluoreszenz.
Der dritte Primer P3 kann auch eine Haarnadelschleife aufweisen, wobei an einen ersten Schleifenabschnitt das erste fluorophore Molekül Fl und an einen gegenüberliegenden zweiten Schleifenabschnitt das zweite fluorophore Molekül F2 in einem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind. In diesem Fall sind das erste Fl und das zweite fluorophore Molekül F2 vorzugsweise so gewählt, daß die bei geschlossener Haarnadelschleife sich ausbildende Wechselwirkung eine Löschung der Fluoreszenz bewirkt. Durch Hybridisierung mit einem zum dritten Primer P3 komplementären Gegenstrang G oder durch eine am dritten Primer P3 erfolgende Synthese wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die Wechselwirkung zwischen dem ersten Fl und dem zweiten fluorophoren Molekül F2 wird aufgehoben. Bei Anregung der fluorophoren Moleküle kommt es zur Fluoreszenz .
Anstatt unter Ausnutzung von Fluoreszenzeffekten kann die Nukleotidsequenz N auch durch Verwendung von markierten Primern nachgewiesen werden. Dazu kann beispielsweise der zweite Primer P2 biotinyliert sein und mittels eines über ein an Stre- patvidin oder Avidin gekoppeltes Enzym an der festen Phase mit einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Gleichfalls kann der zweite Primer P2 mit einem Antikörper markiert sein, der mittels eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers in einer 14
Farbreaktion nachweisbar ist. Es ist auch denkbar, den zweiten Primer P2 mit Digoxigenin zu markieren und dann über en- zym-markierte Anti-Digoxigenin-Antikörper in einer Farbreaktion nachzuweisen.
Es ist ferner möglich, die Nukleotidsequenz N unter Verwendung von markierten Nukleotiden nachzuweisen. Dazu kann ein Teil der Nukleotide biotinyliert sein und mittels eines an Streptavidin oder Avidin gekoppelten Enzyms an der festen Phase mit einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Ein Teil der Nukleotide kann mit Digoxigenin markiert sein und über enzymmarkierte Anti-Digoxigenin-Antikörper in einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Ein Teil der Nukleotide kann auch fluoreszenzmarkiert sein und der Einbau über ein Fluorometer nachgewiesen werden.
Die durch die Bildung der PCR-Produkte P, an der festen Phase M wird eine Zunahme der Schichtdicke hervorgerufen. Diese ist über Plasmonenresonanz , laseroptische Methoden oder die Ver- änderung der elektrischen Eigenschaften meßbar.
15
Bezugs zeichenliste
Pl erster Primer
P2 zweiter Primer P3 dritter Primer
M feste Phase
N Nukleotidsequenz
S Strang
G Gegenstrang SSI Synthesestrang
SGI Synthesegegenstrang
SS2 weiterer Synthesestrang
SG2 weiterer Synthesesgegenstrang
P? kurzes PCR-Produkt Ε_- langes PCR-Produkt
Fl erstes fluorophores Molekül
F2 zweites fluorophores Molekül
AzS zentraler Abschnitt des Strangs
AtS 5 ' -terminaler Abschnitt des Strangs AtG 5 ' -terminaler Abschnitt des Gegenstrangs

Claims

16Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz mittels Po- lymerase-Ketten-Keaktion, wobei die Nuklotidsequenz (N) Bestandteil eines in Lösung befindlichen, aus einem Strang (S) und einem Gegenstrang (G) gebildeten doppelstrangigen Nukleinsäuremoleküls ist, mit folgenden Schritten:
a) Versetzen der Lösung mit einem ersten Primer (Pl), wobei der erste Primer (Pl) komplementär zu einem ersten, 5 ' -terminal eines zentralen Abschnitts (AzS) befindlichen Abschnitt (AtS) des Strangs (S) ist und einem zweiten Primer (P2), wobei der zweite Primer (P2) komplementär zu einem 5 ' -terminalen zweiten Abschnitt (AtG) des Gegenstrangs (G) ist,
b) Inkontaktbringen der Lösung mit einem dritten Primer (P3), dessen 5 ' -terminales Ende an eine feste Phase (M) gebunden ist, wobei der dritte Primer (P3) komplementär zum zentralen Abschnitt (AzS) des die Nukleotidsequenz (N) enthaltenden Strangs (S) ist,
c) Verschließen eines die Lösung enthaltenden Reaktions- gefäßes,
d) wiederkehrendes Aufheizen und Abkühlen der Lösung mit folgenden Schritten:
dl) Aufheizen auf 92°C - 100°C d2) Abkühlen auf 40 °C - 60 °C d3) Aufheizen auf 72°C - 75°C 17
und
e) Detektion des Nukleinsäuremoleküls während oder nach dem Schritt lit. d) bei geschlossenem Reaktionsgefäß.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der dritte Primer (P3) ein DNA-Molekül oder eine PNA-DNA- Chimäre ist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase (M) ein, vorzugsweise elektrisch leitfähiger, Kunststoff ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat , Trimethylthiophen, Tri- aminobenzol und/oder ein Polycarben und/oder Kohlefasern enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist, in deren Kavi- tät der dritte Primer kovalent oder mittels Biotin gebunden ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei Vorliegen der Nukleotidsequenz (N) eine einen strahlungslosen oder direkten Energieübergang ermöglichende Wechselwirkung zwischen einem ersten (Fl) und einem zweiten fluorophoren Molekül (F2) erzeugt oder beseitigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (Fl) an die feste Phase (M) gebunden ist. 18
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (Fl) über den dritten Primer (P3) an die feste Phase (M) gebunden ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der dritte Primer (P3) eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluorophore Molekül (Fl) an einen ersten Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül (F2) gegenüberliegend an einen zweiten Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Wechselwirkung durch Hybridisierung mit einem zum dritten Primer (P3) komplementären Gegenstrang (G) oder durch eine am dritten Primer (P3) erfolgende Synthese beseitigt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das zweite fluo- rophore Molekül (F2) an den zweiten Primer (P2) gebunden ist.
12. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend als erste Komponente ei- nen ersten Primer (Pl) und als zweite Komponente einen zweiten Primer (?2) sowie einen dritten Primer (3), dessen 5 ' -terminaies Ende an eine feste Phase (M) gebunden ist.
13. Kit nach Anspruch 12, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist. 19
14. Kit nach Anspruch 12 oder 13, umfassend als weitere Komponente die zur Durchführung der Polymerase-Ketten- Reaktion erfoderlichen Puffer.
15. Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 14, umfassend als weitere Komponenten die zur Vervielfältigung der Nukleotidsequenz (N) erforderlichen Desoxy-Nukleotid- Triphosphate.
16. Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 15, umfassend als weitere Komponente die zur Durchführung der Polymerase- Ketten-Reaktion erfoderliche Polymerase, vorzugsweise eine Taq-Polymerase.
17. Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei der erste (Pl) und der zweite Primer (P2) sowie die Komponenten in lyophylisiertem Zustand vorliegen.
18. Kit nach einem der Ansprüche 12 und 17, wobei die erste und die zweite und/oder die weiteren Komponenten mit Wachs umhüllt sind.
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