WO1998037191A1 - Humanes zirkulierendes hnlp (humanes neutrophilen-lymphocyten-peptid) - Google Patents
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Classifications
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-
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- Human circulating liNLP human neutrophil ⁇ n lymphocyte peptide
- the present invention relates to a peptide with the formula given in claim 1, polynucleotides coding for peptides with the formula given in claim 1, vectors containing a DNA from the polynucleotides according to the invention, genetically engineered host cells containing the vector according to the invention, DNA hybridizing with a polynucleotide according to the invention , Antibodies directed against the polypeptides according to the invention, antagonists / inhibitors directed against the polypeptides according to the invention, antisense oligonucleotides for inhibiting the expression of the peptides according to the invention, medicaments containing at least one polypeptide according to the invention or a polynucleotide according to the invention, method for producing the peptides according to the invention, a diagnostic agent for Detection of the polypeptides according to the invention and uses of the polypeptides according to the invention.
- R a is NH 2 or a derivative of a primary amino group or an oligo- or polypeptide, the oligo- or polypeptide being composed of naturally occurring amino acids, their derivatives modified in the side chain and / or their stereoisomeric amino acids,
- n is an integer between 3 and 7,
- X is a naturally occurring amino acid, the derivative of which is modified in the side chain and / or the stereoisomeric amino acid thereof,
- R d is COOH, a carboxylic acid derivative or an oligo- or polypeptide, the oligo- or polypeptide being composed of naturally occurring amino acids, their derivatives modified in the side chain and / or their stereoisomeric amino acids.
- the peptide according to the invention preferably has the following structure (formula II):
- R a , R d , n and X have the meanings given above and R b and R c are each an oligo- or polypeptide, the oligo- or polypeptide consisting of naturally occurring amino acids, their derivatives modified in the side chain and / or their stereoisomers Amino acids is built up.
- X n is RDDSE.
- the peptide according to the invention has in particular four molecular forms, of which three in human blood filtrate, one in urine, with the following amino acid sequences:
- peptides are referred to as human circulating neutrophil lymphocyte peptides.
- the peptide according to the invention can be obtained by a purification process starting from human hemofiltrate.
- the human hemofiltrate is optionally diluted with water and acidified.
- the pH is preferably 1.5 to 3.5, in particular 2.5 to 3.0.
- the hemofiltrate is then passed over a cation exchanger, for example a carrier material modified with sulfonic acid groups (Fractogel SP-650 (M), Merck, Darmstadt).
- the peptides bound to the cation exchanger are eluted with a relatively highly concentrated salt solution.
- the ionic strength of the elution solution corresponds approximately to a 0.5 to 1 molar ammonium acetate solution.
- the eluate collected is subjected to a further cation exchange chromatography.
- This chromatography is preferably a step elution with buffers of increasing pH values.
- fractions containing the peptide according to the invention are e.g. further purified by means of preparative reverse phase chromatography and subsequent semi-preparative reverse phase chromatography, for example on support materials modified with C4.
- the degree of purification is preferably checked by means of analytical reverse phase chromatography, for example on carrier materials modified with C18 and by capillary zone electrophoresis.
- the substances obtained by the chromatographic purification were used for structure elucidation.
- the molecular masses of the native peptides as well as the proteolytic fragments and chemically modified derivatives were determined using a Sciex API III mass spectrometer.
- the amino acid analysis was carried out after a total acid hydrolysis.
- the sequence analysis was carried out using Edman degradation of the peptides, their proteolytic cleavage products and chemically modified derivatives using an ABI 473 A sequencer.
- the polynucleotides according to the invention code for the peptides according to the invention.
- the polynucleotides can be used Methods known to those skilled in the art derive primers for analysis and sequencing of the associated mRNA and the gene.
- the polynucleotide is in particular a cDNA which can serve both as a starting point for the genetic engineering of the hNLP and as an analytical tool for detecting the occurrence of DNA or mRNA coding for the peptide.
- the cDNA of the peptide according to the invention has the novel sequence below (Seq. ID No. 6):
- GGC AGA TGT ACG CTT TAA ATT GGT CTC CAT TTC TTA GAA 605 614 623 632 641 650
- the gene of the peptide according to the invention was cloned from human genomic leukocyte DNA and has the following sequence:
- CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
- mice The representation of the cDNA of mouse (Mus musculus) and production of knock-out mice were possible according to the usual methods.
- mice cDNA sequence (Seq. ID No. 10) and the peptide sequence derived therefrom (Seq. ID No. 14) are:
- TGA TGT CCA TAC TGG GGA AGA GTC ACC TCC AAC AGT GAT CTG TTC TGG GGA ATA TTG TTA 305 314 323 332 341 350
- the mouse gene was isolated from a murine cosmid library and sequenced by genomic PCR. The sequence is shown below (Seq. ID No. 15):
- GAGATCAGAA AACAGAGACC CAAGGGTAAA GCTGAAATTA GTGGTGTGGG GTGGGGGTGG 540
- the peptide according to the invention and its cDNA, its gene and analogs, fragments and derivatives of the peptide, the cDNA and the gene and its antagonists or inhibitors can be used as medicaments.
- Its biological activity corresponds to that of an anti-cell proliferative substance similar to the well-known interleukins. It is therefore suitable as a drug for the treatment of disorders in inflammatory processes, disturbed inflammatory reactions, tumor diseases, proliferation and maturation disorders of the hematopoietic system, infectious diseases, inflammatory and neoplastic diseases and proliferation disorders such.
- the peptide according to the invention or its antagonists / inhibitors can be administered parenterally, intravenously, intramuscularly, intranasally, locally topically or bucally in a manner customary for peptides.
- the amount of peptide to be administered is 1 ⁇ g to 1 g per administration unit per day.
- the action of the peptide according to the invention can be inhibited by administration of suitable inhibitors and antagonists.
- the diagnostic agent according to the invention contains poly- or monoclonal antibodies against the peptide according to the invention, optionally in fluorescence or radioactive labeling, in order to be used, for example, in ELISA or RIA known per se.
- the diagnostic agent according to the invention contains DNA, RNA and / or PNA, optionally in modified and / or labeled form for use in test systems known to those skilled in the art, such as PCR or fingerprinting. The invention is described in more detail by the following examples.
- Buffer A Hemofiltrate pH 2.7, conductivity
- ammonium acetate eluates of the batch extraction are combined in amounts of 5,000 to 10,000 liters of hemofiltrate peptide.
- the peptide extract is admixed with Demineralized water with a conductivity of 5.5 mS / cm applied to the preparative cation exchanger.
- the column is rinsed with 0.01 M HCl until the conductivity is below 1 mS / cm.
- the elution is carried out in several stages using the buffers specified below
- Eluates 1-7 are referred to as pH pool I-VII. They are collected separately. Elution takes place until a new baseline is reached, elution volumes of 10 to 25 L being achieved for the individual pH pools I to VII.
- Second preparative separation The individual pH pools are separated for fractionation and simultaneous desalination using reversed phase chromatography.
- the column is rinsed with buffer A. Fractions of 200 ml are collected during the elution. The fractions are freeze-dried and stored at -20 ° C.
- Fraction 15 from pH pool VI was separated successively in several identical chromatographies on a semi-preparative reversed-phase column.
- Buffer B 0.1% TFA, 80% acetonitrile
- capillary fused silica effective length 50 cm total length: 57 cm buffer: 100 mM NaH 2 P0 4 pH 2, 5,
- amino acids After gas phase hydrolysis with 6 N HCl for 1 hour at 160 ° C, the amino acids are analyzed with an automatic amino acid analyzer (AminoQuant, Hewlett-Packard) after double labeling with OPA / Fmoc using the standard program.
- AminoQuant Hewlett-Packard
- the peptides contain the amino acids detectable by this method in accordance with the four molecular forms mentioned.
- cysteines can be detected in peptide sequencing.
- desalting is preferably followed by analytical reverse phase chromatography with a Vydac RP-C18 column (4.6 mm x 25 cm).
- hNLP-22-39 (Seq. ID No. 4), MW 1877 as urine peptide:
- GVSLRPIGASCRDDSECI The linkage of the cysteines to one another in a 1-3 and 2-4 arrangement is determined by analyzing the fragments of the endoproteinase cleavages and is indicated by the brackets.
- NLP-N and NLP-C form pairs of so-called 'degenerate ' PCR primers which contain all coding possibilities for the amino and carboxy-terminal amino acid sequences of the hNLP determined in Example 2 and an additional linker sequence with restriction sites for later cloning.
- the first strand synthesis of the cDNA is carried out with UNIP.
- RNA was prepared from human intestinal tissue using an automatic nucleic acid extractor (ABI, 340) according to the manufacturer's instructions. From 5 ⁇ g of this RNA, the mRNA was transcribed into cDNA first strand using the primers and MMLV-RTase (Gibco-BRL).
- Amplification of the cDNA coding for hNLP The specific amplification of the coding cDNA was carried out by PCR on a thermal cycler (Perkin-Elmer-Cetus, 7000). With about 1 ⁇ g of first cDNA strands from different human tissues, in particular of the intestinal tract, the coding cDNAs are obtained with the primers listed above according to standard methods.
- GGC AGA TGT ACG CTT TAA ATT GGT CTC CAT TTC TTA GAA 605 614 623 632 641 650
- the human gene sequence was amplified, cloned and sequenced by genomic PCR from human DNA from leukocytes by methods known to the person skilled in the art.
- the gene sequence is:
- Length of gene NLP 1255 bp, +1 at: 1; Listed from: 1 to: 1255;
- CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
- mice cDNA sequence (Seq. ID No. 10) and the peptide sequence derived therefrom are:
- Length of mouse cDNA 429 bp, +1 at: 1; Listed from: 3 to: 429;
- TGA TGT CCA TAC TGG GGA AGA GTC ACC TCC AAC AGT GAT CTG TTC TGG GGA ATA TTG TTA 305 314 323 332 341 350
- the knock-out construct has the following structure:
- Synthetic peptide forms of hNLP were obtained using conventional chemical synthesis methods and by means of recombinant expression in E. coli and by expression in Pichia pastoris. The following products were achieved through multiple synthesis:
- CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
- HYPOTHETICAL NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: ATGTGGCACC TCAAACTTTG TGCAGTCCTC ATGATCTTCC TGTTGCTGTT GGGCCAGATA 60
- AATAGTTCCC CAGTACCAGA AGTGAGTTCA GCAAAGAGAT CCCGGAGAAT GACCCCATTT 120
- GAGATCAGAA AACAGAGACC CAAGGGTAAA GCTGAAATTA GTGGTGTGGG GTGGGGGTGG 540
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Abstract
Peptid mit der Formel (I) Ra-C-Xn-C-Rd, wobei Ra NH2 oder ein Derivat einer primären Aminogruppe oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereo-isomeren Aminosäuren aufgebaut ist; n eine ganze Zahl zwischen 3 und 7 ist, X eine natürlich vorkommende Aminosäure, deren in der Seitenkette modifiziertes Derivat und/oder deren stereoisomere Aminosäure ist, Rd COOH, ein Carbonsäurederivat oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
Description
Humanes zirkulierendes liNLP (humanes Neutrophilβn-Lymphocyten-Peptid)
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel, Polynucleotide kodierend für Peptide mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel, Vektoren enthaltend eine DNA aus den erfindungsgemäßen Polynucleotiden, gentechnisch manipulierte Wirtszellen enthaltend den erfindungsgemäßen Vektor, DNA hybridisierend mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid, Antikörper gerichtet gegen die erfindungsgemäßen Polypepitde, Antagonisten/Inhibitoren, gerichtet gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide, Antisense-Oligonucleotide zur Hemmung der Expression der erfindungsgemäßen Peptide, Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein erfindungsgemäßes Polynucleotid, Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide, ein Diagnostikum zur Erfassung der erfindungsgemaßen Polypeptide sowie Verwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptide.
Erfindungsgemäß werden Peptide zur Verfügung gestellt mit der folgenden Struktur (Formel I)
Ra~C"Xn"C_Rd
wobei
Ra NH2 oder ein Derivat einer primären Aminogruppe oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivate und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist,
n eine ganze Zahl zwischen 3 und 7 ist,
X eine natürlich vorkommende Aminosäure, deren in der Seitenkette modifiziertes Derivat und/oder deren stereoisomere Aminosäure ist,
Rd COOH, ein Carbonsäurederivat oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivate und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist .
Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäße Peptid die folgende Struktur (Formel II) :
K.-, — C —Λ._ — C —R ~ C —R„- C, — RJ II
wobei
Ra,Rd, n und X die oben genannten Bedeutungen haben und Rb und Rc jeweils ein Oligo- oder Polypeptid sind, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Xn RDDSE .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Peptid insbesondere vier Molekülformen auf, davon
drei im menschlichem Blutfiltrat, eine im Urin, mit den nachstehend angegebenen Aminosäuresequenzen:
hNLP-17-55, MW 4451:
TPFWRGVSLRP1GASCRDDSECITRLCRKRRCS SVAQE
hNLP - 22 - 55 , MW 3762
GVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP- 26 - 55 , MW 3406
RP1GASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-22-39, MW 1877 als Urin-Peptid:
GVSLRPIGASCRDDSECI
Diese Peptide werden als humane zirkulierende Neutrophilen- Lymphocyten-Peptide bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Peptid ist erhältlich durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat.
Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1,5 bis 3,5, insbesondere 2,5 bis 3,0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise ein mit Sulfon- säuregruppen modifiziertes Trägermaterial (Fractogel SP - 650 (M) , Merck, Darmstadt) . Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert . Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0,5 bis 1 molaren Ammoniumacetat- lösung.
Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher- Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.
Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenden Fraktionen werden z.B. mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C4 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt . Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien und der Kapillarzonenelek- trophorese überprüft .
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltenen Substanzen wurden der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen der nativen Peptide sowie der proteolytischen Fragmente und chemisch modifizierten Derivate erfolgte mittels eines Sciex API III Massenspektrometer . Die Aminosäureanalyse wurde nach einer sauren Totalhydrolyse durchgeführt. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman-Abbau der Peptide, ihrer proteolytischen Spaltprodukte sowie von chemisch modifizierten Derivaten mit einem ABI 473 A Sequenzer.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide kodieren für die erfindungsgemäßen Peptide. Aus den Polynucleotiden lassen sich nach
dem Fachmann bekannten Methoden Primer ableiten zur Analyse und Sequenzierung der zugehörigen mRNA und des Gens.
Das Polynucleotid ist insbesondere eine cDNA, die sowohl als Ausgangspunkt einer gentechnischen Herstellung des hNLP dienen kann, wie auch als analytisches Werkzeug zu Nachweis des Auftretens von für das Peptid kodierender DNA oder mRNA.
Dabei können entsprechende Derivate als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Beispielsweise weist die cDNA des erfindungsgemäßen Peptids die neuartige, nachstehende Sequenz auf (Seq. ID No. 6) :
GA GGG GCG AAA GGG TCC ATG CCA GCA ACA CAA TCA CTC AAA GTC CAG ATG AGG GAT 11 20 29 38 47 56
CAG TAA ATA CAA CGT GCC TGA AAG GTG GCC CTT GAG CAC ATT CCT CCG GTA GAC ATT AAC 65 74 83 92 101 110
TTA TTA AAT TGA TTC TGA TTA CAA ATA TAA ACT TTG CCC CCA TCT CAC CCA GTA ACA ATG 125 134 143 152 161 170
CAA GAG TTG ATG TCA GTC TAT AAA AGG AAG TAG GAA CTG TCC CTG GCT TTC AGG CTC CAA 185 194 203 212 221 230
M W H L K L C A V M I F CAT CCT CCC CCT GTC AAG ATG TGG CAC CTC AAA CTT TGT GCA GTC CTC ATG ATC TTC CTG 245 254 263 272 281 290 L L G Q I D G S P I P E V S S A K R R TTG CTG TTG GGC CAG ATA GAT GGC TCC CCA ATA CCA GAA GTG AGT TCG GCA AAG AGA AGG 305 314 323 332 341 350
P R R M T P F W R G V S L R P I G A S C CCA CGG AGA ATG ACC CCA TTT TGG AGA GGG GTT TCC CTC AGG CCT ATT GGA GCC TCC TGC 365 374 383 392 401 410
R D D S E C I T R L C R K R R C S L S V CGG GAT GAT TCT GAG TGT ATC ACA AGG CTA TGC AGA AAA AGA CGC TGT TCC TTA AGT GTG 425 434 443 452 461 470
A Q E
GCC CAG GAA TGA TGT ACA TAC CAG GGA AAG AAA GGA CAG CAG TCA CCT CCG ACA ATG CTC 485 494 503 512 521 530
CGT TCT ATG GAA TAT TGA TTA ACT GCA TTT TGG CTG GAG ACA CCC AAG TGA AGC AAT CTT 545 554 563 572 581 590
GTA TTT TTA ATA TTT AAA GGC AGA TGT ACG CTT TAA ATT GGT CTC CAT TTC TTC TTA GAA 605 614 623 632 641 650
TGT TGA TAT ATG GAT AAG CAT AAC TAA ACT TGT CAA TTT AGA GTT TAT TTT TCT ATG GAT 665 674 683 692 701 710
ACT ATT AAA TGT CTC AAA TTG poly(A)tail 725 734
Das Gen des erfindungsgemäßen Peptids wurde aus humaner genomischer Leukozyten-DNA kloniert und weist die nachstehende Sequenz auf :
GAGGGGCGAA AGGGTCCATG CCAGCAACAC AATCACTCAA AGTCCAGATG AGGGATCAGT 60
AAATACAACG TGCCTGAAAG GTGGCCCTTG AGCACATTCC TCCGGTAGAC ATTAACTTAT 120
TAAATTGATT CTGATTACAA ATATAAACTT TGCCCCCATC TCACCCAGTA ACAATGCAAG 180
AGTTGATGTC AGTCTATAAA AGGAAGTAGG AACTGTCCCT GGCTTTCAGG CTCCAACATC 240
CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
TGTTGGGCCA GGTAAGGAGG GAAGGATACT TATGTGTGTG TGTGGAGTGT GGAGATGATA 360
GTGGTGGTGG AACTTGAAAG CTAGATTCAG TCCTGAGGAA TGGTTCCTCT GTTCTGAGTC 420
TACAGCATCT GCGGAATGGA ATGATCACTC TTCCAAGGTG TGCAGCAGGG TGTCAACACT 480
TTCATATCTG AATGTCTTTG CCCTTACAGA TAGATGGCTC CCCAATACCA GAAGTGAGTT 540
CGGCAAAGAG AAGGCCACGG AGAATGACCC CATTTTGGAG AGGGGTTTCC CTCAGGCCTA 600
TTGGAGCCTC CTGCCGGGAT GATTCTGAGT GTATCACAAG GCTATGCAGG TACTCCCTGA 660
ACCTGGGAGC AGGGTTGGGC CAGAGAGCCC TGGGAAGCTG GGCAGAGGAG TGACAAGGGG 720
ACACATGAAC CTAAGAATAA AGCTGGGATG GAGGAGTTCT AGACTGAGAC TGGGAGCTCC 780
ATGGAAAATC CCTTAGGAGT TAGGAGCCAA GAACAGCTCT ATGTGGGTAC CATGAAAGAG 840
TGGTGCCTTT CCATTCTTCA GTCTTTCCTG AGACTGGACA GATCAAGCAA AGAGGAAGGA 900
AATGCAGCAT AGGTGGCCCT GGTCATTCCT AGACCCAGTC TTAAAAAACT ACCCTTTCTT 960
TTCCCCTAGA AAAAGACGCT GTTCCTTAAG TGTGGCCCAG GAATGATGTA CATACCAGGG 1020
AAAGAAAGGA CAGCAGTCAC CTCCGACAAT GCTCCGTTCT ATGGAATATT GATTAACTGC 1080
ATTTTGGCTG GAGACACCCA AGTGAAGCAA TCTTGTATTT TTAATATTTA AAGGCAGATG 1140
TACGCTTTAA ATTGGTCTCC ATTTCTTCTT AGAATGTTGA TATATGGATA AGCATAACTA 1200 AACTTGTCAA TTTAGAGTTT ATTTTTCTAT GGATACTATT AAATGTCTCA AATTG
Exon 1: 1-311 Intron 1: 312-509 Exon 2: 510-649 Intron 2 : 650-969 Exon 3: 970-1255
Die Darstellung der cDNA von Maus (Mus musculus) und Herstellung von Knock-out -Mäusen wurden nach den üblichen Verfahren möglich.
Die Maus -cDNA-Sequenz (Seq. ID No. 10) sowie die daraus abgeleitete Peptidsequenz (Seq. ID No . 14) lauten:
GT CGG TCT ATA AAA GGA AAC GGG AAC TGC CCC CTG GCT TTC AGA CTC CAA CAT CAT 11 20 29 38 47 56
L Q L K F A V L L T C L L TCT TTT GCC AAG ATG CTA CAG CTA AAA CTC TTT GCA GTG CTC CTG ACT TGC CTG CTG CTG 65 74 83 92 101 110
L G Q V N S S P V P E V S S A K R S R R CTG GGT CAG GTC AAT AGT TCC CCA GTA CCA GAA GTG AGT TCA GCA AAG AGA TCC CGG AGA 125 134 143 152 161 170
M T P F R G V S L R P I G A S C R D D ATG ACC CCA TTT TGG AGA GGG GTT TCC CTC AGG CCC ATT GGT GCC TCG TGC CGG GAT GAC 185 194 203 212 221 230
S .E C I T R L C R K R R C S L S V A Q E TCT GAG TGT ATC ACA AGA CTA TGC AGA AAA AGA CGC TGT TCC CTA AGT GTG GCC CAG GAG 245 254 263 272 281 290
TGA TGT CCA TAC TGG GGA AGA GTC ACC TCC AAC AGT GAT CTG TTC TGG GGA ATA TTG TTA 305 314 323 332 341 350
ACG ACA TTT TGG TTG GAG ATA GAT AAG TGA AGT AGT CTT TGT TTT TAA TAT TTA AAG ACG 365 374 383 392 401 410
GAT ACT TGC TTT A 425
Das Maus -Gen wurde über eine genomische PCR aus einer murinen Cosmid-Bank isoliert und sequenziert. Die Sequenz ist im Folgenden dargestellt (Seq. ID No . 15) :
Maus-NLP-gen: 799 bp, +1 bei: 1
GTCGGTCTAT AAAAGGAAAC GGGAACTGCC CCCTGGCTTT CAGACTCCAA CATCATTCTT 60
TTGCCAAGAT GCTACAGCTA AAACTCTTTG CAGTGCTCCT GACTTGCCTG CTGCTGCTGG 120
GTCAGGTAAG GAAGGAAACA GTAGTGGCGT GGAATTCCAA GTCAGACTCA GTCCTTAGAA 180
ATGCAGTTCG ATCTCCTGCA ACCTGCAAAG GGCCCTTCTT CTGAGGCTGT GCAGCAGAGG 240
GTGGGTGCTT CCTCAGCTAA AGTGAGTATG CCTTTGCTCT ACAGGTCAAT AGTTCCCCAG 300
TACCAGAAGT GAGTTCAGCA AAGAGATCCC GGAGAATGAC CCCATTTTGG AGAGGGGTTT 360
CCCTCAGGCC CATTGGTGCC TCGTGCCGGG ATGACTCTGA GTGTATCACA AGACTATGCA 420
GGTATTTGAT GATCCCAGGT ACAGGGTGGA CCAGAGAGCA CTGGGAAAGC TGGGAGAGAT 480
GAGATCAGAA AACAGAGACC CAAGGGTAAA GCTGAAATTA GTGGTGTGGG GTGGGGGTGG 540
GGGTGGGGGG AATATATGAA GCTGTGAACT CCATGGAGGG GATTCCGTGA CAGTCAAGAA 600
CCATTCAGAT TCCTAACACT GAACGACAGA TGAAACAAGG AATAATGGAG GCAGCAGAGG 660
TGTCCCAGGG CTCCTTAGGT CTACATCCAA TCTTAATCAC TTCTTTTCTT CCCCCCACTA 720
GAAAAAGACG CTGTTCCCTA AGTGTGGCCC AGGAGTGATG TCCATACTGG GGAAGAGTCA 780 CCTCCAACAG TGATCTGTT
Exon 1: 1-125
Intron 1: 126-284
Exon 2 : 285-421
Intron 2 : 422-721
Exon 3 : 722-799
Neben der gentechnischen Herstellung ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield- Synthese oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die Syn- thesestrategie und der Aufbau des Peptids und von ihm abgeleiteten Derivaten z.B. mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.
Das erfindungsgemäße Peptid sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie seine Antagonisten oder Inhibitoren können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der einer antizellproliferativen Substanz ähnlich der bekannten Interleukine . Es ist daher geeignet, als Arzneimittel zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems, Infektionserkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen und Proliferationsstörungen z. B. der Atemwege, des Magendarmtraktes und des Urogenitalapparates, insbesondere des Blutes und der blutbildenden System, eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Peptid oder seine Antagonisten/Inhibitoren können dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal -topisch oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 μg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren und Antagonisten gehemmt werden.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monok- lonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um z.B. in an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting .
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1
Hämofil rat-Batch-Extraktion
800 bis 1.000 L Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen :
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M) ,
25 cm Durchmesser x 5 cm Länge Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit
5,5 S/cm Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem,
(PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag der insgesamt 4.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (2,7 - 7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.
Erste präparative Auftrennung
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000 bis 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH- Einstellung auf 2,7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von
VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präpara- tiven Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen :
Säule : Vantage 250 VA Säulenmaterial Fractogel TSK SP 650 (M) , 25 cm Durchmesser x 5 cm Länge
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auftrages 0,5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit Probe : Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm Anlage : Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Puffer ppHH-- WWert Puffersubstanzen Leitfähigkeit (mS/cm)
Waschpuffer: 2, 0 0,01 M HCl 1
Elutionspuffer 1 3, 6 0,1 M Zitronensäure-1-hydrat 2 , 9
Elutionspuffer 2 4, 5 0,1 M Essigsäure +
0,1 M Natriumacetat 4 , 0
Elutionspuffer 3 5, 0 0,1 M Äpfelsäure 6 , 2
Elutionspuffer 4 5 6 0,1 M Bernsteinsäure 6 , 1
Elutionspuffer 5 6 6 0 , 1 M NaH2P04 4 , 9
Elutionspuffer 6 7 4 0 , 1 M NaH2P04 6 , 7
Elutionspuffer 7 9 0 0 , 1 M Ammoniumcarbonat 6 , 7
Die Eluate 1 - 7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.
Zweite präparative Auftrennung:
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt .
Chromatographiebedingungen :
Säule : FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg) Säulenmaterial Source RPC, 15 μm
10 cm Durchmesser x 12,5 cm Länge
(FineLine 100)
Fluß: 150 mL/min
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH Puffer A: 10 mM HCl Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl Gradient 0 - 60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert.
Semipräparative Reverse-Phase Cl8 -Chromatographie
Die Fraktion 15 aus pH-Pool VI wurde sukzessive in mehreren identischen Chromatographien über eine semipräparative Reversed- Phase Säule aufgetrennt.
Chromatographiebedingungen :
Säule: 1 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial Vydac RP-C18 5 μm, 300 Ä
Puffer A 0,1 % TFA
Puffer B 0,1 % TFA, 80 % Acetonitril
Gradient 5 - 50% B in 45 min, 50 - 100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron Fraktionen: ä 1 min ab Start des Gradienten
Analytische Reversed-Phase C18 -Chromatographie
Die Fraktion 37 enthielt die erfindungsgemäße Substanz. Sie wurde auf einer analytischen Säule weiter aufgereinigt (Chroma- togramm siehe Abb. 4) .
Chromatographiebedingungen :
Säule : 0,46 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial Vydac RP-C18, 5 μm, 300 Ä Puffer A: 0,1 % TFA Puffer B: 0,1 % TFA, 80 % Acetonitril Gradient 5 - 50 % B in 45 min, 50 - 100 % B in 10 min
Fluß: 0,7 ml/min Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage Kontron
In dieser Rechromatographie wird die Reinheit des isolierten Peptides, wie es zur weiteren Analytik verwandt wird, deutlich. Analog zu diesem Vorgehen wurden auch die Peptide HF 4451 (hNLP- 17-55) und HF 3406 (hNLP-26-55) aufgereinigt .
Beispiel 2
Kapillarzonen-Elektrophorese
Zur Überprüfung der Reinheit wurde eine Kapillarzonen-Elektrophorese für die verschiedenen hNLPs angefertigt. Die Fraktion, enthaltend hNLPs, zeigen die zu über 95% aufgereinigten Substanzen.
Bedingungen: Kapillare : fused silica Effektive Länge 50 cm Gesamtlänge : 57 cm Puffer: 100 mM NaH2P04 pH 2 , 5 ,
0 , 2 % Hydroypropylmethylcellulose
Strom: 120 μA const . Detektion: 200 nm
Temperatur : 25 °C
Beispiel 3
Massenbestimmungen
Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten, modifizierten und/oder durch Endoproteinasespaltung fragmentierten Peptide wurden auf einem Elektrospray-Massenspektrometer (Sciex API III, Fa. Perkin Eimer) durchgeführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden im positive ion mode entsprechend der oben gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt.
Aminosäureanalyse
Nach Gasphasen-Hydrolyse mit 6 N HCl für 1 Stunde bei 160°C werden die Aminosäuren mit einem automatischen Aminosäureanaly- sator (AminoQuant, Hewlett-Packard) nach Doppelmarkierung mit OPA/Fmoc mit dem Standardprogramm analysiert. Die Peptide enthalten die mit dieser Methode nachweisbaren Aminosäuren entsprechend der vier genannten Molekülformen.
Bestimmung von Cysteinen
Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivatisierung, zum Beispiel nach Reduktion mit ß-Mercaptoethanol und Carboxami- domethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid-Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm x 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein pro Cystein um 57 Da erhöhtes Molekulargewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämofiltrat vier Cysteine enthalten, welche zudem mit zwei Disulfidbrücken untereinander verbunden sind.
Sequenzbestimmung
Sowohl die nativen als auch die carboxamidomethylierten Peptide sowie die Fragmente nach Spaltung mit den Endoproteinasen Glu-C und Arg-C werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Aminosäureanalysen und den Massenbestimmungen ergeben sich folgende Sequenzen:
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No . 1) :
TPFWRGVSLRP1GASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
1 I
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No . 2)
GVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No . 3)
RPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-22-39 (Seq. ID No . 4) , MW 1877 als Urin-Peptid:
GVSLRPIGASCRDDSECI
Die Verknüpfung der Cysteine untereinander in einer 1 - 3 sowie 2 - 4-Anordnung wird durch Analyse der Fragmente der Endoprotei- nasespaltungen ermittelt und ist durch die Klammern angegeben.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt-, PIR- , EMBL-Nucleinsäure- und GenBank-Daten- banken durchgeführt. Die Peptidsequenz ist überraschenderweise neu. Es wurde keine Sequenzhomologie zu Mitgliedern von bekannten Peptidfamilien gefunden, so daß den hNLPs eine überraschend neuartige Sequenz zukommt.
Beispiel 4
Synthese von Oligonucleotiden
Primer wurden auf einem Nucleinsäure-Synthesizer (Fa. Applied Biosystems) nach der Phosphoamidit-Methode nach den Angaben des Herstellers synthetisiert, auf OPC-Säulen gereinigt und in bidest. H20 gelöst. NLP-N und NLP-C bilden Paare sogenannter 'degenerierter' PCR-Primer, welche sämtliche Codierungsmöglichkeiten für die in Beispiel 2 bestimmten amino- und carboxyter- minalen Aminosäuresequenzen des hNLP und eine zusätzliche Linkersequenz mit Restriktionsschnittstellen für die spätere Klonierung enthalten. Mit UNIP wird die Erststrangsynthese der cDNA durchgeführt .
Präparation von cDNA
Aus humanem Darmgewebe wurde mit Hilfe eines automatischen Nucleinsäurenextraktors (ABI, 340) Gesamt-RNA nach den Angaben des Herstellers präpariert. Aus 5 μg dieser RNA wurde die mRNA unter Verwendung der Primer und von MMLV-RTase (Gibco-BRL) in cDNA-Erststrang umgeschrieben.
Amplifikation der für hNLP codierenden cDNA
Die spezifische Amplif ikation der codierenden cDNA wurde durch eine PCR an einem Thermocycler (Perkin-Elmer-Cetus, 7000) durchgeführt . Mit etwa 1 μg cDNA-Erststrängen aus verschieden humanen Geweben, insbesondere des Intestinaltraktes, werden mit den oben aufgeführten Primern nach Standardmethoden die codierenden cDNAs erhalten.
Nuc leinsäure -Sequenzierung
Die Nucleinsäurensequenz nach routinegemäß ausgeführter Fluoreszenzsequenzierung ergab folgende Sequenz mit abgeleiteter Aminosäuresequenz (Seq. ID No. 6) :
GA GGG GCG AAA GGG TCC ATG CCA GCA ACA CAA TCA CTC AAA GTC CAG ATG AGG GAT 11 20 29 38 47 56
CAG TAA ATA CAA CGT GCC TGA AAG GTG GCC CTT GAG CAC ATT CCT CCG GTA GAC ATT AAC 65 74 83 92 101 110
TTA TTA AAT TGA TTC TGA TTA CAA ATA TAA ACT TTG CCC CCA TCT CAC CCA GTA ACA ATG 125 134 143 152 161 170
CAA GAG TTG ATG TCA GTC TAT AAA AGG AAG TAG GAA CTG TCC CTG GCT TTC AGG CTC CAA 185 194 203 212 221 230
M W H K L C A V L M I F CAT CCT CCC CCT GTC AAG ATG TGG CAC CTC AAA CTT TGT GCA GTC CTC ATG ATC TTC CTG 245 254 263 272 281 290
L L L G Q I D G S P I P E V S S A K R R TTG CTG TTG GGC CAG ATA GAT GGC TCC CCA ATA CCA GAA GTG AGT TCG GCA AAG AGA AGG 305 314 323 332 341 350
P R R M T P F W R G V S L R P I G A S C CCA CGG AGA ATG ACC CCA TTT TGG AGA GGG GTT TCC CTC AGG CCT ATT GGA GCC TCC TGC 365 374 383 392 401 410
R D D S E C I T R L C R K R R C S L S V CGG GAT GAT TCT GAG TGT ATC ACA AGG CTA TGC AGA AAA AGA CGC TGT TCC TTA AGT GTG 425 434 443 452 461 470
A Q E
GCC CAG GAA TGA TGT ACA TAC CAG GGA AAG AAA GGA CAG CAG TCA CCT CCG ACA ATG CTC 485 494 503 512 521 530
CGT TCT ATG GAA TAT TGA TTA ACT GCA TTT TGG CTG GAG ACA CCC AAG TGA AGC AAT CTT 545 554 563 572 581 590
GTA TTT TTA ATA TTT AAA GGC AGA TGT ACG CTT TAA ATT GGT CTC CAT TTC TTC TTA GAA 605 614 623 632 641 650
TGT TGA TAT ATG GAT AAG CAT AAC TAA ACT TGT CAA TTT AGA GTT TAT TTT TCT ATG GAT 665 674 683 692 701 710
ACT ATT AAA TGT CTC AAA TTG poly(A)taιl 725 734
Das Polyadenylierungssignal ist unterstrichen.
Die humane Gensequenz wurde durch genomische PCR aus humaner DNA von Leukozyten nach dem Fachmann bekannten Methoden verstärkt, kloniert und sequenziert. Die Gen-Sequenz lautet:
Length of gen NLP: 1255 bp, +1 at : 1; Listed from: 1 to: 1255;
Thu, Feb 20, 1997 12:51 PM
GAGGGGCGAA AGGGTCCATG CCAGCAACAC AATCACTCAA AGTCCAGATG AGGGATCAGT 60
AAATACAACG TGCCTGAAAG GTGGCCCTTG AGCACATTCC TCCGGTAGAC ATTAACTTAT 120
TAAATTGATT CTGATTACAA ATATAAACTT TGCCCCCATC TCACCCAGTA ACAATGCAAG 180
AGTTGATGTC AGTCTATAAA AGGAAGTAGG AACTGTCCCT GGCTTTCAGG CTCCAACATC 240
CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
TGTTGGGCCA GGTAAGGAGG GAAGGATACT TATGTGTGTG TGTGGAGTGT GGAGATGATA 360
GTGGTGGTGG AACTTGAAAG CTAGATTCAG TCCTGAGGAA TGGTTCCTCT GTTCTGAGTC 420
TACAGCATCT GCGGAATGGA ATGATCACTC TTCCAAGGTG TGCAGCAGGG TGTCAACACT 480
TTCATATCTG AATGTCTTTG CCCTTACAGA TAGATGGCTC CCCAATACCA GAAGTGAGTT 540
CGGCAAAGAG AAGGCCACGG AGAATGACCC CATTTTGGAG AGGGGTTTCC CTCAGGCCTA 600
TTGGAGCCTC CTGCCGGGAT GATTCTGAGT GTATCACAAG GCTATGCAGG TACTCCCTGA 660
ACCTGGGAGC AGGGTTGGGC CAGAGAGCCC TGGGAAGCTG GGCAGAGGAG TGACAAGGGG 720
ACACATGAAC CTAAGAATAA AGCTGGGATG GAGGAGTTCT AGACTGAGAC TGGGAGCTCC 780
ATGGAAAATC CCTTAGGAGT TAGGAGCCAA GAACAGCTCT ATGTGGGTAC CATGAAAGAG 840
TGGTGCCTTT CCATTCTTCA GTCTTTCCTG AGACTGGACA GATCAAGCAA AGAGGAAGGA 900
AATGCAGCAT AGGTGGCCCT GGTCATTCCT AGACCCAGTC TTAAAAAACT ACCCTTTCTT 960
TTCCCCTAGA AAAAGACGCT GTTCCTTAAG TGTGGCCCAG GAATGATGTA CATACCAGGG 1020
AAAGAAAGGA CAGCAGTCAC CTCCGACAAT GCTCCGTTCT ATGGAATATT GATTAACTGC 1080
ATTTTGGCTG GAGACACCCA AGTGAAGCAA TCTTGTATTT TTAATATTTA AAGGCAGATG 1140
TACGCTTTAA ATTGGTCTCC ATTTCTTCTT AGAATGTTGA TATATGGATA AGCATAACTA 1200 AACTTGTCAA TTTAGAGTTT ATTTTTCTAT GGATACTATT AAATGTCTCA AATTG
Exon 1: 1-311
Intron 1: 312-509
Exon 2: 510-649
Intron 2 : 650-969
Exon 3 : 970-1255
Die Prozessierung des Peptidhormons hNLP ist aus Figur 1 ersichtlich.
Die Darstellung der cDNA von Maus (Mus musculus) und Herstellung von Knock-out -Mäusen wurden nach den üblichen Verfahren möglich:
Die Maus -cDNA- Sequenz (Seq. ID No . 10) sowie die daraus abgeleitete Peptidsequenz lautet :
Length of Maus cDNA: 429 bp, +1 at : 1; Listed from: 3 to: 429;
Translated from: 69 to: 296 (ORFs) ; Genetic Code used: Universal; Thu, Feb 20, 1997 4:32 PM
Frame 3
GT CGG TCT ATA AAA GGA AAC GGG AAC TGC CCC CTG GCT TTC AGA CTC CAA CAT CAT 11 20 29 38 47 56
M Q L K L F A V L L T C L L L TCT TTT GCC AAG ATG CTA CAG CTA AAA CTC TTT GCA GTG CTC CTG ACT TGC CTG CTG CTG 65 74 83 92 101 110
L G Q V N S S P V P E V S S A K R S R R CTG GGT CAG GTC AAT AGT TCC CCA GTA CCA GAA GTG AGT TCA GCA AAG AGA TCC CGG AGA 125 134 143 152 161 170
M T P F W R G V S L R P I G A S C R D D ATG ACC CCA TTT TGG AGA GGG GTT TCC CTC AGG CCC ATT GGT GCC TCG TGC CGG GAT GAC 185 194 203 212 221 230
S E C I T R L C R K R R C S L S V A Q E TCT GAG TGT ATC ACA AGA CTA TGC AGA AAA AGA CGC TGT TCC CTA AGT GTG GCC CAG GAG 245 254 263 272 281 290
TGA TGT CCA TAC TGG GGA AGA GTC ACC TCC AAC AGT GAT CTG TTC TGG GGA ATA TTG TTA 305 314 323 332 341 350
ACG ACA TTT TGG TTG GAG ATA GAT AAG TGA AGT AGT CTT TGT TTT TAA TAT TTA AAG ACG 365 374 383 392 401 410
GAT ACT TGC TTT A 425
Das Knock-out-Konstrukt besitzt folgenden Aufbau:
poiyA
• gcnomic
Beispiel 5
Synthetische Peptidformen von hNLP wurden mit üblichen chemischen Syntheseverfahren sowie mittels rekombinanter Expression in E. coli sowie durch Expression in Pichia pastoris erhalten. Folgende Produkte wurden durch multiple Synthese erreicht:
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No . 1) :
TPFWRGVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No . 2) :
GVSLRPIGASCRDDSECITR CRKRRCSLSVAQE
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No. 3]
RPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP- 1-55, (Seq. ID No . 5]
SPIPEVSSAKRRPRR TPFWRGVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Prof. Dr. Wolf-Georg Forssmann
(B) STRASSE: Feodor-Lynen-Str . 31
(C) ORT: Hannover
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 30625
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Humanes zirkulierendes hNLP (humanes Neu rophi1en-Lymphocyten- Peptid) (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 15 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER : Floppy disk
(B ) COMPUTER : IBM PC compatible
( C) BETRIEBSSYSTEM : PC-DOS/MS -DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBΞSCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Thr Pro Phe Trp Arg Gly Val Ser Leu Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys 1 5 10 15
Arg Asp Asp Ser Glu Cys Ile Thr Arg Leu Cys Arg Lys Arg Arg Cys 20 25 30
Ser Leu Ser Val Ala Gin Glu 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Gly Val Ser Leu Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys Arg Asp Asp Ser Glu
1 5 10 15
Cys Ile Thr Arg Leu Cys Arg Lys Arg Arg Cys Ser Leu Ser Val Ala 20 25 30
Gin Glu
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3: ( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys Arg Asp Asp Ser Glu Cys Ile Thr Arg 1 5 10 15
Leu Cys Arg Lys Arg Arg Cys Ser Leu Ser Val Ala Gin Glu 20 25 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Gly Val Ser Leu Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys Arg Asp Asp Ser Glu 1 5 10 15
Cys Ile
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Ser Pro Ile Pro Glu Val Ser Ser Ala Lys Arg Arg Pro Arg Arg Met 1 5 10 15
Thr Pro Phe Trp Arg Gly Val Ser Leu Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys 20 25 30
Arg Asp Asp Ser Glu Cys Ile Thr Arg Leu Cys Arg Lys Arg Arg Cys 35 40 45
Ser Leu Ser Val Ala Gin Glu 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 737 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GAGGGGCGAA AGGGTCCATG CCAGCAACAC AATCACTCAA AGTCCAGATG AGGGATCAGT 60
AAATACAACG TGCCTGAAAG GTGGCCCTTG AGCACATTCC TCCGGTAGAC ATTAACTTAT 120
TAAATTGATT CTGATTACAA ATATAAACTT TGCCCCCATC TCACCCAGTA ACAATGCAAG 180
AGTTGATGTC AGTCTATAAA AGGAAGTAGG AACTGTCCCT GGCTTTCAGG CTCCAACATC 240
CTCCCCCTGT CAAGATGTGG CACCTCAAAC TTTGTGCAGT CCTCATGATC TTCCTGTTGC 300
TGTTGGGCCA GATAGATGGC TCCCCAATAC CAGAAGTGAG TTCGGCAAAG AGAAGGCCAC 360
GGAGAATGAC CCCATTTTGG AGAGGGGTTT CCCTCAGGCC TATTGGAGCC TCCTGCCGGG 420
ATGATTCTGA GTGTATCACA AGGCTATGCA GAAAAAGACG CTGTTCCTTA AGTGTGGCCC 480
AGGAATGATG TACATACCAG GGAAAGAAAG GACAGCAGTC ACCTCCGACA ATGCTCCGTT 540
CTATGGAATA TTGATTAACT GCATTTTGGC TGGAGACACC CAAGTGAAGC AATCTTGTAT 600
TTTTAATATT TAAAGGCAGA TGTACGCTTT AAATTGGTCT CCATTTCTTC TTAGAATGTT 660
GATATATGGA TAAGCATAAC TAAACTTGTC AATTTAGAGT TTATTTTTCT ATGGATACTA 720
TTAAATGTCT CAAATTG 737
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 254 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: EinzelStrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
GAGGGGCGAA AGGGTCCATG CCAGCAACAC AATCACTCAA AGTCCAGATG AGGGATCAGT 60
AAATACAACG TGCCTGAAAG GTGGCCCTTG AGCACATTCC TCCGGTAGAC ATTAACTTAT 120
TAAATTGATT CTGATTACAA ATATAAACTT TGCCCCCATC TCACCCAGTA ACAATGCAAG 180
AGTTGATGTC AGTCTATAAA AGGAAGTAGG AACTGTCCCT GGCTTTCAGG CTCCAACATC 240
CTCCCCCTGT CAAG 254
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 231 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
ATGTGGCACC TCAAACTTTG TGCAGTCCTC ATGATCTTCC TGTTGCTGTT GGGCCAGATA 60
GATGGCTCCC CAATACCAGA AGTGAGTTCG GCAAAGAGAA GGCCACGGAG AATGACCCCA 120
TTTTGGAGAG GGGTTTCCCT CAGGCCTATT GGAGCCTCCT GCCGGGATGA TTCTGAGTGT 180
ATCACAAGGC TATGCAGAAA AAGACGCTGT TCCTTAAGTG TGGCCCAGGA A 231
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 252 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelsträng
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
TGATGTACAT ACCAGGGAAA GAAAGGACAG CAGTCACCTC CGACAATGCT CCGTTCTATG 60
GAATATTGAT TAACTGCATT TTGGCTGGAG ACACCCAAGT GAAGCAATCT TGTATTTTTA 120
ATATTTAAAG GCAGATGTAC GCTTTAAATT GGTCTCCATT TCTTCTTAGA ATGTTGATAT 180
ATGGATAAGC ATAACTAAAC TTGTCAATTT AGAGTTTATT TTTCTATGGA TACTATTAAA 240
TGTCTCAAAT TG 252
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 429 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GTCGGTCTAT AAAAGGAAAC GGGAACTGCC CCCTGGCTTT CAGACTCCAA CATCATTCTT 60
TTGCCAAGAT GCTACAGCTA AAACTCTTTG CAGTGCTCCT GACTTGCCTG CTGCTGCTGG 120
GTCAGGTCAA TAGTTCCCCA GTACCAGAAG TGAGTTCAGC AAAGAGATCC CGGAGAATGA 180
CCCCATTTTG GAGAGGGGTT TCCCTCAGGC CCATTGGTGC CTCGTGCCGG GATGACTCTG 240
AGTGTATCAC AAGACTATGC AGAAAAAGAC GCTGTTCCCT AAGTGTGGCC CAGGAGTGAT 300
GTCCATACTG GGGAAGAGTC ACCTCCAACA GTGATCTGTT CTGGGGAATA TTGTTAACGA 360
CATTTTGGTT GGAGATAGAT AAGTGAAGTA GTCTTTGTTT TTAATATTTA AAGACGGATA 420
CTTGCTTTA 429
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
GTCGGTCTAT AAAAGGAAAC GGGAACTGCC CCCTGGCTTT CAGACTCCAA CATCATTCTT 60
TTGCCAAG 68
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12: ( i ) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 228 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
ATGCTACAGC TAAAACTCTT TGCAGTGCTC CTGACTTGCC TGCTGCTGCT GGGTCAGGTC 60
AATAGTTCCC CAGTACCAGA AGTGAGTTCA GCAAAGAGAT CCCGGAGAAT GACCCCATTT 120
TGGAGAGGGG TTTCCCTCAG GCCCATTGGT GCCTCGTGCC GGGATGACTC TGAGTGTATC 180
ACAAGACTAT GCAGAAAAAG ACGCTGTTCC CTAAGTGTGG CCCAGGAG 228
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 133 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
TGATGTCCAT ACTGGGGAAG AGTCACCTCC AACAGTGATC TGTTCTGGGG AATATTGTTA 60
ACGACATTTT GGTTGGAGAT AGATAAGTGA AGTAGTCTTT GTTTTTAATA TTTAAAGACG 120
GATACTTGCT TTA 133
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 76 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Met Leu Gin Leu Lys Leu Phe Ala Val Leu Leu Thr Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Gly Gin Val Asn Ser Ser Pro Val Pro Glu Val Ser Ser Ala Lys 20 25 30
Arg Ser Arg Arg Met Thr Pro Phe Trp Arg Gly Val Ser Leu Arg Pro 35 40 45
Ile Gly Ala Ser Cys Arg Asp Asp Ser Glu Cys Ile Thr Arg Leu Cys 50 55 60
Arg Lys Arg Arg Cys Ser Leu Ser Val Ala Gin Glu 65 70 75
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: nicht bekannt
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
GTCGGTCTAT AAAAGGAAAC GGGAACTGCC CCCTGGCTTT CAGACTCCAA CATCATTCTT 60
TTGCCAAGAT GCTACAGCTA AAACTCTTTG CAGTGCTCCT GACTTGCCTG CTGCTGCTGG 120
GTCAGGTAAG GAAGGAAACA GTAGTGGCGT GGAATTCCAA GTCAGACTCA GTCCTTAGAA 180
ATGCAGTTCG ATCTCCTGCA ACCTGCAAAG GGCCCTTCTT CTGAGGCTGT GCAGCAGAGG 240
GTGGGTGCTT CCTCAGCTAA AGTGAGTATG CCTTTGCTCT ACAGGTCAAT AGTTCCCCAG 300
TACCAGAAGT GAGTTCAGCA AAGAGATCCC GGAGAATGAC CCCATTTTGG AGAGGGGTTT 360
CCCTCAGGCC CATTGGTGCC TCGTGCCGGG ATGACTCTGA GTGTATCACA AGACTATGCA 420
GGTATTTGAT GATCCCAGGT ACAGGGTGGA CCAGAGAGCA CTGGGAAAGC TGGGAGAGAT 480
GAGATCAGAA AACAGAGACC CAAGGGTAAA GCTGAAATTA GTGGTGTGGG GTGGGGGTGG 540
GGGTGGGGGG AATATATGAA GCTGTGAACT CCATGGAGGG GATTCCGTGA CAGTCAAGAA 600
CCATTCAGAT TCCTAACACT GAACGACAGA TGAAACAAGG AATAATGGAG GCAGCAGAGG 660
TGTCCCAGGG CTCCTTAGGT CTACATCCAA TCTTAATCAC TTCTTTTCTT CCCCCCACTA 720
GAAAAAGACG CTGTTCCCTA AGTGTGGCCC AGGAGTGATG TCCATACTGG GGAAGAGTCA 780
CCTCCAACAG TGATCTGTT 799
Claims
Peptid mit der Formel I
Ra-C-Xn-C-Rd
wobei
Ra NH2 oder ein Derivat einer primären Aminogruppe oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist,
n eine ganze Zahl zwischen 3 und 7 ist,
X eine natürlich vorkommende Aminosäure, deren in der Seitenkette modifiziertes Derivat und/oder deren stereoisomere Aminosäure ist,
Rd COOH, ein Carbonsäurederivat oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
2. Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel II
Ra-C-Xn-C-Rb-C-Rc-C-Rd II
Ra,Rd, n und X die oben genannten Bedeutungen haben und Rb und Rc jeweils ein Oligo- oder Polypeptid sind, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist .
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit der Bezeichnung natives hNLP (humanes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid) mit nach olgenden Aminosäuresequenzen :
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No . 1) :
TPFWRGVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No . 2)
GVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
I I
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No . 3)
RPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE
hNLP-22-39, MW 1877 (Seq. ID No . 4) : GVSLRPIGASCRDDSECI
hNLP - 1 - 55 , ( Seq . ID No . 5 )
SPIPEVSSAKRRPRRMTPFWRGVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE l J
deren bio_≡ __g.ach aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phospho- rylierte und/oder glykosylierte Derivate.
4. Polynucleotide kodierend für Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder dessen Fragmente, Derivate und Analoga.
5. Polynucleotide nach Anspruch 4 mit der Seq. ID # 6 bis 9 und 11 bis 14.
6. Polynucleotide nach Anspruch 4 und/oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynucleotid aus DNA, RNA oder PNA aufgebaut ist.
7. Vektor enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 6.
8. Gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 7.
9. DNA hybridisierend mit einem Polynucleotid gemäß Anspruch 4, die für ein Polypeptid mit hNLP-Aktivität kodiert.
10. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.
11. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1.
12. Antisense Oligonucleotide zur Hemmung der hNLP Expression.
13. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mindestens ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder Polynucleotide mit der Seq. ID. # 10 und gegebenenfalls verträgliche Träger- und HilfStoffe.
14. Arzneimittel enthaltend mindestens einen der in den Ansprüchen 10 bis 12 genannten Stoffe.
15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 oder 14 zur oralen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären, intracu- tanen, intrathekalen, intranasalen und lokal -topischen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
16. Verfahren zur Herstellung eines hNLP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen-Chromatographie.
17. Verfahren zur Herstellung eines hNLP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Merrifield-Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten Aminosäuren.
18. Verfahren zur Herstellung eines hNLP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechnologischer Vektoren.
19. Diagnostikum zur Erfassung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Polynucleotide nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder Polynucleotide miot der Seq. ID # 10, enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper gegen hNLP oder mit der für das hNLP kodierenden Nucleinsäure oder mRNA hybridisierenden DNA, RNA oder PNA.
20. Diagnostikum nach Anspruch 19, enthaltend Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Antikörper dagegen für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Polypeptide.
21. Diagnostium zur Erfassung von Funktionsstörungen des Knochenmarkes, der Lymphorgane, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatorischen sowie neoplastischen Prozessen enthaltend die Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
22. Verwendung der Polypeptide oder Polynucleotide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems.
23. Verwendung von DNA gemäß Anspruch 9, Antikörpern gemäß Anspruch 10, Antagonisten/Inhibitoren gemäß Anspruch 11, Antisense-Oligonucleotiden gemäß Anspruch 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionserkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen und Proliferationsstörungen z.B. der Atemwege, des Magendarmtraktes und des Urogenitalapparates, insbesondere des Blutes und der blutbildenden Systeme.
24. Vektoren zur Erzeugung von Knock-out-Mutanten in Mäusen zur Etablierung von chronischen Tiermodellen mit Reifungsstörungen der blutbildenden Systeme.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19706937 | 1997-02-20 | ||
| DE19706937.1 | 1997-02-20 | ||
| DE19712487 | 1997-03-25 | ||
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000029621A3 (en) * | 1998-11-16 | 2000-11-09 | Genelabs Tech Inc | Method for measuring target polynucleotides and novel asthma biomolecules |
Citations (2)
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| WO1995001436A1 (en) * | 1993-06-29 | 1995-01-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Conotoxins having acetylcholin receptor binding properties |
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-
1998
- 1998-02-19 WO PCT/EP1998/000950 patent/WO1998037191A1/de active Application Filing
Patent Citations (2)
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| EMBL Datenbank Entry HS551134; Zugriffsnummer T83551; 31 Mai 1995 HILLIER L. ET AL.:"The WashU-Merck EST project" * |
| EMBL Datenbank Entry MM16134; Zugriffsnummer W82161; 27 Juni 1996; MARRA M. ET AL.:"The WashU-HHMI Mouse EST project" * |
| EMBL Datenbank Entry MM82512; Zugriffsnummer W29825; 10 Mai 1996; MARRA M. ET AL.:"The WashU-HHMI Mouse EST project" * |
| ROBERT I. LEHRER ET AL.: "Defensins: Endogenous antibiotic peptides of animal cells", CELL, vol. 64, no. 2, 25 January 1991 (1991-01-25), NA US, pages 229 - 230, XP000170612 * |
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