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WO1999043752A1 - Compositions for transporting negatively charged substances - Google Patents

Compositions for transporting negatively charged substances Download PDF

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Publication number
WO1999043752A1
WO1999043752A1 PCT/JP1999/000954 JP9900954W WO9943752A1 WO 1999043752 A1 WO1999043752 A1 WO 1999043752A1 JP 9900954 W JP9900954 W JP 9900954W WO 9943752 A1 WO9943752 A1 WO 9943752A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
saturated
compound
unsaturated
composition according
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/000954
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Naoto Oku
Mamoru Nango
Hideki Miyazaki
Hiroyuki Sakakibara
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to CA002321200A priority Critical patent/CA2321200A1/en
Publication of WO1999043752A1 publication Critical patent/WO1999043752A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a composition for transporting a negatively charged substance into cells.
  • DDS drug delivery system
  • One is a method using a viral vector.
  • This includes a method in which a nucleic acid having a desired exogenous gene on the genome is infected to thereby introduce an internal nucleic acid into a cell.
  • the other is a method of encapsulating or carrying a desired gene or a vector containing the gene in an artificial or semi-artificial transport carrier (carrier).
  • carrier various processes involved in the behavior and transport of the target substance in the living body depend on the physicochemical properties of the carrier itself, so that the physiologically active substance can be converted into desired organs ('target organs), cells (target organs). It is characterized by reaching cells (cells) or intracellular organs (target organs).
  • carriers in this method include liposomes (F.
  • ribosomes As carriers, Various methods have been devised for using ribosomes as carriers. In recent years, attention has been paid to the fact that DNA molecules are polyadiones, and cationic lipids that have an electrostatic affinity with DNA molecules and can easily form complexes are used as ribosomes, and the DNA is used as target cells in target cells. Attempts have been made to introduce molecules.
  • cationic lipids include lipofectin, 1,2-dioleoxy-3- (trimethylammonio) propane (DOTAP), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxicetilammonium. Pembromide (DMRIE) (F.
  • Kim et al. Disclose a gene transfer system in which a hydrophobic group is bound to polylysine, introduced into plasma protein by hydrophobic interaction, and then electrostatically bound to a DNA molecule (US Patent No. 5, 679, 559).
  • Zhou et al. Prepared liposomes consisting of polylysine with a hydrophobic group and phospholipids (X. Zhou et al., Biochimica et Biophysica Acta. 1065, 8-14 (1991), X. Zhou et al. ., ibid. 1189, 195-203 (1994)).
  • WO 97/45442 pamphlet discloses a liposome containing a cholesterol-introduced polyamine.
  • polyalkyleneimines especially polyethyleneimine (PEI) are known (N. Oku et al., J. Biochem. 100, 935-944 (1986), N. Oku et al., Biochemistry 26, 8145-8150 (1987), Suh et al., Bioorganic Chem. 22, 318-327 (1994)).
  • PEI polyethyleneimine
  • Polyethyleneimine is a linear or branched polymer molecule having a protonated amino group in the molecule and capable of binding to a DNA molecule through the molecule. Since it is not necessary to use a cell membrane denaturant, it has been applied in gene transfer (W096 / 02655, O. Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the present invention relates to a composition comprising a cationic polymer as a constituent, which has a higher introduction efficiency and a lower toxicity to cells when a substance having a negative charge is introduced into cells, and a negative electrode using the composition.
  • An object of the present invention is to provide a method for introducing a charged substance into cells.
  • the present inventors have constructed a novel transport carrier comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups have been introduced, and have introduced a gene transfer into cells using this carrier.
  • a novel transport carrier comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups have been introduced, and have introduced a gene transfer into cells using this carrier.
  • the present inventors have introduced a plurality of cetyl groups into polyethyleneimine to prepare a cetylated polyethyleneimine shown in FIG. 1, to which phospholipid phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine was added.
  • the mixture was mixed to prepare a carrier composition.
  • the resulting composition is mixed with a plasmid into which a fluorescent protein (GFP) gene has been inserted, and the resulting complex is introduced into COS-1 cells, and the efficiency of gene transfer is determined by measuring the fluorescence intensity. And cytotoxicity by measuring the cell density of living cells.
  • GFP fluorescent protein
  • the present inventors synthesized nine types of compounds having different molecular weights and alkyl group lengths and alkyl group introduction rates of polyethyleneimine, and examined the relationship with gene expression (FIGS. 7 and 8). .
  • the molecular weight was around 600, and that the alkyl group was a cetyl group suitable for in vitro gene expression (Table 1).
  • this compound was hardly affected by serum during the gene transfer process.
  • cetylated polyethyleneimine polyethyleneimine has a molecular weight of about 600
  • ribofectamine which is conventionally known as a high transfection reagent, is present in the presence of 50 serum.
  • the expression of the gene was more than 10 times higher than that of the gene (Table 1).
  • the gene expression was more than 200 times higher than that of ribofectamine in normal cerebral vascular endothelial cells (BBMC) (Table 2).
  • the above compounds have a heterogeneous structure due to the use of commercially available polyethyleneimine having a molecular weight distribution as a starting material.
  • Five types of alkylated linear spermine starting from permine Fig. 16). The gene expression of these new compounds was high as expected, and in each case, the compounds into which the cetyl group was introduced were superior.
  • Cetylized linear ethyleneimine and cetylized linear spermine showed more than 10-fold higher expression in HepG2 cells in the presence of serum (Tables 3 and 4). In the absence of serum, octylated linear spermine showed high gene expression, as did ceylated linear spermine (Table 4).
  • alkylated branched polyethyleneimine exhibits excellent gene transfer ability in the presence of serum, particularly when converted into liposomes.
  • alkylated linear ethyleneimine and alkylated linear spermine were synthesized, and as a result of examining gene expression, the derivative into which two cetyls and octyls were introduced was converted into a complex with DNA. And found to show excellent gene expression in vivo.
  • the present invention provides a composition comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups are introduced or a salt thereof as a component, and gene transfer using the composition.
  • a composition comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups are introduced or a salt thereof as a component, and gene transfer using the composition.
  • composition comprising a polyalkyleneimine or a salt thereof in which two or more hydrophobic groups are introduced in one molecule
  • the hydrophobic group is a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxy group, or a phospholipid residue;
  • composition according to (1), wherein the polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced in one molecule is a compound represented by the following structural formula (I):
  • R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated
  • Two R's that are bonded to the same nitrogen atom may be the same or different;
  • R 1 is hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, or a compound represented by the following formula (II)
  • an amide bond may be contained in the basic skeleton and the side chain R m , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated Or an unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, and two R's bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; R m represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated alkoxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (III).
  • an amide bond may be contained in the basic skeleton and the basic skeleton of the side chain R m + 1 , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, saturated or unsaturated.
  • a, b, c, and Xp + Xq + 1 represent arbitrary natural numbers.
  • R ,, R ⁇ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is Echiru group, Purobiru group, butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, O corruptible, nonyl , Decyl, pendecyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendudecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl.
  • At least two of the side chains of R ⁇ R 1 , R m and R m + 1 are a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, and a decyl group
  • the group according to (5) which comprises a group selected from the group consisting of dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendudecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, and octyldecyl.
  • any two or more of the side chains of R, RR m and R ra + 1 are ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl Group, decyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pendecyl group, hexadecyl group, hepdecyl decyl group, octadecyl group, nonadecyl group, and eicosyl group ,
  • R ⁇ R ⁇ R m or any two of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group
  • any two or more of the side chains of R, R 1 , R m , and R m + 1 are an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group , Nonyl, decyl, pendecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl.
  • the composition according to (11), comprising a group selected from the group consisting of:
  • R ,, R ⁇ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group (11) including a group selected from the group consisting of a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptanedecyl group, and an octadecyl group.
  • composition according to (11), wherein the spermine structures are linked in a branched manner are linked in a branched manner.
  • R ⁇ RR m two or more any of the side chains of R m + 1 is E Ji group, propyl group, butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, Select from the group consisting of decyl, decyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, hepdecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl
  • the composition according to (14) which comprises a group represented by the formula:
  • R ⁇ RR m two or more any of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group, dodecyl
  • composition according to (19), wherein the phospholipid has a phosphatidylethanolamine skeleton or a phosphatidylcholine skeleton.
  • a method for introducing a physiologically active substance having a negative charge into a cell comprising a step of contacting the complex according to (22) or (23) with a cell,
  • Kit A polyalkyleneimine or a salt thereof in which a phospholipid and at least two hydrophobic groups are introduced in one molecule for producing the composition according to any one of (19) to (21). Kit, including.
  • the present invention relates to a composition containing a polyalkyleneimine or a salt thereof in which two or more hydrophobic groups are introduced in one molecule.
  • polyalkyleneimine refers to a polymer molecule having a protonated amino group, and may be a linear or branched type.
  • the alkylene monomer as a constituent unit of the polyalkyleneimine is preferably a lower alkyleneimine having 1 to 10 carbon atoms, and is a lower alkyleneimine having 1 to 3 carbon atoms from the viewpoint of solubility in water. Is more preferable. From the viewpoint of ease of synthesis, polyethyleneimine or spermine is particularly preferable.
  • Polyethyleneimine can be produced by a method known to those skilled in the art (for example, JP-B-49-331230, JP-B-43-43). No. 8828, U.S. Pat. No. 4,032,480 and U.S. Pat. No. 4,467,115).
  • commercially available products for example, polyethyleneimine (molecular weight: 600, trade name: epomin (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.), trade name: ExGen 500 (manufactured by Euromedex), tetraethylenepentamine, etc.
  • the average molecular weight of the polyethyleneimine used in the present invention is usually from 200 to 1,000,000, preferably from 300 to 500,000, and more preferably from 500 to 100,000.
  • commercially available spermine can be used.
  • the hydrophobic group to be introduced into the polyalkyleneimine is not particularly limited as long as it enhances the affinity between the polyalkyleneimine and the phospholipid, for example, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, or Examples include a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue.
  • Preferred are an octyl group, a cetyl group, a stearyl group, and an oleyl group.
  • At least two hydrophobic groups are introduced into one molecule of polyalkyleneimine in order to increase the efficiency of introducing negatively charged substances into cells.
  • hydrophobic group introduced into the polyalkyleneimine may be bound to the polyalkyleneimine via a spacer.
  • neutral water-soluble molecules are preferable. For example, the synthesis of amino acids, peptides, polyamino acids, proteins, sugars, and also polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, dextran derivatives, etc. High polymers and their derivatives can be used.
  • the polyalkylenimine When used as a carrier for transporting a negatively charged substance, the polyalkylenimine may form a salt.
  • Polyalkylenimine salt Examples include, but are not limited to, hydrochloride, sulfate, phosphate, carbonate, formate, oxalate, citrate, succinate, and the like.
  • a preferred embodiment of the polyalkyleneimine of the present invention is represented by the following structural formula (I). '-N- (CH 2 ) p-[N- (CH 2 ) q ] xm-[Z- (CH 2 ) “] ⁇ - ⁇ -R ⁇ (I) R" R 1 R 1 R'
  • the basic skeleton may contain an amide bond
  • Z represents a carbon atom or a nitrogen atom
  • R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated
  • two Rs bonded to the same nitrogen atom may be the same or different
  • 1 is hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula ( It represents a II). also, represented in the formula, P, q, r, ⁇ ⁇ , X 1 " is an arbitrary natural number.
  • an amide bond may be contained in the basic skeleton and the side chain R m , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R and R represent hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated Or unsaturated sacyl group, Represents a sum or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, and two R, bonded to the same nitrogen atom, may be the same or different; R m is hydrogen, a cholesterol group, Represents a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated alkoxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (III).
  • 1, m, n, X p s X q represents an arbitrary natural number.
  • an amide bond may be contained in the basic skeleton and the basic skeleton of the side chain R m + 1 , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and: R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated group. Represents a saturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue; even if two Rs bonded to the same nitrogen atom are the same, And a, b, c, X p + 1 and X q + 1 represent any natural numbers.
  • the polyalkyleneimine may have a repeating structure of the following formula (IV) in the basic skeleton:
  • two to five molecules of tetraethylenepentamine are linked linearly.
  • any two or more of the side chains of R, II 1 , m and R m + 1 are an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, Nonyl group, decyl group, pendecyl group, dodecyl group, PT JP
  • the structure containing the formula (IV) may be linked in a branched manner.
  • polyalkyleneimine of the present invention may have a spermine structure in the basic skeleton.
  • spermine structure Preferably, two to five molecules of spermine are linked linearly.
  • the spermine structure may be linked in a branched manner.
  • the polyalkyleneimine prepared by introducing a plurality of hydrophobic groups prepared in this manner can be used alone as a carrier for transporting a negatively charged substance. It is also possible to form ribosomes and use them as carriers. Since the hydrophobic group has the property of stabilizing inside the phospholipid, it is thought that the polyalkyleneimine into which the hydrophobic group has been introduced can stably exist in the ribosome.
  • the phospholipid used for ribosome formation is preferably a neutral or acidic lipid which does not itself interact with a negatively charged bioactive substance. Phospholipids can be of natural or synthetic origin.
  • the alkyl side chain of the phospholipid used in the present invention preferably has 12 to 18 carbon atoms or an oleyl group.
  • Examples of the phospholipid include dioleoyl phosphatidyl having a phosphatidylethanolamine skeleton.
  • Phosphatidylcholine having a luetano-lamine phosphatidylcholine skeleton eg, egg yolk-derived, soy-derived or synthetic
  • the mixing ratio of the phospholipid and polyethyleneimine is not particularly limited as long as the mixture is in a positively charged range to have an electrical affinity with the negatively charged substance. Those skilled in the art can appropriately select a preferable mixing ratio.
  • the present invention relates to a complex containing a physiologically active substance having a negative charge and the above composition.
  • the biologically active substance having a negative charge is not particularly limited as long as it is a biologically active substance having a polyvalent negative charge.
  • the physiologically active substance having a multivalent negative charge include nucleic acids and derivatives thereof.
  • the nucleic acid may be a cyclic or linear single- or double-stranded deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid.
  • nucleic acid derivatives include, for example, phosphorothioate, phosphorodithioate and the like.
  • the mixing ratio of the above composition to the physiologically active substance having a negative charge is preferably 1/100 equivalent to 20 equivalent in terms of charge ratio. Suitable mixing ratios can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the particle size of the composite is preferably 200 mn or less, more preferably 100 nm or less.
  • other auxiliary agents are not particularly required, but, for example, amphiphilic molecules such as phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine and fatty acids can be used as the auxiliary agent. is there.
  • the polyalkyleneimine of the present invention When the polyalkyleneimine of the present invention is used alone in transporting a negatively charged substance, the polyalkyleneimine is directly mixed with the negatively charged substance to form a complex, and then a known method (O. Bouss if et al. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995)), a negatively charged substance can be introduced into cells. On the other hand, the polyalkyleneimine of the present invention is mixed with a phospholipid to form a liposome.
  • a phospholipid such as dioleoylphosphatidylethanolamine (D0PE, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) or phosphatidylcholine (eggPC, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) and the polyalkylene of the present invention are used.
  • An aqueous dispersion of ribosomes is prepared according to a known method (N. Oku et al., Biochim. Biophys. Acta. 1280, 149-154, (1996)).
  • the liposome may contain sterols such as cholesterol as a membrane stabilizer and tocopherol and vitamin E as antioxidants.
  • lipid microspheres In the case of lipid microspheres, the polyalkyleneimine of the present invention, soybean oil, and a surfactant are added, and the method is carried out by a known method (F. Liu et al, Pharmaceutical Res. 13, 1642-1646 (1996)). Lipid microspheres can be obtained. By mixing this with a negatively charged substance and then bringing it into contact with the cells, the negatively charged substance can be introduced into the cells.
  • the present invention also relates to a kit for preparing ribosomes, the kit comprising a phospholipid and a polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced into one molecule or a salt thereof.
  • the kit of the present invention contains, in addition to a phospholipid and a polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced in one molecule or a salt thereof, the above-mentioned membrane stabilizer and antioxidant. May be.
  • the final form of the phospholipid preparation and the polyalkyleneimine preparation contained in the kit of the present invention can be a refrigerated, frozen or lyophilized product. In the case of a freeze-dried product, sorbitol, sucrose, amino acid, various proteins and the like may be contained as a stabilizer.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a polyethyleneimine having a hydrophobic group introduced therein used in Examples.
  • FIG. 2 shows the plasmid obtained when the composition of the present invention and a conventional liposome were used.
  • FIG. 4 is a diagram showing GFP gene expression when the charge ratio between ribosomes and ribosomes is changed.
  • PCL indicates tricetyl-PEI: D0PE (0.65: 1, molar ratio, polyethyleneimine molecular weight: 600).
  • DMRIE D0PE (1: 1, molar ratio
  • D0TAP D0PE (1: 1, molar ratio
  • FIG. 3 is a diagram showing the effect of phospholipids on gene expression.
  • DOPE-PCL indicates tricetyl-PEI: DOPE (0.65: 1, molar ratio).
  • eggPC-PCL indicates tricetyl-PEI: eggPC (0.65: 1, molar ratio).
  • FIG. 4 is a graph showing the cytotoxicity when the concentration of the ribosome alone or the plasmid complex of the present invention was changed.
  • PCL indicates tricetyl-PEI: D0PE (0.65: 1, molar ratio, PEI molecular weight 600).
  • the bar above the bar graph indicates the + side of the soil SD.
  • FIG. 5 is a graph showing cytotoxicity when the concentration of a conventional ribosome (DMRIE) alone or a plasmid complex was changed.
  • DMRIE lipo Indicates DMME: D0PE (1: 1, molar ratio). Cells used COS-1. The bar above the bar indicates the + side of the soil SD.
  • FIG. 6 is a diagram showing the cytotoxicity of conventional liposomes (D0TAP) alone or when the concentration of a plasmid complex is changed.
  • D0TAP conventional liposomes
  • DOTAP lipo Indicates D0TAP: D0PE (1: 1, molar ratio).
  • the bar above the bar indicates the + side of the soil SD.
  • FIG. 7 shows the structure of an alkylated branched type polyethyleneimine using polyethyleneimine having a molecular weight of 600 as a starting material.
  • FIG. 8 shows the structure of an alkylated branched polyethyleneimine starting from polyethyleneimine having a molecular weight of 1,800.
  • FIG. 9 is a diagram showing a synthesis route (1) for alkylated linear ethyleneimine.
  • FIG. 10 is a diagram showing a synthesis route (2) of an alkylated linear ethyleneimine.
  • FIG. 11 is a diagram showing the structure of an alkylated linear ethyleneimine.
  • FIG. 12 is a diagram showing a synthetic route (1) for alkylated linear spermine.
  • FIG. 13 is a diagram showing a synthesis route (2) for an alkylated linear spermine.
  • FIG. 14 is a diagram showing a synthesis route (3) for an alkylated linear spermine.
  • FIG. 15 is a diagram showing a synthetic route (4) for alkylated linear spermine.
  • FIG. 16 is a diagram showing the structure of an alkylated linear spermine. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a solution of 10 mM cetyylated polyethyleneimine in chloroform and a solution of 10 mM dioleoylphosphatidylethanolamine (D0PE, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) were prepared in advance.
  • lipid film After drying this lipid film under high vacuum for 1 hour, it was hydrated with DMEM (manufactured by Gibco BRL) to obtain an ImM solution. Thereafter, freeze-thaw was repeated three times, and the liposomes were sonicated for 10 minutes with a bath-type sonike overnight. The ribosome was stable but prepared at the time of use.
  • DMEM manufactured by Gibco BRL
  • DMRIE 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyshethylammonium bromide
  • D0TAP 3- (trimethylammonio) propane
  • the plasmid DNA used was pEGFP-Cl (Clonetech). Since this plasmid encodes GFP (green fluorescent protein) as a repo overnight gene, its gene expression can be quantified by measuring the fluorescence intensity of GFP. Plasmid was prepared in E. coli, purified by cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation, and dissolved in TE buffer (pH 7.5) at a concentration of 2 / g / ml. The amount of plasmid DNA was kept constant, placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, added with the ImM ribosome solution at each ratio, added with DMEM so that the ratio became 1001, and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • TE buffer pH 7.5
  • the C0S-1 cells were seeded in 35mm di Mesh at 1X10 5 eel Is / di Mesh, and cultured overnight in C0 2 the presence 37 ° C, 5%. After washing once with DMEM, the prepared liposome / plasmid DNA complex was diluted with serum-free DMEM, adjusted to a total volume of 250 jul, and added to the cells. After the addition was incubated for 3 hours under 37 ° C, 5% C0 2 conditions. Three hours later, the ribosome / plasmid MA complex solution was removed, washed twice with serum-free DMEM, and then added with 2 ml of 10% FBS-DMEM and cultured for 48 hours.
  • the cells were washed twice with serum-free DMEM, and a TritonXlOO solution was added at a final concentration of 1%, followed by incubation at room temperature for 30 minutes to solubilize the cells.
  • the cell solution was suspended, transferred to an Etbendorf tube, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes.
  • the gene expression level was determined by measuring the fluorescence intensity at Ex 493 nm and Em 510 nm. The result is shown in FIG. When the composition of the present invention was used, the gene expression was at least twice that of the control DMRIE and D0TAP. It was expensive.
  • the transgene expression was quantified in the same manner as in Examples 1 to 6, except that egg yolk-derived phosphatidylcholine (eggPC) was used in place of DOPE in Example 3.
  • Figure 3 shows the results. As can be seen from FIG. 3, when eggPC was used, the gene expression was similar to DOPE.
  • COS- 1 cells were added one by 1ml per Ueru 24 Uerupure Ichito (co made-learning Inc.) to make a 37 ° C, 5% C0 2 and over ⁇ cultured in the presence Konfuruen bets. After washing the wells twice with DMEM, the prepared plasmid MA / liposome complex solution was added at 200 ⁇ 1 / well at various concentrations. After the addition was 3 hours Lee Nkyubesho down in C0 2 the presence 37 ° C, 5%. As a control, DMEM alone and ribosome solution alone were used.
  • Cytotoxicity was measured using Alamar Blue (alamerBlue, Biosource International, imported from Iwaki Glass Co., Ltd.). First, each sample solution was removed, and 200 ⁇ l of DMEM without serum and 50 ⁇ l of a 5-fold diluted allamable solution were added to each gel. After the addition was incubated for 1 hour at C0 2 presence 37 ° C, 5%. One hour later, the solution in each well was placed in a 1.5-ml Eppendorf tube, and 750 ml of PBS (-) was added thereto to make 1 ml, and the fluorescence intensity at Ex 535 nm and Em 583 nm was measured. The results are shown in Figs. In the case of using the composition of the present invention, particularly in a complex solution having a high concentration compared to the case of using the conventional liposome. Significantly reduced cytotoxicity
  • Example 10 Synthesis of alkylated branched polyethyleneimine derivative
  • a polyethyleneimine having a molecular weight of 600 was used in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • an alkyl group was newly introduced into PEI (6), compound 1, and compound name P6) (Figs. 7 and 8).
  • Example 10 Each of the nine derivatives synthesized in Example 10 was dissolved in sterilized distilled water to adjust the pH to around 7. It was dissolved in water hardly compound 15 30 min heating at 50 ° C, after made pH adjustment, the probe type ultrasonic (BR0NS0N Co., 20Dutycycle, 5 minutes) of was treated with c every career first solution is finally filled evening The solution was filtered through one (DISMIC-25cs, Cellulose acetate, 0.2 m, ADVANTEC T0Y0).
  • the concentration of the carrier solution was the molar concentration of the amine nitrogen. That is, the concentration of polyethyleneimine having a molecular weight of 600 was set to 43 as the molecular weight of the monomer, and 43 mg / ml was defined as the number of positively charged moles of 100 mM (100 nmol / 1).
  • the concentration of the alkylated polyethyleneimine solution was calculated by correcting the molecular weight of the introduced alkyl group and the number of introduced alkyl groups. Stock solutions of these alkylated polyethyleneimines were stored at 4 ° C until use.
  • the / 3-galactosidase (LacZ) gene (derived from pCMVbeta (Clontech)) was inserted into plasmid pCAGGS (Hum Gene Ther. 1998; 9: 1701-7) to construct plasmid pCAG-LZ15.
  • Stock solution of this plasmid (5mg DNA / ml TE) in cell culture medium! )-Diluted with MEM (manufactured by GIBCO BRL) to prepare a DNA solution of 58 ig DNA / ml.
  • Example 11 The stock solution of Example 11 was prepared so that N / P (N: mole number of positive charge of nitrogen per carrier / P: ratio of mole number of negative charge to phosphoric acid of DNA) became 18 equivalents.
  • HepG2 of human hepatoma cells was seeded in a 24-well dish at 30,000 cells / well. Cells were washed twice with MEM immediately before gene transfer. The complex solution of DNA and Example 6 The cells were diluted with MEM and serum-supplemented (50% FBS) MEM so that the concentration became 1 / ⁇ ⁇ , and this gene transfer solution was added so that the cells became 200 1 / ⁇ . After culturing at 37 ° C for 3 hours in a 5% carbon dioxide incubator, remove the gene transfer solution, wash twice with MEM medium containing serum (10% FBS), and then add the same medium to 1 ml / well.
  • An OPTI-MEM medium (GIBCOBR was used to form a MA complex at the ratio of g) and the same amount of DNA was used.
  • Example 14 Except for the cell culture medium of 4, the cells were washed twice with D-PBS (-) (Nikken Institute of Biomedical Research) and cultured cell lysis reagent, LC ⁇ (trade name: Pitka Gene, Wako Pure Chemical Sales) was used. The cells were added to 100/1 / ⁇ ⁇ , left at room temperature for 15 minutes, and treated with a small probe-type ultrasonic device (UR-20P, manufactured by Tommy Seie, Power 10) for 5 seconds to destroy the cells. This cell lysate was transferred from a well to a 0.5 ml eppendorf tube, and the supernatant obtained by centrifugation (1, 200 rpm, 3 minutes, room temperature) was used for measurement of LacZ activity.
  • D-PBS Diakken Institute of Biomedical Research
  • LC ⁇ trade name: Pitka Gene, Wako Pure Chemical Sales
  • LacZ activity was measured according to the protocol of TR0PIX, Inc. Each gene transfer experiment was performed in triplicate, and the LacZ activity was expressed as SD of the average light unit per cell protein (mg) / measurement time (1 second). Cell protein was determined by the BCA method (Pierce).
  • the molecular weight of polyethyleneimine was compared for cetyl derivatives. 600 was higher than 1,800
  • the gene expression of the complex of P6C24.5 and DNA was compared with that of liposome and DNA complex (PCL).
  • the ribosome composition was P6C24.5 / D0PE (1: 1, molar ratio), and the preparation method was according to Example 3.
  • the method for preparing the DNA complex was in accordance with Examples 12-14.
  • the cells were transfected in the same manner as in Example 15 using normal cerebral vascular endothelial cells (BBMC, sold by Cell Systems, Inc., Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • Gene expression of PCL and DNA complex When transfected in the absence of lysate, it was almost equivalent to P6C24.5 alone, about 10 times higher than LipofectAMINE.
  • the gene expression of the PCL and DNA complex was more than 10 times higher than that of P6C24.5 alone and about 200 times higher than that of LipofectAMINE.
  • the HBr salts of the eight derivatives synthesized in Examples 19 and 20 were weighed, sterilized distilled water was added, and the pH was adjusted to around 7 with 1N-NaOH to prepare each stock solution. Sparingly soluble compounds with water 15-30 minutes heating at 80 ° C, after made pH adjusted to warm to room temperature, probe-type ultrasonic (BR0NS0N Co., 20Dutycycle, 5 minutes) of was treated with c every career first solution is Finally, Yuichi Phil (DISMIC-25cs, Cellulose acetate, 0.2 m, ADVANTEC T0Y0). The concentration of the carrier solution was the molar concentration of the amine nitrogen.
  • the stock solution was set to 10 mM (lOnmol / ⁇ 1) positive mole number. These stock solutions were stored at 4 ° C until use. At the time of use, the precipitated stock solution was heated and dissolved at 80 ° C for 15-30 minutes.
  • Table 4 shows the results. At the time of transfection, when serum was not added, TSL-D8 and TSL-D16 showed 10 times or more higher than that of LipofectAMINE, and PSL-D16 showed 5 times or more higher than that of LipofectAMINE. On the other hand, when serum was added, TSL-D16 was 10 times higher than LipofectAMINE.
  • Example 24 Preparation of human liver cancer cells and human glioblastoma cells
  • Human knee cancer cells BxPc-3 Primary pancreatic adenocarc inoma, Dainichi Were incubated at 37 ° C, C0 2 incubator in RPMI medium to obtain
  • FBS GIBC0BRL Co.
  • human glioblastoma SK-N-MC were incubated at 37 ° C, C0 2 incubator at D-MEM medium and the addition of 10% FBS (Glioblastoma, obtained from ATCC) (GIBC0BRL Co.).
  • Each cell was treated with tripsin, washed three times with each ice-cooled medium, and adjusted to 1 ⁇ 10 8 cells / ml. Transplantation into mice subcutaneously was performed within 40 minutes after preparation.
  • each of the cancer cells prepared in Example 24 was subcutaneously administered to SCID mice (male, 5 weeks old, Nippon Clea Co., Ltd.) subcutaneously at two sites on the left and right sides of the flank and two at the top and bottom of the back.
  • Injection needle 29Gxl / 2ga, Terumo Corporation Two weeks after administration, the engrafted human cancer cells BxPc-3 had a tumor diameter of 0.5-0.8 cm in length and 0.5-0.8 cm in width.
  • the tumor diameter of human glioblastoma SK-N-MC was 0.9-1.4 cm in length and 1.1-1.75 cm in width.
  • Plasmid pCAG-EGFP was constructed by inserting jellyfish green protein GFP (Clontech, pEGFP-Nl) into plasmid pCAGGS.
  • a stock solution of this plasmid (8 mg DNA / ml TE) was diluted with 5% glucose (Gosou Pharmaceutical Co., Ltd., glucose injection solution) to prepare a DNA solution of 500 ⁇ g DNA / ml.
  • the number of moles of negative charge of 1 gDNA was 3 nmol
  • Example 21 The stock solution of Example 21 was prepared so that N / P (N: mole number of positively charged nitrogen in carrier / nitrogen: P: ratio of mole number of negatively charged phosphate of DNA) to 0.3 equivalent. Prepared with 5% glucose.
  • Example 28 The DNA complex 50 ⁇ 1 (12.5 / gDNA) of Example 28 was subcutaneously transplanted in Example 25 and directly administered into the tumor of a tumor-bearing mouse (needle 29Gxl / 2 //, Terumo Corporation). After administration of the DNA complex, the mice were sacrificed by vertebral dislocation under ether anesthesia, and the engrafted tumor was cut out subcutaneously from the skin. Expression of the GFP gene was performed by cutting the tumor and observing the internal tumor tissue with a fluorescence microscope. The results are shown in Table 5. In the GFP expression intensity in the table, (+) indicates strong expression, (() indicates slight expression, and (-) indicates no expression.
  • TSL-D8 TSL-D16, PSL-D16, TEL-D8, and TEL-D16 showed stronger fluorescence of GFP than human DNA on human renal cancer cells BxPc-3. Similarly, GFP fluorescence of TEL-D8 was stronger than naked DNA in human glioblastoma SK-N-MC. Table 5
  • composition comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups are introduced as a constituent component

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Abstract

Novel transport carriers comprising polyalkylimines having two or more hydrophobic groups transferred thereinto. It is found out that use of these carriers makes it possible to transfer genes into cells at a high transfer efficiency.

Description

明細書 負電荷物質を輸送するための組成物 技術分野  Description Compositions for transporting negatively charged substances
本発明は、 負電荷物質を細胞内へ輸送するための組成物に関する。 背景技術  The present invention relates to a composition for transporting a negatively charged substance into cells. Background art
薬物治療において、 薬物を目的とする細胞又は細胞内組織に到達させ るシステム、 すなわち ドラ ッグデリノ リーシステム （ Drug Del ivery System;以下単に 「DDS」 と称する） は重要な技術である。 遺伝子治療に おいても、 DDS を利用して遺伝子を所望の細胞に導入することが中心的 な技術であることは言うまでもない。 細胞内に遺伝子を導入するための 方法は大きく二つに分類することができる。  In drug treatment, a system that allows a drug to reach a target cell or intracellular tissue, that is, a drug delivery system (DDS), is an important technology. It goes without saying that the main technology in gene therapy is to use DDS to introduce genes into desired cells. Methods for introducing genes into cells can be broadly classified into two types.
一つは、 ウィルスベクターを用いる方法である。 これには、 所望の外 来性遺伝子をゲノム上に有するウィルスを感染させることにより、 内部 の核酸を細胞内に導入するという方法が含まれる。 もう一つは、 人工的 なまたは半人工的な輸送担体 （キャ リアー） に、 所望の遺伝子または該 遺伝子を含むベクターを封入または担持させる方法である。この方法は、 目的物の生体内挙動および輸送に関与する諸過程を、 キヤリァ一自体の 物理化学的性質に依存させることにより、生理活性物質を所望の臓器（'標 的臓器）、 細胞 （標的細胞） または細胞内器官 （標的器官） に到達せしめ ることを特徴とする。 この方法におけるキャリア一としては例えば、 リ ポソ一ム （F . Ledley et al .， Human Gene Therapy 6 , 1129-1144 ( 1995 ) )、 タンパク質 （Human Gene Therapy 5 , 429 ( 1994 ) )、 ペプチド ( Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America 90, 893 (1993))、 合成高分子化合物 (Tangetal., Human Gene Therapy 4,823-832 (1997))、 および （再構成） センダイウィルス （Exp. Cell Res. 159,399 (1985))などを例示することができる。 One is a method using a viral vector. This includes a method in which a nucleic acid having a desired exogenous gene on the genome is infected to thereby introduce an internal nucleic acid into a cell. The other is a method of encapsulating or carrying a desired gene or a vector containing the gene in an artificial or semi-artificial transport carrier (carrier). In this method, various processes involved in the behavior and transport of the target substance in the living body depend on the physicochemical properties of the carrier itself, so that the physiologically active substance can be converted into desired organs ('target organs), cells (target organs). It is characterized by reaching cells (cells) or intracellular organs (target organs). Examples of carriers in this method include liposomes (F. Ledley et al., Human Gene Therapy 6, 1129-1144 (1995)), proteins (Human Gene Therapy 5, 429 (1994)), peptides ( Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America 90, 893 (1993)), synthetic polymer compounds (Tangetal., Human Gene Therapy 4,823-832 (1997)), and (reconstituted) Sendai virus (Exp. Cell Res. 159,399 (1985)).
キャリアとしてリボソームを用いる方法には、 様々な工夫が施されて きた。 近年、 DN A分子がポリア二オンであることに着目し、 DNA分 子と静電気的に親和性を有し、 容易に複合体を形成できるカチオン性脂 質をリボソームとして用い、 標的細胞に該 D N A分子を導入する試みが なされている。 このようなカチオン性脂質としては、 リポフエクチン、 1、 2-ジォレイルォキシ -3- ( ト リメチルアンモニォ） プロパン （DOTAP)、 1、 2-ジミ リスチルォキシプロビル- 3-ジメチルヒ ドロキシェチルアンモニ ゥムブロ ミ ド （DMRIE) (F. Ledley et al.， Human Gene Therapy 6, 1129-1144 (1995))、 トランスフエク夕ム等が知られている。 しかしなが ら、 カチオン性脂質はェン ドサイ ト一シス過程を経て細胞内に取り込ま れるとリソソーム等により分解されやすく、 遺伝子の導入効率が低いと いう問題があった。  Various methods have been devised for using ribosomes as carriers. In recent years, attention has been paid to the fact that DNA molecules are polyadiones, and cationic lipids that have an electrostatic affinity with DNA molecules and can easily form complexes are used as ribosomes, and the DNA is used as target cells in target cells. Attempts have been made to introduce molecules. Such cationic lipids include lipofectin, 1,2-dioleoxy-3- (trimethylammonio) propane (DOTAP), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxicetilammonium. Pembromide (DMRIE) (F. Ledley et al., Human Gene Therapy 6, 1129-1144 (1995)), Transfuecum and the like are known. However, when the cationic lipid is taken into cells through an end-site lysis process, it is easily decomposed by lysosomes and the like, and there is a problem that the gene transfer efficiency is low.
これらの問題を解决するために、 カチオン性高分子を用いる試みもな されている。 例えば、 Kim らはポリ リジンに疎水基を結合させ、 これを 疎水性相互作用により血漿夕ンパク質へ導入後、 DN A分子と静電気的 に結合させる遺伝子導入システムを開示 している （米国特許第 5， 679， 559号）。 また、 Zhouらは疎水基を導入したポリ リジンとリ ン脂質 からなる リ ボソームを調製した （X. Zhou et al.， Biochimica et Biophysica Acta. 1065, 8-14 (1991)， X. Zhou et al., ibid.1189, 195-203 (1994))。 Zhouらのリボソームは、 ポリ-いリジンを用いること により細胞傷害性を低減させ、 脂質残基を導入することにより標的細胞 への D NA/リボソーム複合体の親和性を向上させることに成功した。 しかしながら、 細胞へ効率良く導入するためには、 細胞を予め化学物質 で処理することが必要であった。 また、 国際公開第 97/45442号パンフレ ッ トにおいては、 コレステロール基を導入したポリアミンを含むリポソ ームを開示している。 In order to solve these problems, attempts have been made to use a cationic polymer. For example, Kim et al. Disclose a gene transfer system in which a hydrophobic group is bound to polylysine, introduced into plasma protein by hydrophobic interaction, and then electrostatically bound to a DNA molecule (US Patent No. 5, 679, 559). Zhou et al. Prepared liposomes consisting of polylysine with a hydrophobic group and phospholipids (X. Zhou et al., Biochimica et Biophysica Acta. 1065, 8-14 (1991), X. Zhou et al. ., ibid. 1189, 195-203 (1994)). The ribosome of Zhou et al. Succeeded in reducing the cytotoxicity by using poly-lysine and improving the affinity of the DNA / ribosome complex for target cells by introducing lipid residues. However, in order to efficiently introduce cells into cells, cells must be It was necessary to process with. WO 97/45442 pamphlet discloses a liposome containing a cholesterol-introduced polyamine.
その他のカチオン性高分子として、 ポリアルキレンィ ミン、 特にポリ ェチレンィ ミ ン （PEI) が知られている （N. Oku et al. , J. Biochem. 100, 935-944 (1986)， N. Oku et al. , Biochemistry 26, 8145-8150 (1987)， Suh et al., Bioorganic Chem. 22, 318-327 (1994))。 ポリエチレンィ ミンは直鎖または分岐型のポリマ一分子であり、 その分子中にプロ トン 化したアミノ基を有し、これを介して DN A分子と結合することができ、 また、 細胞標的物質または細胞膜変性剤を用いる必要がないことから、 遺伝子導入において応用されている （W096/02655, O.Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92， 7297-7301 (1995), B. Abdallah et al., Hum. Gene Ther.7, 1947-1954 (1996), Lambert et al. , Mol. Cell Neurosci.7, 239-246 (1996), R.Kircheis et al. , Gene Ther.4, 409-418 (1997), A. Baker et al., Gene Ther. 4, 773-782 (1997), A. Baker et al., Nucleic Acids Res.25, 1950-1956 (1997), Durmort et al. , Gene Ther. 4, 808-814 (1997), Tang et al., Gene Ther. , 823-832 (1997), A. Boletta et al., Hum. Gene Ther. 8， 1243-1251 (1997), Ferrari et al., Gene Ther. 4, 1100-1106 (1997))。 ポリエチレンィ ミ ンの細胞内 導入機構について ， Demeneix ら に よ る仮説が報告さ れて い る (Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery, ed. by P.L. Feigner et al. ,p.146-151, ACS conference proceeding series, 1996)。 一方、 遺伝子導入能を示すカチオン性リボソーム （またはリポプレツ クス） 構成脂質において極性基にスペルミン構造を有する化合物には、 先に述べた 卜ランスフエク夕ム ( J.-P. Behr et al. , Proceedings of National Academy of Science of United States of America 86， 6982 (1989)、 あるいは DOGS [PROMEGA] )、 リボフ； クタミン （ [Gibco BRL]、 あるいは D0SPA、 P. H-Nelson et al.， FOCUS 15、 73 (1993) )、 セル フ エ クチン （ [Gibco BRL]、 あるいは TM-TPS、 Artificial Self- Assembling Systems for Gene Delivery, ed. by P. L. Feigner et al. , p.169-176, ACS Conference Proceeding Series, 1996)、 GL67 (あるい は #67) 類縁化合物 （E.R.Lee et al. , Human Gene Therapy 7, 1701 (1995)) 、 RPR 120535 関連化合物 （W097/18185、 G. Byk et al., Tetrahedron Lett. , 38, 3219 (1997)) などが知られている。 As other cationic polymers, polyalkyleneimines, especially polyethyleneimine (PEI) are known (N. Oku et al., J. Biochem. 100, 935-944 (1986), N. Oku et al., Biochemistry 26, 8145-8150 (1987), Suh et al., Bioorganic Chem. 22, 318-327 (1994)). Polyethyleneimine is a linear or branched polymer molecule having a protonated amino group in the molecule and capable of binding to a DNA molecule through the molecule. Since it is not necessary to use a cell membrane denaturant, it has been applied in gene transfer (W096 / 02655, O. Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995), B. Abdallah et al., Hum.Gene Ther. 7, 1947-1954 (1996), Lambert et al., Mol.Cell Neurosci. 7, 239-246 (1996), R. Kircheis et al., Gene Ther. 4, 409-418 (1997), A. Baker et al., Gene Ther. 4, 773-782 (1997), A. Baker et al., Nucleic Acids Res. 25, 1950-1956 (1997), Durmort et al. , Gene Ther. 4, 808-814 (1997), Tang et al., Gene Ther., 823-832 (1997), A. Boletta et al., Hum. Gene Ther. 8, 1243-1251 (1997), Ferrari et al., Gene Ther. 4, 1100-1106 (1997)). A hypothesis by Demeneix and colleagues on the mechanism of introduction of polyethyleneimine into cells was reported (Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery, ed. By PL Feigner et al., P.146-151, ACS conference proceeding series, 1996). On the other hand, compounds having a spermine structure in the polar group in the cationic ribosome (or lipoplex) constituent lipid exhibiting gene transfer ability include those described above in J.-P. Behr et al., Proceedings of National Academy of Science of United States of America 86, 6982 (1989), or DOGS [PROMEGA]), Lvov; Kutamine ([Gibco BRL], or D0SPA, P. H-Nelson et al., FOCUS 15, 73 (1993)), Self-ectin ([Gibco BRL]) Or TM-TPS, Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery, ed. By PL Feigner et al., P.169-176, ACS Conference Proceeding Series, 1996), GL67 (or # 67) related compound (ERLee et al., Human Gene Therapy 7, 1701 (1995)), RPR 120535-related compounds (W097 / 18185, G. Byk et al., Tetrahedron Lett., 38, 3219 (1997)) and the like.
しかしながら、 疎水基を導入したポリエチレンイ ミ ンまたは分子量分 布を有しないポリエチレンイ ミン関連構造類縁体を遺伝子導入のための 担体として用いた報告例はない。 またスペルミンを多分子連結した部分 構造をベースとした単一の誘導体による遺伝子送達の報告例もない。 発明の開示  However, there have been no reports of using a polyethyleneim having a hydrophobic group or a polyethyleneimine-related structural analog having no molecular weight distribution as a carrier for gene transfer. In addition, there is no report on gene delivery using a single derivative based on a partial structure in which spermine is linked in multiple molecules. Disclosure of the invention
本発明は、 負電荷を有する物質の細胞内への導入において、 より導入 効率が高く 細胞に対して毒性の少ない、 カチオン性高分子を構成成分 とする組成物、 および該組成物を用いた負電荷を有する物質の細胞内へ の導入法を提供することを課題とする。  The present invention relates to a composition comprising a cationic polymer as a constituent, which has a higher introduction efficiency and a lower toxicity to cells when a substance having a negative charge is introduced into cells, and a negative electrode using the composition. An object of the present invention is to provide a method for introducing a charged substance into cells.
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 複数の疎水基を導入した ポリアルキレンイ ミンを構成成分とする新規な輸送担体を構築し、 この 担体を利用した細胞内への遺伝子導入につき検討を行った結果、 この担 体を利用することにより高い導入効率で、 かつ極めて少ない毒性で、 細 胞内に遺伝子を導入することができることを見出した。  In order to solve the above problems, the present inventors have constructed a novel transport carrier comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups have been introduced, and have introduced a gene transfer into cells using this carrier. As a result of the study, it was found that the gene can be introduced into cells with high transfer efficiency and extremely low toxicity by using this carrier.
具体的には、 本発明者らは、 ポリエチレンィ ミンに複数のセチル基を 導入し、 図 1に示すセチル化ポリエチレンイ ミンを調製し、 これにリン 脂質であるホスファチジルエタノールァミンまたはホスファチジルコリ ンを混合して、 担体組成物を調製した。 そして、 得られた組成物に蛍光 タンパク質 （GFP )遺伝子が挿入されたプラスミ ドを混合し、 これにより 形成させた複合体を COS- 1細胞に導入して、 蛍光強度の測定による遺伝 子導入効率の検討、 および生細胞の細胞密度の測定による細胞毒性の検 討を行った。 その結果、 セチル化ポリエチレンイ ミンを構成成分とする 担体組成物を用いた場合には、 従来用いられていたリポソ一ムを用いた 場合と比較して、 顕著に遺伝子導入効率が高く、 しかも細胞に対する毒 性が極めて低いことを見出した。 Specifically, the present inventors have introduced a plurality of cetyl groups into polyethyleneimine to prepare a cetylated polyethyleneimine shown in FIG. 1, to which phospholipid phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine was added. The mixture was mixed to prepare a carrier composition. The resulting composition is mixed with a plasmid into which a fluorescent protein (GFP) gene has been inserted, and the resulting complex is introduced into COS-1 cells, and the efficiency of gene transfer is determined by measuring the fluorescence intensity. And cytotoxicity by measuring the cell density of living cells. As a result, when the carrier composition containing cetylated polyethyleneimine as a component was used, the gene transfer efficiency was remarkably higher than that when a conventionally used liposome was used, and the cell transfer efficiency was significantly higher. Is found to be very low in toxicity.
次いで、 本発明者らはポリェチレンィ ミ ンの分子量とアルキル基の長 さ、 および、 アルキル基の導入率の異なる 9種の化合物を合成し遺伝子 発現との関連を検討した （図 7、 図 8 )。 その結果、 これら分岐型のポリ ェチレンイ ミンの検討では分子量 600付近、 アルキル基はセチル基が in vitro遺伝子発現に好適であることを見出した （表 1 )。 また、 この化合 物は遺伝子導入過程で血清の影響を受け難いことが明らかとなった。 セ チル化ポリェチレンィ ミン （ポリエチレンイ ミンの分子量は約 600) を DNAと直接複合体を形成させ HepG2細胞に遺伝子導入した時、 50 血清存 在下で、 従来高い遺伝子導入試薬として知られているリボフェク トアミ ンの 10倍以上高い遺伝子発現を示した （表 1 )。 また、 リボソームとし て用いた時、 正常ゥシ脳血管内皮細胞 （BBMC) に対してリボフヱク トァ ミンの 200倍以上高い遺伝子発現を示した （表 2 )。  Next, the present inventors synthesized nine types of compounds having different molecular weights and alkyl group lengths and alkyl group introduction rates of polyethyleneimine, and examined the relationship with gene expression (FIGS. 7 and 8). . As a result, in the examination of these branched polyethyleneimines, it was found that the molecular weight was around 600, and that the alkyl group was a cetyl group suitable for in vitro gene expression (Table 1). In addition, it was revealed that this compound was hardly affected by serum during the gene transfer process. When cetylated polyethyleneimine (polyethyleneimine has a molecular weight of about 600) forms a complex directly with DNA and transfects it into HepG2 cells, ribofectamine, which is conventionally known as a high transfection reagent, is present in the presence of 50 serum. The expression of the gene was more than 10 times higher than that of the gene (Table 1). In addition, when used as ribosomes, the gene expression was more than 200 times higher than that of ribofectamine in normal cerebral vascular endothelial cells (BBMC) (Table 2).
上記の化合物は分子量分布をもつ市販のポリエチレンイ ミインを出発 原料としているため構造が不均一である。 また、 アルキル基の導入率を 合成的に厳密にコン トロールするのが難かしく、 アルキル基の結合位置 を確定できないという問題をもつ。 そこで、 構造を確定できる化合物を 新たにデザインし合成した。 一つはテ トラエチレンペンタミンを出発原 料とした 3種のアルキル化直鎖エチレンィ ミン （図 1 1 )、 他の一っはス ペルミンを出発原料とした 5種のアルキル化直鎖スペルミン（図 1 6 )。 これら新規化合物の遺伝子発現は期待通り高く、 いずれの場合もセチル 基を導入した化合物が優れていた。 HepG2 細胞に対し血清存在下で、 セ チル化直鎖エチレンィ ミンおよびセチル化直鎖スペルミンは 10 倍以上 高い発現を示した （表 3、 表 4 )。 また、 血清非存在下で、 ォクチル化直 鎖スペルミンは、 セチル化直鎖スペルミンと同様に高い遺伝子発現を示 した （表 4 )。 The above compounds have a heterogeneous structure due to the use of commercially available polyethyleneimine having a molecular weight distribution as a starting material. In addition, it is difficult to strictly control the introduction ratio of the alkyl group synthetically, and there is a problem that the bonding position of the alkyl group cannot be determined. Therefore, we newly designed and synthesized a compound whose structure can be determined. One is three kinds of alkylated linear ethyleneimine starting from tetraethylenepentamine (Fig. 11), and the other is ethylene. Five types of alkylated linear spermine starting from permine (Fig. 16). The gene expression of these new compounds was high as expected, and in each case, the compounds into which the cetyl group was introduced were superior. Cetylized linear ethyleneimine and cetylized linear spermine showed more than 10-fold higher expression in HepG2 cells in the presence of serum (Tables 3 and 4). In the absence of serum, octylated linear spermine showed high gene expression, as did ceylated linear spermine (Table 4).
上記は in vitro の遺伝子導入能の結果である。 通常、 非ウィルスべ クタ一は in vitroの結果が in vivoに反映せず、 in vivoの遺伝子発現 は非常に低い問題を抱える。例えば、先行の力チォニヅクリポソ一ム（リ ポフエク トァミン、 DC-Chol/DOPE ) はマウス皮下担癌モデルの腫瘍内投 与で naked DNA よ り遺伝子発現は低いと報告されている （ Gene Ther 1996 , 3, 542-548)。 そこで、 ヒ ト滕臓癌細胞および神経膠芽腫細胞をマ ゥス皮下に移植した担癌モデルを作製し、 このモデルに対する遺伝子発 現を検討した。 結果は上記と同様、 セチル化直鎖エチレンィ ミン、 セチ ル化直鎖スペルミンに加えてォクチル化直鎖ェチレンィ ミン、 ォクチル 化直鎖スペルミン誘導体が naked DNAと比べて明らかに強い遺伝子発現 を示した （表 5 )。  The above is the result of the in vitro gene transfer ability. Normally, non-viral vectors do not reflect in vitro results in vivo, and gene expression in vivo has a very low problem. For example, it has been reported that gene expression of the earlier force liposome (lipofectamine, DC-Chol / DOPE) was lower than that of naked DNA in the intratumoral administration of a mouse subcutaneous tumor-bearing model (Gene Ther 1996, 3). , 542-548). Therefore, we created a tumor-bearing model in which human tumor cancer cells and glioblastoma cells were implanted subcutaneously in the mouse, and examined gene expression in this model. The results showed that, in addition to the above, octylated linear ethylenimine and octylated linear spermine derivatives, in addition to ceylated linear ethyleneimine and acetylated linear spermine, showed significantly stronger gene expression than naked DNA ( Table 5).
以上、 本発明者らはアルキル化分岐ポリエチレンィ ミンが、 特にリポ ソームにした時、 血清存在下で優れた遺伝子導入能を示すことを見い出 した。 また、 これに基づき、 更に、 アルキル化直鎖エチレンィ ミン、 ァ ルキル化直鎖スペルミンを合成し、 遺伝子発現を検討した結果、 セチル およびォクチルを 2 ケ導入した誘導体は DNA との複合体とした時、 in vivoで優れた遺伝子発現を示すことを見出した。  As described above, the present inventors have found that alkylated branched polyethyleneimine exhibits excellent gene transfer ability in the presence of serum, particularly when converted into liposomes. In addition, based on this, alkylated linear ethyleneimine and alkylated linear spermine were synthesized, and as a result of examining gene expression, the derivative into which two cetyls and octyls were introduced was converted into a complex with DNA. And found to show excellent gene expression in vivo.
即ち、 本発明は、 複数の疎水基を導入したポリアルキレンィ ミンまた はその塩を構成成分とする組成物、 および該組成物を用いた遺伝子導入 法に関し、 より具体的には、 That is, the present invention provides a composition comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups are introduced or a salt thereof as a component, and gene transfer using the composition. Regarding the law, more specifically,
( 1 ) 疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンィ ミン またはその塩を含む組成物、  (1) a composition comprising a polyalkyleneimine or a salt thereof in which two or more hydrophobic groups are introduced in one molecule,
( 2 ) 疎水基がコレステロール基、飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和も しくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシ力 ルポ二ル基、 またはリン脂質残基である、 （ 1 ) に記載の組成物、 (2) the hydrophobic group is a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxy group, or a phospholipid residue; The composition according to
( 3 ) 疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンィ ミン が下記構造式 （I) で表される化合物である、 （ 1 ) に記載の組成物、 (3) The composition according to (1), wherein the polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced in one molecule is a compound represented by the following structural formula (I):
R'-N- (CH2) p - [N- (CH2) π] m - [Z- (CH2) r] η - N-R' ( I ) R' R1 R1 ' R'-N- (CH 2 ) p-[N- (CH 2 ) π ] m-[Z- (CH 2 ) r] η-NR '(I) R' R 1 R 1 '
(式中、 基本骨格にアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子も しくは窒素原子を表し、 R' は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは 不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不 飽和のァシルォキシカルボニル基、 リ ン脂質残基を表し、 同一の窒素原 子に結合する 2つの R' は同一であっても異なっていてもよく、 側鎖 R 1は水素、 コ レステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和 もしくは不飽和のァシル基、 飽和も しくは不飽和のァシルォキシカルボ ニル基、 リン脂質残基、 または次式 （II) を表す。 また、 式中、 P、 q、 r、 Xn、 Xmは任意の自然数を表す。） (Wherein the basic skeleton may contain an amide bond, Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated Two R's that are bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; R 1 is hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, or a compound represented by the following formula (II) ) represents a. also represent wherein, P, q, r, X n, X m is an arbitrary natural number.)
Rm Rm R m R m
- [ (CH2) l-N] χρ - [ (CH2) m-Z] Xq - (CH2) n-N-R' (I) ' (式中、 基本骨格および側鎖 Rmにアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 R' は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽 和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R' は同一であっても異なっていても よく、 Rmは水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル 基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキ シカルボニル基、 リン脂質残基、 または次式 （III) を表す。 また、 式中、-[(CH 2 ) lN] χρ-[(CH 2 ) m -Z] X q-(CH 2 ) n -NR '(I)' (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the side chain R m , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated Or an unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, and two R's bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; R m represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated alkoxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (III). Where:
1、 m、 n、 Xp、 Xqは任意の自然数を表す。）
Figure imgf000010_0001
1, m, n, X p and X q represent arbitrary natural numbers. )
Figure imgf000010_0001
- [ (CH2) a-N] ΧΡ+1 - [ (CH2) b—Z] q+1 - (CH2) c"N-R' (Π) -[(CH 2 ) aN] ΧΡ + 1-[(CH 2 ) b—Z] q + 1-(CH 2 ) c "NR '(Π)
R"  R "
(式中、 基本骨格および側鎖 Rm+ 1の基本骨格にアミ ド結合が含まれて いてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 R' は水素、 コレ ステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和 のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂 質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R， は同一であっても 異なっていてもよい。 また、 式中、 a、 b、 c、 Xp + Xq + 1は任意 の自然数を表す。） (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the basic skeleton of the side chain R m + 1 , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, saturated or unsaturated. An alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, wherein two R, which are bonded to the same nitrogen atom, are different even if they are the same. In the formula, a, b, c, and Xp + Xq + 1 represent arbitrary natural numbers.)
(4) 基本骨格に次式 （IV) の繰り返し構造を含む、 （ 1) から （3) のいずれかに記載の組成物、  (4) The composition according to any one of (1) to (3), wherein the basic skeleton contains a repeating structure represented by the following formula (IV):
-CH2-CH2-NH- (IV) -CH 2 -CH 2 -NH- (IV)
(5) テ トラエチレンペン夕ミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖状に連 結した （ 4 ) に記載の組成物、 (5) Two to five molecules of tetraethylenepentamine are linearly linked The composition according to (4),
( 6 ) R，、 R \ Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル 基、 プロビル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォ クチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシ ル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシ ル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群 より選択される基を含む、 （ 5 ) に記載の組成物、 (6) R ,, R \ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is Echiru group, Purobiru group, butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, O corruptible, nonyl , Decyl, pendecyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendudecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl. The composition according to (5), comprising a selected group,
( 7 ) R \ R 1 , Rm、 R m+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 プチル 基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デ シル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォク夕デシ ル基からなる群より選択される基を含む、 （ 5 ) に記載の組成物、(7) at least two of the side chains of R \ R 1 , R m and R m + 1 are a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, and a decyl group The group according to (5), which comprises a group selected from the group consisting of dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendudecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, and octyldecyl. Composition,
( 8 ) 式 （IV) を含む構造が分岐状に連結した （ 4 ) に記載の組成物、(8) The composition according to (4), wherein the structure containing the formula (IV) is branched and linked.
( 9 ) R，、 R Rm、 Rra+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル 基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォ クチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシ ル基、 テトラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシ ル基、 ォクタデシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群 より選択される基を含む、 （ 8 ) に記載の組成物、 (9) Any two or more of the side chains of R, RR m and R ra + 1 are ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl Group, decyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pendecyl group, hexadecyl group, hepdecyl decyl group, octadecyl group, nonadecyl group, and eicosyl group , The composition according to (8),
( 1 0 ) R \ R \ Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 プチ ル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォクタデシ ル基からなる群より選択される基を含む、 （ 8 ) に記載の組成物、(1 0) R \ R \ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group A composition selected from the group consisting of: a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptanedecyl group, and an octadecyl group;
( 1 1 ) 基本骨格にスペルミン構造を含む、 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれ かに記載の組成物、 ( 1 2) スペルミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖状に連結した （ 1 1) に記載の組成物、 (11) The composition according to any one of (1) to (3), wherein the basic skeleton contains a spermine structure; (12) The composition according to (11), wherein 2 to 5 molecules of spermine are linearly linked,
( 1 3) R，、 R 1 , Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチ ル基、 プロビル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデ シル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デ シル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる 群より選択される基を含む、 （ 1 1) に記載の組成物、 (13) Any two or more of the side chains of R, R 1 , R m , and R m + 1 are an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group , Nonyl, decyl, pendecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl. The composition according to (11), comprising a group selected from the group consisting of:
( 14) R，、 R \ Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 プチ ル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォク夕デシ ル基からなる群より選択される基を含む、 （ 1 1 ) に記載の組成物、(14) R ,, R \ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group (11) including a group selected from the group consisting of a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptanedecyl group, and an octadecyl group. A composition of
( 1 5) スペルミン構造が分岐状に連結した （ 1 1)に記載の組成物、(15) The composition according to (11), wherein the spermine structures are linked in a branched manner.
( 1 6) R \ R Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチ ル基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデ シル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デ シル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる 群より選択される基を含む、 （ 14) に記載の組成物、 (1 6) R \ RR m , two or more any of the side chains of R m + 1 is E Ji group, propyl group, butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, Select from the group consisting of decyl, decyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, hepdecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl The composition according to (14), which comprises a group represented by the formula:
( 1 7) R \ R Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 プチ ル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォクタデシ ル基からなる群より選択される基を含む、 （ 14) に記載の組成物、 (1 7) R \ RR m , two or more any of the side chains of R m + 1 is, Petit group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group, dodecyl The composition according to (14), which comprises a group selected from the group consisting of a group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a hexadecyl group, a heptane decyl group, and an octadecyl group.
( 18) さらにリン脂質を含む、 （ 1 ) から （ 17)のいずれかに記載 の組成物、 (18) Any of (1) to (17) further containing a phospholipid A composition of
( 1 9 ) リン脂質が、中性リン脂質または酸性リ ン脂質である、（ 1 8) に記載の組成物、  (19) The composition according to (18), wherein the phospholipid is a neutral phospholipid or an acidic phospholipid.
( 2 0 ) リン脂質が、 ホスファチジルエタノールァミン骨格またはホ スファチジルコ リン骨格を有する、 （ 1 9 ) に記載の組成物、  (20) The composition according to (19), wherein the phospholipid has a phosphatidylethanolamine skeleton or a phosphatidylcholine skeleton.
( 2 1 ) リン脂質が、 ジォレイルホスファチジルエタノールアミンま たはホスファチジルコリンである、 （ 2 0 ) に記載の組成物、  (21) The composition according to (20), wherein the phospholipid is dioleyl phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine,
( 2 2 ) 負電荷を有する生理活性物質と、 （ 1 ) から （ 2 1 ) のいずれ かに記載の組成物を含む複合体、  (22) a complex comprising the physiologically active substance having a negative charge and the composition according to any one of (1) to (21);
( 2 3 ) 負電荷を有する生理活性物質が、 核酸またはその誘導体であ る、 （ 2 2 ) に記載の組成物を含む複合体、  (23) a complex comprising the composition according to (22), wherein the negatively-charged physiologically active substance is a nucleic acid or a derivative thereof;
( 24 ) ( 2 2 ) または （ 2 3 ) に記載の複合体を細胞に接触させる 工程を含む、 負電荷を有する生理活性物質を細胞内へ導入する方法、 (24) A method for introducing a physiologically active substance having a negative charge into a cell, comprising a step of contacting the complex according to (22) or (23) with a cell,
( 2 5 ) ( 1 9 ) から （ 2 1 ) のいずれかに記載の組成物を製造する ための、 リン脂質および疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリァ ルキレンィ ミンまたはその塩を含むキッ ト、 に関する。 (25) A polyalkyleneimine or a salt thereof in which a phospholipid and at least two hydrophobic groups are introduced in one molecule for producing the composition according to any one of (19) to (21). Kit, including.
本発明は、 疎水性基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレン ィ ミンまたはその塩を含む組成物に関する。 本発明において 「ポリアル キレンィ ミン」 とは、 プロ トン化したアミノ基を有するポリマー分子を 指し、 直鎖型であっても分岐型であってもよい。 ポリアルキレンィ ミン の構成単位であるアルキレンモノマーは、 炭素数が 1 ~ 1 0の低級アル キレンィ ミンであることが好ましく、 水に対する溶解性の観点から炭素 数が 1〜 3の低級アルキレンィ ミンであることがさらに好ましい。 合成 の容易性の観点からは、 特にポリエチレンィ ミンまたはスペルミンであ ることが好ましい。 ポリエチレンイ ミンは、 当業者に公知の方法により 製造することができる （例えば、 特公昭 49- 331230号公報、 特公昭 43- 8828 号公報、 米国特許第 4, 032 , 480 号明細書、 および米国特許第 4, 467， 115号参照）。 また、 市販品 （例えば、 ポリエチレンィ ミ ン （分子 量 600， 商品名ェポミ ン （株式会社日本触媒製）、 商品名 ExGen 500 ( Euromedex 社製）、 テ トラエチレンペン夕ミン等） を用いてもよい。 本 発明において用いられるポリエチレンイ ミンの平均分子量は、 通常、 200 から 1， 000， 000であり、 好ましくは 300から 500, 000であり、 さらに好 ましくは 500から 100, 000である。 また、 スペルミ ンは市販品を用いる ことができる。 The present invention relates to a composition containing a polyalkyleneimine or a salt thereof in which two or more hydrophobic groups are introduced in one molecule. In the present invention, "polyalkyleneimine" refers to a polymer molecule having a protonated amino group, and may be a linear or branched type. The alkylene monomer as a constituent unit of the polyalkyleneimine is preferably a lower alkyleneimine having 1 to 10 carbon atoms, and is a lower alkyleneimine having 1 to 3 carbon atoms from the viewpoint of solubility in water. Is more preferable. From the viewpoint of ease of synthesis, polyethyleneimine or spermine is particularly preferable. Polyethyleneimine can be produced by a method known to those skilled in the art (for example, JP-B-49-331230, JP-B-43-43). No. 8828, U.S. Pat. No. 4,032,480 and U.S. Pat. No. 4,467,115). In addition, commercially available products (for example, polyethyleneimine (molecular weight: 600, trade name: epomin (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.), trade name: ExGen 500 (manufactured by Euromedex), tetraethylenepentamine, etc.) can also be used. The average molecular weight of the polyethyleneimine used in the present invention is usually from 200 to 1,000,000, preferably from 300 to 500,000, and more preferably from 500 to 100,000. Further, commercially available spermine can be used.
ポリアルキレンイ ミンに導入する疎水性基としては、 ポリアルキレン ィ ミンとリン脂質との親和性を高めるものであれば特に制限はなく、 例 えば、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 または飽 和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシカル ボニル基、 またはリ ン脂質残基が挙げられる。 好ましくは、 ォクチル基、 セチル基、 ステアリル基、 ォレイル基である。 ポリアルキレンィ ミンに は、 負電荷物質の細胞内への導入効率を高めるために一分子中に少なく とも 2つの疎水性基が導入される。 但し、 疎水性基の導入数を過剰に増 加させると、 ポリアルキレンィ ミンの水に対する溶解性が低下してしま うため好ましくない。 分子内における好適な疎水性基の数は、 当業者で あれば、 適宜選択することが可能である。 ポリアルキレンイ ミンに導入 される疎水性基は、 スぺ一サーを介してポリアルキレンィ ミンに結合し ていてもよい。 スぺ一サ一としては、 中性の水溶性分子が好ましく、 例 えば、 アミノ酸、 ペプチド、 ポリアミノ酸、 タンパク質、 糖、 さらにポ リエチレングリコール、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ ビニルピロリ ドン、 デキス トラン誘導体等の合成高分子およびそれらの誘導体を用いること ができる。 負電荷物質を輸送するための担体として用いる場合、 ポリア ルキレンィ ミンは塩を形成していてもよい。 ポリアルキレンイ ミンの塩 としては、 例えば、 塩酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩、 炭酸塩、 ギ酸塩、 シュ ゥ酸塩、 クェン酸塩、 コハク酸塩等が挙げられるが、 これらに制限され ない。 The hydrophobic group to be introduced into the polyalkyleneimine is not particularly limited as long as it enhances the affinity between the polyalkyleneimine and the phospholipid, for example, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, or Examples include a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue. Preferred are an octyl group, a cetyl group, a stearyl group, and an oleyl group. At least two hydrophobic groups are introduced into one molecule of polyalkyleneimine in order to increase the efficiency of introducing negatively charged substances into cells. However, it is not preferable to increase the number of introduced hydrophobic groups excessively, since the solubility of the polyalkyleneimine in water is reduced. The number of suitable hydrophobic groups in a molecule can be appropriately selected by those skilled in the art. The hydrophobic group introduced into the polyalkyleneimine may be bound to the polyalkyleneimine via a spacer. As a supplier, neutral water-soluble molecules are preferable. For example, the synthesis of amino acids, peptides, polyamino acids, proteins, sugars, and also polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, dextran derivatives, etc. High polymers and their derivatives can be used. When used as a carrier for transporting a negatively charged substance, the polyalkylenimine may form a salt. Polyalkylenimine salt Examples include, but are not limited to, hydrochloride, sulfate, phosphate, carbonate, formate, oxalate, citrate, succinate, and the like.
本発明のポリアルキレンィ ミンの好ましい態様を、 下記構造式 （I)に 示す。 '-N- (CH2) p - [N- (CH2) q] xm - [Z- (CH2) 「] χη -Ν-R· ( I ) R" R1 R1 R' A preferred embodiment of the polyalkyleneimine of the present invention is represented by the following structural formula (I). '-N- (CH 2 ) p-[N- (CH 2 ) q ] xm-[Z- (CH 2 ) “] χη -Ν-R · (I) R" R 1 R 1 R'
(式中、 基本骨格にアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子も しくは窒素原子を表し、 R' は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは 不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不 飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂質残基を表し、 同一の窒素原 子に結合する 2つの R， は同一であっても異なっていてもよく、 側鎖 R 1は水素、 コ レステロール基、 飽和も しくは不飽和のアルキル基、 飽和 もしくは不飽和のァシル基、 飽和も しくは不飽和のァシルォキシカルボ ニル基、 リン脂質残基、 または次式 （II) を表す。 また、 式中、 P、 q、 r、 Χη、 X1 "は任意の自然数を表す。） (Wherein the basic skeleton may contain an amide bond, Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated Represents an acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, and two Rs bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; 1 is hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula ( It represents a II). also, represented in the formula, P, q, r, Χ η, X 1 " is an arbitrary natural number.)
Rm Rm - [ (CH2) 1- ] χρ - [ (CH2) m-Z] Xq - (CH2) n-N-R' (I) R m Rm-[( CH 2) 1-] χρ-[(CH 2 ) m -Z] X q-(CH 2 ) n -NR '(I)
R. R.
(式中、 基本骨格および側鎖 Rmにアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 R， は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽 和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R， は同一であっても異なっていても よく、 Rmは水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル 基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキ シカルボニル基、 リン脂質残基、 または次式 （III) を表す。 また、 式中、 1、 m、 n、 Xp s Xqは任意の自然数を表す。） (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the side chain R m , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R and R represent hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated Or unsaturated sacyl group, Represents a sum or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, and two R, bonded to the same nitrogen atom, may be the same or different; R m is hydrogen, a cholesterol group, Represents a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated alkoxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (III). In the formula, 1, m, n, X p s X q represents an arbitrary natural number. )
Rm+1 Rm+1 - [ (CH2) a-N] XP+1 - [ (CH2) b_Z] xq+1 - (CH2) C-N-R' (Π) R m + 1 R m + 1 -[(CH 2 ) aN] XP + 1-[(CH 2 ) b_Z] xq + 1-(CH 2 ) C -NR '(Π)
R'  R '
(式中、 基本骨格および側鎖 Rm+ 1の基本骨格にアミ ド結合が含まれて いてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 ： R' は水素、 コレ ステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和 のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂 質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R， は同一であっても 異なっていてもよい。 また、 式中、 a、 b、 c、 Xp+ 1、 Xq+ 1は任意 の自然数を表す。） (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the basic skeleton of the side chain R m + 1 , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and: R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated group. Represents a saturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue; even if two Rs bonded to the same nitrogen atom are the same, And a, b, c, X p + 1 and X q + 1 represent any natural numbers.)
該ポリアルキレンイ ミンは、 基本骨格に次式 （IV) の繰り返し構造を 含むことができ、  The polyalkyleneimine may have a repeating structure of the following formula (IV) in the basic skeleton:
一 CH2— CH2 - NH - (IV) One CH 2 — CH 2 -NH-(IV)
好ましくは、 テ トラエチレンペン夕ミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖 状に連結している。  Preferably, two to five molecules of tetraethylenepentamine are linked linearly.
より好ましくは、 R，、 II1、 ： m、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上 が、 ェチル基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプ チル某、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 P T JP More preferably, any two or more of the side chains of R, II 1 , m and R m + 1 are an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, Nonyl group, decyl group, pendecyl group, dodecyl group, PT JP
15  Fifteen
ト リデシル基、 テトラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 へ プタデシル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基か らなる群より選択される基を含み、 さらに好ましくは、 R '、 R \ R m、 R m + 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル 基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ド デシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデ シル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォクタデシル基からなる群より選択さ れる基を含む。 A group selected from the group consisting of a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl group, a nonadecyl group, and an eicosyl group; , R \ R m , R m + 1 at least two of the side chains are a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, a pendecyl group, a dodecyl group, It includes groups selected from the group consisting of tridecyl, tetradecyl, pendecyl, hexadecyl, hepdecyldecyl, and octadecyl.
該ポリアルキレンィ ミンにおいて、 式 （IV) を含む構造は、 分岐状に 連結していてもよい。  In the polyalkyleneimine, the structure containing the formula (IV) may be linked in a branched manner.
また、 本発明のポリアルキレンイ ミンは、 基本骨格にスペルミン構造 を含んでいてもよい。 好ましくは、 スペルミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖状に連結している。 スペルミン構造は、 分岐状に連結していてもよ い。  Further, the polyalkyleneimine of the present invention may have a spermine structure in the basic skeleton. Preferably, two to five molecules of spermine are linked linearly. The spermine structure may be linked in a branched manner.
これにより調製された複数の疎水性基が導入されたポリアルキレンィ ミンは、 単独で負電荷物質を輸送するための担体として用いることも可 能であるが、 さらに、 リン脂質と混合することにより、 リボソームを形 成させて担体として用いることも可能である。 疎水基はリン脂質内部に 安定化する性質を有するため、 疎水基が導入されたポリアルキレンイ ミ ンはリボソームにおいて安定的に存在しうると考えられる。 リボソーム の形成に用いられる リン脂質としては、 それ自体で、 負電荷を有する生 理活性物質と相互作用をしない中性または酸性の脂質であることが好ま しい。 リン脂質は、 天然由来であっても、 合成されたものであってもよ い。 本発明に用いられるリン脂質のアルキル側鎖としては、 炭素数 12〜 18のものまたはォレイル基が好ましい。 リン脂質としては、 例えば、 ホ スファチジルエタノールァミン骨格を有するジォレオイルホスファチジ ルェタノ一ルァミンゃホスファチジルコリン骨格を有するホスファチジ ルコリン （例えば、 卵黄由来、 大豆由来あるいは合成のもの） が好適に 用いられる。 リン脂質とポリエチレンィ ミンの混合比は、 混合物が負電 荷物質と電気的親和性を有する程度に正に帯電する範囲であれば、 特に 制限はない。 好ましい混合比は当業者であれば、 適宜選択することがで ぎる。 The polyalkyleneimine prepared by introducing a plurality of hydrophobic groups prepared in this manner can be used alone as a carrier for transporting a negatively charged substance. It is also possible to form ribosomes and use them as carriers. Since the hydrophobic group has the property of stabilizing inside the phospholipid, it is thought that the polyalkyleneimine into which the hydrophobic group has been introduced can stably exist in the ribosome. The phospholipid used for ribosome formation is preferably a neutral or acidic lipid which does not itself interact with a negatively charged bioactive substance. Phospholipids can be of natural or synthetic origin. The alkyl side chain of the phospholipid used in the present invention preferably has 12 to 18 carbon atoms or an oleyl group. Examples of the phospholipid include dioleoyl phosphatidyl having a phosphatidylethanolamine skeleton. Phosphatidylcholine having a luetano-lamine phosphatidylcholine skeleton (eg, egg yolk-derived, soy-derived or synthetic) is preferably used. The mixing ratio of the phospholipid and polyethyleneimine is not particularly limited as long as the mixture is in a positively charged range to have an electrical affinity with the negatively charged substance. Those skilled in the art can appropriately select a preferable mixing ratio.
また、 本発明は負電荷を有する生理活性物質と上記組成物とを含む複 合体に閧する。 負電荷を有する生理活性物質としては、 多価の負電荷を 有する生理活性物質であれば特に制限はない。 多価の負電荷を有する生 理活性物質としては、 例えば、 核酸およびその誘導体が挙げられる。 核 酸としては、 環状および直鎖状の 1本鎖もしくは 2本鎖のデォキシリボ 核酸であっても、 リボ核酸であってもよい。 核酸の誘導体としては、 例 えば、 ホスフォロチォェ一ト、 ホスフォロジチォエート等が例示される。 本発明の複合体において、 負電荷を有する生理活性物質に対する上記組 成物の混合比は、電荷比で 1/100当量から 20当量であることが好ましい。 好適な混合比は、 当業者であれば適宜選択することができる。 複合体の 粒形は、 200 mn以下であることが好ましく、 100 nm以下であることがさ らに好ましい。 本発明の複合体の製造において、 他の補助剤は特に必要 ないが、 補助剤としては、 例えば、 ホスファチジルェタノ一ルァミンま たはホスファチジルコリン、 脂肪酸など両親媒性の分子等を用いること も可能である。  Further, the present invention relates to a complex containing a physiologically active substance having a negative charge and the above composition. The biologically active substance having a negative charge is not particularly limited as long as it is a biologically active substance having a polyvalent negative charge. Examples of the physiologically active substance having a multivalent negative charge include nucleic acids and derivatives thereof. The nucleic acid may be a cyclic or linear single- or double-stranded deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid. Examples of nucleic acid derivatives include, for example, phosphorothioate, phosphorodithioate and the like. In the complex of the present invention, the mixing ratio of the above composition to the physiologically active substance having a negative charge is preferably 1/100 equivalent to 20 equivalent in terms of charge ratio. Suitable mixing ratios can be appropriately selected by those skilled in the art. The particle size of the composite is preferably 200 mn or less, more preferably 100 nm or less. In the production of the complex of the present invention, other auxiliary agents are not particularly required, but, for example, amphiphilic molecules such as phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine and fatty acids can be used as the auxiliary agent. is there.
負電荷物質の輸送において本発明のポリアルキレンイ ミンを単独で用 いる場合には、 負電荷物質と直接混合して複合体を形成させた後、 公知 の 方 法 （ O. Bouss if et al .， Proc . Natl . Acad. Sc i . USA 92, 7297- 7301 ( 1995 ) ) に従って負電荷物質を細胞内へ導入することができる。 一 方、 本発明のポリアルキレンイ ミンをリン脂質と混合してリポソ一ムを 形成させる場合には、 まず、 ジォレオイルホスファチジルエタノールァ ミン （D0PE、 日本精化株式会社製）またはホスファチジルコリン （eggPC, 日本精化株式会社製）などのリ ン脂質と本発明のポリアルキレンィ ミン を混合し、 これを公知の方法 ( N . Oku et al . , B iochim. Biophys . Acta. 1280， 149-154, ( 1996 ) ) ) に従いリボソームの水分散液を調製する。 この 際、リポソ一ムは膜安定化剤としてコレステロール等のステロール類を、 抗酸化剤として トコフェロール、 ビタミン Eなどを含んでいてもよい。 リピドマイクロスフエアーの場合、 本発明のポリアルキレンィ ミンと大 豆油と界面活性剤とを加えて公知の方法（F . Liu et al ,， Pharmaceutical Res . 13 , 1642-1646 ( 1996 ) )により目的のリピドマイクロスフェアーを得 ることができる。 これを負電荷物質と混合た後、 細胞に接触させること により、 負電荷物質を細胞内へ導入することができる。 When the polyalkyleneimine of the present invention is used alone in transporting a negatively charged substance, the polyalkyleneimine is directly mixed with the negatively charged substance to form a complex, and then a known method (O. Bouss if et al. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995)), a negatively charged substance can be introduced into cells. On the other hand, the polyalkyleneimine of the present invention is mixed with a phospholipid to form a liposome. When forming, first, a phospholipid such as dioleoylphosphatidylethanolamine (D0PE, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) or phosphatidylcholine (eggPC, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) and the polyalkylene of the present invention are used. An aqueous dispersion of ribosomes is prepared according to a known method (N. Oku et al., Biochim. Biophys. Acta. 1280, 149-154, (1996)). At this time, the liposome may contain sterols such as cholesterol as a membrane stabilizer and tocopherol and vitamin E as antioxidants. In the case of lipid microspheres, the polyalkyleneimine of the present invention, soybean oil, and a surfactant are added, and the method is carried out by a known method (F. Liu et al, Pharmaceutical Res. 13, 1642-1646 (1996)). Lipid microspheres can be obtained. By mixing this with a negatively charged substance and then bringing it into contact with the cells, the negatively charged substance can be introduced into the cells.
また、 本発明はリボソームを調製するための、 リン脂質および疎水性 基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンィ ミンまたはその塩 を含むキッ トに関する。 本発明のキッ トにはリン脂質および疎水性基が 一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンイ ミンまたはその塩の他 に、 さらに、 上記の膜安定化剤、 抗酸化剤を含んでいてもよい。 本発明 のキッ トに含まれるリン脂質標品及びポリアルキレンイ ミン標品の最終 形態としては、 冷蔵、 冷凍または凍結乾燥品とすることが可能である。 凍結乾燥品の場合は安定化剤としてソルビトール、 シュ一クロース、 ァ ミノ酸及び各種タンパク質等を含んでいてもよい。 図面の簡単な説明  The present invention also relates to a kit for preparing ribosomes, the kit comprising a phospholipid and a polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced into one molecule or a salt thereof. The kit of the present invention contains, in addition to a phospholipid and a polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced in one molecule or a salt thereof, the above-mentioned membrane stabilizer and antioxidant. May be. The final form of the phospholipid preparation and the polyalkyleneimine preparation contained in the kit of the present invention can be a refrigerated, frozen or lyophilized product. In the case of a freeze-dried product, sorbitol, sucrose, amino acid, various proteins and the like may be contained as a stabilizer. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 実施例において用いた疎水基を導入したポリエチレンィ ミン の構造を示す図である。  FIG. 1 is a diagram showing the structure of a polyethyleneimine having a hydrophobic group introduced therein used in Examples.
図 2は、 本発明の組成物と従来のリポソームを用いた場合のプラスミ ドとリボソームとの荷電比を変えた時の GFP遺伝子発現を表わす図であ る。 図中、 PCL はト リセチル -PEI:D0PE (0.65:1,モル比， ポリエチレン ィ ミ ン分子量 ： 600 ) を示す。 同様に DMRIE:D0PE(1:1，モル比）、 D0TAP:D0PE(1:1,モル比） を示し、 細胞は COS- 1を用いた。 また、 プロッ ト上の棒線は土 SDを示す。 FIG. 2 shows the plasmid obtained when the composition of the present invention and a conventional liposome were used. FIG. 4 is a diagram showing GFP gene expression when the charge ratio between ribosomes and ribosomes is changed. In the figure, PCL indicates tricetyl-PEI: D0PE (0.65: 1, molar ratio, polyethyleneimine molecular weight: 600). Similarly, DMRIE: D0PE (1: 1, molar ratio) and D0TAP: D0PE (1: 1, molar ratio) were shown, and cells used COS-1. The bar on the plot indicates soil SD.
図 3は、 リン脂質の遺伝子発現に及ぼす影響を表わす図である。図中、 DOPE- PCLはト リセチル -PEI: DOPE (0.65:1，モル比） を示す。 eggPC-PCL はト リセチル -PEI: eggPC (0.65:1，モル比） を示す。  FIG. 3 is a diagram showing the effect of phospholipids on gene expression. In the figure, DOPE-PCL indicates tricetyl-PEI: DOPE (0.65: 1, molar ratio). eggPC-PCL indicates tricetyl-PEI: eggPC (0.65: 1, molar ratio).
図 4は、 本発明のリボソーム単独またはプラスミ ド複合体濃度を変え た時の細胞毒性を表わす図である。 図中、 PCL は ト リセチル -PEI:D0PE (0.65:1,モル比、 PEI分子量 600) を示す。 細胞は COS- 1を用いた。 ま た、 棒グラフ上部の棒線は土 SDの +側を示す。  FIG. 4 is a graph showing the cytotoxicity when the concentration of the ribosome alone or the plasmid complex of the present invention was changed. In the figure, PCL indicates tricetyl-PEI: D0PE (0.65: 1, molar ratio, PEI molecular weight 600). Cells used COS-1. The bar above the bar graph indicates the + side of the soil SD.
図 5は、 従来のリボソーム （DMRIE)の単独またはプラスミ ド複合体の 濃度を変えた時の細胞毒性を表わす図である。 図中、 DMRIE lipo.は DMME:D0PE(1:1,モル比） を示す。 細胞は COS- 1を用いた。 また、 棒グラ フ上部の棒線は土 SDの +側を示す。  FIG. 5 is a graph showing cytotoxicity when the concentration of a conventional ribosome (DMRIE) alone or a plasmid complex was changed. In the figure, DMRIE lipo. Indicates DMME: D0PE (1: 1, molar ratio). Cells used COS-1. The bar above the bar indicates the + side of the soil SD.
図 6は、 従来のリポソ一ム （D0TAP)の単独またはプラスミ ド複合体の 濃度を変えた時の細胞毒性を表わす図である。 図中、 DOTAP lipo.は D0TAP:D0PE(1:1，モル比） を示す。 細胞は C0S-1を用いた。 また、 棒グラ フ上部の棒線は土 SDの +側を示す。  FIG. 6 is a diagram showing the cytotoxicity of conventional liposomes (D0TAP) alone or when the concentration of a plasmid complex is changed. In the figure, DOTAP lipo. Indicates D0TAP: D0PE (1: 1, molar ratio). Cells used C0S-1. The bar above the bar indicates the + side of the soil SD.
図 7は、 分子量 600のポリエチレンィ ミンを出発原料としたアルキル 化分岐型ポリエチレンイ ミンの構造を示す。  FIG. 7 shows the structure of an alkylated branched type polyethyleneimine using polyethyleneimine having a molecular weight of 600 as a starting material.
図 8は、 分子量 1,800のポリエチレンィ ミンを出発原料としたアルキ ル化分岐型ポリエチレンィ ミンの構造を示す。  FIG. 8 shows the structure of an alkylated branched polyethyleneimine starting from polyethyleneimine having a molecular weight of 1,800.
図 9は、 アルキル化直鎖型エチレンィ ミンの合成ルート （ 1 ) を示す 図である。 図 10は、 アルキル化直鎖型エチレンィ ミ ンの合成ルート （2) を示 す図である。 FIG. 9 is a diagram showing a synthesis route (1) for alkylated linear ethyleneimine. FIG. 10 is a diagram showing a synthesis route (2) of an alkylated linear ethyleneimine.
図 1 1は、 アルキル化直鎖型エチレンィ ミンの構造を示す図である。 図 1 2は、 アルキル化直鎖型スペルミ ンの合成ルート （ 1 ) を示す図 である。  FIG. 11 is a diagram showing the structure of an alkylated linear ethyleneimine. FIG. 12 is a diagram showing a synthetic route (1) for alkylated linear spermine.
図 13は、 アルキル化直鎖型スペルミ ンの合成ルート （2 ) を示す図 である。  FIG. 13 is a diagram showing a synthesis route (2) for an alkylated linear spermine.
図 14は、 アルキル化直鎖型スペルミ ンの合成ルート （3) を示す図 である。  FIG. 14 is a diagram showing a synthesis route (3) for an alkylated linear spermine.
図 1 5は、 アルキル化直鎖型スペルミ ンの合成ルート （4) を示す図 である。  FIG. 15 is a diagram showing a synthetic route (4) for alkylated linear spermine.
図 1 6は、 アルキル化直鎖型スペルミンの構造を示す図である。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 16 is a diagram showing the structure of an alkylated linear spermine. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明は、 これら の実施例に限定されるものではない。  Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[実施例 1 ] ポリエチレンイ ミンの精製 [Example 1] Purification of polyethyleneimine
市販のポリェチレンィ ミン （分子量 600, 商品名ェポミン SP-006、 株 式会社日本触媒製） 2gを 100mlの蒸留水で溶解し、 分画分子量 500の限 外濾過膜（UH-05， 東洋濾紙製；限外濾過装置 はアミコン社製、 撹拌式セ ル 8，400 型）で、 2-3kg/cm2の窒素気流下、 1000ml の蒸留水で限外濾過 を行った。 不純物を除いた限外濾過処理液 （約 20- 30ml) を凍結乾燥し て精製ポリエチレンィ ミンを得た。 2 g of a commercially available polyethyleneimine (molecular weight: 600, trade name: Epomin SP-006, manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) is dissolved in 100 ml of distilled water, and an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 500 (UH-05, manufactured by Toyo Filter Paper; ultrafiltration apparatus of Amicon, with stirring type cell Le 8,400 inch), 2-3 kg / cm 2 in a nitrogen stream, was ultrafiltered with distilled water 1000 ml. The ultrafiltration solution (about 20-30 ml) from which impurities were removed was freeze-dried to obtain purified polyethyleneimine.
[実施例 2 ] セチル化ポリエチレンィ ミンの合成 20mlのクロ口ホルム中、 lgの精製ポリエチレンィ ミン（分子量 600 )と 1 . 62gのセチル プロマイ ドを混合し （モル比、 1 : 2 )、 1 mlのト リェチ ルアミンを添加して還流させた。次いで、 分画分子量 1000の限外濾過膜[Example 2] Synthesis of ceylated polyethyleneimine In 20 ml of closed mouth form, lg of purified polyethyleneimine (molecular weight: 600) and 1.62 g of cetylpromide were mixed (molar ratio, 1: 2), and 1 ml of triethylamine was added and refluxed. . Next, an ultrafiltration membrane with a molecular cutoff of 1000
( YM1、 アミコン社製）を用い未反応のポリエチレンィ ミンを除去した。 凍結乾燥したセチル化ポリエチレンィ ミンの収率は 70 , 4 であった。 セ チル化ポリエチレンィ ミンのセチル基の導入数は NMRで検討した。即ち、 1 . 3ppm付近のセチル基と 2. 5- 3. 5ppm付近のポリエチレンィ ミンのプロ トン比は 1分子のポリエチレンィ ミンにセチル基 3分子が結合している ことを支持した。 合成したポリエチレンイ ミンを図 1に示す。 Unreacted polyethyleneimine was removed using (YM1, Amicon). The yield of freeze-dried ceylated polyethyleneimine was 70,4. The number of cetyl groups introduced into the ceylated polyethyleneimine was examined by NMR. That is, the proton ratio of the cetyl group around 1.3 ppm and the polyethyleneimine around 2.5-3.5 ppm supported that three molecules of the cetyl group were bonded to one molecule of polyethyleneimine. Figure 1 shows the synthesized polyethyleneimine.
[実施例 3 ] リボソームの調製 [Example 3] Preparation of ribosome
リボソームを調製するために、 予め 10mM セチル化ポリエチレンイ ミ ンのクロ口ホルム 溶液と 10mMジォレオイルホスファチジルエタノール ァミン （D0PE、 日本精化株式会社製） の クロ口ホルム溶液を調製した。 用いた脂質組成はセチル化ポリエチレンィ ミ ン /D0PE=0. 65/1 (モル比） とした。 この脂質をナス型フラスコに取りクロ口ホルムに溶解した後、 口—夕リーエバポレーターでクロ口ホルムを減圧留去し脂質フイルムを 作製した。 この脂質フィルムを高真空下で 1 時間乾燥した後、 ImM溶液 となるように DMEM (ギブコ BRL社製） で水和した。 その後、 凍結融解を 3回繰り返し、 リポソ一ムをバス型ソニケ一夕一で 10分間超音波処理し た。 リボソームは安定ではあるが用時調製した。  In order to prepare ribosomes, a solution of 10 mM cetyylated polyethyleneimine in chloroform and a solution of 10 mM dioleoylphosphatidylethanolamine (D0PE, manufactured by Nippon Seika Co., Ltd.) were prepared in advance. The lipid composition used was ceylated polyethyleneimine / D0PE = 0.65 / 1 (molar ratio). This lipid was taken in an eggplant-shaped flask and dissolved in black-mouthed form. Then, the black-mouthed form was distilled off under reduced pressure using a mouth-evening evaporator to prepare a lipid film. After drying this lipid film under high vacuum for 1 hour, it was hydrated with DMEM (manufactured by Gibco BRL) to obtain an ImM solution. Thereafter, freeze-thaw was repeated three times, and the liposomes were sonicated for 10 minutes with a bath-type sonike overnight. The ribosome was stable but prepared at the time of use.
また、 比較例として、 セチル化ポリエチレンィ ミンの代わりに 1、 2- ジミ リスチルォキシプロピル- 3-ジメチルヒ ドロキシェチルアンモニゥ ムブロミ ド （DMRIE )または 1、 2-ジォレオイルォキシ -3- ( ト リメチルァ ンモニォ） プロパン （D0TAP )を用いて上記と同様にリボソームを得た。 [実施例 4 ] プラスミ ド DNA/リボソーム 複合体の作製 In addition, as a comparative example, 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyshethylammonium bromide (DMRIE) or 1,2-dioleoyloxy- was used in place of ceylated polyethyleneimine. Ribosomes were obtained in the same manner as above using 3- (trimethylammonio) propane (D0TAP). [Example 4] Preparation of plasmid DNA / ribosome complex
プラスミ ド DNAは pEGFP-Cl (クローンテツク社製） を用いた。 このプ ラスミ ドは、 レポ一夕遺伝子として GFP(green fluorescent protein)を コードしているため、 その遺伝子発現は GFPの蛍光強度を測定すること で定量できる。 プラスミ ドを大腸菌で調製、 塩化セシウム平衡密度勾配 遠心法で精製し、 TE 緩衝液 （pH 7.5)に 2 /g/mlの濃度で溶解した。 プ ラスミ ド DNA量を一定にし、 1.5ml エツペン ドルフチューブにとり、 各 比率の ImM リボソーム溶液を添加し、 100 1 となるよう DMEMを加え、 室温で 20分間ィ ンキュベ一シヨンした。  The plasmid DNA used was pEGFP-Cl (Clonetech). Since this plasmid encodes GFP (green fluorescent protein) as a repo overnight gene, its gene expression can be quantified by measuring the fluorescence intensity of GFP. Plasmid was prepared in E. coli, purified by cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation, and dissolved in TE buffer (pH 7.5) at a concentration of 2 / g / ml. The amount of plasmid DNA was kept constant, placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, added with the ImM ribosome solution at each ratio, added with DMEM so that the ratio became 1001, and incubated at room temperature for 20 minutes.
[実施例 5 ] 遺伝子導入 [Example 5] Gene transfer
C0S-1細胞を 1X105 eel Is/ディ ッシュで 35mmディ ッシュに播き、 37°C、 5%C02存在下で一夜培養した。 DMEMで 1回洗浄した後、 調製したリポソ ーム /プラスミ ド DNA複合体を血清無添加の DMEMで希釈し、 全液量 250 jul となるように調製し細胞に添加した。 添加後、 37°C、 5%C02の条件 下で 3時間インキュベーションした。 3時間後、 リボソーム/プラスミ ド MA複合体溶液を除去し、血清無添加の DMEMで 2回洗浄後、 10%FBS- DMEM 2ml を加えて 48時間培養した。 The C0S-1 cells were seeded in 35mm di Mesh at 1X10 5 eel Is / di Mesh, and cultured overnight in C0 2 the presence 37 ° C, 5%. After washing once with DMEM, the prepared liposome / plasmid DNA complex was diluted with serum-free DMEM, adjusted to a total volume of 250 jul, and added to the cells. After the addition was incubated for 3 hours under 37 ° C, 5% C0 2 conditions. Three hours later, the ribosome / plasmid MA complex solution was removed, washed twice with serum-free DMEM, and then added with 2 ml of 10% FBS-DMEM and cultured for 48 hours.
[実施例 6 ] 導入遺伝子発現 （GFP)の定量 [Example 6] Quantification of transgene expression (GFP)
上記の 48時間培養した細胞の培養液を除き血清無添加の DMEMで 2回 洗浄後、 最終濃度 1%の濃度で TritonXlOO溶液を添加後、 室温で 30分 インキュベーションして可溶化した。 細胞溶液を懸濁してエツベン ドル フチューブに移し 3000rpmで 10分間遠心した。遺伝子発現量は Ex 493nm、 Em510nmの蛍光強度測定によった。 この結果を図 2に示す。 本発明の組 成物を用いた場合は対照の DMRIE 、 D0TAPに比べて遺伝子発現は 2倍以 上高かった。 After removing the culture solution of the cells cultured for 48 hours as described above, the cells were washed twice with serum-free DMEM, and a TritonXlOO solution was added at a final concentration of 1%, followed by incubation at room temperature for 30 minutes to solubilize the cells. The cell solution was suspended, transferred to an Etbendorf tube, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The gene expression level was determined by measuring the fluorescence intensity at Ex 493 nm and Em 510 nm. The result is shown in FIG. When the composition of the present invention was used, the gene expression was at least twice that of the control DMRIE and D0TAP. It was expensive.
[実施例 7 ] 比較リポソ一ムを用いた場合の導入遺伝子発現 [Example 7] Transgene expression using comparative liposomes
実施例 3で DOPEの代わりに卵黄由来のホスファチジルコリン（eggPC) を用いた以外は実施例 1〜 6 と同様にして導入遺伝子発現の定量を行つ た。 図 3に結果を示した。 図 3からわかるように、 eggPCを用いた場合、 DOPEに近似した遺伝子発現を示した。  The transgene expression was quantified in the same manner as in Examples 1 to 6, except that egg yolk-derived phosphatidylcholine (eggPC) was used in place of DOPE in Example 3. Figure 3 shows the results. As can be seen from FIG. 3, when eggPC was used, the gene expression was similar to DOPE.
[実施例 8 ] 細胞毒性の検討 [Example 8] Examination of cytotoxicity
COS- 1 細胞を 24 ゥエルプレ一ト（コ一二ング社製）に 1 ゥエルあたり 1ml ずつ添加し、 37°C、 5 % C02存在下でー晚培養しコンフルェン トとし た。 DMEMでゥエルを 2回洗浄後、調製したプラスミ ド MA/リポソ一ム複 合体溶液を様々な濃度で 1 ゥヱルあたり 200〃1ずつ添加した。添加後、 37°C、 5 % C02存在下で 3時間イ ンキュベーショ ンした。 また、 対照とし て DMEMのみ、 リボソーム溶液のみについても同様に行った。 COS- 1 cells were added one by 1ml per Ueru 24 Uerupure Ichito (co made-learning Inc.) to make a 37 ° C, 5% C0 2 and over晚cultured in the presence Konfuruen bets. After washing the wells twice with DMEM, the prepared plasmid MA / liposome complex solution was added at 200 濃度 1 / well at various concentrations. After the addition was 3 hours Lee Nkyubesho down in C0 2 the presence 37 ° C, 5%. As a control, DMEM alone and ribosome solution alone were used.
[実施例 9 ] 細胞密度の測定 [Example 9] Measurement of cell density
細胞毒性について はアラ マ一ブル一 （ alamerBlue、 Biosource International社、 輸入元は岩城硝子株式会社） を用いて行った。 まず、 それそれのサンプル溶液を除去し、 各ゥヱルあたり血清無添加の DMEM 200〃 1および 5倍希釈したアラマ一ブル一溶液を 50〃 1ずつ添加した。 添加後、 37°C、 5 % C02存在下で 1時間インキュベーションした。 1時間 後、 各ゥエルの溶液を 1. 5mlエツペン ドルフチューブにとり、 750〃 1の PBS ( - )を加えて lml し、 Ex 535nm、 Em 583nmの蛍光強度測定を行った。 その結果を図 4、 図 5、 図 6に示す。 本発明の組成物を用いた場合には、 従来のリポソ一ムを用いた場合に比べて特に高濃度の複合体溶液におい て著しく細胞毒性が低下 Cytotoxicity was measured using Alamar Blue (alamerBlue, Biosource International, imported from Iwaki Glass Co., Ltd.). First, each sample solution was removed, and 200 μl of DMEM without serum and 50 μl of a 5-fold diluted allamable solution were added to each gel. After the addition was incubated for 1 hour at C0 2 presence 37 ° C, 5%. One hour later, the solution in each well was placed in a 1.5-ml Eppendorf tube, and 750 ml of PBS (-) was added thereto to make 1 ml, and the fluorescence intensity at Ex 535 nm and Em 583 nm was measured. The results are shown in Figs. In the case of using the composition of the present invention, particularly in a complex solution having a high concentration compared to the case of using the conventional liposome. Significantly reduced cytotoxicity
[実施例 1 0 ] アルキル化分岐ポリエチレンィ ミン誘導体の合成 アルキル基鎖長の遺伝子導入能に及ぼす効果を調べるため、 実施例 1 および 2と同様な方法を用いて、 分子量 600のポリエチレンィ ミン （以 下、 PEI (6)、 化合物 1、 化合物名 P6) にアルキル基を新たに導入した (図 7、 図 8 )。 化合物 2の合成 [Example 10] Synthesis of alkylated branched polyethyleneimine derivative In order to examine the effect of the alkyl group chain length on the gene transfer ability, a polyethyleneimine having a molecular weight of 600 was used in the same manner as in Examples 1 and 2. Hereinafter, an alkyl group was newly introduced into PEI (6), compound 1, and compound name P6) (Figs. 7 and 8). Synthesis of Compound 2
化合物名 P6D20.3 (アルキル化度 20.3%) の合成： Synthesis of compound name P6D20.3 (degree of alkylation 20.3%):
ポリエチレンィ ミン、 PEI (6)5.0gをエタノール 20mlに溶解し、 デシ ルブロマイ ド 3.69g (3.45ml) をゆっく り と添加した。 窒素フロー、 撹 拌をしながら 75°Cで反応させ、 8時間後、 TLCにてデシルブロマイ ドの 消失を確認して合成を終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 (amiconYMl)により精製、 フリーズドライにより水を除去してポリマー を得た。 収率 42.2° ； N R (CDC13 ) δ ： 0.85 (9H,t，CH3- ), 1.30 (36H,m,decyl の CH2 )， 2.70 ( 54H，br, - C2H4 -N -)， 3.20 ( 14H,m, -NH-) δ : 0.85と 2.70のプロ トン比からデシル基が 20.3%導入されているこ とを確認した。 化合物 3の合成 5.0 g of polyethyleneimine and PEI (6) were dissolved in 20 ml of ethanol, and 3.69 g (3.45 ml) of desyl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C. with stirring and nitrogen flow. After 8 hours, the disappearance of decyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amiconYMl), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. Yield 42.2 °; NR (CDC1 3) δ: 0.85 (9H, t, CH 3 -), 1.30 (36H, m, CH 2 of decyl), 2.70 (54H, br , - C 2 H 4 -N -) , 3.20 (14H, m, -NH-) δ: From the proton ratio of 0.85 and 2.70, it was confirmed that 20.3% of decyl groups were introduced. Synthesis of Compound 3
化合物名， P6L18.4 (アルキル化度 18.4%)の合成： Synthesis of compound name, P6L18.4 (alkylation degree 18.4%):
ΡΕΙ (6)2.0gをエタノール 10mlに溶解し、 ラウリルプロマイ ド 1.66g (1.60ml) をゆつく りと添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてデシルブロマイ ドの消失を確認して合成を 終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amicon YM1) により 精製、フリーズドライにより水を除去してポリマ一を得た。収率 68.4%； !H NMR (D20) δ ： 0.80 (8H，t，CH3- )， 1.20(46H，m, laurylの CH2 ),2.60 (54H，br，- C2H4- N- )d ： 0.80 と 2.60 のプロ トン比からラウリル基が 18.4%導入されていることを確認した。 化合物 4の合成 (6) 2.0 g was dissolved in 10 ml of ethanol, and 1.66 g (1.60 ml) of lauryl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C. with nitrogen flow and stirring. After 8 hours, the disappearance of decyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, add 150ml of distilled water and ultrafiltrate (amicon YM1) Water was removed by purification and freeze drying to obtain a polymer. 68.4% yield; H NMR (D 2 0) δ:! 0.80 (8H, t, CH 3 -), 1.20 (46H, m, lauryl of CH 2), 2.60 (54H, br, - C 2 H 4 - N-) d: From the protein ratio of 0.80 and 2.60, it was confirmed that 18.4% of lauryl groups were introduced. Synthesis of Compound 4
化合物名， P6M18.8 (アルキル化度 18.8%)の合成： Synthesis of compound name, P6M18.8 (alkylation degree 18.8%):
PEI (6) 5.0g をエタノール 20ml に溶解し、 ミ リスチルブロマイ ド 4.63g (4.97ml) をゆっく り と添加した。 窒素フ口一、 撹拌をしながら 75°Cで反応させ、 8時間後、 TLCにてミ リスチルプロマイ ドの消失を確認 して合成を終了した。次に、蒸留水を 150ml加え、限外ろ過（amiconYMl) により精製、 フ リーズドライにより水を除去してポリマ一を得た。 収率 54.8%: JH NMR (CDC13 ) δ : 0.90 (8H，t，CH 3 -）, 1.30 (55H,m, myristyl の CH2 ), 2.70 (55H, br, - C2H4- N -）， 3.55 (20H,m,-NH-) (5 : 0.90 と 2.70 のプロ トン比からミ リスチル基が 18.8%導入されていることを確5.0 g of PEI (6) was dissolved in 20 ml of ethanol, and 4.63 g (4.97 ml) of myristyl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C with stirring under a nitrogen atmosphere. After 8 hours, the disappearance of myristyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amiconYMl), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. Yield 54.8%: J H NMR (CDC1 3) δ: 0.90 (8H, t, CH 3 -), 1.30 (55H, m, of myristyl CH 2), 2.70 (55H , br, - C 2 H 4 - N -), 3.55 (20H, m, -NH-) (5: 0.90 and 2.70 show that 18.8% of myristyl groups were introduced.
¾じ、し/ »_ o 化合物 5の合成 ¾ じ 、 し / »_ o Synthesis of Compound 5
化合物名， P6C17.5 (アルキル化度 17.5%) の合成 ： Synthesis of compound name, P6C17.5 (alkylation degree 17.5%):
PEI (6) 1.28gをエタノール 10mlに溶解し、 セチルブロマイ ド 1.30g (1.30DI1) をゆっく りと添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてセチルプロマイ ドの消失を確認して合成を 終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amiconYMl)により精 製、 フリーズドライにより水を除去してポリマ一を得た。 収率  1.28 g of PEI (6) was dissolved in 10 ml of ethanol, and 1.30 g (1.30DI1) of cetyl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C with stirring and nitrogen flow. After 8 hours, the disappearance of cetyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amiconYMl), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. yield
82.6% ; JH NMR(CDC13 ) δ : 0.88 (8H，t，CH3-)， 1.25 (60H,m, cetyl の CH2 )， 2.70 (44H，br,-C2H4-N -)， 3.90(8H,m, -NH-) (5 ： 0.88 と 2.70の プロ 卜ン比からセチル基が 17.5%導入されていることを確認した。 化合物 6の合成 82.6%; J H NMR (CDC1 3) δ: 0.88 (8H, t, CH 3 -), 1.25 (60H, m, CH 2 of cetyl), 2.70 (44H, br , -C 2 H 4 -N -) , 3.90 (8H, m, -NH-) (5: 0.88 and 2.70 It was confirmed from the proton ratio that 17.5% of the cetyl groups had been introduced. Synthesis of compound 6
化合物名， P6C24.5 (アルキル化度 24.5%) の合成 ： Synthesis of compound name, P6C24.5 (degree of alkylation 24.5%):
PEI(6)1.0g をエタノール 10ml に溶解し、 セチルブロマイ ド 1.02g (1.02ml) をゆつく り と添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてセチルプロマイ ドの消失を確認して合成を 終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amicon YM1)により精 製、 フリーズドライにより水を除去してポリマ一を得た。 収率 85.5¾； 1 HNMR (CDC13 ) δ : 0.88 ( 10H， t， CH3 -）， 1.25 (75H,m,cetylの CH2 )， 2.65 (45H,br,-C2H4-N-), 4.88 (22H,m，- NH -） δ ： 0.88 と 2.65 のプロ トン 比からセチル基が 24.5%導入されていることを確認した。 化合物 7の合成 1.0 g of PEI (6) was dissolved in 10 ml of ethanol, and 1.02 g (1.02 ml) of cetyl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C with stirring and nitrogen flow. After 8 hours, the disappearance of cetyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amicon YM1), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. Yield 85.5¾; 1 HNMR (CDC1 3) δ: 0.88 (10H, t, CH 3 -), 1.25 (75H, m, of cetyl CH 2), 2.65 (45H , br, -C 2 H 4 -N- ), 4.88 (22H, m, -NH-) δ: From the protein ratio of 0.88 and 2.65, it was confirmed that 24.5% of cetyl groups were introduced. Synthesis of Compound 7
化合物名， P6S21.1 (アルキル化度 21.1%) の合成 ： Synthesis of compound name, P6S21.1 (degree of alkylation 21.1%):
PEI(6)5,0gをエタノール 20ml に溶解し、ステアリルブロマイ ド 5.57g Dissolve 5.0 g of PEI (6) in 20 ml of ethanol, and add 5.57 g of stearyl bromide.
(5.71ml) をゆつく りと添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてステアリルブロマイ ドの消失を確認して合 成を終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amicon YM1)によ り精製、 フ リーズ ドライ によ り水を除去してポリマーを得た。 収率 86.0%； !H NMR(CDC13 ) (5 ： 0.90 (9H,t,CH3-), 1.30( 74H，m， stearylの CH2 ), 2.70 (57H，br，- C2H4-N-)， 3.70( 17H,m, -NH-) (5 : 0.90と 2.70の プロ トン比からステアリル基が 21.1%導入されていることを確認した。 化合物 8の合成 (5.71 ml) was added slowly. The reaction was carried out at 75 ° C with nitrogen flow and stirring. After 8 hours, the disappearance of stearyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amicon YM1), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. 86.0% yield; H NMR (CDC1 3) ( 5:! 0.90 (9H, t, CH 3 -), 1.30 (74H, m, CH 2 of stearyl), 2.70 (57H, br , - C 2 H 4 - N-), 3.70 (17H, m, -NH-) (5: 0.90 and 2.70). It was confirmed that the stearyl group was introduced by 21.1%.
化合物名， P6S11.3 (アルキル化度 11.3%) の合成 ： J Synthesis of compound name, P6S11.3 (alkylation degree 11.3%): J
26  26
PEI (6) 5.0g をエタノール 2 Oml に溶解し、 ステアリルプロマイ ド 2.78g (2.85ml) をゆつ く り と添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで反応させ、 8時間後、 TLCにてステアリルプロマイ ドの消失を確認 して合成を終了した。次に、蒸留水を 150ml加え、限外ろ過（amicon YM1) により精製、 フ リーズドライにより水を除去してポリマ一を得た。 収率 53.3% ; JH NMR(CDC13 ) δ ： 0.90 (5H，t，CH3-)， 1.25 (35H,m, stearyl の CH2 ), 2.60 (56H,br,-C2H4-N-), (5 : 0.90と 2.60のプロ トン比から ステアリル基が 11.3%導入されていることを確認した。 同様に、 分子量 1,800 (商品名ェポミン SP- 018、 株式会社日本触媒） ポリエチレンィ ミン （PEI (18)と略称） にセチル （cetyl, C=16) 基を導 入し、 導入率の異なる 2種の化合物を合成した。 化合物 9の合成 5.0 g of PEI (6) was dissolved in 2 Oml of ethanol, and 2.78 g (2.85 ml) of stearyl bromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C with nitrogen flow and stirring. After 8 hours, the disappearance of stearyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purification was performed by ultrafiltration (amicon YM1), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. 53.3% yield; J H NMR (CDC1 3) δ: 0.90 (5H, t, CH 3 -), 1.25 (35H, m, CH of stearyl 2), 2.60 (56H, br, -C 2 H 4 -N -), (5: It was confirmed that 11.3% of stearyl groups were introduced from the ratio of 0.90 and 2.60. Similarly, the molecular weight was 1,800 (trade name: Epomin SP-018, Nippon Shokubai Co., Ltd.) Polyethyleneimine ( A cetyl (cetyl, C = 16) group was introduced into PEI (18), and two compounds with different introduction rates were synthesized.
化合物名，P18C12.3 (アルキル化度 12.3%)の合成 Synthesis of compound name, P18C12.3 (alkylation degree 12.3%)
PEI (6)1.50 をエタノール 10ml に溶解し、 セチルプロマイ ド 0.87g (0.87ml) をゆつく りと添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75°Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてセチルプロマイ ドの消失を確認して合成を 終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amicon YM1) により 精製、フ リーズドライにより水を除去してポリマーを得た。収率 84.0 ； l NMR(CDC13 ) δ ： 0.88 ( 15H,t,CH3 1.25 (117H，m，cetylの CH2 )， 2.70(170H,br,-C2H4-N-)3 3.70(23H，m，-NH-)d : 0.88と 2.70のプロ ト ン比からセチル基が 12.3%導入されていることを確認した。 化合物 1 0の合成 1.50 PEI (6) was dissolved in 10 ml of ethanol, and 0.87 g (0.87 ml) of cetylpromide was slowly added. The reaction was carried out at 75 ° C with stirring and nitrogen flow. After 8 hours, the disappearance of cetyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amicon YM1), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. Yield 84.0; l NMR (CDC1 3) δ: 0.88 (15H, t, CH 3 1.25 (117H, m, of cetyl CH 2), 2.70 (170H , br, -C 2 H 4 -N-) 3 3.70 ( 23H, m, -NH-) d: It was confirmed from the proton ratio of 0.88 and 2.70 that 12.3% of cetyl groups were introduced.
化合物名， P18C20.6 ( アルキル化度 20.6%) の合成 PEI (6)1. Og をエタノール 10ml に溶解し、 セチルプロマイ ド 1.19g (1.19ml) をゆつく り と添加した。 窒素フロー、 撹拌をしながら 75 Cで 反応させ、 8時間後、 TLCにてセチルプロマイ ドの消失を確認して合成を 終了した。 次に、 蒸留水を 150ml加え、 限外ろ過 （amiconYMl)により精 製、 フリーズドライにより水を除去してポリマーを得た。 収率 92.8¾； 1 HNMR(CDC13 ) δ ： 0.88 (26H,t，CH3- ), 1.25(207H,m,cetylの CH2 ), 2.70 (155H, br,-C2H4-N-), 5.15(44H,m,-NH-) (5 : 0.88と 2.70のプロ トン 比からセチル基が 20.6%導入されていることを確認した。 Synthesis of compound name, P18C20.6 (alkylation degree 20.6%) PEI (6) 1. Og was dissolved in 10 ml of ethanol, and 1.19 g (1.19 ml) of cetylpromide was added slowly. The reaction was carried out at 75 C with stirring and nitrogen flow. After 8 hours, the disappearance of cetyl bromide was confirmed by TLC, and the synthesis was terminated. Next, 150 ml of distilled water was added, purified by ultrafiltration (amiconYMl), and water was removed by freeze drying to obtain a polymer. Yield 92.8¾; 1 HNMR (CDC1 3) δ: 0.88 (26H, t, CH 3 -), 1.25 (207H, m, of cetyl CH 2), 2.70 (155H , br, -C 2 H 4 -N- ), 5.15 (44H, m, -NH-) (5: 0.88 and 2.70) showed that 20.6% of cetyl groups were introduced.
[実施例 1 1 ] ス トック溶液の調製 [Example 11] Preparation of stock solution
実施例 1 0で合成した 9種の誘導体を各々滅菌蒸留水に溶解し、 pHを 7付近に調製した。 水で溶解し難い化合物は 50°Cで 15- 30分加熱、 pH調 製後、 プローブ型超音波 （BR0NS0N社、 20Dutycycle、 5分） で処理した c 全てのキャ リア一溶液は最後にフィル夕一 （DISMIC- 25cs、 Cellulose acetate, 0.2 m, ADVANTEC T0Y0)で濾過した。 Each of the nine derivatives synthesized in Example 10 was dissolved in sterilized distilled water to adjust the pH to around 7. It was dissolved in water hardly compound 15 30 min heating at 50 ° C, after made pH adjustment, the probe type ultrasonic (BR0NS0N Co., 20Dutycycle, 5 minutes) of was treated with c every career first solution is finally filled evening The solution was filtered through one (DISMIC-25cs, Cellulose acetate, 0.2 m, ADVANTEC T0Y0).
キヤリァー溶液の濃度はァミンニ トロゲンのモル濃度とした。 即ち、 分子量 600のポリエチレンィ ミンの濃度はモノマーの分子量を 43とし、 43mg/mlを lOOmM ( 100nmol/ 1) の陽電荷モル数とした。 一方、 アルキ ル化ポリエチレンイ ミン溶液の濃度は導入したアルキル基の分子量と導 入数を補正して算出した。 これらのアルキル化ポリエチレンィ ミ ンのス トック溶液は使用時まで 4°Cで保存した。  The concentration of the carrier solution was the molar concentration of the amine nitrogen. That is, the concentration of polyethyleneimine having a molecular weight of 600 was set to 43 as the molecular weight of the monomer, and 43 mg / ml was defined as the number of positively charged moles of 100 mM (100 nmol / 1). On the other hand, the concentration of the alkylated polyethyleneimine solution was calculated by correcting the molecular weight of the introduced alkyl group and the number of introduced alkyl groups. Stock solutions of these alkylated polyethyleneimines were stored at 4 ° C until use.
[実施例 12] プラス ミ ド溶液の調製法 [Example 12] Method for preparing plasmid solution
/3-ガラク トシダーゼ （LacZ) 遺伝子 （pCMVbeta(Clontech 社）に由来 する） をブラスミ ド pCAGGS (Hum Gene Ther. 1998; 9:1701-7 ) に挿入 し、 プラスミ ド pCAG-LZ15を構築した。 このプラスミ ドのス トック溶液 (5mg DNA/ml TE)を細胞培養用培地の！)- MEM (GIBC0BRL社製）で希釈し 58 ig DNA/mlの DNA溶液を調製した。 l〃g DNAの負電荷モル数は 3nmol、 58〃g DNAの負電荷モル数は 58 /g x 3n mol=174 nmol とした。 The / 3-galactosidase (LacZ) gene (derived from pCMVbeta (Clontech)) was inserted into plasmid pCAGGS (Hum Gene Ther. 1998; 9: 1701-7) to construct plasmid pCAG-LZ15. Stock solution of this plasmid (5mg DNA / ml TE) in cell culture medium! )-Diluted with MEM (manufactured by GIBCO BRL) to prepare a DNA solution of 58 ig DNA / ml. The mole number of negative charge of l〃g DNA was 3 nmol, and the mole number of negative charge of 58 負 g DNA was 58 / gx 3 nmol = 174 nmol.
[実施例 1 3 ] 各種誘導体キヤリァー溶液の調製法 [Example 13] Methods for preparing various derivative carrier solutions
N/P (N： キャ リア一のニトロゲンの陽電荷モル数/ P： DNA のリン酸を 負電荷モル数の比） が 18 等量となるよう実施例 1 1のス トック溶液を The stock solution of Example 11 was prepared so that N / P (N: mole number of positive charge of nitrogen per carrier / P: ratio of mole number of negative charge to phosphoric acid of DNA) became 18 equivalents.
D-MEMで調製した。 Prepared with D-MEM.
[実施例 1 4 ] DNA複合体の形成法 [Example 14] Method of forming DNA complex
1.5mlエツペン ドルフチューブに実施例 1 2の DNA溶液 100〃1を入れ、 次いで実施例 13のキヤリァー溶液 100 1を加えて軽くボルテックスで 混合後、 室温で 30分以上放置し、 DNA複合体 （N/P=18等量） を形成させ た。 この操作は遺伝子導入 （DNA の トランスフエクシヨン） の直前に行 つた。  Put 100ml1 of the DNA solution of Example 12 in a 1.5 ml Eppendorf tube, then add 1001 of the carrier solution of Example 13 and gently mix by vortexing. Then, leave the mixture at room temperature for 30 minutes or more to mix the DNA complex (N / P = 18 equivalents). This procedure was performed immediately before gene transfer (transfection of DNA).
[実施例 1 5 ] ヒ ト肝癌細胞への in vitro 遺伝子導入 [Example 15] In vitro gene transfer into human hepatoma cells
DNAの遺伝子導入 18時間前にヒ ト肝癌細胞の Hep G2 を 24-ゥ χルデ ィ ヅシュに 30,000細胞数/ゥエルとなるようシ-ドした。遺伝子導入直前 に細胞を MEM で 2 回洗浄した。 実施例 6 の DNA と複合体溶液を
Figure imgf000030_0001
〃 1/ゥヱルとなるよう MEM および血清添加 （50%FBS) MEM で希釈しこの遺伝子導入溶液を細胞 200〃1/ゥエルとなるよう加えた。 5%炭酸ガス培養器で 37°Cで 3時間培養後、 遺伝子導入溶液を除き、 血 清 （10%FBS)を含む MEM培地で 2回洗浄、 次いで同培地を 1ml/ゥエルと なるよう加えて 5%炭酸ガス培養器で 37°Cで 48時間培養した。 対照の LipofectAMINE (GIBC0BRL, 2mg/ml)は DNA： Lipof ectAMINE=290 zg： \μ. gの比率で OPTI-MEM培地（GIBCOBRいで MA複合体を形成させ同量の DNA を用いた。 Eighteen hours before DNA gene transfer, HepG2 of human hepatoma cells was seeded in a 24-well dish at 30,000 cells / well. Cells were washed twice with MEM immediately before gene transfer. The complex solution of DNA and Example 6
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The cells were diluted with MEM and serum-supplemented (50% FBS) MEM so that the concentration became 1 / ゥ ヱ, and this gene transfer solution was added so that the cells became 200 1 / ゥ. After culturing at 37 ° C for 3 hours in a 5% carbon dioxide incubator, remove the gene transfer solution, wash twice with MEM medium containing serum (10% FBS), and then add the same medium to 1 ml / well. The cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 48 hours. Control LipofectAMINE (GIBC0BRL, 2mg / ml) DNA: LipofectAMINE = 290 zg: \ μ. An OPTI-MEM medium (GIBCOBR was used to form a MA complex at the ratio of g) and the same amount of DNA was used.
[実施例 1 6 ] Lac Z 活性の測定 [Example 16] Measurement of Lac Z activity
実施例 1 4の細胞の培地を除き、 D- PBS (-) (日研生物医学研究所） で 2 回洗浄、 培養細胞溶解試薬、 LC^ (商品名 ： ピツカジーン、 和光純薬販 売） を 100/ 1/ゥヱルとなるよう加え、 室温で 15分放置、 小型のプロ一 ブ型超音波装置 （UR-20P、 トミー精ェ社製、 Power 10)で 5秒間処理して 細胞を破壊した。 この細胞溶解液をゥエルから 0.5mlエツペン ドルフチ ュ一ブに移し、 遠心 （l，200rpm、 3分、 室温） した上清を LacZ活性の測 定に供した。  Example 14 Except for the cell culture medium of 4, the cells were washed twice with D-PBS (-) (Nikken Institute of Biomedical Research) and cultured cell lysis reagent, LC ^ (trade name: Pitka Gene, Wako Pure Chemical Sales) was used. The cells were added to 100/1 / よ う, left at room temperature for 15 minutes, and treated with a small probe-type ultrasonic device (UR-20P, manufactured by Tommy Seie, Power 10) for 5 seconds to destroy the cells. This cell lysate was transferred from a well to a 0.5 ml eppendorf tube, and the supernatant obtained by centrifugation (1, 200 rpm, 3 minutes, room temperature) was used for measurement of LacZ activity.
LacZ活性の測定は TR0PIX， Inc社のプロ トコールに従った。 各々の遺 伝子導入実験はト リプリケート （triplicate)で行い LacZ活性は細胞蛋 白（mg)/測定時間（1秒間） 当たりの平均 light unit士 SDで表示した。 細 胞蛋白は BCA法 （Pierce社） によった。  LacZ activity was measured according to the protocol of TR0PIX, Inc. Each gene transfer experiment was performed in triplicate, and the LacZ activity was expressed as SD of the average light unit per cell protein (mg) / measurement time (1 second). Cell protein was determined by the BCA method (Pierce).
[実施例 1 Ί ] アルキル化分岐ポリエチレンイ ミン誘導体の in vitro 遺伝子発現 [Example 1] Gene expression in vitro of alkylated branched polyethyleneimine derivative
アルキル化分岐型ポリェチレンイ ミン -DNA複合体の HepG2細胞に対す る LacZ遺伝子の発現を比較して表 1に示した。 数値は平均値 ±SD (n=3) を示す。 分子量 600のポリエチレンィ ミンにアルキル基を導入すること で遺伝子発現は増強した。 また、 セチル基 （C=16) を導入した P6C24.5、 P6C17.5 と DNA の DNA複合体の遺伝子発現は最も高く、 Lipof ectAMINE に比べ血清非存在下で遺伝子導入した時は約 4倍、50%血清存在下で形質 転換した時は 10倍以上高い値を示した。  Table 1 compares the expression of the LacZ gene in HepG2 cells by the alkylated branched polyethyleneimine-DNA complex. The numerical values indicate the mean ± SD (n = 3). Gene expression was enhanced by introducing an alkyl group into polyethyleneimine having a molecular weight of 600. In addition, the gene expression of the DNA complex of P6C24.5 and P6C17.5 with cetyl group (C = 16) and DNA was the highest, and it was about 4 times higher when transfected in the absence of serum than LipofectAMINE. When transformed in the presence of 50% serum, the value was 10 times higher.
セチル誘導体につきポリエチレンィ ミンの分子量を比較したが分子量 600が 1，800より高い値を示した The molecular weight of polyethyleneimine was compared for cetyl derivatives. 600 was higher than 1,800
表 1  table 1
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Figure imgf000032_0001
[実施例 1 8 ] リボソームとの 遺伝子発現比較 [Example 18] Comparison of gene expression with ribosome
P6C24.5 と DNAとの複合体の遺伝子発現をリポソ一ムと DNAの複合体 (PCL) と比較した。 リボソーム組成は P6C24.5/D0PE (1:1， モル比） と し調製法は実施例 3に準じた。 DNA複合体の調製法は実施例 12- 14に準 じた。 細胞は正常ゥシ脳血管内皮細胞 （BBMC、 セルシステムズ社、 大日 本製薬株式会社販売）を用い、実施例 15と同様の方法で遺伝子導入を行 つ 7こ。  The gene expression of the complex of P6C24.5 and DNA was compared with that of liposome and DNA complex (PCL). The ribosome composition was P6C24.5 / D0PE (1: 1, molar ratio), and the preparation method was according to Example 3. The method for preparing the DNA complex was in accordance with Examples 12-14. The cells were transfected in the same manner as in Example 15 using normal cerebral vascular endothelial cells (BBMC, sold by Cell Systems, Inc., Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
結果を表 2に示す。 表中、 PCLは P6C24.5/D0PE (1:1、 モル比）を示し、 数値は平均値土 SD (n=3)を示す。 PCL と DNA複合体の遺伝子発現は、 血 清非存在下で遺伝子導入 し た時、 P6C24.5 単独 と ほぼ同等、 LipofectAMINEの約 10倍高い値であった。 一方、 血清存在下で遺伝子導 入すると、 PCL と DNA複合体の遺伝子発現は、 P6C24.5単独の 10倍以上、 LipofectAMINEの約 200倍高い値であった。 Table 2 shows the results. In the table, PCL indicates P6C24.5 / D0PE (1: 1, molar ratio), and the numerical value indicates average soil SD (n = 3). Gene expression of PCL and DNA complex When transfected in the absence of lysate, it was almost equivalent to P6C24.5 alone, about 10 times higher than LipofectAMINE. On the other hand, when the gene was transfected in the presence of serum, the gene expression of the PCL and DNA complex was more than 10 times higher than that of P6C24.5 alone and about 200 times higher than that of LipofectAMINE.
表 2  Table 2
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[実施例 1 9 ] アルキル化直鎖エチレンィ ミンの合成 [Example 19] Synthesis of alkylated linear ethyleneimine
図 9-10に示した合成ル一トに従い、 図 11に示した 3種のアルキル化 直鎖型エチレンィ ミンを合成した。 以下に合成法を示す。 化合物 1 2の合成 （図 9 )  According to the synthesis route shown in Fig. 9-10, three types of alkylated linear ethyleneimine shown in Fig. 11 were synthesized. The following shows the synthesis method. Synthesis of Compound 12 (Figure 9)
水素化ナ ト リウム （60¾鉱油懸濁物、 0.462 g、 11.6 mmol) をジメチル ホルムアミ ド （160 ml) に懸濁させ、 氷冷下にてテ トラエチレンペン夕 ミンペン夕 トシレート （化合物 1 1、 10.1 g、 10.5 mmol) のジメチルホ ルムアミ ド （40 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間撹拌した後、 氷冷下 3-[(tert-プチルジメチルシリル）ォキシ]-卜ブロモプロパン （2.92 g、 11.5 mmol) を滴下した。 反応液を室温で 20時間撹拌した後、 水中に注 ぎ、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて飽和食塩水で洗い、 乾燥 '濃縮した。 残渣をシリカゲル （500 g) を用いたカラムクロマ トグ ラフィ一にかけ、 へキサン-酢酸ェチル （2:1) で溶出された分画を集め て、化合物 2 (3.57 g)を白色の粉末として得た。収率 30%； NMR (CDC1 3 ) δ： 0.024 (6Η, s), 0.88 (9H， s), 1.65-1.78 (2H, m)， 2.39 (3H, s), 2.41 (3H, s)， 2.42 (3H， s), 2.44 (3H, s)， 2.45 (3H， s)， 3.10-3.45 (18H, m), 3.58 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.39 (1H， t, J=5.9 Hz), 7.23-7.38 (10H, m), 7.65-7.83 (10H, m). FAB MS m/z ： 1132 [M+H]+. 化合物 1 3の合成 （図 9 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.462 g, 11.6 mmol) was suspended in dimethylformamide (160 ml), and the mixture was stirred under ice-cooling for tetraethylenepentamine. g, 10.5 mmol) in dimethylformamide (40 ml) was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, 3-[(tert-butyldimethylsilyl) oxy] -tribromopropane (2.92 g, 11.5 mmol) was added dropwise under ice cooling. The reaction solution was stirred at room temperature for 20 hours, poured into water, and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (500 g), and the fraction eluted with hexane-ethyl acetate (2: 1) was collected. Thus, compound 2 (3.57 g) was obtained as a white powder. NMR (CDC13) δ: 0.024 (6Η, s), 0.88 (9H, s), 1.65-1.78 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.44 (3H, s), 2.45 (3H, s), 3.10-3.45 (18H, m), 3.58 (2H, t, J = 6.0 Hz), 5.39 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.23-7.38 (10H, m), 7.65-7.83 (10H, m). FAB MS m / z: 1132 [M + H] +. Synthesis of compound 13 (Figure 9)
水素化ナ ト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.0644 g 1.61 mmol) をジメチ ルホルムアミ ド （24ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 1 2 (1.52 g、 1.34 mmol) のジメチルホルムアミ ド （6 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1 時間撹拌した後、 氷冷下 卜ブロモへキサデカン （491 1.61 mmol) を滴下した。 反応液を室温で 6時間撹拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸ェチ ルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃縮し た。 残渣をシリカゲル （ 35 g) を用いたカラムクロマ トグラフィーにか け、 へキサン-酢酸ェチル （3:1) で溶出された分画を集めて、 化合物 1 3 (1.64 g) を白色の粉末として得た。 収率 90% ； Ή MR (CDC13) δ： 0.023 (6Η, s), 0.80-0.95 (3H, m), 0.88 (9H, s)， 1.10-1.35 (26H, m), 1.42-1.55 (2H, m), 1.64-1.80 (2H, m), 2.40 (6H, s), 2.42 (6H， s)， 2.43 (3H, s)， 3.03-3.11 (2H, m)， 3.16-3.23 (2H， m), 3.25-3.45 (16H， m)， 3.58 (2H, t, J=5.9 Hz), 7.25-7.36 (10H, m), 7.71-7.86 (10H, m). FAB MS m/z ： 1356 [M+H]+. 化合物 1 4の合成 （図 9 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.0644 g 1.61 mmol) was suspended in dimethylformamide (24 ml), and dimethylformamide of compound 12 (1.52 g, 1.34 mmol) was added under ice cooling. (6 ml) The solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, tribromohexadecane (491 1.61 mmol) was added dropwise under ice cooling. After the reaction solution was stirred at room temperature for 6 hours, it was poured into water and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography on silica gel (35 g), and the fractions eluted with hexane-ethyl acetate (3: 1) were collected to give Compound 13 (1.64 g) as a white powder. Was. Yield 90%; Ή MR (CDC1 3) δ : 0.023 (6Η, s), 0.80-0.95 (3H, m), 0.88 (9H, s), 1.10-1.35 (26H, m), 1.42-1.55 (2H , m), 1.64-1.80 (2H, m), 2.40 (6H, s), 2.42 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.11 (2H, m), 3.16-3.23 (2H, m ), 3.25-3.45 (16H, m), 3.58 (2H, t, J = 5.9 Hz), 7.25-7.36 (10H, m), 7.71-7.86 (10H, m). FAB MS m / z: 1356 [M + H] + . Synthesis of Compound 14 (Figure 9)
化合物 1 2 (1.47 g 1.30 mmol) および 卜プロモ ドデカン （373 1、 1.56 mmol) から、 化合物 1 3の合成と同様に操作し、 化合物 1 4 (1.48 g) を白色の粉末として得た。 収率 88% ； !H NMR (CDC13 ) δ :0.023 (6Η, s), 0.80-0.95 (3H, m), 0.88 (9H, s)， 1.10-1.35 (18H, m)， 1.41-1.58 (2H, m)， 1.65-1.80 (2H, m)， 2.40 (6H， s)， 2.41 (6H， s)， 2.43 (3H, s), 3.03-3.11 (2H, m)， 3.16-3.23 (2H, m)， 3.25-3.45 (16H， m)， 3.58 (2H, t， J=5.9 Hz), 7.25-7.36 (通， m), 7.71-7.81 (10H, m). FAB MS m/z ： 1300 [M+H]+. 化合物 1 5の合成 （図 9 ) Compound 14 (1.48 g) was obtained as a white powder from compound 12 (1.47 g 1.30 mmol) and topromododecan (3731, 1.56 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 13. Yield 88%; H NMR (CDC1 3) δ :! 0.023 (6Η, s), 0.80-0.95 (3H, m), 0.88 (9H, s), 1.10-1.35 (18H, m), 1.41-1.58 (2H, m), 1.65-1.80 (2H, m), 2.40 (6H, s), 2.41 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.11 (2H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 3.25-3.45 (16H, m), 3.58 (2H, t, J = 5.9 Hz), 7.25-7.36 (m, m), 7.71-7.81 (10H, m). FAB MS m / z: 1300 [M + H] + . Synthesis of compound 15 (Figure 9)
化合物 1 2 (0.803 g、 0.709 mmol) および 1 -プロモオクタン （147〃 1、 0.851 mmol) から、 化合物 1 3の合成と同様に操作し、 化合物 1 5 (0.730 g) を白色の粉末として得た。 収率 83% ； JH NMR (CDC13 ) δ： 0.023 (6H， s)， 0.87 (3H, t, J=6.6 Hz), 0.88 (9H, s)， 1.10-1.35 (10H, m), 1.45-1.57 (2H， m), 1.66-1.77 (2H, m)， 2.40 (6H， s), 2.42 (6H， s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.12 (2H, m), 3.15-3.24 (2H, m), 3.23-3.45 (16H, m)， 3.58 (2H, t, J=5.9Hz), 7.26-7.35 (10H, m), 7.70-7.81 (遺， m). FAB MS m/z ： 1244 [M+H]+. 化合物 1 6の合成 （図 9 ) From compound 12 (0.803 g, 0.709 mmol) and 1-promooctane (147〃1, 0.851 mmol), the same operation as in the synthesis of compound 13 was performed to obtain compound 15 (0.730 g) as a white powder. . 83% yield; J H NMR (CDC1 3) δ: 0.023 (6H, s), 0.87 (3H, t, J = 6.6 Hz), 0.88 (9H, s), 1.10-1.35 (10H, m), 1.45 -1.57 (2H, m), 1.66-1.77 (2H, m), 2.40 (6H, s), 2.42 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.12 (2H, m), 3.15-3.24 (2H, m), 3.23-3.45 (16H, m), 3.58 (2H, t, J = 5.9Hz), 7.26-7.35 (10H, m), 7.70-7.81 (rest, m). FAB MS m / z : 1244 [M + H] + . Synthesis of compound 16 (Fig. 9)
化合物 1 3 (1.63 g、 1.20 mmol) のテ トラヒ ドロフラン （33 ml) 溶 液に、 テ トラブチルアンモニゥムフルオリ ドのテ トラヒ ドロフラン （ 1M) 溶液 （1.44 ml、 1.44 mmol) を氷冷下にて滴下した。 室温で 1.5時間撹 拌した後、 反応液を水で希釈し、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を 水洗 ·乾燥 ' 濃縮し、 得られた残渣をシリカゲル （30 g) を用いたカラ ムクロマトグラフィーにかけた。 へキサン-酢酸ェチル （1:1) で溶出さ れた分画を集めて、 表記の化合物 （1.30 g) を白色の粉末として得た。 収率 87% ； XH NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (3Η, t, J=7.0Hz)， 1.15-1.34 (26H， m)， 1.45-1.55 (2H， m), 1.74-1.84 (2H, m), 2.26 (1H, t, J=6.2Hz, -OH), 2.405 (3H， s)， 2.415 (3H, s)， 2.422 (6H， s)， 2.43 (3H, s)， 3.02- 3.10 (2H， m), 3.22 (2H, t, J=6.6 Hz), 3.25-3.46 (16H， m), 3.66-3.76 (2H， m), 7.26-7.35 (10H, m)， 7.70-7.80 (10H， m). FAB MS m/z ： 1242[M+H]+. 化合物 17の合成 （図 9 ) To a solution of compound 13 (1.63 g, 1.20 mmol) in tetrahydrofuran (33 ml) was added a solution of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran (1M) (1.44 ml, 1.44 mmol) under ice cooling. And dropped. After stirring at room temperature for 1.5 hours, the reaction solution was diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The extract was washed with water, dried and concentrated, and the obtained residue was subjected to column chromatography using silica gel (30 g). The fractions eluted with hexane-ethyl acetate (1: 1) were collected to give the title compound (1.30 g) as a white powder. 87% yield; X H NMR (CDC1 3) δ: 0.88 (3Η, t, J = 7.0Hz), 1.15-1.34 (26H, m), 1.45-1.55 (2H, m), 1.74-1.84 (2H, m), 2.26 (1H, t, J = 6.2Hz, -OH), 2.405 (3H, s), 2.415 (3H, s), 2.422 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.02- 3.10 (2H, m), 3.22 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.25 -3.46 (16H, m), 3.66-3.76 (2H, m), 7.26-7.35 (10H, m), 7.70-7.80 (10H, m). FAB MS m / z: 1242 [M + H] + . Synthesis of 17 (Figure 9)
化合物 1 4 (1.47 g、 1.13mmol) およびテ トラプチルアンモニゥムフ ルオリ ドのテ トラヒ ドロフラン （1M) 溶液 （1.36 ml、 1.36 mmol) から 出発し、 化合物 1 6の合成と同様に操作し、 化合物 1 7 (1.21 g) を白 色の粉末として得た。 収率 91% ； !H NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (3Η, t, J=7.0Hz), 1.16-1.35 (18H， m), 1.44-1.56 (2H, m), 1.74-1.85 (2H, m), 2.27 (1H, t, J=6.0 Hz, -OH), 2.405 (3H, s), 2.415 (3H， s)， 2.423 (6H, s), 2.43 (3H， s)， 3.02-3.12 (2H， m), 3.22 (2H, t， J=6.8Hz)， 3.25-3.45 (16H, m)， 3.66-3.74 (2H, m), 7.26-7.35 (10H, m)， 7.70-7.80 (通, m). FAB MS m/z ： 1186 [M+H]+. 化合物 18の合成 （図 9) Starting from Compound 14 (1.47 g, 1.13 mmol) and a solution of Tetrabutylammonium Fluoride in Tetrahydrofuran (1M) (1.36 ml, 1.36 mmol), the same procedure as in the synthesis of Compound 16 was carried out. 17 (1.21 g) was obtained as a white powder. 91% yield; H NMR (CDC1 3) δ :! 0.88 (3Η, t, J = 7.0Hz), 1.16-1.35 (18H, m), 1.44-1.56 (2H, m), 1.74-1.85 (2H, m), 2.27 (1H, t, J = 6.0 Hz, -OH), 2.405 (3H, s), 2.415 (3H, s), 2.423 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.02-3.12 ( 2H, m), 3.22 (2H, t, J = 6.8Hz), 3.25-3.45 (16H, m), 3.66-3.74 (2H, m), 7.26-7.35 (10H, m), 7.70-7.80 (through, m). FAB MS m / z: 1186 [M + H] +. Synthesis of compound 18 (Fig. 9)
化合物 1 5 (0.590 g, 0.474 mmol) およびテ トラプチルアンモニゥム フルオリ ドのテ トラヒ ドロフラン （1M) 溶液 （0.57 ml、 0.57 mmol) か ら出発し、 化合物 1 6の合成と同様に操作し、 化合物 1 8 (0.513g) を 白色の粉末として得た。 収率 96% ； ^ NMR (CDC13 ) δ： 0.87 (3Η, t, J=7.0Hz), 1.15-1.35 (10H, m), 1.44-1.56 (2H, m), 1.75-1.85 (2H, m)， 2.26 (1H， t， J=6.2 Hz, -OH), 2.41 (3H, s)， 2.415 (3H， s), 2.423 (6H, s)， 2.43 (3H， s)， 3.02-3.12 (2H, m)， 3.22 (2H， t， J=6.6 Hz), 3.26-3.44 (16H， m), 3.66-3.75 (2H， m), 7.27-7.35 (10H, m), 7.70-7.80 (10H, m). FAB MS m/z ： 1130 [M+H]+. 化合物 1 9の合成 （図 9 ) Starting from Compound 15 (0.590 g, 0.474 mmol) and a solution of Tetratylammonium Fluoride in Tetrahydrofuran (1M) (0.57 ml, 0.57 mmol), the same procedure was followed as in the synthesis of Compound 16. Compound 18 (0.513 g) was obtained as a white powder. 96% yield; ^ NMR (CDC1 3) δ : 0.87 (3Η, t, J = 7.0Hz), 1.15-1.35 (10H, m), 1.44-1.56 (2H, m), 1.75-1.85 (2H, m ), 2.26 (1H, t, J = 6.2 Hz, -OH), 2.41 (3H, s), 2.415 (3H, s), 2.423 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.02-3.12 (2H , m), 3.22 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.26-3.44 (16H, m), 3.66-3.75 (2H, m), 7.27-7.35 (10H, m), 7.70-7.80 (10H, m ). FAB MS m / z: 1130 [M + H] + . Synthesis of Compound 19 (Figure 9)
化合物 1 6 (1.30 g、 1.05 mmol) と四臭化炭素 （1.25 g、 3.77 mmol) のメチレンクロ リ ド （26 ml) 溶液に、 ト リフエニルホスフィ ン （ 0.988 g、 3.77 mmol) を氷冷下で加えた。 氷冷下で 20分間、 更に室温で 1時間撹 拌した後、反応液を減圧下で乾固した。得られた残渣をシリ力ゲル（60 g) を用いたカラムクロマ トグラフィ一にかけた。 へキサン-酢酸ェチル (3:1) で溶出された分画を集めて、 表記の化合物 （1.34g) を白色の粉 末として得た。 収率 98% ； !H NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (3Η, t, J=7.0 Hz)， 1.15-1.35 (26H, m), 1.43-1.55 (2H, m), 2.07-2.18 (2H， m)， 2.405 (3H， s), 2.413 (3H, s)， 2.42 (6H, s)， 2.43 (3H, s), 3.02-3.12 (2H, m), 3.18-3.46 (20H, m), 7.26-7.36 (10H, m)， 7.70-7.82 (10H, m). FAB MS m/z ： 1304 and 1306 [M+H]+. 化合物 2 0の合成 （図 9 ) To a solution of compound 16 (1.30 g, 1.05 mmol) and carbon tetrabromide (1.25 g, 3.77 mmol) in methylene chloride (26 ml) was added triphenylphosphine (0.988 g, 3.77 mmol) under ice cooling. Added in. After stirring under ice cooling for 20 minutes and further at room temperature for 1 hour, the reaction solution was evaporated to dryness under reduced pressure. The obtained residue was subjected to column chromatography using a gel (60 g). The fractions eluted with hexane-ethyl acetate (3: 1) were collected to give the title compound (1.34 g) as a white powder. Yield 98%; H NMR (CDC1 3) δ :! 0.88 (3Η, t, J = 7.0 Hz), 1.15-1.35 (26H, m), 1.43-1.55 (2H, m), 2.07-2.18 (2H, m), 2.405 (3H, s), 2.413 (3H, s), 2.42 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.02-3.12 (2H, m), 3.18-3.46 (20H, m), 7.26 -7.36 (10H, m), 7.70-7.82 (10H, m). FAB MS m / z: 1304 and 1306 [M + H] + . Synthesis of compound 20 (Fig. 9)
化合物 1 7 (1.19 g, 1.10 mmol), 四臭化炭素 （1.20 g、 3.61龍 ol)、 ト リフエニルホスフィ ン （0.947 g、 3.61 mmol) から、 化合物 1 9の合 成と同様に操作し、 化合物 2 0 (1.21 g) を白色の粉末として得た。 収 率 97% ； !H NMR (CDCI3 ) δ： 0.88 (3H， t, J=7.0 Hz), 1.15-1.35 (18H， m)， 1.44-1.56 (2H, m), 2.07-2.18 (2H， m), 2.405 (3H, s)， 2.414 (3H， s), 2.42 (6H， s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.10 (2H， m), 3.14-3.45 (20H, m), 7.26-7.36 (通， m)， 7.70-7.82 (10H, m). FAB MS m/z ： 1248 and 1250 [M+H]+. 化合物 2 1の合成 （図 9 ) From compound 17 (1.19 g, 1.10 mmol), carbon tetrabromide (1.20 g, 3.61 mmol) and triphenylphosphine (0.947 g, 3.61 mmol), the same procedure was used as in the synthesis of compound 19. Compound 20 (1.21 g) was obtained as a white powder. 97% yield; H NMR (CDCI3) δ: ! 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.15-1.35 (18H, m), 1.44-1.56 (2H, m), 2.07-2.18 (2H, m ), 2.405 (3H, s), 2.414 (3H, s), 2.42 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.10 (2H, m), 3.14-3.45 (20H, m), 7.26- 7.36 (m, m), 7.70-7.82 (10H, m). FAB MS m / z: 1248 and 1250 [M + H] +. Synthesis of compound 21 (Fig. 9)
化合物 1 8 (1.00 g、 0.886 mmol), 四臭化炭素 （1.06 g、 3.19 mmol) ト リフェニルホスフィ ン （0.837 g、 3.19 mmol) から、 化合物 1 9の合 成と同様に操作し、 化合物 2 1 (1.05 g) を白色の粉末として得た。 収 率 99% ； XH NMR (CDC13 ) δ： 0.87 (3Η, t, J=7.0 Hz), 1.16-1.34 (10H, m), 1.44-1.55 (2H， m)， 2.07-2.18 (2H， m), 2.405 (3H, s), 2.413 (3H， s)， 2.42 (6H, s)， 2.43 (3H, s), 3.03-3.10 (2H, m), 3.19-3.44 (20H, m), 7.26-7.36 (10H, m)， 7.70-7.84 (10H, m). FAB MS m/z ： 1192 and 1194 [読] +. 化合物 2 2の合成 （図 1 0 ) Compound 18 (1.00 g, 0.886 mmol), carbon tetrabromide (1.06 g, 3.19 mmol) The same operation as in the synthesis of compound 19 was performed from triphenylphosphine (0.837 g, 3.19 mmol) to obtain compound 21 (1.05 g) as a white powder. 99% yield; X H NMR (CDC1 3) δ: 0.87 (3Η, t, J = 7.0 Hz), 1.16-1.34 (10H, m), 1.44-1.55 (2H, m), 2.07-2.18 (2H, m), 2.405 (3H, s), 2.413 (3H, s), 2.42 (6H, s), 2.43 (3H, s), 3.03-3.10 (2H, m), 3.19-3.44 (20H, m), 7.26 -7.36 (10H, m), 7.70-7.84 (10H, m). FAB MS m / z: 1192 and 1194 [read] + . Synthesis of compound 22 (Fig. 10)
水素化ナト リウム （60¾鉱油懸濁物、 0.0404 g、 1.01 mmol) をジメチ ルホルムアミ ド （28 ml) に懸濁させ、 氷冷下にてテ トラエチレンペン夕 ミンペン夕 トシレ一ト （化合物 1 1、 0.404 g、 0.421 mmol) のジメチル ホルムアミ ド （2 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間撹拌した後、 氷冷 下化合物 1 9 (1.32 g、 1.01 mmol) のジメチルホルムアミ ド （4 ml) 溶 液を滴下した。 反応液を室温で 18時間撹拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸ェ チルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて飽和食塩水で洗い、 乾燥 ·濃縮 した。 残渣をシリカゲル （ 60 g) を用いたカラムクロマ トグラフィーに かけた。 へキサン-酢酸ェチル （2:1) で溶出される粗生成物を、 液体中 圧クロマトグラフィー （ローバ一 Bカラム） で精製した。 へキサン-酢酸 ェチル （3:2) で溶出される分画を集めて、 表記の化合物 （1.07 g) を白 色の粉末として得た。 収率 75% ； ^ NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (6H， t, J=7.0 Hz), 1.15-1.35 (52H, m), 1.43-1.56 (4H, m)， 1.90-2.04 (4H, m), 2.36 (12H， s)， 2.37 (3H, s)， 2.38 (12H, s)， 2.39 (12H, s), 2.41 (6H, s)， 3.02-3.46 (60H， m), 7.24-7.33 (30H, m), 7.67-7.82 (30H， m). 化合物 2 3の合成 （図 1 0 ) 化合物 1 1 (0.384 g、 0.399 mmol) および化合物 2 0 ( 1.20 g、 0.959 mmol) から、 化合物 2 2の合成と同様に操作し、 化合物 2 3 ( 1.02 g) を白色の粉末として得た。 収率 77% ； MR (CDC13 ) 6： 0.88 (6H, t, J=7.0 Hz), 1.15-1.35 (36H， m), 1.43-1.56 (4H， m), 1.90-2.04 (4H, m)， 2.36 (12H, s), 2.37 (3H, s)， 2.38 (12H， s)， 2.39 (12H， s)， 2.41 (6H, s)， 3.02-3.46 (60H, m), 7.23-7.34 (30H， m), 7.67-7.82 (30H， m). 化合物 2 4の合成 （図 1 0 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.0404 g, 1.01 mmol) was suspended in dimethylformamide (28 ml), and the mixture was stirred under ice-cooling with tetraethylenepentine. A solution of 0.404 g (0.421 mmol) in dimethylformamide (2 ml) was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, a solution of compound 19 (1.32 g, 1.01 mmol) in dimethylformamide (4 ml) was added dropwise under ice cooling. The reaction solution was stirred at room temperature for 18 hours, poured into water, and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (60 g). The crude product eluted with hexane-ethyl acetate (2: 1) was purified by liquid medium pressure chromatography (Rova-B column). The fractions eluted with hexane-ethyl acetate (3: 2) were collected to give the title compound (1.07 g) as a white powder. Yield 75%; ^ NMR (CDC1 3 ) δ: 0.88 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.15-1.35 (52H, m), 1.43-1.56 (4H, m), 1.90-2.04 (4H, m ), 2.36 (12H, s), 2.37 (3H, s), 2.38 (12H, s), 2.39 (12H, s), 2.41 (6H, s), 3.02-3.46 (60H, m), 7.24-7.33 ( 30H, m), 7.67-7.82 (30H, m). Synthesis of compound 23 (Fig. 10) Compound 23 (1.02 g) was obtained as a white powder from compound 11 (0.384 g, 0.399 mmol) and compound 20 (1.20 g, 0.959 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 22. 77% yield; MR (CDC1 3) 6: 0.88 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.15-1.35 (36H, m), 1.43-1.56 (4H, m), 1.90-2.04 (4H, m) , 2.36 (12H, s), 2.37 (3H, s), 2.38 (12H, s), 2.39 (12H, s), 2.41 (6H, s), 3.02-3.46 (60H, m), 7.23-7.34 (30H , M), 7.67-7.82 (30H, m). Synthesis of compound 24 (Fig. 10)
化合物 1 1 (0.387 g、 0.402 mmol) および化合物 2 1 (1.15 g、 0.966 mmol) から、 化合物 2 2の合成と同様に操作し、 化合物 2 4 (0.962 g) を白色の粉末として得た。 収率 75% ； XH NMR (CDC13 ) δ： 0.87 (6Η, t, J=7.0 Hz), 1.15-1.35 (20H, m), 1.42-1.56 (4H， m), 1.90-2.04 (4H, m), 2.36 (12H, s), 2.37 (3H, s)， 2.38 (12H, s), 2.39 (12H， s), 2.41 (6H， s)， 3.02-3.46 (60H， m), 7.23-7.34 (30H, m)， 7.66-7.82 (30H, m). 化合物 2 5の合成 （図 1 0 ) Compound 24 (0.962 g) was obtained as a white powder from compound 11 (0.387 g, 0.402 mmol) and compound 21 (1.15 g, 0.966 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 22. Yield 75%; X H NMR (CDC1 3) δ: 0.87 (6Η, t, J = 7.0 Hz), 1.15-1.35 (20H, m), 1.42-1.56 (4H, m), 1.90-2.04 (4H, m), 2.36 (12H, s), 2.37 (3H, s), 2.38 (12H, s), 2.39 (12H, s), 2.41 (6H, s), 3.02-3.46 (60H, m), 7.23-7.34 (30H, m), 7.66-7.82 (30H, m). Synthesis of Compound 25 (Figure 10)
化合物 2 2 (0.752 g、 0.220皿 ol) に 25¾臭化水素 ·酢酸溶液 （15ml) を加え、 100°Cで 18時間反応させた。 放冷後、 溶媒を溜去して得られる 残渣にエーテルを添加し、 濾過することによ り表記の化合物 HBr 塩 (0.395 g) を白色の粉末として得た。 収率 78% ； 'HNMR (D20) δ： 0.83 (6H， t， J=7.1 Hz), 1.18-1.45 (52H, m), 1.63-1.76 (4H, m)， 2.15-2.28 (4H, m)， 3.07-3.16 (4H， m), 3.22-3.33 (8H， m), 3.40-3.64 (48H, m). FAB MS m/z ： 1096 [ +H]+. 化合物 2 6の合成 （図 1 0 ) To the compound 22 (0.752 g, 0.220 dish ol) was added a 25¾ hydrogen bromide / acetic acid solution (15 ml), and the mixture was reacted at 100 ° C for 18 hours. After allowing to cool, ether was added to the residue obtained by evaporating the solvent, and the mixture was filtered to obtain the title compound HBr salt (0.395 g) as a white powder. Yield 78%; 'HNMR (D 2 0) δ: 0.83 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.18-1.45 (52H, m), 1.63-1.76 (4H, m), 2.15-2.28 (4H, m), 3.07-3.16 (4H, m), 3.22-3.33 (8H, m), 3.40-3.64 (48H, m). FAB MS m / z: 1096 [+ H] + . Synthesis of compound 26 (Figure Ten )
化合物 2 3 (0.814 , 0.247 mmol) から化合物 2 5の合成と同様に操 P The same procedure was used to synthesize Compound 25 from Compound 23 (0.814, 0.247 mmol). P
38  38
作し、 表記の化合物 HBr 塩 （0.429 g) を白色の粉末として得た。 収率 79% ； JH NMR (D20) δ： 0.85 (6H， t, J=7.1 Hz), 1.18-1.44 (36H， m), 1.63-1.76 (4H, m), 2.14-2.27 (4H, m), 3.08-3.16 (4H， m)， 3.25-3.34 (8H, m), 3.43-3.64 (棚, m). FAB MS m/z ： 984 [M+H]+. 化合物 2 7の合成 （図 1 0 ) The title compound HBr salt (0.429 g) was obtained as a white powder. 79% yield; J H NMR (D 2 0 ) δ: 0.85 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.18-1.44 (36H, m), 1.63-1.76 (4H, m), 2.14-2.27 (4H , m), 3.08-3.16 (4H, m), 3.25-3.34 (8H, m), 3.43-3.64 (shelf, m). FAB MS m / z: 984 [M + H] +. Synthesis of Compound 27 (Fig. 10)
化合物 2 4 (0.808 0.254 mmol) から化合物 2 5の合成と同様に操 作し、 表記の化合物 HBr 塩 （0.451 ) を白色の粉末として得た。 収率 85% ； XH NMR (D20) δ： 0.85 (6H， t, J=7.0 Hz), 1.18-1.45 (20H, m), 1.63-1.76 (4H, m)， 2.14-2.29 (4H, m)， 3.08-3.16 (4H, m), 3.25-3.33 (8H, ni), 3.43-3.63 (48H, m). FAB MS m/z ： 872 [M+H]+. The same operation as in the synthesis of compound 25 was carried out from compound 24 (0.808 0.254 mmol) to obtain the title compound HBr salt (0.451) as a white powder. 85% yield; X H NMR (D 2 0 ) δ: 0.85 (6H, t, J = 7.0 Hz), 1.18-1.45 (20H, m), 1.63-1.76 (4H, m), 2.14-2.29 (4H , m), 3.08-3.16 (4H, m), 3.25-3.33 (8H, ni), 3.43-3.63 (48H, m). FAB MS m / z: 872 [M + H] + .
[実施例 2 0 ] アルキル化直鎖スペルミンの合成 [Example 20] Synthesis of alkylated linear spermine
図 12-15に示した合成ルートに従い、図 16に示した 5種のアルキル化 直鎖型スペルミンを合成した。 以下に合成法を示す。 化合物 2 8の合成 （図 1 2 )  According to the synthetic route shown in Fig. 12-15, five types of alkylated linear spermine shown in Fig. 16 were synthesized. The following shows the synthesis method. Synthesis of Compound 28 (Figure 12)
スペルミン四塩酸塩 （10.2g、 29.4 mmol)から、 Raymondらの方法 （J. Med. Chem. 1988, 31， 1183-1190) に従い、 化合物 2 8 (22.6 g)を白色 の粉末として得た。 収率 94%. 化合物 2 9の合成 （図 1 2 )  Compound 28 (22.6 g) was obtained from spermine tetrahydrochloride (10.2 g, 29.4 mmol) as a white powder according to the method of Raymond et al. (J. Med. Chem. 1988, 31, 1183-1190). Yield 94%. Synthesis of Compound 29 (Figure 12)
水素化ナト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.313g、 7.81 mmol) をジメチル ホルムアミ ド （90 ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 2 8 (5.33 g、 6.51 mmol) のジメチルホルムアミ ド （10ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間 撹拌した後、 氷冷下 卜ブロモへキサデカン （2.39ΙΒ1、 7.81 mmol) を滴 下した。 反応液を室温で 6時間撹拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸ェチルで 2 回抽出した。 抽出液を合わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃 縮した。 残渣をシリカゲル （130 g) を用いたカラムクロマトグラフィー にかけ、 へキサン-酢酸ェチル （2:1) で溶出された分画を集めて、 化合 物 2 9 (2.30 g) を粘稠な油状物として得た。 収率 34% ； ^ NMR (CDC1 3 ) δ： 0.88 (3Η, t, J=6,8 Hz), 1.13-1.35 (26H， ) , 1.37-1.49 (2H, m), 1.50-1.59 (4H, m), 1.74-1.90 (4H, m), 2.36 (3H， s), 2.41 (3H, s)， 2.42 (3H, s), 2.43 (3H, s)， 2.96-3.16 (14H, m)， 5.30 (1H， t, J=6.4 Hz), 7.24-7.34 (8H, m), 7.61-7.77 (8H, m). FAB MS m/z ： 1042 [M+H] Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.313 g, 7.81 mmol) was suspended in dimethylformamide (90 ml), and Compound 28 (5.33 g, 6.51 mmol) of dimethylformamide was suspended under ice cooling. (10 ml) solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, tribromohexadecane (2.39ΙΒ1, 7.81 mmol) was added dropwise under ice cooling. I dropped it. After the reaction solution was stirred at room temperature for 6 hours, it was poured into water and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (130 g), and the fraction eluted with hexane-ethyl acetate (2: 1) was collected to give compound 29 (2.30 g) as a viscous oil. Obtained. Yield 34%; ^ NMR (CDC13) δ: 0.88 (3Η, t, J = 6,8 Hz), 1.13-1.35 (26H,), 1.37-1.49 (2H, m), 1.50-1.59 (4H, m), 1.74-1.90 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.96-3.16 (14H, m), 5.30 (1H, t, J = 6.4 Hz), 7.24-7.34 (8H, m), 7.61-7.77 (8H, m). FAB MS m / z: 1042 [M + H]
化合物 3 0の合成 （図 1 2 ) Synthesis of Compound 30 (Figure 12)
化合物 2 8 (4.06 g、 4.88 mmol) および 1-ブロモ ドデカン （1.40 ml、 5.86 mmol) から、 化合物 2 9の合成と同様に操作し、 化合物 3 0 (1.73 g) を油状物として得た。 収率 36% ； !H NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (3Η, t, J=7.0 Hz), 1.12-1.36 (18H， m), 1.37-1.49 (2H, m), 1.50-1.63 (4H， m), 1.72-1.90 (4H, m)， 2.36 (3H， s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.43 (3H， s)， 2.95-3.22 (14H, m), 5.30 (1H, t, J=6.6 Hz), 7.24-7.34 (8H, m), 7.60-7.76 (8H， m). APCI MS m/z ： 987 [M+H]+. 化合物 3 1の合成 （図 1 2 ) The same operation as in the synthesis of compound 29 was carried out from compound 28 (4.06 g, 4.88 mmol) and 1-bromododecane (1.40 ml, 5.86 mmol) to obtain compound 30 (1.73 g) as an oil. 36% yield; H NMR (CDC1 3) δ :! 0.88 (3Η, t, J = 7.0 Hz), 1.12-1.36 (18H, m), 1.37-1.49 (2H, m), 1.50-1.63 (4H, m), 1.72-1.90 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.95-3.22 (14H, m), 5.30 (1H, t, J = 6.6 Hz), 7.24-7.34 (8H, m), 7.60-7.76 (8H, m). APCI MS m / z: 987 [M + H] + . Synthesis of Compound 31 (Figure 1 2)
化合物 2 8 (4.00 g、 4.88 mmol) および 卜ブロモオクタン （1.02ml、 5.86 mmol) から、 化合物 2 9の合成と同様に操作し、 化合物 3 1 (1.73 g) を油状物として得た。 収率 38% ； !H NMR (CDCI3) δ： 0.87 (3H， t， J=7.0 Hz), 1.13-1.36 (10H， m)， 1.38-1.47 (2H， m), 1.51-1.60 (4H， m), 1.72-1.90 (4H, m), 2.35 (3H， s), 2.41 (3H， s)， 2.42 (3H， s), 2.43 (3H， s), 2.95-3.22 (14H， m), 5.30 (1H, t, J=6.8 Hz), 7.24-7.35 (8H， in), 7.61-7.76 (8H， m). APCI MS m/z ： 931 [M+H] + . 化合物 3 2の合成 （図 1 2 ) Compound 31 (1.73 g) was obtained as an oil from compound 28 (4.00 g, 4.88 mmol) and tribromooctane (1.02 ml, 5.86 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 29. ! H NMR (CDCI3) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.13-1.36 (10H, m), 1.38-1.47 (2H, m), 1.51-1.60 (4H, m ), 1.72-1.90 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.95-3.22 (14H, m), 5.30 (1H, t, J = 6.8 Hz), 7.24-7.35 (8H, in), 7.61-7.76 (8H, m). APCI MS m / z : 931 [M + H] + . Synthesis of Compound 32 (Figure 12)
化合物 2 8 (5.06 gs 6.10 mmol) および 卜ブロモブタン （797〃1、 7.33 mmol) から、 化合物 2 9の合成と同様に操作し、 化合物 3 2 (2.11 g) を油状物として得た。 収率 39% ； XH NMR (CDC13 ) δ： 0.87 (3H， t， J二 7.3 Hz), 1.16-1.34 (2H, m), 1.36-1.48 (2H, m), 1.50-1.64 (4H, m), 1.68-1.94 (4H, m), 2.35 (3H， s)， 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s)， 2.43 (3H， s), 2.90-3.22 (14H, m), 5.30 (1H, t, J=6.6 Hz), 7.20-7.38 (8H, m), 7.64-7.77 (8H， m). APCI MS m/z ： 875 [M+H]+. 化合物 3 3の合成 （図 1 2 ) From compound 28 (5.06 g s 6.10 mmol) and tribromobutane (797〃1, 7.33 mmol), the same operation as in the synthesis of compound 29 was performed to obtain compound 32 (2.11 g) as an oil. 39% yield; X H NMR (CDC1 3) δ: 0.87 (3H, t, J two 7.3 Hz), 1.16-1.34 (2H, m), 1.36-1.48 (2H, m), 1.50-1.64 (4H, m), 1.68-1.94 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.90-3.22 (14H, m), 5.30 (1H, t, J = 6.6 Hz), 7.20-7.38 (8H, m), 7.64-7.77 (8H, m). APCI MS m / z: 875 [M + H] + . Synthesis of compound 33 (Figure 1 2)
水素化ナ ト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.582 g、 14.5 mmol) をジメチル ホルムアミ ド （85ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 2 8 (4.96 g、 6.06 mmol) のジメチルホルムアミ ド （15ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間 撹拌した後、氷冷下 3 - [( t e r t -プチルジメチルシリル）ォキシ ] - 1 -ブロモ プロパン （3.68 g、 14.5 mmol) を滴下した。 反応液を室温で 16時間撹 拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて 蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 ·濃縮した。 残渣をシリカゲル （160g) を用いたカラムクロマ トグラフィーにかけ、 へキサン-酢酸ェチル（3:1) で溶出された分画を集めて、 化合物 33 (5.94 g) を油状物として得た。 収率 84% ； XH NMR (CDCI3 ) δ： 0.022 (12H, s)， 0.84-0.91 (18H， m), 1.46-1.62 (4H, m)， 1.62-1.76 (4H, m), 1.78-1.96 (4H， m), 2.41 (6H, s), 2.42 (6H, s)， 3.00-3.26 ( 16H， m)， 3.56 (4H, t， J=5.9 Hz), 7.25-7.34 (8H, m)， 7.63-7.71 (8H, m). FAB MS m/z ： 1185 [M+Na]+. 化合物 34の合成 （図 1 2 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.582 g, 14.5 mmol) was suspended in dimethylformamide (85 ml), and Compound 28 (4.96 g, 6.06 mmol) of dimethylformamide was suspended under ice cooling. (15 ml) solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, 3-[(tert-butyldimethylsilyl) oxy] -1-bromopropane (3.68 g, 14.5 mmol) was added dropwise under ice cooling. The reaction solution was stirred at room temperature for 16 hours, poured into water, and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (160 g), and the fraction eluted with hexane-ethyl acetate (3: 1) was collected to obtain Compound 33 (5.94 g) as an oil. 84% yield; X H NMR (CDCI3) δ : 0.022 (12H, s), 0.84-0.91 (18H, m), 1.46-1.62 (4H, m), 1.62-1.76 (4H, m), 1.78-1.96 (4H, m), 2.41 (6H, s), 2.42 (6H, s), 3.00-3.26 (16H, m), 3.56 (4H, t, J = 5.9 Hz), 7.25-7.34 (8H, m), 7.63-7.71 (8H, m). FAB MS m / z: 1185 [M + Na] + . Synthesis of compound 34 (Fig. 12)
化合物 3 3 (5.94g、 5.10mmol) のテ トラヒ ドロフラン （100ml) 溶液 に、 テ トラプチルアンモニゥムフルオリ ドのテ トラヒ ドロフラン （1M) 溶液 （12.2ml、 12.2mmol) を氷冷下にて滴下した。 室温で 1時間撹拌 した後、 反応液を水で希釈し、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を抽 出液を合わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃縮し、 得られた残 渣をシリカゲル （120g) を用いたカラムクロマ トグラフィーにかけた。 へキサン-酢酸ェチル （1:4) で溶出された分画を集めて、 表記の化合物 (4.55g) を白色の粉末と して得た。 収率 95% ； 'Η NMR (CDC13 )5： 1.54-1.68 (4H, m), 1.70-1.82 (4H, m)， 1.83-1.96 (4H, m), 2.42 (6H， s), 2.43 (6H, s), 2.52 (2H， t, J=5.8 Hz, -OH), 3.06-3.26 (16H, m), 3.70 (4H, q， J=5.7Hz), 7.25-7.35 (8H， m), 7.62-7.73 (8H， m). FAB MS m/z ： 935 [M+H]+. 化合物 3 5の合成 （図 1 2 ) To a solution of compound 33 (5.94 g, 5.10 mmol) in tetrahydrofuran (100 ml) was added a solution of tetrahydrofuran (1 M) in tetrahydrofuran (1 M) (12.2 ml, 12.2 mmol) dropwise under ice-cooling. did. After stirring at room temperature for 1 hour, the reaction solution was diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The extract was combined with the extract, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated, and the obtained residue was subjected to column chromatography using silica gel (120 g). The fractions eluted with hexane-ethyl acetate (1: 4) were collected to give the title compound (4.55 g) as a white powder. Yield 95%; 'Η NMR (CDC1 3) 5: 1.54-1.68 (4H, m), 1.70-1.82 (4H, m), 1.83-1.96 (4H, m), 2.42 (6H, s), 2.43 ( 6H, s), 2.52 (2H, t, J = 5.8 Hz, -OH), 3.06-3.26 (16H, m), 3.70 (4H, q, J = 5.7Hz), 7.25-7.35 (8H, m), 7.62-7.73 (8H, m). FAB MS m / z: 935 [M + H] + . Synthesis of compound 35 (Fig. 12)
化合物 3 4 (4.55g、 4.87mmol) と四臭化炭素 （7.75g、 23.4mmol) の メチレンクロ リ ド （80ml) 溶液に、 ト リフ工ニルホスフィ ン （6.14g、 23.4mmol) を氷冷下で加えた。 氷冷下で 1時間撹拌した後、 反応液を減 圧下で乾固した。 得られた残渣をシリカゲル （150g) を用いたカラムク 口マトグラフィ一にかけた。 0.5% メ夕ノ一ル-メチレンクロリ ドで溶 出された分画を集めて、 表記の化合物 （4.37g) を白色の粉末として得た, 収率 90% ； JH NMR (CDC13 ) δ： 1.52-1.68 (4H， m), 1.80-1.94 (4H, m)， 2.04-2.18 (4H, m), 2.42 (12H, s)， 3.07-3.26 (16H, m)， 3.39 (4H, t, J=6.4 Hz), 7.23-7.37 (8H, m), 7.60-7.77 (8H, m). APCI MS m/z ： 1059, 1061 and 1063 [M+H]+. 化合物 3 6の合成 （図 1 3 ) To a solution of compound 34 (4.55 g, 4.87 mmol) and carbon tetrabromide (7.75 g, 23.4 mmol) in methylene chloride (80 ml) was added trifylnilphosphine (6.14 g, 23.4 mmol) under ice cooling. Was. After stirring for 1 hour under ice cooling, the reaction solution was dried under reduced pressure. The obtained residue was subjected to column chromatography using silica gel (150 g). 0.5% main Yunoichiru - Mechirenkurori attracted dissolved out was fractionated de, the title compound a (4.37 g) as a white powder, yield 90%; J H NMR (CDC1 3) δ: 1.52-1.68 (4H, m), 1.80-1.94 (4H, m), 2.04-2.18 (4H, m), 2.42 (12H, s), 3.07-3.26 (16H, m), 3.39 (4H, t, J = 6.4 Hz), 7.23-7.37 (8H, m), 7.60-7.77 (8H, m). APCI MS m / z: 1059, 1061 and 1063 [M + H] +. Synthesis of compound 36 (Figure 13)
水素化ナト リウム （60 鉱油懸濁物、 0.209g、 5.23mmol) をジメチルホ ルムアミ ド（45ml)に懸濁させ、氷冷下にて化合物 2 9 (2.27g、 2.18mmol) のジメチルホルムアミ ド （8ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間撹拌した 後、氷冷下化合物 3 5 (0.964g、0.908mmol)のジメチルホルムアミ ド（7ml) 溶液を滴下した。 反応液を室温で 2時間撹拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸 ェチルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 ' 濃縮した。 残渣を少量のメチレンクロリ ドに溶解し、 さらに酢酸 ェチルを過剰に加えて室温で 3時間放置した。 析出した結晶を吸引濾過 にて回収して、 表記の化合物 （2.04g) を白色の粉末として得た。 収率 75%。 JH NMR (CDC13 ) δ： 0.88 (6Η, t, J=7.0Hz), 1.15-1.35 (52H， m), 1.37-1.47 (4H, m), 1.48-1.61 (14H, m), 1.74-1.94 ( 14H, m), 2.39 (36H, s)， 2.95-3.22 (48H, m), 7.24-7.33 (24H, m), 7.58-7.75 (24H, m). 化合物 3 7の合成 （図 1 3 ) Sodium hydride (60 mineral oil suspension, 0.209 g, 5.23 mmol) was suspended in dimethylformamide (45 ml), and the compound 29 (2.27 g, 2.18 mmol) in dimethylformamide (45 ml) was cooled under ice-cooling. 8 ml) solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, a solution of compound 35 (0.964 g, 0.908 mmol) in dimethylformamide (7 ml) was added dropwise under ice cooling. The reaction solution was stirred at room temperature for 2 hours, poured into water, and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was dissolved in a small amount of methylene chloride, and excess ethyl acetate was added, and the mixture was left at room temperature for 3 hours. The precipitated crystals were collected by suction filtration to give the title compound (2.04 g) as a white powder. Yield 75%. J H NMR (CDC1 3) δ : 0.88 (6Η, t, J = 7.0Hz), 1.15-1.35 (52H, m), 1.37-1.47 (4H, m), 1.48-1.61 (14H, m), 1.74- 1.94 (14H, m), 2.39 (36H, s), 2.95-3.22 (48H, m), 7.24-7.33 (24H, m), 7.58-7.75 (24H, m). Synthesis of compound 37 (Fig. 13 )
化合物 3 0 (1.73 g、 1.79 mmol) および 化合物 3 5 (0.844 g, 0.795 mmol) から、 化合物 3 6の合成と同様に操作し、 化合物 3 7 ( 1.09 g) を白色の粉末として得た。 収率 48% ； !H NMR (CDCI3 )5： 0.88 (6H, t, J=7.0Hz), 1.12-1.36 (36H, m)， 1.38-1.46 (4H, m), 1.48-1.63 (14H， m), 1.74-1.92 (14H, m), 2.39 (36H， s), 2.95-3.25 (48H, m)， 7.20-7.35 (24H: m)， 7.55-7.75 (24H, m). FAB MS m/z ： 2871 [M+H]+. 化合物 3 8の合成 （図 1 3 ) Compound 37 (1.09 g) was obtained as a white powder from compound 30 (1.73 g, 1.79 mmol) and compound 35 (0.844 g, 0.795 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 36. 48% yield; H NMR (CDCI3) 5: ! 0.88 (6H, t, J = 7.0Hz), 1.12-1.36 (36H, m), 1.38-1.46 (4H, m), 1.48-1.63 (14H, m ), 1.74-1.92 (14H, m), 2.39 (36H, s), 2.95-3.25 (48H, m), 7.20-7.35 (24H : m), 7.55-7.75 (24H, m). FAB MS m / z : 2871 [M + H] + . Synthesis of compound 38 (Figure 13)
化合物 3 1 (1.73 g、 1.86 mmol) および 化合物 3 5 (0.820 , 0.773 mmol) から、 化合物 3 6の合成と同様に操作し、 化合物 3 8 ( 1.39 g) を白色の粉末として得た。 収率 65% ； NMR (CDC1J δ： 0.87 (6Η, t, J=7.0Hz), 1.10-1.33 (20H, m), 1.38-1.47 (4H， m), 1.48-1.63 (14H， m), 1.74-1.94 (14H, m), 2.39 (36H, s)， 3.00-3.15 (標， m)， 7.23-7.33 (24H， m), 7.60-7.75 (24H, m). FAB MS m/z ： 2783 [M+Na]+. 化合物 3 9の合成 （図 1 3 ) From compound 31 (1.73 g, 1.86 mmol) and compound 35 (0.820, 0.773 mmol), operate in the same manner as in the synthesis of compound 36 to obtain compound 38 (1.39 g). Was obtained as a white powder. NMR (CDC1J δ: 0.87 (6Η, t, J = 7.0 Hz), 1.10-1.33 (20H, m), 1.38-1.47 (4H, m), 1.48-1.63 (14H, m), 1.74 -1.94 (14H, m), 2.39 (36H, s), 3.00-3.15 (standard, m), 7.23-7.33 (24H, m), 7.60-7.75 (24H, m). FAB MS m / z: 2783 [ M + Na] + . Synthesis of Compound 39 (Figure 13)
化合物 3 2 ( 1.59 g 1.83 mmol) および 化合物 3 5 (0.882 g、 0.831 mmol) から、 化合物 3 6の合成と同様に操作し、 化合物 3 9 ( 1.33 g) を白色の粉末として得た。 収率 60% ； JH NMR (CDC13 ) 6： 0.86 (6H, t, J=7.3Hz), 1.26-1.27 (4H, m), 1.34-1.48 (4H, m), 1.48-1.66 (14H, m), 1.74-1.94 (14H, m), 2.39 (36H, s), 2.95-3.25 (48H, m)， 7.22-7.36 (24H, m), 7.55-7.75 (24H， m). FAB MS m/z ： 2649 [M+H]+. 化合物 40の合成 （図 1 3 ) From compound 32 (1.59 g, 1.83 mmol) and compound 35 (0.882 g, 0.831 mmol), the same operation as in the synthesis of compound 36 was performed to obtain compound 39 (1.33 g) as a white powder. Yield 60%; J H NMR (CDC1 3) 6: 0.86 (6H, t, J = 7.3Hz), 1.26-1.27 (4H, m), 1.34-1.48 (4H, m), 1.48-1.66 (14H, m), 1.74-1.94 (14H, m), 2.39 (36H, s), 2.95-3.25 (48H, m), 7.22-7.36 (24H, m), 7.55-7.75 (24H, m). FAB MS m / z: 2649 [M + H] + . Synthesis of compound 40 (Fig. 13)
化合物 3 6 (1.01 g、 0.339 mmol) に 25%臭化水素 '酢酸溶液 （10ml) を加え、 100°Cで 6時間反応させた。 さらに 25¾臭化水素 ·酢酸溶液 （10 ml) を追加して 100°Cで 19時間反応させた。 放冷後、 溶媒を溜去して得 られる残渣にェ一テルを添加し、 濾過することにより表記の化合物 HBr 塩（0.628 g)を得た。収率 88%； !HNM (D20) δ： 0.88 (6H，s)， 1.20-1.45 (52H， m), 1.50-1.70 (4H， m), 1.75-1.90 (14H, m), 2.05-2.25 (14H, m), 3.00-3.30 (48H, m), APCI MS m/z ： 1135 [M+H]+. 化合物 4 1の合成 （図 1 3 ) To a compound 36 (1.01 g, 0.339 mmol) was added 25% hydrogen bromide'acetic acid solution (10 ml), and the mixture was reacted at 100 ° C for 6 hours. Further, a 25 ° hydrogen bromide / acetic acid solution (10 ml) was added, and the mixture was reacted at 100 ° C for 19 hours. After allowing to cool, ether was added to the residue obtained by evaporating the solvent, followed by filtration to obtain the title compound HBr salt (0.628 g). Yield 88%; HNM (D 2 0) δ :! 0.88 (6H, s), 1.20-1.45 (52H, m), 1.50-1.70 (4H, m), 1.75-1.90 (14H, m), 2.05- 2.25 (14H, m), 3.00-3.30 (48H, m), APCI MS m / z: 1135 [M + H] + . Synthesis of compound 41 (Fig. 13)
化合物 3 7 ( 1.09 g、 0.379 mmol) から、 化合物 4 0の合成と同様に 操作し、 化合物 4 1 (0.541 ) を得た。 収率 72% ； ln NMR (D20) δ： 0.85 (6H,t, J=7.1Hz), 1.18-1.43 (36H, m)， 1.60-1.72 (4H, m), P /JP /005 Compound 41 (0.541) was obtained from compound 37 (1.09 g, 0.379 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 40. 72% yield; l n NMR (D 2 0 ) δ: 0.85 (6H, t, J = 7.1Hz), 1.18-1.43 (36H, m), 1.60-1.72 (4H, m), P / JP / 005
44  44
1.73- 1.90 (14H, m)， 2.00-2.20 (14H, m)， 3.00-3.30 (48H, m), APCI MS πι/ζ ： 1023 [M+H]+. 化合物 4 2の合成 （図 1 3 ) 1.73- 1.90 (14H, m), 2.00-2.20 (14H, m), 3.00-3.30 (48H, m), APCI MS πι / ζ: 1023 [M + H] + . Synthesis of compound 42 (Fig. 13 )
化合物 3 8 ( 1.03 g、 0.363 mmol) から、 化合物 4 0の合成と同様に 操作し、 化合物 4 2 (0.280 g) を得た。 収率 41% ； !H NMR (D20) δ： 0.85 (6H,t, J=7.0Hz), 1.23-1.42 (20H, m), 1.60-1.73 (4H, m)，Compound 42 (0.280 g) was obtained from compound 38 (1.03 g, 0.363 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 40. 41% yield; H NMR (D 2 0) δ:! 0.85 (6H, t, J = 7.0Hz), 1.23-1.42 (20H, m), 1.60-1.73 (4H, m),
1.74- 1.89 (14H, m), 2.00-2.22 (14H, m)， 3.00-3.32 (48H, m)， APCI MS m/z ： 911 [M+H]+. 化合物 4 3の合成 （図 1 3 ) 1.74- 1.89 (14H, m), 2.00-2.22 (14H, m), 3.00-3.32 (48H, m), APCI MS m / z: 911 [M + H] + . Synthesis of compound 43 (Fig. 13 )
化合物 3 9 (1.14 g、 0.430 mmol) から、 化合物 4 0の合成と同様に 操作し、 化合物 4 3 (0.571 g) を得た。 収率 75% ； XH NMR (D20) δ： 0.91 (6H,t, J=7.6Hz)， 1.30-1.49 (4H, m)， 1.57-1.72 (4H， m)， 1.73-1.90 (14H, m), 2.03-2.23 (HH, m)， 3.00-3.32 (48H, m), APCI MS m/z ： 799 [M+H]+. 化合物 4 の合成 （図 1 4 ) Compound 43 (0.571 g) was obtained from compound 39 (1.14 g, 0.430 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 40. Yield 75%; X H NMR (D 2 0) δ: 0.91 (6H, t, J = 7.6Hz), 1.30-1.49 (4H, m), 1.57-1.72 (4H, m), 1.73-1.90 (14H , m), 2.03-2.23 (HH, m), 3.00-3.32 (48H, m), APCI MS m / z: 799 [M + H] + . Synthesis of Compound 4 (Figure 14)
水素化ナト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.544 g、 13.6龍01) をジメチル ホルムアミ ド （180 ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 2 8 (10.1 g、 12.4 mmol) のジメチルホルムアミ ド （20 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1時間撹拌した後、 氷冷下 3- [(tert-プチルジメチルシリル）ォキシ ]-；1- ブロモプロパン （3.44 g、 13.6 mmol) を滴下した。 反応液を室温で 17 時間撹拌した後、 水中に注ぎ、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を合 わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃縮した。 残渣をシリカゲル (250 g) を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、 へキサン-酢酸ェ チル （1:1) で溶出された分画を集めて、 化合物 4 4 (4.52 g) を白色の 粉末と して得た。 収率 37%。 NMR (CDC13 ) δ： 0.017 (6Η, s)， 0.84-0.89 (9H, s), 1.48-1.58 (4H， m)， 1.60-1.71 (2H, m)， 1.72-1.93 (4H, m), 2.41 (4H， s), 2.42 (4H， s)， 2.43 (4H, s)， 2.93-3.25 (14H, m), 3.55 (2H， t， J=6.0 Hz), 5.30 (1H, t, J=6.4 Hz ), 7.23-7.34 (8H， m)， 7.55-7.77 (8H， m). APCI MS m/z ： 991 [M+H]+. 化合物 4 5の合成 （図 1 4 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.544 g, 13.6 dragon 01) was suspended in dimethylformamide (180 ml), and Compound 28 (10.1 g, 12.4 mmol) in dimethylformamide was suspended under ice-cooling. An amide (20 ml) solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, 3-[(tert-butyldimethylsilyl) oxy]-; 1-bromopropane (3.44 g, 13.6 mmol) was added dropwise under ice cooling. The reaction solution was stirred at room temperature for 17 hours, poured into water, and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (250 g) to give hexane-acetic acid. The fractions eluted with chill (1: 1) were collected to give compound 44 (4.52 g) as a white powder. Yield 37%. NMR (CDC1 3) δ: 0.017 (6Η, s), 0.84-0.89 (9H, s), 1.48-1.58 (4H, m), 1.60-1.71 (2H, m), 1.72-1.93 (4H, m), 2.41 (4H, s), 2.42 (4H, s), 2.43 (4H, s), 2.93-3.25 (14H, m), 3.55 (2H, t, J = 6.0 Hz), 5.30 (1H, t, J = APCI MS m / z: 991 [M + H] + . Synthesis of compound 45 (6.4 Hz), 7.23-7.34 (8H, m), 7.55-7.77 (8H, m).
水素化ナト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.0499 g、 1.24 mmol) をジメチ ルホルムアミ ド （20 ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 4 4 (1.02 g、 1.04 mmol) のジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1 時間撹拌後、 氷冷下にて 化合物 3 5 (0.506g、 0.471mmol) のジメチル ホルムアミ ド （5ml) 溶液を滴下した。 反応液を室温で 22時間撹拌した 後、 水中に注ぎ、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 抽出液を合わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃縮した。 残渣をシリカゲル （30 g) を用い たカラムクロマトグラフィーにかけ、 へキサン-酢酸ェチル （1:1) で残 存する化合物 44を溶出した後、 5% メタノール-メチレンクロリ ドで 溶出された分画を集めて、 化合物 4 5 (0.92 g) を白色の粉末として得 た。 収率 68% ； ^ NMR (CDC13 ) δ： 0.013 (12H, m), 0.85-0.88 ( 18H， m), 1.45-1.58 (14H, m)， 1.60-1.74 (4H， m), 176-1.94 (14H， m), 2.30-2.48 (36H, m)， 2.95-3.25 (48H, m), 3.54 (4H， t， J=6.0 Hz), 7.23-7.34 (24H, m), 7.58-7.73 (24H, m). 化合物 4 6の合成 （図 1 4 ) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.0499 g, 1.24 mmol) was suspended in dimethylformamide (20 ml), and dimethylformamide of compound 44 (1.02 g, 1.04 mmol) was added under ice cooling. (5 ml) solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, a solution of compound 35 (0.506 g, 0.471 mmol) in dimethylformamide (5 ml) was added dropwise under ice cooling. After the reaction solution was stirred at room temperature for 22 hours, it was poured into water and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (30 g), and the remaining compound 44 was eluted with hexane-ethyl acetate (1: 1). The fraction eluted with 5% methanol-methylene chloride was collected. Compound 45 (0.92 g) was obtained as a white powder. 68% yield; ^ NMR (CDC1 3) δ : 0.013 (12H, m), 0.85-0.88 (18H, m), 1.45-1.58 (14H, m), 1.60-1.74 (4H, m), 176-1.94 (14H, m), 2.30-2.48 (36H, m), 2.95-3.25 (48H, m), 3.54 (4H, t, J = 6.0 Hz), 7.23-7.34 (24H, m), 7.58-7.73 (24H , m). Synthesis of compound 46 (Figure 14)
化合物 4 5 (0.901g、 0.313mmol) のテ トラヒ ドロフラン （18ml) 溶液 に、 テ トラプチルアンモニゥムフルオリ ドのテ トラヒ ドロフラン （ 1M) 溶液 （0.75ml、 0.75mmol) を氷冷下にて滴下した。 室温で 1時間撹拌し た後、 反応液を水で希釈し、 メチレンクロリ ドで 2回抽出した。 抽出液 を合わせて蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥 · 濃縮し、 得られた残渣を シリ力ゲル（ 17g)を用いたカラムクロマトグラフィーにかけた。 2% メ 夕ノール-メチレンクロ リ ドで溶出された分画を集めて、 表記の化合物 (0.780g) を白色の粉末として得た。 収率 94% ； JH NMR (CDC13)5： 1.46-1.60 ( 14H, m), 1.68-1.76 (4H， m), 1.78-1.94 (14H, m)， 2.40 (36H, s)， 2.47 (2H, t， J=6.0 Hz, -OH), 2.98-3.24 (48H, m), 3.67 (4H， q, J=5.9Hz), 7.24-7.33 (24H, m), 7.55-7.75 (24H, m). 化合物 4 7の合成 （図 1 5 ) A solution of compound 45 (0.901 g, 0.313 mmol) in tetrahydrofuran (18 ml) was added to tetrahydrofuran (1M) in tetrahydroammonium fluoride. The solution (0.75 ml, 0.75 mmol) was added dropwise under ice cooling. After stirring at room temperature for 1 hour, the reaction solution was diluted with water and extracted twice with methylene chloride. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated, and the obtained residue was subjected to column chromatography using a silica gel (17 g). The fractions eluted with 2% methanol-methylene chloride were collected to give the title compound (0.780 g) as a white powder. 94% yield; J H NMR (CDC1 3) 5: 1.46-1.60 (14H, m), 1.68-1.76 (4H, m), 1.78-1.94 (14H, m), 2.40 (36H, s), 2.47 ( 2H, t, J = 6.0 Hz, -OH), 2.98-3.24 (48H, m), 3.67 (4H, q, J = 5.9Hz), 7.24-7.33 (24H, m), 7.55-7.75 (24H, m ). Synthesis of compound 47 (Figure 15)
化合物 4 6 (0.761g、 0.286mmol) のメチレンクロリ ド U2ml) 溶液に 四臭化炭素 （0.947g、 2.86mmol) と ト リフエニルホスフィ ン （0.750g、 2.86mmol) を氷冷下で加えた。 室温で 1.5時間撹拌した後、 反応液を減 圧下で乾固した。 得られた残渣をシリ力ゲル （40g) を用いたカラムクロ マトグラフィ一にかけた。 へキサン-酢酸ェチル （1:3) で溶出された分 画を集めて、表記の化合物（0.744g)を白色の粉末として得た。収率 94%c XH NMR (CDC13 ) δ： 1.40-1.66 (14H, m), 174-1.97 (14H, m), 2.02- 2.16 (4H, m), 2.40 (36H, s)， 2.94-3.24 (48H, m), 3.37 (4H, t， J=6.4 Hz), 7.23-7.35 (8H， m)， 7.55-7.77 (24H, m). 化合物 4 8の合成 （図 1 5 ) To a solution of compound 46 (0.761 g, 0.286 mmol) in methylene chloride (2 ml) was added carbon tetrabromide (0.947 g, 2.86 mmol) and triphenylphosphine (0.750 g, 2.86 mmol) under ice cooling. After stirring at room temperature for 1.5 hours, the reaction solution was dried under reduced pressure. The obtained residue was subjected to column chromatography using a silica gel (40 g). The fractions eluted with hexane-ethyl acetate (1: 3) were collected to give the title compound (0.744 g) as a white powder. 94% c X H NMR (CDC1 3) δ: 1.40-1.66 (14H, m), 174-1.97 (14H, m), 2.02- 2.16 (4H, m), 2.40 (36H, s), 2.94- 3.24 (48H, m), 3.37 (4H, t, J = 6.4 Hz), 7.23-7.35 (8H, m), 7.55-7.77 (24H, m). Synthesis of compound 48 (Figure 15)
水素化ナト リウム （60%鉱油懸濁物、 0.0307 g、 0.769 mmol) をジメチ ルホルムアミ ド （18ml) に懸濁させ、 氷冷下にて化合物 2 9 (0.668 g、 0.641 mmol) のジメチルホルムアミ ド （5 ml) 溶液を滴下した。 室温で 1 時間撹袢後、 氷冷下にて 化合物 4 7 (0.731g、 0.263fflinol) のジメチ ルホルムアミ ド （5ml) 溶液を滴下した。 反応液を室温で 4時間撹拌した 後、 水中に注ぎ、 メチレンクロ リ ドで 2回抽出した。 抽出液を合わせて 蒸留水、 飽和食塩水で洗い、 乾燥，濃縮した。 残渣をシリカゲル （30g) を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、 へキサン-酢酸ェチル（1:1) で残存する化合物 29を溶出した後、 2% メタノール-メチレンクロリ ドで溶出された分画を集めて、 化合物 48 (0.761 g) を白色の粉末とし て得た。 収率 62% ； JH NMR (CDC13 ) δ ： 0.88 (6H， t， J=6.4 Hz), 1.12-1.34 (52H, m)， 1.40-1.48 (4H， m), 1.49-1.62 (24H, m)， 1.73- 1.95 (4H, m)， 2.38 (30H, s), 2.39 (30H， s), 2.97-3.27 (80H, m), 7.23-7.33 (40H, m), 7.55-7.74 (權， m). 化合物 49の合成 （図 1 5) Sodium hydride (60% mineral oil suspension, 0.0307 g, 0.769 mmol) was suspended in dimethylformamide (18 ml), and dimethylformamide of compound 29 (0.668 g, 0.641 mmol) was added under ice-cooling. (5 ml) The solution was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, the dimethyl compound of compound 47 (0.731 g, 0.263fflinol) was added under ice-cooling. A solution of formamide (5 ml) was added dropwise. After the reaction solution was stirred at room temperature for 4 hours, it was poured into water and extracted twice with methylene chloride. The extracts were combined, washed with distilled water and saturated saline, dried and concentrated. The residue was subjected to column chromatography using silica gel (30 g), and the remaining compound 29 was eluted with hexane-ethyl acetate (1: 1). The fraction eluted with 2% methanol-methylene chloride was collected. Compound 48 (0.761 g) was obtained as a white powder. 62% yield; J H NMR (CDC1 3) δ: 0.88 (6H, t, J = 6.4 Hz), 1.12-1.34 (52H, m), 1.40-1.48 (4H, m), 1.49-1.62 (24H, m), 1.73- 1.95 (4H, m), 2.38 (30H, s), 2.39 (30H, s), 2.97-3.27 (80H, m), 7.23-7.33 (40H, m), 7.55-7.74 (right, m). Synthesis of compound 49 (Fig. 15)
化合物 4 8 (0.742 g 0.158mmol) に 25%臭化水素 ·酢酸溶液 （ 15 ml) を加え、 100°Cで 4時間反応させた。 さらに 25%臭化水素 ·酢酸溶液（7.5 ml) を追加して 100°Cで 19時間反応させた。 放冷後、 溶媒を溜去して得 られる残渣にエーテルを添加し、 濾過することにより表記の化合物 HBr 塩（0.442 g)を得た。収率 86%； ^NMR (D20) δ： 0.93 (6H,m), 1.30-1.60 (52H, m)， 1.70-1.80 (4H， m)， 1.80-2.00 (24H, m), 2.10-2.35 (24H, m)， 3.08-3.48 (80H, m). APCI MS m/z ： 1619 [ +H]+. A 25% hydrogen bromide / acetic acid solution (15 ml) was added to compound 48 (0.742 g, 0.158 mmol), and the mixture was reacted at 100 ° C for 4 hours. Further, a 25% hydrogen bromide / acetic acid solution (7.5 ml) was added, and the mixture was reacted at 100 ° C for 19 hours. After allowing to cool, ether was added to the residue obtained by evaporating the solvent, and the mixture was filtered to obtain the title compound HBr salt (0.442 g). 86% yield; ^ NMR (D 20 ) δ: 0.93 (6H, m), 1.30-1.60 (52H, m), 1.70-1.80 (4H, m), 1.80-2.00 (24H, m), 2.10- 2.35 (24H, m), 3.08-3.48 (80H, m). APCI MS m / z: 1619 [+ H] + .
[実施例 2 1 ] ス トック溶液の調製 [Example 21] Preparation of stock solution
実施例 1 9、 2 0で合成した 8種の誘導体の HBr塩を秤量、 滅菌蒸留 水を加え、 lN-NaOHで pHを 7付近に調製後各々のス ト ック溶液を調製し た。 水で溶解し難い化合物は 80°Cで 15-30分加熱、 室温に戻して pH調 製後、 プローブ型超音波 （BR0NS0N社、 20Dutycycle、 5分） で処理した c 全てのキャ リア一溶液は最後にフィル夕一 （DISMIC-25cs、 Cellulose acetate, 0.2 m， ADVANTEC T0Y0)で濾過した。 キャリアー溶液の濃度 はァミンニトロゲンのモル濃度とした。 即ち、 ス トツク溶液は 10mM の (lOnmol/^1) 陽電荷モル数とした。 これらのス トック溶液は使用時ま で 4°Cで保存した。 使用時、 沈殿したス トック溶液は一旦、 80°Cで 15-30 分加熱溶解して用いた。 The HBr salts of the eight derivatives synthesized in Examples 19 and 20 were weighed, sterilized distilled water was added, and the pH was adjusted to around 7 with 1N-NaOH to prepare each stock solution. Sparingly soluble compounds with water 15-30 minutes heating at 80 ° C, after made pH adjusted to warm to room temperature, probe-type ultrasonic (BR0NS0N Co., 20Dutycycle, 5 minutes) of was treated with c every career first solution is Finally, Yuichi Phil (DISMIC-25cs, Cellulose acetate, 0.2 m, ADVANTEC T0Y0). The concentration of the carrier solution was the molar concentration of the amine nitrogen. That is, the stock solution was set to 10 mM (lOnmol / ^ 1) positive mole number. These stock solutions were stored at 4 ° C until use. At the time of use, the precipitated stock solution was heated and dissolved at 80 ° C for 15-30 minutes.
[実施例 2 2 ] アルキル化直鎖エチレンィ ミ ンの in vitro遺伝子導 入 [Example 22] In vitro gene transfer of alkylated linear ethyleneimine
アルキル化直鎖エチレンィ ミンのヒ ト肝癌細胞（Hep G2)に対する遺伝 子発現を検討した（表 3 )。 表中、 数値は平均値土 SD (n=3)を示す。 化合 物は TEL-D8、 TEL-D12, TEい D16を用い、 方法は実施例 12- 16に準じた。 これらの中で、 TEL-D16 は最も高い遺伝子発現を示した。 TEL- D16 の遺 伝子発現は トラ ンスフエクシヨ ン時の血清添加の有無にかかわらず LipofectAMINEの約 10倍高い値であつた。  Gene expression of alkylated linear ethyleneimine in human hepatoma cells (Hep G2) was examined (Table 3). In the table, the numerical values indicate the average soil SD (n = 3). The compounds used were TEL-D8, TEL-D12 and TE-D16, and the method was according to Examples 12-16. Of these, TEL-D16 showed the highest gene expression. The gene expression of TEL-D16 was about 10 times higher than that of LipofectAMINE regardless of the presence or absence of serum at the time of transfection.
表 3 遺伝子発現  Table 3 Gene expression
化合物  Compound
化合物名 ¾荷比 LacZ (RLU/wg · sec)  Compound name Load ratio LacZ (RLU / wgsec)
番号  Number
(eq) No serum 50% Serum  (eq) No serum 50% Serum
9 179±41 163±23  9 179 ± 41 163 ± 23
TEL-D8 27  TEL-D8 27
18 177±67 146±20  18 177 ± 67 146 ± 20
9 295±198 134±10  9 295 ± 198 134 ± 10
TEL-D12 26  TEL-D12 26
18 4,130±3,316 128±6  18 4,130 ± 3,316 128 ± 6
9 106,494±22,206 23,608±8,655  9 106,494 ± 22,206 23,608 ± 8,655
TEL-D16 25  TEL-D16 25
18 155,013±8,191 17,593±6,292  18 155,013 ± 8,191 17,593 ± 6,292
LipofectAMINE 9,345±9，573 2,373±1,620 [実施例 2 3 ] アルキル化直鎖スペルミ ンの ini v itro 遺伝子導入 アルキル化直鎖スペルミンのヒ ト肝癌細胞（Hep G2 )に対する遺伝子発 現を検討した。 表中、 数値は平均値土 SD ( n=3 )を示す。 化合物は T化合 物は TSL-D4、 TSL-D8, TSL-D12, TSL-D16, PSL-D16を用い、 方法は実施 例 12- 16に準じた。 LipofectAMINE 9,345 ± 9,573 2,373 ± 1,620 [Example 23] In vivo gene transfer of alkylated linear spermine The gene expression of alkylated linear spermine in human hepatoma cells (Hep G2) was examined. In the table, numerical values indicate the average soil SD (n = 3). The compound used was TSL-D4, TSL-D8, TSL-D12, TSL-D16, and PSL-D16 as the T compound, and the method was according to Examples 12-16.
結果を表 4に示した。 トランスフヱクシヨン時、 血清無添加の場合、 LipofectAMINEの遺伝子発現に比べて、 TSL-D8、 TSL-D16は 10倍以上、 また、 PSL-D16は 5倍以上高い値を示した。 一方、 血清添加では TSL-D16 は LipofectAMINEの 10倍以上高い値であつた。  Table 4 shows the results. At the time of transfection, when serum was not added, TSL-D8 and TSL-D16 showed 10 times or more higher than that of LipofectAMINE, and PSL-D16 showed 5 times or more higher than that of LipofectAMINE. On the other hand, when serum was added, TSL-D16 was 10 times higher than LipofectAMINE.
表 4  Table 4
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[実施例 2 4 ] ヒ ト滕臓癌細胞およびヒ ト神絰膠芽腫細胞の調製 ヒ 卜膝臓癌細胞 BxPc-3 ( Primary pancreatic adenocarc inoma, 大日 本製薬株式会社より入手） を 10%FBS (GIBC0BRL社製） を添加した RPMI 培地（GIBC0BRL社製）で 37°C、 C02培養器で培養した。 同様にヒ ト神経膠 芽腫 SK-N-MC( Glioblastoma, ATCCより入手）を 10%FBSを添加した D-MEM 培地（GIBC0BRL 社製）で 37°C、 C02培養器で培養した。 各々の細胞を tripsin処理後、氷冷した各々の培地で 3回洗浄後、 1x10の 8乗 cells/ml となるよう調製した。マウス皮下への移植は調製後 40分以内に行った。 [Example 24] Preparation of human liver cancer cells and human glioblastoma cells Human knee cancer cells BxPc-3 (Primary pancreatic adenocarc inoma, Dainichi Were incubated at 37 ° C, C0 2 incubator in RPMI medium to obtain) from the Pharmaceutical Co., Ltd. was added 10% FBS (GIBC0BRL Co.) (GIBC0BRL Co.). Similarly human glioblastoma SK-N-MC were incubated at 37 ° C, C0 2 incubator at D-MEM medium and the addition of 10% FBS (Glioblastoma, obtained from ATCC) (GIBC0BRL Co.). Each cell was treated with tripsin, washed three times with each ice-cooled medium, and adjusted to 1 × 10 8 cells / ml. Transplantation into mice subcutaneously was performed within 40 minutes after preparation.
[実施例 2 5 ] 皮下移植担癌マウスの作製 [Example 25] Preparation of subcutaneously transplanted tumor-bearing mouse
SCIDマウス （雄、 5週令、 日本クレア株式会社） の脇腹左右の 2ケ所 および背部上下の 2ケ所の計 4ケ所の皮下に実施例 2 4で調製した癌細 胞各々 0.2mlを投与した （注射針 29Gxl/2ガ、 テルモ株式会社）。 投与 2 週後、 生着したヒ ト脬臓癌細胞 BxPc-3 の腫瘍径は縦 0.5-0.8cm、 横 0.5-0.8cmであった。 一方、 ヒ ト神経膠芽腫 SK-N-MCの腫瘍径は縦 0.9- 1.4cm, 横 1.1- 1.75cmであった。  0.2 ml each of the cancer cells prepared in Example 24 was subcutaneously administered to SCID mice (male, 5 weeks old, Nippon Clea Co., Ltd.) subcutaneously at two sites on the left and right sides of the flank and two at the top and bottom of the back. Injection needle 29Gxl / 2ga, Terumo Corporation). Two weeks after administration, the engrafted human cancer cells BxPc-3 had a tumor diameter of 0.5-0.8 cm in length and 0.5-0.8 cm in width. On the other hand, the tumor diameter of human glioblastoma SK-N-MC was 0.9-1.4 cm in length and 1.1-1.75 cm in width.
[実施例 2 6 ] プラスミ ドの調製法 [Example 26] Method for preparing plasmid
クラゲの緑色蛋白質の GFP (Clontech 社、 pEGFP-Nl) をプラスミ ド pCAGGSに挿入したプラスミ ド pCAG-EGFPを構築した。 このプラスミ ドの ス トック溶液 （ 8mgDNA/ml TE) を 5%グルコース（抉桑薬品工業株式会 社、 ブドウ糖注射液）で希釈し 500〃g DNA/ml の DNA溶液を調製した。 1 gDNAの負電荷モル数は 3nmol、 500〃gDNAの負電荷モル数は 500〃gx 3 nmol = l,500nmol とした。  Plasmid pCAG-EGFP was constructed by inserting jellyfish green protein GFP (Clontech, pEGFP-Nl) into plasmid pCAGGS. A stock solution of this plasmid (8 mg DNA / ml TE) was diluted with 5% glucose (Gosou Pharmaceutical Co., Ltd., glucose injection solution) to prepare a DNA solution of 500 μg DNA / ml. The number of moles of negative charge of 1 gDNA was 3 nmol, and the number of moles of negative charge of 500 μg DNA was 500 μg × 3 nmol = 1,500 nmol.
[実施例 2 7 ] 各種誘導体キヤリァ一溶液の調製法 [Example 27] Preparation method of carrier solution for various derivatives
N/P (N： キャリア一のニ トロゲンの陽電荷モル数/ P： DNA のリン酸を 負電荷モル数の比） が 0.3 等量となるよう実施例 21 のス トック溶液を 5 %グルコースで調製した。 The stock solution of Example 21 was prepared so that N / P (N: mole number of positively charged nitrogen in carrier / nitrogen: P: ratio of mole number of negatively charged phosphate of DNA) to 0.3 equivalent. Prepared with 5% glucose.
[実施例 2 8 ] DNA複合体の形成法 [Example 28] Method of forming DNA complex
1 . 5mlエツベン ドルフチューブに実施例 26の DM溶液 100〃 1を入れ、 次いで実施例 27のキヤリァー溶液 100〃1を加えて軽くボルテツクスで 混合後、 室温で 30分以上放置し、 DNA複合体 （N/P=0. 3等量） を形成さ せた。 一夜、 4 °Cで放置後、 以下の実験に供した。  100 ml of the DM solution of Example 26 was added to a 1.5 ml Etbendorf tube, and then 100 ml of the carrier solution of Example 27 was added. The mixture was gently mixed by vortex, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more. N / P = 0.3 equivalent). After leaving overnight at 4 ° C, it was subjected to the following experiment.
[実施例 2 9〗 皮下移植担癌マウスでの遺伝子発現 [Example 2 9〗 Gene expression in subcutaneously transplanted tumor-bearing mice]
実施例 28の DNA複合体 50〃 1 ( 12. 5 / gDNA )を実施例 2 5の皮下移植 担癌マウスの腫瘍内に直接投与した （注射針 29Gxl/2 //、 テルモ株式会 社）。 DNA複合体の投与 10 曰後、 マウスをエーテル麻酔下に類椎脱臼屠 殺し、 生着した腫瘍を皮下から挟みで切り出した。 GFP遺伝子の発現は、 腫瘍を切断し内部の腫瘍組織を蛍光顕微鏡で観察することで行った。 結 果は表 5に示した。 表中の GFP 発現強度において、 （+ ) は強い発現、 (士 ） は僅かな発現、 （-） は発現なしを示す。 ヒ ト臈臓癌細胞 BxPc-3 に対し、 TSL-D8、 TSL- D 16、 PSL-D 16 、 TEL-D8、 TEL-D 16 が nakedDNA よ り強い GFPの蛍光が観察された。同様にヒ ト神経膠芽腫 SK-N-MCに対し、 TEL-D8が nakedDNAより強い GFPの蛍光が観察された。 表 5 The DNA complex 50〃1 (12.5 / gDNA) of Example 28 was subcutaneously transplanted in Example 25 and directly administered into the tumor of a tumor-bearing mouse (needle 29Gxl / 2 //, Terumo Corporation). After administration of the DNA complex, the mice were sacrificed by vertebral dislocation under ether anesthesia, and the engrafted tumor was cut out subcutaneously from the skin. Expression of the GFP gene was performed by cutting the tumor and observing the internal tumor tissue with a fluorescence microscope. The results are shown in Table 5. In the GFP expression intensity in the table, (+) indicates strong expression, (() indicates slight expression, and (-) indicates no expression. TSL-D8, TSL-D16, PSL-D16, TEL-D8, and TEL-D16 showed stronger fluorescence of GFP than human DNA on human renal cancer cells BxPc-3. Similarly, GFP fluorescence of TEL-D8 was stronger than naked DNA in human glioblastoma SK-N-MC. Table 5
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産業上の利用の可能性
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Industrial applicability
本発明により、 複数の疎水基を導入したポリアルキレンィ ミンを構成 成分とする組成  According to the present invention, a composition comprising a polyalkyleneimine into which a plurality of hydrophobic groups are introduced as a constituent component
物、 および該組成物を用いた遺伝子導入法が提供された。 これにより、 従来のカチオン性高分子に比し、 より高い効率で、 負電荷の生理活性物 質を細胞内へ輸送することが可能となった。 And a gene transfer method using the composition. This has made it possible to transport a negatively charged physiologically active substance into cells with higher efficiency than conventional cationic polymers.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . 疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンイ ミンま たはその塩を含む組成物。 1. A composition containing a polyalkyleneimine or a salt thereof in which two or more hydrophobic groups are introduced in one molecule.
2 . 疎水基がコ レステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシ力 ルポ二ル基、 またはリン脂質残基である、 請求項 1に記載の組成物。  2. The hydrophobic group according to claim 1, wherein the hydrophobic group is a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxy group, or a phospholipid residue. Composition.
3 . 疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキレンィ ミンが 下記構造式 U ) で表される化合物である、 請求項 1に記載の組成物。  3. The composition according to claim 1, wherein the polyalkyleneimine having two or more hydrophobic groups introduced in one molecule is a compound represented by the following structural formula U).
R -N- (CH2) p - CN- (CH2) q] χηι - [Z- (CH2) 「] χη -N- " ( I ) " R〗 R〗 R' R -N- (CH 2 ) p-CN- (CH 2 ) q] χηι-[Z- (CH 2 ) "] χη -N-" (I) "R〗 R〗 R '
(式中、 基本骨格にアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子も しくは窒素原子を表し、 R ' は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは 不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不 飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂質残基を表し、 同一の窒素原 子に結合する 2つの R， は同一であっても異なっていてもよく、 側鎖 R 1は水素、 コ レステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和 もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシカルボ ニル基、 リン脂質残基、 または次式 （I I ) を表す。 また、 式中、 P、 q、 r、 X \ X mは任意の自然数を表す。） (Wherein the basic skeleton may contain an amide bond, Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated Represents an acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, and two Rs bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; 1 represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (II) . also, represented in the formula, P, q, r, and X \ X m number of arbitrary nature.)
Rm Rm R m R m
- C ( CH2) i-N] χρ - [ (CH2) m-Z] Xq - ( CH2) n_N-R' ( I ) -C (CH 2 ) iN] χρ-[(CH 2 ) m -Z] X q-(CH 2 ) n _N-R '(I)
R' (式中、 基本骨格および側鎖 Rmにアミ ド結合が含まれていてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 R ' は水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽 和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R' は同一であっても異なっていても よく、 Rmは水素、 コレステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル 基、 飽和もしくは不飽和のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキ シカルボニル基、 リン脂質残基、 または次式 （III) を表す。 また、 式中、 1、 m、 n、 Xp、 Xqは任意の自然数を表す。）
Figure imgf000056_0001
R ' (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the side chain R m , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated Or an unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, and two R's bonded to the same nitrogen atom may be the same or different; R m represents hydrogen, a cholesterol group, a saturated or unsaturated alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated alkoxycarbonyl group, a phospholipid residue, or the following formula (III). In the formula, 1, m, n, X p and X q represent arbitrary natural numbers.)
Figure imgf000056_0001
- [ (CH2) a-N] XP+卜 [ (CH2) b-Z] XQ+1 - (CH2) C- -R" (D -[(CH 2 ) aN] XP + [(CH 2 ) bZ] XQ + 1-(CH 2 ) C --R "(D
(式中、 基本骨格および側鎖 Rm+ 1の基本骨格にアミ ド結合が含まれて いてもよく、 Zは炭素原子もしくは窒素原子を表し、 R' は水素、 コレ ステロール基、 飽和もしくは不飽和のアルキル基、 飽和もしくは不飽和 のァシル基、 飽和もしくは不飽和のァシルォキシカルボニル基、 リン脂 質残基を表し、 同一の窒素原子に結合する 2つの R ' は同一であっても 異なっていてもよい。 また、 式中、 a、 b、 c、 Xp+ 1、 Xq+ 1は任意 の自然数を表す。） (In the formula, an amide bond may be contained in the basic skeleton and the basic skeleton of the side chain R m + 1 , Z represents a carbon atom or a nitrogen atom, and R ′ represents hydrogen, a cholesterol group, saturated or unsaturated. An alkyl group, a saturated or unsaturated acyl group, a saturated or unsaturated acyloxycarbonyl group, or a phospholipid residue, wherein two R's bonded to the same nitrogen atom are different even if they are the same. In the formula, a, b, c, X p + 1 , and X q + 1 represent any natural numbers.)
4. 基本骨格に次式 （IV) の繰り返し構造を含む、 請求項 1から 3の いずれかに記載の組成物。  4. The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the basic skeleton contains a repeating structure represented by the following formula (IV).
一 CH2— CH2— NH— (IV) One CH 2 — CH 2 — NH— (IV)
5. テ トラエチレンペン夕ミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖状に連結 した請求項 4に記載の組成物。 5. The composition according to claim 4, wherein two to five molecules of tetraethylenepentamine are linked linearly.
6. R \ R \ Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチ ル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群より選 択される基を含む、 請求項 5に記載の組成物。 6. R \ R \ R m, or any two of the side chains of R m + 1 is Echiru group, propyl group, butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchi group, nonyl group, decyl Selected from the group consisting of a group, an decyl group, a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptane decyl group, an octadecyl group, a nonadecyl group, and an eicosyl group The composition of claim 5, comprising a group.
7. R'、 R \ Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル 基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テトラデシル基、 ペン 夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォク夕デシル基 からなる群より選択される基を含む、 請求項 5に記載の組成物。 7. R ', R \ R m , or any two of the side chains of R m + 1 is a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, Okuchiru group, nonyl group, decyl group, Undeshiru group, dodecyl The composition according to claim 5, comprising a group selected from the group consisting of a group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptanedecyl group, and an octadecyl group.
8. 式 （IV) を含む構造が分岐状に連結した請求項 4に記載の組成物。 8. The composition according to claim 4, wherein the structure containing the formula (IV) is linked in a branched manner.
9. R，、 R 1 Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチ ル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群より選 択される基を含む、 請求項 8に記載の組成物。 9. Any two or more of the side chains of R, R 1 R m and R m + 1 are an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, Selected from the group consisting of decyl, decyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendecyl, hexadecyl, hepdecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl. 9. The composition of claim 8, comprising a group.
1 0. R，、 R 1 , Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ブチル 基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デ シル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォクタデシ ル基からなる群より選択される基を含む、 請求項 8に記載の組成物。10. Any two or more of the side chains of R, R 1 , R m , and R m + 1 are butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, pendecyl 9. The composition according to claim 8, comprising a group selected from the group consisting of a group, a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group, and an octadecyl group. .
1 1. 基本骨格にスペルミン構造を含む、 請求項 1から 3のいずれか に記載の組成物。 1 1. Any of claims 1 to 3, wherein the basic skeleton contains a spermine structure A composition according to claim 1.
1 2. スペルミンが 2分子ないし 5分子、 直鎖状に連結した請求項 1 1に記載の組成物。  12. The composition according to claim 11, wherein 2 to 5 molecules of spermine are linked linearly.
1 3. R，、 R Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル 基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォ クチル基、 ノニル基、 .デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシ ル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシ ル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群 より選択される基を含む、 請求項 1 1に記載の組成物。 1 3. Any two or more of the side chains of R, RR m and R m + 1 are ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl,. Selected from the group consisting of decyl, decyl, dodecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pendecyl, hexadecyl, hepdecyl, octyldecyl, nonadecyl, and eicosyl 12. The composition of claim 11, comprising a group comprising:
1 4. R，、 R Rm、 R m+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ブチル 基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デ シル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ベン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォク夕デシ ル基からなる群より選択される基を含む、 請求項 1 1に記載の組成物。1 4. Any two or more of the side chains of R, RR m and R m + 1 are butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, pendecyl, dodecyl 12. The composition according to claim 11, comprising a group selected from the group consisting of a group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a benzyl group, a hexadecyl group, a heptane decyl group, and an octadecyl group. object.
1 5. スペルミ ン構造が分岐状に連結した請求項 1 1に記載の組成物。15. The composition according to claim 11, wherein the spermine structure is linked in a branched manner.
1 6. R，、 R 1 Rm、 R m + 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ェチル 基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォ クチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシ ル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシ ル基、 ォク夕デシル基、 ノナデシル基、 およびエイコシル基からなる群 より選択される基を含む、 請求項 1 4に記載の組成物。 1 6. Any two or more of the side chains of R, R 1 R m , and R m + 1 are ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl Group, decyl group, pendecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pendudecyl group, hexadecyl group, hepdecyldecyl group, octyldecyl group, nonadecyl group, and eicosyl group 15. The composition of claim 14, comprising a group selected from:
1 7. R'、 R1 Rm、 Rm+ 1の側鎖のいずれか 2個以上が、 ブチル 基、 ペンチル基、 へキシル基、 ヘプチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デ シル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 ト リデシル基、 テ トラデシル基、 ペン夕デシル基、 へキサデシル基、 ヘプ夕デシル基、 およびォク夕デシ ル基からなる群より選択される基を含む、 請求項 1 4に記載の組成物。 1 7. R ', R 1 R m , R m + 1 Any two or more of the side chains are butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, decyl 15. The method according to claim 14, further comprising a group selected from the group consisting of a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, a pendecyl group, a hexadecyl group, a heptanedecyl group, and an octadecyl group. Composition.
1 8 . さらにリン脂質を含む、 請求項 1から 1 7のいずれかに記載の 組成物。 18. The composition according to any one of claims 1 to 17, further comprising a phospholipid.
1 9 . リン脂質が、 中性リン脂質または酸性リン脂質である、 請求項 1 8に記載の組成物。  19. The composition according to claim 18, wherein the phospholipid is a neutral phospholipid or an acidic phospholipid.
2 0 . リン脂質が、 ホスファチジルエタノールァミン骨格またはホス ファチジルコリン骨格を有する、 請求項 1 9に記載の組成物。  20. The composition according to claim 19, wherein the phospholipid has a phosphatidylethanolamine skeleton or a phosphatidylcholine skeleton.
2 1 . リン脂質が、 ジォレイルホスファチジルエタノールァミンまた はホスファチジルコ リンである、 請求項 2 0に記載の組成物。  21. The composition according to claim 20, wherein the phospholipid is dioleyl phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine.
2 2 . 負電荷を有する生理活性物質と、 請求項 1から 2 1のいずれか に記載の組成物を含む複合体。  22. A complex comprising a physiologically active substance having a negative charge and the composition according to any one of claims 1 to 21.
2 3 . 負電荷を有する生理活性物質が、核酸またはその誘導体である、 請求項 2 2に記載の組成物を含む複合体。  23. The complex comprising the composition according to claim 22, wherein the negatively charged physiologically active substance is a nucleic acid or a derivative thereof.
2 4 . 請求項 2 2または 2 3に記載の複合体を細胞に接触させる工程 を含む、 負電荷を有する生理活性物質を細胞内へ導入する方法。  24. A method for introducing a negatively charged physiologically active substance into cells, comprising the step of bringing the complex according to claim 22 or 23 into contact with cells.
2 5 . 請求項 1 9から 2 1のいずれかに記載の組成物を製造するため の、 リ ン脂質および疎水基が一分子中に 2個以上導入されたポリアルキ レンイ ミンまたはその塩を含むキヅ ト。  25. A key for producing the composition according to any one of claims 19 to 21, comprising a polyalkyleneimine having a phospholipid and two or more hydrophobic groups introduced in one molecule, or a salt thereof. G.
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