WO1998031809A1 - Slc humaine de chemokine cc - Google Patents

Description

明 細 書 ヒ卜 C C型ケモカイン S L C 技術分野

本発明は新規なヒ 卜 CC 型ケモカイン SL 該タンパク質をコードするポリヌ クレオチド、 該タンパク質の製造方法、 該タンパク質または該タンパク質をコー ドするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物、 さらに、 該タンパク質の単クロ ーン抗体及び該抗体を産生し得るハイプリ ドーマに関し、 さらに該タンパク質と その特異的レセプターとの結合によリ誘発される生物作用に対するァゴニストノ ィンバースァゴニス卜 アンタゴニス卜をスクリ一二ングする方法に関する。 背景技術

物理的、 化学的または生物学的な機序によリ起こる外来性あるいは内因性のさ まざまな組織傷害、 侵襲、 抗原暴露などは強い炎症反応や免疫反応を誘導する。 これらの反応は重要な生体防御反応であるが、 またときには急性あるいは慢性の 疾患の原因ともなりうる。 炎症反応や免疫反応を誘発する原因が組織に加えられ ると、 まず好中球、 顆粒球、 リンパ球あるいはマクロファージなどのような炎症 性細胞あるいは免疫担当細胞の血管内皮細胞への吸着、 血管外への移動、 そして 侵襲あるいは障害された組織や抗原の存在する組織での集積が起こる。 このよう な一連の細胞遊走反応を誘導する物質として一群のケモタクティック ·サイ 卜力 イン、 いわゆるケモカイン、 が存在する。 ケモカインは遊走反応 （ケモタクティ ック反応） を誘導する一群のサイ 卜力インであり、 アミノ酸配列の類似性から構 造的にも相互に密接に関係する。 これまでにヒ トでは 30 種以上のケモカインが 報告されている。 ケモカインは、 共通に保存された 4個のシスティン残基のうち の最初の 2個の並び方から、 大きく αあるいは CXC型 （2個のシスティンが 1 個 のアミノ酸で隔てられている） と i8あるいは CC 型 （2 個のシスティンが隣り合 つている） に分けられる。 CXC 型ケモカインとして、 ヒ 卜では、 I L- 8、 β -TG, PF-4、 MGSA/GRO , ENA- 78、 NAP- 2、 GCP- K GCP-2、 I P- 10, SDF- 1 /PBSF、 M I G、 な どが知られている。 cxc型ケモカインは主に好中球の活性化と遊走を誘導する。 CC型ケモカインとして、 ヒ トでは、 MIP-1 α、 ΜΙΡ-1 β , RANTES, MCP-K MCP-2, MCP- 3、 卜 309、 ェォタキシンなどが知られている。 CC 型ケモカインは、 主にモ ノサイ 卜/マクロファージの活性化と遊走を誘導する。 さらに CC 型ケモカイン には、 T 細胞、 好塩基球、 好酸球、 などに対して活性化と遊走誘導を示すものが 知られている ( Oppenheim et al, Annu. Rev. Immunol. 9： 617-648, 1991； Baggiol ini et a I . , Adv. Immunol. 55: 97-179, 1994; Ben— Baruch et al. , J. Biol. Chem. 270: 11703-11706, 1995; M. Baggiol ini et al, Annu. Rev. Immunol. 15: 675-705, 1997; B.丄 Rol l ins, Blood 90: 909-928, 1997)。 発明の概要

本発明は、 ン一ザンブロッ 卜解析により主として二次リンパ組織に構成的に発 現していることが認められる、 C C R 7のリガンドである新たに見出されたヒト CC 型ケモカインまたはその変異体、 またはそれらの断片であるタンパク質、 好 ましくは配列番号 1のアミノ酸残基 2 4から 1 3 4のアミノ酸配列あるいは配列 番号 1 のアミノ酸残基 1 から 1 3 4のアミノ酸配列を有するヒ 卜 CC 型ケモカイ ン、 またはこの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加の 中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列を有しかっかつ該ヒ 卜 CC 型ケモカイ ンの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性を有する、 あるい は該ヒ 卜 CC型ケモカインのアンタゴニストとして機能する該ヒ卜 CC型ケモカイ ンの変異体またはそれらの断片であるタンパク質 ；本発明のタンパク質を含有す る医薬組成物 ；本発明のタンパク質に対する抗体、 好ましくは単クローン抗体で ある抗体 ；本発明の単クローン抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞； 本発明のタ ンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、 好ましくは配列番号 1 の 1 2 8位 の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列、 好ましくは配列番号 1 の 5 9位の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列の全長または一部を含む本発明のポリヌクレオチド 分子、 またはその塩基置換、 塩基付加もしくはアレル変異による変異体 ；配列番 号 1 の〗 位の Cから 8 6 4位の Aまでの塩基配列の全長または一部と相補的な配 列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子、 またはその塩基置 換、 塩基付加もしくはアレル変異による変異体であって本発明のタンパク質の活 性または機能を阻害する分子 ；本発明のポリヌクレオチド分子を含有するべクタ 一、 好ましくは発現ベクターまたは治療用ベクターであるベクター ；本発明の発 現ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体；本発明の形質転換体を培 養し、 産生されたタンパク質を培養物から回収することを特徴とする、 本発明の タンパク質を製造する方法 ；本発明のポリヌクレオチド分子またはその変異体を 含有する医薬組成物 ；本発明の治療用ベクターを含有する医薬組成物 ；本発明の タンパク質とその特異的レセプター C C R 7との結合によリ誘発される生物作用 に対するァゴニス卜、 ィンバースァゴニス卜またはアンタゴニス卜をスクリ一二 ングする方法であって、 該ァゴ二スト、 インバースァゴニス卜またはアンタゴニ ス卜を含むと推定される試料を該タンパク質とその特異的レセプター C C R 7と の結合反応に加えてその結合阻止を測定したり、 あるいは該タンパク質の特異的 レセプター C C R 7と直接反応させて、 そのレセプターに対する結合性および または反応性を測定する工程を包含する方法 ；本発明のスクリーニング方法によ つて得ることのできる、 本発明の夕ンパク質とその特異的レセプター C C R 7と の結合によリ誘発される生物作用に対するァゴニス卜、 ィンバースァゴニストま たはアン夕ゴニス卜、 に関する。 図面の簡単な説明

図 1 は、 ヒト SLCの cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。 図 2は、 本発明の SLCタンパク質と、 既知の 14種のヒ卜 CC型ケモカインとの アミノ酸配列を比較した結果を示す図である。 右の数値は SLCタンパク質とのァ ミノ酸一致率を示している。

図 3は、 各種のヒ卜組織における SLC の mRNAの発現をノーザンプロッ 卜によ リ解析した結果を示す図面に代わる写真である。

図 4は、 精製 SLCタンパク質を SDS- PAGEを用いて純度検定した図である。 図 5は、 精製 SLCタンパク質によるヒ ト T細胞株 HUT78細胞および HUT1 02細 胞のケモタキシス反応誘導を示すグラフである。

図 6は、 精製 SLCタンパク質の種々のレセプターに対する反応性を細胞内カル シゥ厶瀑度の変化によって示しているグラフである。

図 7は、 精製 SLC タンパク質によるヒ卜 C C R 7安定発現マウス L1.2細胞株 のケモタキシス反応誘導を示すグラフである。

図 8は、 SLC.タンパク質による HIVウィルス増殖の促進を示すグラフである。 発明の開示

本発明者らは、 新たな CC型ケモカインを見い出すべく、 種々のヒト CC型ケモ 力インアミノ酸配列をもとに、 アメリカ PJCBI が公開している核酸配列データべ ース GenBank の一部で、 cDNA部分配列から構成される Expressed Sequence Tag (EST)データベースを TBLASTN 検索ソフトを用いて検索した。 その結果、 新たな CC 型ケモカイン様夕ンパク質をコードすると考えられる DNA 断片の配列の存在 を見い出し、 ヒ ト胎児肺組織由来 tnRNAからその全長 cDNAを相補的にカバーする 2種類の cDNA クローンを分離して、 その全長にわたる塩基配列を決定した。 そ して、 この遺伝子はおもにリンパ節、 小腸、 盲腸、 脾臓などの二次リンパ組織全 般で構成的に発現しており、 遺伝子工学的技術を用いて産生したそのタンパク質 がヒ卜 T細胞に対して細胞遊走活性を有することを示して、 本発明を完成するに 至った。 そしてこの新規のヒ ト CC 型ケモカインを SLC (Secondary Lymphoid tissue Chemok ί ne) と命名した。

SLC は cDNA の塩基配列から予想されるオープンリーディングフレーム （open reading frame, 0RF) から 1 3 4個のアミノ酸からなるタンパク質と推定され、 さらに成熟型タンパク質では 2 3番目のグリシンと 2 4番目のセリンの間でシグ ナル配列が切断されて、 1 1 1 個のアミノ酸からなる分子量約 1 2. 2 kDaの塩 基性タンパク質であると推定される。 成熟型の SLC は既知の CC型ケモカインと 有意の相同性を示し、 特に CC型ケモカインで保存されている 4個のシスティン はすべて保存されている。 しかし、 既存の CC 型ケモカインとの相同性は最も高 い MIP-1 3に対しても 3 3 %程度である。

本発明 SLC の機能解析の結果、 その特異的レセプターは Mark Birkenbach et al. , J. Vi rol. 67: 2209-2220, 1993 に記載されている C C R 7であることが判 明した。 この C C R 7はリンパ系細胞株に特異的に発現していると報告されてい るので [前掲、 Vicki し Schweickart et aに， GENOMICS 23: 643-650, 1994] 、 そのリガンドである本発明 SLCはリンパ球を遊走する機能を有していると推定さ れる。 また、 CCR7 (前掲文献には EBI1 として記述されている） はェプスタイン 一バールウィルス （Epstein- Barr virus、 EBV) ゃヒトヘルぺスウィルス （Human Herpesvirus) 6 または 7 (HHV- 6, 7)の感染により誘導されるレセプターであり (Ralf Burgs tah I er, et al. B i ochem. B i ophys. Res. Com. 215: 737- 743, 1995; Hi toshi Masegawa, et al. J. Virol. 68: 5326— 5329, 1994)、 EBV や HHV- 6, 7の惹き起こす疾病への関与が示唆されている。 従って、 そのリガンド である本発明 SLCは EBVや HHV-6, 7のライフサイクルを調節したり、 これらのゥ ィルスが惹き起こす疾病に関与していると推定される。

本発明はノーザンプロッ ト解析によリ主として二次リンパ組織に構成的に発現 していることが認められる、 C C R 7のリガンドであるヒ卜 CC 型ケモカインま たはその変異体、 またはそれらの断片であるタンパク質に関する。 好ましくはァ ミノ酸残基 9 9個以上のヒ 卜 CC 型ケモカインまたはその変異体、 またはそれら の断片であるタンパク質である。

本明細書中、 「二次リンパ組織」 なる用語は、 免疫担当細胞のもとになる前駆 細胞の産生、 分化を支配する骨髄または胸腺などの一次リンパ組織に対する用語 であり、 リンパ節、 小腸、 盲腸、 脾臓などのリンパ系組織およびリンパ球に富む 組織であり現実に免疫応答を担う組織を意味する。

ひとつの態様としては、 本発明は配列番号 1 のアミノ酸残基 2 4 - 1 3 4のァ ミノ酸配列を有するヒト CC型ケモカイン （SLC) 、 またはこの配列に 1 または数 個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加の中から選ばれる少なくとも 1 つを 含む配列を有し、 かつ該ヒト CC 型ケモカインの機能または活性と実質的に同じ 程度である機能または活性を有する該ヒ ト CC 型ケモカインの変異体、 あるいは 該ヒ ト CC型ケモカインに対するアンタゴニストとして機能しうる該ヒ ト CC型ケ モカインの変異体、 に関する。 好ましくは、 配列番号 1 のアミノ酸残基 8 2のァ ミノ酸が T y r残基でない変異体である。

また、 本発明は、 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 ~ 1 3 4のアミノ酸配列を有す るヒト CC 型ケモカイン （SLC 前駆体） 、 またはこの配列に 1 または数個のアミ ノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加の中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列 を有し、 かつ該ヒ卜 CC 型ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度であ る機能または活性を有する該ヒ ト CC型ケモカインの変異体、 あるいは該ヒ卜 CC 型ケモカインに対するアンタゴニス卜として機能しうる該ヒ卜 CC 型ケモカイン の変異体、 に関する。 好ましくは、 配列番号 1 のアミノ酸残基 8 2のアミノ酸が T y r残基でない変異体である。

本明細書中、 「CC 型ケモカインの変異体」 とは元のタンパク質のアミノ酸配 列にアミノ酸もしくはアミノ酸配列の置換、 欠失、 挿入、 付加を含む配列を有し、 および あるいは化学的または生化学的な改変または天然もしくは非天然のアミ ノ酸を含むことのできる改変夕ンパク質であリ、 機能または活性が実質的に該 CC型ケモカインと同じであるタンパク質あるいは該 CC型ケモカインのアンタゴ 二ストとして機能するタンパク質、 を意味する。

また、 本発明は本発明の CC 型ケモカインまたはその変異体の断片であるタン パク質をも包含する。 この断片の長さは例えば、 5から 1 0 0アミノ酸残基、 あ るいは 2 0から 8 0アミノ酸残基であり、 それぞれの機能または活性が実質的に 本発明の CC型ケモカインと同じであるタンパク質あるいは該 CC型ケモカインの アンタゴニストとして機能するタンパク質、 を意味する。

別の態様として、 本発明は、 本発明の CC 型ケモカインおよび該タンパク質の 変異体をコードするポリヌクレオチド分子に関する。

本明細書中、 「ポリヌクレオチド分子」 は DNA、 RNA あるいは S—才リゴを含 む非天然分子も包含し得る。 DNA の場合、 cDNA、 ゲノミック DNA あるいは合成 DNAであり得る。 また DNAおよび R NA いずれも 2本鎖でも 1 本鎖でもあり得る。 1本鎖の場合、 コード鎖あるいは非コード鎖でぁリ得る。

詳細には、 配列番号 1 の 1 2 8位の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列、 また は配列番号 1 の 5 9位の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列を含むポリヌクレオ チド分子に関する。

さらに、 本発明はこれらのポリヌクレオチド分子の塩基置換、 塩基付加もしく はアレル変異による変異体を提供する。

「塩基置換、 塩基付加による変異体」 とは、 配列番号 1 に記載された塩基配列 とは異なる遺伝子コードを用いて、 結果的には、 配列番号 1 に記載されたァミノ 酸 1 から 1 3 4のタンパク質と同じタンパク質、 あるいは配列番号 1 に記載され たアミノ酸配列 2 4から 1 3 4のタンパク質と同じタンパク質、 をコードしうる 変異体を意味する。

「アレル変異による変異体」 とは自然に存在する個人差や人種差に基づく塩基 変異を意味し、 コードするアミノ酸配列が変化する場合もある。

本発明はさらに、 配列番号 1 の 1 位の Cから 8 6 4位の Aまでの塩基配列の全 長または一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド分子、 またはその塩基置換、 塩基付加もしくはアレル変異による変異体であつ て請求項 1 記載のタンパク質の活性または機能を阻害する分子。

特に、 5 'ノンコーディング部分の相補的な配列が好ましいが、 より好ましく は転写開始部位、 翻訳開始部位、 5 '非翻訳領域、 ェクソンとイントロンとの境 界領域もしくは 5 ' CAP領域に相補的配列であることが望ましい。 好ましい長さは、 約 1 0塩基対 （ b p ) から約 6 0 b pである。

また、 別の態様として、 本発明は本発明のポリヌクレオチド分子を含有するべ クタ一に関する。 本発明ベクターには発現ベクター、 クローニングベクター、 治 療用ベクターなどの種々の用途を持つベクターが包含される。

発現ベクターは本発明タンパク質の大量生産に利用できる。 発現ベクターにつ いての詳細は以下の項に示す。

治療用ベクターは本発明ポリヌクレオチド分子を投与し細胞内に導入する手 法に用い、 ウィルスベクターによる方法およびその他の方法 （日経サイエンス、 1 994年 4月号、 20-45頁 ； 月刊薬事、 36 ( 1 ) 23- 48 ( 1 994) ； 実験医学増刊、 1 2 ( 1 5)、 ( 1 994) ) . およびこれらの引用文献（等）のいずれの手法も適用することができる。 ウィルスベクターによる方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノウィ ルス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボック スウィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等のウィルスベクター等に本 発明の DNAあるいは RNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。 この中で、 レ トロウィルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルス等 を用いた方法が特に好ましい。 その他の方法としては、 プラスミ ドを直接筋肉内に投与する方法 （DNAヮクチ ン法） 、 リボソーム法、 リポフエクチン法、 マイクロインジェクション法、 リ ン酸カルシウム法、 エレク トロボレ一シヨン法等が挙げられ、 特に DNAワクチン 法、 リボソーム法が好ましい。

さらなる態様として. 本発明は本発明のタンパク質もしくはその変異体または それらをコードするポリヌクレオチド分子もしくはそれを含有する治療用べクタ 一を含有する医薬組成物に関する。 本発明の医薬組成物には例えば、 抗炎症剤、 免疫応答調節剤、 抗感染症剤、 抗癌剤、 炎症および または免疫に関連する疾患 の予防剤または診断剤が包含される。

本発明のポリヌクレオチド分子を医薬として作用させるには、 直接体内に導 入する i n v i v o方法、 およびヒ卜からある種の細胞を採用し体外で遺伝子を該 細胞に導入しその細胞を体内に戻す e x v i v o方法がある。

本発明タンパク質またはポリヌクレオチド分子の投与量は、 患者の年齢、 体 重等により適宜調整することができるが、 通常本発明タンパク質として、 0. 00 1 mg〜1 00mgであり、 これを数日ないし数月に 1 回投与するのが好ましい。 なお、 本発明のタンパク質は生体内活性物質であることから、 該タンパク質の 活性が生じる量、 すなわち本発明のタンパク質を含む医薬組成物の使用量にお いてはその急性毒性は問題とならないことが容易に推測される。

さらに、 本発明は本発明のタンパク質またはその変異体に対する抗体、 特に単 クローン抗体、 および該単クローン抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞に関する。 別の態様として、 本発明は、 本発明のタンパク質とその特異的レセプターの関 係を提供することによって、 本発明のタンパク質とその特異的レセプター C C R 7との結合により誘発される生物作用に対するァゴニス卜、 ィンバースァゴニス 卜またはアンタゴニストとして働く物質を探索し、 評価する工程を包含する方法 に関する。 すなわち、 該ァゴ二スト、 インバースァゴニストまたはアンタゴニス 卜を含むと推定される試料を本発明タンパク質とその特異的レセプター C C R 7 の結合反応に加えてその結合阻止を測定したり、 該タンパク質の特異的レセプタ 一への直接の結合性および または反応性を測定する工程を包含する方法に関す る。 また、 本発明は、 本発明のスクリーニング方法によって得ることのできる、 本 発明のタンパク質とその特異的レセプター C C R 7との結合により誘発される生 物作用に対するァゴニスト、 ィンバースァゴニストまたはアンタゴニストに関す る。 発明の好ましい実施の形態

本発明はノ一ザンブロッ 卜解析によって主として二次リンパ組織における、 お よび胸腺における構成的な発現が認められるヒ卜 CC型ケモカインに関する。 以下、 本発明タンパク質の調製工程を説明する。 本明細書において、 特に指示 のない限り、 当該分野で公知である遺伝子組換え技術、 動物細胞、 昆虫細胞、 酵 母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、 発現したタンパク質の分離精 製法、 分析法および免疫学的手法が採用され得る。

I . 本発明タンパク質の調製

本発明の SLCタンパク質をコードする DNAを含む DNA断片の配列決定方法を例 示する。 この DNA断片の配列は、 例えばヒ卜のリンパ節、 小腸、 盲腸、 胸腺、 脾 臓あるいは胎児肺組織などから由来した cDNA から得ることができるが、 そのた めには、 まず、 cDNAから SLCタンパク質をコードする cDMAのクローニングを行 うためのプライマーが必要である。

( 1 ) ESTライブラリ一からの SLC cDNA部分配列の検索

アメリカ NCBI が公開している核酸配列データベース GenBank の一部であり、 cDNA 部分配列から構成される Expressed Sequence Tag (EST)データベースを、 種々のヒ 卜 CC型ケモカインアミノ酸配列をもとに TBLASTN検索ソフトを用いて 検索し、 CC 型ケモカインと有意の相同性をもつが、 既知のケモカインとは異な るタンパク質をコードすると考えられる cDNA 部分配列を得る。 得られた cDNA 部分配列をもとにポリメレース連鎖反応（PCR)用プライマー 1 対を合成する。

( 2 ) SLCの全長 cDNAの塩基配列の決定

つぎに、 これらのプライマーを用いて、 例えばヒ 卜胎児肺組織の mRNA から、 cDNA末端迅速増幅法 （Rapid Ampl if ication of cDNA Ends, RACE法） (Frohman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ： 8998-9002, 1988) を利用して、 cDNA の全長にわたる塩基配列を決定する。 すなわち ヒ 卜胎児肺組織よ り Quickprep Micro mRNA 精製キッ ト（Pharmacia 社製）を用いて poly(A)+RNA を抽 出し、 この poly(A)+RNAからマラソン cDNA増幅キッ ト （C I ontech社製）を用い て、 5'側 RACE.と 3'側 RACEを行う。 すなわち、 まず上流側の 5'側プライマーか ら下流の 3'側へ向かって cDNAの 3'端まで cDNAを増幅し、 得られた cDNA断片を 適当な塩基配列決定用ベクター、 例えば pGEM- T (Promega社製） や pBluescript (Stratagene 社製） 、 に挿入する。 次に組換えプラスミ ドを回収し、 クロー二 ングされた cDNA 断片の塩基配列を、 例えば Sanger 法 （Sanger et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977) によって決定する。 つぎに、 同 様にして、 下流の 3'側プライマーから上流の 5'側へ向かって cDMA の 5'端まで cDNAを増幅する。 得られた cDNA断片を上記と同様に適当な塩基配列決定用べク ターに挿入し、 組換えプラスミ ドを回収し、 クローニングされた cDNA の塩基配 列を決定する。 このようにして決定した 2種類の cDNA クローンの塩基配列を両 者で共通する領域を用いて重ね合せることによって、 全長の cDNA に対応する塩 基配列が決定される。

( 3 ) SLCの全長 cDNAの調製

得られた SLC の全長 cDNA の塩基配列をもとに、 SLC タンパク質をコードする 領域の両端の塩基配列にもとづいて合成した 2種類のプライマーを用いてポリメ ラーゼ連鎖反応法 （PCR) により増幅し、 適当な塩基配列決定用ベクター （上 記） に挿入し、 組換えベクターを回収して、 クローニングされた cDNA の塩基配 列を決定する （上記） 。

(4 ) 組換え SLCの発現

つぎに得られた SLC タンパク質をコードする cDNA を適当な発現ベクターに組 み込み、 SLC タンパク質を発現するための発現べクタ一とする。 適切な発現べク ターとしては、 例えば、 細菌については pRSET、 pGEMEX. pKK233- 2、 など、 酵 母については pYES2、 昆虫細胞については pVU 393、 pFAST- Bac、 動物細胞につい ては pEF- B0S、 pSRa、 pDR2、 などが各々挙げられる。 この発現ベクターを適当な 宿主細胞、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞、 または動物細胞に導入して、 形質転 換体を作製する。 大腸菌などの原核微生物では、 原核微生物の分泌タンパク質に 由来するシグナル配列 （例えばシグナルペプチド OMPa) と成熟型 SLC タンパク 質とが融合した融合タンパク質として、 強力なプロモーター （例えば T7 プロモ 一ター） の支配下に発現し得る。 酵母では、 酵母の分泌タンパク質の天然前駆物 質に由来するシグナル配列 （例えばフェロモン αのプレブ口配列） と成熟型 SLC タンパク質とが融合した融合タンパク質として、 発現し得る。 動物細胞では、 す でに存在するシグナル配列を含む SLCタンパク質の前駆体タンパク質の遺伝子を 強力なプロモーター （例えば EF- 1 αプロモーター） の下流に挿入し、 効果的な 選択マーカー （例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ） と共に動物細胞 （例えば CH0 dhfr- 細胞） に導入し、 薬剤 （この場合はメ 卜 トレキセー卜） に対する耐性によ リ細胞を選択し、 高発現の細胞株を樹立し得る。 またシグナル配列を含む SLC夕 ンパク質前駆体の遺伝子をウィルスまたはレ卜ロウィルスに組込み、 この組換え ウィルスを動物細胞に感染にさせることにより、 発現し得る。 これら形質転換体 を培養することにより、 SLCタンパク質が産生分泌され得る。

あるいは、 成熟型 SLCタンパク質は、 例えば固相法を用いて、 3個のジスルフ ィ ド結合の存在に必要な注意を払って、 報告された方法 （Clark-Lewis et al. , Biochemistry 30:3128-3135, 1991 ) をもちいて全合成される。

得られたタンパク質の精製は当業者に周知の方法、 例えば、 ァフィ二ティー力 ラム、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 逆相クロ マトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 などを組み合わせて行うことができ る （Imai et al. , J. Biol. chem. 271： 21514-21521, 1996) 。

本発明の SLCタンパク質の変異体の発現は、 当業者に周知の遺伝子組換え技術 (. Sambrook et a I. , Molecular Cloning: A I aboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory) によって変異を導入した DNA を用いて 行うことができる。

II . 本発明タンパク質に対する抗体の調製

本発明の SLCタンパク質に対する抗体は、 例えば、 推定される SLCのアミノ酸 配列の一部に基づいて通常のペプチド合成機で合成した合成ペプチドや、 SLC を 発現するベクターで形質転換した細菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞、 などにより 産生された SLCタンパク質を通常のタンパク化学的方法で精製し、 これらを免疫 原として、 マウス、 ラッ ト、 八ムスター、 ゥサギ、 などの動物を免疫して、 その 血清由来の抗体 （ポリクローナル抗体） を作製する。

あるいは、 免疫したマウスゃラッ 卜の脾臓またはリンパ節からリンパ球を取り だ し 、 ミ エ ロ ー マ 細胞 と 融 合 さ せ て Kohler と Mi l stein の 方法 t Nature, 256, 495-497 (1975) ] 又 は そ の改良法で あ る Ueda ら の方法 [Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 79:4386-4390, 1982)] に従ってハイプリ ドーマを作 製し、 該ハイプリ ドーマから単クローン抗体を産生させ得る。 例えば以下の工程 により SLCタンパク質の単クローン抗体を得ることができる。

( a ) SLCタンパク質によるマウスの免疫、

( b ) 免疫マウスの脾臓の除去及び脾臓細胞の分離、

( c ) 分離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進剤 （例えば ポリエチレングリコール） の存在下での上記の Kohler らに記載の方法による融

( d ) 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地での得られたハイプリ ド 一マ細胞の培養、

( e ) 酵素結合免疫吸着検定 （ELISA)、 ウェスタンプロッ ト、 などの方法に よる所望の抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞の選択及び限定希釈法等によるク ローニング、

( f ) SLC 単クローン抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞を培養し、 単クロー ン抗体を収穫する。

【0 0】

III . SLCタンパク質の mRNAとタンパク質の検出

本発明の SLCの mRNAとタンパク質の存在は、 通常の特異的 mRNAおよびタンパ ク質に対する検出法を用いて行うことができる （Sambrook et al. , Molecular Cloning: A I aboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1988) 。 例えば、 mRNA はアンチセンス RNA や cDNA をプローブに用いたノーザンプロッ ト解析ゃィンサイツ ·ハイプリ ダイゼ一シヨン法により検出できる。 また、 mRNAを逆転写酵素で CDNA に変換し たのち、 適当なプライマーの組み合わせによるポリメラーゼ連鎖反応法 （PCR) によっても検出することができる。 タンパク質については、 SLC タンパク質に特 異的な抗体を用いた免疫沈降やウェスタンプロッ トなどにより検出することがで さる。

IV . SLCタンパク質の免疫学的定量法

例えば、 放射性アイソトープ、 ペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼ のような酵素、 あるいは蛍光色素などで標識した一定量の SLCに、 濃度既知の非 標識 SL (：、 および血清由来の抗 SLCポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗 体を加えて、 抗原抗体競合反応を行わせる。 非標識抗原の濃度を適当に変化させ た後、 抗体と結合した標識抗原と抗体に結合していない標識抗原とを適当な方法 で分離して、 抗体と結合した標識抗原の放射能量、 酵素活性または蛍光強度を測 定する。 非標識抗原量が増すにつれ、 抗体と結合する標識抗原の量は減少する。 この関係をグラフにして標準曲線を得る。 また SLCタンパク質上の異なるェピ卜 ープを認識する 2種類の単クローン抗体の一方を固相化し、 他方を上記のいずれ かの方法でラベルし、 固相化抗体に結合した SLCの量をラベル抗体で検出定量す る、 いわゆるサンドイッチ法も可能である。

次に、 上記の反応系に潺度既知の非標識抗原の代わりに未知量の抗原を含む試 料を加え、 これを反応させた後に得られる、 放射能量、 酵素活性、 または蛍光強 度、 を標準曲線にあてはめれば、 試料中の抗原、 すなわち SLCタンパク質の量を 知ることができる。 SLC タンパク質を定量することによリ、 炎症反応や免疫反応 をモニターするための新しい方法が提供され得る。

V . SLCタンパク質のケモカイン活性の測定

本発明の SLCタンパクのケモカイン活性は、 例えば、 試験管内では、 一定の口 径のポアを有するフィルタ一を介在させて仕切った培養容器の一方の側に SLCを 入れ、 他方の側に標的細胞を入れて、 一定時間後にフィルターのポアを通過して SLC の存在する側へ移動した細胞数をランダムな移動数と比較して示し得る。 ま た、 生体内では、 精製した SLCタンパク質を動物に投与して細胞の浸潤と集合を 組織学的方法で検出することによつても示し得る。 実施例

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

実施例 1

SLCの cDNAの単離およびその構造決定

(1 ) ESTライブラリ一からの SLC cDNA 部分配列の検索。

アメリカ NCBI が公開している核酸配列データベース GenBank の一部で、 さま ざまな cDNA に由来する部分配列から構成される Expressed Sequence Tag(EST) データベースを、 種々のヒト CC 型ケモカインのアミノ酸配列をもとに TBLASTN 検索ソフトを用いて検索し、 CC 型ケモカインと有意の相同性をもつが、 既知の ケモカインとは異なるケモカインタンパク質をコードすると考えられる ESTデー タ （GenBank ァクセッション ' ナンバー ： W17274、 84422. W84375、 67885, W67812、 T25128) を見出した。 これらのデータはそれぞれヒ卜胎児肺 （W17274) 、 ヒト胎児心臓 （W84422、 W84375, W67885, W67812) および結腸直腸癌 （T25128) の cDNA ライブラリー由来の cDNA で、 長さは 535bp、 455bp、 400bp、 482bp、 196bp、 164bpであり、 それぞれ 1996年 4月 29日、 1996年 6月 27日、 1996年 6 月 27 日、 1996 年 10 月 15 日、 1996 年 10 月 15 日、 1995 年 8 月 24 日、 に GenBankに登録されている。

(2) SLC cDPJAの単離

SLC cDNA の単離は、 SLC に特異的なプライマーを用いる RACE 法（Frohman et ai. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, 1988)により行った。 まず、 GenBank EST データ W17274 の配列をもとに RACE 用プライマー、 NCC-8- 5'RACE プライマーおよび NCC-8R- 3' RACE プライマーを合成した。 fJCC-8-5' RACE プライ マーおよび NCC-8R-3' RACEプライマーの配列はそれぞれつぎの通リである ：

NCC-8-5' RACE 5' -CCTTCTTGCATCTTGGGTTCAGGCTTC-3' (配列番号 2)

NCC-8-3' RACE 5' -GAAGCCTGAACCCAAGATGCAAGAAGG-3' (配列番号 3 ) 次に、 ヒ 卜胎児肺組織から、 QuickPrep Micro mRNA 精製キッ 卜 （Pharmacia 社製） を用いて mRNAを抽出した。 この mRNAから Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech 社製） を用いて cDNA を合成した。 すなわちヒ 卜胎児肺 mRNA 1 At gと Marathon cDNA 合成プライマー 10 pmole とを含む水溶液 5 μ i を 70°Cで 2分間加熱し、 氷冷後、 これに dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 1 mM) および MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素 （100 ュニッ ト） を加え、 50 mM Tris-HCI (pH8.3), 6 mM MgCI₂， 75 mM KCI の反応液 10 I 中、 42°Cで 1 時間 一本鎖 cDNA合成反 応を行った。 反応後、 反応液を水冷し、 これに dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 0.2 mM) 、 E. col i DMA ポリメラーゼ I (24 ユニッ ト） 、 Ε· coli DNA リガーゼ （4.8 ュニッ 卜 ） 、 および E. col i RNase H (1 ュニッ ト） を加え、 100 mM KCし 10 mM 硫酸アンモニゥ厶、 5 mM MgC 1₂, 0.15 mM β -NAD, 20 mM Tris-HCI (pH7.5), 0.05 mg/ml ゥシ血清アルブミンの反応液 80 I 中、 16 で 1時間半、 2本鎖 cDNA合成反応を行った。

次いで、 この反応液中に T4 DNAポリメラ一ゼ （10ユニッ ト） を加え、 16°Cで 45 分間反応し、 cDNA を平滑末端化した。 反応後、 フエノール抽出 ' エタノール 沈殿の操作を行った後、 DNAを 10 μ I の蒸留水に溶解した。 その内の 5 μ I の 溶液に Marathon cDNA アダプター 20 pmole および T4 DNA リガーゼ （1 ュニッ 卜） を加え、 50 mM Tris-HCI (pH7.8 )、 10 mM MgCIい 1 mM DTT、 1 mM ATP, 5¾ (w/v) ポリエチレングリコール（MW 8, 000)の反応液 10 I 中、 16°Cで約 20時間 反応させ、 2本鎖 cDNAの両端にアダプターを結合させた。 反応後、 70¾で 2分 間加熱してリガーゼを失活させ、 さらに 10 mM Tricine -K0H (pH9.2), 0.1 mM EDTA で 250倍に希釈後、 94°Cで 2 分間加熱し、 アダプターを結合させた 2本鎖 cDNAを変性させた。

つぎに RACE反応を行った。 まず、 5' RACE反応では、 上記の変性させた cDNA 5 μ I に dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 0, 2 mM) 、 TAKARA LA Taq (2, 5 ュニッ ト） 、 TaqStart 抗体 （0.55 μ. g) 、 アダプタ一部に結合する API プライマー 10 pmole. および NCC- 8-5' RACE プライマー （配列番号 2 ) 10 pmole を加え、 lx TAKARA LA Taq緩衝液の反応液 50 μ I 中、 94°Cで 1分の前処理後、 直ちに 94°C、 30秒 ； 60°C、 30秒 ； 68°C、 4分の条件で 30サイクルの PCRを行った。 また、 3' RACE 反応は、 上記と同様の反応条件で、 NCC- 8- 5'RACE プライマーの代わりに NCC-8-3' RACE プライマー （配列番号 3 ) を用いて行った。 反応後、 それぞれの PCR産物を 2¾低融点ァガロースゲル電気泳動で分離し、 おもな 5'RACE 断片 （約 540bp) およびおもな 3' RACE 断片 （約 350bp) をフ ιノール抽出法で回収し、 それぞれエタノール沈殿の操作を行った後、 10 μ I の蒸留水に溶解した。 それ ぞれの DMA水溶液の 5 μ I をベクター pCR-l I (St ratagene社製） 1.0 I と混合 し、 T4 DMA リガーゼを用いて 16°Cで約 20時間反応させて連結させ、 それぞれの 組換えプラスミ ドを作製した。 これを用いて大腸菌 （Ε· col i) XLI-Blue MRF'

(Stratagene社製） を形質転換し、 コロニーを得た。

( 3 ) 陽性クローンの同定と塩基配列決定

上記工程で得られたコロニーの内の数個からプラスミ ド DNAを抽出し、 SP6 プ 口モーター · プライマーおよび T7 プロモーター · プライマーを用いて cDNA の 5'および 3' 端側の塩基配列を調べたところ、 すべて EST W1727 とほぼ同一の 塩基配列であった。 そこで 5' RACE反応および 3' RACE反応のそれぞれから得ら れたクローンを 1 個づっ選択し （以下 5' -RACE cDNAと 3'- RACE cDNAと称す） 、 それらについて全塩基配列を Sanger らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 , 〗 977)に従って決定した。 そしてこのようにして得られた一部重複 する 2つの cDNA配列から SLCの cDNAの全長が決定された。 その結果、 最初に現 れる翻訳開始コ ドン ATGの規定するメチォニンを含む 1 3 4個のアミノ酸残基か らなるタンパク質をコードする塩基配列が存在することが判明した。 このタンパ ク質のアミノ酸配列は既知のケモカインとは一致はしないが、 有意の相同性を有 し、 またケモカインの構造的特徴である保存された 4個のシスティン残基を含み、 また分泌タンパク質の特徴である N端側に疎水性に富むシグナル配列様の配列が 存在することから、 このタンパク質は新規のケモカインと推定された。

(4 ) SLCの推定アミノ酸配列の解析

決定された全長 cDNA の塩基配列および推定される開始コ ドンから始まる最長 の翻訳枠 （open reading frame ： 0RF)のアミノ酸配列を図 1 に示す。 この遺伝 子は 1 3 4個のアミノ酸よりなる 0RFを有し、 N末端には分泌タンパク質に特徴 的なシグナルペプチドと推定される約 2 0個の疎水性の強いアミノ酸配列を有す る。 この 1 3 4個のアミノ酸からなるタンパク質の分子量は 1 4， 6 2 9であつ た。 シグナルペプチドの切断部位は、 計算によると、 2 3位のグリシンと 2 4位 のセリンの間と推定された。 シグナルペプチド切断後の、 1 1 1 個のアミノ酸か らなる、 推定上の成熟型タンパク質は、 分泌タンパク質であると推定され、 その 分子量は 1 2, 2 3 7、 また等電点は 1 0. 7 2であった。

アミノ酸配列の類似性解析は、 ClustalW プログラムを用いて行った。 その結 果を図 2に示す。 得られた cDNA塩基配列の 0RFから推定されるタンパク質を含 めてすべての CC 型ケモカインで保存されているアミノ酸は星印で示し、 またほ とんどの CC 型ケモカインで保存されているアミノ酸は黒丸で示した。 また得ら れた cDNA塩基配列の 0RFから推定されるタンパク質と他の CC型ケモカインとの 相同性の程度をシグナルべプチドが切断されたあとの成熟型タンパク質につい て！！!表示で右側に示した。 すなわち成熟型分泌タンパク質のァミノ酸配列は CC型 ケモカインに属する、 例えば、 MIP-1 β ( Lipes et aに， Proc. Natに Acad. Scに USA 85:9704-9708, 1988) と 33¾、 MIP-1 a (Obaru et al. , J. Biochem.99:885- 894, 1986 ) と 31% 、 LD78- β ( Nakao et al. , Mol. Cel I. Biol. 10:3646- 3658, 1990 ) ''と 3 、 eotaxin ( Kitaura et al. , J. Biol. Chem.271 :7725- 7730, 1996 ) と 3 、 MCP-1 ( Furutan i et a I . , B i ochem. B i ophys. Res. Commun. 159:249-255, 1989; Yoshimura et al. , FEBS Lett. 244:487-493, 1989) と 31¾、 MCP-2 ( Van Damme et al. , J. Exp. Med. 176:59-65, 1992 ) と 31¾ 、 CP-3

(Opdenakker et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 191 :535-542, 1993) と 30¾、 CP-4 ( Uguccioni et al. , J. Exp. Med.183:2379-2384, 1996 ) と 28%、 RANTES

(Schal I et al. , J. Immunol. 141 :1018-1025, 1988) と 27¾, 1-309 (Mi l ler et al. , J. Immunol. 143 : 2907-2916,〗 989 ) と 24¾ 、 TARC ( Imai et al. , J. Biol. Chem.271 : 21514-21521, 1996) と 21%、 の相同性があることが明らか となった。 また、 全ての CC ケモカインで保存されている、 4 つのシスティンは SLC でも保存されていることが明らかとなった。 従って、 得られたアミノ酸配列 は新規のヒ ト CC型ケモカインのものであると考えられる。

実施例 2

ノーザンブロッ 卜解析による SLC mRNAの発現解析 各種のヒ卜組織より単離した poly(A)+RNA 2 μ gをァガロースゲル電気泳動に かけ、 既にナイロン膜に転写した状態のもの （マルチプルティ ッシュプロッ ト） を Clonetech 社より購入し、 マルチプライ厶 DNA 標識システム （Pharmacia 社 製） により ³² Pで標識した SLCの 5' -RACE cDNAをプローブとして、 ハイプリダイ ゼーシヨン反応を行った。 ハイブリダィゼ一シヨン溶液は 50%ホルムアミ ド、 5XSSC、 50m Tris. CI pH7.5、 5x Denhard' s solution, 0.5¾SDS. にサケ精子 DNA100 μ g/ml を加えたものを用い、 42°Cで 1 6時間ハイブリダィゼーシヨンを 行った。 膜の洗浄は 0. h SSC、 0. U SDS の緩衝液、 65°Cの条件で行った後、 X 線フイルム（Kodak 社製）に感光させ、 それらを現像して解析した。 各種のヒ卜組 織での SLC mRNAの発現を図 3に示す。 図 3の結果から、 SLCの mRNAは、 免疫系 組織、 特にリンパ節、 小腸、 盲腸、 脾臓等の二次リンパ組織、 および胸腺に強く 発現していることが明らかとなつた。

実施例 3

SLCタンパク質の調製

( 1 ) SLCタンパク質の発現

SLC タンパク質をコードする cDNA を導入して昆虫細胞に SLC タンパク質を産 生させた。 まず、 SLC タンパク質の全長をコードする cDNA を SLC の 5' -RACE cDNA (上記）を制限酵素 BamHI と Xbal で分解し、 大腸菌内でバキュロウィルスと 組み換えをおこせるベクター pFAST-Bac (Gibco-BRL社製） の BamHI と Xbal サイ 卜の間に挿入し、 ベクター pFAST- Bac-SLC を作製した。 このベクターを大腸菌 (E. coi i) DmOBac(G'ibco-BRL社製）に導入し、 SLCタンパク質を発現する組換 えバキュロウィルス DNAを作製した。 この組換えバキュロウィルス DMAを、 昆虫 細胞 Sf 9に、 Cel lFectin Reagent (G i bco-BRL 社製） を用いて導入しその培養 上清から組換えバキュロウィルスを得た。 こうして得られた組換えバキュロウィ ルスを発現効率のよい昆虫細胞 High Fiveに感染させ、 培養 2日後、 培養上清を 回収した。 この培養上清には野性型バキュロウィルスを感染させた培養上清には 存在していない約 1 5 kDのタンパク質が高濃度に検出された。 この約 1 5 kDの タンパク質は、 成熟型にプロセスされた SLCタンパク質であることが、 以下の試 験例 2において示されるが、 分子量が大きくなつているのは何らかの修飾による ものと推定される。

(2) SLCタンパク質の精製

組換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞の培養上清を 0, 22 n mのフィ ルターでろ過滅菌し、 イオン交換カラム HiTrap. SP 陽イオン交換カラム (Pharmacia 社製） にアプライし、 緩衝液 A(50mM HES pH6.5)で洗浄後、 緩衝液 B(50mM ES ρΗ6· 5， 1Μ NaC I )によるグラディエントによりタンパク質を溶出させ た。 SLCを含む画分は SDS - PAGEを用いて同定し、 0.4- 0.5M NaCI の溶出画分に 1 5 kD のタンパク質を見出すことができた。 この画分をコスモシル逆相カラム

(ナカライテスク社製） にアプライし、 溶液 C(0.05 FA)で洗浄後、 溶液 D (ァセ 卜ニトリル， 0.05¾ TFA)によるダラディエン卜をもちいた逆相クロマトグラフィ 一によつて精製を行なった。 SLC タンパク質はァセ卜二トリル 28¾！の位置の単一 ピークとして同定でき、 SDS-PAGE 後の銀染色によリほぼ単一バンドとして観察 され、 純度 9 5 %以上の SLCタンパク質を得ることに成功した。 精製 SLCタンパ ク質は凍結乾燥後、 エンド卜キシンフリーの蒸留水 （扶桑薬品株式会社製） に溶 解し、 ケモタキシス活性を測定した。 試験例 1

精製 SLCタンパクの細胞遊走活性

実施例 3で得られた組換え SLCを含む培養上清を用いて細胞遊走活性を検討し た。 細胞としてはヒト T 細胞株 HUT78 および HU 02 ( imai et al.， J. Biol. Chem. 271 :21514-21521, 1996)を用いた。 試験液を培養液 （RPM卜 1640， 20mM Hepes (pH7.4), 〗!¾ BSA) にて希釈 し、 4 8 ウ エノレの走化性チャ ンバ一 (chemotaxis chamber, Neuro Probe 社製） の下ゥエルに加え、 上ゥエルには上 記培養液に懸濁した 4x10⁵個の T細胞株 HUT78細胞を加えた。 IV型コラーゲン溶 液 （5 μ g/ml 水溶液） で室温、 2時間コートしたポリビニルピロリ ドン不含ポ リカーボネー卜膜 （穴径 5 I m, Neuro Probe社製） で上下ゥエルの分離を行つ た。 3 7°Cで 2時間培養後、 膜を取り外し， PBS で上側を洗浄し，固定および染色 を行った。遊走した細胞は 8 0 0倍の顕微鏡下で、 1 ゥエルにつき無作為に選ん だ 5視野について数を測定した。 その結果を図 6に示す。 図 6のグラフに示され るように、 SLC精製タンパク質は HUT78細胞および HUT102 細胞に対して非常に 強い遊走活性を示したが、 溶解バッファーにはそのような遊走活性は検出されな かった。 試験例 2

SLCの N末端の決定

成熟型分泌 SLCの N末端を決定するために精製 SLCタンパクの N末端アミノ酸 配列は、 アミノ酸シーケンサー （島津社製） を用いて決定し、 Ser-Asp-Gly-Gly- Ala- Gin- Asp-X-X-Leu-Lys-Tyr であった。 このアミノ酸配列は、 図 1 に示した塩 基配列から推定されるアミノ酸配列のうち、 推定されるシグナル配列の切断部位 である 2 3位のダリシン残基と 2 4位のセリン残基の間でシグナルべプチドが切 断され、 1 1 1 個のアミノ酸からなる成熟型分泌 SLCタンパク質となったときに 予想される fJ末端アミノ酸配列と一致した。 試験例 3

SLCの特異的レセプターの同定

SLCの特異的レセプターを決定するため、 種々のレセプターに対する SLCの反 応性を、 SLC とレセプターとの結合が惹き起こす細胞内カルシウム溏度の上昇で 検討した。 細胞には、 対照としてマウスプレ B細胞株 L1.2 を、 およびヒトケモ 力インレセプター （C C R) 1 から C C R 7までの 7種のレセプターをそれぞれ 安定に発現するマウスプレ B細胞株 L1.2の CCケモカインレセプタートランスフ ェクタン卜を用いた。

これらの細胞 5x10⁶を 2mM のカルシゥ厶インディケ一夕一 Fu ra-2AM を培養液 (RPMI-1640, 20mM Hepes (pH7.4), 1¾ FCS)中でローデイ ングした。 1% FCS を 含む HBSSで 2回洗浄後、 同緩衝液で 2ml に調整した。 Fura-2 由来の蛍光を、 絰 時的に蛍光強度計 （パーキンエルマ一製） で測定した。 その結果を図 7に示す。 図 7 に示されるように、 CCR7 のトランスフエクタントに SLCタンパク質を ΙΟηΜ 加えると強い一過性の細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。 一方、 親株 L1.2や、 その C C R 1 から C C R 6 卜ランスフエクタントに 10nM SLCタンパク 質を加えても反応は見られず、 それぞれの適切なリガンドを ΙΟηΜ 加えると細胞 内カルシウム濃度の上昇が検出された。 このことから、 CCR7 は SLC の特異的レ セプターであることが示された。

次いで、 SLCの CCR7 トランスフエクタントに対する細胞遊走活性を検討した。 試験例 1 と同様に試験液を培溶液（ RPMI-1640, 20mM Hepes (pH7.4), 1¾ BSA)に て希釈し、 トランスウエルチヤンバー （Costar 社製） の下ゥエルに加え、 上ゥ エルには上記培溶液に懸濁した 5xl0⁶のマウスプレ B 細胞株 L1.2 またはその CCR7 トランスフエクタン卜を加えた。 37°Cで 4 時間培養後、 下ゥエルに遊走さ れてきた細胞数をセルソーター（べク トンディキンソン社製） で計測した。 その 結果を図 7に示す。 図 7に示されるように、 SLC 精製タンパク質は CCR7 トラン スフェクタントに対しては遊走活性を示したが、 その親株 L1.2 には遊走活性を 示さなかった。 このことから、 CCR7 トランスフエクタン卜の SLC への遊走には CCR7が必須であり、 CCR7は S LCの機能的なレセプターであることが示された。 試験例 4

SLCによる HIVウィルス増殖促進作用

健常成人ボランティアよリ採取した末梢血単核球 （PBMC) をフイ トへ厶ァダル チニン （PHA) と IL-2， 20 U/ml を含む培養液 （RPN卜 1640， 10¾FCS) で 2 日間培 養し、 これらの細胞にヒ ト免疫不全ウィルス （HIV) 株、 NL432 あるいは SF162 を moi.約 0.1 で加え、 2 時間 37°Cにてインキュベーションし、 感染させた。 感 染細胞を洗浄後、 IL-2, 20 U/ml を含む培養液 （RPN卜 1640, 10¾FCS) で細胞瀑 度が 1 X 10⁶/ml になるように懸濁した。 このとき、 示した濃度 32〜4000ng/ml の SLC を加え、 あるいは加えず、 7 日間培養維持し、 培養上清中の HIV逆転写酵素 活性で HIVの産生量を調べた。 逆転写酵素活性は以下のようにして測定した。

ΙΟΟμΙの 50mM Tris-HCI, pH8.3、 150m KCI、 lOmM MgCI 0.1¾ Nonidet P-40、 10mM ジチオスレィ トール、 5mg/nil ポリ（rA)、 5mg/ml (dt),₂.₁₈. [³H]dTTP からな る反応液に培養上清 10μΙ を加え、 37°Cで 3 時間反応させたのち氷冷して反応を 停止した。 反応液をセルハーべスターを用い、 DEAE-フィルターマッ ト （フアル マシア社製） に吸着させ、 5¾ Na₂HP0₄と H₂0 で洗浄後、 LKB ベ一夕プレー卜シン チレーシヨンスぺク 卜ロスコピー （フアルマシア社製） によって放射活性を測定 した。

結果を図 8に示す。 図 8は、 SLCが濃度 160-4000ng/ml で HIVのウィルス増殖 を有意に促進することを示している。 用いたウィルス株である NL432は T細胞指 向性であり、 SF 1 62 はマクロファージノ単球指向性であるが、 SLC はそのどちら の株に対してもウィルス増殖を促進している。 産業上の利用可能性

白血球の遊走と組織への浸潤を誘導するケモカインは生体内での炎症反応や免 疫反応にとって必須の物質である。 ケモカインには現在、 主に CXC型と CC型が 知られており、 それぞれに複数の種類が存在し、 産生組織、 産生細胞、 産生を誘 導する刺激の種類、 産生誘導から産生停止に到る反応時間、 遊走を誘導する標的 細胞の種類、 特異的レセプターの存在、 などに関し相互に異なる性質を示す。 本 発明の SLC は構造的には CC型ケモカインのグループに属し、 おもにリンパ節、 小腸、 盲腸、 胸腺、 脾臓などのリンパ系組織およびリンパ球に富む組織で構造的 に発現しており、 T 細胞のようなリンパ球に対して遊走活性を示すという性質を 示す。

SLCは T細胞のようなリンパ球に対して遊走活性を示すことによリ、 リンパ球 が関与する急性あるいは慢性の炎症反応や免疫反応に関与することが容易に予想 される。 そのため本発明の SLCは、 その機能解明にょリ、 リンパ球の関わる炎症 反応や免疫反応を理解し、 またそのような現象を誘導したり抑制したりするあら たな手段を提供する。 また本発明の SLCは、 主として二次リンパ組織、 例えばリ ンパ節、 小腸、 盲腸および脾臓、 および胸腺などのリンパ系組織ではかなリのレ ベルで構成的に発現していることから、 正常の生体でもリンパ球の体内動態、 す なわち体内循環ゃリンパ組織でのホーミングを制御したリ、 またリンパ組織での リンパ球の移動と定着、 成熟分化、 抗原認識、 生存、 増殖、 等に関与しているこ とが予想される。 そのため、 本発明の SLCは、 その機能解明により、 各種リンパ 系組織でのリンパ球の移動と定着、 分化成熟、 抗原認識、 細胞の増殖や生存の調 節、 等を理解するのに役立ち、 またそのような現象を調節するのに有用な手段を 提供する。

すなわち本発明で提供される SLCのタンパク質あるいはその変異体は、 生体内 での SLCの作用を増強したり、 抑制したりすることにより、 SLCの関与する生理 的あるいは病理的な生体反応を調節することを可能とする。 また本発明によって提供される SLCを全長あるいは部分的にコードするポリヌ クレオチド分子 （DNA、 RNA あるいは S—才リゴ等を含む非天然ポリヌクレオチ ド分子、 2本鎖あるいは 1本鎖） は、 適当な方法によりそのままポリヌクレオチ ドとして生体内に投与したり、 適当なベクターに導入して生体外で細胞に導入し てその細胞 （形質転換細胞） を体内に戻したり、 あるいは適当なベクターに導入 して直接体内に投与したりしうる。 それによつて、 目的とする組織や細胞での SLC タンパク質の産生を増強したり抑制したりすることが可能となり、 それによ つて、 各種の炎症あるいは免疫反応による急性あるいは慢性疾患、 癌、 ウィルス やその他の微生物による感染症、 SLC遺伝子の構造や発現の異常をともなう疾患、 などへの治療法に有用である。

また、 本発明によって提供される SLCの塩基配列、 SLCを全長あるいは部分的 にコードするポリヌクレオチド分子 （DNA、 RNA あるいは S —オリゴを含む非天 然分子） 、 SLC に対する特異的抗体は、 SLC の遺伝子変異を検出し解析するのに 有用であり、 また SLCの遺伝子発現 （mRNA) やタンパク質の発現を特異的に検出 し定量することに有用である。 それによつて SLC遺伝子や SLCタンパク質の関与 する炎症性疾患、 血液系疾患、 免疫系疾患、 感染症、 癌、 などの診断や原因究明 にあらたな手段を提供し、 またそのような疾患の診断および治療にあらたな手段 を提供することが期待される。

また、 SLCは T細胞指向性のウィルスおよびマクロファージノ単球指向性のゥ ィルスのどちらの株に対してもウィルス増殖を促進しウィルスの細胞指向性に関 わらず作用することが示された。 H I V は感染直後に血液中でもウィルス粒子が検 出されるものの、 以後、 発症までの長期にわたり血液中のウィルス量が激減する。 この間、 H I V は休止しているわけでなく、 リンパ節で持続的に増殖 （持続感染） していることが知られている。 リンパ節で発現している SLCが試験管内での H I V のウィルス増殖を促進することは、 生体内での H I Vのリンパ節での持続的な増殖 に関与している可能性を示している。 SLCとそのレセプター CCR7の結合を阻害す るインヒビターは新しい抗 H I V薬となる可能性がある。 配列表 配列番号： 1

配列の長さ ： 864

配列の型 ：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

起源

生物名 ： ヒ卜

配列の特徴

特徴を表わす記号 ： CDS

存在位置 ： 59..460

特徴を決定した方法： S

C TTG CAG CTG CCC ACC TCA CCC TCA GCT CTG GCC TCT TAC TCA 43

CCC TCT ACC ACA GAC ATG GCT CAG TCA CTG GCT CTG AGC CTC CTT 88

Met Ala Gin Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu

1 5 10

ATC CTG GTT CTG GCC TTT GGC ATC CCC AGG ACC CAA GGC AGT GAT 133 I I e Leu Va I Leu Ala Phe Gly l ie Pro Arg Thr Gin Gly Ser Asp

15 20 25

GGA GGG GCT CAG GAC TGT TGC CTC AAG TAC AGC CAA AGG AAG ATT 178 Gly Gly Ala Gin Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gin Arg Lys l ie

30 35 40

CCC GCC AAG GTT GTC CGC AGC TAC CGG AAG CAG GAA CCA AGC TTA 223 Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gin Gl u Pro Ser Leu

45 50 55

GGC TGC TCC ATC CCA GCT ATC CTG TTC TTG CCC CGC AAG CGC TCT 268 Gly Cys Ser l ie Pro Ala l ie Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser

60 65 70 2 ν α ^· 涎 ¾ ¾：籙

^ m： 一

瞵伞ー： om

98 WW VVVVVVVV33 1013110103 VVVVlVVOi

028 3VV133V1V1 丄丄 V3丄 V1VVV 1311331131 0DV3333V3V 13VD333133 D3V1VD133V 09 DD13D3V00V 31V31VV3VD 0VV0113333 1313V00V30 V303V3DVDV 91V33V303V 00 033131DVDV 339V3DVDD3 VDV3VDV331 D3V303DV39 V3V333D10D V3130D1VDD 0^9 13D3V13i30 V03311V331 01V3333V03 VV丄丄丄 33_m 10111313V3 VOOOilDOOO 089 13D1V3300V DODVOOVODi D333DDDV31 331V13D0V0 DVV3VV391V 3VV333VVD1

029 309VV0il33 0VV03V3133 0V3DV3333V OVDDiOOOOV 3D133DV33V OiDVODOOVI sX"i OJd

09f V33 D3D VVV 133

οει 9ZI 0 1

」リ丄 " ID J9S 3-< niO 」4丄 8JV "i SAQ 3 "Ί J9S 3 s A|D

8 30V DVD V3i 333 3V3 丄。 V 3DV 0VV 3D1 ODD VVV 331 333 DVV V33

911 Oil 901

3 」リ丄 sAつ J8S B I v Λ I g 3JV dsy sAi 3JV 5λ3 3 "13

£0 VVV DVV 333 13V 3VV 331 309 DDD DOV 3V9 DVV D3V 001 ODD 9VD

001 S6 06

B|V OJd sA"i u|3 OJd J3S OJd Jij丄 sA， dsy Π31 S!H u|3 law nan

8 ε 033 V33 VVV DV3 V33 031 V33 V3V 3VV 3V9 913 iVO 9V3 91V 913

98 08 9Z

"ID u|3 ΙΒΛ 丄 na， Π|3 sAi o」d dsv B I V sX3 na n |3 B|V U|0 ειε 0V3 0V3 3丄 3 33丄 313 9 9 3VV V33 3V3 V09 丄 3丄 13 DVD V09 9V0

^SI00/86dUT/XDJ 配列

CCTTCTTGCA TCTTGGGTTC AGGCTTC 27 配列番号 3

配列の長さ ： 25

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類 ：他の核酸 合成 DNA

配列

GAAGCCTGAA CCCAAGATGC AAGAAGG 27

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ノーザンプロッ ト解析により主として二次リンパ組織に構成的に発現し ていることが認められる、 C C R 7のリガンドであるヒ ト CC 型ケモカインまた はその変異体、 またはそれらの断片であるタンパク質。

2 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 2 4から 1 3 4のアミノ酸配列を有するヒ 卜 CC型ケモカイン、 またはこの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加の中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列を有しかつ該ヒト CC 型 ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性を有する 該ヒ卜 CC 型ケモカインの変異体、 またはそれらの断片である、 請求項 1記載の 夕ンパク質。

3 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 2 4から 1 3 4のアミノ酸配列を有するヒ卜 CC 型ケモカインの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付 加の中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列を有しかつ該ヒ卜 CC 型ケモカイ ンのアンタゴニス卜として機能する該ヒ 卜 CC 型ケモカインの変異体またはその 断片である請求項 1 記載のタンパク質。

4 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 から 1 3 4のアミノ酸配列を有するヒ 卜 CC型ケモカイン、 またはこの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加の中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列を有しかつ該ヒト CC 型 ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性を有する 該ヒ卜 CC 型ケモカインの変異体、 またはそれ の断片である請求項 1 記載の夕 ンパク質。

5 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 から 1 3 4のアミノ酸配列を有するヒ 卜 CC 型ケモカインの配列に〗 または数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付 加の中から選ばれる少なくとも 1 つを含む配列を有しかつ該ヒ卜 CC 型ケモカイ ンのアンタゴニストとして機能する該ヒ ト CC 型ケモカインの変異体、 またはそ の断片である請求項 1 記載のタンパク質。

6 . 請求項 1 から 5までのいずれかに記載のタンパク質を含有する医薬組成 物。

7 . 請求項 1 から 5までのいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。

8 . 抗体が単クローン抗体である請求項 7記載の抗体。

9 . 請求項 8記載の単クローン抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞。

1 0 . 請求項 1 から 5までのいずれかに記載のタンパク質をコードするポリ ヌクレオチド分子。

1 1 . 配列番号 1 の 1 2 8位の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列の全長ま たは一部を含む請求項 1 0記載のポリヌクレオチド分子、 またはその塩基置換、 塩基付加もしくはァレル変異による変異体。

1 2 . 配列番号 1 の 5 9位の Aから 4 6 0位の Aまでの塩基配列の全長また は一部を含む請求項 1 0記載のポリヌクレオチド分子、 またはその塩基置換、 塩 基付加もしくはアレル変異による変異体。

1 3 . 列番号 1 の 1位の Cから 8 6 4位の Αまでの塩基配列の全長または 一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子、 またはその塩基置換、 塩基付加もしくはアレル変異による変異体であって請求項 1記載のタンパク質の活性または機能を阻害する分子。

1 4 . 請求項 1 0から 1 3までのいずれかに記載のポリヌクレオチド分子を 含有するベクター。

1 5 . 発現ベクターまたは治療用ベクターである請求項 1 4に記載のベクタ

1 6 . 請求項 1 5に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質 転換体 ₀

1 7 . 請求項 1 5に記載の形質転換体を培養し、 産生されたタンパク質を培 養物から回収することを特徴とする、 請求項 1 から 5までのいずれかに記載の夕 ンパク質を製造する方法。

1 8 . 請求項 1 0から 1 3までのいずれかに記載のポリヌクレオチド分子ま たはその変異体を含有する医薬組成物。

1 9 . 請求項 1 5に記載の治療用ベクターを含有する医薬組成物。

2 0 . 請求項 1 から 5までのいずれかに記載のタンパク質とその特異的レセ プターとの結合によリ誘発される生物作用に対するァゴニス卜、 ィンバースァゴ 二ストまたはアンタゴニス卜をスクリ一二ングする方法であって、 該ァゴニスト, インバースァゴニストまたはアンタゴニス卜を含むと推定される試料を該タンパ ク質とその特異的レセプター C C R 7との結合反応に加えてその結合阻止を測定 し、 あるいは該タンパク質の特異的レセプター C C R 7と直接反応させて、 その レセプターに対する結合性および または反応性を測定する工程を包含する方法,

2 1 . 請求項 2 0に記載のスクリ一二ング方法によって得ることのできる、 請求項 1 から 5までのいずれかに記載のタンパク質とその特異的レセプター C C R 7との結合により誘発される生物作用に対するァゴニス卜、 インバースァゴニ ス卜またはアンタゴニス卜。